PL149015B1 - Method for manufacturing ryfamycines - Google Patents

Description

Opis patentowy opublikowano: 90 04 30 Twórcywynalazku: Edward Zukowski, Kazimiera Skrzypkowska, Wieslaw Drzewinski, Stefan Ledwoch, Ryszard Andruszaniec, Krystyna Nowakowska, Miroslaw Dabrowski, Krzysztof Bujnowski, Jerzy Szymanski, Witold Szmigielski, Witold Napiórkowski, Jan Dominiak Uprawniony z patentu: TarchominskieZaklady Farmaceutyczne „POLFA", Warszawa (Polska) Sposób wytwarzania ryfamycyn Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania ryfamycyn, zwlaszcza ryfamycyn O i ryfamycyn S.Zwiazki te otrzymuje sie w skali przemyslowej glównie na drodze chemicznego przeksztalcania ryfamycyny B, antybiotyku wytwarzanego w procesie biosyntezy. Znany jest równiez sposób biologicznej transformacji ryfamycyny B do ryfamycyny O i ryfamycyny S przy uzyciu odpowied¬ nich enzymów.Ryfamycyny O i S stanowia pólprodukty do wytwarzania aktywnych biologicznie antybioty¬ ków stosowanych w lecznictwie, takich jak ryfamycyna SV i ryfampicyna.Z doniesien literaturowych i opisów patentowych znane sa metody otrzymywania ryfamycyn, zwlaszcza ryfamycyn O i S, polegajace na chemicznym utlenianiu ryfamycyny B, wylacznie w przesaczu z brzeczki po fermentacji, a nie bezposrednio w brzeczce, do ryfamycyny O, a nastepnie na przeksztalceniu ryfamycyny O w ryfamycyne S lub ryfamycyne SV.Próby wyodrebniania ryfamycyny B z brzeczki po fermentacji dla jej przeksztalcenia w ryfamycyne O i nastepnie w ryfamycyne S, wiazaly sie z uzyciem duzej ilosci rozpuszczalników, które wymagaly stosowania aparatury o zwiekszonej objetosci oraz prowadzenie wielokrotnej ekstrakcji. Ponadto równoczesnie z produktem wlasciwym ekstrahuje sie produkty uboczne, co powoduje koniecznosc dodatkowego oczyszczania i pociaga za soba obnizenie wydajnosci procesu.Jeden ze sposobów otrzymywania ryfamycyny B po procesie fermentacji, przed jej utlenieniem do ryfamycyny O, jest podany w opisie patentowym USA nr 2988 490. Z brzeczki uzyskuje sie przesacz pofermentacyjny (bulion), zawierajacy ryfamycyne B, który poddaje sie ekstrakcji, a nastepnie reekstrakcji ryfamycyny B. Do ekstrakcji w kwasnym zakresie pH stosowane sa rozpu¬ szczalniki organiczne, takie jak chloroform, octan etylu lub butylu oraz wodny roztwór buforowy dla przeprowadzenia ryfamycyny B, przed jej utlenieniem, z rozpuszczalnika organicznego do warstwy buforowej. Uzyskana wodna warstwe buforowa, zawierajaca ryfamycyne B, zadawano srodkiem utleniajacym i po reakcji z roztworu wodnego wytracano ryfamycyne O.2 149 015 Opisany sposób ma wiele niedogodnosci, takich jak wielokrotnosc ekstrakcji, stosowanie rozpuszczalników o duzej objetosci, niska wydajnosc i bardzo duza zawartosc substancji balastowych.Wedluginnej metody, opisanej w patencie belgijskim nr 796 018, proces utleniania ryfamycyny B do ryfamycyny O prowadzi sie w klarownym przesaczu, uzyskanym z brzeczki pofermentacyjnej, za pomoca znanych czynników utleniajacych, takich jak nadsiarczan sodu, azotyn sodu lub nadtlenek wodoru, przy wartosci pH 4,0-7,5, w temperaturze 15-25°C, w ukladzie jednofazowym bez stosowania rozpuszczalników organicznych. Proces utleniania przebiega w jednofazowym roztworze wodnym, powstalym z brzeczki pofermentacyjnej po oddzieleniu grzybni. Uzyskana w tych warunkach ryfamycyna O, jako nierozpuszczalny produkt w przesaczu wodnym, oddzielana jest przez saczenie. Metoda ta nie zapewnia selektywnosci, a produkt wykazuje tylko 60-70% czystosci. Jednoczesnie uzyskuje sie niska wydajnosc ryfamycyny O rzedu 85% w przeliczeniu na aktywnosc produktu.Znany jest równiez sposób otrzymywania ryfamycyn B, O i S metoda adsorpcji na zasadowej zywicy makrousieciowanej, a nastepnie na desorpcji w odpowiednim ukladzie rozpuszczalników organicznych, jak podano w opisie patentowym USA nr 4402877. W tej metodzie takze nalezy stosowac znaczne ilosci rozpuszczalników, przy czym selektywnosc produktów jest mala, a wydaj¬ nosc procesu uzyskiwanej ryfamycyny O w stosunku do utlenianej ryfamycyny B nie przekracza równiez 85%.W opisie patentowym USA nr 4431 735 podano sposób przeksztalcania ryfamycyny B do ryfamycyny O, a nastepnie do ryfamycyn S lub SV metoda biologiczna, która polega na poddaniu ryfamycyny B dzialaniu enzymatycznego utleniania przy zastosowaniu drobnoustrojów z gatunku Humicola lub Monocillium. Sposób ten daje dobre wyniki ale tylko w przypadku uzywania czystych roztworów ryfamycyny B, natomiast jesli jej transformacja jest przeprowadzana bezpos¬ rednio z bulionu pofermentacyjnego lub z brzeczki, metoda ta nie zapewnia uzyskania wysokiej czystosci produtku. Z przeprowadzonych doswiadczen wynika, ze odtrzymuje sie wówczas ryfa- mycyne O o czystosci 70-75%, wymagajaca dodatkowego oczyszczania przez co obniza sie wydaj¬ nosc procesu. Bardzo powoli przebiega proces transformacji, bo okolo 10 godzin i wymaga stosowania aparatury o duzej pojemnosci z uwagi na potrzebe wprowadzania nadmiaru rozpu¬ szczalników, przy czym procesu nie mozna prowadzic w sposób ciagly.Wedlugwynalazku, sposób wytwarzania ryfamycyn O i S z ryfamycyny B, zawartej w brzeczce pofermentacyjnej lub w jej wodnym przesaczu polega na prowadzeniu procesu utleniania ryfamy¬ cyny B do ryfamycyny O w ukladzie dwufazowym wodnoorganicznym z zastosowaniem nie mieszajacego sie z woda rozpuszczalnika organicznego lub mieszaniny rozpuszczalników nie mieszajacych sie z woda w ilosci 10-30% objetosciowych w stosunku do fazy wodnej w znanym zakresie pH srodowiska reakcji oraz znanymi srodkami utleniajacymi.Jako rozpuszczalniki organiczne nie mieszajace sie z woda stosuje sie zgodnie z wynalazkiem weglowodory aromatyczne, takie jak toluen lub benzen, badz chlorowcoalkany, takie jak 1,2- dichloroetan lub chloroform.Przez wprowadzenie rozpuszczalnika organicznego nie mieszajacego sie z woda lub miesza¬ niny tych rozpuszczalników bezposrednio do wodnego przesaczu pofermentacyjnego lub brzeczki z zawartoscia ryfamycyny B, oraz przez dodanie do mieszaniny znanego czynnika utleniajacego, nastepuje transformacja ryfamycyny B do ryfamycyny O, która przechodzi z fazy wodnej do fazy organicznej. Po procesie ulteniania oddziela sie od fazy wodnej faze organiczna, zawierajaca ryfamycyne O w postaci ekstraktu, który ewentualnie przemywa sie wodnym roztworem buforu fosforanowego lub roztworem mocznika o tej samej wartosci pH w przypadku stosowania chlo- rowcoalkanu jako rozpuszczalnika organicznego nie mieszajacego sie z woda.Sposób prowadzenia procesu utleniania ryfamycyny B zarówno w brzeczce, który dotychczas nie byl stosowany,jak i w przesaczu pofermentacyjnym z udzialem rozpuszczalnikóworganicznych nie mieszajacych sie z woda, w ukladzie dwufazowym wodnoorganicznym, jest nie znany w technice i stanowi istote wynalazku.Ryfamycyne O wydziela sie z ekstraktu przez krystalizacje. Jesli jako rozpuszczalnik organi¬ czny nie mieszajacy sie z woda stosowany jest toluen lub benzen, to ekstrakt z zawartoscia ryfamycyny O zageszcza sie prawie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, a do pozostalosci149015 3 dodaje sie nizszy alkohol alifatyczny, np. metanol, odpedza resztki toluenu lub benzenu, dodaje wode, obnizajac temperature krystalizacji do 4°C i otrzymuje sie krystaliczna ryfamycyne O z wydajnoscia 95% o czystosci 98%.Przy zastosowaniu toluenu lub benzenu jako rozpuszczalnika organicznego nie mieszajacego sie z woda mozna bez dodatkowej obróbki zagescic ekstrakt do stezenia okolo 120 000/ig ryfamy- cyny Owi cm3 i przeprowadzic transformacje ryfamycyny O bez jej wydzielania do ryfamycyny S przy uzyciu kwasu siarkowego i alkoholu alifatycznego o 1-4 atomach wegla, korzystnie metanolu.Po transformacji wydziela sie ryfamycyne S przez krystalizacje z wydajnoscia 80% i o czystosci 98%. Oznaczenie czystosci dokonywano metoda spektrofotometryczna i chromatograficzna.Roztwór toluenowy zawierajacy ryfamycyne S, po uprzedniej transformacji ryfamycyny B do ryfamycyny O i drugiej transformacji ryfamycyny O do Sjest przydatny do dalszego przerobu dla otrzymania 3-formyloryfamycyny SV wedlug znanych metod bez koniecznosci dodatkowego oczyszczania i wyodrebniania krystalicznej ryfamycyny S.Znamienna cecha prowadzonego wedlug wynalazku procesu utleniania ryfamycyny B jest fakt, ze powstajaca w czasie procesu ryfamycyna Ojest natychmiast ekstrahowana do rozpuszczal¬ nika organicznego nie mieszajacego sie z woda, jako nierozpuszczalna w fazie wodnej, a rozpu¬ szczalna w fazie organicznej, w której nie ulega rozkladowi, co zapewnia znaczne zwiekszenie wydajnosci utleniania i zabezpiecza czystosc produktu. W ten sposób unika sie równiez mechani¬ cznego osadzania ryfamycyny O na smolistych pozostalosciach zwiazków zanieczyszczajacych wyjsciowy roztwór.Procesy utleniania, ekstrakcji i rozdzialu faz przebiegaja szybko w ciagu zaledwie 1-2 godzin.Wybór szczególnie toluenu do procesu utleniania wiaze sie z istnieniem takiego fazowego napiecia powierzchniowego, które zabezpiecza ryfamycyne O przed dzialaniem reagentów w fazie wodnej oraz szybko i skutecznie odprowadza ryfamycyne O ze srodowiska wodnego po jej utworzeniu. Ponadto charakter fizykochemiczny toluenu sprzyja selektywnosci w minimalizowa¬ niu rodzaju zanieczyszczen i ich ilosci, które przechodza do fazy organicznej, nie zaburzajac kontaktu ryfamycyny B z czynnikiem utleniajacym.Selektywnosc utleniania ryfamycyny B do ryfamycyny O w brzeczce lub w przesaczu pofer¬ mentacyjnym i ekstrakcji wedlug wynalazku przedstwione sa na zalaczonym do opisu chromato- gramie /TLC/ wykonanym na folii firmy Merck-DC-Alufolien Kieselgel 60F 254, w ukladzie benzen — metanol /5:1/, w którym kolejne pozycje oznaczaja: 1. ryfamycyna O — standard, 2. ryfamycyna O — produkt wyodrebniony sposobem wedlug wynalazku, 3. ryfamycyny O — ekstrakt toluenowy otrzymany sposobem wedlug wynalazku, 4 i 5. ryfamycyna O — ekstrakty ograniczne otrzymane sposobem wedlug innych wynalazków.Przyklad I. Do 2 dm3 brzeczki pofermentacyjnej, zawierajacej 400//g/cm3 ryfamycyny B, dodano przy ciaglym mieszaniu 350 cm benzenu i 9 g nadsiarczanu sodu, po czym mieszano przez 1 godzine. Staly osad grzybni oddzielono na wirówce, a warstwe ciekla pozostawiono do rozdzialu dwóch faz: wodnej i organicznej. Faze wodna odrzucono pozostawiajac faze benzenowa do dalszego postepowania. Odwirowany osad grzybni wymieszano z 1 dm3 wody i powtórnie ekstra¬ howano go 200 cm3 benzenu. Odwirowany osad odrzucowno, a warstwe ciekla rozdzielono na wodna i organiczna, benzenowa, wykorzystujac tylko faze organiczna. Polaczone wyciagi benze¬ nowe zawierajace ryfamycyne O odparowano do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Do suchej pozostalosci dodano 150 cm3 metanolu, ogrzano do temperatury 35-40°C i roztwór odsaczono do stalych zanieczyszczen. Do metanolowego roztworu ryfamycyny O dodano podczas mieszania 40 cm3 wody i po 4 godzinach krystalizacji w temperaturze 4°C oddzielono wytracone krysztaly ryfamycyny O, przemytoje 50 dm3 mieszaniny wodno-metanolowej /l: 1/ i wysuszono w tempera¬ turze 45-55°C pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymano 7,6 g ryfamycyny O z wydajnoscia 95% i o czystosci 98%.Przyklad II. Do 5dm3 brzeczki pofermentacyjnej o zawartosci 5200/yg ryfamycyny B w lem3 dodano podczas mieszania 1 dm3 toluenu i 28,5g nadsiarczanu amonu, po czym calosc mieszano przez 1,5 godziny.Osad grzybni oddzielono przez odwirowanie a ciecz pozostawiono do rozdzialu faz, jak w przykladzie I. Po odrzuceniu grzybni i warstwy wodnej uwolniono warstwe toluenowa jako faze organiczna od stalych zanieczyszczen przez filtracje. Odparowano do sucha faze toluenowa, zawierajaca ryfamycyne O pod zmniejszonym cisnieniem i po krystalizacji z4 149 015 "uwodnionego metanolu /l :1/ oraz wysuszeniu otrzymano 25 g ryfamycyny O, co stanowi 96% wydajnosci produktu o czystosci 98,5%.Przyklad III. Do 200 dm3 przesaczu pofermentacyjnego /bulionu/, zawierajacego 5000//g ryfamycyny B i 1 cm3, przy wartosci pH 7,2 dodano podczas mieszania 40 dm3 toluenu i 1,1 kg nadsiarczanu sodu. Calosc mieszano 0,5 godziny i pozostawiono do rozdzialu dwóch faz. Wodna faze odrzucono a organiczna faze toluenowa, zawierajaca ryfamycyne O zageszczono do objetosci 10 dm3. Nastepnie do zageszczonego roztworu dodano 10 dm3 metanolu i 0,64 dm3 oraz 33% roztworu kwasu siarkowego. Calosc mieszano w temperaturze 20°C przez 8 godzin. Ekstrakt organiczny, zawierajacy ryfamycyne S, po odmyciu z niego metanolu i kwasu siarkowego woda, zageszczono pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 2 dm3, dodano 20 dm3 metanolu i odparo¬ wano do objetosci 3 dm3. Wykrystalizowany osad ryfamycyny S mieszano w temperaturze -5°C przez 3 godziny, odsaczono go, przemyto ochlodzonym metanolem i wysuszono. Otrzymano 0,8 kg ryfamycyny S o aktywnosci 940/ig/mg, co stanowi 81% wydajnosci. Czystosc 98,5%.Przyklad IV. Do 2,5dm3 przesaczu pofermentacyjnego /bulionu/ o zawartosci 4000//g ryfamycyny B w 1 cm3 dodano podczas mieszania 350 cm3 chloroformu i 8 g nadsiarczanu sodu, po czym calosc mieszano przez 6 godzin. Po reakcji utlenienia ryfamycyny B do ryfamycyny O dodano stezony 0,5% roztwór buforu fosforanowego do wartosci pH 7,2. Calosc mieszanoprzez godzine, a nastepnie ogrzano do temperatury 35-40°C i dodano roztwór wodny NaCl w ilosci 4% wagowo/ objetosciowo. Po 15 minutach przerwano mieszanie i roztwór schlodzono powoli do temperatury 18-20°C. Po 6 godzinach oddzielono faze chloroformowa a faze wodna ekstrahowano ponownie 170 cm3 chloroformu. Po rozwarstwieniu faz wodna faze oddzielono i odrzucono, a zebrane ekstrakty chloroformowe, zawierajace ryfamycyne O, odsaczono do zanieczyszczen stalych i zageszczono do stezenia ryfamycyny O okolo 150000 — 180 000//g/cm3. Nastepnie dodano metanol w ilosci równej objetosci zageszczonego ekstraktu chloroformowego i 6,4 cm3 33% kwasu siarkowego, prowadzac hydrolize ryfamycyny O od ryfamycyny S, jak w przykladzie III. Otrzy¬ mano 7,7 g ryfamycyny S o aktywnosci 950//g/mg i czystosci 98%. Wydajnosc procesu 77%.Przyklad V. Do 150dm3 bulionu o zawartosci ryfamycyny B 4500//g w lem3 dodano podczas mieszania rozpuszczalniki nie mieszajace sie z woda w mieszaninie skladajacej sie z 20 dm3 toluenu i 5 dm3 1,2-dichloroetanu oraz 0,8 kg nadsiarczanu amonu. Calosc mieszano 0,5 godziny i pozostawiono ja do rozdzialu faz, po czym faze wodna odrzucono a faze organiczna zageszczono pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 4,5 dm3. Nastepnie do zageszczonego roztworu, zawie- rajacego ryfamycyne O , dodano 4,5 dm metanolu i 0,4 dm 33% kwasu siarkowego, przeprowa¬ dzajac hydrolize ryfamycyny O do ryfamycyny S, jak w przykladzie III. Otrzymano 0,54 kg ryfamycyny S o aktywnosci 960//g/mg, co stanowi 83% wydajnosci. Czystosc produktu — 98,5%.Przyklad VI. Do 200 cm3 ekstraktu toluenowego, otrzymanego sposobem jak w przykla¬ dzie III, zawierajacego 15 g ryfamycyny S dodano 15 g bezwodnego siarczanu sodu i calosc mieszano przez 30 minut. Po odwodnieniu ekstraktu odsaczono osad siarczanu sodu i dodano do ekstraktu 7,5 g dwutlenku manganu, 10 cm3 N-metylo-tertbutyloaminy i 4,3 cm3tertbutyloaminy.Calosc ogrzewano w temperaturze 50°C przez 12 godzin przy ciaglym mieszaniu. Nastepnie odsaczono dwutlenek manganu zjego zredukowanymipochodnymi i ekstrakt przemyto niewielka iloscia toluenu. Roztwór toluenowy zageszczono pod zmniejszonym cisnieniem az do sucha, rozpuszczono sucha pozostalosc w 75 cm3 czterowodorofuranu i dodano podczas mieszania roz¬ twór, zawierajacy 80 cm3 15% kwasu siarkowego i 5 g kwasu askorbinowego. Calosc mieszano w ciagu 3 godzin w temperaturze 45°C do czasu calkowitej hydrolizy i redukcji do 3-formylo- ryfamycyny SV.Nastepnie po redukcji roztwór ochlodzono do temperatury 15°C w celu krystalizacji, miesza¬ jac przez 2 godziny.Wytracony osad odsaczono i przemyto 50% roztworem wodnym czterowodo¬ rofuranu. Po wysuszeniu osadu otrzymano 13,5 g 3-formyloryfamycyny SV o aktywnosci 900//g/mg, co stanowi 90% wydajnosci, obliczonej w stosunku do ryfamycyny S w ekstrakcie toluenowym. Czystosc produktu — 98,5%.149 015 5 PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania ryfamycyny O i S z ryfamycyny B, zawartej w przesaczu brzeczki pofermentacyjnej, przez jej utlenienie do ryfamycyny O znanymi srodkami utleniajacymi i nastep¬ nie przez dalsze przekszatlcenie w ryfamycyne S oraz w 3-formyloryfamycync SV, znamienny tym, ze proces utleniania ryfamycyny B do ryfamycyny O prowadzi sie w brzeczce pofermentacyjnej lub wjej wodnym przesaczu w ukladzie dwufazowym wodnoorganicznym z zastosowaniem nie miesza¬ jacego sie z woda rozpuszczalnika organicznego lub mieszaniny rozpuszczalników organicznych nie mieszajacych sie z woda, w ilosci 10-30% objetosciowych w stosunku do fazy wodnej, nastepnie oddziela sie od fazy wodnej faze organiczna, zawierajaca ryfamycyne O w postaci ekstraktu, który ewentualnie przemywa sie roztworem wodnym buforu fosforanowego* lub wodnym roztworem mocznika i zageszcza, po czym albo wydziela sie ryfamycyne O przez krystalizacje i poddaje hydrolizie do ryfamycyny S, albo bez jej wydzielania przeprowadza sie transformacje ryfamycyny O do ryfamycyny S lub do 3-formyloryfamycyny SV bezposrednio w ekstrakcie.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, zejako rozpuszczalniki organiczne nie mieszajace sie z woda stosuje sie weglowodory aromatyczne, takie jak toluen lub benzen, badz chlorowcoal- kany, takie jak 1,2-dichloroetan lub chloroform. gooo? r; Sr' "i C3 o u li II O r \ z 3 PL