Przedmiotem wynalazku jest sposób wyltwarza- nia nowego tatradekapeptydu o wzorze 1, oraz Jego farmaceutycznie dopuszczalnych, addycyjnych soli z kwasami.Sdmatostatyna, anana takze jako ozyminiJk ha¬ mujacy wydzielanie somatoitiropiny, jdst telfcradeka- peiptyden o wizoirize 2. Teoi letiradekapeiptyd wyizo¬ lowano iz ekstraktów podwzgórzy owczych, iStwier- dzajac, ze wykazuje on aikltywmoisc hamowania wy¬ dzielania hoirmomu wzrostu (GH), znanego takze jalko somaitoftiroipina [P. Brazeau, W. Valis, R. Bur¬ gas, N. Ling, M. Buitcher, J. Rivier i R. Guiille- Poza tym w opisie paitenitowyim Stanów Zjed- noczonyclh Nr 3 904594 opisano naturalna soima- tostoityine ja(k równiez rodzine irmych zwiazków posiadajacych sekwencje dodeikapeptydowa repre- zenitowama w pozycjach 3—14 hormonu naturalne¬ go. Ponadto, zwiazek oznaczony D-AQax-somati06ita- tyna, zositai przedstawiony przez Ferlanda i wsp. w MolecuOair and CeBulaT Endoorinolloigy, 4, 7i9—S8 (1976)..Chociaz D-AJa^-isomatoisltaitytna jesit stereoizloime- rem naturalnej L-AflaJ-isornaitosl^yny, posiada oma o polowe mniejsza aktywnosc w hamowaniu in vivo wydizielania kwasów zoladkowych niz na¬ turalna somartostatyna. Wyltwanzana sposobem we- dluig wynalazku D-Y^nsoniaitotsltaityna rózni sie 10 16 20 od D-Ala1-isomatostatyny (tym, ze w miejsce dwóch atomów wodoru posiada dwie grupy metylowe.Mozna byloby wiec oczekiwac, ze aktywnosc far¬ makologiczna D-Ya^isomatastaityny bedzie podob¬ na do aktywnosci D-Ala^somatostatyny, a wiec bedizie nizsza, niz aktywnosc naturalnego hormo¬ nu w hamowaniu in vivo wydzielania kwasów zoJladikowyclh. D-YM^somaitostatyna posiada jed¬ nakze niJetcb wyzsza aktywnosc od aktywnosci na¬ turalnego hormonu, co wskazuje na nieoczekiwa- ne wlasciwosci D-Vail1-samatotstatyny w porów¬ naniu ze 'znanymi zwiazlkaimi o podobnej struk¬ turze.Biologicznie czynny tetradekapeptyd wytwarza¬ ny siDosobem wedlug Wynalazku posiada wzór 1 dotyczacy takze jego nietoksycznych isoii addy¬ cyjnych z Ikwasami. Budowa jego rózni sie od budowy somaltostatyny tyim, ze w pozycji 1 za¬ miast L^aianihy zawiera on reszte D-waliny. Dla wygody tetadekapelpltyd o wzorze 1 mozna okre¬ slic jako D-Val1HSomatostaityne. Tak wiec, sposo¬ bem wedlug wynalazku wytwarza sie zwiazek o wzorze 1 oraz jego farmaceutycznie dopuszczalne, nietoksycznie sole addycyjne z kwasami.Cecha ("sposobu wedlug wynalazku jest to, ze odpowiedni pios^tolancuiohowy tetradekapeptyd o wzorze H-D-Vad-01y-L-Cys-L^Lys-L-Asn-L-Phe-L- -Pne^L-T^p^HLys-L-Thir-L-Phe-I^Thr-L-SOT -Cys-OH poddaje isie reakcji ze srodkiem uitlenia- 114 533s * jacym. W reakcji tej dwie grupy tiolowe zostaja przeksztalcone w imostek dwuisdarazkowy.• Korzysitmue jako srodek utleniajacy istoisuje sie powietrze.Do faTiniaceuitycznde dopuszczalnych nietoksycz¬ nych soli addycyjnych iz kwasami naleza sode oiigandczne i nieorganiczne* na przyklad sole u- tworzone z takimi kwasami, jak kwas solny, siar- feowy, sulfonowy, winowy, fumarowy, bromowo- doroiwy, glijkolowy, cytrynowy, niaiedinowy, fosfo- rowy, bursztynowy, octowy, azotowy, benzoesowy, askorbinowy, p-(toduenosuManowy, benizenoauLfomo¬ wy, naditalenrasa^onowy d propioinowy. Korzyistoiy- md kwasnymi solami addcyijnyimi sa sole uttworzo^ ne z^kwa&enr octowym^ Kazda z powyzszych soir oteymiujc sie 'w anahy sposób. ~ P^sltotancuchowy te^rapepltyd istamowiacy zwia¬ zek wygcciwy iw^spo&obde wedlug wynalazku o- trzjnmiuije *sie^ z peptjclu o wizonize R-iD- -Cyis^I^AanHLH^ -L-Ly^R^J^ThiiCRs}^^ -L-Cyis<'Ri)-X, w którym R oznacza aitom wodoru lub grupe zabezpieczajaca grupe a-aminowa; Rj c- znacza atom wodoru Hub grupe izabeizpieozajaca grupe tao; R2 oznacza atom wodoru lub grupe za¬ bezpieczajaca grupe e^aniinowa; Rj i R4 kazdy o- zmaoza atom wodoru llufb grupe zalbezpieazajaca ginupe liydroikisyilowa; R5 oznacza aitom wodoru lub grupe formylowa, a X oznacza igrupe hydroksylo- wa albo ugruipowainde o wtzomze 3, w którym ofcre- slentie zywdica oznacza zywdce ipoddfltyirenowa, iz tym, ze w przypadku |g|dy X oznacza grupe ihydrokisytlo- wa, kazdy a. podstawników R, Ri, R2, R$, R4 i R$ oznacza atom wodoru, a gdy X orniacza ugnupo- " wande o wzorze 2, kazdy z R, R^ .R2 R3 i R4 ma znaczenie inne niz atom wodoru. Grupy zabezpieczajace grupe a^aoniinowa oznaczone sym¬ bolem R isa dobrze izname w daiedziiniie peptydów.Wiele z mdch wysaazególnda J. W. Barton w roz¬ dziale 2 cytowanej wyzeu '.pracy McOmde. l Pnzydciadami takich grup zabezpieczajacych sa grupy: benaydokisyteariboinyaowa, pHC^orofoenzylDksy- karbonylowa, pHbronTObentzylojkisyikadbon^ o- K^hloi^beniz^loksyikarbonydowa, fi^-dwucihloroben- zyloktsykambonylowa, 2,4-^3jwuioMorObe(rkzylo|ksyk!ar- bonylowa, onbroniabemylokisyikatfbm p-tme- toksybenizyloksykarbonyflowa^ p^toóbemyflofcsy- kairbonylowa, inHiizejdjbuitokisyika^ Ill-raed.amyloksykarbonylowa, 2-/p^dw.ufenylo/i- zoipropokisykarbonylowa t(Bp-QC), adajnienfcylakisy- karbonyilowa, iizopropcki&jflkartbonyilowa, cylkflopen- tyloksykarbonylowa, cylkloliefesyiloikisylkarbonylowa, cyikloheptydodosykiawbonyaowa; trójfenyllometydowa (tritylowa) d r^tolueiwsailfonyllowa. Korzystna gru¬ pa zabezpieczajaca grupe «naiminowa, oznaczona symbolem R, jest grupa IIInra;baitoksykaribonylo- wa.Ri oznacza albo atom wodoru grupy- tioflowej cysteiny aOibo* grupe izafbezpdeczajaca te grupe. Wie¬ le grup zaibecpieczajacych tego rodzaju opisali R. G. Htickey, V. R. Ra© i W. G. Rlhodes w roz¬ dziale 7 cytowanego MaOmie. Plnzyjkiadamd talkach gruip iabezpieazajacych sa takze grupy jak p- - -metoktsytoenzyilowa, -betnizylowa, p-ttolilowa, benz- 1533 4 hydrylicwa, aoetaimiidometylowa, tritylowa, pHnditro- benzylowa, Ill^rzed.butylowa, izobutaksymetylo- wa, a tateze jaikaikdlwielk iz pochodnych gnupy tri- tylowej. Inine grupy opisal, na pnzylkla6 Houtoeir- rWeyil w Methodes der Ongamiischen Chemie, ,ySyn- these von Peptiden", tomy 15/1 i- 16/2 (H9T74), Stuttgant,, Niemicy. Konzyiatna grupa zabezpiecza¬ jaca gruipe tdodowa oiznaczona symbolem Ri jest grupa p-metctey(beinzyilowa.R2 oznacza albo atom wodoru funkcji f-amino¬ wej reszlty lizyny, albo grupe zalbezpieczajajca gru¬ pe c-aminowa. PnzyMadem taikich grup jesJt wiek- s,zosc gruip wyzej wymieiriioraych, nadajacych sie 15 do uzycia jako grupy zabezpieczajace grupe a- -aminowa. Do typowych grup teigo rodizaiju nalezy grupa beozylofcsykarbonyaowa, ninrizejdjbiultolksyikar- tonydowa, III-rzeJd.amydolkisylkairbonylowa, cyklo- penftyloksykarbonylowa, adamonitylclkByikaribonylo- 20 wa, pHmetofcsybeinizylloksykairbonyaowa, p-chfloroiben- . izyilioiksy wa, o^hlloiroibenizydolcsytkarboinylówa, 2,6Hdwuchlo»- robeozyloiksyikarbonylowa, 2,4-dwiuchlorobeinzyk- Jcsyfearbonydowa, o-bro 25 p-initxobenizylokisykarboctylowa^ izopropakisyikaTbo- nyflowa, cyikdohekisyloksyikaribonyttowa, cylldohepty- Iciksyikairtbonyaowa i pntoluenostuilionyilowa.Jaik pnzedatawioinio ponizaj, proces, w którym wytwarza sie subatrat do otazyimywanda - teitradie- 30 kapeptydu o wizonze 1, obejmuje powtarzajace sie odszczepiamie grupy zabezpieczajacej grupe CHami- ncwa od koncowego amiinokwaisu obecnego w lan¬ cuchu peptydowym. To tez jedynym ogranicze^ indem odmosizacym sie do rodlzaju grupy zabezpie- 35 czajacej grupe c-arndnowa reszty lieyny jesit wa¬ runek, aby grupe te .stanowila taka grupa, totóra nde udeginije odjazczepieiniu w warunkach przyje¬ tych dla selektywnego odszczepiainda grupy zaibez- pieczajaoej grupe a-amimowa. Dobór odpowiedindich 40 grup zabezpieczajacyoh grupy anamimowa i e-ami- nowa jes;t dobnze izmamy w dziedzinie ohemid pep- tydów i zalezy od wzglednej laitwoscd odszczepda- nia sde poszczególnych grup. Tafloie igrupy jak grupa 2^/p^bifenylilo/iizopropo 45 OC) i trdityilicwa, sa ibardizo laMine i moga zo¬ stac odszczepione juz nawet w dbecnosci slabego kwasu. Do adiszczepieniia innych grup, takdcth jak grupa Illnrzejd^bu^cteykarbonyaowa, IH-rzed.aimylo- ksykarbonylowa, adamawtyloksyikaiiflbonyaowa i p- 90 -mei^ofcsybenjzyllolksyikarbonydowa, kondeczoie jesft u- zycie uimiaiitowainie mocnego kwasu, takiego jak kwas solny i trojfluorooctowy lub tróijiliioTek bo¬ ru w kwasie ocftowyim. Jeazcze ibardizdej kwasne srodowisko niezbejdine jest do spowodowamia od- 55 szazepienia innych grup izabe^pieczajaicych, tattdch jak grupa (benzyloksykarblolnylowa, dMorowcoben-. zylpiksykarbonyaowa, pnniilrotoenizydokisyfcarbc^ wa, cykloodkliiloklsykarbK^ i iizopropctayfcar- bonylowa. Do lodiszczepienda tych oistartmach grup «o potrzebne sa drastycznie kwasne warunki, takie ja(k zastosowande broanowodoru, fluorowodoru lub ^ trójiflluorooctainu Iboru w kwaisie frojiffluoToooto- wym.Oozyrwiscde w prizypadlku uzycia mocniejszego 69 kwasu ulega odiszczepniendu kazda z bairdinej la- ^6 114 533 6 bilnych grup. Wlasciwy dobór grup zabezpiecza¬ jacych grupy aminowe polega na zastosowaniu do ochrony fumlkcji a-aimiinowej grup bairdzateB labil- nyoh niz do ochrony funikcji e-aiminowel z uw- zglednieniem warunlków selektywnego Odiszczepia- nia, które zapewniaja usuniecie wylacznie grupy zabezpieczaijacej funkcje tt^aminowa. W tymi kon¬ tekscie R«* korzystnie * oznacza grrulpe o-chiloTobein- zyloksyfcarbonylowa lufo cyikloken.tyllolksyi^^ wa i w zwiazfcu iz itym, laorzysifcna grupa zabez¬ pieczajaca grupe a^airninowa. z Wyboru, która moz- na zastosowac w przypadlku kazdego aminokwa¬ su, rktóry przylacza sie do lancucha pepitydowe- go, jest grupa IirnraedJbiJtoikisylcad^onyilowa.Ra i R4 oznaczaja atom wodoru grupy wodoro¬ tlenowej lufo grupe zabezpieczajaca grupe wodo¬ rotlenowa, treoniny i seryny. Wiele grtup zabez¬ pieczajacych tego* rodzaju opisal C. B. Reefte w rozdziale 13 cyfrowanego McOmie. Do typowych grup zabezpieczajacych tego rodzaiju nalezy, na przyklad, grupa aiEriilowa o 1—4 atomach we¬ gla, talka jalk metylowa, eftyOowa 1 IU-ffzejd-bultyflo- wa,'"(grupa benzylowa, pdd&telwiona grupa beozylo- wa, taka ijalk pnmeltoksyfoemylowa, p-tófcrobenz.y- lowa, p^dHtottiofoenylowa i o^ohlorooeri^yJowa, gru¬ pa alikatnokaabonylowa o, i^3atfomach wegla, ta¬ ka jak foimyflowa, ace^yOowa i propdonylo^ gru¬ pa trójifenylometytiowa (Mtyflowa) i temu podob¬ ne. Korzystanie,, jezeli R3 i R4 Oznaczaja grulpy zabesgpieczajaoe, grupa z wyboru jeat w obu przy¬ padkach grupa benzyilowta.R5 oznacza aiibo atom wodoru alfbo grupe for- myilowa i stanowi ugrupowanie =NRs resaty tryp- tófaou. Grupa fortmyllowa pelni funkcje garfupy zabezpieczajacej. Uzycie (takiej grupy zabezpiecza¬ jacej jest waruirtkowe, (to ftez wlasciwie R5 moze oznaczac atom wodoru (N-niezahezpieczony) lub grupe formylowa (N-zabea^piecaony).Grupa X jesft zwiazana z Itermdnallna grupa kar- boksyflowa lancucha tetraldekapelptydu. X moze oz¬ naczac grupe hydroksylowa d w tym^ przypadlkfu wystepuje wodna gcupa kaifootosyilowa. X moze tez oznaczac zywice stanowiaca staly nosnik, z którym w trakcie syntezy zflaczona jesit konco'- wa grupa karboksyllowa pepltyfdu. Te stala zy¬ wice przedstawia wzór 3.W powyzszych przypadJkaich, gdy X oznacza grupe hydirolfcsylowa, kazdy z syimboE R, Ri, R2, R8, R4 i R5 oznacza aitom woidotru. Gdy X ozna¬ cza.- staly nosnik — zywice, kazdy z symboli R, Ri, R2, R3 i R4 oznacza grupe zabezpieczaja¬ ca.W niniejszym opisie csltosuje sie nastepujace skróty, z których wiekszosc jest dofoitze znana i stosowana1: Ada — alanina; Aisn — aisparagina; Cys — cysteina; Gly — glicyna; Lys — lizyna; Phe — ^enyloalenina; Ser — seryma'; Thr — treo- ndma; Trp — tryptofain; Vail — waflina; DOC — N,N%dwucykJohefcsyfloIkar^ DMF — N,N- ^wumetyktfommanidd; BOC — grupa HfI^rzejd.bu- toksykanbonyflowa; PMB — grupa p-metoksyiben- zylowa; CBzOC — grupa OMchlorolbenzylofcsykar- bonylowa; CPOC — grupa cyikikjpentyloaDsykairfoo- nyOowa; Bal — @nupa benzyrlowa; FVxr —. grupa fonmyfl/ow-a; DpOC — gnupa 2-^bifenyililo/iizopro- poksyfcairfbonyllowa. , ' ^ Chociaz dobór poszczególnych gnup zafbezpiejcza- jacych przeznaczonych 'do wykorzystania w syn¬ tezie zwiazlków o wzorze 1 jest dobrze znany w dzietónie pej*tydów, naliczy wzdac pod uwage, ze wybór danej grupy ochronnej jest zalezny od sekwencji ireatkcji. Innymi slowy, grupe zabez¬ pieczajaca z wyboru powinna sitanowic grupa 10 trwala wobec odczynników i warunków sitoso^ wanych w nastepnych etapach sekwencji- pro¬ cesu. Na przylklad, jak to juz azesciowo omówio¬ no, zastosowana grupa zabezpieczajaca rmisd byc talka grupa, która kpozo$tade nienaruszona w wa- 15 rumkach odszczepienia grupy zabezpieczaifajcej gru¬ pe a^amiinowa koncowego aminokwaisu we frag¬ mencie peptydu przygortowywanego do przylacze¬ nia kolejnego fragmentu aoninokwaisowego do lan¬ cucha peptydowegc. Jest takze rzecza wazna, aby 10 jako grupe zabezpieczajaca wyfhrasc tafca grupe, która pozostaje nienarutszona podczas budowy lan¬ cucha peptyldcwego i która mozna laitwo usu¬ nac po zaikonczeniiu symifcezy zajdanego tetradieka- peptydu. Zagadnienia te sa znane w dziedzinie 25 chemii, peptyidów. j Z powyzszego wynika, ze tetradekapeptyd o wzorze 1 mozna wytwarzac na Tdrodze syntezy -w fazie stalej. Syniteza ta polega na istopniowej budowie lancucha peptydowego, zaczynajac od C- 4conca peptyidiu. Dokladniej, najpierw wiaze sie cystdine poprzez jej grupe karboksylowa z zy¬ wica na drodze reakcji cyistediny, o zabezpieczo¬ nej gruipie aminowej i tidlowej, ;z ohlorometylo- wana lub hyidrokjsyme(tylowana zjrwica. Sjpasób wy- twarzamLa zywicy hydirdksymetyllowanej jest opi¬ sany przez Bodantsdky'ego i wsp. w Ghem. Ind.(London), S8, 16^7—98 <1986). Handaowo dostepna jest zywica chdorometyflowana produtocji Lab. Sy¬ stems, Inc. San Mateo, Califiarnda. 40 Wiazanie cysteiny na C4concem z zywica pro¬ wadzi sie w ten sposób, ze najpierw zabezpieczo¬ na cyisteine przeksztalca sie w jej sól tezowa. .Otrzymana sól poddaje sie naistepnie reakcji z 49 zywica wedlug metody opUsanetf pczez Bj F. Gisi- na w Heav. OMm. Acta, $6, 147« (1S73). W inny sposób, cyisteine mozna zwiazac z zywica atoty- wujac funkcje kaofooksyflowa czasteczM cysteiny znanymi metodami. Na przyfk&ad cySteine mozna 50 poddac reafecji z zywica w obecnosci uwiazflcu aitotywujajcego grupe' kaiboksyiowa, taMego jak N,N'-dwucytkftoihekiS3^oka^^ (DCC).Po pizylaczeniu cystediny (jej wolna grupa kar-- boksylowa do nosnilka zywicy, -pozostale etapy 55 sekwencji buldowy peptydai obejamuja ikolejna ad- dycje poiszczególnycih amindkwasów do N-teonoowej czesci lancucha peptydowego. IV) .tez nieodzow¬ nie kazda isekwencja procesu obejmuje odszcze- pienie gruipy zaibezjpieczajacej grupe a-aiminowa 60 z aniiinolkwaisu istancwdapego N-teoniec fragmen¬ tu peptydu, a nastepnie przylajczenie kolejnej iesz- ty amiinokwasowej do juz wolnego i akitywnego aminokwaisu na N-*oncu. Odiszczepienie grupy za¬ bezpieczajacej grupe a-amdnowa dokonac mozna 65 w obecnosci tewaisu, takiego jak kwas bromowo-7 114 533 « dorowy, solny, trójlfluoroootowy, p-toluenosulfono- wy, benzenosuflfonowy, natfl^enosudifonowy i octo¬ wy z utworzeniem odpowiedniej ikiwasnej isoli ad¬ dycyjnej.Inna metoda nadiaijaca sie do przeprowadzenia odszczepiania girupy zabezpieczajacej grupe amiino- wa .polega na uzyciu trójfiluortou boru. Na przy¬ klad dwuetyOoelterat trójfluoalku boru w lodowa¬ tym kwasie octowym powoduje . przeksztalcenie fragmentu peptydu z zabezpieczona .grupa amino¬ wa w kompleks z BFj, który nastepnie mozna przeksztalcic w odblokowany fragment peptydu poddajac go dzialaniu zasady, itakiej jaik wodny roztwór wodoroweglanu potasowego. Mozna sitoso- wac kazda z tych meltod jezeli tyfllko stwierdzi sie, ze metoda z wylboru daije odszczepianie,, gru¬ py zabezplecizaijacej N-koncowa grupe anamanowa z uniknieciem odiszczepienia jalMejlkolwielk innej grupy zabezpieczajacej wystepujacej w lancuchu peptydowym. Z tego wizgjledu odszczepienie N- nkon-coweij grupy zabezpieczajacej, korzystnie pro¬ wadzi sie za pomoca kwasu trójlflluoroofltowego.Ogólnie biorac, odszczepienie prowadzi sie w tem- peratunze od okolo 0°C do zblizonej do tempera¬ tury pokojowej.Zwiazek otrzymany po roastzczepieniu na N- --koncu wystepuje zazwyczaj w posltaci kwasnej soli addycyjnej z tym kwaisem, którego luzyto do odiszczepienia grupy zabezpieczajacej. Nastep¬ nie otrzymany zwiazek mozna przeksztalcic w zwiazek o wolnej koncowej grupie amonowej pod¬ dajac go dzialaniu slabej zasady, zazwyczaj ami¬ ny (trzeciorzedowej, takiej jak pirydyna, trójeltyilo- amina i tym podobne.Lancuch peptydowy jest teraz przygotowany do reakcji z nastepnym amkiokwaisem. Mozna ja przeprowadzic roznymi znanymi metodami Alby u- zyskac przylaczenie isie bezposrednio nastepuja- cego aminokwasu do N-konca lancucha pepty- dowego stosuje sie aminokwas zawierajacy«wol¬ na grupe karboksytlowa, o odpowiednio zabezpie¬ czonej funkcji cHaminowej i kazdym innym ak¬ tywnym ugrupowaniu.Aminolkwas poddaje sie reakcji prowadzacej do uaiktywnienda funkcji karboksylowej, w celu prze¬ prowadzenia reakcji sprzegania. Do tego rodzaju metod aktywacji, mozliwych do zastosowania w syntezie, nalezy przekisztalceniie aminokwasu w mieszany bezwodnik. W ten sposób wolna grupa karboksylowa aminokwasu ulega aktywacji na; drodze reakcji z innym kwasem, zazwyczaj kwa¬ sem weglowym w postaci chlorku kwasowego.Przykladami takich chlorków kwasowych, któ¬ rych mozna uzyc w celu wytworzenia odpowied¬ nich mieszanych bezwodników sa ichloromrówozaa etylu, cMorochloronirówczan fenylu, chloromirów- czan IlHrzedjbutyllu, ohloiomirówiozan izobutylu, chlorek trójmeftyloacetyilu^ i temu podobne.Innym sposobem aktywowania funikcji karbo¬ ksylowej aminokwasu w celu przeprowadzenia re¬ akcji sprzegania jest przeksztalcenie aminokwasu w jego aktywna pochodna estrowa. Przykladami takich aktywnych estrów sa, na przyklad ester 2,4,5-toójchIorc wy, ester p-niitrofenylowy, ester utworzony z 1- ^ydiix)lkisyibenzotriazo(lem oraz ester utworzony z N-hydroksyburs^yrwmidem. Inna wydajna meto¬ da przylaczenia Cnkonca aminokwaisu do frag- 15 memtu peptydu polega na przeprowadzeniu reak¬ cji (Sprzegania w oibecnosci co najmniej równomb- lowej ilosci N,N'^wiucyklohelksyQok!airtoodwuiniidu (DCC). Te ostatnia metode fcorzystmie stosuje sie w przypadku wytwarzania teltradelkapelpltydu o wyzej podanym wzorze,' w którym X oznacza gru¬ py o wzorze 2.Po wyltwonzendiu zadanej sekwencji aminokwa- sów, otrzymany peptyd mozna usunac z zywicy stanowiacej nosnik. Pirzeprowadza sie to przez poddanie zabezpieczonego, zwiazanego z nosnikiem tetradekapeptydiu reakcji z tflluorowodorem. Dzia¬ lanie to powoduje uwolnienie peptydu z zywicy.Jednakze zarazem uwalniaja sie pozostale gru¬ py zabezpLeczajace -znajdujace sie przy aktywnych ugrupowaniach obecnych w lancuchlu pepltydowym, jak równiez grupa zabezpieczajaca grupe a-ami- nowa wystepujaca na,N-4donciu aminokwasu.W przypadiku uzycia (fluorowodoru do przepro¬ wadzenia odisaczepienia peptydu do zywicy, a.tak¬ ze do usuniecia gtrup zabe^eczajacych, korzyst¬ nie reakcje prowadizi sie w obecnosci anizolu.Stwierdzono, ze obecnosc anizolu hamuje moz¬ liwe alkilowanie pewnych resat aminokwaisowych obecnych w lancuchu peptydowym. Poza tym, od- szczepienie korzysitnie prowadzi sie w obecnosci etanotiolu. Etanoitiol sluzy jalko zabezpieczenie pierscienia indolowego ireszty tryptofanu oraz u- latwia r^zeiksztalcenie zaMcteowanych resdt cyste¬ rnowych w forme tiolowa.-JTalkze w przypadku, gdy R5 oznacza girupe formyilowa, obeonoisc eta¬ notiolu ulatwia odiszczeipienie grupy tfonmyOowej przez fluorowodór.Zwiazek uzyskany po zakonczeniu reakcji roz¬ szczepiania Stanowi peptyd o lancuchu proisitym zlozony z 14 reszt ammdkwaisowych. iW celu u- zyskania produktu o wzorze 1 konieczne jest pod¬ danie 4etradekapeptydu o lancuchu prostym re¬ akcji w wairuinlkach do prowadzacych jego utle¬ nienia, przez iprzeksizitalcenia obydwu grup tiolo- wych obecnych w czasteczce cysteiny, w mostek dwusiarczkowy. Przeprowadza sie to przez po¬ dzialanie na rozcienczony iroatwór liniowego oater- nastopeptydu jiednym z wielu róznych srodków utleniajacych, nip. jodem i zedazicyjanlkiem pota¬ sowym. Jako srodek utleniajacy mozna takze sto¬ sowac powietrze. pH mieszaniny na ogól wynosi od okolo 2,5 do okolo 9,0, korzystnie od okolo 7,0 do okolo 7,6. W przypadku zastosowania po¬ wietrza, jako srodka utleniajacego, stezenie roz¬ tworu peptydu nie /przekracza na ag(A 0,4 mg peptydu1 na mj roztworu i zazwyczaj wynosi okolo 50 pg/mL Zwiazek o wzorze ii mozna podawac zwierze¬ tom deplokrwistym i czlowiekowi w dowolny spo¬ sób,, w tym doustnie, podjezytkowo, podjsJkórnie, domiesniowo, dozylnie i innytmi sposobami. Kaz¬ dy z tych zwiazków wykazuje, aczkolwiek nie¬ koniecznie w równowaznym stopniu, aktywnosc hamowania wydzielania hormonu wzrosju. Ta ak- 15 20 29 35 40 45 50 55 609 tywnosc Jest cenna w tyich praypadkach, (kiedy pacjent wyimaga. leczenia ze wzgledu na' nadmier¬ ne wydzielanie somattotiropdny, któremu towarzy¬ sza takie i^epontyisilne stany jalk cukrzyca mlodo- oianyoh i akromegalia. Zwiajziki ite wylkazujja tak¬ ze inne dzialanie fizjologiczne, jak hamoiwame wydzielania sie kwasów zoladkowych, co jest u- zyteczne w leczeniu wcrzodlu, hamowanie egzokry- nowego wydzielania trzustki, co potencjalnie jest uzyteczne w lleczeniu zapalenia itrzusitiki, hamowa- nie wydzielania insuliny i glukagonu oraz oslabie¬ nie czynnosci ruchowej geliiit,, co jest uzyteczne w iradiologiiii zoladka i jelilt.Korzystnie zakres dawki przy podawaniu pod- jezykowym lub doustnym wynosi od okolo 1 mg do okolo 100 mgtfkg wagi dala dziennie. Ogólnie, zakres dawki przy podawaniu dozyOnym, pod¬ skórnymi luib doamesnóowyni wynosi od okoJo 10 ug do okolo 1 mg/kg wagi dala dziennie, a korzyst- nde (wynosi od okolo 50^g do okolo 100 pg/kg wagi ciala dziennie. Jest oczywiste, ze zakres1 daw¬ ki jest szeroki zaleznie od poszczególnych przy¬ padków, jak równiez zaleznie od tego, w jak ciezkim stanie znagduije sie pacjemlt.Jest takze mozliwe podawanie zwiazku o wzo¬ rze 1 lacznie^ z fasrma^euftyicznym nosnikieim, na przyklad w postaci tabletek lulb kapsulek. Moz¬ na stasowac" obojejtne rozcienczakndki lub nosni¬ ki, na przyklad wejgUan magnezowy lub laktoze, lacznie ize zwyklymi czynnikami rockruszaijacymi, na przyklad skrobia kukurydziana i kwasem algi¬ nowym, oraz czynnikami poslizgowymi pnzy ta¬ bletkowaniu, na przyklad siteairyndanem magnezo¬ wym, m Normalnie ilosc nosndlka 1/ufb rogcieniczalntilka wy¬ nosi od okolo 5 do okolo flffi/i koncowego prepa¬ ratu, a korzystnie od okolo 50 do okolo 85V« kon¬ cowego preparatu. Koncowy preparat moze zawie¬ rac takze odpowiednie czynnfiki smakowo-zapa- chowe, vktóre czynia go pmyjeminiejszytm przy po¬ dawaniu.W przypadku dozylnego podawania zwiazku o wzorze 1, mozna Isltosowac odpowiednie nosniki, takie jak na przyklad, izOtoniozny mozrtwór soli, buforowe roztwory fosforanów d temu podob¬ nych. ~ D-Vaa1^somaitolsitatyne badano na "psach pod wzgledem hamowania m vivo wydziela sie kwa¬ sów zoladkowych. U szesciu psów z przetoka sta¬ la d torebka Hedndenbadna wywolywano wydzie¬ lanie kwatsu soimego w zolajdlku przez infuzde C- -koncowego azteropepltydu gastryny w iloscd 0,5 jii/ikg/godzine. Kazdy pies sluzyl jako swoja wlas¬ na kontrola, otrzymujac innego okreslonego dnia tylko- ozteropeptyd. W innym dniu, szesc psów otrzymalo czteropeptyd a po uplywie jednej gor dziny stanu (stanctfanarnego wydzielania HO, po¬ dawano przez ijedna godzine D-Vaa1HSomatosttaJty- ne w infiuzjd, w ilosci 0,715 /^kg/godzine.Zbieranie próbek kwaisów zoladkowych konty¬ nuowano przez dodatkowe 1 1/2 godziny w od¬ stepach' l^nminiuitowyich. Próbki mdaarectzkowano do pH Ift za pomoca automatycznego urzadzenia do miareczkowania. Maksymalny wfplyw hamuijajcy D- 533 10 -Val1HSomaitositatyny elksltrapolowano z Itarzywej dawka-odpowiedz dla somatostatyny i wzgledna aktywnosc analogu wyrazano jako •/• akttylwno- sci somatostajtyny. D-Vad1-fioniatosttaiyna hamuje stacjonarne wydzielanie wywolane przez C-ikon- cowy cateropepltyd gaisltryny w B5JL ±, 6,0^/f bledu staindardcweigo sredniej. Efekt taki jest ekwiwa¬ lentem wywolywanego przez somadosftatyne w ilo¬ sci 0,935 jug^lkgyigodizdne. Aktywnosc analogu w stosunku do somatostajtyny wynosi wiec 1I25M.Badano równiez wplyw D-IVal^somatoSta|tyny na czynnosc ruchowa jelilt u nie uspionych psów. U- zyto trzy pisy z ikalteteffem w swietle przedtedoli- ka, dwuriasfonicy i odzwiemnlka. Zmiany cisnienia w swietle jelita retjeisitrowano za pomoca Ydlsacor- dera przy uzyciu tensomlettiriu i minialturowego gal- wanometru swiiertflnego. (Po usiadenau stanu stacjo¬ narnego podawano dozytMe w inifuaji D-«Val1-sb- matostatyne w przeciagu dziesieciu min.ut. Zwia¬ zek poczatkowo podwyzszal tiisn&ende w swietle odzwiemika, a nastepnie obnazal .je, podczas, gdy ciSnienie w dwunatitinlicy i przedsionku w trak¬ cie badania pozostawalo obnizone. Minimaikia daw¬ ka skuteczna wymagana dla' zwiekszenia cisnie¬ nia w odiwienniku, a Obnizenia cisnieniu w dwu¬ nastnicy i pr,zedJsionJku wynosila <04I25 jUg/kg —10 mimut. Jest to pqTÓwnywalne z aktywnoscia samej somaitostatyny, wynoszaca 0y125 do 0,25 - /4g/kg/10 mónuft.Wykazano równiez, ze- D-Val1nsomartosltatyna ha¬ muje wydzielanie trzustkowe. U trzech psów, ma¬ jacych zarówno trausltkowa (jak i zoladkowa prze¬ toke, wywolywano wydzdedande trzustkowe przez 5 inffiuzje sekretyny w ilosci 2 jednu/kg/godz. i cno- lecystokihiny w ilosci 0,45 jednjkg-godz., a wy¬ dzielanie HC1 w zolajdku przez krtuzjje tetraga- stryny w ilosci 0,5 ^g/kg/godaine.Po ustaleniu sie odpowiedizi na poziornde sta- 40. cjonarnytm, kazdemai psu podawano D-Va/l1-soma- tostatyne pulzez ijedha gocMme w ilosci 0,75 p&fagf /godzine. Mateymadny wplyw Ihamuljacy, wyrazo¬ ny jako procentowa zmiana w sltosunlku do kon¬ troli, wynosi, dla bialka calkowitego -^5»l^/». 45 Badano równdez w^lyw D^Val1Hsomatoistaltyny na wydizielande hormonu wzrostu, W przyjjejtym spo¬ sobie postepowania uzyto normalnych szczurów samców Sprague-Dawley o wadze 100—120 gTa- mów (Laborartory Supply Company, Indianapolis, 50 Indiana). Test ten stanowi modyfikacje metody - P. Brazeani, W. VaHe i R. Gorilllemana, Endocrin- logy, 94, im (1074), W badaniach tych uzyfto piec grup po osiem szczurów. Wszystkim jszczurom po¬ dano dootrzewnowo sól sodowa penltobairbdltaihi w 55 celu pobudzenia wydzietonia hormomi wzroatu.Szczury z jednej grupy (sluzyly jako kotiitaolne i otrzymaly tyOko fi^jologticzny roztwór soSd. Dwie grupy otrzymaly somadostaftyne, jedna w ilosci 2 /ig/szczura, podskórnie, a druga 50 ^g/szczura, 50 podskórnie. Szczurom z dwóch innych grup po¬ dano D-Vad1HSomatostaityne, odpowiednio 2 /Ag/ /szczura, podskórnie i 50 ^wg/azczuTa, podskór¬ nie.Stezenie Jwrinonu wzrositu w surowicy bylo 55 mierzone po ujplywie 20 rndnutt od jednoczesnego'II 114 533 12 podania soli sodowej penltolbaiilblitolu i zwiazku badanego. Nastepnie oceniano stopien zmniejsze- nia stezenia hormonu wzrostu, w surowicy w od- • iiiesieniu tdo grupy kontrolnej, porowniujjac wzgled¬ na aktywnosc D-ya^-scmatostatyny i somatosta- tyny.Przy poziomie dawkowania wynoszacym 2 pgl /szczura, D-Ya^HSomatostatyna powodowala 2*/t za-* hamowania Tzwiekszenia wydzielania hormonu wzrostu, podczas gdy somartostatyina dawala 44% zaihamowania, w stosunku do koinltrodi Przy po- /aomde dawkowania wynoszacym 60 jig/lszozura, D-Vaa1HSO(martoatatyina powodowala 7QV§ zahaimo- wafiia -zwiekszenia wydzielania hormonu wzrostu, podczas gdy isomartOstatyna dawala 70^/t zahamo¬ wania, w stosunku do kontroli.Badano aktywnosc D-Vtad^somatostatyny hamo¬ wania in vivo wydizielairiia glufcagomu i insuliny pod wiplywern pabudzenia L^alamdina. Od normal¬ nych (psów imleszancow, olbu plci, nie katnmiohycih przez noc, (pobierano koffitrotoe próbki jkrwi, a - nastepnie iro&poczynano podawanie w dozyflnej in- fuzji fazjologiicznegO' rozitworu soli, somafflocrtatyny lufo D-VasI,HSoniartJOsitaityny. Po 30 mdin/uftacih, do¬ datkowo podawano dozylnie przez okres 15 mdmiut L-aflamdne. Po zakonczeniu infiuzji L-alanAny in- fiuaje fizjologicznego roztworu sefli, somatastautyny i D-Vad1nsoniartO)srta*yny konitynuowano jeszcze przez 15 minuj, intfuztfa iL-alaniny powodowala oslfcry wzrost stezenia ghikagomu i imsufliiny w osoczu.Stezenie to wracalo do wartosci równej fcomltroa- nej po zakonczeniu iinifiutoji L-alaminy. Na pod¬ stawie powyzszych danych minimalma dawke D- -Vai1HsonLatoWtatyny ihamuljaca wydizdelanie gSLufca- gonu, okreslono jako 0,06 do 0,111 jag/kg/min, a hamujaca wycteielanie insuliny jatko 0,006 do 0,03 ^g/kg/min, zas mindrnakia dawke somatostatyny hamujaca wydizdelanie gtakagomi okreslono jalko 0,10 do 0,12 jug/kg/minute, a hamujaca wydziela¬ nie kiisuddhy (jato 0,03 do 0,10 #g/kg/mdm*iite.'Nastepujajcy przyklad ikteftru)e sposób wedlug wynalazku, Pr z y k l a d. Utlenianie do D-ya^-somatostatyny Rozjtwór zredukowanej D-Vad1HSomaJtoatatyny (374 md, teoretycznie 175 ml) rozcienczono za po¬ moca 147 ml 0,2 M kwasu octowego i 2067 md wody destylowanej w cediu uzyskania stezenia 50 /4g/ml. Podano (stezony wodorotlenek amonos- wy w celu doprowadzenia pH mieszaniny do 6,7.Roztwór mieszano w (temperaturze pokojowej bez dostepu swiaitla w ciagu 64 godzin i po uplywie tego czasu miace&fcowanie metoda EUmana wy¬ kazalo, ze utlenienie bylo caflikowilte.'Mieszanine zatezono pod zimniejlszonyni cisnie¬ niem do objetosci okolo 10 jnl. Koncentrat roz¬ cienczono za pomoca 10 md kwaski octowego lo¬ dowatego, po czym odsolono na (kolumnie zawie¬ rajacej Sephadex G-<25 F. Warunki tihromaitoigira- fii byly nastepujace: iozpujscoczakufc, odgazowany 5 om; temperatura, 26°C; szyfbfcasc pnzeplywu, 246 rnl/godzane; objetosc frakcji, 16,4 tmQ.Wyfcres (phzedeltawiajacy wielkosc adjsortoancji pray 280 mp w zaleznosci od kolejnych foakeji 10 wykazali dwa duze piki. Pierwiszy reprezentowal produkt w ioirniie zagirelgowanej, a dinugi ireprezen- towall produkt monomeryczny. Malterial leprezen- towany przez drugi pik (frakcje 49—64 / 767—1050 ml) zebrano razem i izOaofiiliizowano do (sucha bez dostepu swiaitla. Otrzymana tstafta ipozositalosc noz- puisizjozoino w .16 ma odigaizowanego 0,2 m ikwasu Odtowego i nandesiono na kolumne zalwdertaljaca Sepihadex G-25 F. iWairunitói idhiroimaltogiralfiii byly nastepujace: roiz-pulszciza-lndlk, odgaizowany 0£ M kwas octowy; wymiary Ikoluurmy, 5,0 (X (1150 cm; tempeira-tuira, 26°C; iszylblkosc ' ipitoeiplywiu 4T715 ml/ /godzine; Objetosc frakcji, (16,6 &a!l.^ Wylkres praied-sitawiajacy wieUkasc atosorlbancji przy 280 mia w zaieznotsci od kolejnych .ftrakcji wykazal jeden duzy pik. Badania sjpektbposkopowe UV wykazaly, ze ^owna dzejsc piteu odipowdada wlasciwemu produkitowi. Fraikpje 167—472 M tojsci wycieku 2500—2895 mil, szozyit = 2667 ml) polajczono i zliofilizowano do sucha bez dostepu swia^tla. Badania spektroskopowe UV wykazaly o- becnosc 96 mjg zadanego zwiazku (wydajnosc w stosunku do formy zffndukowaine} = 54^/t).M Ozesc otrzymanego prodiukitu istalego rtwpuBsaazo- no w 5 ml 5(f/• kwasu odtowego i (pjojwltórnle dhro- maitcigratfowano na koOiumnie zawierajacej Sepha- dex G-125 F. Warunki chiromiaftogErajfli toyfty na¬ stepujace: rozpuszczalnik, odjgatzowany 50^/t kwas jj ootowy; wymiairy tedlumny, yi X 180 cm; tem- peTaitUTa, 26°C; szybkosc przeplywu, 58,2 mO/feo- dzdne; oibjetosc tfrafccji, 8,67 ml.Wykres przediatawiajajcy wielkosc absorbancji pnzy 280 m/i w zaflezmosci od kolejnych fratocji 35 wykazal jeden duzy pik. Badania spektroskopowe UV wykazaly, ze glówna czesc pfflku odpowiada wlasciwemu prodluktowi. Fj-aikaje 96-h60 (4188-^532 ml, szczyt = 605 md) polajczono i zliotfiaiizowano do sucha bez dostepu swiaitla. 40 Skrecalnosc optyiozna («]|? = ^42^° (lP/# kwas octowy) Analiza aminckwasow: Val 0t9S; GWy l,0fl; 2 Cys 1,81; 2 Lyis 1,90; Asn 0,06; 3 Plhe 2,04; Trp 0,80; 2 Thrl,ai; Ser 0^6r 4s Powyzsze wyniki wyrazono w postaci stosunku w odniesieni\i do prowadzono nastepujace itnzy 21^odizdnne reakcje hydroMizy: (1) w obecnosci suilfotOeriku metyllowego w celu M utlenienia cysteiny do kwasu cysteinowego, (2) z uzyciem kwasu ticgliikolowego jaiko sub¬ stancji do usuwania zanieazyiszcizen, <3) bez isnibisitancji do usuwania zanieczyszczen lub utleniacza. 85 Wszystkie powyzsze wartosci sa ito srednie z wyników trzech reakcji hydirolizy¥ z wyijaifeiem nasrtepujacyoh: Cyts i Ser tyJfco (H) i (3) Trp tyllko(2) •o Phe tylko (2) d (3).Zastrzezenia patentowe ii. Spastób^wyftwamzainda nowego telradekapepty- • du o wzorze 1 oraz jego faormaoe^yioznie dopu-13 114 533 14 azozalmycih, nieltolkisyicizinycfh soli addycyjnych z kwa¬ sami, znamienny tym, ze proiatoilanicuicfoofwy tetra- dekaipaptyd o wzorze H-D-Va(l-GilyHL-Cy|s-L-iLyis-L- -Asn-L-Pihe-L-Phe-L-Tirip-L^Lyis-L^Tihr-LHPhe-L- -Thr-L^Seir-L-Cys-OH podidaje sie realkicji ze sro¬ dowiskiem utleiniiajajcym. 2. Sipoisób wedlug zasitrz. ,2, znamienny tym, ze jaiko srodek 'utlemiajajcy isltoisiuje sie powietrze.H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L- i -Trp- L- Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr- L-Ser-L-Cys-OH Nzór 1 zynica -O-CH 2 V^ Nzór 2 PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL