PL156393B1 - Mikrobiologiczny sposób wytwarzania diolu - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania diolu o wzorze 3, ewentualnie w postaci zcyklizowanej o wzorze 1 na drodze transformacji w warunkach hodowli mikroorganizmu, znamienny tym, że hoduje się mikroorganizm Hyphozyma roseoniger, zidentyfikowany jako CBS 214.83 i ATCC 20 624 w wodnej pożywce z napowietrzaniem, zawierającej związek lub związki o wzorach 15, 16 i/lub 17, w którym R oznacza rodnik przedstawiony wzorami 18-27, przy pH pożywki 2,5-9 i o temperaturze 12-30°C, po czym wytworzony diol o wzorze 3, ewentualnie w środowisku pożywki cyklizuje się do związku o wzorze 1 lub alternatywnie wyodrębnia się diol o wzorze 3 i następnie cyklizuje się go do związku o wzorze 1.

Description

Przedmiotem wynalazku jest mikrobiologiczny sposób wytwarzania diolu ewentualnie w postaci furanowej z wykorzystaniem drobnoustroju.

Przedstawiony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 029 255 dodekahydro-3a,6,6,9a-tetrametylonafto[2,l-b]furan (związek o wzorze 1) jest ważnym zapachowym związkiem chemicznym. Jest on stosowany do sporządzania kompozycji perfumeryjnych o wysokiej jakości oraz do wytwarzania takich wyrobów jak środki zapachowe do wyrobów kosmetycznych i do użytku domowego, gdzie pożądany jest trwały efekt utrwalający. Związek o wzorze 1 jest także składnikiem tinktury z ambry (patrz B. D Mockherjee i R. R. Ratel, Proceedings of the 7th International Congress of Essential Oils, Kyoto, Japonia (1977), doniesienie nr 136). Syntetyczny związek o wzorze 1 stosuje się do sporządzania sztucznych kompozycji ambry. Związek o wzorze 1 można wytworzyć z 2-etylenodekahydro-2-hydroksy-2,5,5-8a-pentametylo-l-naftalenopropanolu (wzór 4) który znany jest jako Sclareol, otrzymywany z szałwi (Salvia Sclarea).

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 050 532 ujawniono sposób przekształcania związku o wzorze 4 w dodekahydro-3a,6,6,9a-tetrametylonafto[2,1 -bjfuran-/1H/on-2 (wzór 2), w dwuetapowej reakcji utleniania. W pierwszym etapie, wodną zawiesinę Sclareolu poddaje się reakcji ze środkiem utleniającym w postaci nadmanganianu metalu alkalicznego w warunkach alkalicznych, powodując częściowo utlenienie Sclareolu. W drugim etapie, wodną mieszaninę reakcyjną z pierwszego etapu zakwasza się i traktuje w warunkach kwaśnych środkiem utleniającym w postaci nadmanganianu lub kwasu chromowego, kończąc w ten sposób proces utleniania. Związek o wzorze 2 można łatwo przekształcić w związek o wzorze 1 znanymi sposobami, na przykład redukując związek o wzorze 2 odczynnikiem wodorującym [patrz np. Helv. Chim. Acta, 33, 1308 (1950)] otrzymuje się dekahydro-2-hydroksy-2,5,5,8a-tetrametylonaftalenoetanol (związek o wzorze 3), który następnie łatwo przekształca się drogą cyklizacji w związek o wzorze 1.

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 029 255 ujawniono sposób wytworzenia związku o wzorze 1 drogą odwodnienia związku o wzorze 3 za pomocą AI2O3 w temperaturze 200-225°C, i następnie ogrzewania w temperaturze 130-160°C pod zmniejszonym ciśnieniem w obecności kwasu /1-naftalenosulfonowego w celu cyklizacji do związku o wzorze 1.

Alternatywnie, związek o wzorze 1 można wytworzyć drogą cyklizacji związku o wzorze 3 za pomocą chlorku p-toluenosulfonylu w pirydynie, jak to opisali Cambie i wsp. w Aust. J. Chem., 24, 591 (1971).

W powyższych źródłach nie ma wzmianki lub sugestii na temat konwersji związków labdanowych metodami mikrobiologicznymi w dekahydro-2-hydroksy-<a,2,5,5,8a-tetrametylonaftalenoetanol (wzór 3) lub dodekahydro-3a,6,6,9a-tetrametylonafto[2,l-b]furan ( wzór 1), jak to ma miejsce w nowym i wydajnym przemysłowo sposobie według wynalazku.

156 393 3

Wynalazek obejmuje biologicznie czystą hodowlę drobnoustroju Hyphozyrna roseoniger zidentyfikowanego jako CBS 214.83 i ATCC 20624.

Sposób według wynalazku dotyczy hodowli zawierającej drobnoustrój Hyphozyma roseoniger, zidentyfikowany jako CBS214.83 i ATCC 20624, i zdolny do wytwarzania w ilości dającej się wyodrębniać diolu o wzorze 3, podczas transformacji związków z grupy o wzorach 15, 16 i 17, w których R oznacza grupy o wzorach 18-27. Hodowlę prowadzi się przy napowietrzaniu w środowisku wodnej pożywki.

Według wynalazku hodowlę drobnoustroju można prowadzić przy pH od około 2,5 do około 9,0 i w temperaturze od około 12°C do około 30°C.

W dalszym aspekcie, wynalazek dotyczy wytwarzania diolu o wzorze 3 w procesie hodowli drobnoustroju Hyphozyma roseoniger, zidentyfikowanego jako CBS 214.83 i ATCC 20624, prowadzonej przy napowietrzaniu w wodnym środowisku pożywki zawierającej jeden lub więcej ze związków o wzorach 15,16 i 17, w których R oznacza grupy o wzorach 18-27. Hodowlę drobnoustroju można prowadzić przy pH od około 2,5 do około 9,0 i w temperaturze od około 12°C do około 30°C.

W innym aspekcie wynalazku, w procesie hodowli drobnoustroju Hyphozyma roseoniger, zidentyfikowanego jako CBS 214.83 i ATCC 20624, prowadzonej przy napowietrzaniu w wodnej odżywczej pożywce zawierającej jeden lub więcej związków z grupy o wzorach 15,16 i 17, gdzie R oznacza grupy o wzorach 18-27 otrzymuje się diol o wzorze 3, który można wyodrębniać z wodnego medium pożywki, cyklizować z wytworzeniem związku (uranowego o wzorze 1.

Budowę niektórych omawianych związków według wynalazku ilustrują wzory 1—14.

Związki o wzorach 4-14 mogą być stosowane jako substraty w procesie transformacji według wynalazku do pożądanych produktów. Związki o wzorach 6, 11 i 13 obserwowano jako półprodukty podczas transformacji Sclareolu sposobem według wynalazku. Proces transformacji polega na hodowaniu drobnoustroju Hyphozyma roseoniger CBS 214.83 i ATCC 20624 w środowisku wodnej pożywki, w obecności związków o wzorach 4-14. Związki te mogą być stosowane pojedynczo lub w mieszaninie zawierającej dowolną ilość tych związków.

Postać mikroorganizmu nie odgrywa roli. Może on być użyty jako kultura (zawiesina) tj. komórki i odpowiedni roztwór odżywczy, albo w postaci komórek zawieszonych w roztworze buforowym. Komórki albo ekstrakt enzymów z nich mogą być zaszczepione na odpowiednim stałym podłożu, które może być użyte do transformacji.

Zawiesinę hodowli przygotowuje się zaszczepiając odpowiednią wodną pożywkę drobnoustrojem. Odpowiednia odżywka winna zawierać źródła azotu, sole nieorganiczne, czynniki wzrostowe, pożądany substrat (substraty) i ewentualnie inne źródła węgla.

W sposobie według wynalazku odpowiednimi źródłami węgla są np. glikoza, galaktoza, L-sorboza, maltoza, sacharoza, cellobioza, trehałoza, L-arabinoza, L-ramnoza, etanol, gliceryna, L-erytrytol, D-mannit, laktoza, melibioza, rafinoza, melezytoza. skrobia, D-ksyloza, D-sorbit, σ-metylo-D-glikozyd, kwas mlekowy, kwas cytrynowy i kwas bursztynowy. Odpowiednimi źródłami azotu są np. substancje organiczne zawierające azot, takie jak pepton, wyciąg mięsny, wyciąg drożdżowy, namokowy wyciąg kukurydzy, kazeina, mocznik, aminokwasy, albo zawierające azot związki nieorganiczne, takie jak azotany, azotyny i nieorganiczne sole amonowe. Odpowiednimi solami nieorganicznymi są np. fosforany magnezu, potasu, wapnia lub sodu. Do powyższej pożywki hodowlanej można dodawać np. jedną lub więcej witamin z grupy B i/lub jeden lub więcej pierwiastków śladowych, takich jak Fe, Mo, Cu, Mn i B. Dodawanie witamin lub pierwiastków śladowych nie jest konieczne gdy do pożywki wprowadzono małą ilość wyciągu drożdżowego. Może być pożądane dodawanie antybiotyku, takiego jak chloramfenikol lub chlorotetracyklina, gdy występuje problem zakażenia bakteryjnego.

Do hodowania drobnoustroju można stosować hodowlę stacjonarną lub podpowierzchniową z napowietrzaniem np. w kolbach trzęsawkowych lub fermentorach, Proces ten można prowadzić w zakresie pH od około 2,5 do około 9,0, korzystnie od około 3,0 do około 7,5, a najkorzystniej od około 3,0 do około 6,5. Wartość pH można regulować dodatkiem kwasów nieorganicznych lub organicznych, takich jak kwas solny, kwas octowy i kwas szczawiowy, lub dodatkiem zasad, takich jak wodorotlenek sodowy i wodorotlenek amonowy, a'bo dodatkiem buforów, takich jak fosforanowy lub ftslanowy. Temperatura podczas inkubowania powinna być utrzymywana w zakresie od

156 393 około 12°C do około 33°C, korzystnie w zakresie od 15°C do 30°C, a najkorzystniej w zakresie od około 18°C do około 28°C.

Proces według wynalazku można dogodnie prowadzić dodając jeden lub więcej związków o wzorach 4-14 do pożywki podczas hodowania, jako jedyne źródło węgla. Alternatywnie, substrat można dodawać w kombinacji z innym źródłem węgla, takim jak dekstroza, albo podczas hodowania, albo gdy źródło węgla zostanie wyczerpane. Jedynym ograniczeniem stężenia substratu w pożywce hodowlanej jest możliwość efektywnego napowietrzania. Korzystnie jednak stężenie substratu wynosi od około 0,1 do około 100 g/litr, korzystniej od około 0,5 do około 50g/litr, a najkorzystniej od około 1,5 do około 30 g/litr. Transformację można prowadzić w dowolnych z wymienionych warunkach.

Całkowity czas transformacji (po okresie wstępnej hodowli) może być różny w zależności od składu pożywki odżywczej i stężenia substratu. Na ogół, hodowla w kolbach trzęsawkowych wymaga od około 12 do około 264 godzin. Natomiast, gdy stosowany jest fermentor, wówczas czas hodowania można skrócić do około 48 godzin lub mniej.

Transformację można prowadzić stosując komórki drobnoustroju izolowane z roztworu hodowli albo stosując ekstrakt enzymu izolowany z komórek w sposób dobrze znany -specjalistom. W takim przypadku, transformację można prowadzić w różnych wodnych odżywczych pożywkach, np. w roztworze buforu, w roztworze fizjologicznym soli, w świeżym roztworze odżywczym lub w wodzie. Izolowane komórki lub ekstrakt enzymu można immobilizować na stałym nośniku i realizować pożądaną transformację. Substraty można też transformować stosując mutanty omawianego drobnoustroju. Takie mutanty można łatwo uzyskiwać stosując znane w tej dziedzinie metody, np. poddając komórki działaniu promieniowania UV lub rentgenowskiego, lub działaniem znanych substancji mutagennych, takich np. jak oranż akrydynowy.

Substrat można dodawać do środowiska w postaci proszku lub zawiesiny w emulgatorze, takim jak Tween 80 (monostearynian polioksyetylenosorbitu), lub w postaci roztworu w emulgatorze, lub w postaci roztworu w hydrofilowym rozpuszczalniku, takim jak aceton, metanol, etanol, glikol etylenowy lub dioksan. Można również dodawać środek powierzchniowo czynny lub środek rozpraszający do wodnej zawiesiny substratu, albo substrat można emulgować za pomocą ultradźwięków.

Do ograniczenia pienienia można stosować zwykłe środki przeciwpienne, takie jak oleje silikonowe (np. UCON), pochodne polialkilenoglikolu, olej kukurydziany lub olej sojowy.

Transformację substratu można śledzić za pomocą standardowych technik analitycznych, takich jak chromatografia gazowo-cieczowa, chromatografia cienkowarstwowa, wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa, spektrometria w podczerwieni i magnetyczny rezonans jądrowy. Jeśli obserwuje się szybki zanik substratu dodaje się wówczas dodatkową jego porcję w celu maksymalnego wykorzystania możliwości transformacyjnych drobnoustroju. Proces na ogół zakańcza się gdy zaniknie większość substratu w hodowli. Związek o wzorze 3 można wyodrębniać z wodnego środowiska pożywki lub może być cyklizowany do związku furanowego o wzorze 2, albo w wodnym środowisku pożywki albo po wyodrębnieniu. Wyodrębnianie i oczyszczanie związku o wzorze 1 lub związku o wzorze 3 z brzeczki fermentacyjnej może być prowadzone znanymi technikami, takimi jak sączenie lub wirowanie, ekstrakcja rozpuszczalnikiem, destylacja, krystalizacja, itp. Związek o wzorze 3 można przekształcać w związek furanowy o wzorze 1 drogą dobrze znanych sposobów cyklizacji. Na przykład przez reakcję diolu o wzorze 3 z chlorkiem p-tolueno-sulfonylu w pirydynie, w temperaturze 0°C zgodnie ze sposobem, który podali Cambie i wsp. w Aust. J. Chem., 24,591 (1971), który podaje,się tutaj jako odnośnik. Proces ten prowadzi się bądź w mieszaninie transformacyjnej albo z wyodrębnionym diolem o wzorze 3. Przykłady innych metod cyklizacji opisali R. B. Wagner i H. D. Zook w „Synthetic Organie Chemistry, John Wiley, 1965, str. 838-839, co podaje się tutaj jako odnośnik.

Drobnoustrój wykorzystywany w sposobie według wynalazku został wyizolowany z próbki gleby z centrum stanu New Jersey w Stanach Zjednoczonych Ameryki. Szczep ten został zdeponowany w Centraalbureau voor Schimmelculture pod numerem CBS 214.83 oraz w American Type Culture Collection pod numerem ATCC 20624.

Drobnoustrój został zbadany i scharakteryzowany przez Centraalbureau voor Schimmel Cultures. Ze względu na różową barwę jego kolonii i specyficzne właściwości morfologiczne i

156 393 5 hzjochemiczne szczep został uznany przez CBS za nowo odkryty drobnoustrój o nazwie Hyphozyma roseoniger.

Powyższy drobnoustrój ma wyraźne formy drożdżową i nitkowatą. Obie wykazują podobne właściwości biologiczne i nadają się do przeprowadzania opisywanej iransformacji.

Właściwości fazy drożdżowej powyższego drobnoustroju są następujące.

1. Kształt i rozmiar.

Wzrost na agarze ΫΜ: rozowe, błyszczące, gładkie kolonie przedstawiają nitkowate komórki wzrostowe, w kształcie pączków, oKrągłc lub cylindryczne o wymiarach około 2X7 pm lub czasami większe.

Wzrost na agarze słodowym: różowy, niekiedy biązowawy z wytworzeniem grzybni właściwej po A--3 tygodniach; bet skupisk lącczących, błyszczący.

Wzrost na agarze, z mąką kukurydzianą; jasnopomarańczuwo-różowy, błyszczący; gładkie kolonie zrnefcsziałeonc grzybnią,

Wzrost na agarze ziemniaczano-dekstrozowym i agarze słodowym Diłco; różowy, gładki, błyszczący, okazjonalnie przechodzący w czarny w pokojowej tempciaiurze po 2-5 tygodniach.

Wziosi na agarze YPCA: osiąga średnicę 8 mm po 10 dniach, płaski, śluzowaty, bladopomarańczowy (6A3; Kornerups Wanscher, 1978), z ostrymi nieco płatkowatymi brzegami.

Wzrost na agarze Ch A: średnica 4 mm po 10 dniach; po trzech tygodniach w środku staje się oliwkowy z miejscami jasnobrązowymi (óDó) do ciemnobrązowych (5F7), w końcu grzybnia podstawowa rozchodząca się ze śluzowatej kolonii przechodzi w gęstą, oliwkowobrązową (4Γ·4) “tolonię, miejscowo z cienkimi, brudnymi, centralnymi plamami białymi, a później w gęste pęczki grzybni powietrznej.

Drobnoustrój wytwarza grzybnię właściwą z anastomozami obserwowanymi na skrawkach ziemniaków i na ryżu. Wydaje się, że jest to grzyb należący do strzępczaków z wyraźną fazą diożdżową w jego cyklu życiowym.

2. Fermentacja na cukrach (patrz tabela 1).

Tabela 1

Fermentacja

Związek Gaz Kwas

Glikoza - Galaktoza - ·

Maltoza ·

Sacharoza - ·

Laktoza - Rafinoza - Melibioza -

Inulina - 3. Przyswajanie związków węgla (patrz tabela 2).

Tabela 2

Przyswajanie związków węgla

Glikoza	+	Laktoza	V
Galaktoza	+	Melibioza	-u
L-sorboza	+	Rafinoza	+
Maltoza	+	Melezytoza	+
Sacharoza	+	Inulina	-
Cellobioza	+	Skrobia rozpuszczalna	+
Trehaloza	+	D-ksyloza	+
L-arabinoza	+	D-sorbit	+
D-arabinoza	-	σ-metylo-D-glikozyd	+
D-ryboza	+	Salicyna	-
L-ramnoza	+	Inozyt	-
D-glikozoamina	-	Kwas mlekowy	+
Etanol	+	Kwas cytrynowy	+
Gliceryna	+	Kwas bursztynowy	+
L-erytryt	+	G!ikozo-yJakton	+
Adonit		Dulcyt	-
D-mannit	+

156 393

4. Rozszczepianie arbutyny: wynik testu pozytywny

5. Przyswajanie NH4NO3: wynik testu pozytywny.

6. Przyswajanie KNO3: wynik testu pozytywny.

7. Przyswajanie KNO2: wynik testu pozytywny.

8. Wzrost na etyloaminie: wynik testu pozytywny.

9. Wzrost na pożywce nie zawierającej witamin: wynik testu pozytywny.

10. Wzrost w temperaturze 12°C: wynik testu pozytywny.

11. Wzrost w temperaturze 26°C: wynik testu pozytywny.

12. Wzrost w temperaturze 30°C: wynik testu pozytywny.

13. Wzrost w temperaturze 37°C: wynik testu negatywny.

14. Wzrost w temperaturze 45°C: wynik testu negatywny.

Właściwości nitkowatej postaci powyższego drobnoustroju są podobne do właściwości fazy drożdżowej, z następującymi wyjątkami.

Wzrost na agarze YM: różowe, szorstkie kolonie przedstawiają nitkowaty wzrost z właściwą grzybnią.

Wzrost na agarze słodowym i agarze ziemniaczano-dekstrozowym: różowe, szorstkie kolonie przedstawiają nitkowaty wzrost po 2 tygodniach w pokojowej temperaturze, kolonie przechodzą w czarne.

Wzrost na skrawkach ziemniaka i na ryżu: wytwarzana jest właściwa grzybnia z anastomozami.

Wzrost w ciekłej pożywce takiej jak pożywka YM: różowy, podobny do drożdżowego wzrost i okazjonalnie nieco grzybni.

Wzrost na agarze ziemniaczano-sacharozowym: nitkowaty z występowaniem fazy drożdżowej.

Poniższe przykłady ilustrują korzystne sposoby realizowania wynalazku,ale w żaden sposób nie ograniczają jego zakresu. Jeśli nie zaznaczono inaczej ciężary podano w gramach, temperatury w stopniach Celsjusza, a ciśnienie w mm słupa rtęci.

Przykład I. Przykład ten ilustruje proces fermentacji z zastosowaniem jako substratu 2-etylenodekahydro-2-hydroksy-a,2,5,5,8a-pentametylo-l-naftalenopropanolu (związek o wzorze 4).

Cztery kolby, z których każda zawierała 100 ml wodnego roztworu zawierającego 0,1% NH4NO3, 0,1% H2KPO4, 0,05% MgSO4'7H2O, śladowe pierwiastki i witaminę B kompleks, wyjaławiano w ciągu 20 minut w temperaturze I20°C. Do każdej kolby dodano 5 ml 50% wodnego roztworu dekstrozy i 0,1 ml Tweenu 80 zawierającego 10 mg Sclareolu (związek o wzorze 4). Każdą kolbę zaszczepiono 5% objętościowymi trzydniowej hodowli komórek CBS 214.83 (ATCC 20624). Hodowle następnie inkubowano w temperaturze 25°± 1°C, na trzęsawce obrotowej (200 obr/min), w ciągu 3-4 dni. Po okresie wstępnej inkubacji dodawano porcjami 8,0 g w ciągu następnych 5 dni mieszaninę Sclareolu rozpuszczonego w Tweenie80, a inkubowanie kontynuowano w ciągu następnych 4 dni. Po zakończeniu inkubowania zawartość czterech kolb połączono, ekstrahowano 3 X 200 ml octanu etylu i suszono nad Na2SC>4. Po odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano 4,0 g surowego produktu, który krystalizowano z mieszaniny heksanu i chloroformu i otrzymano 2,4 g dekahydro-2-hydroksy-2,5,5,8a-tetrametylonaftalenoetanolu (związek o wzorze 3) o temperaturze topnienia 13(05-131,5°C (w literaturze 132—133°C). Czystość oznaczana za pomocą chromatografii cieczowo-gazowej wynosiła 100%. Widmo PMR (CDCI3) <: 0,79 (2s, 6H), 0,87 (2, 3H), (2, 3H), 0,9-20 (m, 16H), 3,41-3,49 (m, 1H), 3,72-3,79 (m, 1H). Widmo IR (CHCLY/m^SO, 3360,2950, 1460,1380 cm’\ Widmo masowe: m/e236,221,117,137,109. Skręcalność właściwa [a]²²D = -16,8° (CHCI3) (literatura [σ]22’⁵0 = -17,3°, CHCh). Patrz, M. Stoli i M. Hinder, Helv. Chim. Acta, 36, 1955-2008 (1953).

Przykład II. Przykład ten ilustruje wydajność procesów fermentacji przy zastosowaniu różnych ilości Sclareolu (związek o wzorze 4) jako substratu.

Zastosowano postępowanie podobne do opisanego w przykładzie I, z tym, że zamiast pierwiastków śladowych i witamin użyto 0,1 g wyciągu drożdżowego, oraz że Sclareol (związek o wzorze 4) rekrystalizowano z heksanu, sproszkowano, przepuszczono przez sito 50mesh i następnie zmieszano z równą ilością Tweenu 80. Po wstępnym okresie inkubowania przez 4 dni, do każdej

156 393 7 kolby dodawano porcjami w ciągu 5 dni mieszaninę Sclareolu (związek o wzorze 4) i Tweenu 80 i inkubowano w ciągu następnych 4 dni. W tabeli 3 podano ilości dodanego do każdej kolby Sclareolu i wydajność izolowanego diolu o wzorze 3. Każdy produkt miał charakterystykę spektralną identyczną z podaną w przykładzie I.

Tabela 3

Całkowita ilość Sclareolu o wzorze 4	Wydajność izolowanego diolu o wzorze 3
Kolba	g	%
1	2	81
2	3	74
3	5	71

Przykład III. Przykład ten ilustruje efektywność procesu fermentacji przy zastosowaniu przemywanych komórek z fazy spoczynkowej.

Zastosowano postępowanie podobne do opisanego w przykładzie I, z tym tylko, że po wstępnym inkubowaniu w ciągu 3 dni, komórki ze 100 ml brzeczki hodowlanej zebrano i przemyto 3 X 25 ml 0,3 X 10^_4 molarnego buforu fosforanowego o pH 7,2 i odwirowano. Przemyte komórki zawieszono w 100 ml powyższego buforu i inkubowano w temperaturze 25°C±1°C na trzęsawce obrotowej (200 obr/min), w ciągu 7 dni. Następnie dodawano porcjami w ciągu pierwszych 4 dni inkubowania 0,5g Sclareolu rozpuszczonego w 5g Tweenu80. Po zakończeniu inkubowania chromatografia cienkowarstwowa wykazała, że cała ilość Sclareolu (związek 4) została przekształcona w diol o wzorze 3. Po przerobie w zwykły sposób otrzymano diol o wzorze 3 o czystości według chromatografii cieczowo-gazowej wynoszącej 99%, z wydajnością 98%. Charakterystyka spektralna produktu była identyczna jak w przykładzie I.

Przykład IV. Przykład ten ilustruje proces fermentacji z zastosowaniem kolejnych związków o wzorach od 4 do 14 jako substratów, w celu otrzymania dekahydro-2-hydroksy-2,5,5,8atetrametylonaftalenoetanolu (związek o wzorze 3).

Jedenaście kolb zawierających po 100 ml wodnego roztworu pożywki opisanej w przykładzie II wyjaławiano w ciągu 20 minut w temperaturze 120°C. Do każdej kolby dodano 4 ml 50% roztworu wodnego dekstrozy i 0,1 ml Tweenu 80 zawierającego 10 mg odpowiedniego substratu. Każdą kolbę zaszczepiono 5% objętościowymi komórek z trzydniowej hodowli CBS 214.83 (ATCC 20624) i inkubowano w temperaturze 24±1°C na trzęsawce obrotowej (200 obr/min), w ciągu 3 dni. Po wstępnym okresie inkubowania do każdej kolby dodawano mieszaninę 1: 7 (ciężar/ciężar) substratu rozpuszczonego w Tweenie 80. Następnie, inkubowanie kontynuowano w ciągu kilku dni (patrz tabela 4). Postęp transformacji kontrolowano za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. Po zakończeniu inkubacji zawartość każdej kolby ekstrahowano 3X75 ml octanu etylu, ekstrakty suszono nad NaaSOą i odparowywano rozpuszczalnik. Pozostałości oddzielnie oczyszczano chromatograficznie na żelu krzemionkowym, stosując do elucji mieszaninę 95:5 heksanu i izopropanu. Wyniki jedenastu doświadczeń, łącznie z wydajnościami diolu o wzorze 3, zestawiono w tabeli 4.

Tabela 4

Wytwarzanie związku o wzorze 3 przez CBS 214.83 (ATCC 20624) z różnych substratów

Całkowity czas Wydajność diolu Substrat g/100 ml inkubacji (dni) o wzorze 3 (%)

Związek o wzorze

4	0,3	7	96
5	0,3	11	89
6	0,3	7	91
7	0,2	10	51
8	0,2	10	13
9	0,2	10	7
10	0,3	7	98
11	0,3	6	1)0
12	0,3	11	91
13	0,24	8	98
14	0,5	4	100

156 393

Przykład V. Przykład ten ilustruje sposób wytwarzania związków o wzorach 7, 8 i 9, które mogą być stosowane jako substraty w sposobie według wynalazku.

Roztwór 9,24 g (0,03 mola) Sciareolu w 40 ml chlorku metylenu dodano jednorazowo do mieszaniny 12,93 g (0,06 mola) chiorochronnanu pirydymowego, 2,46 g (0,03 mola) octanu sodowego i 100 ml chlorku metylenu. Całość mieszano w ciągu 4 godzin w temperaturze 25°C, po czym dodano 200ml eteru etylowego i zdekantowano supernatant sponad gumowatego osaau. Osad przemyto 3 X 50 ml eteru etylowego i roztwór eterowy przepuszczono przez 40 g żelu krzemionkowego 60. Rozpuszczalnik odparowano, pozostałość rozpuszczono w 2 ml etanolu i 4 ml eteru etylowego. Całość mieszano w ciągu 3 godzin w temperaturze 25°C razem z roztworem 15 g wodorosiarczynu sodowego w 60 ml wody. Mieszaninę ekstrahowano 2 x 30 ml eteru etylowego i warstwę wodną zalkalizowano 1(0% roztworem wodorotlenku sodowego, a następnie ekstrahowano 4 X 50 ml eteru etylowego. Ekstrakty eterowe suszono nad NazSOą i odparowano rozpuszczalnik otrzymując 2,72 g pozostałości, którą chromatografowano na 70 g żelu krzemimikowegoóO, stosując do elucji mieszaninę 4.1 heksanu i octanu etylu. Otrzymano 0,/4g trans-aldehydu o wzorze 7, 0,69 g cis-aldehydu o wzorze 8 i 0,64 g cyklicznych aldehydów o wzorze 9.

[/E/-lR-/lar, 2/34a/J8acr/]-5-/dekahydro-2-hydrok.sy-2,5,5,8a--etrametylo-lnaftalenyiC'/3imetylo-2-pentanal o wzorze 7 miał temperaturę topnienia 83-85°C; skręcalność właściwą [σ]0 =+14,2° (c = 5,76, CHCh); widmo PMR (CDCh) δ: 0,78 (s, 6H), 0,86 (s, 3H), 1,17 (s, 3H), 2,15 (szeroki s, 3H), 0,8-2,5 (m, 17H), 5,82 (d, 1H), J = 8 Hz), 9,98 (d, 1H, J = 8 Hz); widmo IR (CHCl3)Amax:3570,3440,2940,2850,1670,1630,1460,1440,1390 cm-¹; widmo masowe: m/e 306, 291, 273,109, 95, 84; widmo UV (95% etanol): Zmax 241 (nm/obliczono 231) (ε — 17.300); analiza elementarna: obliczono dla C20H34O2: C-78,37, H-^11,18; znaleziono: C-77,92, H-11,02.

[/ZAlR/·-.^, 2β, 4a/?, 8aa/]-/-/dekahydro-2-hydroksy2,5,5,8a-tetrametylo-l-naftaienylΰ/3-metyio-2-pentanal o wzorze 8: temperatura topnienia 91-93,5°C; skręcalność właściwa [aju =+8,9° (c = 3,13, CHCI3): widmo PMR (CDC13) δ: 0,78 (s, 6H), 0,87 (s, 3H), 1,14 (s, 3H), i ,98 (szeroki s, 3H), 0,9-2,8 (m, 17H), 5,75 (d, 1H, J = 8 Hz), 10,0 (d, 1H, J = 8Hz); widmo IR (CHC3): 3570, 3450, 2940, 2840, 1670, 1630, 1460, 1440, 1390 cm'! widmo masowe: m/e 306,273,109,95, 84; widmo (JV (95% etanol): 2max 242 nm (obliczono 231) (ε = 13.000); analiza elementarna: obliczono dla C20H34O2: C-78,37, H-11,18; znaleziono: C-78,34, H-11,02.

[/4aR-/4aa,6a/ł, 1 Oaaa, 1 Ob////-dodekahydro-3,4a,7,7,1 Oa-pentametylo-1 H-nafto[2,1 -bjpirano- 1-acetaldehyd o wzorze 9: widmo PMR (CDCI3) δ: 0,78 (s, 6H), 0,85 (s, 3H), 1,25 (s, 3H), i ,27 (s, 3H), 0,9-2,6 (m, 18H), 9,8-10,0 (m, 1H); widmo IR (film): Amax 2940,2850,1720,1460,1440,1380, ί 370 cm 1; widmo masowe; m/e (dwa sygnały podobnych ms) 291, 273, 262, 245, 109, 43.

Przykład VI. Przykład ten ilustruje sposób wytwarzania związku o wzorze 10, który może być stosowany jako substrat w sposobie według wynalazku.

Do zawiesiny 0,72 g (0,015 mola) wodorku sodowego w postaci 50% zawiesiny, przemytego od oleju mineralnego heksanem w 15 ml dwumetoksyetanu, wkroplono w ciągu 10 minut roztwór 3,78 g (0,015 mola) diizopropylofosfonooctanu etylu w 30 ml dimetoksyetanu. Po zakończeniu wydzielania się wodoru dodano jednorazowo 3,22g (0,01 mola) [1R-/la, 2β, 4&β, 8aa/--4-/2acetylooksydekahydro-2,5,5,8a-etrametylo--naftalenylo/butanonU2 (można go otrzymywać metodą opisaną przez J. A. Barltropa i wsp., w J. Chem. Soc., 4613,1960). Mieszaninę ogrzewano w ciągu 21 godzin w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną, po czym ochłodzono i wiano do 100 ml wody z lodem. Mieszaninę zakwaszono 6n kwasem solnym i ekstrahowano 4 X 10 ml mieszaniny 4: 1 heksanu i octanu etylu. Ekstrakty organiczne przemyto 2 X 10 ml wody, 2 X 15 ml nasyconego roztworu wodorowęglanu sodowego i suszono nad Na2SQ4. Rozpuszczalniki odparowano i pozostałość chromatografowano na żelu krzemionkowym 60, stosując do elucji mieszaninę 9: 1 heksanu i octanu etylu. Otrzymano 3,02g [/E, Z/-lR-/la, 2β, 4aj3, 8aa:/]-/-/2-acetylooksydekahydro-2,5,/,8a-tetrametylo-i-naftalenylo/-3-metylo-2-pentenianu etylu w postaci bezbarwnego, gęstego oleju.

Mieszaninę 2,19 g (0,00557 mola) [/^/^-/f 2β, 4a/J, a_aa:/]-5-/2-acetoksydekahydrO 2,5,5,8a-tetrametylo-i-naftalenylo/-3-metylO2pentenianu etylu, 65 ml izopropanolu, 10 ml wody i 1,47 g (0,0223 mola) wodorotlenku potasowego ogrzewano w ciągu 24 godzin w temperaturze

156 393 wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Mieszaninę zatężono do objętości 20 ml, dodano 50 ml wody i ekstrahowano eterem etylowym. Fazę wodną zakwaszono 6n kwasem solnym i ekstrahowano 5 X 20 ml eteru etylowego. Ekstrakty eterowe przemyto solanką, suszono nad Na2SO4 i odparowano rozpuszczalnik. Otrzymano 1,781 g surowego produktu, który chromatografowano na żelu krzemionkowym 60, eluując mieszaniną 9:1 heksanu i izopropanolu. Otrzymano 0,455 g cisizomeru i 1,223 g trans-izomeru związku o wzorze 10. Po rekrystalizacji z mieszaniny heksanu i octanu etylu otrzymano analityczne próbki: kwas [/Z/-lR-/lcr, 2/3, 4a/3, 8aa/J-5-/dekahydro-2hydroksy-2,5,5,8a-tetrametylo-l-naftalenylo-3-metylo-2-pentenowy, temperatura topnienia 147-149°C; skręcalność właściwa [ct]d = +62,96/ (c — 4,66, CHCI3); widmo PMR (CDCI3) 5:0,81 (s, 6H),0,88(s, 3H), 1,21 (s,3H), 1,92 (szeroki s, 3H), 0,9-2,4 (m, 17H), 5,72 (szeroki s, 1H), 6,8-7,3 (b, szeroki s, 1H); widmo IR (CHCI3): Amax3500,3400,2940,2550,1690,1640,1460,1440 cm’1; widmo masowe: m/e 322,304, 276, 109; widmo UV (95% etanol): Amax 228 (obliczono 217) (ε = 7300);

analiza elementarna: obliczono dla C20H34O3; C-74,49, H-10,63; znaleziono: C-74,20, H-10,40;

kwas [/E/-lR-/lar, 2/3, 4a/3, 8aa/]-5-/dekahydro-2-hydroksy-2,5,5,8a-tetrametylo-l-naftalenylo/-3-metylo-2-pentenowy, temperatura topnienia 151-153°C; skręcalność właściwa [a]c = +9,44° (C = 4,83, CHCh); widmo PMR (CDCh) <5: 0,79 (s, 6H), 0,87 (s, 3H), 1,15 (s, 3H), 2,17 (szeroki s, 3H), 0,9-2,4 (m, 17H), 5,70 (szeroki s, 1H), 5,8-6,1 (szeroki s, 1H); widmo IR (CHCI3): Pmax 3560,,3400, 2940, 2550,1690,1640, 1460,1440 cm’1; widmo masowe: m/e 322, 304, 289, 276, 109; widmo UV (95% etanol): Amax 230 nm (obliczono 217 nm) (ε = 5700); analiza elementarna: obliczono dla C20H34O3; C-74,49, H-10,63; znaleziono: C-74,12, H-10,52.

Przykład VII. Przykład poniższy ilustruje sposób wytwarzania związku o wzorze 11, który może być stosowany jako substrat w sposobie według wynalazku.

Do roztworu 8,484 g (0,084 mola) diizopropyloaminy w 90 ml czterowodorofuranu wkroplono w temperaturze 0°C w ciągu 20 minut 38,2 ml 2,2 molarnego roztworu n-butylolitu w heksanie (0,084 mola). Następnie, w ciągu 15 minut wkroplono roztwór 2,52 g (0,042 mola) kwasu octowego w 20 ml czterowodorofuranu. -Mieszaninę ogrzewano w ciągu 45 minut w temperaturze .50°C, ochłodzono do temperatury 25°C i w ciągu 10 minut wkroplono roztwór 4,508 g (0,014 mola) [1R-/la, 2/3, 4a/3, 8aaJ-4-/²-acetoksydekahy'dro-2,5,5,8a-tetrarmetylo-l-naftalenylo/biitanomi-2 (można go.wytwarzać w sposób opisany przez J. A. Barltropai wsp., w J. Chem. Sos., 4613,1960), w 35 ml czterowodorofuranu. Całość mieszano w ciągu 17 godzin w temperaturze 25°C, a następnie ogrzewano w ciągu 30 minut w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Mieszaninę ochłodzono do temperatury 25°C i dodano 40 ml wody oraz 5g wodorotlenku potasowego, po czym ogrzewano w ciągu 4 godzin w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną, ochłodzono, wlano do 100 ml wody i ekstrahowano 3 X 30 ml mieszaniny 4: 1 heksanu i octanu etylu. Warstwę wodną oziębiono do temperatury 0°C, zakwaszono 6n kwasem solnym i ekstrahowano 4 X 50 ml mieszaniny 4: 1 heksanu i octanu etylu. Połączone ekstrakty przemyto solanką, suszono nad Na2SO4 i odparowano rozpuszczalnik. Otrzymano 2,071 g surowego produktu, który chromatografowano na żelu krzemionkowym 60, eluując mieszaniną 10:10:0,1 heksanu, octanu etylu i kwasu octowego. Otrzymano 1,434 g kwasów o wzorze 11. Po krystalizacji z mieszaniny heksanu i octanu etylu otrzymano próbkę analityczną: temperatura topnienia 136-137,5°C; widmo PMR (CDCI3) <5 0,76 (s, 6H), 0,85 (s, 3H), 1,16 i 1,19 (s, 3H), 1,28 (s, 3H), 0,8-1,9 (m, 16H), 2,4-2,8 (m, 2H), 6,1-6,6 (szeroki s, 2H); widmo IR (CDCh): ymax 3550,2930,2700,1710,1455,1385 cm’¹; widmo masowe: m/e 340, 304, 289, 109, 95, 43; analiza elementarna: obliczono dla C20H36O4: C-70,54, H-10,66; znaleziono: C-70,99, H-10,63.

Przykład VIII. Przykład poniższy ilustruje konwersję a-etenylo-dekahydro-2-hydroksyar,2,5,5,8a-pentametylo-l-naftalenopropanolu (związek o wzorze4) w dodekahydro-3a,6,6,9atetrametylonafto[2,l-b]furan (związek o wzorze 1), z zastosowaniem dwuetapowego procesu.

Zastosowano postępowanie podobne do opisanego w przykładzie II, z tym, że stosowano siedem kolb, oraz że ilość Sclareolu (związek o wzorze 4) dodawanego do każdej kolby oraz czas inkubowania były zmienne (patrz tabela 5). Po zakończeniu inkubacji zawartość każdej kolby przerabiano oddzielnie i otrzymano siedem szarż surowego diolu o wzorze 3. Każdą próbkę poddawano oddzielnie reakcji z chlorkiem p-toluenosulfonylu w pirydynie, stosując metodę opisaną przez Cambie i wsp. w Aust. J. Chem. 24,591 (1971). Każdy produkt reakcji destylowano w rurze kulkowej i otrzymywano furan o wzorze 1 o następującej charakterystyce: widmo PMR

156 393 (CDCls) δ: 0,83 (2s, 6H), 0,88 (s, 3H), 0,9-1,8 (m, 13H), 1,9-2,0 (m, 1H), 3,77-3,92 (m, 2H); widmo IR (stop): 2940, 1460, 1385, 1365 cm1; widmo masowe: m/e 236, 221, 204, 177, 137, 97.

Wyniki siedmiu powyższych doświadczeń zestawiono w tabeli 5.

Tabela 5

Ilość Sclareolu o wzorze 4	Caikowitv czas inkubacji dni	Produkt o wzorze 1
Kolba	mg
Wydajność”	Czystość”' %
1	160	7	115	95
2	240	8	169	97
3	320	9	220	97
4	400	10	270	93
5	400	14	258	96
6	560	14	361	97
7	720	14	468	97

* Do wydajności nie wliczono próbek pobieranych do analizy.

”” Czystość oznaczano za pomocą chromatografii cieczowo-gazowej.

Przykład IX. Przykład poniższy ilustruje bezpośrednią cyklizację produktu transformacji, dekahydro-2-hydroksy-2,5,5,8a-tetrametylonaftaien.oetanolu o wzorze 3, bez wyodrębniania z wodnej pożywki, do dodekahydro-3a,6,6,9a-tetrametylonafto[2,l-b]furanu o wzorze 1.

Powtórzono postępowanie podobne do opisanego w przykładzie II, stosując jako substrat 2.,0 g Sclareolu w 100 mi brzeczki fermentacyjnej. Po całkowitym czasie inkubacji wynoszącym 14 dni, zawartość kolby przeniesiono do naczynia¹, reakcyjnego zaopatrzonego w mieszadło, ogrzewanie i chłodnicę zwrotną. Dodano 2,48 g chlorku p-toluenosulfonylu, 25 g pastylek wodorotlenku sodowego i 200 ml czterowodorofuranu. Całość mieszano w ciągu 5 godzin w temperaturze 20°C, po czym dodano jeszcze 1,50 g chlorku p-toluenosulfonylu i całość mieszano w ciągu nocy. Następnego dnia mieszaninę ogrzewano w ciągu 30 minut w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną, ochłodzono i ekstrahowano 3X 100 ml octami etylu. Połączone ekstrakty suszono nad Na2SO<, odparowano rozpuszczalnik i pozostałość destylowano w rurze kulkowej. Otrzymano 1,38 g stałego produktu, który zgodnie z analizą instrumentalną zawierał 85% dodekahydro3a,ć,6,9a~tetrametylonafto[2,J-b]furanu o wzorze 1.

Przykład X. Poniższy przykład ilustruje alternatywny sposób bezpośredniej cyklizacji produktu transformacji, dekahydro-2-hydroksy-2,5,5,8a-tctramety!onaftaienoetanolu o wzorze 3, bez wyodrębniania z wodnej pożywki, do dodekahydro-3a,6,6,9a-tetrametylonafto[2,l-b]furanu o wzorze 1.

Stosowano postępowanie podobne do opisanego w przykładzie II, stosując jako substrat 2,0 g Sclareolu w 100 ml brzeczki fermentacyjnej. Po całkowitym czasie inkubacji wynoszącym 14 dni, zawartość kolby przeniesiono do naczynia reakcyjnego zaopatrzonego w mieszadło, ogrzewanie i chłodnicę zwrotną. Brzeczkę fermentacyjną zakwaszono 6n kwasem solnym do pH około 1, dodano 100 ml octanu etylu i całość mieszano ogrzewając w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną w ciągu 6 godzin. Po ochłodzeniu oddzielono warstwę octanową, przemyto aż do zobojętnienia i suszono. Rozpuszczalnik odparowano i pozostałość destylowano w rurze kulkowej, otrzymując 1,4 g stałego produktu, który zgodnie z analizą instrumentalną zawierał 38% dodekahyd.ro-3a,6,6,9a-tetrametylonafto[2,l-b]furanu o wzorze 1.

Przykład XI. Przykład ten ilustruje alternatywny sposób bezpośredniej cyklizacji produktu transformacji, dekahydro-2-hydroksy-2,5,5,8a-tetrametylonaftalenoetanolu o wzorze 3, bez wyodrębniania z wodnej pożywki, do dodekahydro-3a,6,6,9a-ietrametylonafto[2,l-b]furanu o wzorze 1.

Stosowano postępowanie podobne do opisanego w przykładzie VIII, z tym, że do brzeczki fermentacyjnej zamiast ón kwasu solnego dodano 10 g żywicy jonowymiennej Dowex 50X2 400. Po przeróbce i destylacji w ruize kulkowej otrzymano 1,32 g stałego produktu, który zgodnie z analizą instrumentalną zawierał 37% związku o wzorze 1.

Jest oczywiste, że opisany powyżej wynalazek może być realizowany różnymi drogami, które nie oznaczają odejścia od jego podstawowej idei i zakresu. Wszystkie takie modyfikacje wchodzą w zakres załączonych zastrzeżeń..

OH

Wzór 13

Wzór 19

OH

Wzór 21

Wzór 20

CHO

Wzór 22

-CH₂^Y^vCH0 -CHz^Y^COOH

Wzór 23

OH

-CHz-^HcOOH

Wzór 25

-ch₂

Wzór 24

CH, '(Λ

Wzór 27

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 5000 zł.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób wytwarzania diolu o wzorze 3, ewentualnie w postaci zcyklizowanej o wzorze 1 na drodze transformacji w warunkach hodowli mikroorganizmu, znamienny tym, że hoduje się mikroorganizm Hyphozyma roseoniger, zidentyfikowany jako CBS 214.83 i ATCC 20624 w wodnej pożywce z napowietrzaniem, zawierającej związek lub związki o wzorach 15,16 i/lub 17, w którym R oznacza rodnik przedstawiony wzorami 18-27, przy pH pożywki 2,5-9 i o temperaturze 12-30°C, po czym wytworzony diol o wzorze 3,ewentualnie w środowisku pożywki cyklizuje się do związku o wzorze 1 lub alternatywnie wyodrębnia się diol o wzorze 3 i następnie cyklizuje się go do związku o wzorze 1.