CN102532199A - 核苷类化合物之新型苄基胺基磷酸酯前药的结构与合成 - Google Patents

Abstract

本发明描写了一种如式(i)所示的、新型苄基胺基磷酸酯结构，它可用作各种核苷类化合物(包括非环核苷、碳环核苷、呋喃环核苷等)的前体药物(prodrug)，强化核苷类化合物的生物活性，从而应用于病毒感染及癌症的治疗。

Description

核苷类化合物之新型苄基胺基磷酸酯前药的结构与合成

权利要求

1.一种核苷类化合物的新型苄基胺基磷酸酯前药，其特征是如下分子结构：

其中，胺基磷酸酯官能团含有

一个由适当取代的苄醇参与形成的磷酯键；一个由适当取代的苄氨基或α-氨基酸酯参与形成的磷酰胺键；一个由核苷(包括非环核苷、碳环核苷、和呋喃环核苷等)的5’-羟基参与形成的磷酯键。

2.如权利要求1所述的苄基胺基磷酸酯衍生物，

R₁与R₂各自独立，可以是氢、卤素、羰基、羧基、硝基、酯基、酰氨基、C₁-C₈的烷基、C₁-C₈的烷氧基、C₁-C₈的胺基、C₂-C₈的烯基、C₂-C₈的炔基、C₂-C₈的酰基。

R₃、R₄、R₅为氢、卤素、苯环或C₁-C₄的烷基。

R₆为苯环、R₁与R₂取代的苯环、或者是羧酸酯-COOR₁₂，其中R₁₂为C₁-C₈的烷基。

3.如权利要求1所述的苄基胺基磷酸酯衍生物，X₁可以不存在、或者是CR₃R₄；X₂选自O、CR₃R₄、或C＝CR₃R₄；

X₃可以不存在、或者是亚甲基CH₂。

4.如权利要求1所述的氨基磷酸酯衍生物，T₁、T₂相互独立，可以是H和CHR₇，而R₇为H、OH或F；T₁、T₂也可以互相键合在一起构成如下官能团

这里，R₈、R₉、R₁₀、R₁₁相互独立，可以是氢、卤素、氰基、叠氮、氨基或C₁-C₄的烷基、烯基或炔基。

5.如权利要求1所述的氨基磷酸酯衍生物，Base是嘌呤或者嘧啶类碱基，或者其化学和代谢衍生物。

技术领域

本发明涉及一类核苷类化合物新型的苄基胺基磷酸酯前药(1)，作为核苷单磷酸酯的等价物，它的结构特征及其制备方法。

发明背景

核苷类化合物是核糖核酸，也即生物遗传基因DNA与RNA的结构单体，因而在所有生命体中皆有重要功能，并被广泛用于病毒感染和癌症的治疗。

1960年代以来，许多生物活性的核苷化合物被用于治疗各种病毒感染，如疱疹，艾滋病，乙型和丙型肝炎。大量研究已经证实，核苷产生生物活性的机理都是相同的，核苷类药物要起作用，必须是在活化成其相应的三磷酸核苷后，才能表现出药用活性。具体而言，核苷常首先通过宿主细胞激酶的催化作用与磷酸根相结合而转化成核苷5′-单磷酸酯，进而分步再生成二磷酸核苷和三磷酸核苷，只有三磷酸核苷才是核糖核酸聚合酶的底物，能直接参与核糖核酸双螺旋高分子链的合成。核苷的三磷酸酯最终通过选择性结合病毒的逆转录酶或聚合酶，中断病毒或癌细胞的DNA或RNA分子链的合成与复制，进而达到抗癌或者灭杀病毒的作用。

通常情况下，核苷的5’-单磷酸酯化是速度限制、效率较差的反应。很多核苷由于磷酸化受阻，显示的生物活性很低，甚至根本没有生物活性。故而早期核苷类药物的设计与开发，必须同时满足宿主细胞激酶和病毒聚合酶的结构要求。为了降低核苷化合物对磷酸化激酶的依赖，McGuigan等发明了芳基胺基磷酸酯类前药(2)[J.Med.Chem，(1993)，36，1048-1052；WO2010081082；WO2009142827；WO2008062206；WO2007020193；WO2005070944；WO2005012327；WO2000047591；WO2000018775]。

McGuigan型芳基胺基磷酸酯结构

核苷的McGuigan型芳基胺基磷酸酯(2)在体内能够被酯酶水解，代谢成核苷单磷酸脂，故而是其单磷酸酯的等价物，它可以绕开选择性高、效率较差的核苷在激酶作用下的单磷酸酯化反应，直接输送活性核苷5′-单磷酯进入细胞组织产生生物作用。其结果McGuigan芳基胺基磷酸酯能使无生物活性的核苷转变成具有显著生物活性的潜药，或能提高核苷药的生物活性。

到目前为止，核苷McGuigan型芳基胺基磷酸脂前药是世界上应用最为广泛的一种核苷前体药物。体外试验表明，这种前药的生物活性的确比相应核苷的高得多。但McGuigan前药代谢产生的苯酚类有潜在的致癌毒性，而且其脂基容易被肠道内广泛分布的酯酶水解，而降低其生物利用度。

利用适当取代的苄基替代McGuigan型胺基磷酸酯结构中的芳基，作者发明提出了一种新型的苄基胺基磷酸酯衍生物(1)作为核苷单磷酸酯等价物，在此描述了它的结构特征和制备方法。

本发明的氨基磷酸酯衍生物(1)可以强化核苷类化合物的生物活性，强化其抗病毒或抗癌活性。当核苷与这种新型苄基胺基磷酸酯结合后，生成的前药对酯酶稳定，且其代谢产生的苯甲醇，苯甲酸类化合物则相对较安全，有效地克服了McGuigan前药释放出毒性苯酚的缺陷。尤其是，本发明所描述的前药还具有显著的肝靶向作用，特别适合于开发治疗肝病，如肝癌和肝炎等的药物。

发明内容

本发明设计并提供了一种新型的苄基胺基磷酸酯的结构及其合成方法，这种苄基胺基磷酸酯在与核苷结合后，作为后者的单磷酸酯等价物可以活化核苷，提高核苷类药物的活性。该类化合物结构如(1)所示：

其中，

R₁与R₂为氢、卤素、羰基、羧基、硝基、酯基、酰氨基、C₁-C₈的烷基、C₁-C₈的烷氧基、C₁-C₈的胺基、C₂-C₈的烯基、C₂-C₈的炔基、C₂-C₈的酰基；

R₃、R₄、R₅为氢、卤素或C₁-C₄的烷基；

R₆为苯环、R₁与R₂取代的苯环、或者是羧酸酯-COOR₁₂，其中R₁₂为C₁-C₈的烷基。

X₁可以不存在、或者是CR₃R₄。

X₂选自O，CR₃R₄，或C＝CR₃R₄。

X₃可以不存在、或者是亚甲基CH₂。

T₁、T₂相互独立，可以是H和CHR₇，而R₇为H、OH或F；T₁、T₂也可以互相键合在一起构成如下官能团

这里，R₈、R₉、R₁₀、R₁₁相互独立，可以是氢、卤素、氰基、叠氮、氨基或C₁-C₄的烷基、烯基或炔基。

B是嘌呤或者嘧啶类碱基，或者其化学和代谢衍生物。

根据上述的结构特征，一个具体的化合物实例结构如下：

这里X₁，R₁-R₆以及Base的定义如前所述，更加具体化的实例是

这里R₁和R₂各自独立，其定义如前所述。

除了上述碳环核苷的氨基磷酸酯衍生物以外，另外一个具体的呋喃环核苷氨基磷酸酯化合物实例结构如下：

这里R₁-R₆、R₁₁以及Base的定义如前所述，更加具体的实例是

这里R₁定义如前所述。

本发明的新型苄基胺基磷酸酯衍生物(1)，可以由苄基胺基磷酰氯中间体(8)、5’-羟基未保护的核苷化合物(9)、在适当的碱催化剂的存在下在有机溶剂中制备而得。反应分子式如下：

式中R₁-R₆、X₁-X₃、T₁、T₂以及Base如前所述，所述的有机碱主要是1-甲基咪唑或者叔丁基氯化镁。核苷底物(9)、苄基氨基磷酰氯(8)和有机碱试剂的摩尔比是1∶1-5∶1-10，通常增加有机碱的用量对反应无碍。

采用本发明的制备方法，反应温度是-78℃到溶剂回流温度，推荐为-78℃至室温，反应时间由TLC监测，通常为5-100小时。该反应的有机溶剂是二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿、苯、甲苯、乙醚、乙腈、DMF等，推荐为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃。

中间体胺基磷酰氯(8)可以由三氯氧磷与等当量的取代苄醇(10)和胺基化合物(11)反应，在适当碱性缚酸剂存在下、在适当的有机溶剂中制备而得。碱性缚酸剂可以是三乙基胺、二异丙基乙胺、吡啶、N，N-二甲基吡啶、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠等，推荐为三乙基胺、二异丙基乙胺、吡啶。反应溶剂可以是苯、甲苯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙腈等，推荐为二氯甲烷、苯和四氢呋喃。反应温度为-78℃到溶剂回流温度，推荐为-78℃到室温，反应时间为3-12小时，反应时间延长对反应无碍。反应式如下：

式中R₁-R₆定义如前所述。在一定条件下，三氯氧磷与取代苄醇(10)的反应产物(12)甚至可不必分离而直接用于下一步反应，即与有机胺(11)结合生成氨基磷酰氯(8)。两步反应一锅处理，合成方法简单，产率几乎定量，可以工业化生产。胺基磷酰氯(8)的稳定性高，可以快速纯化处理。

核苷化合物可以由已知文献报道的方法制备而得。

具体实施方式

所有水敏感反应均在干燥条件下进行。苯、四氢呋喃或二氯甲烷在金属钠存在下回流、干燥、蒸馏后保存待用。核苷底物参照文献方法合成，尿嘧啶为市场购得，核苷底物使用前应在真空下50℃左右干燥。核苷化合物的苄基胺基磷酸酯衍生物利用硅胶柱层析方法分离，得到的是差向异构体的混合物，其成因为氨基磷酸酯官能团中心磷原子的手性。

通过下述实施例有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1

将30毫摩尔适当取代的卞醇和三乙胺(4.25mL，30.5mmol)在干燥苯(125mL)中的溶液，在0-10℃下缓慢滴加入新鲜蒸馏的三氯氧磷(10mL，107mmol)于干燥苯(50mL)中，反应溶液缓慢升温并在室温下搅拌过夜。在干燥条件下将反应混合物过滤，滤液浓缩便得到取代苄基磷酰二氯(12)。

实施例2

将取代苄基磷酰二氯(12)(4mmol)、适当取代的卞胺(13，4mmol)溶入到干燥二氯甲烷(50mL)中，在-78℃下2个小时内缓慢滴加入三乙胺(0.6mL，4.3mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液。反应液在室温下搅拌反应5小时，蒸除溶剂，残余物中加入干燥乙醚(25mL)，在氮气保护下过滤，滤液浓缩后得到的N，O-二取代苄基磷酰氯(14)可以直接用于下一步反应而不必纯化。

也可以将得到的N，O-二取代苄基磷酰氯(14)溶于干燥四氢呋喃(4mL)中配成1mol/L的溶液待用。

实施例3

在室温下，将N-甲基咪唑(410mg，5mmol)缓慢滴加入尿嘧啶(244mg，1mmol)于无水四氢呋喃(5mL)的悬浮液中，室温下搅拌30分钟。然后将N，O-二苄基磷酰氯(14b，618mg，2mmol)的四氢呋喃(2mL)的溶液慢慢加入到上述反应混合物中，常温下搅拌反应过夜。旋转蒸发浓缩反应液，残余物溶于氯仿(10mL)，有机相分别用稀盐酸(1M，10mL)、饱和碳酸氢钠(10mL)、水(15mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，浓缩，合成的尿嘧啶苄基氨基磷酸酯用硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化而得到。MS(m/e)518(M+H).¹H NMR(CD₃OD，400MHz)δ7.66(d，J＝6.8Hz，0.5H)，7.58(d，J＝8.4Hz，0.5H)，6.98-7.32(m，9H)，5.72(d，J＝5.6Hz，0.5H)，5.70(d，J＝5.2Hz，0.5H)，5.47(，d，J＝8Hz，0.5H)，5.43(d，J＝8Hz，0.5H)，4.80-4.88(m，2H)，3.85-3.98(m，7H)，2.19-2.17(m，3H).

实施例4

参照文献方法[J.Org.Chem.，65(25)，8499-8509，2000]合成Abacavir(15)，其核磁氢谱数据与文献相符。¹N MR(CD₃OD，400MHz)δ7.72(s，1H)，6.14-6.16(m，1H)，5.87-5.89(m，1H)，5.51-5.56(m，1H)，3.56-3.63(m，2H)，2.96-3.02(m，1H)，2.83-2.92(m，1H)，2.72-2.79(m，1H)，1.62-1.70(m，1H)，0.80-0.84(m，2H)，0.57-0.60(m，2H).

实施例5

在室温下，将叔丁基氯化镁(1.0M，2mL，2mmol)缓慢滴加入Abacavir(15)(286mg，1mmol)于无水四氢呋喃(5mL)的悬浮液中，室温下搅拌30分钟。然后将N，O-二苄基磷酰氯(14a，450mg，1.5mmol)的四氢呋喃(2mL)的溶液慢慢加入到上述反应混合物中，常温下搅拌反应过夜。旋转蒸发浓缩反应液，残余物溶于氯仿(10mL)，有机相分别用稀盐酸(1M，10mL)、饱和碳酸氢钠(10mL)、水(15mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，浓缩，生成的苄基氨基磷酸酯(16)用硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)纯化而得到(230mg，42％)。MS(m/e)546(M+H)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ7.40(s，1H)，7.20-7.33(m，10H)，6.01-6.04(m，1H)，5.81-5.83(m，1H)，5.75(s，1H)，5.47(s，1H)，4.94-5-06(m，2H)，4.83(s，2H)，3.99-4.07(m，4H)，3.17-3.24(m，1H)，3.03-3.11(m，1H)，2.96(s，1H)，2.67-2.75(m，1H)，1.58-1.67(m，1H)，0.80-0.84(m，2H)，0.57-0.60(m，2H).

实施例6

参照文献方法[US 20050272932]合成Entecavir(17)，其核磁氢谱数据与文献相符。¹H NMR(CD₃OD，400MHz)δ7.75(s，1H)，5.50(t，J＝8.0Hz，1H)，5.22-5.24(m，1H)，4.78-4.93(m，1H)，4.37-4.39(m，1H)，3.76-3.3.78(m，2H)，2.67(s，1H)，2.36-2.42(m，1H)，2.20-2.23(m，1H).

实施例7

将N，N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(200μL)加入到Entecavir(65mg)在干燥甲醇(2mL)的悬浮液中，室温下搅拌24小时。过滤，滤饼用乙醚洗涤，定量得到产物(18)。¹H NMR(CD₃OD，400MHz)δ8.63(s，1H)，7.86(s，1H)，5.60(t，1H)，5.23(s，1H)，4.76(s，1H)，4.64(s，1H)，4.39-4.20(m，1H)，3.77-3.80(m，2H)，3.18(s，3H)，3.10(s，3H)，2.68-2.74(m，1H)，2.40-2.48(m，1H)，2.20-2.27(m，1H).

实施例8

将叔丁基氯化镁(1.0M，3mL，3.0mmol)滴加入化合物(18)(330mg，1.0mmol)在无水四氢呋喃(5mL)悬浮液中，反应液在室温搅拌1小时，随后加入磷酰氯(14a)(1M，4mL，4.0mmol)的四氢呋喃溶液。反应液室温下继续搅拌过夜，减压蒸除溶剂，残余物用硅胶柱层析分离(二氯甲烷/甲醇＝10/1)得到N²-DMF氨基磷酸酯衍生物(19)70mg，产率12％。MS(m/z)592(M+H).

实施例9

将N²-DMF氨基磷酸酯衍生物(19)(70mg，0.12mmol)溶于正丙醇(5mL)中，加热回流24小时。蒸除溶剂，残余物用柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到产物氨基磷酸酯衍生物(20)(10mg，14％)。MS(m/z)537(M+H)。

实施例10

将取代苄基磷酰二氯(12)(4mmol)、丙氨酸乙酯盐酸盐(615mg，4mmol)溶入到干燥二氯甲烷(50mL)中，在-78℃下1个小时内缓慢滴加入三乙胺(1.2mL，8.5mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液。反应液在室温下搅拌反应过夜，TLC监测反应完全后蒸除溶剂，残余物中加入干燥乙醚(25mL)，在氮气保护下过滤，滤液浓缩后得到的苄基胺基磷酰氯(21)可以直接用于下一步反应而不必纯化。

实施例11

参照文献方法[WO 2010081082]合成化合物(22a)和(22b)，其核磁氢谱数据与文献相符。

化合物(22a)：¹H NMR(CD₃OD，400MHz)δ8.77(s，1H)，8.48(s，1H)，6.19(s，1H)，4.23(d，J＝9.0Hz，1H)，4.17(s，3H)，4.01-4.10(m，2H)，3.88-3.90(m，1H)，0.90(s，3H)。

化合物(22b)：¹H NMR(CD₃OD，400MHz)δ8.27(s，1H)，5.99(s，1H)，4.26(d，J＝9.0Hz，1H)，4.09(s，3H)，4.01-4.07(m，2H)，3.88(dd，J＝3.0，12.4Hz，1H)，0.97(s，3H)。

实施例12

化合物(22a，296mg，1mmol)溶于10mL无水THF中，冰浴冷却下加入1-甲基咪唑(410mg，5mmol)和苄基胺基磷酰氯(21，920mg，3mmol)。反应混合物室温下搅拌24小时，TLC监测反应完全后减压蒸除溶剂，残余物以硅胶柱层析纯化(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)进而得到产物(23)白色固体(260mg，46％)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ8.49(s，0.5H)，8.48(s，0.5H)，8.14(s，0.5H)，8.05(s，0.5H)，7.23-7.34(m，5H)，6.18(d，J＝8.4Hz，1H)，5.01-5.20(m，3H)，3.93-4.51(m，11H)，2.83(s，br，1H)，1.30(d，J＝7.2Hz，3H)，1.13-1.17(m，3H)，0.90(s，1.5H)，0.84(s，1.5H)；MS(m/z)566(M+H)。

实施例13

化合物(22b)(310mg，1mmol)溶于无水THF(10mL)中，0-5℃下缓慢加入叔丁基氯化镁(1M，2mL，2mmol)，随后搅拌30分钟。苄基胺基磷酰氯(21，610mg，2mmol)的THF(2mL)溶液慢慢滴加入反应容器中，室温下搅拌反应24小时。加入饱和氯化铵水溶液(10mL)淬灭反应，萃取分离，水相用乙酸乙酯洗涤，有机相合并、干燥(Na₂SO₄)、过滤、浓缩，残余物由硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)从而得到产物(24，93mg，16％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ7.96(s，0.5H)，7.94(s，0.5H)，7.23-7.40(m，5H)，6.16(s，0.5H)，6.14(s，0.5H)，4.01-4.67(m，13H)，2.64(s，br，1H)，1.31(s，1.5H)，1.29(s，1.5H)，1.17-1.21(m，3H)，0.98(s，1.5H)，0.96(s，1.5H)；MS(m/z)581(M+H)。

Claims (5)

1.一种核苷类化合物的新型苄基胺基磷酸酯前药，其特征是如下分子结构：

其中，胺基磷酸酯官能团含有

一个由适当取代的苄醇参与形成的磷酯键；一个由适当取代的苄氨基或α-氨基酸酯参与形成的磷酰胺键；一个由核苷(包括非环核苷、碳环核苷、和呋喃环核苷等)的5’-羟基参与形成的磷酯键。

2.如权利要求1所述的苄基胺基磷酸酯衍生物，

R₁与R₂各自独立，可以是氢、卤素、羰基、羧基、硝基、酯基、酰氨基、C₁-C₈的烷基、C₁-C₈的烷氧基、C₁-C₈的胺基、C₂-C₈的烯基、C₂-C₈的炔基、C₂-C₈的酰基。

R₃、R₄、R₅为氢、卤素、苯环或C₁-C₄的烷基。

R₆为苯环、R₁与R₂取代的苯环、或者是羧酸酯-COOR₁₂，其中R₁₂为C₁-C₈的烷基。

3.如权利要求1所述的苄基胺基磷酸酯衍生物，X₁可以不存在、或者是CR₃R₄；X₂选自O、CR₃R₄、或C＝CR₃R₄；X₃可以不存在、或者是亚甲基CH₂。

4.如权利要求1所述的氨基磷酸酯衍生物，T₁、T₂相互独立，可以是H和CHR₇，而R₇为H、OH或F；T₁、T₂也可以互相键合在一起构成如下官能团

这里，R₈、R₉、R₁₀、R₁₁相互独立，可以是氢、卤素、氰基、叠氮、氨基或C₁-C₄的烷基、烯基或炔基。

5.如权利要求1所述的氨基磷酸酯衍生物，Base是嘌呤或者嘧啶类碱基，或者其化学和代谢衍生物。