FI64576B - Foerfarande foer framstaellning av en terapeutiskt anvaendbar somatostatinanalog - Google Patents

Description

FSFn [B] (11)KUULUTUSJULKAISU , . ς , ^STä 1 J ' UTLÄGGNI NGSSKRIFT 04j/0 •ISÄÄ (4¾ Patent a-ddeiat ' (51) Kv.ik.^h*t.ci.3 C 07 C 103/52 SUOM I—FI N LAN D CM) ρκ«μμ·μι*ιι 78118¾ (22) Hak«mi«pUvl — AmOknlngidag l8.0¾.78 (23) Alkuptlvl—GlltlghMdac 10.0¾.78 (41) Tullut JulklMktl — Bllvlt offantllg 22.10.78

HtmttU j* rekisterihallitut NlhtlvUulp»™ ). kuuLJultotaun pvm— .-, 'o'o,

Patent- oeh registentyreiaen ' ' Aiwftksn uttafd ech wUkriftu» publicarad -ja.uu.uj (32)(33)(31) Pyydetty ttuolkaus—Begird prtorttee 21.0¾. 77 USA(US) 789^72 (71) Eli Lilly and. Company, 307 East McCarty Street, Indianapolis, Indiana, USA(US) (72) James Edwin Shields, Indianapolis·, Indiana, USA(US) (7¾) 0y Kolster Ah (5¾) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen somatostatiinianalogin valmistamiseksi - Förfarande för frametällning av en terapeutiskt ^ användbar somatostatinanalog

S

S

Tämä keksintö koskee menetelmää, jonka avulla voidaan valmistaa tetradekapeptidiä D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH (kaava I), sekä sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä happoadditiosuoloja.

Keksinnölle on tunnusomaista, että vastaava suoraketjuinen tetradekapeptidi, jonka kaava on III, H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH saatetaan reagoimaan hapettimen kanssa.

Somatostätiini, (joka tunnetaan myös somatotropiinin eritystä ehkäisevänä tekijänä) on tetradekapeptidi, jonka kaava on L-Ala-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH. Tämä tetradekapeptidi on eristetty lampaan hypotalamuksen uutteista ja se on todettu ehkäisevän kasvuhormoonin eritystä, joka tunnetaan myös somatotropiinina. Katso lähemmin P. Brazeau, W. Vale, R. Burgus, N. Ling, M. Butcher, J. Rivier ja R. Guillemin, Science,179, 77 (1973).

Tämän lisäksi US-patentissa n:o 3 904 594 on esitetty luonnon somatostätiini samoin kuin muiden geenisten yhdisteiden luokka, 2 64576 jossa on luonnon hormoonin dodekapeptidisekvenssi asemassa 3-14.

Myös Ferland et ai./ Molekular and Cellular Endocrinology, 4, 79-88 (1976) ovat aikaisemmin selostaneet yhdistettä, jota voidaan mukavuussyistä nimittää D-Ala^-somatostatiiniksi. D-Ala1-somatosta-tiini, vaikka se on luonnon L-Ala'^-somatostatiinin kanssa rakenteellisesti stereomeerinen, on suunnilleen puoliksi niin tehokas kuin luonnon somatostatiini estämään in vivo vatsahapon eritystä. Tämän keksinnön mukainen yhdiste, D-Val^-somatostatiini, eroaa D-Ala^-soma-tostatiinista siten, että kaksi vetyä on korvattu metyyliryhmillä.

Jos pitäisi päätellä jotakin D-Val1-somatostatiinin farmakologisen tehokkuuden suhteen, niin sen odottaisi olevan samanlainen kuin D-Ala^"-somatostatiinin, täten se olisi vähemmän tehokas kuin luonnon hormoo-ni estämään in vivo vatsahapon eritystä. Kuitenkin D-Val^-somatosta-tiinin tehokkuus on jonkin verran suurempi kuin luonnon hormoonin. Tämäkin tulos osoittaa, ettei D-Vai -somatostatiinin suhteen voida ennakolta ennustaa vertaamalla sitä rakenteellisesti samanlaisiin, aikaisemmin käytettyihin yhdisteisiin.

Kaavan I mukaisen biologisesti aktiivisen tetradekapeptidin N\kaava on määritelty edellä ja siihen kuuluvat myös sen ei-toksiset hai>poadditiosuolat. Sen rakenne eroaa soma tostatiinin rakenteesta siinä,x^ttä D-valiini-jäännös on asemassa 1 L-alaniinijäännöksen asemesta. Mukavuussyistä kaavan I mukaisesta tetradekapeptidistä voidaan käyttää nimitystä D-Val^-somatostatiini.

Valmistettaessa keksinnön mukaisessa menetelmässä lähtöaineena käytettävää kaavan III mukaista suoraketjuista tetradekapeptidiä muodostuu välituotteena yhdistettä, R-D-Val-Gly-L-Cys(R1)-L-Lys(R2)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp(R5)-L-Lys(R2)-L-Thr(R3)-L-Phe-L-Thr(R3)-L-Ser(R^)-L-Cys(R^)-X, jonka kaava on II ja jossa R on vety tai <*·-amino-funktion suojaryhmä, R^ on vety tai tio-funktion suojaryhmä, R2 on vety tai £-amino-funktion suojaryhmä, R3 ja R4 merkitsevät kumpikin vetyä tai hydroksi-funktion suojaryhmää,

Rt- on vety tai formyyli, ja X on hydroksi tai /'------\___ hartsi ~0~°*2 \ / 64576 jossa kaavassa hartsi on polystyreeni, sillä ehdolla, että X:n ollessa hydroksi R, R^, R2, R3' R4 la R5 merkitsevät kukin vetyä, ja kun X on /’-hartsi '°~cH2 y niin R, R^, R2, R3 ja R4 merkitsevät kukin muuta kuin vetyä. Uutta kaavan I mukaista tetradekapeptidiä saattamalla vastaava suoraket-juinen tetradekapeptidi, jonka kaava on III reagoimaan hapettimen kanssa. Tämä reaktio muuttaa kaksi sulfhydryyliryhmää disulfidi-sillaksi.

Farmaseuttisesti vaarattomia ei-toksisia happoadditiosuoloja ovat orgaaniset ja epäorgaaniset happoadditiosuolat, esimerkiksi ne, jotka on valmistettu käyttäen seuraavia happoja: kloorivetyhappo, rikkihappo, sulfonihappo, viinihappo, fumaarihappo, bromivetyhappo, glykolihappo, sitruunahappo, maleiinihappo, fosforihappo, meripihka-happo, etikkahappo, typpihappo, bentsoehappo, askorbiinihappo, p-tolueenisulfonihappo, bentseenisulfonihappo, naftaleenisulfonihap-po ja propionihappo. Happoadditiosuolat ovat edullisimmin etikkaha-posta valmistettuja. Kaikki edellä olevat suolat voidaan valmistaa tavanmukaisten menetelmien mukaan.

Kuten seuraavassa tulee esiin, kaavan III mukaisten tetradeka-peptidilähtöaineiden valmistusmenetelmä sisältää jaksottaan toistuvia peptidikatjun terminaalisen aminohapon cx^aminofunktion suojaryhmän lohkaisuja. Ainoa rajoitus, mikä siis tehdään £-aminofunktion suoja-ryhmän identtisyyteen nähden lysiinijäännöksessä on se, että se ei lohkea niissä olosuhteissa, joissa lohkaistaan selektiivisesti et·-ami-nofunktiota suojeleva ryhmä, ^-aminofunktion ja <f-aminofunktion suo-jaryhmien sopiva valinta on seikka, jonka alaan perehtyneet peptidi-kemistit tuntevat hyvin ja valinta riippuu siitä suhteellisesta helppoudesta, millä jokin suojaryhmä voidaan lohkaista. Täten esimerkiksi sellaiset ryhmät kuin 2-(p-bifenylyyli)-isopropyylioksikarbonyyli . 64576 4 ί (BpOC) ja trityyli ovat hyvin labiileja ja ne voidaan lohkaista jo hyvin heikkoa happoa käyttäen. Melko voimakasta happoa kuten kloori-vetyhappoa, trifluorietikkahappoa tai booritrifluoridia etikkahapos-sa tarvitaan lohkaistaessa muita ryhmiä kuten t-butyylioksikarbonyy-li, t-amyylioksikarbonyyli, adamantyylioksikarbonyyli ja g-metok-sibentsyylioksikarbonyyli. Vielä voimakkaampia happo-olosuhteita tarvitaan aikaansaamaan eräiden muiden suojaryhmien lohkaisu, kuten esimerkiksi bentsyylioksikarbonyylin, halogeenibentsyylioksi-karbonyylin, g-nitrobentsyylioksikarbonyylin, sykloalkyylioksikar-bonyylin ja isopropyylioksikarbonyylin lohkaisu. Näiden jälkimmäisten ryhmien lohkaisu vaatii erittäin voimakkaita happo-olosuhteita kuten bromivedyn, fluorivedyn tai booritrifluoriasetaatin käyttöä trifluorietikkahapossa. Luonnollisesti myös kaikki labiilimmat ryhmät lohkeavat voimakkaammissa happo-olosuhteissa. Aminofunktion suojaryhmän sopiva valinta merkitsee siis sitä, että (^-aminofunktion suojeluryhmänä käytetään labiilimpaa ryhmää kuin £-aminofunktion suojelemiseen ja tähän liittyvät myös lohkaisuolosuhteet, jotka on suunniteltu sellaisiksi, että selektiivisesti poistetaan vain^i,-aminofunktion suojaryhmä. Tässä suhteessa on 1*2 edullisimmin o-kloori-bentsyylioksikarbonyyli tai syklopentyylioksikarbonyyli ja niiden kanssa valitaan edullisimmin käytettäväksick-aminofunktion suoja-ryhmänä kussakin aminohapossa, joka lisätään peptidiketjuun, t-butyy-lioksikarbonyyli.

Ryhmät R3 ja R4 esittävät hydroksyyliryhmän vetyä tai treonii-nin ja vastaavasti seriinin alkoholisen hydroksyylin suojaryhmää. Useita sellaisia suojaryhmiä on esitetty teoksessa McOmie, supra, luku 3, C.B.Reese. Tyypillisiä tällaisia suojaryhmiä ovat esimerkiksi C1-C4~alkyyli, kuten metyyli, etyyli ja t-butyyli; bentsyyli, subs-tituoitu bentsyyli, kuten g-metoksibentsyyli, p-nitrobentsyyli, g-klooribentsyyli ja o-klooribentsyyli? C^-C-j-alkanyyli kuten formyy-li, asetyyli ja propionyyli; trifenyylimetyyli (trityyli). Kun R^ ja R^ ovat suojaryhmiä, niin suojaryhmäksi valitaan kummassakin tapauksessa edullisimmin bentsyyli.

Ryhmä 5 esittää joko vetyä tai formyylia ja definoi osanNR^ tryptofaani-jäännöksessä. Formyyli toimii suojaryhmänä. Tällaisen suojaryhmän käyttäminen on valinnanvaraista ja sen vuoksi R^ voi sopivasti olla vety (suojaamaton N) tai formyyli (suojattu N).

Ryhmä X tarkoittaa tetradekapeptidiketjun karboksyylipäätettä; se voi olla hydroksyyli, mikä definoi vapaan karboksyyliryhmän. Tämän 5 64576 lisäksi X tarkoittaa kiinteää hartsituklosaa, johon peptidin terminaalinen karboksyyli on liittynyt sei1 synteesin aikana. Tämä kiinteä hartsi voidaan esittää kaavalla ·=*. j h ar ts i •—· i

Kaikissa edellä olevissa yhdisteissä merkitsee R, Rj, R2/ R3, R4 ja R5 kukin vetyä silloin kun X on hydroksyyli. Kun X merkitsee kiinteää hartsitukiosaa, niin R, R^, R2^ R3 ja R^ ovat kukin suoja-ryhmiä .

Seuraavia lyhennyksiä, joista useimmat ovat hyvin tunnettuja ja alalla yleisesti käytettyjä, käytetään tästä lähtien 1

Ala - Alaniini

Asn - Asparagiini

Cys - Kysteiini

Gly - Glysiini

Lys - Lysiini

Phe - Fenyylialaniini

Ser - Seriini

Thr - Treoniini

Trp - Tryptofaani

Vai - Väliini DCC - NrN'disykloheksyylikarbodi-imidi DMF - N,N'-dimetyyliformamidi BOC - t-butyylioksikarbonyyli PMB - g-metoksibentsyyli CBzOC - o-klooribentsyylioksikarbonyyli CPOC - Syklopentyylioksikarbonyyli

Bzl - Bentsyyli

For - Formyyli

BpOC - 2-(p-bifenyyli)isopropyylioksikarbonyyli 6 64576

Vaikka siis ammattitaitoinen, synteettisten peptidien tutkimuksen parissa työskentelevä kemisti pystyy valitsemaan kaavan III mukaisten yhdisteiden valmistuksessa kulloinkin käytettävät suoja-ryhmät, on kuitenkin hyvä tietää, että suoritettavien reaktioiden sekvenssi vaatii valitsemaan juuri nimenomaiset suojaryhmät. Toisin sanoen, valitun suojaryhmän on oltava stabiili sekä reagenttien suhteen että niiden olosuhteiden suhteen, jotka vallitsevat reaktio-sekvenssin peräkkäisissä vaiheissa. Kuten edellä on jo jonkin verran tuotu esiin, on jonkin määrätyn suojaryhmän oltava sellainen, joka pysyy koskemattomana niissä olosuhteissa, joita käytetään lohkaisemaan aX-aminofunktion suojaryhmä peptidifragmentin terminaalisesta aminohappojäännöksestä, kun valmistellaan seuraavaksi tulevan aminohappofragmentin liittämistä peptidiketjuun. On myös tärkeätä valita suojaryhmäksi sellainen, joka pysyy koskemattomana peptidi-ketjua rakennettaessa ja joka on helposti poistettavissa kun täydennetään halutun tetradekapeptidi-yhdisteen synteesiä. Kaikki nämä seikat ovat ammattitaitoisen peptidikemistin tiedossa.

Kuten edellisestä käy selville, voidaan kaavan III mukaisia tetra-dekapeptidejä valmistaa kiinteän faasin synteesin avulla. Tämä synteesi käsittää peptidiketjun rakentamisen jaksottaisesti alkaen peptidin C-terminaali-päästä. Tarkemmin sanottuna ensin liitetään kys-teiini karboksyylifunktiostaan hartsiin antamalla amino-suojatun, S-suojatun kysteiinin reagoida kloorimetyloidun hartsin tai hydrok-simetyylihartsin kanssa. Hydroksimetyylihartsin valmistamisen ovat selostaneet Bodanszky et ai. Chem. Ind. (Lontoo), 38 1597-98 (1966). Kloorimetyloitua hartsia on saatavissa kaupallisesti Lab.Systems,

Inc.San Mateo, Kalifornia.

Kun C-terminaalinen kysteiini on liitetty hartsiin, muutetaan suojattu kysteiini ensin kesiumsuolakseen. Tämän suolan annetaan sitten reagoida hartsin kanssa menetelmän mukaan jonka on selostanut B.F.Gisin, Hely.Chin.Acta, 56 1476 (1973). Vaihtoehtoisesti voidaan kysteiini liittää hartsiin aktivoimalla kysteiinimolekyylin karbok-syylifunktio soveltamalla helposti tunnettavaa tekniikkaa. Kysteiinin voidaan esimerkiksi antaa reagoida hartsin .kanssa käyttämällä apuna karboksyyliryhmää aktivoivaa yhdistettä kuten N,N*-disykloheksyyli-karbodi-imidiä (DCC).

Sen jälkeen kun vapaan karboksyylin sisältävä kysteiini on liitetty sopivasti hartsi-tukiosaan,käsittää loppuosa peptidin ra- 7 64576 kentamissekvenssistä kunkin aminohapon jaksottain tapahtuvan lisäämisen peptidiketjun N-päätteiseen osaan. Tämän vuoksi jokaiseen yksityiseen sekvenssiin kuuluu«A-aminofunktion suojaryhmän lohkaisu siitä aminohaposta, joka edustaa peptidifragmentin N-päätteistä osaa, minkä jälkeen seuraa järjestyksessä seuraavan aminohappojäännöksen liittäminen aminohapon N-päätteeseen, joka on tällöin vapaa ja reak-tiokykyinencA-aminofunktion suojaryhmän lohkaisu voidaan suorittaa käyttämällä happoa kuten bromivetyhappoa, kloorivetyhappoa, trifluo-rietikkahappoa, p-tolueenisulfonihappoa, bentseenisulfonihappoa, naftaleenisulfonihappoa ja etikkahappoa, jolloin muodostuu vastaava happoadditiosuola-yhdiste. Eräs toinen menetelmä, jota voidaan käyttää lohkaisemaan aminosuojaryhmä, on booritrifluoridin käyttö. Esimerkiksi booritrifluoridi-dietyyli-eteraatti jääetikassa muuttaa amino-suojatun peptidifragmentin BF-j-kompleksiksi, joka sitten voidaan muuttaa ei-suojatuksi peptidifragmentiksi käsittelemällä emäksellä kuten kaliumbikarbonaatin vesiliuoksella. Kaikkia näitä menetelmiä voidaan käyttää, jos vain ollaan selvillä siitä, että valitun menetelmän avulla on voitava lohkaista N-terminaalinencA-amino-funktion suojaryhmä ilman muiden peptidiketjussa olevien suojaryhmien irroittamista. Tämän vuoksi on edullisinta, että N-terminaalisen suojaryhmän lohkaisu suoritetaan käyttäen trifluorietikkahappoa. Lohkaiseminen suoritetaan tavallisesti lämpötilassa, joka on 0°C:n ja huoneenlämmön välillä.

Kun N-päätteessä tapahtuva lohkaisu on suoritettu, niin tuloksena oleva yhdiste on tällöin normaalisti suojaryhmän lohkaisussa käytetyn hapon happoadditiosuolan muodossa. Sen jälkeen se voidaan muuttaa yhdisteeksi, jonka päässä on vapaa amino käsittelemällä sitä laimean emäksen avulla, tyypillisimmin tertiäärisen amiinin kuten pyridiinin tai trietyyliamiinin avulla.

Peptidiketju on sitten valmis reagoimaan järjestyksessä seuraavan aminohapon kanssa. Se voi tapahtua minkä tahansa tunnetun tekniikan awila, joita on useita. Kun järjestyksessä seuraava aminohappo liitetään N-päätteiseen peptidiketjuun, käytetään aminohappoa, jossa on vapaa karboksyyli, mutta jonka <A-aminofunktio on sopivasti suojattu, samoin kuin mikä tahansa sen muista reaktiokykyisistä osista. Aminohappo joutuu sellaisiin olosuhteisiin, joissa sen karboksyyli funktio aktivoidaan liittämisreaktiota varten. Eräs tällainen aktivoimistekniikka, jota voidaan käyttää synteesissä, on aminohapon muuttaminen seka-anhydridiksi. Aminohapon vapaa karboksyylifunktio s 64576 aktivoituu tällöin reagoidessaan toisen hapon, tyypillisimmin hap-pokloridinsa muodossa olevan karboksyylihapon kanssa. Esimerkkejä tällaisista happoklorideista, joita voidaan käyttää sopivien seka-anhydridien muodostamiseen, ovat etyyliklooriformiaatti, fenyyli-klooriformiaatti, sek-butyyliklooriformiaatti, isobutyylikloori-formiaatti ja pivalyylikloridi.

Toinen menetelmä, jolla aminohapon karboksyylifunktio voidaan aktivoida liittymisreaktion aikaansaamiseksi, on muuttaa aminohappo reaktiokykyiseksi esterijohdannaisekseen.Esimerkkeinä tällaisista reaktiokykyisistä estereistä mainittakoon 2,4,5-trikloorifenyy-liesteri, pentakloorifenyyliesteri, p-nitrofenyyliesteri, 1-hyd-roksibentsotriatsolista muodostettu esteri ja N-hydroksisukkinimi-distä muodostettu esteri. Vielä eräs menetelmä, jonka avulla saadaan aikaan C-terminaalisen aminohapon liittyminen peptidifragmenttiin, on sellainen, että liittymisreaktio suoritetaan siten, että mukana on vähintäin ekvimolaarinen määrä N,N'-disykloheksyylikarboni-imi-diä (DCC). Tämä jälkimmäinen menetelmä on parhaana pidetty valmistettaessa kaavan II mukaista tetradekapeptidiä, jossa X on ,__ hartsi -0-ch2-/ '<

Kun haluttu aminohapposekvenssi on valmis, voidaan tuloksena saatu peptidi poistaa hartsitukiosastaan. Tämä tapahtuu käsittelemällä suojattua, hartsitukiosan omaava tetradekapeptidiä fluorive-dyllä. Fluorivedyllä käsittely lohkaisee peptidin hartsista; sen lisäksi se kuitenkin lohkaisee myös kaikki jäljellä olevat reaktio -kykyisten osien suojaryhmät peptidiketjussa samoin kuin N-termi-naalisen aminohaponcA-aminofunktion suojaryhmän. Kun käytetään fluo-rivetyä lohkaisemaan peptidi hartsista samoin kuin lohkaisemaan suo -jaryhmät, on edullisinta suorittaa reaktio siten, että mukana on anisolia. Anisolin mukanaolon on havaittu estävän peptidiketjussa olevien joidenkin aminohappojännösten potentiaalinen alkyloituminen. Lisäksi on edullista suorittaa lohkaisu siten, että mukana on etyy-limerkaptaania. Etyylimerkaptaani auttaa suojaamaan tryptofaani-jäännöksen indolirengasta ja lisäksi se helpottaa suojattujen kyste-iinien konversiota tiolimuodoikseen. Kun R,- on formyyli, niin etyyli- 9 64576 merkaptaanin mukanaolo helpottaa formyyliryhmän lohkaisua fluorive-dyllä.

Kun lohkaisureaktio on suoritettu, niin saatu tuote on suora-ketjuinen peptidi, joka sisältää 14 aminohappojäännöstä. Jotta saataisiin kaavan I mukainen tuote, on välttämätöntä käsitellä suoraketjuista tetradekapeptidiä hapettavissa olosuhteissa, jolloin molekyylissä olevat kaksi sulfhydryyliryhmää, yksi kummassakin kysteiini-osassa, muuttuvat disulfidi-sillaksi. Tämä saadaan aikaan käsittelemällä lineaarisen tetradekapeptidin laimennettu liuos millä tahansa hapettavalla aineella, esimerkiksi jodilla tai kalium-ferrisyanidilla. Myös ilmaa voidaan käyttää hapettavana aineena, jolloin seoksen pH-arvo on tavallisesti 2,5-9,0 ja edullisimmin noin 6,2-7,2. Kun hapettavana aineena käytetään ilmaa, ei peptidi-liuoksen konsentraatio ole tavallisesti suurempi kuin noin 0,4 mg peptidiä m 1 kohti liuosta ja tavallisesti noin 50 yg/ml.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan antaa lääkkeeksi lämminverisille imettäväisille, myös ihmisille, millä tavalla tahansa seu-raavista: oraalisesti, sublinguaalisesti, subkutaanisesti, intra-venöösisti, tai muuta antotapaa noudattaen. Kukin näistä yhdisteistä vaikuttaa, vaikka ei välttämättä yhtä suuressa määrin, kasvu-hormoonin eritystä inhiboivasti. Tämä inhiboiva vaikutus on edullinen niissä tapauksissa, joissa hoidettava henkilö tarvitsee terapeuttista käsittelyä somatotropiinin liiallisen erityksen suoksi, mikä eristys liittyy haitallisiin taudintiloihin kuten, nuoruusiän diabetekseen ja akromegaliaan. Nämä yhdisteet vaikuttavat myös muulla tavoin fysiologisesti, kuten esimerkiksi inhiboivat vatsahapon eritystä, mikä on edullista hoidettaessa vatsahaavaa; ne inhiboivat pankreaksen eksokriinistä eritystä, mikä on mahdollista hyödyllistä pankreatitiksen hoidossa; ne inhiboivat insuliinin ja glukagonin eritystä ja vähentävät suoliston liikkeitä, mitä voidaan käyttää hyödyksi gastrointestinaalisessa röntgenkuvauksessa. Sublinguaalisesti tai oraalisesti annettaessa on annostus edullisimmin noin 1 mg - 100 mg/kg ruumiin painoa kohti päivässä. Kun lääke annetaan intravenöösisti, subkutaanisesti tai intramuskuläärisesti, on annostus tavallisesti noin 10 yg - 1 mg/kg ruumiinpainoa kohti päivässä ja edullisimmin noin 50^ug - 100^ug/kg ruumiinpainoa kohti päivässä.

On selvää, että annostus voi vaihdella laajoissa rajoissa riippuen kulloinkin käsiteltävästä tilasta samoinkuin taudintilan vakavuudesta .

10 64 57 6

Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan antaa lääkkeeksi myös yhdessä farmaseuttisen kantaja-aineen kanssa, esimerkiksi tablettien tai kapselien muodossa. Inertejä laimennusaineita tai kantaja-aineita esimerkiksi magnesiumkarbonaattia tai laktoosia voidaan käyttää yhdessä tavanmukaisten hajoamista edistävienaineiden kuten maissitärkkelyksen tai algiinihapon kanssa ja voiteluaineiden kuten magnesiumstearaatin kanssa. Kantaja-aineen tai laimennusaineen määrä on tyypillisimmin noin 5 - 95 % lopullisesta seoksesta ja edullisimmin noin 50 - 85 % lopullisesta seoksesta. Sopivia makua antavia aineita voidaan myös käyttää tekemään seoksesta paremman makuinen.

Kun kaavan I mukaisia aineita annetaan intravenöösisti, voidaan käyttää sopivia kantaja-aineita, kuten esimerkiksi isotonista suolaliuosta ja fosfaattipuskuriliuoksia.

Seuraavat esimerkit valaisevat kaavan I mukaisten yhdisteiden ja niiden välituotteiden valmistusta.

Esimerkki 1 N-t-butyylioksikarbonyyli-L-kysteinyyli-(S-p-metoksibentsyyli) metyloitu polystyreenihartsi 500 ml:aan N,N-dimetyyliformamidia (DMF), joka sisälsi N-t-bu-tyylioksikarbonyyli-(S-p-metoksi bentsyyli)-kysteiini /joka on valmistettu 9,06 g:sta (26,5 mnoolia ) vapaata happoa/kesiumsuolaa, lisättiin 51,0 g kloorimetyloitua polystyreenihartsia (Lab.Systems, Inc., 0,75 mmoolia/g). Seosta hämmennettiin huoneenlämmössä 6 päivän ajan. Hartsi suodatettiin ja pestiin peräkkäin kolme kertaa seoksella, jossa oli 90 % DMF:a ja 10 % vettä, kolme kertaa 95-%:sella etanolilla ja kolme kertaa DMF:11a. Hartsi suspendoitiin 500 ml:aan DMF:a ja siihen lisättiin liuos, jossa oli 10,5 kesium-asetaattia. Seosta hämmennettiin 6 päivää huoneenlämmössä. Sen jälkeen hartsi suodatettiin ja pestiin peräkkäin, kerran DMF:n vesi-liuoksella, kolme kertaa seoksella, jossa oli 90 % DMF:a ja 10 % vettä, kolme kertaa 95-%:sella etanolilla, kolme kertaa metyleeni-kloridilla, kolme kertaa 95-%:sella etanolilla ja kolme kertaa kloroformilla. Pienet hiukkaset poistettiin suspendoimalla hartsi kloroformiin neljä kertaa ja vetämällä joka kerta neste pois. Sen jälkeen hartsi kuivattiin vakuumissa 40°(£ssa yli yön ja saatiin 44,8 g otsakkeen yhdistettä.

11 64576

Aminohappoanalyysi osoitti 0,25 mmoolia Cys/g kohti hartsia. Kysteiini määrättiin kysteiinihappona happohydrolyysistä, joka suoritettiin käyttäen 1:1 seosta dioksaania ja konsentroitua kloori-vetyhappoa, johon oli lisätty pieni määrä dimetyylisulfoksidia.

Esimerkki 2 N—t—butyylioksikarbonyy1i—D—valyyli—glysyyli—L—(S-p-metoksi-bentsyyli)kysteinyyli-L-(N-o-klooribentsyylioksikarbonyyli)-lysyyli-L-asparaginyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli-L-(formyyli) tryptofyyli-L-(N-o-klooribentsyylioksikarbonyyli)lysyyli-L-(o-bentsyy- li)treonyyli-L-fenyylialanyyli-L-(O-bentsyyli)treonyyli-L-(O-bent-syyli)seryyli-L-(S-p-metoksibentsyyli)kysteinyyli metyloitu polysty-reeni-hartsi.

Esimerkissä 1 saatu tuote (7,0 g) pantiin Beckmanin reaktio-astiaan 990, automaattiseen peptidien synteesilaitteeseen ja kaksitoista jäljellä olevista kolmestatoista aminohaposta lisättiin käyttäen automaattista synteesilaitetta. Tuloksena oleva suojattu tride-kapeptidihartsi jaettiin kahteen samanlaiseen osaan ja lopullinen jäännös pantiin toiseen näistä osista. Käytettiin aminohappoja seu-raavan käyttösekvenssinmukaisesti:(DN-t-butyylioksikarbonyyli-(0-bent-syyli-L-seriini; (2) N-t-butyylioksikarbonyyli-(O-bentsyyli)-L-treoniini; (3) N-t-butyylioksikarbonyylifenyylialaniini, (4) N-t- butyylioksikarbonyyli- ( -bentsyyli)-L-treoniini; (5) N^-t-butyyli-oksikarbonyyli-N^—o-klooribentsyylioksikarbonyyli-L-lysiini; (6) -t-butyylioksikarbonyyli-(N-formyyli-L-tryptofaani; (7) N-t-butyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniini; (8) N-t-butyylioksikarbo-nyyli-L-fenyylialaniini; (9) N-t-butyylioksikarbonyyli-L-asparagiini, p-nitrofenyyli-esteri; (10) N^-t-butyylioksikarbonyyli-N^-o-kloo- ribentsyylioksikarbonyyli-L-lysiini; (11) N-t-butyylioksikarbonyyli- (S-p-metoksibentsyyli)-L-kysteiini; (12) N-t-butyylioksikarbo-nyyli-glysiini; ja (13) N-t-butyylioksikarbonyyli-D-valiini.

Suojaryhmän poistamisen, neutraloinnin, liittämisen ja uudel-leenliittämisen sekvenssi, jonka mukaan kukin aminohappo liitetään peptidiin on seuraava: 1) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, jokainen suoritetaan kloroformilla; 2) BOC-ryhmän poistaminen käsittelemällä kahdesti 20 min ajan, kummallakin kerralla käyttäen (10 ml/g hartsia) seosta, jossa on 29 £ tri fluorietikka-happoa, 48 % kloroformia, 6 trietyylisilaania ja 17 % metyleeni-kloridia; 3) kaksi pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, i2 6 4 5 7 6 kumpikin kloroformilla; 4) yksi pesu (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan metyleeniklordilla; 5) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, käyttäen kussakin seosta, jossa on 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; 6) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kukin metyleenikloridilla; 7) neutralointi kolmen käsittelyn avulla, kolmen minuutinajan kukin ja käyttäen (10 ml/g hartsia) 3-%:sta trietyyliamiinia mety-feenikloridissa; 8) kolme pesua (10 ml/g hartsia,kukin kolmen minuutin ajan, metyleenikloridilla; 9) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kukin kolmen minuutin ajan seoksella, jossa on 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; 10) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan kukin metyleenikloridilla; 11) lisätään 1,0 mmoolia/g hartsia suojattua aminohappoa ja 1,0 mmoolia/g hartsia N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidiä (DCC)IO ml:ssa/g hartsia metylee-nikloridia, jota seuraa sekoitus 120 minuutin ajan; 12) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kukin kolmen minuutin ajan ja metyleenikloridilla; 13) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan Xukin f’ seoksella, jossa on 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyyliälkoho-lia; 14) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan kukin, metyleenikloridilla; 15) neutralointi kolmen käsittelyn avulla, kukin kolmen minuutin ajan käyttäen 10 ml/g hartsia 3-%:tista trietyyliamiinia metyleenikloridissa; 16) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kukin metyleenikloridilla; 17) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kukin seoksella, jossa on 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; 18) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kukin metyleenikloridilla; 19) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kukin DMFtlla ; 20) lisätään 1,0 mmoolia/g hartsia suojattua aminohappoa ja 1,0 mmoolia/g hartsia N,N'-disykloheksyylikarnodi-imidiä (DCC) 10 mlssa/g hartsia seosta, jossa on 1:1 suhteessa DMl?:a ja metyleenikloridia, mitä seuraa hämmentäminen 120 minuutin ajan; 21) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan DMFrlla; 22) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan metyleenikloridilLa; 23) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan seoksella, jossa on 90 V. t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; 24) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kukin kolmen minuutin ajan metyleenikloridilla; 25) neutralointi kolmen käsittelyn avulla, kukin kolmen minuutin ajan käyttäen 10 ml/g hartsia seosta, jossa on 3 7, trietyyliamiinia metyleenikloridissa; 13 64576 26) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan mety-leenikloridilla; 27) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan seoksella, jossa 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; ja 28) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan metyleenikloridilla.

Yllä olevaa sekvenssikäsittelyä käytettiin lisättäessä jokainen aminohappo, paitsi glysiini- ja asparagiinijäännökset. Glysiinin lisäys suoritettiin käyttäen vain vaiheita 1-18. Asparagiinijäännös lisättiin sen aktiivisen p-nitrofenyyli-esterin kautta. Näin menel-len yllä oleva vaihe 11) muutettiin seuraavaksi 3-vaihesekvenssiksi: a) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan DMF:lla; b) lisättiin 1,0 mmoolia/g hartsia N-t-butyylioksikarbo-nyyli-L-asparagiinin p-nitrofenyyliesteriä 10 ml:ssa/g hartsia seosta, jossa on 1:3 suhteessa DMF:a ja metyleenikloridia, mitä seurasi hämmentämistä 720 minuutin ajan; ja c) kolme pesua (10 ml/g hartsia) , kukin kolmen minuutin ajan käyttäen DMF:a. Samoin edellä oleva vaihe 20) muutettiin siten, että käytettiin N-t-bytyylioksikarbo-nyyli-L-asparagiinin p-nitrofenyyliesteriä seoksessa, jossa oli 3:1 suhteessa DMF:a ja metyleenikloridia, mitä seurasi hämmentämis- .

tä 720 minuutin ajan.

Valmis peptidi-hartsi kuivattiin vakuumissa. Osa tuotteesta hydrolysoitiin pystyjäähdyttäjänolosuhteissa 72 h ajan seoksessa, jossa oli kloorivetyhappoa ja dioksaania. Tuloksena olevan yhdisteen aminohappoanalyysi antoi seuraavat tulokset: Asn, 1,04; 2 Thr, 2,68; Ser, 1,08; Vai, 1.12; Gly, 1.04? 3 Phe, 3.87; 2 Lys, 2.00,

Trp, 0.75.

Tryptofaani määrättiin 21 päivän hydrolyysin avulla yhdisteen näytteestä, jossa oli mukana dimetyylisulfoksidia ja tioglykolihappoa. Kysteiiniä ei määrätty, sillä se tuhoutui analyysimenetelmän vuoksi.

Esimerkki 3 D-valyyli-glysyyli-L-kysteinyyli-L-lysyyli-L-asparaginyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli-L-tryptofyyli-L-lysyyli-L-treonyv-li-L-fenyylialanyyli-L-treonyyli-L-seryyli-L-kysteiini.

Seokseen, jossa oli 5 ml anisolia ja 5 ml etyy1imerkaptaania, lisättiin 2.828 g (substituutiotaso 0.150 mmoolia/y) esimerkki 2:n suojattua tetradeknpoptidL hartsia. Seos jäähdytettiin nestemäisessä vypessä ja 56 ml nestemäisiä lluorivetyä lisättiin tislauksessa.

Saadun seoksen annettiin lämmetä 0°C:oen ja sitä sekoitettiin 2 h.

64576 14

Fluorivety poistettiin sitten tislaamalla. Jäännökseen lisättiin eetteriä ja seos jäähdytettiin 0°C:een. Saatu sakka otettiin talteen suodattamalla ja pestiin eetterillä. Tuote kuivattiin ja suojaamaton tetradekapeptidi uutettiin hartsiseoksesta käyttäen 1 M etikkahappoa ja pientä määrää jääetikkahappoa. Etikkahappoliuos lyofilisoitiin sitten välittömästi kuiviin pimeässä. Saatu valkea kiinteä aine suspendoitiin seokseen, jossa oli 10 ml 0,2 M etikka-happoa, josta oli poistettu kaasu, ja 4 ml jääetikkahappoa. Saatua suspensiota kuumennettiin, mutta sakka ei liuennut täysin. Liukenematon osa suodatettiin pois ja opakki, väritön suodos pantiin Sephadex G-25 F pylvääseen. Kromatograafiset olosuhteet olivat: liuotin, 0,2 M etikkahappoa, josta oli poistettu kaasu; pylvään koko 7,5 x 150 cm; lämpötila 26°C; virtausnopeus 629 ml/h, fraktion tilavuus 22,0 ml.

Absorptio kohdassa 280 nm kutakin fraktionumeroa kohti osoitti yhden leveän piikin, jota seurasi olka. UV-spektroskopia paljasti, että pääpiikki tarkoitti yhdistettä. Fraktiot, jotka yhdistettiin, ja niiden virtausvolyymit olivat seuraavat:

Fraktiot 224-240 (4906-5280 ml, piikki 5054 ml). Tämä fraktiokoko-elma ei sisältänyt seuraavaa olkaa. UV-spektroskopia ilmaisi, että ainetta oli mukana 175 mg (saalis 24,8 %). Ellnen-titraus osoitti, että vapaiden sulfhydryylien määrä oli 93,6 % teoreettisesta.

Esimerkki 4

Hapettaminen D-Val^-somatostatiiniksi

Pelkistetyn D-Val^-somatostatiinin (374 ml, teoreettisesti 175 mg) liuos esimerkistä 3 laimennettiin 147 ml:lla 0,2 M etikka-happoa ja 2967 ml :11a tislattua vettä, jolloin konsentraatioksi saatiin 50^,ug/ml. Lisättiin konsentroitua ammoniumhydroksidia, jolla seoksen pH-arvo säädettiin 6,7:ksi. Liuosta hämmennettiin huoneenlämmössä pimeässä 64 h,minkä jälkeen Ellman-titraus osoitti hapettumisen tapahtuneen täydellisesti.

Seos konsentroitiin vakuumissa noin 10 ml:n volyymiin.Konsent-raatti laimennettiin 10 ml :11a jääetikkahappoa ja sen jälkeen se absorboitiin Sephadex G-25 F pylvääseen. Kromatograafiset olosuhteet olivat: liuotin, 50-%:sta etikkahappoa, josta kaasu oli poistettu, pylvään koko 5,0 x 90 cm, lämpötila 26°C, virtausnopeus 246 ml/h, fraktion volyymi 16,4 ml.

15 64576

Absorptio kohdassa 280 nm kutakin fraktionumeroa kohti osoitti yhden leveän piikin. UV-spektroskopia osoitti, että pääosa piikistä oli yhdistettä. Fraktiot 157-172 (virtausvolyymit 2590-2855 ml, piikki = 2667 ml) yhdistettiin ja lyofilisoitiin kuiviin pimeässä. UV-spektroskopia osoitti 95 mg haluttua tuotetta (pelkistetyn muodon saalis = 54,3 %).

Osa tuloksena olevasta kiinteästä aineesta liuotettiin 5 ml:aan 50-%:sta etikkahappoa ja kromatografioitiin uudelleen Sephadex G-25 F pylväässä. Kromatograafiset olosuhteet olivat: liuotin 50-% etikkahappoa, josta kaasu poistettu, pylvään koko 2,5 x 180 cm, lämpötila 26°C, virtausnopeus 53,2 ml/h fraktion volyymi 8,87 ml.

Absorptio kohdassa 280 nm kutakin fraktionumeroa kohti osoitti yhden leveän piikin. UV-spektoskopia osoitti, että suurin osa piikistä esitti tuotetta. Fraktiot 56-60 (488-532 ml, piikki = 505 ml) yhdistettiin ja lyofilisoitiin kuiviin pimeässä.

Optinen kierto ^ = ^_Pros «etikkahappo) ·

Aminohappoanalyysi: Vai 0,98; Gly 1,01; 2 Cys 1,81; 2 Lys 1,99;

Ans 0,95; 3 Phe 2,94; Trp 0,80; 2 Thr 1,91; Ser 0,85.

Yllä olevat tulokset on ilmaistu suhteessa (Gly + Lys)/3 = 1,0. Suoritettiin seuraavat 21-tunnin hydrolyysit: 1) Käyttäen dimetyylisulfoksidia hapettamaan kysteiini kys-teiinihapoksi 2) Tiolykolihappo huuhdeltiin 3) Ilman huuhtelua tai hapetusta.

Kaikki yllä olevat arvot ovat keskiarvoja kolmesta hydrolyy-sistä, paitsi seuraava:

Cys ja Ser; 1) ja 3) ainoastaan

Trp 2) ainoastaan

Phe 2) ja 3) ainoastaan.

Testattiin koiriin D-Val -somatostatiinin kykyä inhiboid a vat-sahappoeritystä in vivo. Kuudella koiralla, joilla oli pysyvä fistula ja Heidenhain-pussi, indusoitiin vatsan HCl-eritystä infusoimal-la gastriinin C-terminaalista tetrapeptidiä 0,5^,ug/kg/h. Kukin koira toimi omana kontrollinaan saaden erillisenä päivänä ainoastaan tetrapeptidiä. Toisena päivänä kaikki kuusi koiraa saivat tetrapeptidiä ja kun HCl-eritystä oli jatkunut yhden tunnin ajan, infu-' 1 soitiin D-Val -somatostatiinia 0,75^ug/kg/h. yhden tunnin ajan.

16 64576

Vatsahapponäytteitä kerättiin vielä 1,5 h ajan 15 min väliajoin. Näytteet titrattiin pH-arvoon 7 automaattisella titrauslaitteella. D-Val^-somatostatiinin maksimaalinen inhibaatiovaikutus ekstrapoloitiin somatostatiinin annosherkkyyskäyrän suhteen ja analogisen yhdisteen suhteellinen tehokkuus somatostatiinin tehokkuuteen nähden ilmaistaan aktiivisuusprosenttina. D-Val -somatostatiini inhiboi pysyvän olostilan happoeritystä,joka oli indusoitu gastriinin C-terminaalisella tetrapeptidillä 85,1 %:lla - 6,0 % keskimääräinen standardivirhe. Tämä teho on ekvivalenttinen somatostatiinin tehon kanssa, jota annetaan 0,935^ug/kg/h. Sen tehokkuus suhteessa somatostatiinin tehokkuuteen on siis 125 %.

D-Val^-somatostatiinin vaikutusta myös suoliston liikkeisiin kokeiltiin tajuissaan oleviin koiriin. Käytettiin kolmea koiraa, joihin oli asennettu intralumenaaliset katetrit antrumiin, duone-numiin ja pylorukseen. Suoliston lumenin painevaihtelut rekisteröitiin Visicorder-laitteella käyttäen jännitysmittaimia ja miniatyyrikokoa olevia valonsädevalvanometrejä. Sen jälkeen kun oli kont-roloitu pysyvä olotila, infusoitiin D-Val^-somatostatiinia intrave-nöösisti yli 10 minuutin ajan. Aluksi yhdiste lisäsi pyloruksessa intralumenaalipainetta ja sen jälkeen pienensi sitä, kun taas paine duodenumissa ja antrumissa pysyi alentuneena koko testin ajan. Minimiannos, joka tarvittiin lisäämään pyloruksen painetta ja vähentämään duodenumin ja antrumin paineita, oli 0,125^ug/kg - 10 min.

Tämä vastaa itse somatostatiinin vaikutusta annoksella 0,125 -0,25yug/kg - 10 min. D-Val^-somatostatiinin on osoitettu inhiboivan myös pankreaksen eritystä. Kolmessa koirassa, joilla oli sekä pank-reas- että totaalinen mahalaukkufistula, indusoitiin pankreaksen eritys infusoimalla sekretiiniä 2 yksikköä/kg/h ja kolekystokiniiniä 0,45 yksikköä/kg/h ja mahalaukun HCl-eritystä infusoimalla tetragast- riinia 0,5,ug/kg/h. Kun oli määritetty vakioherkkyys, jokainen koi-' 1 ra sai D-Val -somatostatiinia yhden tunnin ajan 0,75^ug/kg/h. Inhiboivan vaikutuksen huippu oli ilmoitettuna muutoksena prosenteissa kokonaisproteiinin kontrolliarvosta -51 %.

Myös D-Val^-somatostatiinin vaikutusta kasvuhormoonin eritykseen testattiin. Menetelmässä, jota käytettiin, testattiin normaaleja Sprague-Dawley-rotua olevia koirasrottia, jotka painoivat 100 -120 g (Laboratory Supply Company, Indianapolis, Indiana). Testi on muunnos menetelmästä, jonka ovat so 1 ostaneet P.Hrazeau, W.Vale ja 17 6 4 5 7 6 R.Guilleman, Endocrinology, 94, 184 (1974). Tässä kokeessa käytettiin viittä kahdeksan rotan ryhmää. Natriumpentobarbitalia annettiin intraperitoneaalisesti kaikkiin rottiin stimuloimaan kasvuhor-moonin eritystä. Yksi ryhmä toimi kontrollina ja sai vain suolaliuosta. Kaksi ryhmistä sai somatostatiinia, yksi niistä 2^ug/rotta, subkutaanisesti ja toinen ryhmä 50/ug/rotta subkutaanisesti. Toiset kaksi ryhmää saivat D-Val -somatostatiinia, toinen 2^ug/rotta subkutaanisesti ja toinen 50^ug/rotta subkutaanisesti. Kasvuhormoo-nin seerumikonsentraatio mitattiin 20 minuuttia sen jälkeen kuin oli annettu simultaanisesti natriumpentobarbitalia ja testiyhdistettä. Sitten määrättiin kasvuhormoonin seerumikonsentraation inhibaatio-aste kontrolliryhmään nähden ja D-Val^-somatostatiinin ja itse so-matostatiinin suhteellisia vaikutuksia vertailtiin keskenään.

Annostasolla 2^,ug/rotta D-Val -somatostatiini inhiboi kasvuhormoonin erityksen lisäystä 2 %:11a yli kontrollin, kun taas somatostatiini aikaansai 44 %:n inhiboinnin. Annostamalla 50/Ug/rotta 1 ' D-Val -somatostatiini inhiboi kasvuhormoonin erityksen lisäystä 73 %:lla yli kontrollin,kun taas itse somatostatiini aikaansai 79 %:n inhiboinnin.

Testattiin myös D-Val^-somatostatiinin kykyä inhiboida in vivo glukagonin ja insuliinin eritystä L-alaniinilla stimuloinnin jälkeen. Normaalien sekarotuisten, kumpaakin sukupuolta olevien koirien annettiin paastota yli yön. Otettiin kontrolliverinäytteet ja sen jälkeen aloitettiin suolaliuoksen, somatostatiinin tai D-Val-somatos-tatiinin infusoiminen intravenöösisti. 30 minuutin kuluttua annettiin vielä lisäksi L-alaniinia intravenöösisti 15 minuutin ajan. Suolaliuoksen, somatostatiinin tai D-Val^-somatostatiinin infusoin-tia jatkettiin 15 minuutin ajan sen jälkeen, kun L-alaniinin infuusio oli lopetettu. L-alaniinin infuusio aiheutti äkillisen glukagonin ja insuliinin seerumikonsentraation lisääntymisen, mikä palautui kontrollikonsentraatioon L-alaniinin infuusion päätyttyä. Edellä olevasta pääteltiin, että D-Val^-somatostatiinin minimiannos, joka inhiboi glukagonia on 0,06 - 0,ll^ug/kg/min ja vastaava insuliinille 0,006 - 0,03^,ug/kg/min, kun taas somatostatiinin minimiannos glukagonin inhiboimiseen on 0,10-0,12^ug/kg/min ja insuliinin in-hiboimiseen 0,03 - 0,10^ug/kg/min.

64576 18

Farmakologiset vertailukokeet Käyttäen koiria koe-eläiminä tutkittiin somatostatiinin ja sen tiettyjen analogien inhiboivaa vaiktuusta in vivo mahahapon eritykseen. Kukin yhdiste testattiin käyttäen kuutta koiraa, joilla oli krooninen suoliavanne ja Heidenhain-pohjukka, jolloin suolahapon eritys mahassa indusoitiin infusoimalla gastriinin C-terminaalista tetra-peptidiä nopeudella 0,5 mikrogrammaa/kg tunnissa. Kukin koira toimi omana kontrollinaan, jolloin sille yhtenä päivänä annettiin pelkästään tetrapeptidiä. Toisena päivänä kullekin kuudesta koirasta annettiin ensin tetrapeptidiä ja yhden tunnin kuluttua siitä, kun suolahapon eritys oli stabiloitunut, tutkittavaa yhdistettä infusoitiin yhden tunnin ajan. Mahahapponäytteita kerättiin edelleen 1,5 tunnin ajan 15 minuutin välein. Näytteet titrattiin pH-arvoon 7. Kunkin tutkitun yhdisteen maksimi-inhibitiovaikutus ekstrapoloitiin somatostatiinin annos/vastinekäyrästä, ja tutkittavan yhdisteen suhteellinen teho somatostatiiniin nähden ilmaistiin prosentuaalisena aktiivisuutena. Saatiin seuraavat tulokset.

Yhdiste Maksimi-inhibitiovaikutus (%) L-Ala^-somatostätiini (luonnon sekvenssi) 100 D-Ala^-somatostatiini 54 D-Val^-somatostatiini 125

Tuloksista ilmenee, että D-Ala^-somatostatiinin (luonnon somatostatiinin (L-Ala ) stereoisomeeri) aktiivisuus on noin puolet luonnon somatostatiinin aktiivisuudesta. Esillä olevan keksinnön mukainen yhdiste, D-Val -somatostätiini, eroaa D-Ala -somatosta-tiinista siinä, että kahden vetyatomin tilalla on substituenttina metyyliryhmät. Asiantuntija olettaisi, että D-Val^-yhdisteen farmakologinen aktiivisuus olisi suunnilleen samaa suuruusluokkaa kuin D-Ala^-yhdisteen, mutta nyt kokeellisesti saatiin kuitenkin erilainen tulos. Tämä tulos oli täysin odottamaton ja osoittaa selvästi, että D-Val^-somatostatiinilla on odottamattomat ominaisuudet rakenteellisesti samankaltaisiin yhdisteisiin verrattuna.