CN103980318B - 含有取代苄基的核苷磷酸酯前药及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有取代苄基的新型核苷磷酸酯前药及其制备方法和用途。所述含有取代苄基的新型核苷磷酸酯前药为式(I)或式(II)所示的化合物或其异构体或可药用盐，它可用作各种核苷类似物，例如非环核苷、碳环核苷、呋喃环核苷等的前体药物，强化核苷类化合物的生物活性，从而应用于病毒感染及癌症的治疗。

Description

含有取代苄基的核苷磷酸酯前药及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体而言，涉及一种含有取代苄基的新型核苷磷酸酯前药及其制备方法和用途。

背景技术

核苷类化合物是脱氧核糖核酸和核糖核酸，也即生物遗传基因DNA与RNA的结构单体，因而在所有生命体中皆有重要功能,并被广泛用于病毒感染和癌症的治疗。1960年代以来，许多生物活性的核苷类似物被用于治疗各种病毒感染，如疱疹，艾滋病，乙型和丙型肝炎。这些人工合成的核苷类似物、能够通过阻断病毒核酸链的生长，破坏病毒基因的复制，成为抗病毒药物(图1)。

如图1所示，核苷必须首先分三步活化成三磷酸核苷，才能参与DNA或RNA的合成，进而表现出生理活性。当一个核苷类似物能够选择性打入病毒或癌细胞的遗传基因，阻止其核酸链复制繁殖，同时对宿主细胞基因无伤害(毒性)时，这个核苷类似物就可成为抗病毒或抗癌药物。

三磷酸核苷本身由于携带多个负电荷、极性非常高，难以通过细胞壁而进入细胞内部，所以不能直接作为抗病毒药物使用。早期核苷类抗病毒药物的形式就是极性适中的核苷本身，它在进入细胞后在宿主细胞激酶(kinase)作用下分三步磷酰化，最终成为三磷酸核苷而发挥药效。近来随着磷酸酯类前药技术的进步，用化学的方法直接将单磷酸的低极性等价结构单元引入核苷分子中，使核苷磷酸酯前药在进入细胞内部后再释放出单磷酸核苷，而不必受核苷激酶的选择性限制。由此，核苷磷酸酯前药就成为了升级核苷类药物性能的流行方式。

核苷前药的研究是当前一个热点，尤其磷酸酯类前药是一种最有效的升级核苷类药物的方式，也能够使得一些由于核苷激酶限制不能磷酰化的 核苷表现出生物活性，文献报道的核苷的磷酸酯类前药之结构类型主要有七类(J.Am.Chem.Soc.,2004,126,5154-5163；WO2012094248，图2)。

如图2所示，(2-1)-(2-5)等五种核苷前药均含有酯基，能在酯酶(包括磷脂酶)作用下水解，释放出单磷酸核苷。由于酯酶广泛分布于肠胃道、肝脏等消化系统，它们不具有非常强的肝靶向性。这类前药的杰出代表为McGuigan等发明的芳基氨基磷酸酯(2-5),是目前在核苷类化合物前药中应用最为广泛和成功的一个；核苷前药(2-6)和(2-7)含有取代苄基，它们只能在氧化酶(如细胞色素P450酶)的帮助下，氧化裂解脱去，释放出单磷酸核苷。由于P450酶系主要分布于肝脏，所以这些核苷前药主要在肝细胞内裂解释放，被称为肝靶向(HepDirect)前药。

众所周知，McGuigan型核苷前药是英国科学家Christopher McGuigan于1990年代最先发明、并被不断完善了的芳基氨基磷酸酯结构单元(3-1，图3)，结构特点是它含有一个氨基酸酯的氨基参与形成的磷酰胺键P(O)-N，还有一个芳基酚参与形成的磷酯键P(O)-O-Ar。已证实McGuigan前药(3-1)的氨基酸酯键首先断裂释放出游离羧酸衍生物(3-2)，产生的羧基官能团能够催化酚基氧磷键水解，形成五元环磷酸酯衍生物(3-3)，随后释放出单核苷酸(3-4)，最终代谢生成能够参与核酸链聚合、具有生理活性的三核苷酸(3-6)。

简而言之，McGuigan前药(3-1)在体内能够被酯酶激发而连续水解，代谢生成单核苷酸(3-4)，所以核苷前药(3-1)就成为了其单核苷酸(3-4)的等价物，它能够绕开选择性高、效率差的单核苷酸激酶催化下的单磷酸酯化反应，直接输送核苷的5′-单磷酯进入细胞并产生生物活性。其结果是McGuigan前药能使那些因无法磷酰化而失去生物活性的核苷重新具有生物活性，或者提高已知核苷药物的生物活性，但它代谢所产生的酚类有潜在的致癌毒性，此外其酯基容易被肠道内广泛分布的酯酶水解，而降低其生物利用度。

实际上，McGuigan前药自发明之后，其芳基酚基磷酯结构单元P-O-Ar很少变化，各种取代芳基酚构成的氨基磷酸酯结构被大量研究且专利保护。然而，脂肪醇(包括苄醇)与氨基酸酯组合构成的氨基磷酸酯(4-1， 图4)却大多无法成为其单核苷酸的等价物，也没有相关的专利报道。其原因在于脂肪醇磷酰化而构成的磷酯键P-O-R水解困难，在氨基酸酯水解释放出的羧酸衍生物(4-2)后，无法再水解形成五元环磷酸酯(4-3)，从而阻断了单核苷酸(4-4)的生成。

Idenix公司最近专利公开了一种新型的脂肪醇-氨基酸酯组合而成的磷酸酯前药(4-5)。

发明内容

综合McGuigan前药和HepDirect前药的结构特点，将肝靶向前药结构中的取代苄基置换掉McGuigan前药中的芳环，本发明人设计出了含有取代苄基的磷酸酯前药(I)和前药(II),在此描述了它的结构特征、制备方法及用途。

本发明的磷酸酯前药可以强化核苷类化合物的生物活性，升级其固有的抗病毒或抗癌活性。当核苷与这种新型含取代苄基的磷酸酯结合后，生成的前药对酯酶稳定，且其代谢产生的苯甲酸类化合物则相对较安全，有效地克服了McGuigan前药释放出毒性苯酚的缺陷。尤其是，本发明所描述的前药还具有显著的肝靶向作用，特别适合于开发治疗肝病，如肝癌和肝炎等的药物。

本发明是通过以下技术方案来实现的。

一方面，本发明提供一种含有取代苄基的新型核苷类似物磷酸酯前药，该前药为式(I)或式(II)所示的化合物或其异构体或可药用盐，

如式(I)和式(II)所示，本发明的磷酸酯前药结构中至少含有一个取代苄基。式(I)中的磷酸酯官能团含有一个由适当取代的苄醇参与形成的 磷酯键和一个由适当取代的α-氨基酸酯参与形成的磷酰胺键；式(II)中的磷酸酯官能团含有两个由相同或不同的取代苄醇参与形成的磷酯键。

其中，R₁与R₁’各自独立，可以是卤素、羧基、硝基、酯基、酰氨基、C₁-C₈的直链或支链烷基、C₁-C₈的直链或支链烷氧基、C₁-C₈的胺基、C₂-C₈的直链或支链烯基、C₂-C₈的直链或支链炔基、C₂-C₈的酰基。

R₂和R₃各自独立，可以为(取代)苯环、(取代)芳香基、(取代)苄基、C₁-C₁₂的直链或支链烷基、C₃-C₆的饱和或不饱和环烷基、C₂-C₈的直链或支链烯基、C₂-C₈的直链或支链炔基。

Nucleoside是指各种核苷类似物，包括常见的呋喃环核苷、碳环核苷以及非环核苷，其具有以下结构通式：

其中，X₁可以不存在、或者是CH₂或CHCH₃。

X₂选自O、CH₂、C＝CH₂或CHCH₃。

X₃可以不存在、或者是亚甲基CH₂。

T₁、T₂相互独立，可以是H和CH₂R₄，而R₄为H、OH或F；T₁、T₂也可以互相键合在一起构成如下官能团：

其中，R₅、R₆、R₇、R₈相互独立，可以是氢、羟基、卤素、氰基、叠氮、氨基或C₁-C₄的烷基、烯基、炔基或者C₁-C₄的烷氧基。

Base是嘌呤或者嘧啶类碱基，或者其化学和代谢衍生物，其具有以下结构通式：

其中，X₄可以选自氢、卤素(F、Cl、Br、I)、羟基、甲基、氨基、乙烯基、2-溴代乙烯基、C_1-8直链或支链烷基取代或者未取代乙炔基；

X₅、X₆和X₇各自独立，可以选自氢、卤素、羟基、氨基、C₁-C₄烷氧基或C₁-C₄烷氨基。

Z为氮、CH或者CX₄，X₄定义如前所述。

优选地，式(I)为下式的化合物：

其中，R₁、R₂、R₃和Nucleoside的定义如前所述。

优选地，式(I)为非环核苷替诺福韦的苄基氨基磷酸酯衍生物，即式(I)为下式的化合物：

其中，R₁、R₂、R₃的定义如前所述。优选为：

其中，R₂、R₃的定义如前所述。

优选地，式(I)为呋喃环核苷，例如2’-甲基核糖核苷取代的苄基磷酸酯化合物，即式(I)为下式的化合物：

其中，R₁、R₂、R₃、Base的定义如前所述。

优选为

其中，R₂、R₃、Base的定义如前所述。

优选地，式(II)为下式的化合物：

其中，R₁、R₁’和Nucleoside的定义如前所述。

优选地，式(II)所示的化合物为：

其中，R₁、R₁’、Base的定义如前所述。

优选地，式(II)所示的化合物为：

其中，R₁、R₁’的定义如前所述。

优选地，在前述的化合物(例如式(I)、(II)、(III)、(IV)、(VI)、(VIII)、(IX)、式(X))中，R₁与R₁’各自独立地选自取代或未取代的C₁-C₈的直链或支链烷基。

优选地，在前述的化合物(例如式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII))中，R₂选自苄基或C₁-C₁₂的直链或支链烷基。

优选地，在前述的化合物(例如式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII))中，R₃选自C₁-C₁₂的直链或支链烷基。

优选地，在前述的化合物(例如式(I)、(II)、(III)、(VIII))中，Nucleoside选自以下基团：

优选地，Nucleoside为 但不仅限于这些核苷。

在一个具体的实施方案中，前述化合物为：

本发明所述的异构体包括互变异构体、顺反异构体、构象异构体和光学异构体。

本发明所述的可药用盐是指本发明的磷酸酯前药式(I)或式(II)的化合物与无机酸或有机酸形成的盐，优选地，所述有机酸为富马酸；更优选地，所述可药用盐选自：

另一方面，本发明提供一种前述化合物的制备方法。具体地，本发明的取代苄基磷酸酯衍生物(I)可以由含有强吸电子基团的苯酚离去基团的磷 酸酯中间体(1)或(3)与5’-羟基未保护的核苷类似物(2)在有机碱的催化下，在有机溶剂中进行反应制备而得。反应分子式如下：

其中R₁、R₁’、R₂、R₃、Nucleoside、Base的定义如前所述；X为强吸电子基团，可以是一个，也可以是多个，可以选自NO₂、SO₂CH₃、F；Y为氧原子、硫原子、亚甲基或C＝CH₂；n为1、2、3、4或5。

优选地，所述的有机碱主要是叔丁基氯化镁。

优选地，式(2)的核苷类似物与含有强吸电子基的苯酚离去基团的磷酸酯(1)或者(3)以及有机碱的摩尔比是1：1-5：1-10，通常增加有机碱的用量对反应无碍。

优选地，采用本发明的制备方法，反应温度是-78℃到溶剂回流温度，推荐为0℃至室温。

优选地，反应时间由TLC监测，通常为5-100小时。

优选地，该反应的有机溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿、二氧六环、苯、甲苯、乙醚、乙腈、DMF等中的一种或多种，推荐为二氯甲烷、二氧六环或四氢呋喃。

单苄基酚基磷酸酯中间体(1)可以由三氯氧磷分别与等当量的取代苯酚(4)、取代苄醇(6)和α-氨基酸酯(7)反应，在适当碱性缚酸剂存在下、在适当的有机溶剂中制备而得。

优选地，碱性缚酸剂可以是三乙基胺、二异丙基乙基胺或吡啶。

优选地，有机溶剂可以是苯、甲苯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、四氢呋喃、二氧六环、乙酸乙酯、乙腈等中的一种或多种，推荐为二氯甲烷、苯或四氢呋喃。

优选地，反应温度为-78℃到溶剂回流温度，推荐为-78℃到室温。

优选地，反应时间为3-12小时，反应时间延长对反应无碍。

反应式如下：

其中，X、n、R₁、R₁’的定义如前所述。

在一定条件下，三氯氧磷与取代苯酚(4)的反应产物(5)可不必分离而直接用于下一步反应，即与苄醇(6)和α-氨基酸(7)分步缩合、生成单苄基酚基磷酸酯产物(1)。多步反应可以一锅处理，合成方法简单，产率很高，可以工业化生产。苄基酚基磷酸酯(1)的稳定性高，可以柱层析纯化处理。

双苄基酚基磷酸酯中间体(3)可以由三氯氧磷分别与等当量的取代苯酚(4)、取代苄醇(6)和取代苄醇(8)反应，在适当碱性缚酸剂存在下、在适当的有机溶剂中制备而得。取代苄醇(6)和(8)各自独立，不排除可以具有完全相同的分子结构。

优选地，碱性缚酸剂可以是三乙基胺、二异丙基乙基胺或吡啶。

优选地，有机溶剂可以是苯、甲苯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、四氢呋喃、二氧六环、乙酸乙酯、乙腈等中的一种或多种，推荐为二氯甲烷、苯或四氢呋喃。

优选地，反应温度为-78℃到溶剂回流温度，推荐为-78℃到室温。

优选地，反应时间为3-12小时，反应时间延长对反应无碍。

反应式如下：

其中，X、n、R₁、R₁’的定义如前所述。

在一定条件下，三氯氧磷与取代苯酚(4)的反应产物(5)可不必分离而直接用于下一步反应，即与取代苄醇(6)和(8)分步缩合、生成双苄基酚基磷酸酯产物(3)。多步反应可以一锅处理，合成方法简单，产率较高，可以工业化生产。双苄基酚基磷酸酯(3)的稳定性高，可以柱层析纯化处理。核苷类似物(2)可以由已知文献报道的方法制备而得。

又一方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含前述的化合 物或其异构体或可药用盐。

再一方面，本发明的前述含有取代苄基的核苷类似物磷酸酯衍生物前药或其异构体或可药用盐，可以用于升级各种核苷类抗病毒药物或抗癌药物。即本发明提供前述的化合物或其异构体或可药用盐在制备预防和/或治疗由病毒，例如HIV、HBV和HCV等感染引起的疾病的药物；或者在制备预防和/或治疗癌症的药物中的用途。

附图说明

图1为核苷、核苷酸与核酸的聚合过程；

图2为常见核苷前药；

图3为McGuigan型芳基胺基磷酸酯(3-1)及其作用机理；以及

图4为脂肪醇-氨基酸参与构成的氨基磷酸酯前药特点。

具体实施方式

以下实施例中，所有水敏感反应均在干燥条件下进行。苯、四氢呋喃或二氯甲烷在金属钠存在下回流、干燥、蒸馏后保存待用。核苷类似物参照文献方法(Org.Proc.Res.Dev.,2010,14,1194；J.Org.Chem.,2003,68,6799)合成,核苷类似物使用前最好在真空下50℃左右干燥。核苷化合物的取代苄基磷酸酯衍生物利用硅胶柱层析方法分离,得到的是单取代苄基磷酸酯(I)或者是双取代苄基磷酸酯(II)的差向异构体混合物。

通过下述实施例有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1

将化合物(9，12.8g,50mmol)溶于二氯甲烷(100mL)中并冷却至-78℃下，20分钟内缓慢滴加邻甲基苄醇(6.1g,50mmol)和三乙胺(7.7mL,55 mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液。反应液在-78℃下搅拌30分钟，然后将其转入到另一个装有干燥L-丙氨酸盐酸盐(7.68g,50mmol)的0℃下的二氯甲烷(100mL)溶液的反应容器中。向上述反应液中缓慢滴加三乙胺(14.7mL,105mmol)，20分钟滴加完毕，并使反应液零度下继续搅拌一小时。旋转蒸发除去溶剂，加入乙酸乙酯研粉，过滤，滤液浓缩，残余物用硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝7：3)得到无色油状产物(11)(17.7g,84％)、久置能缓慢固化。

¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ8.15-8.17(m,2H),7.16-7.34(m,6H),5.15(t,J＝8.0Hz,2H),4.08-4.15(m,2H),3.92-3.96(m,1H),3.70-3.82(m,1H),2.32(s,1.5H),2.31(s,1.5H),1.35(d,J＝7.2Hz,1.5H),1.32(d,J＝7.2Hz,1.5H),1.18-1.23(m,3H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ3.29,3.21；MS(m/z)423(M+H)。

实施例2

化合物(12，296mg,1mmol)溶于20mL无水四氢呋喃中，室温下加入叔丁基氯化镁格氏试剂(1.0M,4mL,4mmol)。搅拌反应30分钟后，缓慢滴加入化合物(11，844mg,2mmol)的四氢呋喃溶液(4mL)，反应混合物室温下搅拌24小时，TLC监测反应完全后加入饱和氯化铵溶液(20mL)淬灭，乙酸乙酯萃取(20mL x3)，有机相合并，干燥，浓缩，残余物以硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝20：1)进而得到白色粉末状产物(13)(370mg,64％)。

¹H NMR(CD₃OD,400MHz)δ8.50(s,0.5H),8.47(s,0.5H),8.39(s,0.5H),8.35(s,0.5H),7.28-7.30(m,1H),7.09-7.17(m,3H),6.15(s,0.5H),6.14(s,0.5H),5.04-5.09(m,2H),4.22-4.60(m,4H),4.16(s,3H),4.02-4.07(m,2H),3.78-3.81(m,1H),2.31(s,1.5H),2.30(s,1.5H),1.27-1.31(m,3H),1.13-1.18(m,3H),0.88-0.91(m,3H)；³¹P NMR(CD₃OD)δ9.72,9.62；MS(m/z)580 (M+H)。

实施例3

采用与实施例2相同的合成方法，将化合物(14)与(11)在叔丁基氯化镁格氏试剂作用下偶联，得到白色粉状产物(15)。

¹H NMR(CD₃OD,400MHz)δ7.93(s,0.5H),7.90(s,0.5H),7.28-7.31(m,1H),7.10-7.17(m,3H),5.95(s,0.5H),5.94(s,0.5H),5.04-5.09(m,2H),4.00-4.43(m,6H),4.02(s,3H),3.78-3.82(m,1H),2.27-2.31(m,3H),1.27-1.31(m,3H),1.13-1.16(m,3H),0.90-0.95(m,3H)；³¹P NMR(CD₃OD)δ9.76,9.67；MS(m/z)595(M+H)。

实施例4

采用与实施例2相同的合成方法，将化合物(11)与2’-甲基脲嘧啶(16)缩合偶联，得到白色粉状产物(17)。

³¹P NMR(CD₃OD)δ9.70,9.55；¹H NMR(CD₃OD)δ7.66(d,J＝8.0Hz,0.5H),7.61(d,J＝8.0Hz,0.5H),7.31-7.36(m,1H),7.16-7.22(m,3H),5.94(s,0.5H),5.93(s,0.5H),5.52(d,J＝8.0Hz,0.5H),5.39(d,J＝8.0Hz,0.5H),5.06-5.12(m,2H),3.73-4.44(m,7H),2.36(s,1.5H),2.35(s,1.5H),1.36(s,1.5H),1.34(s,1.5H),1.17-1.27(m,3H),1.12(s,1.5H),1.11(s,1.5H)；MS(m/z)542(M+H)。

实施例5

将2-甲基苄醇(18，1.22g,11mmol)和三乙胺(2.1mL,15mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液于-78℃、20分钟内滴加到化合物(9，1.285g,5mmol)的10mL二氯甲烷溶液中，反应液在此温度下搅拌反应30分钟，随后升温到室温搅拌过夜。减压蒸除溶剂、残余物用柱层析(己烷:乙酸乙酯＝10:1)纯化后得到无色油状产物(19)(60％)。

³¹P NMR(CDCl₃)δ-5.60；¹H NMR(CDCl₃)δ8.10(d,J＝8.8Hz,2H),7.14-7.26(m,10H),5.13-5.16(m,4H),2.30(s,6H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ137.36,133.19,130.76,129.67,129.53,126.37,125.70,120.76,120.70,69.25,69.19,18.92。

实施例6

采用与实施例2相同的合成方法，将化合物(19)与2’-甲基脲嘧啶(16)缩合偶联，得到白色泡沫状产物(20)。

¹H NMR(CDCl₃)δ7.60(d,J＝8.0Hz,1H),7.13-7.30(m,10H),5.93(s,1H),5.62(d,1H),4.96-5.12(m,4H),3.78-4.17(m,4H),2.35(s,3H),2.22(d,6H)；MS(m/z)547(M+H)。

实施例7

在80mL N，N-二甲基甲酰胺的溶剂中，加入(R)-9-[2-(膦酰甲氧基)丙基]-腺嘌呤(21，3.5g,8.9mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(1.9g,10mmol)、三乙胺(3.8mL,27mmol)、4-(N,N-二甲氨基)吡啶(320mg,2.6mmol)和2-甲基苄醇(1.8g,14.7mmol),室温搅拌30分钟后，于100度加热反应24小时，反应完毕，减压浓缩除去溶剂，残余物溶于水中，经反相C-18柱层析(甲醇：水＝1：9)纯化，得到产物(22，69％)。

³¹P NMR(MeOH-d₄)δ-30.98；¹H NMR(MeOH-d₄)δ8.32(s,1H),8.25(s,1H),7.07-7.23(m,4H),4.88-4.96(m,2H),4.39-4.43(m,1H),4.20-4.25(m,1H),3.92-3.96(m,1H),3.80-3.85(m,1H),3.64-3.69(m,1H),2.27(s,3H),1.16(d,J＝6Hz,3H)；¹³C NMR(MeOH-d₄)δ15.59,17.66,62.29,63.92,65.50,65.55,75.84,75.86,118.03,125.73,128.09,128.20,130.03,136.49,143.91,145.23,149.19,150.46。

实施例8

在20mL N，N-二甲基甲酰胺的溶剂中，加入(R)-9-[2-(膦酰甲氧基)丙基]-腺嘌呤(21，0.57g,2mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(0.38g,2mmol)、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.46g,3mmol)和2-甲基苄醇(180mg,1.5mmol),室温搅拌30分钟后，于100度加热反应24小时，反应完毕，减压浓缩除去溶剂，残余物溶于水中，经反相C-18柱层析(甲醇：水＝1：9)纯化，得到产物(22)。

实施例9

将化合物22(45mg，0.11mmol)悬浮于乙腈(1mL)中，50℃搅拌下加入二氯亚砜(33μL,0.25mmol)，然后在75-80℃反应两小时。随后氮气保护下蒸除溶剂，残余物溶于干燥的二氯甲烷(2mL)中并冷却至-30℃。一小时内慢慢加入L-丙氨酸乙酯盐酸盐(30mg,0.2mmol)和三乙胺(30μL,0.22mmol)的二氯甲烷溶液(0.5mL)，反应液慢慢升至室温过夜。待反应结束，加入10％磷酸二氢钠溶液淬灭反应，加入二氯甲烷(10mL)稀释、萃取，有机相用饱和食盐溶液洗涤、干燥(硫酸钠)、过滤然后浓缩，残余物以柱层析纯化，得到白色固体产物(23，48％)。

³¹P NMR(MeOH-d₄)δ-23.35,-24.24；¹H NMR(MeOH-d₄)δ8.16(s,0.5H),8.15(s,0.5H),8.10(s,1H),7.12-7.24(m,4H),4.95-4.99(m,2H),4.33(t-d,J₁＝13.6Hz,J₂＝2.4Hz,1H),4.01-4.20(m,3H),3.80-3.93(m,3H),3.64-3.70(m,1H),2.28(s,1.5H),2.27(s,1.5H),1.12-1.30(m,9H)；MS(m/z)491(M+H)。

实施例10

采用实施例9的合成方法，将化合物(22)与丙氨酸异丙酯盐酸盐缩合，得到淡黄色泡沫状固体产物(24)。

¹H NMR(MeOH-d₄)δ8.17(s,0.5H),8.16(s,0.5H),8.10(s,1H),7.10-7.24(m,4H),4.94-4.99(m,2H),3.80-4.20(m,6H),3.64-3.70(m,1H),2.29(s,1.5H),2.28(s,1.5H),1.10-1.32(m,12H)；MS(m/z)505(M+H)。

实施例11

将化合物(22，0.78g,2mmol)、L-苯基丙氨酸异丙酯盐酸盐(1.46g,6mmol)和三乙胺(0.84mL,6mmol)的吡啶(8mL)溶液加热到60℃5分钟，随后将由三苯基磷(1.84g,7mmol)与化合物(25，1.54g,7mmol)在吡啶(8mL)中新鲜制备的亮黄色溶液加入到上述核苷(22)与氨基酸的反应液中，60℃下反应过夜。反应结束后减压浓缩，残余物在乙酸乙酯和碳酸氢钠水溶液间分配，有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，残余物用柱层析(二氯甲烷：甲醇＝20：1)分离，得到产物(26)。

¹H NMR(MeOH-d₄)δ8.17(s,0.5H),8.16(s,0.5H),8.11(s,1H),6.98-7.24(m,9H),4.94-4.99(m,2H),3.52-4.42(m,9H),2.29(s,1.5H),2.28(s,1.5H),0.92-1.30(m,9H)；MS(m/z)581(M+H)。

实施例12

在氮气保护下，将化合物(21，287mg,1mmol)与1-甲基-2-吡咯烷酮(28，1mL)和三乙胺(300μL)混合搅拌30分钟，随后加入化合物(27，400mg,2.5mmol)并使反应液于55-60℃反应。TLC监测反应结束后，冷却反应液至室温，加入乙酸乙酯(10mL)稀释，水洗、干燥(无水硫酸钠)、过滤、浓缩，残余物以柱层析分离可以得到产物(29)。

MS(m/z)：536(M+H)。

实施例13

在化合物22(410mg，1.04mmol)、L-丙氨酸异丙酯酯盐酸盐(300mg,2mmol)和PyBOP(1.85g，3mmol)于DMF(30mL)的悬浮液中，室温下慢慢加入和三乙胺(1mL),反应液室温搅拌24小时。加水淬灭反应，减压整除溶剂，残余物溶于乙酸乙酯后，分别用稀盐酸水溶液、碳酸氢钠饱和溶液及盐水洗涤有机相，干燥(硫酸钠)、过滤然后浓缩，残余物以柱层析纯化，以(二氯甲烷：甲醇：三乙胺＝100：5：0.1)为展开剂缓慢梯度淋洗，得到淡黄色泡沫状固体产物(24)。

产物(24)为两种差向异构体(24a)及(24b)的混合物，可以通过制备级薄层层析多次展开而分离，其中(24a)为低极性首先洗脱出来的产物，产物(24)结构中磷手性中心的绝对构型是根据文献(NUCLEOSIDES,NUCLEOTIDES&NUCLEIC ACIDS,2001,20(4–7),621)数据推断得到，两种差向异构体的大量分离可采用制备级手性柱柱层析方法实现。

24a:¹H NMR(CDCl₃)δ8.34(s,1H),7.92(s,1H),7.10-7.30(m,4H),5.80(s,2H),4.94-5.08(m,3H),4.30(dd,1H),3.80-4.14(m,4H),3.47-3.63(m,2H),2.32(s,3H),1.19-1.41(m,12H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ23.9；MS(m/z)505(M+H)。

24b:¹H NMR(CDCl₃)δ8.33(s,1H),7.93(s,1H),7.10-7.32(m,4H),5.85(s,2H),4.90-5.05(m,3H),4.40(dd,1H),3.84-4.15(m,3H),3.55-3.63(m,1H),3.17-3.33(m,2H),2.34(s,3H),1.14-1.40(m,12H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ24.7；MS(m/z)505(M+H)。

实施例14

将化合物(24)(25mg,0.05mmol)溶于1mL乙腈中，加入富马酸(5 mg，0.9eq)，加热回流30分钟得到澄清溶液，降温至45-50℃之间后趁热过滤，滤液冷却至室温后洗出白色固体，滤除溶剂，滤饼以冷乙腈洗涤，得到白色固体产物(30)。

Mp.101-102.5℃；¹H NMR(DMSO-d₆)δ8.13(s,1H),8.08(s,1H),7.17-7.31(m,6H),6.63(s,2H),5.23-5.26(m,1H),4.82-4.92(m,3H),4.16-4.23(m,2H),3.92-3.95(m,1H),3.72-3.85(m,3H),2.27(s,1.5H),2.26(s,1.5H),1.02-1.22(m,12H)；³¹P NMR(DMSO-d₆)δ24.5,24.3。

实施例15

将化合物(24b，50mg,0.1mmol)溶于无水乙腈(2mL)中，加入富马酸(10mg,0.09mmol)后加热回流1小时，冷却至室温慢慢析出固体，过滤，用0-5℃冷乙腈洗涤滤饼，得到白色粉末固体(30b)。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ8.13(s,1H),8.08(s,1H),7.18-7.30(m,6H),6.60(s,2H),5.20-5.23(m,1H),4.81-4.92(m,3H),4.16-4.25(m,2H),3.94-3.95(m,1H),3.72-3.85(m,3H),2.26(s,3H)，1.02-1.22(m,12H)；³¹P NMR(DMSO-d₆)δ24.5。

实施例16

将化合物(24a，40mg,0.08mmol)溶于无水乙腈(2mL)中，加入富马酸(8mg,0.07mmol)后加热回流1小时，冷却至室温慢慢析出固体，过滤，用0-5℃冷乙腈洗涤滤饼，得到白色粉末固体(30a)。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ8.13(s,1H),8.08(s,1H),7.18-7.32(m,6H),6.63 (s,2H),5.22-5.28(m,1H),4.83-4.92(m,3H),4.13-4.27(m,2H),3.92-3.95(m,1H),3.72-3.85(m,3H),2.27(s,3H),1.02-1.25(m,12H)；³¹P NMR(DMSO-d₆)δ24.3。

实施例17

在氮气保护下，将化合物(21，287mg,1mmol)、2-甲基苄醇(490mg,4mmol)和三乙胺(0.5μL)于DMF(5mL)的混合液在室温下搅拌30分钟，随后加入HATU(950mg,2.5mmol)并使反应液于55-60℃反应3天。TLC监测反应结束后，冷却反应液至室温，加入乙酸乙酯(10mL)稀释，水洗、干燥(无水硫酸钠)、过滤、浓缩，残余物以柱层析分离可以得到泡沫状固体产物(31)。¹H NMR(CD₃Cl)δ8.32(s,1H),7.87(s,1H),7.13-7.29(m,8H),6.32(s,2H),4.92-5.07(m,4H),4.24-4.28(m,1H),4.03-4.09(m,1H),3.83-3.86(m,1H),3.74-3.80(m,1H),3.53-3.59(m,1H),2.29(s,3H),2.28(s,3H),1.13(d,J＝6.2Hz,3H)；³¹P NMR(CD₃Cl)δ21.73。

实施例18

原料(31，500mg,1mmol)溶于乙腈(3mL)中，加入富马酸(100mg,0.9mmol)后回流反应一小时，冷却过滤，得到白色沉淀即为产物(32)。

Mp.108-109℃；¹H NMR(DMSO-d₆)δ8.12(s,1H),8.02(s,1H),7.16-7.27(m,8H),6.63(s,2H),4.92-4.97(m,4H),4.16-4.23(m,2H),3.92-3.95(m,3H),2.25(s,3H),2.23(s,3H),1.04(d,J＝6.2Hz,3H)；³¹PNMR(CD₃Cl)δ22.0。

实施例19(HCV活性)

化合物的抗HCV活性的测试方法参考文献报道(WO2007/027248)在人类肝细胞Huh-7中进行,待测化合物的活性通过带有萤光素酶基因的HCV复制子的复制情况来评估。在此，萤光素酶的信号强度直接对应于病毒RNA的复制量。核苷磷酸酯前药配置成从0.14到300μM等不同浓度的DMSO溶液，然后施加到96-孔板上，随后加入复制子细胞(每孔6000个细胞)。细胞在核苷前药的存在下孵化48小时，然后测量萤光素酶强度。萤光素酶信号的减弱标志着细胞中HCV复制子RNA的减弱，它可以进而用以计算抗病毒活性指标EC₅₀。

经测试，化合物(13)、(15)、(17)和(20)均表现出较好的抗丙肝病毒活性，例如化合物(17)的EC₅₀为1.2μM，在100μM下对PBM、CEM等细胞均无任何毒性。

实施例20(HIV活性)

化合物的抗HIV-1活性的测试方法参考文献报道(Antimicrob.AgentsChemother.,1992,36,2423)在PBM淋巴细胞中进行。核苷磷酸酯前药配置成(20-40mM)的DMSO溶液，然后稀释成一系列不同的浓度后与HIV-1_LAI病毒感染了的PBM细胞共同培养。HIV-1_LAI病毒与PBM细胞数量比MOI＝0.01，DMSO溶剂本身对病毒繁殖没有影响，AZT为参照，抗病毒活性指标EC₅₀根据抑制率-浓度曲线计算而得(Adv.Enzyme Regul.,1984,22,27)。

经测试证实，化合物(22)、(23)、(24)、(26)、(29)、(30)、(30a)、(30b)及(32)均表现出较好的抗艾滋病毒活性，结果见下表。

由上表可见，化合物(30)与其代谢产物PMPA相比，体外抗艾滋病毒活性提高500倍；它相比于目前一线抗艾滋病药物替诺福韦酯TDF，具有更高的抗HIV活性及更低的细胞毒性，说明在T细胞内化合物(30)裂解释放PMPA的能力优于TDF，并且它的代谢产物安全无毒，不似TDF会释放出甲醛；化合物(30)与二代替诺福韦酯TAF相比，具有相似的抗艾滋病活性以及更佳的安全性，已知TAF的代谢会产生带有毒性的苯酚。

实施例21动物实验

将6只健康比格犬,分为3组,每组雌雄各1只。第1组动物服用TDF，第2组服用化合物(24)，第3组服用化合物(30)。所有动物给药前禁食12h,给药剂量均为10mg·kg^-1,分别于给药后0、2、4、8和24小时由前肢静脉采血2mL，离心分离出外周血单核细胞(PBM)，PBM细胞内PMPA的定量测定采用HPLC-MS方法(Clin.Chem,1992,480-485)。血药浓度数据经DAS2.0软件处理，计算两个药物在PBM细胞内代谢出PMPA的药代参数AUC_0-24。

实验结果发现三组比格犬在口服TDF、(24)与(30)后，PMPA在外周血单核细胞中的AUC_0-24分别为3.8、71和78μg.h/mL，也即口服化合物(24)、(30)后PMB细胞内产生的PMPA量分别超过口服TDF的18倍和20倍，化合物(24)和(30)输送PMPA达淋巴细胞的能力明显高于目前的一线抗艾滋病药TDF。

Claims (11)

1.一种式(IV)所示的化合物或其异构体或可药用盐：

其中，R₁选自卤素、C₁-C₈的直链或支链烷基、C₁-C₈的烷氧基、C₂-C₈的直链或支链烯基和C₂-C₈的直链或支链炔基；

R₂和R₃各自独立地选自苯环、苄基、C₁-C₁₂的直链或支链烷基、C₃-C₆的饱和或不饱和环烷基、C₂-C₈的直链或支链烯基、C₂-C₈的直链或支链炔基；

其中，式(IV)所示的化合物或其异构体不包括以下化合物：

其中，所述异构体包括互变异构体、顺反异构体、构象异构体和光学异构体。

2.根据权利要求1所述的化合物或其异构体或可药用盐，其特征在于，R₁各自独立地选自卤素、C₁-C₈的直链或支链烷基。

3.根据权利要求1或2所述的化合物或其异构体或可药用盐，其特征在于，R₂选自苄基或C₁-C₁₂的直链或支链烷基。

4.根据权利要求1或2所述的化合物或其异构体或可药用盐，其特征在于，R₃选自C₁-C₁₂的直链或支链烷基。

5.根据权利要求1或2所述的化合物或其异构体或可药用盐，其特征在于，所述化合物为：

6.根据权利要1或2所述的化合物或其异构体或可药用盐，其特征在于，所述可药用盐为式(IV)的化合物与无机酸或有机酸形成的盐。

7.根据权利要6所述的化合物或其异构体或可药用盐，其特征在于，所述有机酸为富马酸。

8.一种可药用盐，所述可药用盐选自：

9.一种药物组合物，该药物组合物包含权利要求1至7中任一项所述的化合物或其异构体或可药用盐。

10.权利要求1至7中任一项所述的化合物或其异构体或可药用盐在制备预防和/或治疗由病毒感染引起的疾病的药物；或者在制备预防和/或治疗癌症的药物中的用途。

11.权利要求10所述的用途，其特征在于，所述疾病为由HIV、HBV和HCV病毒感染引起的疾病。