PL170447B1

PL170447B1 - Method of obtaining novel 1 alpha-hydroxyvitamin d4 and novel transition and analog compounds

Info

Publication number: PL170447B1
Application number: PL91294706A
Authority: PL
Inventors: Joyce C Knutson; Charles W Bishop; Robert M Moriarty
Original assignee: Lunar Corp
Priority date: 1990-09-21
Filing date: 1991-09-20
Publication date: 1996-12-31
Also published as: NZ239897A; CA2069084C; HU213471B; NO921955L; EP0503035A4; KR920703487A; CN1130507A; HUT62559A; ZA917553B; HU9201691D0; ES2169023T3; US5488120A; PL294706A1; CN1061220A; DE69132862T2; WO1992005130A1; HU211963A9; KR100231809B1; EP0503035A1; AU650286B2

Abstract

1. Sposób wytwarzania nowej 5, 6 -cis-1a-hydroksywitaminy D 4, znamienny tym, ze obejmuje: a) tosylowanie witaminy D 4 z wytworzeniem tosylanu witaminy D 4; b) solwolize tosylanu witaminy D 4 do 3,5-cyklowitaminy D 4; c) utlenianie 3,5-cyklowitaminy D 4 do 1a-hydroksy-3,5-cyklowitaminy D 4 i d) kolejno solwolize i reakcje Dielsa-Aldera 1a-hydroksy-3,5-cyklowitaminy D 4 i wydzielenie 5, 6 -cis-1a-hydroksy witaminy D 4. ( 1 2 ) OPIS PATENTOWY ( 1 9 ) PL ( 1 1 ) 170447 © B1 (51) intCl6 C07C 401/00 A 61K 31/59 PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowej 5,6-cis-1a-hydroksywitaminy D 4.

Wiadomo, że witamina D odgrywa ważną rolę w regulowaniu metabolizmu wapnia u zwierząt i ludzi, patrz Harrison's Principals of Internal Medicine: część 11, Disorders of Bone and Mineral Metabolism, rozdz. 335, E. Braunwald i wsp. (wyd.). McGraw-Hill, Nowy Jork 1987, str. 1860-1865. Dwie najbardziej znane, użyteczne formy witaminy D stanowią witamina D 3 i witamina D2. Witamina D3 jest syntetyzowana endogennie w skórze zwierząt i człowieka, podczas gdy witamina D 2 jest postacią witaminy D dostarczoną przez rośliny. Witamina D 2 różni się od witaminy D 3 tym, że zawiera podwójne wiązanie między C22 i C23 oraz grupę metylową przy C24. U człowieka i szczurów witamina D 3 i witamina D2 mają równoważną biopotencję.

Witamina D4, znana także jako naświetlony 22,23-dihydroergosterol lub 22,23-dihydrowitamina D2 lub 22,23-dihydroergokalcyferol, różni się od witaminy D 3 tym, że zawiera grupę metylową przy C24. Witaminę D4 po raz pierwszy opisano w 1936 r. Patrz, W. Grab. Z. Physiol. Chem.. 243:63 (1936); F.G. McDonald, J. Biol. Chem.. 14:IVX (1936). Patrz także, A. Windaus i G. Trautmann, Z. Physiol. Chem.. 247:185-188 (1937). W publikacjach tych występowały pewne niezgodności odnośnie poziomu aktywności biologicznej witaminy, sugerujące, że u szczura aktywność witaminy D 4 stanowi 1/3 lub 3/4 aktywności witaminy D4, a u pisklęcia 1/10 lub 1/5 aktywności witaminy D 3.

Bardziej określone badania aktywności biologicznej witaminy D4 przeprowadził DeLuca i wsp. w 1968 r. (DeLuca i wsp., Arch. Biochem. Biophys., 124:122-128 (1968). Autorzy potwierdzili, że witamina D4 jest mniej aktywna niż witamina D 3. DeLuca i wsp., donoszą, że według ich badań aktywność witaminy D4 stanowi 2/3 aktywności witaminy D 3 lub witaminy D2 u szczura i 1/5 aktywności witaminy D 3 u pisklęcia.

170 447

DeLuca i wsp. piszą, że od czasu, gdy witamina D 4 była po raz pierwszy opisana przez Windhausa i Trautmanna, jej synteza najwyraźniej jest mało stosowana i komentują, że jest to być może spowodowane faktem, że witamina D4 pozostaje tylko w sferze akademickich zainteresowań.

Zdaniem Zgłaszającego witamina D4 pozostaje tylko w sferze akademickich zainteresowań, bowiem nie są znane Zgłaszającemu żadne dalsze badania nad witaminą D4 od czasu doniesień DeLuca i wsp. Faktycznie w The Merck Index stwierdzono odnośnie witaminy D4, że jej biologiczna aktywność wydaje się wątpliwa. Merck Index. S Budawari (wyd.), wyd. 11 -te, Merck a. Co., Rahway, N.J. (1989) str. 1579#9930.

Od czasu, gdy DeLuca i wsp., odkryli aktywną postać witaminy D 3, 1,25-dihydroksywitaminę D 3 (patent Stanów Zjedn. Ameryki nr 3 697 559) i jej syntetyczny prekursor, la-hydroksywitaminę D 3 (patent Stanów Zjedn. Ameryki nr 3 741 996) największe zainteresowanie skoncentrowało się na leczniczym wykorzystaniu tych aktywnych metabolitów witaminy D 3. Niestety, chociaż metabolity witaminy D3 były wielce obiecujące jako środki terapeutyczne, nigdy nie zostały w pełni wykorzystane z powodu ich wyjątkowo wysokiej toksyczności. Np. toksyczność ogranicza skuteczność witaminy D 3, jej aktywnych postaci i analogów, w zapobieganiu ubytkom kości lub odnowieniu ubytków kostnych.

Wiele badań wskazuje, że przy dawkach wymaganych dla zapewnienia skuteczności tych środków w zapobieganiu ubytkom kości lub w odnowieniu ubytków, w hiperkalcemii i nadmiernym wydalaniu wapnia z moczem występują problemy.

Donoszono, że 1 α-hydroksywitamina D 3 w dziennej dawce 2 ^g/dzień (która, jak okazało się w pewnych badaniach, jest skuteczna w zapobieganiu ubytkom kości) powoduje toksyczność u około 67% pacjentów. Istnieje zatem potrzeba biologicznie silnie działającego metabolitu witaminy D o niskiej toksyczności, tak by lek praktycznie był środkiem terapeutycznym.

Nowy związek wytwarzany sposobem według wynalazku, 5,6-cis-1a-hydroksywitamina D4 oraz biologiczne produkty jej metabolizmu są bioaktywnymi postaciami witaminy D4. Twórcy niniejszego wynalazku odkryli, że te aktywne postacie witaminy D 4 mają dużo większą biopotencję niż była do przewidzenia na podstawie uprzednio opisywanych testów biologicznych z witaminą D4. Odkryli także, że bioaktywne nowe związki są mniej toksyczne niż było to do przewidzenia na podstawie ich biopotencji. Taka kombinacja wysokiej aktywności z niską toksycznością sprawia, że związki te są użyteczne jako środki terapeutyczne w leczeniu zaburzeń metabolizmu wapnia.

Nowy związek wytwarzany sposobem według wynalazku stosuje się jako związek aktywny w kompozycjach farmaceutycznych przeznaczonych do leczenia chorób wywołanych nieprawidłowym metabolizmem wapnia.

Badanie nowego związku wymagało prowadzenia prac nad procesami jego wytwarzania. Podczas syntezy α-hydroksywitaminy D4 wytworzono także nowe związki przejściowe. 1,25dihydroksywitaminę D4 i 1,24-dihydroksywitaminę D4 wyizolowano jako biologiczne produkty metabolizmu 1a-hydroksywitaminy D4.

Inne zalety i pełniejsza ocena konkretnych adaptacji, odmian kompozycyjnych, fizycznych i chemicznych cech niniejszego wynalazku będą widoczne po przeanalizowaniu następującego szczegółowego opisu wynalazku łącznie z towarzyszącymi rysunkami.

Figura 1 ilustruje preparatywne etapy syntezy witaminy D4, a Figura 2 ilustruje preparaty wne etapy syntezy 1a-hydroksywitaminy D4, w której jako związek wyjściowy stosuje się witaminę D 4.

Stosowane tu terminy aktywność bilogiczna lub biologicznie aktywny należy rozumieć jako odnoszące się do właściwości biochemicznych związków, takich jak wywieranie wpływu na metabolizm, np. oddziaływanie na stężenie wapnia w surowicy lub wiązanie się z odpowiednim białkiem receptorowym, np. wiązanie się z białkiem receptora witaminy D.

170 447

Sposobem według wynalazku wytwarza się związek o wzorze (I)

w którym Rxi R2 oznaczają H.

Sposób według wynalazku obejmuje następujące etapy:

a) tosylowanie witaminy D4 z wytworzeniem tosylanu witaminy D4;

b) solwolizę tosylanu witaminy D4 do 3,5-cyklowitaminy D4;

c) utlenianie 3,5-cyklowitaminy D4 do 1a-hydroksy-3, 5-cyklowitaminy D4 i

d) kolejno solwolizę i reakcję Dielsa-Aldera 1 a-hydroksy-3,5-cyklowitaminy D4 z wytworzeniem 1a-hydroksywi tarniny D4 i wydzielenie 5,6-cis-1 α-hydroksywitaminy D4.

Schemat na fig. 1 przedstawia syntezę witaminy D4, którą stosuje się jako związek wyjściowy w sposobie według wynalazku.

Jako związek wyjściowy w syntezie według fig. 1 stosuje się ergosterol. Ergosterol poddaje się nasyceniu w bocznym łańcuchu w 6-etapowym procesie i otrzymuje się 22,23-dihydroergosterol (VIII), stosując procedurę podobną do procedury Bartona i wsp., JCS Perkin I, 1976, 821-826.

Następnie 22,33-dihydroergosterol naświetla się jak opisał Windaus i wsp., Z. Psysiol. Chem., 1937, 147:185 i otrzymuje się witaminę D4 [22,23-dihydrokalcyferol] (IX). Jak widać na fig. 2, witaminę D4 następnie hydroksyluje się w 4-etapowym procesie i uzyskuje się 1a-hydroksywitaminę D4, stosując procedurę podobną do opisanej przez Paarena i wsp., J. Org. Chem. 1980, 45:3253.

Bardziej szczegółowo, ergosterol acetyluje się do 3P-octanu. Octan ergosterolu poddaje się hydroksychlorocowaniu przy podwójnym wiązaniu 5,6 z wytworzeniem pochodnej 6 a-chloro-5o^-hydroksylowej. Tę chlorohydrynę redukuje się i ponownie acetyluje do pochodnej 5ahydroksylowej (tzn. do 5a-olu). 5a-ol poddaje się uwodornieniu w celu nasycenia bocznego łańcucha. Wytworzony 3e-acetoksyergost-7-en-5a-ol redukuje się do octanu 22,23-dehydroergosterolu. Następnie 22,23-dehydroergosterol naświetla się w celu wytworzenia witaminy D4. Witaminę D 4 tosyluje się i uzyskuje się 3P-tosylowitaminę D 4. Następnie przeprowadza się solwolizę tosylanu i otrzymuje się 6-metoksy-3,5-cyklowitaminę D 4. Cyklowitaminę D4 poddaje się allilowemu utlenianiu i wytwarza się 1a-hydroksylową pochodną cyklowitaminy. ^-hydroksylową pochodną poddaje się kolejno solwolizie i reakcji typu Dielsa-Aldera, która usuwa grupę 5-metoksylową i oddziela się 5,6-cis-1 α-hydroksy witaminę D 4 od 5,6-trans-1a-hydroksywitaminy D4.

170 447

Etap a) w sposobie według wynalazku korzystnie przeprowadza się przez reakcję witaminy D 4 z chlorkiem toluenosulfonylu w obecności suchej pirydyny.

W etapie b) korzystnie tosylan witaminy D4 poddaje się buforowanej solwolizie.

W etapie c) korzystnie 3,5-cyklowitaminę D4 poddaje się allilowemu utlenianiu dwutlenku selenu.

Natomiast etap d) korzystnie obejmuje solwolizę 1a-hydroksycyklowitaminy D4 za pomocą mieszaniny sulfotlenku dimetylu i kwasu organicznego z wytworzeniem mieszaniny 5,6-cisila-hydroksy- i 5,6-trans-ia-hydroksywitaminy D 4 i reakcję Dielsa Aldera wytworzonej mieszaniny, w której wytwarza się addukt 5,6-trans ia-hydroksywitaminy D4 i oddzielnie wytworzonej 5,6-cis-ia-hydroksywitaminy D 4.

1,24-dihydroksywitamina D4 i 1,25-dihydroksywitamina D4 - metabolity ia-hydroksywitaminy D4, syntetyzuje się przez inkubowanie pochodnych ia-hydroksylowych z ludzkimi komórkami wątroby, hodowanie komórek i odzyskiwanie 1,24-dihydroksy- lub 1,25dihydroksywitaminy D4. Stosując testy na wiązanie witaminy D z białkiem receptorowym stwierdzono, że metabolity te są biologicznie aktywne.

Stwierdzono, że związek o wzorze (I) ma cenną aktywność farmakologiczną, mianowicie jako środek regulujący metabolizm wapnia, zwłaszcza stężenie wapnia w surowicy. Mianowicie, związek o wzorze (I) zwiększa stężenie wapnia w surowicy u szczurów z niedoborem witaminy D. Stwierdzono także, że związek o wzorze (I) ma niską toksyczność, co polepsza jego właściwości farmaceutyczne. Toksyczność związku o wzorze (I) zmierzona w teście LD 50 jest podobna do toksyczności odpowiadających związków witaminy D2 i niższa od toksyczności odpowiadających związków witaminy D3. Zatem, związek wytworzony sposobem według wynalazku nadaje się do stosowania w różnych klinicznych i weterynaryjnych przypadkach, a szczególnie jest użyteczny w leczeniu nieprawidłowego metabolizmu wapnia i fosforu.

Wynalazek umożliwia leczenie nieprawidłowego metabolizmu wapnia spowodowanego np. przez niewydolność wątroby, niewydolność nerek, niewydolność żołądkowo-jelitową itd. Związek o wzorze (I) można stosować profilaktycznie lub leczniczo w chorobach niedoboru witaminy D i w chorobach związanych, np. w osteodystrofii nerkowej, biegunce tłuszczowej, przeciwdrgawkowemu rozmiękczeniu kości, krzywicy fosfatemicznej witamino-D-opomej, w osteoporozie, w tym osteoporozie pomenopauzalnej, osteoporozie starczej, osteoporozie indukowanej steroidami i w innych stanach chorobowych charakteryzujących się ubytkiem masy kostnej, w krzywicy z rzekomym niedoborem (zależnej od witaminy D), krzywicy związanej z odżywianiem i krzywicy związanej ze złym wchłanianiem pokarmu, we wtórnym rozmiękczeniu kości i osteopenii związanej z niedoczynnością przytarczyc, w pooperacyjnej niedoczynności przytarczyc, w samoistnej niedoczynności przytarczyc, rzekomej niedoczynności przytarczyc i w alkoholizmie.

Związek o wzorze (I), a korzystnie jego metabolit, taki jak 1,24-dihydroksywitamina D4, jest cenny w leczeniu chorób skóry związanych z nadmierną proliferacją, takich jak łuszczyca.

Związek o wzorze (I) jest użyteczny jako związek aktywny w kompozycjach farmaceutycznych, które wykazują zmniejszone działanie uboczne i niską toksyczność w porównaniu ze znanymi analogami aktywnych postaci witaminy D3, w zastosowaniu np. w chorobach wywołanych przez nieprawidłowy metabolizm wapnia.

Farmakologicznie aktywny związek wytwarzany sposobem według wynalazku można przeprowadzać konwencjonalnymi metodami stosowanymi w farmacji, w środki lecznicze przeznaczone do podawania pacjentom, np. ssakom łącznie z ludźmi. Na przykład, związki o wzorze (I) można stosować w mieszaninach z konwencjonalnymi zarobkami, np. z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami odpowiednimi do stosowania dojelitowego (np. doustnego), pozajelitowego lub miejscowego, które nie reagują ze związkami aktywnymi w sposób szkodliwy.

Odpowiednie farmaceutycznie dopuszczalne nośniki obejmują, ale nie są do nich ograniczone, wodę, roztwory soli, alkohole, gumę arabską, oleje roślinne (np. olej kukurydziany, olej bawełniany, olej arachidowy, olej z oliwek, olej kokosowy), tran rybi, estry oleiste, takie jak Polysorbat 80, glikole polietylenowe, żelatynę, węglowodory (np. laktozę, amylozę lub skrobię), stearynian magnezu, talk, kwas krzemowy, gęstopłynną parafinę, monoglicerydy i diglicerydy

170 447 kwasów tłuszczowych, estry kwasów tłuszczowych i pentaerytrytu, hydroksymetyloceluloza, poliwinylopirolidon itp.

Preparaty farmaceutyczne mogą być wyjałowione i, razie potrzeby, mogą być mieszane ze środkami pomocniczymi, np. z substancjami smarującymi, konserwującymi, ze stabilizatorami, środkami zwilżającymi, emulgatorami, z solami wpływającymi na ciśnienie osmotyczne, z buforami, środkami barwiącymi, smakowo-zapachowymi i/lub z jednym lub więcej innymi związkami aktywnymi, np. z witaminą D 3 lub D2 i ich 1a-hydroksylowymi metabolitami, ze sprzężonymi estrogenami i ich równoważnikami, z antyestrogenami, kalcytoniną, bisfosfonianami, z dodatkami wapniowymi, kobalominą, toksyną krztuśćcową i z borem.

Do podawania pozajelitowego szczególnie odpowiednie są jałowe roztwory do wstrzyknięć, korzystnie roztwór olejowy lub wodny, jak również zawiesiny, emulsje lub wszczepy, a także czopki. Dogodną postacią użytkową są ampułki.

Do podawania dojelitowego szczególnie odpowiednie są tabletki, drażetki, ciecze, krople, czopki, pastylki do ssania, proszki lub kapsułki. Jeśli wskazany jest nośnik o słodkim smaku, można stosować syrop, eliksir lub postać podobną.

Można także wytwarzać kompozycje o przedłużonym lub bezpośrednim uwalnianiu, np. z liposomami lub takie, w których związek aktywny jest chroniony za pomocą degradujących się w sposób zróżnicowany powłok, np. przez mikrokapsułkowanie, wielokrotne powlekanie itd.

Miejscowo można stosować odpowiednie nie nadające się do rozpylania, lepkie, półstałe lub stałe postacie, które obejmują nośnik odpowiadający stosowaniu miejscowemu, o lepkości dynamicznej korzystnie większej od lepkości wody. Odpowiednie formulacje obejmują, nie ograniczając się do nich, roztwory, zawiesiny, emulsje, kremy, maści, zasypki, mazidła, balsamy, aerozole, plastry przezskórne itd., które, jeśli potrzeba, są wyjałowione lub mieszane ze środkami pomocniczymi, np. ze środkami konserwującymi, stabilizatorami, demulgatorami, środkami zwilżającymi itd.

Do podawania doodbytniczo związek formułuje się w kompozycję farmaceutyczną zawierającą podłoże czopkowe, takie jak olej kakaowy lub inne triglicerydy. W celu przedłużenia okresu przechowywania kompozycja korzystnie zawiera przeciwutleniacz taki jak kwas askorbinowy, butylowany hydroksyanizol lub hydrochinon.

Korzystnie kompozycje farmaceutyczne podaje się doustnie. Na ogół związek wytwarzany sposobem według wynalazku przygotowuje się w postaci użytkowej zawierającej około 0,5 pg do około 25 pg związku w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku na dawkę jednostkową. Dawka związku zwykle wynosi około 0,01 do około 0,5 pg/kg/dzień, korzystnie około 0,04 do około 0,03 pg/kg/dzień.

Oczywiście, faktyczne korzystne ilości związku aktywnego w konkretnym przypadku będą zmieniać się w zależności od skuteczności konkretnego stosowanego związku, konkretnej postaci kompozycji, sposobu stosowania, konkretnego leczonego miejsca i organizmu. Np. konkretna dawka dla danego pacjenta zależy od wieku, masy ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci, diety, czasu i sposobu podawania, od szybkości wydalania i od leków stosowanych w kombinacji, a także od powagi danego zaburzenia, w przypadku którego stosuje się terapię. Dawki dla danego pacjenta można określić w sposób konwencjonalny, np. przez zwykłe porównanie aktywności różnicowych danych związków i znanego środka, np. za pomocą odpowiedniego konwencjonalnego protokołu farmakologicznego.

Związek wytwarzany sposobem według wynalazku można także korzystnie stosować w kompozycjach weterynaryjnych, np. w kompozycjach do karmienia zwierząt domowych w celu leczenia lub zapobiegania hipokalcemii. Zwykle związek wytwarzany sposobem według wynalazku wprowadza się do paszy dla zwierząt w takiej ilości, że normalne spożycie takiej paszy dostarcza zwierzęciu około 0,01 do 0,5 (tg związku/kg/dzień.

Następujące przykłady podane są jedynie w celu ilustracji i nie ograniczają wynalazku. W przykładach wszystkie temperatury są podane w stopniach Celsjusza, jeśli nie wskazano inaczej, wszystkie części i procenty są wagowe. Widma protonowego magnetycznego rezonansu jądrowego ( Ή NMR) uzyskano w aparacie IBM Sy-200 (200 MHz) i Bruker Am-400 (400 MHz) z komputerem 3000 w roztworze CDCb z CHCl3 jako wzorcem wewnętrznym. Widma w podczerwieni zarejestrowano z przekształceniem Fouriera (FTIR) stosując próbki w postaci

170 447 tabletek z bromkiem potasu (KBr) lub w postaci cieczy. Widma masowe zarejestrowano za pomocą spektrometru mas Finnigan MAT-90 przy 20 eV/CI. Temperatury topnienia oznaczono w aparatach typu Hoover-Thomas (kapilarny) Uni-Melt i Fisher-Johns (typu cover-slip).

Przykład 1: Synteza 1a-hydroksy witaminy D 4

Ergosterol (II) przeprowadzono w octan ergostrerolu (III) przez rozpuszczenie 100 g (0,25 mola) ergosterolu w 600 ml bezwodnej pirydyny i 68 ml (0,7 mola) bezwodnika octowego. Roztwór mieszano przez noc w temperaturze pokojowej, po czym oziębiono dodając 1,2 1 lodu, co spowodowało wytrącenie się osadu. Wytrącony osad przemyto 5-krotnie 400-mililitrowymi porcjami wody, po czym jeden raz 400 ml CH 3 CN. Wytworzony produkt suszono na powietrzu i otrzymano 79 g (71%) octanu ergosterolu w postaci białego krystalicznego ciała stałego o następującej charakterystyce: Temperatura topnienia (t.t.): 169 - 171°C;

’H NMR: (400 MHz, CDCls), δ ppm 2,05 (3H, s, 3p-CH3CO), 4,65-4,75 (1H, m, 3a-H), 5,15-5,25 (2H, m, 22-H i 23-H), 5,4 (1H, d, 6-H), 5,6 (1H, d, 7-H); FTIR [KBr]: 1734 cm'¹ (C=0 rozciągające) 968 cm⁴ (C-H skręcające).

Octan ergosterolu (III) (26 g, 0,062 M) rozpuszczono w 2,5 1 świeżo destylowanego odtlenionego toluenu. Do tego roztworu dodano pod azotem w -78°C w ciągu 30 minut 9 ml (0,111 mola) chlorku chromylu rozpuszczonego w 240 ml suchego CH2Cl2. Układ reakcyjny mieszano w 78°C przez dalsze 15 minut, po czym jednorazowo dodano 62 ml nasyconego roztworu borowodorku sodu w etanolu. Po mieszaniu w -78°C przez następne 15 minut roztwór reakcyjny przelano do dwufazowego układu 3N kwasu solnego (3 1) i benzenu (3 1). Warstwę organiczną oddzielono, po czym przemyto wodą (2 1), dwukrotnie roztworem solanki (2 x 1 1) i wysuszono za pomocą bezwodnego MgSO 4. Wysuszony roztwór przesączono i zatężono pod próżnią. Surowy produkt krystaliczny potraktowano następnie CH3 CN (280 ml) i po przesączeniu wytworzonej zawiesiny otrzymano 12,5 g (41%) białego krystalicznego 33-acetoksy-6achloroergosta-7,22-dien-5a-olu (IV) o następującej charakterystyce: t.t. 190 - 192°C; ’HNMR (400 MHz, CDCls), δ ppm 2,05 (3H, s, 3P-OAc), 4,65 (1H, d, 6 β-Η), 5,1 (1H, s, 7-H), 5,1-5,3 (2H, m, 22-H i 23-H); FTIR [KBr}; 1732 c'¹ (C=O rozciągające), 968 cm-¹ (C-H skręcające), 3437 cm-1 (O-H rozciągające).

3P-acetoksy-6a-chloroergosta-7,22-dien-5a-ol (IV) (21,4 g, 0,0444 mola) w suchym THF (900 ml) dodano powoli do mieszanej zawiesiny wodorku litowo-glinowego (2,66 g, 0,07 mola) w suchym THF (750 ml) w temperaturze pokojowej pod azotem. Mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 3 godziny i oziębiono do 0°C. Nadmiar wodorku rozłożona za pomocą nasyconego roztworu Na2SO4. Po przesączeniu przez bezwodny Na2SO4 i odparowaniu przesączu uzyskano substancję stałą, którą od razu potraktowano bezwodnikiem octowym (110 ml) i suchą pirydyną (220 ml) w 0°C. Po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano octan (12,75 g, 61%) 3(^-ac^^tt4^k^;^y^ir^(^^,stinn-7,;^'2-dien-5a-ol (V) o następującej charakterystyce: t.t.: 229 - 232°C; FTIR [KDr] 1736 cm^u (C=O rozciągające), 3460 cm⁴(O-H rozciągające), 972 cm- (C-H skręcające).

3P-acetoksyergosta-7,22dien-5a-ol (V) (2,5 g, 0,0055 mola) wytrząsano przez 16 godzin ze świeżo przygotowanym PtO2 (0,5 g) w octanie etylu (820 ml) pod gazowym H2 (15 psi). Odsączono katalizator i po odparowaniu przesączu uzyskano surowy octan, który rozpuszczono w CH 2Cl2 i chromatografowano na żelu krzemionkowym. Po elucji za pomocą CH2O2 otrzymano zasadniczo czysty 3P-acetoksyergost-7-en5a-ol (VI) (2,15 g, 85%) w postaci białej krystalicznej substancji o następującej charakterystyce: t.t.: 228 - 232°C;

’H NMR (400 MHz, CDCls), 5 ppm 2,05 (3H, s, 3 β-OAc), 5,05-5,20 (2H, m, 3a-H i 7-H; FTIR [KBr]: 1736 cm⁴ (C=O rozciągające), 3462 cm⁴ (O-H rozciągające).

Do 3e-acetoksyergost-7-en-5a-olu (VI) (12,0 g, 0,0262 mola) w suchej pirydynie (800 ml) dodano w O°C pod azotem podwójnie destylowany chlorek tionylu (9,7 ml) w suchej pirydynie (170 ml). Po 2,5 godz. roztwór rozcieńczono wodą oziębioną lodem (1,5 1) i ekstrahowano dwiema porcjami eteru (2,5 1 + 1,51). Połączone ekstrakty eterowe przemyto roztworem NaHCO3 (1,01 x 2), następnie IN HCl (1,51 x 2), a potem wodą (11). Roztwór eterowy wysuszono za pomocą MgS O4, i po przesączeniu i odparowaniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano surowy produkt, który przeprowadzono w zawiesinę w CH 3CN (100 ml). Produkt zebrano przez

170 447 odsączenie i rekrystalizowano z CH 3CN i uzyskano 4,5 g (39%) białego krystalicznego octanu 22,23-dihydroergosterylu (VII) o następującej charakterystyce: t.t.: 144 - 147°C;

'Η NMR (400 MHz, CDCb), 5 ppm 2,05 (3H, s, 3P-OAc), 4,65-4,75 (1H, m, 3a-H), 5,4 (1H, d, 6-H), 5,6 (1H, d, 7-H); FTIR [KBr]: 1734 cm'¹ (C=O rozciągające).

Octan 22,23-dihydroergosterylu (VII) (4,8 g, 0,011 mola) dodano od razu do mieszanej zawiesiny wodorku litowo-glinowego (2,5 g, 0,066 mola) w suchym eterze (1,11) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Dodano 5N NaOH, aby rozłożyć nadmiar wodorku litowo-glinowego, po czym dodano wodę (500 ml). Następnie wodny roztwór ekstrahowano czterema 250-mililitrowymi porcjami eteru. Połączone ekstrakty eterowe i połączoną warstwę organiczną przemyto roztworem solanki (1 1), po czym wysuszono za pomocą Na2SO4. Po odparowaniu eteru pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano związek 22,23-dihydroergosterol, (VIII) (4,1 g, 91%) w postaci białej krystalicznej substancji o następującej charakterystyce: t.t.: Χ4Ί - 150°C;

^lH NMR (400 MHz, CDCb), δ ppm 3,6-3,7 (1H,m, 3a-H), 5,4 (1H, d, 6H), 5,6 (1H, d, 7-H); FTIR [KBr]: 3400 cm⁴ (O-H rozciągające).

22,23-dihydroergosterol (VIII) (2,0 g, 5,0 mmoli) rozpuszczono w roztworze eteru etylowego i benzenu (4:1, 600 ml) i naświetlono (lampa nurkowa Hannovia, 450 W), mieszając pod azotem w naczyniu kwarcowym chłodzonym wodą przez 3 godziny. Roztwór zatężono pod próżnią i uzyskano lepką substancję, którą rozpuszczono w 100 ml etanolu i ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w atmosferze argonu przez 8 godzin. Następnie roztwór zatężono pod próżnią, a pozostałość zaadsorbowano w kolumnie z żelem krzemionkowym i eluowano 30% octanem etylu w heksanie. Otrzymano witaminę D4 (22,23-dihydroergokalcyferol) (IX) z wydajnością 1,2 g (60%) o następującej charakterystyce:

-H NMR (400 MHz, CDCb), δ ppm 0,55 (3H, s, 18-H3) 0,78 (6H, dd, 26-H3 i 27-H₃), 0,87 (3H,d, 21-H3) 0,93 (3H, d, 28-H3), 3,94 (1H, m, 3-H), 4,82 (1H, m, ostry, 19-H), 5,04 (1H, m (ostry), 19-H), 6,04 (1H, d, 7-H), 6,24 (1H, d, 6-H).

Do mieszanego roztworu witaminy D4 (IX) (3,0 g, 7,5 mmoli) w 10 ml suchej pirydyny dodano świeżo rekrystalizowanego chlorku toluenosulfonylu (3,6 g, 19 mmoli) w 0°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 5°C w ciągu 24 godzin, po czym szybko przerwano reakcję przez wylanie mieszaniny na lód i nasycony NaHCO3 (100 ml) i mieszaninie.

Wodną zawiesinę ekstrahowano CH2Ck (3 x 300 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto 10% HCl (3 x 200 ml), nasyconym NaHCO3 (3 x 200 ml) i nasyconym NaCl (2 x 200 ml), wysuszono nad MgSO4 i zatężono pod próżnią uzyskując 3,5 g (84%) nowego związku przejściowego, tosylanu witaminy D4 (X) o następującej charakterystyce:

*H NMR (400 MHz, CDCb), 8 ppm 0,54 (3H, s, 18-H3), 0,78 (6H, dd, 26-H3 i 27-H3) 0,87 (3H, d, 21-H3), 0,96 (3H, d, 28-H3), 2,45 (3H, s, CH3 (tosylan)) 4,68 (3H, m, 3-H), 4,82 (1H, m (ostry), 19-H) 5,04 (1H, m, (ostry), 19-H), 5,95 (1H, d, 7-H), 6,09 (1H, d, 6-H), 7,34 i 7,79 (4H, d, aromatyczny).

Do mieszanej zawiesiny NaHCO3 (17,0 g, 202 mmole) w metanolu (200 ml) wkroplono roztwór tosylanu witaminy D4 (X) (3,5 g, 6,3 mmoli) w suchym CH2Ck (10 ml). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w atmosferze argonu przez noc, po czym oziębiono do temperatury pokojowej i zatężono pod próżnią do około 50 ml. Koncentrat rozcieńczono eterem (600 ml), przemyto wodą (3 x 300 ml), wysuszono nad MgSO4 i zatężono pod próżnią. Pozostałość przepuszczono przez kolumnę z żelem krzemionkowym i eluowano 10% octanem etylu w heksanie i otrzymano nowy związek przejściowy, 3,5-cyklowitaminę D4 (XI) (olej ciężki) w ilości 1,5 g (58%) o następującej charakterystyce:

‘H NMR (400 MHz, CDCls), δ ppm 0,56 (3H, s, 18-H3) 0,78 (6H, dd,26-H3 i 27-H₃), 0,87 (3H, d, 21-H3) 0,94 (3H, d, 28-H3), 3,28 (3H, s, OCH3), 4,2 (1H, d, 6-H), 4,91 (1H, m (ostry), 19-H), 4,98 (1H, d, 7-H), 5,08 (1H, m (ostry), 19-H).

Do zawiesiny dwutlenku selenu (0,22 g, 2 mmole) w suchym CH 2Cb (150 ml) mieszanej w kolbie trójszyjnej dodano bezwodny wodoronadtlenek t-butylu w toulenie (3M) (2,6 ml, 7,8 mmoli). Mieszaninę mieszano przez 3 godziny pod argonem. Następnie dodano pirydynę (0,3 ml, 3,7 mmoli), po czym wprowadzono cyklowitaminę D 4 (XI) (1,5 g, 3,6 mmoli) w postaci roztworu w CH2O2 (50 ml). Po mieszaniu przez 30 minut dodano 10% wodny roztwór NaOH

170 447 (200 ml). Mieszaninę reakcyjną następnie rozcieńczono eterem (500 ml) i rozdzielono fazy. Fazę organiczną przemyto I0%o NaOH (3 x 200 ml), wodą (2 x 200 ml) i nasyconym roztworem NaCl (2 x 200 ml), wysuszono nad MgSO4 i zatężono pod próżnią. Pozostałość zaabsorbowano w kolumnie z żelem krzemionkowym i eluowano 30% octanem etylu w heksanie i uzyskano 0,45 g (29%) nowego związku przejściowego, la-hydroksy-3,5-cyklowitaminę D4 (XII) (olej) o następującej charakterystyce:

H NMR (400 MHz, CDCb), δ ppm 0,54 (3H, s, 18-H3) 0,78 (6H, dd, 26-H3 i 27-¾) 0,86 (3H, d, 21-H3), 0,95 (3H, d, 28-H3), 3,26 (3H, s, OCH3) 4,2 (1H, d, 6-H), 4,22 (1H, m, 1-H), 4,95 (1H, d, 7-H), 5,18 (1H, dd, 19-H), 5,25 (1H, d, 19-H).

Roztwór 1a-hydroksy-3,5-cyklowitaminy D4 (XII) (0,45 g, 1,05 mmola) w roztworze sulfotlenku dimetylu (4,5 ml) i lodowatego kwasu octowego (3,6 ml) ogrzewano do 50°C pod argonem w ciągu 1 godziny. Następnie mieszaninę reakcyjną przelano przez lód i nasycony roztwór NaHCO3 (100 ml) i estrahowano eterem (3 x 200 ml). Połączone ekstrakty eterowe przemyto nasyconym roztworem NaCl (3 x 200 ml), wysuszono nad MgSO4, zatężono pod próżnią i uzyskano mieszaninę zawierającą 5,6-cis i 5,6-trans 1a-hydroksywitaminę D 4 (około 4:1, metodą Ή NMR) z wydajnością 0,4 g (92%). Mieszaninę 5,6-cis i 5,6-trans 1a-hydroksywitaminy D4 (0,4 g, 0,97 mmola) rozpuszczono w octanie etylu (25 ml) i dodano świeżo rekrystalizowany bezwodnik maleinowy (0,08 g, 0,8 mmola). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano do 35°C pod argonem przez 24 godziny. Po odparowaniu rozpuszczalnika pod próżnią surową mieszaninę chromatografowano w kolumnie z żelem krzemionkowym stosując jako eluent octan etylu i heksan (1:1) i otrzymano nową aktywną postać witaminy D4, 5,6-cis 1 α-hydiOksy witaminę D 4 (XIII) z wydajnością 90 mg (23%) o następującej charakterystyce: t.t. 128 - Ó0°C; IR v_max (czysty): 3400 cm'¹ (OH-rozciągające);

Ή NMR (400 MHz, CDCb), 5 ppm 0,55 (3H, s, 18-H), 0,79 (6H, dd, 26-¾ i 27-¾) 0,87 (3H, d, 21-H3) 0,94 (3H, d, 28-H3), 4,24 (1H, m, 3-H), 4,44 (1H, m, 1-H), 5,02 (1H, n, (ostry), 19-H), 5,34 (1H, m (ostry), 18-H), 6,02 (1H, d, 7-H), 6,4 (1H, d, 6-H); Widmo masowe [Ci] m/e (intensywność względna): 415 (M+1,41%) 397 (M+1-OH 100%), 379 (27%), 135 (22%).

Przykład 2: Próba biologiczna na 1a-hydroksywitaminę D4

Młode świeżo odstawione od matki szczury samce (szczep Holtzman, Holtzman Company, Madison, Wisconsin) karmiono dietą z brakiem witaminy D zawierającą odpowiednio wapń (0,47%) i fosfor (0,3%). W ciągu 3-4 tygodnia dieta taka spowodowała wyjątkowy niedobór witaminy D charakteryzujący się niskim poziomem wapnia w surowicy i słabym wzrostem. Po 4 tygodniach na takiej diecie zawartość wapnia w surowicy spadła poniżej 7 mg/dl. Następnie szczury rozdzielono na 4 grupy i doustnie podawano bi-hydroksywitaminę D4 w nośniku takim jak olej kokosowy lub sam nośnik (próba kontrolna) codziennie przez 14 dni. Po 24 godzinach od ostatniej dawki szczury zabito i zmierzono poziom wapnia we krwi standardową techniką laboratoryjną. Wyniki tych oznaczeń są przedstawione w tabeli 1.

Tabela 1

Wzrost slęzema wapnia w surowicy

Związek	Dawka (pg/kg/dzień)	Liczba szczurów	Stężenie wapnia w surowicy (mg/dl) ±Standardowe odchylenie
Próba kontrolna	-	10	6,1± 0,48
1 -OH-D4	0,042	8	7,1±0,80
1 -OH-D4	0,250	7	11,60 ±0,45
1-OH-D4	1,500	9	12,7 ±0,37

Dane w tabeli 1 wskazują, że 1a-hydroksywitamina D4 jest skuteczna w zwiększeniu poziomu wapnia w surowicy u szczurów z niedoborem witaminy D oraz że odpowiedź jest zależna od dawki. Nieoczekiwanie, poziom odpowiedzi jest korzystny w porównaniu z odpowiedzią, o której donosił Wientroub i wsp. dla 1,25-dihydroksywitaminy D 3 podawanej szczu10

170 447 rom z niedoborem witaminy D w warunkach doświadczalnych podobnych do opisanych powyżej. Patrz, S. Wientroub, P.A. Price, A.H. Raddi, The Dichotomy in the Effects of 1,25 dihydroxy vitamin D3 and 24,25 dihydroxy vitamin D 3 on Bone Gamma-Carboxyglutamic Acid-Containing Protein in Serum Bone in vitamin D-DeficientRats, Calcif. Tissue Int. (1987) 40:166-172.

Przykład 3: Testy na toksyczność

Ostrą toksyczność doustną ia-OH-Dp u szczurów oceniono przez oznaczenie średniej dawki śmiertelnej (LD50) stosując dobrze znaną metodę. Szczury karmiono standardową dietą laboratoryjną przez 8-10 tygodni. Pięciu zwierzętom każdej płci podano jedną doustną dawkę 1a-OH-D4. Zwierzęta obserwowano przez 14 dni 1 zanotowano liczbę zwierząt padłych. Oznaczona wartość LD 50 wynosiła około 1,0 mg/kg dla samców i 3,0 mg/kg dla samic.

Dla porównania wartość LD50 dla ła-hydroksywitaminy D2 w tych samych warunkach znaleziona przez twórców wynosi 1,7 i 1,8 mg/kg dla samców i samic szczurów, odpowiednio. Uprzednio donoszono, ze toksyczność 1 (χ-hydroksywitaminy D 2 jest mniejsza niz 1 a-hydroksywitaminy D3. G. Sjoden, C. Smith, U. Lindgren 1 H. F. DeLuca, Proc. Soc. Experimental Biol. Med.. 178-432-436 (1985).

Przykład 4: Wytwarzanie i wyodrębnianie 1,25-dihydroksy witaminy D4

-α-hydroksywitaminę D4 wytworzoną sposobem według niniejszego wynalazku inkubuje się z ludzkimi komórkami wątroby w hodowli, które metabolizują związek do kilku produktów, w tym do metabolitu -1,25-dihydroksywitaminy D4. Metabolit 1,25 wyodrębnia się i oczyszcza metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej 1 identyfikuje się metodą chromatografii gazowej 1 spektrometrii mas. Badania nad wiązaniem wykazują, że 1,25-dihydroksywitamina D 4 ma dobre powinowactwo do wiązania się z białkiem receptora witaminy D u ssaków, co wskazuje na jej biologiczną aktywność. Stosowane procedury są podobne do opisanych przez Strugnella i wsp., Biochem. Pharm. vol. 40:333-341 (1990).

Przykład 5: Wytwarzanie i wyodrębnianie 1.24-dihydroksywitaminy D4

Wytwarzanie 1 wyodrębnianie 1,24-dihydroksywitaminy D 4 przeprowadza się jak opisano powyżej w przykładzie 4. 1a-hydroksywitaminę D4 wytworzoną sposobem według niniejszego wynalazku inkubuje się z ludzkimi komórkami wątroby w hodowli, które metabolizują związek do kilku produktów obejmujących metabolit 1,24-dihydroksywitaminę D4. Metabolit 1,24 wyodrębnia się 1 oczyszcza metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i identyfikuje się metodą chromatografii gazowej i spektrometrii mas. Badania nad wiązaniem z nowym metabolitem wykazują, że metabolit ma dobre powinowactwo do wiązania się z białkiem receptora witaminy D u ssaków, co wskazuje, że lek jest biologicznie aktywny.

Przykład 6: Badanie hiperkalcemii

Samice szczurów karmiono handlową dietą zawierającą wapń (0,8%) i fosfor (0,6%). Szczury podzielono na 4 grupy i każdej grupie podawano doustnie codziennie przez 13 tygodni 1a-OH D4 w nośniku takim jak olej kokosowy albo sam nośnik (kontrola). Po 24 godzinach od ostatniej dawki szczury zabito i oznaczono poziom wapnia w surowicy standardową metodą.

Ta procedura wykazuje brak wpływu na stężenie wapnia w surowicy lub tylko nieznaczny jego wzrost w dawkach 1a—OH-D4 do 2,5 pg/kg/dzień.

Przykład 7: Dalsze badania biologiczne

Młode świeżo odstawione od matki samce szczurów karmi się dietą z niedoborem witaminy D i niską zawartością wapnia (0,02%). Po upływie 4 tygodni szczury podzielono na 4 grupy i dożylnie podano im 1a-OH D4 w nośniku takim jak etanol lub sam nośnik (kontrola). Po 16 godzinach od podania szczury zabito i zmierzono jelitowy transport wapnia wykorzystując wywrócone woreczki dwunastnicze, według metody Martina i DeLuca Am. J. Phvsiol.. 216:1352-1359.

Postępując według tej procedury wykazuje się stymulację jelitowego transportu wapnia w sposób zalezny od dawki.

Przykład 8: Prowadzi się badanie kliniczne z pacjentami dochodzącymi z osteoporozą pomenopauzalną, w wieku 55-75 lat. Badanie obejmuje do 120 pacjentek losowo podzielonych na trzy leczone grupy i prowadzi się je przez 12-24 miesięcy. Dwie z grup leczonych otrzymują stałe dawki 1 -witaminy D4 (u.i.d.; dwa różne poziomy dawek powyżej 3,0 pg/dzień), a pozostała

170 447 grupa otrzymuje odpowiednie placebo. Wszyscy pacjenci otrzymują normalną dawkę wapnia w pożywieniu (50θ do 800 mg/dzień) i nie przyjmują dodatków wapniowych. Skuteczność ocenia się porównując grupy pacjentek przed i po leczeniu pod względem (a) gęstości mineralizacji kości w całym organizmie, kości promiennych, udowych i kręgowych oznaczonej metodą absorpcjometrii promieni Roentgena (DRXA), (b) biopsji kości grzebienia biodrowego i (c) poziomu osteokalcyny w surowicy. Bezpieczeństwo ocenia się przez porównanie wydalania z moczem hydroksyproliny, poziomów wapnia w surowicy i moczu, klirensu kreatyniny, azotu mocznikowego we krwi i innych rutynowych oznaczeń.

Badanie to wykazuje, że pacjentki leczone 1 α-witaminą D 4 mają znacznie wyższe gęstości kości w całym organizmie, kości promieniowych, udowych i/lub kręgowych w stosunku do pacjentek, którym podawano placebo. Leczone pacjentki wykazują także znacznie zwiększony poziom osteokalcyny w surowicy. Biopsja kości u leczonych pacjentek wykazuje, że 1 ^-witamina D4 stymuluje prawidłowe tworzenie się kości. Monitorowane parametry bezpieczeństwa potwierdzają nieznaczne występowanie hiperkalcemii lub nadmierne wydalanie wapnia z moczem lub inne zaburzenia metaboliczne związane z terapią 1 «-witaminą D4.

Przykład 9: Badania kliniczne prowadzi się ze zdrowymi kobietami po menopauzie w wieku 55-60 lat. Badaniem obejmuje się do 80 pacjentek losowo podzielonych na dwie leczone grupy i prowadzi się je przez 12-24 miesięcy. Jedna leczona grupa otrzymuje stałą dawkę Ια-witaminy D 4 (u.i.d.;) poziom dawki powyżej 3,0 pg/dzień), a pozostała otrzymuje odpowiednie placebo. Badanie prowadzi się jak wskazano powyżej w przykładzie 2.

Badanie to wykazuje, że pacjentki leczone 1a-witaminą D4 mają zmniejszone ubytki gęstości kości w całym organizmie, kości promieniowych, udowych i/lub kręgowych w stosunku do wartości wzorcowych. W przeciwieństwie do tego, pacjentki traktowane placebo wykazują znaczne ubytki w tych parametrach w stosunku do wartości wzorcowych. Monitorowane parametry bezpieczeństwa potwierdzają bezpieczeństwo długotrwałego podawania 1a-witaminy D4 na tym poziomie dawki.

Przykład 10: Przeprowadzono podwójnie ślepą próbę kliniczną przez 12 miesięcy, kontrolowaną przez placebo z 30 mężczyznami i/lub kobietami z chorobą nerek, którzy poddawani są przewlekłej hemodializie. Wszyscy pacjenci przechodzą 8-tygodniowy okres kontrolny, podczas którego otrzymują podtrzymującą dawkę witaminy D3 (400 IU/dzień). Po tym okresie kontrolnym pacjentów dzieli się losowo na dwie leczone grupy: jedna grupa otrzymuje stałą dawkę 1a-witaminy D 4 (u.i.d.; dawka powyżej 3,0 pg/dzień) a druga grupa otrzymuje odpowiednie placebo. Obydwie leczone grupy otrzymują podtrzymującą dawkę witaminy D 3, utrzymują normalną dawkę wapnia w pożywieniu i nie przyjmują dodatków wapniowych. Skuteczność oceniono przez porównanie dwóch grup pacjentów przed i po leczeniu pod względem a) bezpośrednich pomiarów jelitowej absorpcji wapnia, b) gęstości mineralizacji kości w całym organizmie kości promieniowych, udowych i/lub kręgowych i c) oznaczeń poziomu wapnia i osteoklacyny w surowicy. Bezpieczeństwo ocenia się przez regularne odczytywanie poziomu wapnia w surowicy.

Analiza danych klinicznych wykazuje, że 1a-witamina D 4 znacznie zwiększa poziom osteokalcyny w surowicy i jelitową absorpcję wapnia, jak określono przez pomiary z zastosowaniem jedno- lub podwójnie izotopowej techniki. Pacjenci leczeni tym związkiem wykazują znormalizowane poziomy wapnia w surowicy, niezmieniające się wartości gęstości kości w całym organizmie, kości promieniowych, udowych i/lub kręgowych w stosunku do wartości wzorcowych. W przeciwieństwie do tego pacjenci traktowani placebo wykazują często hipokalcemię, znacznie zmniejszenie gęstości kości w całym organizmie, kości promieniowych, udowych i/lub kręgowych. W traktowanej grupie obserwuje się nieznaczne występowanie hiperkalcemii.

Mimo iż niniejszy wynalazek został opisany i zilustrowany konkretnymi przykładami, dla znawcy jest oczywiste, że w opisanym zakresie można przeprowadzić różne modyfikacje, obejmujące odmiany, dodatki i pominięcia.

170 447

FIGURA 1

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania nowej 5,6-cis-la-hydroksywitaminy D4, znamienny tym, że obejmuje:

a) tosylowanie witaminy D4 z wytworzeniem tosylanu witaminy D4;

b) solwolizę tosylanu witaminy D4 do 3,5-cyklowitaminy D4;

c) utlenianie 3,5-cyklowitaminy D 4 do 1a-hydroksy-3,5-cyklowitaminy D4 i

d) kolejno solwolizę i reakcję Dielsa-Aldera 1 a-hydroksy-3,5-cyklowitaminy D4 i wydzielenie 5,6-cis-1 α-hydroksywitaminy D 4.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap a) obejmuje reakcję witaminy D4 z chlorkiem toluenosulfonylu w obecności suchej pirydyny.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) tosylan witaminy D4 poddaje się buforowanej solwolizie.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie c) 3,5-cyklowitaminę D4 poddaje się allilowemu utlenianu dwutlenkiem selenu.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap d) obejmuje solwolizę la-hydroksycyklowitaminy D4 za pomocą mieszaniny sulfotlenku dimetylu i kwasu organicznego z wytworzeniem mieszaniny 5,6-cis-1a-hydroksy- i 5,6-trans-1a-hydroksy witaminy D4 i reakcję Dielsa Aldera wytworzonej mieszaniny, w której wytwarza się addukt 5,6-trans 1 a-hydroksywitaminy D4 i oddzielenie wytworzonej 5,6-cis-hl-hydroksywitaminy D4.

★ ★ ★