CN108047108B - 一种阿法骨化醇的有关杂质pzb及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种阿法骨化醇的有关杂质PZB，即(1α,3β,5Z,7E)‑9,10‑开环麦角甾‑5,7,10(19)‑三烯‑1,3‑二醇，以及其制备方法，属于化学制药技术领域。本发明所述高纯度的阿法骨化醇的有关杂质PZB，可作阿法骨化醇成品检测分析中的杂质标准品，从而提升阿法骨化醇成品检测分析对杂质的准确定位和定性，有利于加强对该杂质的控制，进而提高阿法骨化醇成品质量。本发明提供的方法原料便宜易得，操作简单，重现性好，HPLC纯度≥99.5%。

Description

一种阿法骨化醇的有关杂质PZB及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于化学制药技术领域，具体涉及一种阿法骨化醇相关的PZB的制备方法，以及利用该杂质作为杂质对照品，在阿法骨化醇的原料药和制剂中的检测与分析等质量控制方面的用途。
背景技术
阿法骨化醇，化学名：9，10-开环胆甾-5Z，7E，10（19）-三烯-1α，3β-二醇。化学式为：
。
最早由美国骨保健国际公司（Bone Care International）研制，并先后在以色列，德国，日本，意大利获得批准上市。现丹麦LEO制药公司的产品在全世界广泛销售，多用于因维生素D代谢障碍而引起的钙代谢紊乱，临床用于骨质疏松症，慢性肾功能不全，甲状旁腺功能减退症，抗维生素D佝偻病，骨软化症等。
我国从1997年开始有国产品上市，主要有片剂和胶丸剂两种剂型。
阿法骨化醇是维生素D类化合物中的脂溶性甾醇，是一类参与钙、磷的内环境稳定和骨的矿化过程的物质。阿法骨化醇是维生素D3在体内经肾脏的1α-羟化酶作用转变而来的活性维生素D。
阿法骨化醇具有治疗中老年性骨质疏松症、甲状旁腺功能低下、维生素D3依赖性佝偻病、肾性骨营养不良以及用于由肾衰竭等多种肾脏病引起的肾源性佝偻病、肾性骨质病变、甲状旁腺功能减退等作用。另外，阿法骨化醇对继发性骨质疏松，尤其是肾上腺皮质类固醇诱导的骨质疏松症及器官移植术后的骨质丢失的治疗有重要作用。进而，阿法骨化醇近来被发现可以显著减少心脏、肺及肝脏移植术后继发性的骨质流失。
阿法骨化醇性质不稳定，对光、热、空气均很敏感，尤其是在反应过程中容易产生一些异构体杂质及其它有关物质，难于分离纯化，因而合成条件较难把握，合成工艺技术门槛高、难度大。同时，对原料药和制剂产品的质量控制也提出了更好的要求。
2015年版中国药典中，阿法骨化醇的检查项下的有关物质方法是采用自身对照的高效液相法，质量控制得较为粗糙，对具体的杂质情况也未明确说明，只是笼统地描述到：“供试品溶液色谱图中如有杂质峰，除前阿法骨化醇峰外，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积（1%）”。
阿法骨化醇的异构体杂质PZB,即(1α,3β,5Z,7E)-9,10-开环麦角甾-5,7,10(19)-三烯-1,3-二醇，是起始物料维生素D3中含有的少量维生素D4参与反应过程而最终残留在成品中的异构体杂质，影响产品质量，其结构式如下所示，
。
经检索，尚未有关于该杂质合成的文献报道，因此，提供一种阿法骨化醇的异构体杂质PZB的合成方法，用于杂质对照品的制备具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种阿法骨化醇的异构体杂质PZB，即(1α,3β,5Z,7E)-9,10-开环麦角甾-5,7,10(19)-三烯-1,3-二醇的合成方法，该合成方法具有操作简单，原料便宜易得，收率高，纯度高等优点。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
本发明提供了一种阿法骨化醇的异构体杂质PZB，即(1α,3β,5Z,7E)-9,10-开环麦角甾-5,7,10(19)-三烯-1,3-二醇，其结构如式1化合物所示，
。
优选地，本发明提供的上述杂质的高效液相纯度为大于等于98.5%，优选为大于等于99.0%，更加优选为大于等于99.5%；该杂质的用途是用于阿法骨化醇的有关物质对照品，或者用于阿法骨化醇的杂质鉴定。
本发明提供的上述阿法骨化醇的有关杂质PZB，在阿法骨化醇原料药和制剂的质量控制中的用途。
本发明提供的上述杂质，其采用的杂质分析方法为高效液相色谱法，其计算方法选自外标法，加校正因子的自身对照法，不加校正因子的自身对照法，峰面积归一化法中的一种。
本发明的另一个目的在于提供一种制备如上所述杂质PZB的方法，包含如下步骤：
（1）向反应瓶内加入式2化合物即维生素D4、二氯甲烷、咪唑，避光，控温0-5 ℃滴加叔丁基二甲基氯硅烷；滴加完毕后升至室温反应，TLC监控至原料反应完全，水洗，无水硫酸钠搅拌干燥，得式3化合物溶液；
（2）将式3化合物的二氯甲烷溶液，并降温至-20 ℃以下，避光搅拌下，通入二氧化硫气体， TLC监控至原料反应完毕，减压浓缩，母液真空浓缩得棕色油状物，即式4化合物；
（3）将式4化合物、碳酸氢钠、95%乙醇加入反应瓶内，避光，氩气保护，加热至回流约2-3h， TLC监控至原料反应完毕，浓缩，残余物中加入乙酸乙酯、水，搅拌至固体全溶，静置，分液，有机层饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得微黄色透明油状物，即式5化合物；
（4）向反应瓶内加入二氯甲烷 、乙腈、式5化合物、和N—甲基氧化吗啉，加热回流，加入二氧化硒，回流反应2-3h，TLC监控，冷却至室温，加入水，搅拌静置分液，有机相饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得深棕色油状物，即式6化合物；
（5）向反应瓶内加入式6化合物、二氯甲烷、咪唑，搅拌溶解，控温0-5℃, 滴加叔丁基二甲基氯硅烷；滴加完毕后升至室温反应2h，TLC监控至原料反应完全，水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，得深棕色油状物，即式7化合物；
（6）向光化学反应器内加入式7化合物、蒽 、甲苯、三乙胺，通入氩气，打开紫外灯光源，室温反应，TLC监控至原料反应完毕，浓缩，得浅黄色油状物，即式8化合物；
（7）将式8化合物、四氢呋喃和四丁基氟化铵加入反应瓶内，氩气置换4次，60℃避光回流反应1-2 h，TLC监控至原料反应完毕，40℃真空浓缩，残余物用乙酸乙酯溶解后水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得油状物；用乙酸乙酯溶解，加入马来酸酐，氩气置换，35℃避光恒温反应24 h，浓缩后用硅胶柱层析纯化，得到白色固体，即式1化合物。
上述制备方法，其优化改进的实验操作如下：
（1）向反应瓶内加入式2化合物即维生素D4 80g、二氯甲烷5L、咪唑35g，避光，控温0-5 ℃滴加叔丁基二甲基氯硅烷47g；滴加完毕后升至25-30℃反应，TLC监控至原料反应完全，水洗，无水硫酸钠搅拌干燥，得式3化合物的溶液；
（2）将式3化合物的二氯甲烷溶液，并降温至-20 ℃以下，避光搅拌下，通入二氧化硫气体300g， TLC监控至原料反应完毕，减压浓缩，母液真空浓缩得棕色油状物，即式4化合物；
（3）将式4化合物、碳酸氢钠140g、95%乙醇1.5L加入反应瓶内，避光，氩气保护，加热至回流约2-3h， TLC监控至原料反应完毕，浓缩，残余物中加入乙酸乙酯1.5L、水1.5L，搅拌至固体全溶，静置，分液，有机层饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得微黄色透明油状物，即式5化合物 100g；
（4）向反应瓶内加入二氯甲烷2L 、乙腈1.5L、式5化合物 100g、和N—甲基氧化吗啉 90g，加热回流，加入二氧化硒 20g，回流反应2-3h，TLC监控，冷却至室温，加入水1.5L，搅拌静置分液，有机相饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得深棕色油状物，即式6化合物101g；
（5）向反应瓶内加入式6化合物 101g、二氯甲烷800mL、咪唑38g，搅拌溶解，控温0-5℃, 滴加叔丁基二甲基氯硅烷40g；滴加完毕后升至室温反应2h，TLC监控至原料反应完全，水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，得深棕色油状物，即式7化合物 76g；
（6）向光化学反应器内加入式7化合物 76g、蒽 7g、甲苯300mL、三乙胺1mL，通入氩气，打开紫外灯光源，室温反应，TLC监控至原料反应完毕，浓缩，得浅黄色油状物，即式8化合物71g；
（7）将式8化合物71g、四氢呋喃 400mL和四丁基氟化铵 40g加入反应瓶内，氩气置换4次，60℃避光回流反应1-2 h，TLC监控至原料反应完毕，40℃真空浓缩，残余物用乙酸乙酯400mL溶解后水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得油状物；用乙酸乙酯400mL溶解，加入马来酸酐 8g，氩气置换，35℃避光恒温反应24 h，浓缩后用硅胶柱层析纯化，洗脱溶剂是正己烷-乙酸乙酯，得到白色固体，即式1化合物13g，HPLC纯度为99.5%。
本发明还提供了一种利用上诉杂质PZB作为杂质对照品，检测与分析阿法骨化醇原料药中有关物质的方法，具体包含如下步骤：
取本品，加甲醇-水（80:20）溶解并稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另取杂质PY1、杂质PY2、杂质PZB与阿法骨化醇适量，精密称定，加甲醇-水（80:20）溶解并稀释制成每 l ml中约含阿法骨化醇0.1mg，杂质PY1、杂质PY2各 0.5μg，杂质PZB 0. lμg的溶液，作为系统适用性溶液；照高效液相色谱法（中国药典2015年版四部通则0512）测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（YMC ODS-AQ 150mm*4.6mm，3μm），以乙腈-水（77:23）为流动相；柱温为35℃，检测波长为265nm，精密量取系统适用性溶液100μl注入液相色谱仪，前阿法骨化醇峰、杂质PY1峰、杂质PY2峰、杂质PZB峰相对阿法骨化醇峰的相对保留时间分别约为0.85、0.92、1.1和1.24，各杂质峰与阿法骨化醇峰的分离度均符合要求；精密量取供试品溶液和对照溶液各100μl，注入液相色谱柱，记录色谱图至主峰保留时间的3倍；供试品溶液色谱图中如有杂质峰，以峰面积按加校正因子的主成分自身对照法计算，除前阿法骨化醇峰外，杂质PY1和杂质PY2峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍（0.5%），杂质PZB峰面积不得不大于对照溶液峰面积的0.1倍（0.1%），其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.1倍（0.1%），各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积（1.0%），其中，PY1的结构式如下所示，
；
PY2的结构式如下所示，
；
PZB的结构式如下所示，
。
本发明还提供了一种利用上述杂质PZB作为杂质对照品，测定阿法骨化醇原料药中含量的方法，其特征在于，具体包含如下步骤，照高效液相色谱法（中国药典2015年版四部通则0512）测定：
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基键合硅胶为填充剂；以水-乙腈（23:77）为流动相；检测波长为265nm。取杂质PY1、杂质PY2、杂质PZB与阿法骨化醇适量，精密称定，加甲醇-水（80:20）溶解并稀释制成每 l ml中含有阿法骨化醇0.1mg，杂质PY1、杂质PY2各0.5μg，杂质PZB 0. lμg的溶液，作为系统适用性溶液，取100μl注入液相色谱仪，记录色谱图，各杂质峰与阿法骨化醇峰的分离度应符合要求。理论板数按阿法骨化醇峰计算不低于2000；
测定法 取本品，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含100μg的溶液，作为供试品溶液，精密量取100μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿法骨化醇对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得；
其中，PY1的结构式如下所示，
；
PY2的结构式如下所示，
；
PZB的结构式如下所示，
。
本发明取得的有益的技术效果是：
（1）本发明条件易控，路线简单，溶剂易得；
（2）本发明制备的阿法骨化醇的异构体杂质PZB可达99%以上的纯度，可作为对照品使用；
（3）合成阿法骨化醇的异构体杂质PZB，不仅为阿法骨化醇的杂质鉴定和杂质检测提供对照品，从而提升阿法骨化醇成品检测分析中对杂质PZB的准确定位和定性，有利于加强对该杂质的控制，进而对阿法骨化醇原料药及其制剂的质量标准的提高及产品的质量控制提供有益参考，也为同类化合物合成提供借鉴。
附图说明
图1是阿法骨化醇的有关杂质PZB的氢谱。
图2是阿法骨化醇的有关杂质PZB的碳谱。
图3是阿法骨化醇的有关杂质PZB的DEPT90谱。
图4是阿法骨化醇的有关杂质PZB的DEPT135谱。
图5是阿法骨化醇的有关杂质PZB的H-HCOSY谱。
图6是阿法骨化醇的有关杂质PZB的HMBC谱。
图7是阿法骨化醇的有关杂质PZB的HSQC谱。
具体实施方式
下面结合优选实施例，对本发明进行进一步说明，但本发明不限于下述实施例。
本发明所用试剂和物料均市售可得。
合成路线如下所示。
实施例1 式4化合物的制备
向反应瓶内加入式2化合物即维生素D4 80g、二氯甲烷5L、咪唑35g，避光，控温0-5℃滴加叔丁基二甲基氯硅烷47g；滴加完毕后升至25-30℃反应，TLC监控至原料反应完全，水洗，无水硫酸钠搅拌干燥，得式3化合物的溶液； 将式3化合物的二氯甲烷溶液，并降温至-20 ℃以下，避光搅拌下，通入二氧化硫气体300g， TLC监控至原料反应完毕，减压浓缩，母液真空浓缩得棕色油状物，即式4化合物115g。
实施例2 式5化合物的制备
将式4化合物115g、碳酸氢钠140g、95%乙醇1.5L加入反应瓶内，避光，氩气保护，加热至回流约2-3h， TLC监控至原料反应完毕，浓缩，残余物中加入乙酸乙酯1.5L、水1.5L，搅拌至固体全溶，静置，分液，有机层饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得微黄色透明油状物，即式5化合物 100g。
实施例3 式6化合物的制备
向反应瓶内加入二氯甲烷2L 、乙腈1.5L、式5化合物 100g、和N—甲基氧化吗啉90g，加热回流，加入二氧化硒 20g，回流反应2-3h，TLC监控，冷却至室温，加入水1.5L，搅拌静置分液，有机相饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得深棕色油状物，即式6化合物101g。
实施例4 式7化合物的制备
向反应瓶内加入式6化合物 101g、二氯甲烷800mL、咪唑38g，搅拌溶解，控温0-5℃, 滴加叔丁基二甲基氯硅烷40g；滴加完毕后升至室温反应2h，TLC监控至原料反应完全，水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，得深棕色油状物，即式7化合物 76g。
实施例5 式8化合物的制备
向光化学反应器内加入式7化合物 76g、蒽 7g、甲苯300mL、三乙胺1mL，通入氩气，打开紫外灯光源，室温反应，TLC监控至原料反应完毕，浓缩，得浅黄色油状物，即式8化合物71g。
实施例6 式1化合物的制备
将式8化合物71g、四氢呋喃 400mL和四丁基氟化铵 40g加入反应瓶内，氩气置换4次，60℃避光回流反应1-2 h，TLC监控至原料反应完毕，40℃真空浓缩，残余物用乙酸乙酯400mL溶解后水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得油状物；用乙酸乙酯400mL溶解，加入马来酸酐 8g，氩气置换，35℃避光恒温反应24 h，浓缩后用硅胶柱层析纯化，洗脱溶剂是正己烷-乙酸乙酯，得到白色固体，即式1化合物13g，HPLC纯度为99.5%。
实施例7 式1化合物的制备
向反应瓶内加入式2化合物即维生素D4 40g、二氯甲烷2.5L、咪唑17g，避光，控温0-5 ℃滴加叔丁基二甲基氯硅烷30g；滴加完毕后升至25-30℃反应，TLC监控至原料反应完全，水洗，无水硫酸钠搅拌干燥，得式3化合物的溶液； 将式3化合物的二氯甲烷溶液，并降温至-20 ℃以下，避光搅拌下，通入二氧化硫气体160g， TLC监控至原料反应完毕，减压浓缩，母液真空浓缩得棕色油状物，即式4化合物56g；
将式4化合物56g、碳酸氢钠65g、95%乙醇800mL加入反应瓶内，避光，氩气保护，加热至回流约2-3h， TLC监控至原料反应完毕，浓缩，残余物中加入乙酸乙酯1L、水1L，搅拌至固体全溶，静置，分液，有机层饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得微黄色透明油状物，即式5化合物44g；
向反应瓶内加入二氯甲烷1L 、乙腈800mL、式5化合物 44g、和N—甲基氧化吗啉40g，加热回流，加入二氧化硒 12g，回流反应2-3h，TLC监控，冷却至室温，加入水1L，搅拌静置分液，有机相饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得深棕色油状物，即式6化合物42g；
向反应瓶内加入式6化合物 42g、二氯甲烷370mL、咪唑17g，搅拌溶解，控温0-5℃,滴加叔丁基二甲基氯硅烷22g；滴加完毕后升至室温反应2h，TLC监控至原料反应完全，水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，得深棕色油状物，即式7化合物 37g；
向光化学反应器内加入式7化合物37g、蒽 3g、甲苯150mL、三乙胺0.5mL，通入氩气，打开紫外灯光源，室温反应，TLC监控至原料反应完毕，浓缩，得浅黄色油状物，即式8化合物35g；
将式8化合物35g、四氢呋喃 200mL和四丁基氟化铵 20g加入反应瓶内，氩气置换4次，60℃避光回流反应1-2 h，TLC监控至原料反应完毕，40℃真空浓缩，残余物用乙酸乙酯200mL溶解后水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得油状物；用乙酸乙酯200mL溶解，加入马来酸酐 5g，氩气置换，35℃避光恒温反应24 h，浓缩后用硅胶柱层析纯化，洗脱溶剂是正己烷-乙酸乙酯，得到白色固体，即式1化合物6g，HPLC纯度为99.5%。
实施例8 式1化合物的结构解析
图1是阿法骨化醇的有关杂质PZB的氢谱。
图2是阿法骨化醇的有关杂质PZB的碳谱。
图3是阿法骨化醇的有关杂质PZB的DEPT90谱。
图4是阿法骨化醇的有关杂质PZB的DEPT135谱。
图5是阿法骨化醇的有关杂质PZB的H-HCOSY谱。
图6是阿法骨化醇的有关杂质PZB的HMBC谱。
图7是阿法骨化醇的有关杂质PZB的HSQC谱。
从上可知，样品氢谱除去溶剂CDCl3和H2O峰外共有15组峰，对应比例为：1:1:1:1:1:1:1:1:1:21:1:3:3:6:3，对应46个氢。各氢归属如下：δ6.369 (d，1H，J=11.13Hz），归属为6-H；δ6.030 (d，1H，J=11.22Hz），归属为7-H；；δ5.328（s，1H），归属为19（E）-H；δ5.006（s，1H），归属为19（Z）-H；δ4.450（s，1H），归属为1-H；δ4.250（s，1H），归属为3-H；δ2.809（d，1H），归属为9-H；δ2.598（d，1H），归属为4-H；δ2.323（m，1H），归属为4-H；δ1.255-2.200（m，21H），归属为1-H，2-H，3-H，9-H，11-H，12-H，14-H，15-H，16-H，17-H，22-H，23-H，24-H，25-H；δ0.931-1.255（m，1H），归属为20-H；δ0.916-0.931（m，3H），归属为21-H；δ0.813-0.907（m，3H），归属为28-H；δ0.771-0.795（d，6H），归属为26-H，27-H；δ0.541-0.543（s，3H），归属为18-H。
从上可知，除去溶剂CDCl3外共有28组峰，对应28个碳，与样品结构分子式C28H46O2有28个碳相符。δ18.40；δ19.17；δ18.98；δ20.36；δ20.67；δ22.43；δ23.77；δ27.73；δ29.26；δ30.75；δ31.60；δ33.81；δ36.36；δ38.99；δ40.64；δ43.01；δ45.42；δ46.08；δ56.59；δ56.71；δ67.01；δ70.97；δ111.90；δ117.09；δ125.21；δ132.89；δ143.53；δ147.79。
上述质谱数据与理论分子量414.6和分子式C28H46O2相符。
根据样品的核磁共振氢谱，碳谱谱图所示氢，碳个数，归属与结构相符，所以样品结构为：
。
实施例9 以有关杂质PZB作为杂质对照品，检查阿法骨化醇原料药中的有关物质
本发明提供了一种利用杂质PZB作为杂质对照品，检查阿法骨化醇原料药中的有关物质的方法，具体包含如下步骤：
取本品，加甲醇-水（80:20）溶解并稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取杂质PY1、杂质PY2、杂质PZB与阿法骨化醇适量，精密称定，加甲醇-水（80:20）溶解并稀释制成每 l ml中约含阿法骨化醇0.1mg，杂质PY1、杂质PY2各 0.5μg，杂质PZB 0. lμg的溶液，作为系统适用性溶液；照高效液相色谱法（中国药典2015年版四部通则0512）测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（YMC ODS-AQ 150mm*4.6mm，3μm），以乙腈-水（77:23）为流动相；柱温为35℃，检测波长为265nm，精密量取系统适用性溶液100μl注入液相色谱仪，前阿法骨化醇峰、杂质PY1峰、杂质PY2峰、杂质PZB峰相对阿法骨化醇峰的相对保留时间分别约为0.85、0.92、1.1和1.24，各杂质峰与阿法骨化醇峰的分离度均符合要求。精密量取供试品溶液和对照溶液各100μl，注入液相色谱柱，记录色谱图至主峰保留时间的3倍；供试品溶液色谱图中如有杂质峰，以峰面积按加校正因子的主成分自身对照法计算，除前阿法骨化醇峰外，杂质PY1和杂质PY2峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍（0.5%），杂质PZB峰面积不得不大于对照溶液峰面积的0.1倍（0.1%），其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.1倍（0.1%），各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积（1.0%），其中，PY1的结构式如下所示，
；
PY2的结构式如下所示，
；
PZB的结构式如下所示，
。
实施例10 以有关杂质PZB作为杂质对照品，测定阿法骨化醇原料药中的含量
本发明提供了一种利用杂质PZB作为杂质对照品，测定阿法骨化醇原料药中含量的方法，具体包含如下步骤，照高效液相色谱法（中国药典2015年版四部通则0512）测定：
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基键合硅胶为填充剂；以水-乙腈（23:77）为流动相；检测波长为265nm。取杂质PY1、杂质PY2、杂质PZB与阿法骨化醇适量，精密称定，加甲醇-水（80:20）溶解并稀释制成每 l ml中含有阿法骨化醇0.1mg，杂质PY1、杂质PY2各0.5μg，杂质PZB 0. lμg的溶液，作为系统适用性溶液，取100μl注入液相色谱仪，记录色谱图，各杂质峰与阿法骨化醇峰的分离度应符合要求。理论板数按阿法骨化醇峰计算不低于2000；
测定法 取本品，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含100μg的溶液，作为供试品溶液，精密量取100μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿法骨化醇对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得；
其中，PY1的结构式如下所示，
；
PY2的结构式如下所示，
；
PZB的结构式如下所示，
。
以上所揭示的仅为本发明的较佳实施例，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此，本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (2)

1.一种阿法骨化醇的有关杂质PZB，即(1α,3β,5Z,7E)-9,10-开环麦角甾-5,7,10(19)-三烯-1,3-二醇的制备方法，PZB结构如式1化合物所示，
；
其特征在于，包含如下步骤：
（1）向反应瓶内加入式2化合物即维生素D4、二氯甲烷、咪唑，避光，控温0-5 ℃滴加叔丁基二甲基氯硅烷；滴加完毕后升至室温反应，TLC监控至原料反应完全，水洗，无水硫酸钠搅拌干燥，得式3化合物溶液；
（2）将式3化合物的二氯甲烷溶液，并降温至-20 ℃以下，避光搅拌下，通入二氧化硫气体， TLC监控至原料反应完毕，减压浓缩，母液真空浓缩得棕色油状物，即式4化合物；
（3）将式4化合物、碳酸氢钠、95%乙醇加入反应瓶内，避光，氩气保护，加热至回流约2-3h， TLC监控至原料反应完毕，浓缩，残余物中加入乙酸乙酯、水，搅拌至固体全溶，静置，分液，有机层饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得微黄色透明油状物，即式5化合物；
（4）向反应瓶内加入二氯甲烷 、乙腈、式5化合物、和N—甲基氧化吗啉，加热回流，加入二氧化硒，回流反应2-3h，TLC监控，冷却至室温，加入水，搅拌静置分液，有机相饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得深棕色油状物，即式6化合物；
（5）向反应瓶内加入式6化合物、二氯甲烷、咪唑，搅拌溶解，控温0-5℃, 滴加叔丁基二甲基氯硅烷；滴加完毕后升至室温反应2h，TLC监控至原料反应完全，水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，得深棕色油状物，即式7化合物；
（6）向光化学反应器内加入式7化合物、蒽 、甲苯、三乙胺，通入氩气，打开紫外灯光源，室温反应，TLC监控至原料反应完毕，浓缩，得浅黄色油状物，即式8化合物；
（7）将式8化合物、四氢呋喃和四丁基氟化铵加入反应瓶内，氩气置换4次，60℃避光回流反应1-2 h，TLC监控至原料反应完毕，40℃真空浓缩，残余物用乙酸乙酯溶解后水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得油状物；用乙酸乙酯溶解，加入马来酸酐，氩气置换，35℃避光恒温反应24 h，浓缩后用硅胶柱层析纯化，得到白色固体，即式1化合物。
2.根据权利要求1所述阿法骨化醇有关杂质PZB的制备方法，其特征在于，具体的实验操作如下：
（1）向反应瓶内加入式2化合物即维生素D4 80g、二氯甲烷5L、咪唑35g，避光，控温0-5℃滴加叔丁基二甲基氯硅烷47g；滴加完毕后升至25-30℃反应，TLC监控至原料反应完全，水洗，无水硫酸钠搅拌干燥，得式3化合物的溶液；
（2）将式3化合物的二氯甲烷溶液，并降温至-20 ℃以下，避光搅拌下，通入二氧化硫气体300g， TLC监控至原料反应完毕，减压浓缩，母液真空浓缩得棕色油状物，即式4化合物115g；
（3）将式4化合物115g、碳酸氢钠140g、95%乙醇1.5L加入反应瓶内，避光，氩气保护，加热至回流约2-3h， TLC监控至原料反应完毕，浓缩，残余物中加入乙酸乙酯1.5L、水1.5L，搅拌至固体全溶，静置，分液，有机层饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得微黄色透明油状物，即式5化合物 100g；
（4）向反应瓶内加入二氯甲烷2L 、乙腈1.5L、式5化合物 100g、和N—甲基氧化吗啉90g，加热回流，加入二氧化硒 20g，回流反应2-3h，TLC监控，冷却至室温，加入水1.5L，搅拌静置分液，有机相饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得深棕色油状物，即式6化合物101g；
（5）向反应瓶内加入式6化合物 101g、二氯甲烷800mL、咪唑38g，搅拌溶解，控温0-5℃,滴加叔丁基二甲基氯硅烷40g；滴加完毕后升至室温反应2h，TLC监控至原料反应完全，水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，得深棕色油状物，即式7化合物 76g；
（6）向光化学反应器内加入式7化合物 76g、蒽 7g、甲苯300mL、三乙胺1mL，通入氩气，打开紫外灯光源，室温反应，TLC监控至原料反应完毕，浓缩，得浅黄色油状物，即式8化合物71g；
（7）将式8化合物71g、四氢呋喃 400mL和四丁基氟化铵 40g加入反应瓶内，氩气置换4次，60℃避光回流反应1-2 h，TLC监控至原料反应完毕，40℃真空浓缩，残余物用乙酸乙酯400mL溶解后水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得油状物；用乙酸乙酯400mL溶解，加入马来酸酐 8g，氩气置换，35℃避光恒温反应24 h，浓缩后用硅胶柱层析纯化，洗脱溶剂是正己烷-乙酸乙酯，得到白色固体，即式1化合物13g，HPLC纯度为99.5%。
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