NO862825L - Polynukleotidprober. - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

1. Oppfinnelsens område

Oppfinnelsen vedrører polynukleotider som kan merkes for

å tjene som prober som er nyttige ved probing av human- eller animal-genomet, og en fremgangsmåte for å identifisere genomisk DNA under anvendelse av slike prober. Fremgangsmåten for identifisering er f.eks. nyttig ved paternitets- og maternitetstesting, i forensisk medisin og diagnose av genetiske sykdommer og cancer.

2. Beskrivelse av teknikkens stand

Den tidligere hovedmetode for identifisering av genetisk variasjon i genomisk DNA er å påvise restriksjonsfragmentlengde-polymorfismer (RFLPs), se f.eks. identifikasjonen av locuset for den DNA-defekt som er ansvarlig for Huntington's chorea sykdom, ved J.F. Gusella et al, Nature 306 , 234-238 (1983), og analyse av predisposisjon for retinoblastoma av W.K. Cavanee et al., Nature 305^, 779-784 (1983).

De fleste RFLPs resulterer fra endringer i liten målestokk

i DNA, vanligvis basesubstitusjoner, som skaper eller ødelegger spesifikke restriksjons-endonuklease-spaltningspunkter. Siden den gjennomsnittlige heterozygositet for human-DNA er lav (tilnærmet 0,001 pr. basepar), vil restriksjons-endonukleaser sjelden påvise en RFLP ved et gitt locus. Selv når de er påvist, er de fleste RFLPs bare dimorfe (nærvær og fravær av et restriksjons-endonuklease-spaltningspunkt) med en heterozygositet, bestemt ved allelefrekvenser, som aldri kan overstige 50% og som vanligvis er meget mindre. Som resultat vil alle slike RFLPs være u-informative ved genealogi-analyse alltid når kritiske individer er homozygote.

Genetisk analyse kunne forenkles betydelig ved tilgjengelig-het av prober for hypervariable regioner av DNA som viser multiallelisk og tilsvarende ved høye heterozygositeter. Den første slik region ble isolert av A.R. Wyman et al, Proe. Nat. Acad.

Sei. USA 72, 6754-6758 (1980), tilfeldigvis fra et bibliotek av vilkårlige segmenter av human-DNA. Den strukturelle basis for multiallelisk variasjon ved dette locus er ikke kjent ennå. Senere, og igjen tilfeldigvis, er flere andre sterkt variable regioner blitt oppdaget nær human-insulin-genet, [G.I. Bell et al, Nature 295 , 31-35 (1982)], zeta-globin-gener [N.J. Proudfoot et al, Cell 31, 553-563 (1982) og S.E.Y. Goodbourn et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA 80, 5022-5026 (1982)] og c-Ha- ras-1 oncogen [D.J. Capon et al., Nature 302, 33-37 (1983)]. I hvert tilfelle består den variable region av tandemgjentagelser av en kort sekvens (en "minisatelitt") og polymorfisme skyldes alleliske differanser i antall gjentagelser, som oppstår sannsynligvis ved mitotiske eller meiotiske ulike endringer eller ved DNA-glidning under replikering. Den resulterende minisatelitt-lengdevariasjon kan påvises ved anvendelse av eventuelle restriksjonsendonuklease som ikke spalter gjentagelsesenheten.

Oppfinneren her og hans kolleger har tidligere beskrevet

en kort minisatelitt sammensatt av fire tandemgjentagelser av en 33 bp lang sekvens i en intron av human-myoglobin-genet, se P. Weller et al., EMBO J. 2'439-446 (1984). Det ble bemerket

at den 33 bp lange gjentagelse viste svak likhet i sekvens med de ovennevnte andre human-minisatelitter som erkarakteriserttidligere. Artikkelen antok at minisatelittregionene kunne oppstå ved transposisjon. Hvis den 33 bp lange gjentagelse i human-myoglobin-genet kunne transponeres, så kunne den tilveiebringe en probe for tandem-repetitive regioner i human-genomet som ofte assosieres med multiallelisk polymorfisme som skyldes gjentagende antallsvariasjon.

3 Ytterligere, upublisert bakgrunnsinformasjon

Human-genomisk DNA ble probet med en DNA-probe omfattende tandemgjentagelser av den 33 bp lange sekvens fra myoglobin-genet. Polymorf variasjon ble observert ved flere forskjellige regioner i den genomiske DNA for 3 individer (far, mor og datter), idet variasjonen inntraff i størrelsen på større fragmenter

(2-6 kb). Dataene stemte overens med stabilt nedarvet polymorfisme som skyldes lengdevariasjon av mer enn en minisatelitt-regioner.

Oppsummering av oppfinnelsen

Ytterligere forskning har avslørt at det er mulig å probe genomisk DNA på slik måte at det vises variabilitet i minisatelitt-eller de hypervariable regioner langt mer effektivt enn ved å anvendemyoglobingen-33 bp-gjentagelsesproben.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den oppdagelse at mange minisatelitter i human- eller animal-genomisk DNA inneholder en region av DNA som har en høy grad av homologi mellom forskjellige minisatelitter. Denne felles kjerneregion har kort lengde, tilnærmet 16 basepar. Det er nå funnet at en probe som har som sin essensielle bestanddel en kort kjernesekvens av nukleotider tandemvis gjentatt minst 3 ganger, vil tjene til å påvise mange forskjellige minisatelittregioner i den genomiske DNA og med en så fin grad av presisjon at det muliggjør individer å bli identifisert eller tatt fingeravtrykk av med referanse til variasjoner i deres DNA i disse regioner. Et så utmerket resultat er sterkt uventet, siden tidligere forskning har gitt prober som bare har evne til å påvise enkelte minisatelittregioner i genomisk DNA. Disse tidligere prober fører til bedre grad av differensiering enn hva som gis av RFLPs,

men ikke til et fingeravtrykk som i sin essens er unikt for et individ. Bemerkelsesverdig er det funnet at foreliggende kjerneprobe har evne til å differensiere DNA med referanse til mer enn én minisatelittregion eller hypervariabelt locus, og det er denne oppdagelse som gir en uvanlig grad av ikke-nærliggenhet til den oppfinneriske handling og gjør dette til en oppfinnelse av funda-mental videnskapelig nyhet og viktighet.

Ut fra kjennskap til en kjernesekvens kan DNA-prober produseres som har egenskapen å hybridisere med minisatelitt-regioner fra et utvalg av loci i genomet. Imidlertid er den blotte gjenkjennelse eller identifikasjon av en spesiell kjernesekvens utilstrekkelig i seg selv for produksjon av en brukbar probe. Det er også nødvendig å produsere polynukleotid som inneholder tandemgjentagelser av kjernesekvensen eller derivater derav. Slike prober kan bli isolert som minisatelitter fra human- eller animal-DNA, eller kan istedet bli konstruert ved syntetiske teknikker. Det er også viktig å etablere den ytterligere tvang som påvirker vellykket hybridisering. Disse inkluderer kjennskap til graden av homologi med konsensuskjernen som kan være tolererbar og også den tolererbare lengde på en eventuell ikke-kjerne-DNA innen og uten den gjentagende enhet som et hele.

Således involverer foreliggende oppfinnelse gjenkjennelse

og oppdagelse:

(1) at kjennskap til eventuell kjernesekvens kan benyttes på denne måte. Den innebærer den ytterligere forståelse: (2) at ved å undersøke forskjellige hypervariable loci i et genom kan forskjellige kjernesekvenser finnes som har den nødvendige grad av consensus; (3) at en familie av DNA-prober kan akkumuleres som vil erkjenne forskjellige spektra av polymorfismer; (4) at en spesiell genetisk klassifisering kan foretas mer vellykket med én probe enn med en annen; (5) at ved anvendelse av mer enn én probe i hvilken som helst klassifisering forsterkes sannsynligheten for identifikasjon; (6) at ved videre studium av en første generasjon av vellykkede prober kan enklere og mer vellykkede prober produseres, f.eks.

ved syntese.

Således tilveiebringes, i henhold til et første aspekt

av oppfinnelsen, en fremgangsmåte for å fremstille et polynukleotid som har polymorfe minisatelitt-lengdespesifikke bindingskarak-teristikker omfattende:

(i) å identifisere en naturlig tandemgjentagende sekvens i DNA som har evne til begrenset hybridisering til andre polymorfe DNA-regioner, (ii) å identifisere en naturlig consensus-kjernesekvens i gjentagelsessekvensen putativt ansvarlig for slik binding, og (iii) å isolere eller kunstig bygge en perfekt eller imperfekt tandemgjentagelses-sekvens avledet fra den naturlige consensus-kjernesekvens som har minisatelittbindingsegenskaper som oppviser lavere genom-locus-spesifisitet og høyere polymorf fragment-akkseptans enn den naturlige gjentagelsessekvens.

Kjernekomponenten i proben kan defineres på forskjellige måter grunnet på de samme underliggende prinsipper. Det mest fundamentale underliggende prinsipp er at gjentagelsessekvensen til proben skal bestå av eller inkludere en nukleotid sekvens fra en felles kjerneregion, felles for minisatelitter av human-eller animal-genomisk DNA. Den felles kjerneregion er "felles"

i den betydning å vise høy grad av consensus, f.eks. minst 80%,

slik som mellom én minisatelitt og en annen. Disse minisatelitter kan påvises f.eks. ved probing av genomisk DNA-fragmenter med myoglobingen-33 bp-gjentagelsessekvensen, for å gi hybridiserte fragmenter heri referert til som "A33-positive" fragmenter. Disse fragmenter og den 33 bp lange gjentagelse av myoglobin-genet inneholder en tilnærmet 16 bp lang felles kjernesekvens. De ^33-positive fragmenter kan selv bli anvendt som prober av genomisk DNA for å generere videre fragmenter som også har den felles kjernesekvens, skjønt eventuelt med liten variasjon derav.

Et annet prinsipp er at kjernenukleotid-sekvensen skal

ikke være så kort at den svikter med hensyn til å hybridisere effektivt til minisatelittregionene i DNA-prøven, og heller ikke så lang at den svikter med hensyn til å påvise polymorfismene godt, f.eks. at den blir for meget lik den 33 bp lange tandem-gjentagelse i myoglobin-genet. Generelt må kjernen ha fra 6 nuklotider og opp til det maksimale funn i den felles kjerne av minisatelitter, tilnærmet 16. Gjentagelsessekvensen til proben trenger ikke å bestå utelukkende av kjernen, men kan inneholde et lite antall flankerende nuklotider på hver side av kjernesekvensen. De gjentagende enheter trenger ikke være nøyaktige gjentagelser enten med hensyn til antall eller type av nukleotider og enten med hensyn til kjerne- eller ikke-kjerne-kompo-nentene i de gjentagende enheter. Det er imidlertid bekvemt å beskrive og definere dem her som gjentagende enheter, til tross for at dette er en tilnærmet betegnelse. Blokken av n gjentagende enheter kan være flankert på hver side av hvilken som helst nukletidsekvens, hvis utstrekning og type ordinært er irrelevant.

Polynukleotider i henhold til oppfinnelsen inkluderer spesifikt slike som er definert på hver av de følgende måter:

FØRSTE DEFINISJON

Polynukleotider som har den generelle formel, lest i

5 1 3<1>retning

hvor

"kjerne" representerer en sekvens somhar minst 6 påfølgende nukleotider, valgt blant hvilke som helst av de følgende sekvenser lest i samme betydning:

hvor

X er A eller G, Y er C eller T, m er 0,1 eller 2, p er 0 eller 1, q er 0 eller 1, n er minst 3;

J og K representerer sammen 0-15 ytterligere nukleotider innen den gjentagende enhet; og

H og L representerer hver 0 eller minst 1 ytterligere nukleotid som frankerer de gjentagende enheter,

og forutsatt at:

(i) "kjerne" og J og K ikke nødvendigvis har samme sekvens eller lengde i hver (J.kjerne.K) gjentagende enhet; (ii) "kjerne" kan også representere en variant-kjernesekvens; (iii) totale aktuelle kjernesekvenser i alle n gjentagende enheter har minst 70% homologi med totale "ekte" kjernesekvenser som definert ovenfor med hensyn til formlene 2 til 5 i samme antall n av gjentagende enheter;

og polynukleotider av komplementær sekvens til ovennevnte.

ANNEN DEFINISJON

Polynukleotider som har den generelle formel

hvor:

"kjerne" representerer en sekvens av fra 6 til 16 fort-løpende nukleotider, lest i samme 5' -> 3<1>betydning, valgt fra (1) den 5' -> 3' felles kjerneregion i en første human- eller animal-minisatelitt oppnådd ved probing av human- eller animal-genomisk DNA med en probe-DNA som inneholder en myoglobin-tandem-gjentagelsessekvens av tilnærmet 33 nt pr. gjentagelsesenhet (2), den 5' ->- 3<1>felles kjerneregion til en annen human- eller animal-minisatelitt oppnådd ved probing av human- eller animal-DNA med

en probe-DNA som inneholder en tandemgjentagelses-sekvens omfattende den felles kjerneregion i den første minisatelitt,

og (3) og 5' -> 3' felles kjerneregion i en tredje human- eller

animal-minisatelitt oppnådd ved probing av human- eller animal-genomisk DNA med en probe-DNA inneholdende en tandemgjentagelses-sekvens omfattende den felles kjerneregion i den annen minisatelitt, idet hver tandemgjentagelses-sekvens er en gjentagelse av minst 3 enheter,

og polynukleotider av komplementær sekvens til ovennevnte.

TREDJE DEFINISJON

Polynukleotider som har den generelle formel

hvor:

"kjerne" representerer hvilke som helst av de sekvenser som har minst 5 fortløpende nukleotider fra innen en felles kjerneregion av minisatelitter av human- eller animal-genomisk DNA som viser minst 75%, fortrinnsvis 80% consensus;

"kjerne" har ikke nødvendigvis samme sekvens i hver gjentagende enhet, og alle andre symboler er som definert ovenfor, og polynukleotider av komplementær sekvens til ovenstående.

FJERDE DEFINISJON

Polynukleotider som har minst tre gjentagelser av en sekvens av fra 6 til 36 nt inklusive en fortløpende (5<1>3') kjernesekvens valgt fra:

hvor p = ikke G, W = A eller T og X = A eller G

eller en variant derav, forutsatt at de totale aktuelle kjernesekvenser i alle gjentagelser har minst 70% homologi med de totale "ekte" kjernesekvenser definert med hensyn til formel (6) i samme antall gjentagelser,

og polynukleotider av komplementær sekvens til ovennevnte.

I de ovenstående formler og gjennom hele er sekvensen vist

i den vanlige angivelse 5' -> 31 .

Oppfinnelsen inkluderer polynukleotider av DNA, RNA og

av hver annen type som er hybridiserbar til DNA. Polynukleotidene som er definert ovenfor er umerket og kan være i dobbeltstrenge6 (ds) eller enkeltstrenget (ss) form.

Oppfinnelsen inkluderer merkede polynukleotider i ss-form for anvendelse som prober såvel som deres merkede ds-forløpere, fra hvilke ss-probene kan produseres.

32

De er fortrinnsvis P-radiomerket pa hvilken som helst konvensjonell måte, men kan alternativt være radiomerket på annen måte som er kjent på hybridiseringsområdet, bli merket med biotin eller en lignende substans ved metoden til D.C. Ward et al, som beskrevet i Proceedings of the 1981 ICN-UCLA Symposium on Developmental Biology using Purified Genes holdt i Keystone, Colorado 15-20 mars 1981 vol. XXIII 1981, s. 647-658 Academic Press; redaktør Donald D. Brown et al eller til og med enzym-merket ved metoden til A.D.B. Malcolm et al, Abstracts of the 604th Biochemical Society Meeting, Cambridge, England (møte 1. juli 1983).

Derfor, i henhold til et annet aspekt av oppfinnelsen, tilveiebringes en polynukleotidprobe som er nyttig bestemmelser angående genetisk opprinnelse for human- eller animal-DNA-holdige prøver som omfatter, med innlemmelse av en merket eller markørkomponent, et polynukleotid omfattende minst tre tandem-gjentagelser (inklusive varianter) av sekvenser som er homologe med en minisatelittregion i human- eller animal-genomet i en grad som muliggjør hybridisering av proben til et tilsvarende DNA-fragment oppnådd ved fragmentering av DNA-prøven med en restriksjonsendonuklease,

karakterisert vedat:

a) hver av gjentagelsene inneholder en kjerne som er minst 70% homolog med en consensus-kjerneregion av lignende lengde som er tilstede i et flertall av minisatelitter fra forskjellige genomiske loci; b) kjernen er fra 6 til 16 nukleotider lang; c) det totale antall nuklotider innen den gjentagende

enhet som ikke bidrar til kjernen er ikke mer enn 15.

Oppfinnelsen inkluderer også en fremgangsmåte for å identifisere en prøve av human- eller animal-genomisk DNA som omfatter å probe nevnte DNA med en probe i henhold til oppfinnelsen og påvise hybridiserte fragmenter av DNA.

Dette aspekt i henhold til oppfinnelsen kan innebære:

å fragmentere total DNA fra en prøve av cellulært materiale under anvendelse av en restriksjons-endonuklease,

å hybridisere sterkt variable DNA-fragmenter med en probe som definert ovenfor som inneholder, i tillegg til en merket eller markør-komponent, en gjentatt kjernekomponent, og

å bestemme merke- eller markør-konsentrasjonen som er bundet til DNA-fragmenter med forskjellig lengde, eller mer generelt til bånd av forskjellig molekylstørrelse.

Normalt sorteres eller segregeres den fragmenterte DNA i henhold til kjedelengde, f.eks. ved elektroforese, før hybridisering, og markør-konsentrasjonen føles for å oppnå et karak-teristisk mønster, hvorav individuelle elementer har spesifikk genetisk opprinnelse.

Definisjoner

De følgende definisjoner anvendt i forbindelse med foreliggende oppfinnelse og de ovennevnte tidligere søknader kan være til hjelp.

Hypervariabel

En region av human- eller animal-DNA ved et anerkjent locus eller punkt sies å være hypervariabel hvis den inntreffer i mange forskjellige former, f.eks. med hensyn til lengde eller sekvens.

Restriksjonsfragmentlengde- polymorfisme ( RFLP)

Er genetisk variasjon i mønstret av human- eller animal-DNA- f ragmenter separert etter elektroforese og påvist ved en probe.

Minisatelitt

En region av human- eller animal-DNA som er sammensatt av tandem-gjentagelser med kort DNA-sekvens. Alle gjentagelses-enheter viser ikke nødvendigvis perfekt identitet. (Prober i henhold til oppfinnelsen omfatter minisatelitter som er polymorfe .)

Polymorf

Et gen eller annet segment av DNA som viser variabilitet fra individ til individ sies å være polymorft.

Kjerne ( Sekvens)

Opprinnelig benyttet i betydningen av consensuskjerne-sekvens , men utvidet til eventuell gjentatt eller varientsekvens avledet derfra.

Consensuskjerne ( Sekvens)

En sekvens som kan identifiseres som en vesentlige eller perfekt matching mellom gjentagelsesenhetene av to eller flere minisatelitter av varierende opprinnelse eller loci.

Gjentagelse ( Sekvens)

En sekvens som er en perfekt eller imperfekt tandem-gjentagelse av en gitt kjernesekvens eller et segment inneholdende kjernesekvensen.

Definert kjerne ( Sekvens)

En kjernesekvens som er fullstendig i samsvar med én av formlene (2) til (8) innen sin egen lengde.

Variant ( Kjernesekvens)

En aktuell kjernesekvens som avviker fra en definert kjernesekvens i mindre grad (>50% homologi).

Perfekt gjentagelse ( Sekvens)

En sekvens som er en eksekt tandemrepetering av en gitt kjernesekvens eller av et segment som inneholder kjernesekvensen.

Imperfekt gjentagelse ( Sekvens)

En sekvens i hvilken minst én enhet avviker i basepar-substitusjon og/eller lengde fra minst én annen enhet. (Det vil normalt være minst 3 tandemgjentagelser i en probesekvens innen hvilken det normalt vil være minst én definert kjernesekvens og minst én variant.)

% Homologi

Ved sammenligning av to sekvenser av samme lengde: antall basepar (bp) minus antall bp substitusjoner i én som er nødvendig for å gi den annen, som prosent av antall basepar.

Nukleotid (nt) og basepar (bp) anvendes synonymt. Begge kan referere til DNA eller RNA. Forkortelsene C, A, G, T refererer konvensjonelt til (deoksy)cytidin, (deoksy)adenosin, (deoksy)guanosin og enten deoxytymidin eller uridin.

Tandemgjentagelses-sekvensen (kunstig eller et naturlig isolat) kan således være en perfekt gjentagelse, men er mer å foretrekke en imperfekt gjentagelse. Fortrinnsvis er minst to gjentagelser imperfekte gjentagelser av consensuskjerne-sekvensen. Det er fortrinnsvis minst tre gjentagelser og mer å foretrekke minst 7 i probesekvensen.

Produksjon av en probe kan innebære isolasjon av en naturlig minisatelitt ved kloning og identifisering ved DNA-sekvensering. Det kan også innebære fjerning av den krevede kjerne og dens påfølgende omdannelse til en tandemgjentagelse, eller stimulering av ulike utbyttinger med kjernefragmenter av forskjellig opprinnelse. Det kan også inkludere kloning av polynukleotidet.

På den annen side kan byggetrinnet inkludere syntetisering av den identifiserte consensuskjerne-sekvens eller et fragment derav. Consensuskjerne-sekvensen inneholder fortrinnsvis ikke mindre enn 6 bp og inneholder fortrinnsvis ikke mer enn 16 bp.

En tandemgjentagelse av den syntetiske kjerne konstrueres deretter.

Naturligvis kan polynukleotidet være resultatet av en rekkefølge av operasjoner ved forskjellige tidspunkter som følger kloning av vellykkede eller delvis vellykkede intermediater og kan inkludere fragmenter av naturlig eller syntetisk opprinnelse, slik at sluttpolynukleotidet kan bære liten likhet med opphavs-minisatelitten.

Probene i henhold til oppfinnelsen er nyttige på følgende områder:

1. Paternitets- og maternitetstesting hos mennesker.

2. Familiegruppeverifisering i f.eks. immigranttvister og arvetvister.

3. Zygositetstesting hos tvillinger.

4. Testing angående innavl hos mennesker.

5. Generell genealogi-analyse hos mennesker.

6. Identifisering av loci av genetisk sykdom hos mennesker, hvorved det muliggjøres å konstruere spesifikke tråder

for å påvise en genetisk defekt.

7. Forensisk medisin (a) lage fingeravtrykk av sedprøver fra voldtektsofre

(b) lage fingeravtrykk av blod, hår og sædprøver fra f.eks. til-smusset tøy (c) identifisering av menneskerester. 8. Celle-chimaerisme-studier, f.eks. etter donor- kontra recipientceller etter benmargtransplantasjon. 9. Livdyravl og genealogi-analyse/autentisering. (Dette kunne f.eks. inkludere rutinekontroll og sjekking av rene stammer av dyr, og sjekking av stamtavler når det gjelder rettssaker som involverer f.eks. rasehest- og hundeavl). Også for å tilveiebringe genetiske markører som kan vise

assosiasjon med nedarvede trekk av økonomisk betydning.

10. Rutinekvalitetskontroll av dyrkede dyrecellelinjer, sjekking angående kontaminering av rene cellelinjer og

for rutine-identifiseringsarbeid.

11. Analyse av tumor-celler og tumorer for molekylære abnormaliteter. 12. Det forventes at polynukleotidene eller probene som er avledet derav har potensiell anvendelse i planteavl.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er en skjematisk representasjon av fremgangsmåten ved å fremstille en 33 bp gjentagelses-sekvens av myoglobin-genet, innsetting av det i et plasmid og kloning av det. Fig. 2 er en fotokopi av et fotografi av autoradiogram av fragmenter av genomisk DNA som hybridiserer til forskjellige DNA-prober, og som også viser en nedstamning av beslektede individer hvis DNA ble identifisert i to av autoradiogrammene. Fig. 3 viser autoradiogrammer av DNA-prøver fra 3 ubeslektede human-individer probet med tre forskjellige prober i henhold til oppfinnelsen. Fig. 4 viser et autoradiogram av DNA-prøver fra 9 human- individer, hvorav noen er beslektet og to er identiske tvillinger, probet med en probe i henhold til oppfinnelsen. Fig. 5 viser autoradiogrammer av DNA-prøver fra 2 mennesker og 17 ikke-humane dyr probet med en probe i henhold til oppfinnelsen. Fig. 6 viser en serie av autoradiogrammer av DNA-prøver fra medlemmer av en ghanesisk familie involvert i en immigra-sjonstvist, probet i overensstemmelse med oppfinnelsen. Fig. 7 viser autoradiogrammer av DNA-prøver fra en søsken-flokk angrepet av nevrofibromatose. Fig. 8 viser autoradiogrammer av DNA fra en Gujerati-avstamning produsert for undersøkelse av mulige ko-inheritens av minisatelitt-fragmenter og nedarvet persistens av foetal haemoglobin (HPFH); og Fig. 9a og 9b er genetiske diagrammer som illustrerer nedarving av HPFH og av forskjellige minisatelitter i en stor stamtavle. Fig. 10 er et diagram som illusterer fremstillingen av en klonet kunstig minisatelitt. Fig. 11 viser en serie av autoradiogrammer av DNA-prøver fra to ubeslektede placentaer, probet med nye syntetiske prober. Fig. 12 viser en serie av autoradiogrammer av probede DNA-prøver fra en stor søskenflokk. Fig. 13 er et autoradiogram som viser forskjellige DNA-båndmønstre oppnådd for tvillinger under anvendelse av to forskjellige prober. Fig. 14 er et autoradiogram som sammenligner båndmønstre produsert ved anvendelse av enkeltstrengede og dobbeltstrengede prober. Fig. 15 og 15A er autoradiogrammer som viser DNA-fingeravtrykk oppnådd fra forensiske prøver. Fig. 16 er et autoradiogram som viser DNA-fingeravtrykk oppnådd fra en hundefamilie. Fig. 17 er et autoradiogram som viser DNA-fingeravtrykk fra en korthåret huskatt-familie. Fig. 18 er et autoradiogram som viser DNA-fingeravtrykk oppnådd fra forskjellige sauer under anvendelse av to forskjellige prober. Fig. 19 er et autoradiogram som viser DNA-fingeravtrykk fra

tre forskjellige griser.

Fig. 20 er et autoradiogram som viser DNA-fingeravtrykk

for en ku-familie og ytterligere kveg; og

Fig. 21 er et autoradiogram i likhet med fig. 20 som benytter en annen slags probe.

Beskrivelse av de foretrukne utførelsesformer

Et human-genomisk bibliotek av 10-20 kb Sau3A partiell av human-DNA klonet i fag ÅL47,1 ble klassifisert ved hybridisering med den 33 bp lange myoglobin-gjentagelses-probe "pAV33,7".

Minst 40 sterkt-til-svakt hybridiserende plater ble identifisert

i et bibliotek av 3x10 5 rekombinater. En vilkårlig utvelgelse av åtte av disse positive plater ble renset (Å33,l-15), og Southern blot-analyse av fag DNA ble anvendt for å vise at i

hver rekombinant ble den hybridiserende DNA lokalisert innen en unik kort (0,2-2 kb) region av rekombinanten. Sekvensanalyse viste at denne region i hver av de åtte rekombinanter inneholder en minisatelitt sammensatt av 3-29 tandem-kopier av en gjentagelses-sekvens hvis lengde varierte fra 16 bp i X33,15 til 64 i X33,4. De fleste minisatelitter inneholdt et integrerende

antall gjentagelser. I A33,6 besto den 37 bp lange gjentagelse på sin side av en divergert trimer av en grunnleggende 12 bp enhet. Hver X33 rekombinant representerte en annerledes region av human-genomet, bedømt av den klone-spesifikke DNA-sekvens som flankerer hver minisatelitt.

De åtte klonede minisatelitt-regioner ble lokalisert innen 0,5-2,2 kb Hinfl DNA-fragmenter, mindre enn de polymorfe 2-6 kb DNA-fragmenter som kan påvises av pAV33,7 i HinfI-digester av human-DNA. For å bestemme om noen av de klonede minisatelitt-regioner også var polymorfe, ble 32p-merkede enkeltstrengede DNA-prober fremstilt ut fra egnede M13-subkloner av hver minisatelitt og hybridisert ved høy stringens til et panel av 14 ubeslektede britiske hvite personers DNAs oppløst med Hinfl. Typiske hybridiseringsmønstre viser at under disse hybridiserings-mønster påviser hver probe en unik region av human-genomet og at tre av disse regioner er sterkt polymorfe.

Nærmere detaljer av ovennevnte metode er gitt i eksemplene.

Det refereres nå til definisjonene av polynukleotidene som er angitt ovenfor, og definisjonene samsvarer med følgende generelle formel:

hvor C representerer en kjernesekvens og de andre symboler er som definert ovenfor. I alle definisjoner kan kjernesekvensen i en enhet være de samme eller forskjellige fra de andre.

F.eks. kan den inneholde et ekstra nukleotid eller to, mangle

et nukleotid eller to eller avvike i (f.eks.) 1 til 4 nukleotider, sammenlignet med en consensus-sekvens anvendelig på de gjentagende enheter som et hele.

Kjernen kan defineres på forskjellige måter. En generell definisjon kan oppnås ved referanse til den metode ved hvilken kjernesekvenser kan identifiseres. En minisatelitt-region av genomisk DNA sammenlignet med en sekvens som f.eks.

En x-nukleotid lang sekvens tatt fra minisatelitten som viser den største homologi med et x-nukleotid valgt blant alle mulige x-nukleotid-sekvenser omfattet i formel (2) regnes for å være kjernesekvensen. Dette er naturligvis en svært trang vei å definere kjernen på, og bør resultere i en eller noen få kjerner med lengde 6 nukleotider, 1 eller noen få 7 nukleotider land osv. opp til 16 nukleotider lang ("noen få" fordi i noen tilfeller vil det være mer enn én sekvens av størst, f.eks. 100%, homologi). For å reflektere den oppdagede mulighet av variasjon i kjernesekvensen som er definert således, postuleres det at det kan være variasjon i en utstrekning at alle n gjentagende enheter i gjennomsnitt har minst 70% homologi i sine kjerner ved kjerner som definert ovenfor. Eventuelle flankerende sekvenser, J og K, innen den gjentagende enhet, inkluderes ikke i oppreg-ningen for homologiformål, idet sammenligningen bare er mellom kjerner. De definerte kjerner kan ha varierende lengder og kan være "blandet", dvs. i noen gjentagelses-enheter være homologe med (f.eks.) GGGCAGGAXG av formel (2) og i andre være homologe med (f.eks.) GGGCAGGTGG av formel (3). Varianter bør derfor anses på bakgrunn av homologier med (kjerne) nsnarere enn nød-vendigvis med "kjernen" selv.

Den "første" definisjon som er definert tidligere stammer fra de ovenstående betraktninger, men er forenklet ved det at kjernen er definert som en sekvens av hvilken som helst lengde fra 6 og opp til maksimum på 12-16, alt etter tilfellet, i formlene (2) til (5) som er vist. Det er en lignende forutset-ning for varianter.

Den "annen" definisjon definerer kjernen på bakgrunn av suksessive hybridiseringstrinn, hvorav hvert kan produsere ytterligere minisatelitt-fragmenter. Man vil lett se at ved å utføre et tilstrekkelig antall hybridiseringer på utstrakte biblioteker av human-genomisk DNA, undersøkelse av et tilstrekkelig antall hybridiserte fragmenter, lage prober av dem, igjen probe den genomiske DNA osv., teoretisk opp til et uendelig antall ganger, bør det være mulig å komme til et område av consensuskjerne-sekvenser som er vidt representert i minisatelitt-DNAs. I praksis forventes det ikke at disse operasjoner ville måtte gjøres et svært stort antall ganger og i en enorm målestokk for at man skulle komme fram til en tilstrekkelig vid consensuskjerne-region, og derfor er (vilkårlig) bare 3 probe-operasjoner inkludert i definisjonen.

I den "tredje" definisjon representerer W kjernen og ser

på muligheten av en i stor grad felles consensuskjerne-region med variasjoner på seg som ikke avviker med mer enn 25% (f.eks. 4 nukleotider av 16). Etter således å ha definert en kjerneregion av opp til tilnærmet 16 nukleotider med eventuell variasjon opp til 25% defineres kjernen W som en sekvens av minst 6 fortløpende nukleotider fra innen nevnte region.

Den "fjerde" definisjon involverer en redefinert consensuskjerne-formel (6) oppnådd fra studier som involverer syntetiske polynukleotider.

Disse studier har ført til ytterligere definisjoner av kortere kjernesekvenser.

Fortrinnsvis er den fortløpende (5' 3')-sekvens:

derfor bevart i alle.gjentagende enheter, idet P og W har de betydninger som er gitt i den fjerde definisjon ovenfor. P er fortrinnsvis T; W er fortrinnsvis A.

Fortrinnsvis er også den fortløpende (5' 3')-sekvens:

bevart i alle gjentagende enheter. I henhold til et annet aspekt tilveiebringes polynukleotider som har minst tre gjentagelser inklusive den fortløpende 5' -> 3'-kjernesekvens

hvor P = ikke G, W = A eller T og X = A eller G

eller en variant derav, forutsatt at de totale aktuelle kjernesekvenser i alle gjentagelser har minst 70% homologi med de totale "ekte" kjernesekvenser som er definert med hensyn til formel (7) i samme antall gjentagelser,

og polynukleotider av komplementær sekvens til ovennevnte.

I alle definisjoner ovenfor er kjernen minst 5 nukleotider lang, mer å foretrekke minst 7 eller 8 og helst 12 eller flere, f.eks. 14 til 16. Sekvensen GGGCAGGAXG av formel (2) (de siste 10 nukleotider ved 3'-enden) er en sekvens av høy consensus og viser seg spesielt lovende. Fortrinnsvis omfatter kjernen minst 6 og mer å foretrekke alle 10 nukleotider av denne sekvens.

Variant-kjernene har fortrinnsvis minst 75% og mer å foretrekke minst 80 eller 85% homologi.

De flankerende sekvenser J og K innen hver gjentagende enhet er fortrinnsvis utelatt eller holdt korte, f.eks. til 0,

1 eller 2 nukleotider på hver side, og fortrinnsvis bør J og K

sammen ikke overstige 20, mer å foretrekke 15. Det totale antall nukleotider i summen J + kjerne + K, innen en gjentagende enhet bør fortrinnsvis ikke overstige 36, mer å foretrekke 31 og helst 25.

Antall av gjentagelsesenheter n er fortrinnsvis minst 10, bekvemt 10-40, men i prinsippet kan n være hvilket som helst tall, endog opp til 10.000.

De flankerende sekvenser H og L er irrelevante. De kan utelates eller kan være tilstede i hvilket som helst antall nukleotider, f.eks. opp til 20.000, skjønt å arbeide med en så lang probe ville ordinært ikke være fornuftig. De kan inneholde ds-DNA selv når gjentagelses-sekvensene er av ss-DNA.

Metoden med identifisering kan gjøre bruk av hvilke som helst kjente teknikker angående probing, idet den mest vanlige av disse består i å spalte DNA-prøven med restriksjonsenzymet eller -enzymer (ett eller flere alt etter hva som passer) som ikke spalter tandengjentagelses-sekvensene eller spalter bare i irrelevant utstrekning som ikke interfererer med deres egne til

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. Temperaturene er angitt i°C.

Eksempel 1

(1) Konstruksjon av en probe inneholdende lange tandem-gjentagelsessekvenser, fra human- myoglobin- genet

Konstruksjonen av denne probe er illustrert skjematisk i fig. 1 i tegningene som viser fem trinn, merket (a) til (e). Utgangs-myoglobingenet (a) er beskrevet av P. Weller et al., EMBO J., 3, 439-446 (1984). Som vist der, har genet en region som er beliggende i første intron, omfattende fire gjentagelser av en 33 bp sekvens flankert av nesten identiske 9 bp sekvenser (r i fig. 1). Denne region ble isolert i et 169 bp Hinfl fragment (b), som ble ende-reparert og forsterket ved kloning inn i Smal-punktet i plasmid pUC13, se J. Vieira et al., gen 19, 259-268 (1982). En monomer ble isolert (c) ved spalting av de tredje og fjerde gjentagelser med restriksjons-endonuklease AvaII (A). (En enkeltbasesubstitusjon i gjentagelser 1 og 2 eliminerer dette punkt og skaper i stedet et Ddel (D)-punkt). Ligering av 33 bp-monomeren via de ikke-identiske AvaII sticky ends produsert av en hode-ti1-hale-polymer (d), med ukjent antall (n) gjentagende enheter. Polymerer som inneholder minst 10 gjentagelser ble isolert ved preparativ agarosegel-elektroforese, ende-reparert, ligert inn i Smal-punktet til pUC13 og klonet i E.coli JM83, se J. Vieira et al., ovenfor. Strukturen til den polymere DNA-innsats i det resulterende plasmid, betegnet pAV33.7, (e), ble bekreftet ved utskjæring av innsatsen ved polylinkeren med BamHI pluss EcoRI, inn-fyllingsmerking med a- 32P-dCTP ved BamHI-punktet og delvis digerering med AvalI. Merkede partielle digereringsprodukter ble oppløst ved elektroforese på en 2% agarosegel. pAV33.7

ble funnet å inneholde 23 gjentagelser av 33 bp-monomeren som var inneholdt i et 767 bp BamHI- EcoRI-fragment som vist (e).

(2) Sekvensering av et utvalg av minisatellitt-regioner fra humangenomet ved myoglobin 33 bp- gjentagelsesproben

Et bibliotek av 10-20 kb human-DNA-fragmenter klonet i bakteriofag XL47,1, se P. Weller et al., ovenfor og W.A.M. Loenen et al., Gene 20, 249-259 (1980), ble klassifisert ved hybridisering med en 767 bp pAV33.7 innsats som er beskrevet i trinn (1) ovenfor,<32>p-merket in vitro ved fremgangsmåten til P. Weller et al., se ovenfor. Et utvalg av åtte positive plaque ble renset for å gi rekombi nanter betegnet >.33,1-15. Hver slik fag-DNA ble digerert enkeltvis med Hinfl eller Haelll, elektroforesert gjennom en 1,5% agarose-gel, og 33-gjentagelse-relaterte sekvenser deri ble lokalisert ved Southern blot-hybridisering med pAV33, 7 DNA. Hver rekombinant ga et enkelt "X33-positivt" Hinfl- og HaeIII-fragment, med unntagelse av for X33. 4 og 11 som ikke ga noen påvisbare posi tive Hae111-fragmenter (på grunn av et Haelll-spaltningspunkt som var til stede i gjentagelsesregionene i disse rekombinanter). De X33-positive Hinfl- og HaelII-fragmenter ble isolert ved preparativ gel-elektroforese, ende-reparert om nødvendig, og butt-ende-ligert inn i Smal-punktet til den dobbeltstrengede DNA ml3mp8, J. Messing et al., Gene 19^,269-276 (1982). Positive ssMl3-rekombinanter ble isolert etter transformering inn i E.coli JM101 og sekvensert ved dideoksynukleotid-kjede-avslutningsmetoden. Alle X3 3-positive fragmenter inneholdt en tandem-repetitiv region,

som i noen tilfeller kunne sekvenseres direkte. I andre tilfeller hvor gjentagelsesregionen var for langt fra sekvenseringsprimer-punktet, ble M13-innsatsene avkortet ved spaltning med restriksjons-endonukleaser og resekvensert.

Strukturen til de X33-positive fragmenter er vist nedenunder i. form av 8 kart betegnet X33.1; 33.3; 33.4; 33.5; 33,6; 33t10; 33.11 og 33,15. Det aktuelle restriksjonsenzym som var anvendt, og lengder av fragmenter i nukleotider var X33.1: Haelll, 2000; 33.3: Hinfl, 465; 33.4: Hinfl, 2000; 33.5: Hinfl, 1600; 33.6: Haelll, 720; 33.10: Haelll, 720; 33,11: Hinfl,

1020; X33.15: Hinfl, 1220. Hvert kart viser gjentatt sekvens av baser i øvre skript-tilfelle over en rektangulær ramme. "Gjentagelsene" er ikke invariabelt fullstendige hva angår antall baser, og noen avviker ved substitusjon av baser. Derfor er den gjentatte sekvens som er vist over rammen en konsensus-sekvens (con), som er den med hvilken det meste av sekvenseringen som er gjort, står i overensstemmelse. Rammen viser hvordan gjentagelsene avviker fra konsensus. Åpne rom i rammen betegner funnet overensstemmelse. Basesymbolene A, C, G, T i rammen betegner substitusjon av den base istedenfor den som er vist

over den i konsensus-sekvensen. X = A eller G. Y = C eller T.

- = et manglende nukleotid sammenlignet med konsensus.

>>><<><< (sildeben)-symboler indikerer at sekvenseringen ikke er gjort ennå, selv om det er tydelig ut fra autoradiogrammene av sekvenseringsgelene at sekvensen er en "gjentagelse" av konsensus (anvendelse av betegnelsen "gjentagelse" er naturligvis på samme tilnærmede måte som ovenfor). Fragmenter X33.3;

33.5; 33.10; 33.11 og 33.15 er blitt fullstendig sekvensert,

de andre delvis sekvensert. Tallene under "con" på venstre side av rammene er gjentagelsesnummerne for sekvensene. Det nederste nummer i denne kolonne indikerer antall gjentagelser. Således inneholder X33.1 26 gjentagelser av en 62 nukleotiders (nt) sekvens som er vist i øvre skript-tilfelle over rammen.

Den sekvens som er vist i nedre skript-tilfelle ved toppen og bunnen av hvert kart er flankerende sekvens som ligger respektive mot 5'- og 3'-sidene av gjentagelsessekvensblokken, og disse flankerende sekvenser er ikke gjentatt. Med andre ord er strukturen analog med den for random-kopolymer representert av de flankerende sekvenser, i hvilke enheter av blokk-kopolymer, representert ved tandem-gjentagelsene, fremstår.

(3) Oppdagelse og identifikasjon av en felles, kort "kjerne"-sekvens beliggende i og delt med gjentagelsessekvensen fra hvert X33- positivt fragment

Gjentagelsessekvensen for hver region ble sammenlignet med myoglobin 33 bp-gjentagelsessekvensen i pAV33.7, og med sin reverse komplement, ved anvendelse av prikk-matriseanalyse. Svært bemerkelsesverdig ble det funnet en enkelt, liten, utvetydig region av sekvens-likhet mellom myoglobin 3 3 bp-gjentagelsessekvensen og konsensus-gjentagelsessekvensene i de X33-positive fragmenter. Den samme region ble delt med gjentagelsene av alle åtte X33-fragmenter og vil bli kalt den "felles kjerne". Oversikten nedenunder viser sammenligningen.

I oversikten er det hele av hver konsensus-sekvens som bestemt i trinn (2) ovenfor, vist. Disse er de deler som på tandem-måte repeterer i myoglobi.n-3 3 bp-proben og i de X 3 3-positive fragmenter isolert fra human-genomisk DNA. Oversikten viser felles kjerneregion som 16 nukleotider lang i øvre skript-tilfelle.

Denne sekvens er en trimer, slik at de flankerende regioner bidrar til kjernen.

Atter, X = A eller G, Y = C eller T, - = et manglende nukleotid. Man vil se at det er et vesentlig mål for overensstemmelse for disse 16 nukleotider, hvorav 8 viser 100% overensstemmelse og en niende "X" overensstemmer i den utstrekning at det er enten A eller G. Disse 9 nukleotider er understreket i nederste linje, hvilket viser nukleotidene i den felles kjerneregion. Restene av tandem-gjentagelsessekvensene, vist i nedre skript-tilfelle, flankerer den felles kjerneregion. Begynnelsen/endepunktet for hver gjentagelses-konsensus er identifisert ved symboletT ; når det gjelder X33.4 og A33.15, så er det et ikke-integrerende antall gjentagelser, og den separate gjentagelse begynner, og sluttpunkter er derfor vist ved de forskjellige symboler V. Man vil innse at den felles kjerneregion var identifiserbar bare ved sofistikert analyse, siden den ofte ikke faller helt innen en enkelt konsensussekvens av de A33-positive fragmenter og skyter seg inn mellom to suksessive sekvenser av myoglobin-gen 33 bp-gjentagelsen.

For å illustrere utstrekningen av overensstemmelse med

de polynukleotider som er definert å være i henhold til oppfinnelsen, er de diverse determinanter gitt i tabell 1 nedenunder.

(4) Oppdagelse av at polymorfe human-genomiske DNA-fragmenter kan påvises ved hybridisering med prober av individuelle X3 3- positive fragmenter

Under henvisning til fig. 2 ble DNA fremstilt av hvite blodlegemer tatt fra en vilkårlig prøve av britiske hvite personer (1-6) og fra utvalgte medlemmer av en stor briti.sk/- asiatisk avstamning (7-18). Avstamningen vises konvensjonelt med kvadrat som betegner en mannlig person, sirkelen en kvinne-lig person og ekteskap ved en linje mellom dem. To blods-beslektede ekteskap, mellom søskenbarn, er betegnet ved en dobbelt linje mellom partnerne. 10 yg prøver av DNA ble digerert med Hinfl, elektroforesert gjennom en 20 cm lang 1% agarose-gel, denaturert in si tu og overført ved avklapping

32

til et Sartorius nitrocellulosefilter. Enkelt-strengede P-merkede hybridiseringsprober ble fremstilt av M13 rekombinanter inneholdende mini satellitt (tandemvis gjentagelse)-regioner.

De presise prober som ble anvendt er beskrevet senere. Fremgangsmåten var som følger: Tilnærmet 0,4 yg M13 enkelt-strenget DNA ble koblet med 4 ng 17-mer sekvenseringsprimer,

[M.L. Duckworth et al., Nucleic Acids Res. 9, 1691-1706 (1981)],

i 10 yl 10 mM MgCl2, 10 mM tris-HCl (pH 8,0) ved 60° i 30 min. Primer-forlengelse ble utført ved å tilsette 16 yl 80 yM dATP,

80 yM dGTP, 80 yM dTTP, 10 mM tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA pluss 3 yl (30 yCi)a-<32>P-dCTP (3000 Ci mmol<-1>) og 1 yl av 5 enheter yl ^ Klenow-fragment (Boehringer) og inkubere ved 37°

i 15 min. Forlengelse ble fullført ved å tilsette 2,5 yl 0,5 mM dCTP og forfølge ved 37° i ytterligere 15 min. ("Forfølgelse" betyr å tilsette en dNTP blanding for å fullføre sirkelen av ds-DNA på skabelonen av M13 ss DNA). DNA ble spaltet ved et passende restriksjons-endonukleasepunkt enten i innsatsen eller i M13-polylinkeren som var lengst bort fra innsatsen, denaturert ved tilsetning av 1/10 vol. 1,5 M NaOH, 0,1 M EDTA, og det 32

P-merkede enkelt-strengede DNA-fragment som strakk seg fra primeren ble gjenvunnet ved elektroforese gjennom en 1,5% agarose-gel med lavt smeltepunkt (Sea Plaque). Det utskårne bånd (spesifikk aktivitet > IO<9>cpm/yg DNA) ble smeltet ved 100°C i nærvær av 1 mg alkali-skåret bærer-human-placental-DNA (skjærkraftbehandlet i 0,3M NaOH, 20 mM EDTA ved 100° i 5 min.

og så nøytralisert med HC1) og tilsatt direkte til hybridiserings-

kammeret. Bærer-DNA tjente også til å undertrykke eventuell påfølgende hybridisering til repetitive DNA-sekvenser.

De presise hybridiseringsprober som ble anvendt var:

(A) 33.1, et tilnærmet 2000 nt subklonet Haelll-fragment inneholdende minisatellitten (26 gjentagelser av en 62 nt sekvens = 1612 nt) pluss tilnærmet 350 nt flankerende human-DNA; (B) 33.4, et 695 nt ikke-minisatellitt EcoRI-fragment på den primer-proksimale side av minisatellitten inneholdt i et

2015 nt Hinfl-fragment; og (C, D, E) 33.15, et 592 nt subklonet fragment inneholdende A33. 15-minisatellitt-sekvensen (29) gjentagelser av en 16 nt sekvens, som er i gjennomsnitt to nukleotider forskjellig fra den felles kjerneregion som er vist ovenfor) pluss 128 nt flankerende human-DNA.

Hybridiseringen ble utført som beskrevet av A.J. Jeffreys et al., Cell TL, 55-564 (1980), med unntagelse av at dekstransulfat ble erstattet av 6 vekt/vol.% polyetylenglykol 6000 for å redusere bakgrunnsmerking. Filtere A og B ble hybridisert natten over i 0,5xSSC ved 65° og vasket i 0,2xSSC ved 65°. FiltereC-E ble hybridisert og vasket i lxSSC ved 65°. Filtere ble autoradiografert i 1-3 dager ved -80°C under anvendelse av en hurtig-wolfram-intensifiserende skjerm.

Som vist i fig. 2, påviste den gjentatte kjerneprobe A33.15, en ekstremt kompleks profil av hybridiserende fragmenter i human-DNA digerert med Hinfl. Bare de største (4-20 knt) Hinfl-fragmenter kunne oppløses fullstendig, og disse viste ekstrem polymorfisme i den grad at hybridiseringsprofilen tilveiebringer et i.ndividuelt-spesif ikt DNA-"f ingeravtrykk" .

Avstamningsanalysen bekreftet den ekstreme polymorfe variasjon, som er så stor at alle individer, selv innen et enkelt slektskapsforhold med et søskenbarnekteskap (16-18 i fig. 2), kan skjelnes. Familiene i (fig. 2(D, E) viser at de fleste av de store Hinfl-fragmenter ble transmittert fra hver av foreldrene til bare noen av avkommet, hvilket fastslo at de fleste av disse fragmenter er til stede i den heterozygose tilstand og at heterozygositeten for disse store, hypervariable fragmenter må nærme seg 100%. Motsatt kan alle fragmenter i avkom spores tilbake til den ene eller annen av foreldrene

(med bare én unntagelse) og derfor utgjøre et sett med stabilt nedarvede genetiske markører. Intet bånd blir spesifikt

transmittert fra far til sønn eller far til datter, se filter D, fig.2. Dette sjalter ut Y- og X-binding respektive og innebærer at disse minisatellittfragmenter hovedsakelig er autosomale i sin opprinnelse. Selv om det ikke ennå er kjent hvorfra disse DNA-fragmenter har sin opprinnelse i settet av autosomer, så er de ikke avledet fra en enkelt lokalisert region av ett autosom. I stedet kan par av foreldre-fragmenter bli identifisert som segregerer uavhengig i avkommet, se filter D, fig. 2. For å være presis kan et par av bånd AB i én av foreldrene (og fraværende fra den annen) ikke være alleliske hvis det er minst ett AB eller — avkom; nærværet av A- eller -B-rekombinant avkom fastslår videre mangel på tett tilknytning mellom A og B. Omhyggelig undersøkelse av det opprinnelige autoradiogram av den familie som er vist i fig. 2D avslører ved disse kriterier minst 10 oppløsbare bånd hos moren, hvorav 8 er gjensidig ikke-alleliske og ikke nært forbundet.

To andre bånd kan hvert være en allele av ett av de 8 uforbundne fragmenter, ved det at bare A- og -B-avkom er observert i det begrensede antall avkom som er analysert, selv om en så liten prøve er utilstrekkelig til å bevise at slike par av fragmenter er alleler av et enkelt locus. Konklusjonen er at kjerneproben har evne til å gi nyttig informasjon samtidig på minst flere adskilte uforbundne hypervariable loci. Denne konklusjon blir undersøkt i. flere detaljer i. eks. 8.

I motsetning til dette ga de to andre prober (filtere

A og B, fig. 2), som ikke er i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, bare ett eller to bånd og var tydelig ute av stand til å påvise mange forskjellige polymorfe regioner samtidig og derfor å være av generell diagnostisk bruk.

Eksempel 2

Anvendelse av ytterligere, varierende (kjerne) i prober for å påvise nye sett av hypervariable regioner i human- DNA

To ytterligere prober, avledet fra klonede A33-positive fragmenter, A33.. 5 og A33..6, ble fremstilt analogt med eks. 1, trinn (4). Proben 33.5 besto av et 308 nt DNA-fragment klonet i. M13mp8 og omfattet 14 gjentagelser av den konsensus-sekvens som er vist ovenfor, som i sin effekt er en 17 nt lang variant av den felles kjernesekvens, sammen med 70 nt flankerende human-DNA. Proben 33.6 inkluderte 18 gjentagelser av en 37 nt sekvens som på sin side omfatter 3 gjentagelser av en tilnærmet 12 nt avkortet sekvens avledet fra den felles kjerneregion pluss ytterligere TC ved dens 5'-ende. De 18 x 37 nt gjentagelsesblokker var flankert av 95 nt human-DNA. Strukturen til 37 nt-sekvensen kan representeres på følgende måte:

Denne probe var likeledes klonet i M13mp8.

Lengre ut i denne beskrivelse gis en lint konsensus-sekvens AGGGCTGGAGG for denne probe.

32

Begge prober ble merket med P og hybridisert analogt

med eks. 1, trinn (4) til human-DNA fra et panel bestående av

14 ubeslektede hvite personer. Begge prober påviste et komplekst sett av hybridiseringsfragmenter, hvorav mange viste ekstrem polymorf variasjon. Flere av fragmentene påvist ved 33.5 var nye og var ikke tidligere påvist ved 33.15-kjerneproben. 33.6-proben påviste et nesten fullstendig nytt sett av mi.ni-satellitter, og den korrekte nedarving av disse er blitt veri-fisert ved avstamningsanalyse (se eks. 8).

De følgende eksempler illustrerer og eksemplifiserer oppfinnelsen ytterligere.

Digereringen av DNA-prøven utføres fortrinnsvis med en restriksjons-endonuklease som gjenkjenner 4 basepar av nukleotider. Det er funnet at DNA-fingeravtrykkmønsteret for de lengste hypervariable fragmenter i stor grad er uavhengig av den 4 bp lange gjenkjennelses-restriksjons-endonuklease som er anvendt. Dette antyder sterkt at disse store fragmenter ikke er avledet fra lengre minisatelitter, men at hvert inneholder en komplett lang, homogen minisatelitt, blottet for restriksjons-endonuklease-spalningspunkter og flankert av human-DNA som inneholder den normale høye densitet av 4 bp spaltningspunkter. Dette er i samsvar med resultater som er presentert i de tidligere eksempler og eksempel 8 som viser at det meste av disse store minisatelittfragmenter er utilknyttet og segregerer uavhengig i avstamning.

I en foretrukken utførelsesform blir en prøve av DNA "dobbelt fingeravtrykket" ved anvendelse av to forskjellige prober, i separate hybridiseringer som produserer to forskjellige fingeravtrykk, f.eks. prober fra fragmenter A33,15 og 33.6.

På denne måte vil den allerede lave sannsynlighet for at to ubeslektede individer vil ha det samme fingeravtrykk bli ytterligere redusert. For eksempel indikerer eks. 4 en sannsynlighet så lav som 10 -19 selv hvis, slik det foretrekkes, ufullstendig oppløste hybridiserende DNA-fragmenter med lengde mindre enn 4 kb ignoreres.

Oppfinnelsen inkluderer en fremgangsmåte for farskapstesting. Tilnærmet halvparten av de polymorfe minisatellitt-fragmenter i et avkom avledes fra faren, og disse fars-fragmenter kan identifiseres ved sammenligning med morens og avkommets DNA-fingeravtrykk. Alle di sse fars-fragmenter vi l ordinært

være til stede i farens DNA. Det anslås at ved anvendelse av en probe 33.15 og DNA-fragmenter med lengde minst 4 kb vil sannsynligheten for at den putative far tilfeldigvis er i besittelse av alle 6-far-spesifikke DNA-fragmenter som typisk er identifisert i avkommet, er av størrelsesorden 10 ^ og at anvendelse av begge prober 33.6 og 33.15 reduserer den til størrelsesorden 10 . Naturligvis vil de nøyaktige sannsynligheter være avhengig av den nøyaktige oppløsning og kompleksitet ved de oppnådde DNA-mønstre og vil bli forbedret hvis ytterligere fars-fragmenter mindre enn 4 kb lange analyseres eller hvis en tredje probe anvendes.

Tilstrekkelig DNA (0,5-5 yg) kan isoleres hurtig fra en enkelt dråpe av menneskeblod for bestemmelse av DNA-fingeravtrykk. Således er DNA-fingeravtrykk blitt produsert fra et randomisert panel av individer inklusive to mennesker hvis DNA på forhånd var blitt fingeravtrykk-bestemt, pluss to søstre.

De to tidligere karakteriserte individer kunne lett og utvetydig identifiseres på basis av DNA-fingeravtrykk-sammenligninger,

og det kunne også de to søstre som hadde et vesentlig antall minisatellittfragmenter felles.

DNA kan tas fra et utvalg av celler fra et gitt individ, som alle gir det samme fingeravtrykk. Således kan DNA-fingeravtrykkene for sæd- og blod-DNA skjelnes, i likhet med mønstrene for monozygote tvillinger. Videre synes mønstrene å være stabilt opprettholdt i dyrkede celler, som vist ved å sammenligne DNA-fingeravtrykkene fra blod-DNA med DNA isolert fra Epstein-Barr-virus transformerte lymfoblastoid-cellelinjer

som stammer fra samme individ.

Ikke-human-dyr som oppfinnelsen er anvendelig på, inkluderer de fleste pattedyr, fugler, amfibier og fisk. Eksempler er høns, hamstere, kaniner, mus, spurver, tårnfalker, frosker, salamandere og fisk. Når det gjelder høns, ble en svært kompleks, tilsmørt porsjon av hybridiserende DNA-fragmenter produsert. Digerering med Haelll eliminerte til-smøringen og avslørte et "rent" fingeravtrykk. Det er derfor sannsynlig at hønse-DNA også inneholder en lang kjerne-holdig satellitt hvis gjentagelsesenheter inneholder et eller flere Haelll-spaltningspunkter; spaltning med Haelll reduserer derfor denne satellitt til svært små DNA-f ragmenter som migrerer vekk fra bunnen av gelen under DNA-elektroforese. Det er leilighets-vis sannsynlig at andre dyr vil produsere tilsmørte bånd og at disse vil være oppløsbare hvis DNA digereres med passende enzymer som spalter de lengre fragmenter.

I de følgende ytterligere eksempler er temperaturene

i °C.

Eksempel 3

DNA ble isolert fra frisk human-placenta, som beskrevet av A.J. Jeffreys, Cell 18, 1-10 (1979). Tre individuelle placentaer ble anvendt, merket 1-3. 8 yg prøver av DNA ble digerert med Hinfl og/eller Sau3A, i nærvær av 4 mM spermidintriklorid for å påskynde fullstendig digerering, gjenvunnet etter fenolekstraksjon ved etanolutfelling og elektroforesert gjennom en 20 cm lang 0,6%ig agarose-gel ved 30 V i ca. 24 timer, inntil alle DNA-fragmenter mindre enn 1,5 kb lange hadde elektroforesert fra gelen. DNA ble så overført ved avklapping til et Sartorius nitrocellulosefilter. Høy spesifikk aktivitet (større enn 10 9 cpm<32>P/yg DNA) enkelt-strenget Ml3 DNA.

Prober ble fremstilt som beskrevet i eks. 1, trinn (4).

De presise prober som ble anvendt var: (a) 33.5 probe bestående av et 2 20 nt Haelll DNA-fragment inneholdende det meste av A33.5 minisatellitt (17 nt x 14 gjentagelser) pluss ca. 60 nt flankerende human-DNA, subklonet inn i Smal-punktet i M13mp8; (b) 33.6 probe bestående av et 720 nt Haelll-fragment bestående av minisatellitten pluss ca. 50 nt flankerende human-DNA subklonet inn i Smal-punktet i M13mp8; og (c) den samme 33.15 probe som i eks. 1, trinn (4), idet denne var et 59 2 nt Pstl - AhalII-fragment inneholdende minisatellitten pluss 128 nt flankerende human-DNA subklonet inn i M13mpl9 DNA digerert med Pstl pluss Smal. Southern blot-hybridisering og vasking ble utført i lxSSC ved 65° som beskrevet tidligere for filtere C-E i eks. 1, (trinn 4). Filterne ble autoradiografert ved romtemperatur uten en intensifiseringsskjerm i 4 dager.

Hver probe produserte et annet slags fragmentmønster

hvis kompleksitet er stort sett uavhengig av den tetranukelotid-restriksjonsendonuklease som ble anvendt. Fig. 3 viser det oppnådde mønster.Oppløsning av polymorfe fragmenter mindre enn 4 kb lange forbedres i dobbelte digereringer med Hinfl pluss Sau3A, på grunn av eliminering av bakgrunns-hybridisering forårsaket sannsynligvis av relativt divergerte og invariante Hinfl-minisatellitt-fragmenter som har akkumulerte Sau3A-spaltningspunkter innen en eller flere gjentagelsesenheter.

I dobbelte digereringer kan antall oppløsbare polymorfe fragmenter påvist av probe 33.15 bli øket fra ca. 15 til ca. 23

pr. individ, på bekostning av å tape ca. 20% av lange, enkelte digereringsminisatellitt-fragmenter som antagelig inneholder et Sau3A-spaltningspunkt i de fleste eller alle gjentagelses-enheter .

Eksempel 4

8 yg prøver av menneskeblod-DNA tatt fra en vilkårlig prøve av 20 ubeslektede britiske hvite personer ble digerert med Hinfl og Southern blot-hybridisert med minisatellittproben 33.6 eller 33.15 som beskrevet i. eks. 3. Hvert DNA-f ingeravtrykk (individ A) ble sammenlignet med mønsteret i det nærliggende gel-spor (individ B), og det antall bånd i A som var klart fraværende fra B, pluss de som hadde en ko-migrerende motpart av grovt sett lik autoradiografisk intensitet i B,

ble avmerket. Resultatene, vist i nedenstående tabell, er gjennomsnitt for alle parvise sammenligninger. En liten andel (ca. 6%) av ytterligere svakt hybridiserende fragmenter i A ble

tilpasset ved sterkt hybridiserende fragmenter i B, og siden det i slike tilfeller ikke var mulig å bestemme om båndet i A også var til stede i B, ble slike fragmenter ignorert. Hvis ko-migrerende bånd i A og B alltid er identiske alleler av det samme minisatellitt-locus, så er middels-sannsynligheten X at en allele i A også er til stede i B, beslektet med den middels allele-frekvens (homozygositet) q ved x = 2q - q 2, hvorfra q = 1 - (1-X)^. I praksis vil en (ukjent) andel av ko-migrerende bånd i A og B tilfeldigvis være avledet fra forskjellige minisatellitt-loci, og derfor er antagelsene med hensyn til mi ddel-allele-frekvens og homozygositet maksimale og avhenger av den elektroforetiske oppløsning av minisatellitt-fragmenter.

De sannsynligheter som er vist i tabell 1 henspiller på de individuelle størrelsefragmenter av DNA som er vist. For å oppnå en total sannsynlighet som vedrører den mest leselige del av fingeravtrykket, d.v.s. all DNA over 4 kb i. størrelse, må

de tre tall kombineres. Således er den gjennomsnittlige sannsynlighet for at alle fragmenter påvist av probe 33.15 i individ A også til stede i B, lik 0,08<2>,<9>x 0,20<5>-<1>x 0,27<6>,<7>= 3 x 10 ^. Sannsynligheten for at alle fragmenter som er påvist av begge prober 33.15 og 33.6 i A også er til stede i

-19

B, er 5 x 10 .

Eksempel 5

Dette eksempel illustrerer den somatiske stabilitet hos DNA-fingeravtrykk og deres anvendelse i farskapstesting.

Lymfoblastoid-cellelinjer transformert av EB-virus og lagret i flytende nitrogen ble re-etablert i flytende kultur etter 2 år. Disse dyrkede lymfocytter ble vasket to ganger i normal saltløsning; DNA fra lymfocytt-pelleten og fra hvite blodlegemer ble fremstilt som beskrevet av A.J. Jeffreys, Cell 18, 1-10 (1979). Sperm-DNA ble fremstilt på samme måte, med unntagelse av at sperm oppsamlet fra sæd ble behandlet med IM 2-merkaptoetanol i 5 minutter ved romtemperatur, før lysering med SDS. DNA-fingeravtrykk ble fremstilt som beskrevet i eks.3, under anvendelse av 5 yg prøver av DNA digerert med Hinfl og hybridisert med probe 33.6 (a) eller 33.15 (b).

Eksempel 6

Dette eksempel illustrerer anvendelse av en probe i henhold til oppfinnelsen for å påvise sterkt polymorfe regioner i DNA av forskjellige hvirveldyr.

DNA-prøver ble fremstilt fra blod tatt fra høns, spurver og tårnfalker, fra kanin- og muse-lever, fra human-placenta og fra kadaver fra frosker og fisk som innvollene var tatt ut av. 8 yg prøver av DNA ble digerert med HinfI, med unntagelse av for hønse-DNA som ble digerert med Haelll. Restriksjonsdigereringene ble elektroforesert gjennom en 0,6%ig agarose-gel, denaturert, overført til et Sartorius nitrocellulosefilter og hybridisert som beskrevet tidligere med human-minisatellittproben 33.15. Hybridiseringsstringensen var ved 65° i lxSSC. Resultatene er vist i. fig. 5, med følgende prøver:

Som man kan se, ble vellykkede variable DNA-fingeravtrykk oppnådd fra nesten alle de testede hvirveldyr og er øyensynlig så informative som human-DNA-fingeravtrykkene.

Hønse-DNA spaltet med Hinfl produserte også en svært kompleks, skjønt mindre intens, tilsmøring av hybridiserende DNA (ikke vist). Imidlertid eliminerte digerering med Haelll denne tilsmøring og avslørte et rent, polymorft fingeravtrykk-mønster.

De to innavlede musestammer har enklere fingeravtrykk

enn musene som er fanget i. vill tilstand. Dette er å forvente, siden de fleste hypervariable minisatelli.tt-loci vil være heterozygose i vill tilstand, men homozygose ved innavl, og derved halvere antall hybridiserende DNA-fragmenter i innavlede stammer.

De følgende eksempler illustrerer videre anvendelsen av spesielle prober som er beskrevet ovenfor.

Eksempel 7

Dette beskriver anvendelse av DNA-fingeravtrykkanalyse

i et immigrasjonstilfelle, hvis løsning ville ha vært svært vanskelig, om ikke umulig, ved konvensjonelle genetiske metoder.

Tilfellet gjaldt en ghanesisk gutt født i Storbritannia, som emigrerte til Ghana for å bli gjenforenet med sin far og senere vendte tilbake alene til Storbritannia for å slutte seg til sin mor, bror og to søstre. Imidlertid var det belegg for å antyde at det hadde inntruffet en utbytting, enten med en ubeslektet gutt eller med en sønn av én av morens søstre som alle lever i. Ghana. Som resultat av dette ble gutten som vendte tilbake ikke gittzoppholdstillatelse i Storbritannia.

På anmodning av familiens advokat ble det foretatt en analyse for å bestemme hvem moren til gutten var. For å komplisere saken var hverken faren eller noen av morens søstre tilgjengelige for analyse. Videre, selv om moren var sikker på at gutten var hennes sønn, var hun ikke sikker på hvem som var hans far. DNA-fingeravtrykk fra blod-DNA-prøver tatt fra tilgjengelige medlemmer av familien (moren M, broren B,

søstrene Sl og S2 og gutten X som det var diskusjon om) ble derfor tillaget ved Southern blot-hybridisering til to minisatellittprober 33.6 og 33.15 som beskrevet ovenfor, hvorav hver påviser et forskjellig sett av hypervariable minisatellitter i human-DNA. 8 yg prøver av blod-DNA fra moren (M), gutten det er diskusjon om (X), hans bror (B), søstre (Sl, S2) og et ubeslektet individ (U) ble digerert med Hinfl, elektroforesert gjennom en 0,7%ig agarosegel og Southern blot-hybridisert til probene. Autoradiogrammene er vist i fig. 6. Fragmenter som er til stede i morens (M) DNA-fingeravtrykk er indikert ved en kort horisontal linje; fars-fragmenter som er fraværende fra M, men til stede i minst én av de udiskutable søsken (B, Sl, S2) er merket med en lang linje. "Mors"- og fars-fragmenter transmittert til X er vist ved en prikk. DNA-fingeravtrykkene av X inneholder ingen ytterligere oppløste fragmenter. Alle fragmenter ble avmerket fra de opprinnelige autoradiogrammer tatt ved varierende eksponeringer; delvis-oppløste svake bånd, spesielt mot bunnen av gelen, som ikke kunne avmerkes med<p>ålitelighet ble ignorert.

Det første trinn var å fastslå farskapet for X fra mønsterne av hypervariable fragmenter. Selv om faren var utilgjengelig, kunne mesteparten av DNA-fingeravtrykk rekonstru-eres fra fars-spesifikke DNA-fragmenter tilstedeværende i minst én av de tre udiskutable søsken (B, Sl, S2), men fraværende fra M. Av de 39 farsfragmenter som således ble identifisert, var tilnærmet halvparten til stede i DNA-fingeravtrykkene til X. Siden DNA-fragmenter skjelden deles mellom DNA-fingeravtrykkene fra ubeslektede individer (se individ U i fig. 6), antyder dette meget sterkt at X har samme far som B, Sl og S2. Etter substraksjon av disse fars-spesifikke DNA-fragmenter gjensto det 40 fragmenter i X, hvorav alle var til stede i M. Dette på sin side gir sterk indikasjon på at M er moren til X

og derfor at X, B, Sl og S2 er ekte søsken.

Det er ovenfor vist at den middels sannsynlighet for at

et fragment i DNA-fingeravtrykket til én person er til stede

i et annet individ vilkårlig valgt ut er tilnærmet 0,2 for nordeuropeere. Den tilsvarende vurdering for faren og M er 0,26, hvilket etablerer at DNA-fingeravtrykk-variabilitet hos disse ghanesere ikke er signifikant forskjellig fra det for nordeuropeere. I de følgende sannsynlighetsvurderinger gjøres den sterkt konservative antagelse at alle bånd deles med en ensartet sannsynlighet på 0,26 (kvantifisering følger).

Det første spørsmål er om X er beslektet med denne familie. DNA-fingeravtrykkene til X inneholder 61 avmerkbare fragmenter, hvorav alle er til stede i M og/eller faren.

Hvis X er ubeslektet, så er sannsynligheten for at hvert av hans bånd er til stede i disse foreldre, l-(l-0,26) = 0,45; sannsynligheten for at M og/eller faren tilfeldigvis har alle 61 av X's bånd, er derfor 0,45<61>= 7xl0~<22>. X er klart beslektet med denne familie.

Det neste problem er om en ubeslektet kvinne, og ikke M kunne være moren til X. DNA-fingeravtrykkene til X inneholder 40 "mors"-fragmenter, hvorav vi anslår at~25 var nedarvet spesifikt fra moren; gjenværende fragmenter deles mellom moren og faren og kan derfor ikke anvendes for å anføre bevis for at M er moren. Alle 25 mors-spesifikke fragmenter i X er til stede i M. Sannsynligheten for at M er ubeslektet med X, men tilfeldigvis deler alle 25 fragmenter , er derfor 0,26= 2x10. Derfor må X og M være beslektet.

Det siste og vanskeligste problem er om M's søster, som ikke var tilgjengelig for analyse, kunne være moren til X (faren ville naturligvis måtte være M's ektemann). Hvis bånd deles mellom vilkårlige mennesker med en middels sannsynlighet på 0,26, så er den tilsvarende chanse for at et fragment i ett individ også er til stede i en slektning, lik 0,62. Oddsene for at M er søsteren til X's virkelige mor og tilfeldigvis inneholder alle 25 av X's mors-spesifikke bånd er derfor

25 ~* 6

0,62 = 3x10 . Vi konkluderer derfor med at, utenfor all rimelig tvil, M må være den virkelige mor til X. Dette bevis ble tilveiebragt for immigrasjonsautoritetene, som lot saken mot X falle og ga ham oppholdstillatelse i Storbritannia og tillot ham å bli hos familien.

Denne vanskelige sak viser hvordan DNA-fingeravtrykk kan gi utvetydig positivt vitnesbyrd om slektskapsforhold, selv i noen tilfeller hvor kritiske familiemedlemmer er borte. Foreliggende tilfelle ble forenklet ved det faktum at X hadde samme far som sine søsken, og at denne far ikke transmitterte noen bånd utelukkende til X (i gjennomsnitt ville 1/16 av farsbånd bli transmittert således). Slike X-unike fragmenter ville, selv om de øyensynlig svekker beviset på slektskaps-forholdet mellom X og M, ikke nødvendigvis ugyldiggjøre analysen i praksis. X ville sannsynligvis ikke ha mer enn 5 slike fars-fragmenter, i tillegg til de 25 mors-spesifikke fragmenter. Oddsene for at minst 25 av 30 spesifiserte bånd som tilfeldigvis passer sammen mellom X og M hvis de er ubeslektet, eller hvis M er X's tante, er henholdsvis 8x10

-3

og 9x10 . Denne analyse er derfor robust og ville gi tydelig vitnesbyrd for eller mot påstått slektskap i de fleste slike tilfeller. Vanligvis vil naturligvis alle relevante medlemmer i en familie være tilgjengelige, i f.eks. farskapssaker eller hos familier som har vanskeligheter med hensyn til gjenforening ved immigrasjon; DNA-fingeravtrykk vil nesten alltid være i stand til å løse slike problemer.

Kvantifisering av DNA- fingeravtrykk

61 DNA-fragmenter ble avmerket i M, sammenlignet med 39 fragmenter nedarvet spesifikt fra faren. 1/8 av farens heterozygose DNA-fragmenter vil ikke bli transmittert til B,

Sl eller S2, og derfor er den korrigerte vurdering av antall fars-spesifikke fragmenter lik 39x8/7 = 45. Siden de totale antall av fragmenter i DNA-fingeravtrykkene av M og faren skulle være tilnærmet likt, så er antall fragmenter i M som deles med faren, lik~ (61-45) = 16. Den middels sannsynlighet for deling med hensyn til bånd (x) i M og faren er derfor 16/61 = 0,26, hvilket er i overensstemmelse med tidligere vurderinger avledet fra klassifisering av en vilkårlig prøve av nordeuropeere (x = 0,2, ref. 2).

Tilnærmet halvparten av de 45 farsbånd ble transmittert til B, Sl og S2 (18, 24 og 18 resp.) som forventet for heterozygose bånd. Av de 61 bånd i M var mer enn halvparten nedarvet av B, Sl og S2 (32, 38 og 39 resp., middel = 36,3), som forventet, siden noen av M's bånd vil deles med faren og derfor vil bli transmittert til de fleste eller alle av barna.

Hvis M's DNA-fingeravtrykk inneholder n av de samme bånd transmittert til alle av barna pluss (61-n) heterozygose bånd transmittert til halvparten av barna, så blir n + 0,5(61-n)

= 36,3, hvorfra n = 12, overensstemmende med vurderingen av 16 bånd felles for M og faren (se ovenfor).

DNA-fingeravtrykkene av X er sammensatt av 21 far-spesifikke fragmenter pluss 40 bånd som deles med M. Andelen av de sistnevnte bånd som er mor-spesifikke og ikke deles med faren kan vurderes på to måter. For det første bør antall mor-spesifikke bånd være grovt sett lik det antall som er spesifikt for faren, d.v.s. 45/2 = 22,5. For det annet vil (~12) av de 40 morsbånd i X være delte mors/fars-bånd (se ovenfor), hvilket etterlater 28 mor-spesifikke bånd i X. Det antall fragmenter som X har fått spesifikt fra sin mor er derfor~25.

Sannsynligheter for bånd- deling: Den middels sannsynlighet for at et fragment i ett individ tilpasses av et bånd av lignende elektroforetisk mobilitet og autoradiografisk intensitet i en annen vilkårlig person, er definert som x (x = 0,2-0,26,

se ovenfor). Større minisatellittfragmenter deles mindre hyppig, sannsynligvis på grunn av lavere allelefrekvenser og bedre elektroforetisk oppløsning, og derfor er fragment-delingssannsynligheten x heterogen. Siden nesten alle fragmenter nedarves uavhengig, er den maksimale sannsynlighet for at alle n fragmenter i et individ er til stede i et annet tilfeldig individ derfor x<n>; eventuell heterogenitet i x vil redusere denne sannsynlighet.

Bånd- deling mellom søsken: Hvis bånd som deles alltid representerer identiske alleler av det samme hypervariable locus, så

er x beslektet med middel-allelefrekvensen q ved x = 2q-q 2, hvorfra det kan sees at sannsynligheten for gitt bånd i et individ også er til stede i hans eller hennes bror eller søster er (4+5q-6q2+q3)/4 (2-q).

For x = 0,26, er q lik 0,14 og det forventede antall av bånd som er til stede i en første bror eller søster som deles ved en registrering, er 0,62. Denne sannsynlighet blir svakt redusert hvis det antas istedet at bånd som deles av vilkårlige mennesker aldri er identiske alleler, d.v.s. at mange minisatellitter har alleler av samme størrelse.

Anvendelse av DNA- fingeravtrykk på

analyse av genetisk sykdom

For å bestemme hvor gjørlig det er å anvende DNA-fingeravtrykk for koblingsanalyse hos mennesker, spesielt for under-søkelse angående hypervariable DNA-fragmenter som kosegregerer med sykdoms-loci i store slektskapsforhold, ble DNA-fingeravtrykkene til to store familier undersøkt, idet den ene segregerte for neurofibromatose og den annen for nedarvet persistens av føtalt hemoglobin tilsynelatende bestemt av et autosomal-dominant gen som ikke var koblet til 3~globin-gen-gruppen.

Eksempel 8

Segregering av hypervariable minisatellittfragmenter i DNA-fingeravtrykkene til en slektning affisert av neurofibromatose

Blod-DNA-prøver digerert med Hinfl ble elektroforesert

på en 35 cm lang 0,7%ig agarosegel og Southern blot-hybridisert til minisatellittprober 33.6 og 33.15. DNA-fingeravtrykk er vist i fig. 7 for den uangrepne far (F), 5 sønner (S) og 6 døtre (D); den angrepne mor var ikke tilgjengelig for studier. Avkom angrepet av multiple neurofibromata er angitt med (+); de andre av avkommet viste intet tegn på neurofibromatose. Oppløste fars-(#) og mors-(O) heterozygose DNA-fragmenter er antydet, og deres segregering inn i avkommet ble anmerket direkte fra opprinnelige autoradiogrammer tatt ved korte, middels og lange eksponeringer. Bare de DNA-fragmenter ble avmerket hvis posisjoner og relative intensiteter i hvert avkom passet med dem hos foreldrene. Koblede par AB

av DNA-fragmenter som segregerer AB eller — inn i avkommet er koblet ved en kontinuerlig linje; alleler som segregerer A- og -B er koblet ved prikkede linjer. Ett morsfragment som viser tegn på kobling til neurofibromatose er markert med en stjerne; alle seks angrepne av avkommet har arvet dette fragment, og fire av fem uangrepne barn har ikke dette bånd, hvilket gir en konkordans av 10/11 mellom arveligheten av dette bånd og neurofibromatose.

Materialer og metoder

DNA- isolasjon

Friskt blod ble fortynnet med samme volum av lxSSC

(SSC, saltløsning, natriumcitrat, 0,15 M NaCl, 15 mM trinatrium-citrat, pH 7,0),sjiktet på Histopaque-1077 (Sigma) og nukleerte celler oppsamlet ved sentrifugering. Alternativt ble frosset blod tinet i 2 vol lxSSC og nukleerte celler pluss kjerner pelletert ved sentrifugering ved 10.000 G i 15 min. Høymolekyl-vekt-DNA ble fremstilt som beskrevet i Jeffreys, A.J. (1979). Cell 18, 1-10.

Southern- blot- analyse

5 yg prøver av human-DNA ble digerert med 20 enheter av Hinfl i nærvær av 4 mM spermidintriklorid ved 37° i 2 timer,

og utvunnet ved fenolekstraksjon og etanolutfelling. Restriksjonsdigereringer ble oppløst i 16 yl H2O pluss 4 yl gel-belastningsmiks (12,5% ficoll 400, 0,2% bromfenolblått, 0,2 M tris-acetat, 0,1 M Na-acetat, 1 mM EDTA, pH 8,3) og 2 yl 5 mg/ml etidiumbromid, og belagt på en horisontal agarosegel (0,7% Sigma type I agarose i 40 mM tris-acetat, 20 mM Na-acetat, 0,2 mM EDTA, 0,5 yg/ml etidiumbromid (pH 8,3); geler 0,7 cm tykk, 20 cm eller 35 cm lang). Etter likevekts-dannelse i 10 min. ble geler elektroforesert ved V/cm i 24-48 timer, inntil alle DNA-fragmenter mindre enn 1,5 kb lengde hadde elektroforesert av gelen. DNA-ble overført ved avklapping på et nitrocellulosefilter (Sartorius, 0,45 ym porestørrelse).

32

P-merket enkelt-strenget probe-DNA ble fremstilt fra de human-minisatellitt-M13-rekombinanter 33.6 og 33.15, hybridisert til Southern blots i lxSSC ved 65° og autoradiografert som beskrevet i hovedsøknaden.

Data- analyse

Lagring av segregeringsdata og analyse av kobling ble utført på en BBC mikrocomputer modell B.

Tabell 2 gir en oppsummering av minisatellittmarkører i neurofibromatose-familien.

Antall forskjellige loci (c) avmerket er gitt ved n-a-b. Hele DNA-fingeravtrykket, inklusive uoppløste og derfor uavmerkede fragmenter, er avledet fra N-heterozygose loci (2N-fragmenter). Antatt at de (n-b)-distinkte fragmenter som er avmerket er en vilkårlig prøve av 2N båndene i et DNA-fingeravtrykk, så er det anslåtte totale antall hypervariable loci. N påvist ved en gitt probe relatert til antall alleliske par a ved

For å studere transmisjonsfrekvensen av hypervariable fragmenter (fig. 7) ble antall fragmenter som var påvist ved prober 33.6 og 33.15, av n avmerket, som ble transmittert til nøyaktig r barn i søskenflokken på 11, sammenlignet med det forventede antall som var gitt av den binominale fordeling<11>Cr.n under antagelse av 50% transmisjon (tabell 4). Fragmenter211 som var til stede i alle barna kan være fra homozygose loci, og disse ble ignorert. Morsfragmenter som ikke var transmittert til noen barn kunne ikke bli avmerket, da mor-DNA ikke var tilgjengelig. De midlere transmisjonsfrekvenser (+ S.E.M.) er også gitt. Kobling mellom par av fragmenter AB ble undersøkt ved avmerking av antall avkom som var korkordante for AB (enten AB eller —), under anvendelse av alle mulige parvise sammenligninger mellom fars- eller mors-fragmenter som har første utelukkede alleler og tilknyttede bånd (d.v.s. c loci ble analysert hos hver av foreldrene, se tabell 3, hvilket gir c ( c- 1) parvise sammenligninger). Par av fragmenter som faller inn 2i 0- eller 11-barnsklassene representerer alleler eller tett forbundne par, respektive; pr. definisjon faller ingen par inn i hver klasse. Den observerte fordeling sammenlignes med den som forventes hvis alle c loci er uforbundet (U), i hvilket tilfelle antallet av parvise sammenligninger som gir presist r (AB eller —) avkom er gitt ved den binominale fordeling Cr . c ( c- 1) . Fordelingen sammenlignes også med den som for-211 2 ventes hvis de c loci klasedannes og anbringes med jevn avstand, med nærliggende loci separert ved en rekombinasjonsfrekvens 6 (10, 20 eller 30 cM fra hverandre). Klasen vil derfor bli spredd over (c-l)tp kartenheter, hvor = -1/2 ln (1-2G) . For c loci (prøvetatt ved en eller annen allele tilfeldig), er antall parvise sammenligninger som gir nøyaktig r (AB og —) avkom i søskenflokken på 11 gitt ved : hvor er rekombinasjonsfraksjonen mellom to loci i kart-enheter fra hverandre; x^er gitt ved kartdannelsesfunksjonen

Resultater

DNA- fingeravtrykkprober

To minisatellitt-hybridiseringsprober anvendt i dette studium er fullstendig beskrevet i hovedsøknaden. Probe 33.15 består av en klonet human-minisatellitt sammensatt av 29 gjentagelser av en 16 bp variant av kjernesekvensen. Gjentagelsesenheten av minisatellitten i probe 33.6 er en divergert trimer av den mest bevarte 11 bp 3'-ende i kjernesekvensen og er gjentatt 18 ganger. Sekvensene i kjernen og probegjentagelses-enheten er:

Forskjellen både i sekvens og i gjentagelseslengde av prober 33.6 og 33.15 resulterer i deres påvisning av forskjellige mønstre av lange hypervariable minisatellitt-fragmenter i Hinfl-digereringer av human-DNA. Den 4 bp restriksjons-endonuklease maksimerer oppløsningen av variable minisatellitter ved å frigjøre lange tandem-repétitive minisatellitter i DNA-fragmenter med lite flankerende DNA.

Analyse av DNA- fingeravtrykk i en stor søskenflokk

For å undersøke segregeringen av individuelle minisatellitt-DNA-fragmenter ble en stor søskenflokk bestående av 11 engelske individer segregert for neurofibromatose (von Recklinghausen's sykdom), en autosomal dominant forstyrrelse som assosieres med tumorer i det perifere og sentrale nervesystem. Ingen genetiske markører er ennå blitt knyttet sammen med denne sykdom.

Blod-DNA-fingeravtrykk, påvist ved prober 33.6 og 33.15, av de 11 barna (6 angrepet, 5 uangrepet) ble sammenlignet med sin uangrepne far i fig. 7. Oppløsning av minisatellitt-DNA-fragmenter ble maksimert ved elektroforese i 35 cm lange agarose-geler.

Siden mange av disse hypervariable minisatellitter, spesielt de største DNA-fragmenter, har lave allelefrekvenser og sjelden deles av ubeslektede individer som forutsagt, er mange av disse fragmenter i neurofibromatosefamilien til stede i den heterozygose tilstand og transmitteres til bare noe av avkommet. Selv om DNA i den angrepne mor var utilgjengelig, kunne mor-deriverte minisatellittfragmenter lett identifiseres som fragmenter som er til stede i noe avkom, men fraværende hos faren. Fars-fragmenter kunne likeledes bli identifisert.

Under anvendelse av begge prober 33.6 og 33.15, var det mulig å avmerke segregeringen av 41 fars- og 32 mors-DNA-fragmenter i denne søskenflokk (fig. 7, tabell 3). Tallrike ytterligere polymorfe fragmenter eksisterer også, men ble enten elektroforesert av gelen eller ble ufullstendig oppløst og kunne derfor ikke avmerkes på pålitelig måte.

Heterozygote fars-DNA-fragmenter ble transmittert i et gjennomsnitt til 53% av avkommet- Likeledes viste mors-fragmenter 48% transmisjon, igjen i overensstemmelse med 1:1 segregering (tabell 4). Videre fulgte det antall barn som mottok hvert fragment den forventede binominale fordeling, i hvilken andelen av foreldrefragmenter som transmitteres til

nøyaktig r barn i søskenflokken på 11 er

(tabell 4).

Det ble konkludert at disse DNA-fragmenter viser Mendelian-nedarving og at avmerkingen av foreldrebånd, spesielt de mindre og mindre godt oppløste fragmenter, ikke er særlig influert av mulige tilfeller av segregering av to eller flere ovenpå hverandre lagte bånd som ville gi en tilsynelatende<_>>75% transmisjons-frekvens. Den korrekte maternitet og paternitet hos alle søsken er også fastslått ved disse DNA-fingeravtrykk.

Ved parvise sammenligninger mellom segregeringsmønsterne

i alle fars- eller mors-DNA-fragmenter i denne store søskenflokk er det mulig å identifisere alleliske par av fragmenter pluss par som viser tett tilknytning i kobling (oddsene for chanse for ko-segregering hos et gitt par av bånd i denne søskenflokk er 1/1024). Flere tilfeller av alleliske par av både fars- og mors-fragmenter kunne identifiseres med begge prober (fig. 7).

Probe 33.6 påviste også et forbundet par av fragmenter hos både mor og far. En lignende binding ble funnet i et annet slektskaps forhold (se nedenunder), hvilket antyder at minst én av de hypervariable regioner som hybridiserer til probe 33.6 er en lang minisatellitt/satellitt som inneholder et eller flere spaltningspunkter for Hinfl og spaltes derfor for å produsere to eller flere fragmenter som kosegregerer som en minisatellitt-"haplo-type" i slektskapsforhold. Ingen av de molymorfe DNA-fragmenter som var avmerket ved anvendelse av probe 33.15 var til stede i settet av fragmenter som påvises av 33.6; ethvert slikt fragment som hybridiserte til begge prober ville ha blitt påvist som bånd av lik størrelse som ble transmittert fra samme mor eller far til de samme barn (d.v.s. "forbundet"). Disse to prober hybridiserer derfor til i det vesentlige fullstendig forskjellige undersett av human-minisatellitter.

Ved å eliminere alleler og forbundne fragmenter ble det konkludert at 34 og 25 distinkte loci ble avmerket hos henholdsvis faren og moren (tabell 3). For~80% av loci er bare én av de to alleler oppløst, og den annen allele er sannsynligvis beliggende i det dårlig oppløste kompleks av kortere minisatellittfragmenter. Dette innebærer at store forskjeller i minisatellitt-allele-lengder må forekomme, hvilket sannsynligvis kommer av ulik utbytting i disse tandem-repetitive regioner; flere alleliske par som er identifisert i fig. 7 viser virkelig vesentlige lengdeforskjeller. Fra andelen av bånd som kan pares til alleler, er det mulig å anslå at det totale antall av heterozygote loci som er til stede i hele DNA-fingeravtrykkene påvist ved prober 33.6 og 33.15 er tilnærmet 43-66, hvorav tilnærmet halvparten kan avmerkes i faren og moren (tabell 3). Det er ikke mulig å bestemme allelisme mellom fars- og mors-fragmenter i denne søskenflokk.

Alle fars-loci som er avmerket er autosomale og viser ikke spesifikk transmisjon hverken til døtre (X-tilknytning) eller sønner (Y-tilknytning). Videre segregerer øyensynlig alle par

AB av fars-DNA-fragmenter uavhengig inn i avkom, for å gi gjennomsnittlig like antall av (AB,—) og A-, -B) avkom; nøyaktige antall fulgte den forventede binominale fordeling for utilknyttede loci (tabell 4). Mors-DNA-fragmenter oppførte seg på samme måte. Mer detaljert analyse antyder at den minimale locus-til-locus-fordeling for disse loci må være<_>30 cM (46 kart-enheter); noen tettere fordeling ville utvikle signifikante antall par av fragmenter som har tendens til å ko-segregere (forbundet i kobling) eller segregere som pseudo-alleler (forbundet i repulsjon) (tabell 4). De oppløsbare minisatellitt-loci må derfor spres over minst halvparten av det 3000 cm lange human-genom, og må derfor bli spredt over mange eller alle human-autosomene.

Ett mors-minisatellitt-fragment (fig. 7) viser svake tegn på tilknytning i kobling med neurofibromatose, med 10/11 barn konkordante for dette fragment og sykdommen (0 = 10 cM,

p = 0,006). Siden imidlertid 25 forskjellige mors-loci er blitt avmerket, ville sannsynligheten for at en allele av minst ett av disse loci tilfeldigvis skulle vise den observerte grad av tilknytning i kobling eller i repulsjon, er høy (p = 0,24).

Eksempel 9

DNA- fingeravtrykk av et utstrakt slektskapsforhold mulig tilknytning til HPFH

Analyse av DNA-fingeravtrykk ble utvidet til et mer uttømmende fire-generasjons-slektskapsforhold av Gujerati-asiater som er segregerende både for 3-thalassemi og for nedarvet persistens av føtal hemoglobin (HPFH).

Autoradiogrammer av mørkørsegregeringsmønstre vist i fig. 8A og 8B ble produsert som følger. 10 yg prøver av blod-DNA ble digerert med Hinfl, og DNA-fingeravtrykk ble produsert som beskrevet i fig. 7, under anvendelse av probe 33.6 (A) eller 33.15 (B). Elektroforese ble utført i en relativt kort (20 cm agarosegel). Slektskaps-forholdet mellom individer er gitt i fig. 9. A, hypervariable fragmenter a, b og c er tett forbundet og er enten alle til stede eller alle fraværende i hvert individ i stamtavlen.

B, ko-segregering av bånd g og HPFH (H). Individer IV 7 og

IV 8 er eneggede tvillinger og har uskjelnbare DNA-fingeravtrykk.

Materialer og metoder var som i eks. 8.

Ko-segregeringsanalyse er vist i fig. 15. 9A og 9B.

I fig. 9A, ble segregeringen av 30 hypervariable fragmenter fra II 4 og 27 fragmenter fra II 5 inn i avkom III 1-11 klassifisert for mulig tilknytning av par AB i foreldre-fragmenter; mulige eksempler på tilknytning som viser minst 6/7 (AB,—) avkom ble videre undersøkt i ytterligere slektninger.

De to tydeligste eksempler på tilknytning er vist (a-f, nærvær av fragmenter a-f i. et individ; •, fragment fraværende) . Fragmenter a-c og e, f viser hvert perfekt ko-segregering; fragment d har tendens til å ko-segregere med a-c, men søskenflokk IV 1-4 er ikke-informativ og eneggede tvillinger IV 7,8 er rekombinante, idet de har nedarvet a-c, men ikke d.

B, nedarving av 6-thalassemi-trekk (CC) , HPFH (H) og minisatellittfragment g. Individer avmerkes som har HPFH hvis de viste > 1% HbF (normal) eller > 3% HbF (3-thalassemi-trekk). HPFH og 3-thalassemi-trekk segregerer uavhengig i III 1-11 og IV 5-8 og bestemmes ved uforbundne loci.. Fragment g kosegregerer perfekt med HPFH i de undersøkte individer.

Resultater

Som vist i fig. 9A, B er forhøyelse av HbF transmittert uavhengig av 3-thalassemi-trekk og blir øyensynlig bestemt ved et autosomal-dominant locus uforbundet til 3~globi.n-gen-klasen. En lignende sardinisk stamtavle er blitt rapportert av Gianni et al., EMBO J.2, 921-925 (1983).

I fig. 8A og 8B, ble 30 variable fragmenter avmerket i bestefaren (II 4) og 27 fragmenter i bestemoren (II 5).

Studium av deres syv etterkommere (III 1-11) indikerte at disse fragmenter ble avledet fra minst 22 distinkte uforbundne fars-og 18 mors-autosomale loci, ved anvendelse av de kriterier som er beskrevet for neurofibromatosefamilien. De gjenværende DNA-fragmenter viste tegn på allelisme eller kobling til andre fragmenter, selv om bevis med denne lille søskenflokk ikke er mulig (et gitt par av foreldre-DNA-fragmenter har en 1/64 chanse til tilfeldig å bli transmittert enten forbundet eller som alleler i en søskenflokk på 7). Ytterligere tegn på for-binding ble søkt i. ytterligere medlemmer av stamtavlen, og de to sterkeste tilfeller av tilknytning er vist i fig. 8 og 9. Fragmentene a, b og c påvist ved probe 33.6 blir transmittert

i perfekt kobling fra II 4 inn i hans barn (III 1-11) og deretter barnebarn (IV 1-8) ; ingen rekombinanter ble sett i.

14 informative avkom (p = 4x10 -9 for tre ko-segregerende bånd). Som diskutert ovenfor, antyder dette at fragmenter a-c representerer en minisatellitt-"haplotype" avledet fra et enkelt hypervariabelt locus. Bånd å påvist ved probe 3 3.15 viser også tegn på kobling til bånd (a-c; imidlertid er én søskenflokk (IV 1-4) u-informativ siden begge foreldre bærer fragment d,

og en annen (IV 5-8) inneholder en rekombinant (eneggede tvillinger IV 7,8). Beviset på binding mellom bånd d og klasen a-c er derfor svak (© = 10 cM, p = 0,01). Morsbånd e (påvist ved 33.6) og f (påvist ved 33.15) viser også tett kobling både i. etterkommerne av II 4 og II 5, i ytterligere beslektede søskenflokker III 15-20 og IV 17-22, (20 informative avkom), ingen rekombinanter, 9=0 cM, p = 10 — 6). Siden prober 33.6

og 33.15 påviser forskjellige sett av minisatellitter og ikke kryss-hybridiserer til fragmenter e og f, kan disse fragmenter representere et eksempel på autentisk binding mellom to forskjellige autosomale minisatellitt-loci. Endelig er de to koblingsgrupper (fragmenter a-c og e-f) ikke alleler fra samme locus. Individ III 1 er en forbindelse heterozygot som bærer både fars-klase a-c og morparet e-f; begge klaser transmitteres til to av hans fire barn, hvorved det fastslås at de ikke segregerer som alleler, men istedet må være avledet fra to uforbundne hypervariable regioner.

Ingen av mor-(II 5)-minisatellittfragmentene viste signifikant kobling til 3-thalassemi-trekk og er derfor ikke tett forbundet med 3~globin-gen-klasen på kromosom 11. Derimot ko-segregerte ett mor-fragment (g) 8,6 kb i lengde med HPFH i de syv avkom og i tre informative søskenflokker av barnebarn

(fig. 9). Ingen rekombinanter ble sett i 12 avkom, hvilket

-4

antyder tett tilknytning (9 = 0 cM, p = 2x10 ). Selv å ta hensyn til det faktum at 17 loci i II 5 er blitt undersøkt, gjør at denne kobling fremdeles er signifikant (sannsynligheten for at en allele.av minst ett av de 17 avmerkede loci ville vise ko-segregering tilfeldigvis med HPFH er 0,004). Det er videre blitt kontrollert at fragment g i II 5 er en enkelt minisatellitt-allele og ikke to på hverandre lagte segregerende DNA-fragmenter, ved å undersøke DNA-fingeravtrykkene til alle individer vist

i fig. 9, digerert med Sau3A istedenfor Hinfl; hvert positive fingeravtrykk inneholdt et tilsvarende Sau3A-fragment av størrelse lik den for fragment g (8,2 kb mot 8,6 kb), som forventet for et enkelt minisatellittfragment.

Diskusjon

Human-herkomst-analyse viser at DNA-fingeravtrykkene påvist ved hjelp av minisatellittprober med pålitelighet kan anvendes for å studere segregeringen av multiple heterozygose DNA-fragmenter, selv i familier hvor en eller annen av foreldrene er utilgjengelig for studier. Ved anvendelse av to slike prober er det mulig å analysere opp til 34 hypervariable loci samtidig i et enkelt individ, en grad av genetisk markør-generasjon som er langt høyere enn hva som oppnås ved konvensjonelle metoder, inklusive RFLPs, i human-genetikk. Den stabile nedarving av variable minisatellittfragmenter sammen med den lave populasjonsfrekvens av individuelle fragmenter gjør dem ideelt egnet for koblingsanalyse, som vist ved de eksempler på kobling som er oppdaget i de to stamtavler som er analysert. Vi ville hevde at, selv om disse hypervariable minisatellitter kan være rekombinasjons-"hotspots", så er den anslåtte grad av ulik utbytting som inntreffer ved en lang minisatellitt (~0,001 pr. gamete) ikke tilstrekkelig til å forurolige signifikant koblingen mellom et minisatellitt-locus og et nabo-gen, slik som et sykdoms-locus.

Det anslås at det totale antall av hypervariable loci påvist sammen ved minisatellittprober 33.6 og 33.15 er tilnærmet 60. Minst én av de to alleler av ca. halvparten av disse loci kan oppløses i et gitt DNA-fingeravtrykk, og det følger derfor at i forskjellige DNA-fingeravtrykk vil spektret av loci. som undersøkes ikke være identisk. De fleste eller alle av disse loci er genetisk uforbundet og må derfor være spredt over en vesentlig andel av human-genomet. Deres presise beliggenhet er ikke kjent og må avvente kloningen og den regionale lokalisering av individuelle hypervariable minisatellitt-loci.. Pussig nok er ingen minisatellitter ennå blitt funnet på X- eller Y-kromosomet i noen stamtavler som er studert. Vi anslår at tilnærmet 43 forskjellige loci er blitt avmerket for mulig kjønnsbinding i. faren i neurofibromatosefamilien sammen med individuell II 4 i. HPFH-familien. Siden X- og Y-kromosomene sammen utgjør~5% av genomet til en mannsperson,

så er sannsynligheten for at ingen av 4 3 vilkårlig dispergerte loci . residerer på disse kromosomer, lik (0,95) 43 = 0,1; den

sannsynlige mangel på kjønss-bundne minisatellitter er derfor ikke signifikant.

Disse dispergerte hypervariable mdnisatellitt-loci er godt egnet for undersøkelse for markører knyttet til sykdoms-loci, som vist ved de foreløpige eksempler på kobling til neurofibromatose og til HPFH. Ulik konvensjonell enkelt-locus-genetisk analyse kan koblingsdata ikke oppsamle mellom ubeslekt-tede små stamtavler, siden en annerledes minisatellitt-allele sannsynligvis vil være assosiert med sykdoms-locus i hver stamtavle. Istedet er DNA-fingeravtrykk bare egnet for studering av kobling, spesielt av dominante forstyrrelser, i en utstrakt stamtavle og mest ideelt i en enkelt, stor søskenflokk.

Så langt tillater prober 33.6 og 33.15 opp til 34 autosomale hypervariable loci å bli avmerket i et individ. Chansen for at minst ett av disse loci er tett forbundet med et gitt sykdoms-locus (innen 10 cM) er 20%, antatt vilkårlig disper-gering av minisatellitter gjennom det 3000 cM lange human-koblingskart. For utstrakte stamtavler såsom HPFH-familien, faller denne sannsynlighet til~10% siden bare én allele av de fleste loci kan avmerkes, og for å påvise kobling må denne allele være forbundet i kobling med sykdoms-locuset. For å heve disse sannsynligheter til over 50% ville det være nødvendig med avmerking på >104 hypervariable loci i en enkelt, stor søskenflokk og >208 loci i en utstrakt stamtavle. Disse tall overstiger det totale antall loci påvist av de to minisatellittprober som er blitt anvendt hittil. Imidlertid påviser prober 33.6 og 33.15 essensielt totalt forskjellige sett av hypervariable loci, hvilket antyder at det totale antall av human-minisatellitter som inneholder forskjellige versjoner av kjernesekvensen kan være stort.

I konvensjonell human-herkomst-analyse hvor det anvendes definerte enkelt-locus-markører, gir tegn på kobling mellom en markør og et sykdoms-locus vanligvis direkte den tilnærmede genomiske lokalisering av sykdomsgenet og kan fastslås ytterligere ved analyse av ytterligere stamtavler. Det motsatte er tilfellet for DNA-fingeravtrykk. Videre analyse av mulig kobling mellom et hypervariabelt DNA-fragment og en sykdom er mulig via isolasjon av fragmentet ved preparativ gel-elektroforese og kloning. Locus-spesifikke hybridiseringsprober kan så bli konstruert ut fra den isolerte minisatellitt, enten ved å anvende unike sekvens-DNA-segmenter umiddelbart flankerende minisatellitten eller ved å anvende hele minisatellitten i høy-strå ngens-hybridiseringer . Slike locus-spesifikke prober kan anvendes både for å utvide koblingsdataene i ekstra familier og for å lokalisere minisatellitten innen human-genomet. Denne løsning bekreftes løpende ved kloning av det 8,2 kb Sau3A minisatellitt-fragment som øyensynlig er forbundet med HPFH-locuset i Gujerati-stamtavlen.

Som beskrevet ovenfor produserer prober 33.5, 33.6 og 33.15, hvorav hver består av en human-minisatellitt sammensatt i hvert tilfelle av en annerledes variant av kjernesekvensen, forskjellige DNA-fingeravtrykk og påviser derfor forskjellige sett av hypervariable minisatellittregioner i human- og annen hvirveldyr-DNA. Spesielt påviser prober 33.6 og 33.15 stort sett eller fullstendig forskjellige sett av minisatellitter (kfr. den tredje søknad og "DNA 'fingerprints<1>and linkage analysis i human pedigrees" av A.J. Jeffreys, V. Wilson, S.L. Thein, D.J. Weatherall&B.A.J. Ponder), som et resultat av forskjeller både i lengde og presis sekvens av den gjentatte kjerne som er til stede i hver probe.

For å undersøke om det lar seg gjøre å påvise ytterligere hypervariable regioner under anvendelse av tandem-gjentagelser av andre versjoner av kjernesekvensen er en serie av syntetiske ministallitter blitt fremstilt.

Eksempel 10

Syntese og kloning av en kunstig minisatellitt

Løsningen med hensyn til å fremstille polykjerneprober

er vist i fig. 10, som illustrerer ruten mot fremstilling av en klonet tandem-gjentagelse av overgangs-"hotspot"-initiator-sekvensen (Chi, GCTGGTGG) til E. coli. De trinn som er involvert i å lage en poly-Chi-probe anvendte standard-DNA-teknikker og var: 1. Et syntetisk oligonukleotid inneholdende en tandem-gjentagelse av den 8 nukleotider-lange Chi-sekvens ble fremstilt ved fremgangsmåten til H.W.D. Matthes et al., (1984) (EMBO J. 3, 801-805) og D.G. Brenner&W.V. Shaw (1985) EMBO J. 4, 561-568. Et annet oligonukleotid bestående av en dimer av den

komplementære sekvens til Chi ble også syntetisert.

2. Disse to oligonukleotider ble koblet sammen ved 37° i

10 mM MgCl2, 10 mM tris-HCl (pH 8,0) for å danne et kort, dobbelt-strenget segment av DNA. Sekvensen i det annet oligonukleotid ble valgt for å produsere et koblet molekyl med 3-nukleotider lange 5'-projiserende termini egnet for hode-til-hale-legering. 3. 5 1-termi.niene ble fosforylert ved anvendelse av T4-polynukleotid-kinase pluss ATP. 4. Koblede DNA-fragmenter ble ligert sammen på hode-til-hale-måte ved anvendelse av T4 DNA-ligase pluss ATP for å produsere en gjentatt Chi-polymer. 5. Ligerte polymerer ble separert etter størrelse, ved elektroforese gjennom en l,5%ig agarosegel, og polymerer større enn 150 basepar i lengde ble isolert ved elektroforese på DE81-papir (Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corri, P.&Chambon, P., Anal. Biochem. 112, 295-298). 6. De utvunne, lange polymerer ble gjort butte på enden ved innfyllingsreparering ved anvendelse av Klenow-fragmentet til E. coli DNA-polymerase I og ble ligert inn i Smal-punktet til M13mpl9 RF DNA (J. Messing&J. Vieira, 1982. Gen 19, 269-276). Ligert DNA ble transformert til E. coli JM101 og enkelt-strenget fag-DNA isolert fra individuelle hvite plaque. 7. DNA-innsatsen fra hvert klonet isolat ble sekvensert ved di.deoksynukleotid-metoden (M. D. Biggin, T.J. Gibson&H.F. Hong, 1983. Proe. Nat. Acad. Sei. USA 80, 3963-3965) for å bestemme lengden, orienteringen og sekvensen til den polymere innsats.

En rekombinant Ml3-fag ble funnet, betegnet M13.kjerne A, som inneholdt 50 tandem-gjentagelser av den Chi-sekvens-orienterte 5'-»3' i den modne enkelt-strengede fag-DNA [d.v.s. at innsatsen er poly-(Chi), ikke poly(komplement til Chi)].

32 8. En P-merket enkelt-strenget hybridiseringsprobe ble fremstilt ved primer-utvidelse, under anvendelse av de samme metoder som for fremstilling av prober fra fag 33.6 og 33.15.

Eksempler 11- 15

Fremstilling av fem ytterligere nye kunstige minisatellitter

Ved anvendelse av ovenstående teknikk ble fem ytterligere versjoner av kjernesekvensen syntetisert og klonet som polykjerne- rekombinanter i M13, slik at man fikk rekombinanter M13.kjerne A-F. Kjernevariantene ble valgt slik at både lengden og den nøyaktige sekvens av kjernen ble variert. Tabell 5 oppsummerer gjentagelsessekvensen i. kloner M13.kjerne A-F sammenlignet med kjernesekvensen og med tidligere anvendte prober 33.5, 33.6 og 33.15 beskrevet i de tidligere søknader. De mest invariante baser i kjernesekvensen er understreket. Orienteringen av hver innsats i vektoren Ml3mpl9 er også gitt (-», innsats er poly (kjerne) ; -<-, innsats er den komplementære sekvens av poly(kjerne)). Baser gitt i nedre skript indikerer avganger fra kjernesekvensen. Korte karakteristikker av hver sekvens er oppsummert i "kommentarene".

Eksempel 16

Hybridisering av M13. kjerne A- F til human- DNA digerert med Hinfl

I en innledende klassifisering ble DNA-digereringer av to ubeslektede individer probet med 33.15 og med hver av probene M13.kjerne A-F. 8 yg prøver av DNA fra to ubeslektede placentaer (1,2) ble digerert med Hinfl, elektroforesert gjennom en 0,7%ig agarosegel, Southern-blottet og hybridisert til hver probe merket med<32>P etter den fremgangsmåte som er beskrevet i hovedsøknaden. De resulterende autoradiogrammer er vist i fig. 11. Alle prober påviste multiple DNA-fragmenter i hvert individ.

Resultater

Hver av probene B, C og D påviste et fingeravtrykk av DNA-fragmenter som varierte vesentlig mellom de to individer; fingeravtrykket varierte også fra probe til probe, selv om noen fragmenter ble påvist av mer enn én probe og overlappet i en viss grad med settet av hypervariable fragmenter påvist av probe 33.15. Vi konkluderer med at prober B-D alle er egnet for DNA-fingeravtrykkbestemmelse og sammen vil utvide antall hypervariable minisatellitter som kan undersøkes hos mennesker og andre hvirveldyr. Av interesse her er det vellykkede fingeravtrykk oppnådd med kjerne C, som inneholder bare det sentrale, mest bevarte 7 basepar-segment i kjernesekvensen.

Videre avkorting av kjernen for å produsere den 6 basepar lange gjentagelse i. kjerne E fullstendig endret DNA-finger-avtrykkmønsteret og avslørte et sett av fragmenter som for det meste deles med de to individer som er testet (d.v.s. at disse fragmenter ikke viser ekstrem polymorf variasjon). Således er det usannsynlig at kjerne E er så nyttig som probe for DNA-fingeravtrykkanalyse som de tidligere anvendte prober 33.5, 33.6 og 33.15. Dette antyder også et praktisk minimumskrav på 7 basepar for kjernesekvenser for generell vellykket DNA-fingeravtrykkbestemmelse. Avbrytelse av den sentrale, mest bevarte region i kjernen (M13.kjerne F) synes også å redusere kompleksiteten og variabiliteten til DNA-fingeravtrykkmønsteret.

M13.kjerne A (poly-Chi) produserer et nytt og intenst mønster av hybridiserende DNA-fragmenter. Mange av disse fragmenter er svært store (>15 kb) og dårlig oppløst og kan godt være avledet fra en konvensjonell, lang satellittsekvens som inneholder det leilighetsvise HinfI-spaltningspunkt. Noen DNA-fragmenter viser individuell variabilitet.

Eksempel 17

Ytterligere undersøkelse av kjerne A

Mønsterne produsert av M13.kjerne A ble ytterligere analysert i den familie som var angrepet av neurofibromatose, som også var blitt godtkarakterisert vedanvendelse av prober 33.6 og 33.15 (kfr. eks. 8 og fig. 7). I fig. 12 er det vist fingeravtrykk fra HinfI-digereringer av DNA fra faren (F), seks døtre (D) og fem sønner (S). Individer angrepet av neurofibromatose, en autosomal-dominant nedarvet cancer, er merket +;

DNA fra den angrepne mor var ikke tilgjengelig. Segregerende fars- (•) og mors- (o)-bånd er antydet. Bånd som er forbundet med en heltrukken linje er sammenknyttet, og de som er forbundet med stiplede linjer er segregerende som alleler. Bånd merket (x) er tidligere blitt påvist ved anvendelse av probe 33.15.

Resultater

Ulik de DNA-fingeravtrykk som er oppnådd med prober 33.6 og 33.15, er nivået av variabilitet relativt lavt, idet mange fragmenter er transmittert til alt avkom (d.v.s. disse fragmenter er vanlige, ikke sjeldne, i populasjonen og er hyppig til stede i den homozygote tilstand). Segregeringen av 6 heterozygote fars- og 9 heterozygote mors-bånd kunne avmerkes i søskenflokken på 11 barn. Ett av fars- og et allelisk par av mors-båndene er tidligere blitt påvist med probe 33.15. Etter eliminering av alleliske og forbundne par av bånd sitter vi tilbake med 2 nye fars-loci og 6 nye mors-loci som ikke tidligere var avmerket med hverken probe 33.6 eller 33.15, sammenlignet med 34 fars- og 25 mors-loci tidligere avmerket. Poly-Chi-proben er derfor til begrenset nytte i human-genetisk analyse.

Resultatene fra eksemplene 16 og 17 bekrefter betydningen av de ni dominante nukleotider som er understreket i øverste rekke i tabell 5 og diskutert tidligere på side 18 i hoved- søknaden. De går også langt inn på å bekrefte den forutsigelse som er gjort i hovedsøknaden at en minimums-sekvens på seks nukleotider er nødvendig i en vellykket probekjerne. Således er kjerne E representativ for minimumsnytte, og det er mulig at andre sekvenser av seks nukleotider kan vise marginalt forbedret nytte, f.eks. den sekvens TGGGCA som skal diskuteres senere. Økningen til syv nukleotider er nokså dramatisk innen rammen av undersøkelsen.

I forsøket på å definere det essensielle ved en nyttig kjernesekvens kan variantene X og Y som er anvendt ovenfor for å indikere alternative nukleotider, på nyttig måte utvides til en fullstendig logisk gruppe, som antydet nedenunder:

( ) = ikke benyttet i følgende diskusjon.

Ved anvendelse av denne terminologi kan et aspekt ved oppfinnelsen sies å omfatte et polynukleotid inklusive den gjentatte kjernesekvens nedenunder:

Ovenstående indikerer naturligvis den mest representative 12 nukleotiders sekvens. Imidlertid er det blitt vist at den 7 nukleotiders kjerne C også har stor nytte, og for å inkludere denne med "tillatte" varianter fra ovenstående 12 kjernesekvens, kan et aspekt sies å inkludere også et polynukleotid omfattende gjentagelser av den 7 kjernesekvens som er anført nedenunder:

Fortrinnsvis vil naturligvis P være lik T som i kjerne C. Den annen, mest foretrukne mulighet ville være A.

For tydelighetens skyld er prosent homologi også angitt i tabell 3. Hva angår de kunstige prober i henhold til foreliggende oppfinnelse skal det bemerkes at gjentagelsene er nøyaktige gjentagelser, slik at homologien til minisatellitten som en helhet kan indikeres ved homologien til kjernesekvensen.

Dette er ikke nødvendigvis tilfelle for de tidligere prober 33.6, 33.15 og 33.5 hvor homologien er angitt i parentes. Dette skyldes varianter som inntreffer mellom gjentagelsene. Kjerne F er muligens indikativ for en minste prosent homologi for nyttighet. Imidlertid var denne mangel på konsensus kanskje overdrevet ved avbrytelse av den sentrale gruppering

som er til stede i. kjernen. Det er verd å merke seg at ovenstående gruppering er til stede i de mest vellykkede prober B, C og D og er avbrutt i alle de mindre vellykkede prober A, E og F. Det er derfor å forvente at mer vellykkede prober som har en minste 70% total homologi med formel (6) kan oppnås. Det er verd å merke seg at den sentrale 6 polynukleotid-gruppering av formel (8)

også er blitt avbrutt i kjerne E. Det er kanskje å forvente at en 6 nukleotiders kjernesekvens som ovenfor ville være mer vellykket, selv om økningen i lengde fra 6 til 7 nukleotider kan vise seg å være et mere dominerende karakteristikum.

Følgelig kan et aspekt ved oppfinnelsen sies å omfatte et polynukleotid inklusive gjentagelser av kjernesekvensen TGGGCA.

Mer generelt kan oppfinnelsen sies å inkludere som et aspekt et polynukleotid i henhold til den "første" definisjon ovenfor i hvilken sekvensen TGGGCA er til stede i alle de gjentagende sekvenser.

Sett fra et annet aspekt kan oppfinnelsen sies å inkludere en modifikasjon av polynukleotidet av den "første" definisjon ovenfor, i hvilken "kjerne" representerer en sekvens av minst 6 fortløpende nukleotider, lest i. samme 5<*->»3' retning, valgt fra den sekvens som er vist i formel (2); "kjerne" har ikke nødvendigvis samme sekvens i hver gjentagende enhet, forutsatt at alle enheter inneholder sekvensen TGGGCA.

Fortrinnsvis vil de gjenværende grupper i hver enhet

ha minst 70% homologi med sekvensen av formel (6) (eller mer å foretrekke) (2)) innen begrensningen for den totale enhets-lengde.

Bestemmelse av tvi lii ng-zygosi tet ved f ødselen Bestemmelse av zygositet hos tvillinger er av betydning ikke bare for epidemiologiske, genetiske og obstretiske studier, men på grunn av forskjellen i prognose mellom monozygote og dizygote tvillinger. Monozygote, eller identiske, tvillinger har lavere fødselsvekt, mer medisinske komplikasjoner og høyere mortalitetrater enn dizygote tvillinger. Hos hvite personer er ca. 30% av nyfødte tvillinger av forskjellig kjønn og derfor dizygote. Undersøkelse av placentamembranen viser atter 20% tilfeller som er monochorioniske, og disse er alltid monozygote. De gjenværende 50%, en andel som er relativt konstant mellom populasjoner, har samme kjønn, har diamnotisk di.chorioni.sk placenta og kan være enten mono- eller dizygote. Et utvalg av metoder er blitt anvendt for å bestemme zygositet i. disse tilfeller, inklusive fastslåelse av generelt utseende, fingeravtrykk, hud-podning, smakstesting og bestemmelse av genetiske markører. Sistnevnte er det som er mest pålitelig, med en nøyaktighet på 95-98%. Imidlertid må store antall av slike markører vanligvis bli undersøkt på grunn av relativt lave heterozygositeter hos de fleste protein- og antigen-varianter.

I de følgende eksempler ble DNA fra 12 sett av nyfødte tvillinger undersøkt ved hjelp av minisatelli.tt-DNA-prober som beskrevet ovenfor. DNA-"fingeravtrykk" som ble oppnådd viser en slik variabilitet mellom individer at bare monozygote tvillinger viser identiske mønstre. I de 7 tilfeller hvor zygositet kunne bestemmes ut fra observasjon av kjønn eller placenta-undersøkelse, samsvarte DNA-resultatet med disse funn. I de andre 5 tvillingpar og i. to sett av trillinger tillot DNA-analyse hurtig bestemmelse av zygositet. DNA-prober i overensstemmelse med oppfinnelsen utgjør derfor en enkelt genetisk test som skulle tillate positiv bestemmelse av zygositet i alle tilfeller av multippel pregnans.

Eksempel 18

Enkelt-strengede DNA-prober 33.6 og 33.15 ble anvendt for å bestemme zygosi.teten til tolv sett av nyfødte tvillinger,

og detaljer for disse er angitt i tabell 6.

Navlestreng-blodprøver oppsamlet ved nedkomst eller perifere blodprøver (0,5 -1,0 ml), oppnådd fra hver baby dagen etter fødselen, ble anvendt for DNA-ekstraksjon. Placentaer ble undersøkt for å bestemme om de var mono- eller di-amniotiske og chorioniske. DNA ble ekstrahert ved standardmetoder (Old, J.M., Higgs, D.R. Gene analysis. In: D.J. Weatherall, ed. Thalassaemias. Methods in Haematology, Churchill Livingstone, 1983) og 10-15 yg digerert med Hinfl. Prøver ble elektroforesert gjennom en 22 cm lang 0,6%ig agarosegel ved 45 V i~36 timer inntil alle DNA-fragmenter < 1,5 kb lange hadde elektroforesert fra gelen. DNA ble overført ved avklapping til et nitrocellulosefilter og innbakt ved 80° under vakuum i 2 timer. De enkelt-strengede DNA-prober, 33.15 og 33.6, ble merket med<32>P som beskrevet tidligere.

Resultatene er vist i fig. 13.

I fig. 13 viser gatene 1, 2 DNA-bånd-mønstrene oppnådd

for hver tvilling i tilfellet 1 under anvendelse av den 33.6 enkelt-strengede minisatellittprobe. Gatene 3 til 19 viser de "fingeravtrykk" som ble oppnådd med den enkelt-strengede 33.15-probe: tilfelle 1, gater 3, 4; tilfelle 2, gater 5, 6; tilfelle 3, gater 7, 8; tilfelle 4, gater 9, 10; tilfelle 5, gater 11, 12; tilfelle 6, gater 13, 14; tilfelle 7, gater 15, 16. Gatene 17-19 er tre trillinger av hunkjønn, hankjønn og hunkjønn. Sammenligning mellom gatene 1 og 2 og gatene 3 og 4 viser at

de to prober, 33.6 og 33.15, påviser forskjellige sett av minisatellittbånd. Størrelse markører er vist i kilobaser.

I syv tilfeller (se tabell 6) kunne zygositet bestemmes simpelthen ved undersøkelse av kjønnet på tvillingene og deres placentamembraner. Alle tvillinger med monochorioniske (eller monoamniotiske) placentaer (f.eks. tilfelle 1) er monozygote, selv om bare ca. 50% av monozygote tvillinger har monochorio-nisk placenta (2). Derfor må tvillingene i tilfelle 1 være monozygote, og de viste identiske DNA-mønstere med begge prober 33.15 og 33.6 (fig. 1). I fem tilfeller var tvillingene av forskjellig kjønn og viste forskjellige båndmønstere med begge prober 33.15 og 33.6. I tilfellene 3, 5, 7, 9 og 11 var tvillingene av samme kjønn og hadde dichorioniske placentaer, så disse kunne være enten mono- eller di-zygote. DNA-analyse viste at to sett av tvillinger (tilfeller 5 og 9) hadde for skjellige båndmønstere og var derfor dizygote mens i de andre tre sett (tilfeller 3, 7 og 11) identiske båndmønstere indikerte monozygositet.

To sett av nyfødte trillinger ble likeledes studert.

I begge tilfeller hadde moren tatt fertilitets-medisiner for å fremkalle graviditet, og hver trilling viste et unikt bånd-mønster (f.eks. gate 17-19, fig. 13).

Resultatene er vist i fig. 14, hvor gatene 1 og 2 viser

de resultater som anvender enkelt-strenget 33.15 og gatene 3

og 4 de resultater som anvender dobbelt-strenget 3 3.15.

Eksempel 19

Selv om enten enkelt- eller dobbelt-strengede prober var adekvate for å foreta hver diagnose, var flere bånd skjelnbare med flere radioaktive enkelt-strengede prober (fig. 14).

Som et alternativ til disse enkelt-strengede prober har

vi undersøkt muligheten av å anvende de tilsvarende dobbelt-strengede prober som kan være mer familiære i de fleste labora-torier. De dobbelt-strengede DNA-prober som ble anvendt var i) et dobbelt-strenget 600 bp Pst I - Aha III-fragment inneholdende "kjerne"-minisatellitten fra A33.15 og ii) et dobbelt-strenget 720 bp Hae III-fragment inneholdende "kjerne"-minisatellitten fra X33.6. Disse ble merket ved nick-translasjon til en spesifikk aktivitet på 0,5 - 1,0 x 10 9 cpm<32>p/yg DNA. Prehybridiserings- og hybridiseringsbetingelser var som beskrevet i den ovenfor identifiserte standardmetode med unntagelse av at 1 x SSC og 10% dekstransulfat ble anvendt i hybridiserings-pufferen for dobbelt-strengede prober. Filterne ble vasket i 1 time i 1 x SSC ved 65°C og autoradiografert med intensifiserende skjermer i 1-3 dager ved -70°C.

Diskusjon av eksemplene 18 og 19

I de syv tilfeller hvor zygositet kunne bestemmes uavhengig var DNA-resultatene i overensstemmelse med den konklusjon som er basert på observasjoner av kjønn og placentaundersøkelse.

I de andre fem par var en "clearcut"-bestemmelse av zygositet mulig med minisatellittprobene. Likeledes viste begge sett av trillinger som ble studert, seg å være trizygote.

I de 50% av tilfeller hvor tvi liingzygositet ikke kan bestemmes ved enten forskjellig kjønn (dizygote) eller en monochorioni.sk placenta (monozygoti.sk) , må genetisk analyse anvendes. Informativiteten til slike tester er proporsjonal med graden av polymorfisme ved de genetiske loci. som undersøkes og antall loci som testes. Med multiple antigen fra røde blodlegemer og enzymbestemmelser kan nøyaktigheter for zygositet av størrelsesorden 95-98% bli oppnådd, men bare hvis de relevante allelefrekvenser i populasjonen er kjent (Nylander, P.P.S. The phenomenon of twinning. In: Barron, S.L., Thomson, A.M. eds. Obstetrical Epidemiology. London. Academic Press, 1983: 143-165). Likeledes produserer analyse av multiple restriksjonsenzym-punkt-polymorfismer med flere forskjellige DNA-prober en signifikant prosentandel av "falsk positiv" diagnose av monozygositet

(Derom, C, Bakker, E., Vlietineck, R., Derom, R., Van der Berghe, H., Thiery, M., Pearson, P. Zygositetsbestemmelse hos nyfødte tvillinger under anvendelse av DNA-varianter. J. Med. Genet., 1985, 22:279-282). Minisatellittprober i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse overvinner dette problem på grunn av det store antall og vesentlig variabilitet hos de hypervariable DNA-segmenter som de påviser. Som allerede beskrevet, er hybridiserende minisatellittfragmenter sjelden delt mellom vilkårlig utvalgte individer (kfr. også ubeslektede individer i fig. 13). Det er allerede vist ovenfor at oddsene mot to ubeslektede individer som viser identiske DNA-fingeravtrykk med både prober 33.6 og 33.15, som påviser forskjellige sett av hypervariable loci, derfor er astronomiske (p << 10 — 18, se eks. 4). Hos søsken som har ca. halvparten av sine fragmenter felles,

er sannsynligheten for en slik "falsk positiv"-diagnose av genetisk identitet lik < 10 — 8. Derfor tilveiebringer den kombinerte bruk av enkelt-strengede hybridiseringsprober 33.6 og 33.15 en nøyaktighet som er av størrelsesorden større enn tidligere genetiske tester. Selv ved anvendelse av de mer konvensjonelle dobbelt-strengede minisatellittprober som svikter med hensyn til å hybridisere til noen av de svakere bånd som er påvist av enkelt-strengede prober (fig. 14), kan tilstrekkelig informasjon oppnås fra DNA-fingeravtrykk til å redusere den "falske mono--4

zygositets"-rate til < 10

En annen fordel ved denne metode for zygositetsbestemmelse er at svært lite prøve kreves for analysen. 1/2 ml av perifert-eller navlestreng-blod har alltid gitt tilstrekkelig DNA. Med tilgjengeligheten av denne likefremme måte å bestemme zygositet på hos nyfødte så vel som hos eldre tvillinger og trillinger, bør mer presise epidemiologiske studier på determinantene og effektene av forskjellige typer av multippel pregnans være mulig.

I de følgende eksempler er molekylvektmarkører ikke angitt i autoradiogrammene, men det effektive generelle område var 1,5 til 20 kb som i andre resultater.

Anvendelse av DNA- fingeravtrykkbestemmelse på forensisk vi tenskap

Den individuelle spesifisitet hos DNA-fingeravtrykk påvist ved minisatllittprober 33.6 og 33.15 gjør dem ideelt egnet til individuell identifikasjon i forensisk vitenskap. Den eneste usikkerhet er om DNA overlever i. en tilstrekkelig unedbrutt form i f.eks. tørket blod eller sædflekker til å tillate DNA-fingeravtrykkanalyse. For å bestemme om det lar seg gjøre å analysere forensi ske prøver ble et pilot-studium utført på DNA - prøver levert av Dr. Peter Gill fra Home Office Central Research Establishment, Aldermaston.

Eksempel 20

Tørkede blod- og sædprøver på tøy ble oppbevart i forskjellige tidsrom ved romtemperatur før DNA-ekstraksjon utført av Dr. Gill (lysering med SDS i nærvær av IM DTT fulgt av fenolekstraksjon og etanolutfelling). DNA ble likeledes ekstrahert fra friske hår-røtter og fra vaginatamponger tatt før og etter seksuelt samvær. DNA-prøver ble digerert med Hinfl, elektroforesert gjennom en 0,8%ig agarosegel og avklappet på et nitro-32 cellulosefilter. Filteret ble hybridisert med P-merket enkelt-strenget probe 33.15, under anvendelse av vår standard-teknikk som beskrevet ovenfor.

Prøver som ble elektroforesert var:

1. 40 yl sædflekk på tøy, 4 uker gammel.

2. 40 yl frisk sæd.

3. 60 yl friskt blod.

4. 60 yl blodflekk på tøy, 4 uker gammel.

5. 60 yl blodflekk på tøy, 2 år gammel.

6. 15 hår-røtter.

NB. 1-6 ble tatt fra samme mann.

7. 60 yl blodflekk på tøy, mann, fersk.

8. Vagina-tampong tatt fra 11, 1 time etter samleie med 7.

9. Som i 8, men 7 timer etter samleie.

10. Vagina-tampong tatt fra 11.

11. 60 yl blodflekk på tøy, kvinne, fersk.

De oppnådde DNA-fingeravtrykk er vist i fig. 15. Tilstrekkelig DNA (~0,5-3 yg) ble ekstrahert fra hver prøve for analyse. DNA i tørkede blodflekker, opp til 2 år gamle, og i tørket sæd, opp til 1 måned gammel, var ikke signifikant ned-bygget og ga identiske DNA-fingeravtrykk med dem som ble oppnådd fra friskt blod og sæd fra samme individ. Et DNA-fingeravtrykk kunne likeledes bli oppnådd fra så lite som 15 hår-røtter.

Vagina-tampongene tatt etter samleie ga også et unedbygget DNA-fingeravtrykk. Imidlertid passet tampongmønsterne primært til dem for kvinnens, ikke mannens blod, hvilket indikerte at det meste av DNA oppsamlet fra tampongene var fra vagina-epithelceller som ble avskallet av tampongen, og ikke fra sæd. Allikevel kunne tre ytterligere ikke-kvinne-bånd påvises i de post-coitale prøver; disse passet til hovedbåndene i mannens blod og må ha stammet fra sæd; slike bånd kunne påvises i en prøve som ble tatt 7 timer etter samleie.

Diskusjon

Disse foreløpige resultater indikerer at DNA opprettholdes intakt i et utvalg av forensiske prøver og derfor at DNA-fingeravtrykkbestemmelse for identifikasjonsformål er anvendelig på minst noen forensiske prøver. For eksempel er det nå mulig med positiv identifikasjon av en voldtektsforbryter fra sædflekker fra klærne til et offer. Situasjonen med vagina-tamponger fra voldtektsoffere er mindre sikker på bakgrunn av den kontaminer-ende vagina-DNA; imidlertid bør fjerning av denne kvinne-DNA

ved sds-lysering før 2-DTT eller markaptoetanol-mediert reduksjon av spermer som trenges for isolasjon av sperm-DNA produsere et klarere sperm-DNA-fingeravtrykk. Identifikasjon av voldtekts-forbrytere bør da være mulig ved DNA-fingeravtrykkanalyse av sædprøver og/eller vagina-tamponger.

Det er siden blitt fastslått, i. et nylig utført studium

i ko-operasjon med Dr. Gill, at klare "fingeravtrykk" av sperm-

DNA kan oppnås fra vagina-tamponger etter samleie under anvendelse av en preliminær separasjonsteknikk som generelt er som beskrevet ovenfor.

Fig. 15A viser DNA-fingeravtrykk (gate 3) fra to vagina-tamponger tatt 6,5 h etter samleie. I gate 1 er det vist et fingeravtrykk fra en blodprøve fra den mannlige partner, og i gate 2 er det vist et DNA-fingeravtrykk fra blod oppnådd fra

den kvinnelige partner. Kvinnelige cellekjerner fra tampongene ble preferensielt lysert ved preliminær inkubering i en SDS/proteinase K-blanding. Spermkjerner er ugjennomtrengelige for denne behandling og kan derfor separeres fra den kvinnelige komponent ved sentrifugering. Spermkjerner ble etterpå lysert ved behandling med en SDS/proteinase K/DTT-blanding.

Det er tydelig at denne separasjonsprosess var helt ut vellykket. Sperm-DNA-fingeravtrykkene fra sæd-kontaminerte vagina-tamponger passet perfekt til fingeravtrykk oppnådd fra blodet til den mannlige partner.

DNA- fingeravtrykk fra økonomisk viktige dyr oppnådd ved anvendelse av human- minisatellitt- prober

Eksempler 21- 25

Det ble laget DNA-prøver fra blod tatt fra hunder, katter, får, griser, hester og kveg. 8 yg prøver ble digerert med en passende restriksjons-endonuklease ( Hinfl med mindre annet er angitt), og restriksjonsdigereringene ble utvunnet etter fenolekstraksjon ved etanolutfelling. Restriksjonsdigereringer ble gjenoppløst i vann, elektroforesert gjennom en 0,7%ig agarosegel, denaturert overført til et Schleicher-Schull nitrocellulose-

32

filter og hybridisert som beskrevet tidligere med P-merkede human-minisatellittprober 33.6 eller 33.15.

Eksempel 21

Hunder

DNA-fingeravtrykk oppnådd fra en hundefamilie ved anvendelse av probe 33.6 er vist i fig. 16. De prøver som ble elektroforesert var:

Gate 1. Beagle, far.

Gate 2. Greyhound, mor.

Gater 3, 4, 5. "Greagle"-hvalper fra disse foreldre (henholdsvis hunn, hann og hann).

Et detaljert DNA-fingeravtrykk, i kompleksitet lik dem som stammer fra human-DNA, ble oppnådd fra hver hund. DNA-fingeravtrykkene viste vesentlig variabilitet, hvilket kan sees ved å sammenligne de mønstre som er oppnådd fra faren og moren (gater 1, 2). Alle tre av avkommet har forskjellige DNA-fingeravtrykk, i hvert tilfelle sammensatt av bånd hvorav alle kan spores tilbake til faren og/eller moren. Disse DNA-fingeravtrykk er derfor til nytte ved paternitetstesting og avstamningsanalyse hos hunder, slik som hos mennesker.

DNA i prøvene 1-3 ble svakt nedbrutt og reduserte derved preferensielt intensitetene til de største (langsomst migrerende) bånd. Til tross for denne nedbrytning kunne transmisjonen av bånd fra foreldre til avkom lett bestemmes.

Eksempel 22

Katter

Fig. 17 viser DNA-fingeravtrykk fra en korthåret huskatt-familie under anvendelse av (venstre) probe 33.6 og (høyre) probe 33.15.

Gate 1. mor

Gate 2. far

Gate 3. kattunge

Begge prober 33.6 og 33.15 produserer informative DNA-fingeravtrykk. De fleste bånd i kattungen kan avmerkes som maternalé eller paternale, og således er disse DNA-fingeravtrykk egnet for herkomst-testing såvel som for individuell identifikasjon hos katter.

Eksempel 2 3

Sauer

DNA-fingeravtrykk oppnådd fra forskjellige sauer under anvendelse av prober 33.6 (venstre) og 33.15 (høyre) er vist i fig. 18. Prøvene var:

Gate 1. Crossbred, hunn

Gate 2. Crossbred, hunn

Gate 3. Dorset, hunn

Gate 4. Hampshire x Dorset, hunn

Gate 5. Dorset, hann

Individuell-spesifikke DNA-fingeravtrykk ble oppnådd fra hver sau med begge prober. DNA-fingeravtrykkene er svakere og mindre komplekse enn human-DNA-fingeravtrykk, men stadig til nytte for identifikasjons- og genetiske formål. Probe 33.6 påviser én eller to svært intense polymorfe bånd i hver sau, i. tillegg til et område av svakere bånd. Disse bånd stammer sannsynligvis fra et enkelt minisatellitt-locus som tilfeldigvis viser en svært høy grad av homologi med probe 33.6.

Eksempel 24

Griser og hester

Fig. 19 viser DNA-fingeravtrykk fra tre forskjellige griser (gater 1-3) og tre forskjellige hester (gater 4-6)

(kjønn og rase ikke spesifisert). Begge prober 33.6 og 33.15 produserer individuell-spesifikke DNA-fingeravtrykk med hver art. DNA-fingeravtrykkene, spesielt med probe 33.15, er svake og inneholder svært få bånd sammenlignet med de tilsvarende human-DNA-fingeravtrykk, men allikevel vil den kombinerte bruk av begge prober være til nytte i individuell identifikasjon.

Eksempel 25

Kveg

Fig. 20 viser DNA-fingeravtrykk av HinfI-DNA-digereringer oppnådd med probe 33.6 på en kufamilie og på ytterligere kveg. Prøvene er:

[Gate 1. Human]

Gate 2. Dam

Gate 3. Sire

Gate 4. Kalv av 1 og 2

Gate 5. Angus-okse

Gate 6. Fresian-okse

Som hos sauer, griser og hester, ble et ganske enkelt, men allikevel individuell-spesifikt DNA-fingeravtrykk oppnådd fra hvert dyr. Hos kalven kunne alle bånd spores tilbake til dam og/eller sire, hvilket bekrefter herkomsten til dette dyr.

Fig. 21 viser resultater med probe 33.15 på den samme ku-DNA. Individuelle gater er markert:

1. Dam

2. Sire

3. Kalv av 1 og 2

4. Angus-okse

5. Fresian-okse

[6. Human]

Probe 33.15 produserer et intenst og uoppløsbart-komplekst mønster av hybridiserende DNA-bånd i. ku-DNA digerert med Hinfl.

I en Bg&II-digerering er dette intense signal hovedsakelig begrenset til svært store DNA-fragmenter, hvilket antyder at dette signal stammer fra en klase-dannet sekvens eller region

- mest sannsynlig en konvensjonell satellitt-DNA. Kort auto-radiografi.sk eksponering av Hi nf I-di ger er ingen viser en "sti.ge" av bånd mot bunnen av gelen, med en periodisitet mellom "stige-trinnene" på 45-50 basepar (data ikke vist). Derfor stammer det intense signal mest sannsynlig fra en satellitt med en gjentagelsesenhet som er 45-50 basepar lang. Det intense signal ødelegges i stor grad i ku-DNA digerert med PvuII, Ddel eller Alul, hvilket antyder at satellitt-DNA-gjentagelsesenheten inneholder et eller flere punkter for hver av disse restriksjons-endonukleaser, men ikke for Hinfl eller Bglll. Disse er nøyaktig egenskapene til 1.720 ku-satellitten (E. Poschl og R.E. Streek: "Prototype sequence of bovin 1.720 satellite DNA". J. Mol. Biol. 143, 147-153; 1980) som består av 100.000 tandem-gjentagelser av en 46 basepar-gjentagelsesenhet. Sammenligninger av sekvensen på 1.720-gjentagelsesenheten med kjerneproben 33.6-gjentagelsesenheten og 33.15-gjentagelsesenheten er gitt nedenunder:

Som man kan se, inneholder 1.720-satellitt-gjentagelsesenheten en nær perfekt kopi av 3'-regionen i kjernesekvensen (det som passer sammen er indikert ved<*>ovenfor). Denne region i 1.720-gjentagelsen gir en utmerket tilpassing med gjentagelsesenheten på 33.15, men passer mindre perfekt sammen med 33.6. Dette forklarer hvorfor 1.720-satellitt-DNA påvises av probe 33.15, men ikke 33.6 (fig. 20). (1.720-stalli.tt-gjentagelses enheten (lik den for myoglobin A33-minisatellitten) inneholder for mange nukleotider på hver side av kjernen (H + J i formel (1) > 15) til å tjene som en multilocusprobe i overensstemmelse med oppfinnelsen).

I den hensikt å påvise ku-minisatellitter som hybridiserer til probe 33.15, ble ku-DNA digerert med Alul eller Ddel eller Ddel, for å redusere 1.720-satelli.tten til 46 basepar-monomerer som vil elektroforese fra bunnen av denne gel.

Fig. 21 viser at rene DNA-fingeravtrykk faktisk ble oppnådd for hvert av disse restriksjonsenzymer fra kalv-DNA

(nr. 3). Imidlertid stammer nesten alle disse bånd fra variant-blokker av 1.720 satellitt-DNA innleiret i normal 1.720-DNA, som har mistet Alul og Ddel-punktene i hver gjentagelse (kanskje ved mutasjon av en eller annen av de understrekede baser som er indikert ovenfor, som ville ødelegge de overlappende Alul-og Ddel-punkter). Dette ville føre til følgende fakta: a. Praktisk talt identiske kalve-DNA-fingeravtrykk ble oppnådd under anvendelse av Alul og Ddel.

b. De største fragmenter hybridiserer overensstemmende .mer intenst enn de mindre (siden de inneholder tilsvarende mer 1.720 satellitt-gjentagelsesenheter; det største kalve-DNA-fragment inneholder~440 av disse enheter).

Hos mennesker øker ikke båndintensiteten kontinuerlig med

størrelsen (fig. 21).

c. Nesten alle av kalve-DNA-fingeravtrykkfragmentene blir eliminert av Hhal, som kutter én gang innen 1.720-gjentagelsesenheten (se ovenfor, data ikke vist). d. Siren (nr. 2) har nesten ingen hybridiserende fragmenter i en Alul-digerering. Dette antyder at regionen av 1.720 satellitt-DNA som inneholder disse variant-gjentagelsesblokker er fjernet i dette dyr.

e. Dam (nr. 1)- og kalv (nr. 3)-DNA-fingeravtrykkene er så og si identiske. Damen er sannsynligvis heterozygot for en delesjon, ekvivalent med den som sees hos siren, og har tilfeldigvis transmittert det ikke-deleterte kromosom (og derfor alle bånd) til kalven. Således er alle disse bånd knyttet sammen og ikke transmittert uavhengig inn i avkommet, hvilket forekommer hos mennesker.

Allikevel viser alle fem kvegdyr som ble testet, forskjellige "satellitt"-DNA-fingeravtrykkmønstre, og derfor kan disse uvanlige typer av fingeravtrykk være til nytte i individuell identifikasjon, skjønt ikke for tilveiebringelse av multilocus-markørinformasjon.

Visse prober kan med hell virke der hvor n ikke nødvendig-vis er lik tre i formel (1). I slike prober kan minst ett par av gjentagelser av (J.kjerne.K) bli separert fra minst to ytterligere gjentagelser ved en DNA-sekvens som ikke inneholder noen kjerne. Således kan en tilstrekkelig lang probe bli konstruert i hvilken (J.kjerne.K)-sekvenser er arrangert i par som er separert av "ikke-kjerne"-DNA-sekvenser.

Claims (34)

1. Polynukleotider som har den generelle formel, lest i retningen 5'->-3'

hvor:"kjerne" representerer en sekvens som har minst 6 fort-løpende nukleotider valgt blant hvilke som helst av de følgende sekvenser lest i. samme betydning:

hvor: X er A eller G, Y er C eller T, T = T eller U, m er 0, 1 eller 2, p er 0 eller 1, q er 0 eller 1, n er minst 3; J og K sammen representerer 0-15 ekstra nukleotider innen den gjentagende enhet; og H og L hver representerer 0 eller minst 1 ekstra nukleotid som flankerer de gjentagende enheter, og forutsatt at: (i) "kjerne" og J og K ikke nødvendigvis har den samme sekvens eller lengde i hver (J.kjerne.K) gjentagende enhet; (i.i) "kjerne" også kan representere en variant-kjernesekvens; (iii) totale faktiske kjernesekvenser i alle n gjentagende enheter har minst 70% homologi. med de totale "virkelige" kjernesekvenser som definert ovenfor med hensyn til formlene 2 til 5 1. samme antall n av gjentagende enheter; og polynukleotider fra komplementær sekvens til ovennevnte.

2. Polynukleotider som angitt i krav 1, hvor det totale antall nukleotider som er til stede i. hver (J.kjerne.K) gjentagende sekvens ikke overstiger 25.

3. Polynukleotider som angitt i krav 1, hvor kjerne har et maksimum av 16 nukleotider.

4. Polynukleotider som angitt i krav 1, hvor kjerne representerer en sekvens av minst 7 av nevnte fortløpende nukleotider.

5. Polynukleotider som angitt i krav 1, hvor kjerne representerer en sekvens av minst 12 av nevnte fortløpende nukleoti der.

6. Polynukleotider som angitt i krav 1, hvor kjerne representerer en sekvens av fra 14 til 16 av nevnte fortløpende nukleotider valgt fra den sekvens som er vist i formel (2),

(3) eller (4).

7. Polynukleotider som angitt i hvilket som helst av de foregående krav, hvor de faktiske kjernesekvenser har minst 80% homologi. med virkelige kjernesekvenser.

8. Polynukleotider som angitt i krav 7, hvor J er 0 eller 1 og K er 0 eller 1.

9. Polynukleotider som angitt i, hvilket som helst av de foregående krav, hvor det totale antall nukleotider som er til stede i hver (J.kjerne.K) gjentagende enhet ikke overstiger 20.

10. Polynukleotider med den generelle formel, lest i retningen 5' ->-3 1

hvor: "kjerne" representerer en sekvens av fra 6 til 16 fortløpende nukleotider, lest i. samme betydning, valgt fra (1) den vanlige kjerneregion i. en første human- eller ani.mal-mi.nisatellitt oppnådd ved probing av human- eller animal-genomi.sk DNA med en probe som inneholder en myoglobin-tandem-gjentagende sekvens av tilnærmet 33 nt pr. gjentagende enhet (2) den vanlige kjerneregion i en annen human- eller animal-minisatellitt oppnådd ved å probe human- eller animal-DNA med en probe som inneholder en tandem-gjentagende sekvens omfattende (1) (3) den vanlige kjerneregion i en tredje human- eller animal-minisatellitt oppnådd ved å probe human- eller animal-genomi.sk DNA med en probe som inneholder en tandem-g jentagende sekvens omfattende (2) idet hver nevnte tandem-gjentagende sekvens er en gjentagelse av minst 3 enheter, og polynukleotider av komplementær sekvens til ovennevnte.

11. Polynukleotider som har den generelle formel,lest i retni ngen 5' -»-3'

hvor: "kjerne" representerer hvilken som helst av de sekvenser som har minst 6 fortløpende nukleotider fra innen en vanlig kjerneregion av et flertall av minisatellitter av human- eller animal-genomisk DNA som viser minst 75% konsensus; "kjerne" har ikke nødvendigvis den samme sekvens i hver gjentagende enhet, og alle andre symboler er som definert i krav 1, og polynukleotider av komplementær sekvens til ovennevnte.

12. Polynukleotider som har minst 3 gjentagelser av en sekvens av fra 6 ti l 36 nt inklusive en fortløpende (5 1 -»-3 1) -kjernesekvens valgt blant:

hvor P = ikke G, W = A eller T eller U og X = A eller G eller en variant derav, forutsatt at de totale faktiske kjernesekvenser i alle gjentagelser har minst 70% homologi med de totale "virkelige" kjernesekvenser definert med hensyn til formel (6) i. samme antall gjentagelser, og polynukleotider av komplementær sekvens til ovennevnte.

13. Polynukleotider som angitt i krav 12, hvori hver gjentagelse eller variant-gjentagelse inkluderer sekvensen av formel (6).

14. Polynukleotider som angitt i hvilket som helst av de foregående krav, hvor den fortløpende (5 1 -»-3 ')-sekvens :

er beholdt i alle gjentagende enheter, idet P og W har de betydninger som er gitt i krav 12.

15. Polynukleotider som angitt i. hvilket som helst av de foregående krav, hvor den fortløpende (5 '-»-3 1 )-sekvens :

er beholdt i alle gjentagende enheter, og T = T eller U.

16. Polynukleotider som angitt i hvilket som helst av kravene 12-15, hvor P er T eller U.

17. Polynukleotider som angitt i hvilket som helst av kravene 12-16, hvor W er A.

18. Polynukleotider som angitt i. hvilket som helst av kravene 12-17, hvor den beskrevne fortløpende kjernesekvens eller bevarte sekvens er identisk med den gjentagende sekvens.

19. Polynukleotider som har minst 3 gjentagelser inklusive den fortløpende 5 '-*3 '-k j ernesekvens

hvor P = ikke G, W = A eller T eller U og X = A eller G eller en variant derav, forutsatt at de totale faktiske kjernesekvenser i alle gjentagelser har minst 70% homologi med de totale "sanne" kjernesekvenser definert med hensyn til formel (7) i samme antall gjentagelser, og polynukleotider av komplementær sekvens til ovennevnte.

20. Polynukleotider som angitt i krav 19, hvor W ved 5'-enden er A og ved 3'-enden er T eller U.

21. Fremgangsmåte for fremstilling av et polynukleotid som har polymorfe minisatellitt-lengde-spesifikke bindings-karakteristika, omfattende (i) å identifisere en naturlig tandem-gjentagende sekvens i DNA som har evne til begrenset hybridisering til andre polymorfe DNA-regioner, (ii) å identifisere en naturlig konsensus-kjernesekvens i den gjentatte sekvens putativt ansvarlig for slik binding, og (ili) isolere eller på kunstig måte bygge opp en perfekt eller imperfekt tandem-gjentagende sekvens som stammer fra den naturlige konsensus-kjernesekvens som har minisatellitt-bindingsegenskaper som viser lavere genom-locus-spesifisitet og høyere polymorf fragment-akseptans enn den naturlige gj entagelsesekvens.

22. Fremgangsmåte som angitt i krav 21, hvor polynukleotidet er som definert i hvilket som helst av kravene 1-20.

23. Polynukleotidprobe anvendelig i genetisk opprinnelses-bestemmelser i human- eller animal-DNA-holdige prøver, omfattende, sammen med innlemmelsen av en merket eller markør-komponent, et polynukleotid som omfatter minst tre tandem-gjentagelser (inklusive varianter) av sekvenser som er homologe med en minisatellittregion i human- eller animal-genomet til en grad som muliggjør hybridisering av proben til et tilsvarende DNA-fragment oppnådd ved fragmentering av DNA-prøven med en restriksjons-endonuklease, karakterisert ved at: a) gjentagelsene hver inneholder en kjerne som er minst 70% homolog med en konsensus-kjerneregion av lignende lengde til stede i et flertall av mini satellitter fra forskjellige genomiske loci; b) kjernen er fra 6 til 16 nukleotider lang; c) det totale antall nukleotider i den gjentagende enhet som ikke bidrar til kjernen er ikke mer enn 15.

24. Probe som angitt i krav 23, hvor kjernen inneholder den 5'-^ 3' fortløpende sekvens:

hvor P = ikke G; W = A eller T eller U.

25. Probe som angitt i krav 23, hvor polynukleotidet er et polynukleotid som angitt i hvilket som helst av kravene 1-20, idet minst de gjentagende enheter er i. enkeltstrenget form.

26. Polynukleotidprober som består av merkede polynukleotider som definert i. hvilket som helst av kravene 1-20, hvor minst de gjentagende enheter er i. enkeltstrenget form.

27. Prober som angitt i hvilket som helst av kravene 23-26, helt i enkelt-strenget form.

28. Fremgangsmåte for fremstilling av en probe som er anvendelig ved genetisk opprinnelsesbestemmelse i human- eller animal-DNA-holdige prøver, som omfatter å innføre en merking eller markør i et polynukelotid i henhold til hvilket som helst av kravene 1-20 eller som fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til krav 21.

29. Fremgangsmåte for å identifisere en prøve av human- eller animal-genomisk DNA som omfatter å probe nevnte DNA med en probe i henhold til hvilket som helst av kravene 23-27 og påvise hybridiserte fragmenter i nevnte DNA.

30. Fremgangsmåte som angitt i krav 29, hvor fragmentene som er påvist oppnås ved å spalte DNA-prøven med restriksjonsenzym(er) som ikke skadelig spalter tandem-gjentagelses-sekvensene derav.

31. Fremgangsmåte som angitt i. krav 29 eller 30, i hvilken det gjøres sammenligning mellom mønstere av positive fragmenter oppnådd ved å anvende minst to forskjellige prober i henhold til hvilket som helst av kravene 23-27.

32. Probe som er locus-spesifikk for en minisatellittregion i det human- eller animal-genom som er forbundet med arvet sykdom, abnormalitet eller trekk og oppnådd ved isolering av en slik sykdom, abnormalitet eller trekk-assosiert bånd observert ved sammenligning av individuelle mønstere produsert av en eller flere prober i henhold til hvilket som helst av kravene 23-29 i en familie- eller genealogi-analyse.

33. Probe som stammer fra et fingeravtrykkbånd oppnådd ved anvendelse av en eller flere prober i henhold til hvilket som helst av kravene 23-27, og observert å være assosiert med en kromosom- eller DNA-abnormalitet assosiert med cancer.

34. Modifikasjon av proben i henhold til hvilket som helst av kravene 23-27 eller 33 i hvilken minst ett par av tandem-gjentagelser av (J.kjerne.K) er adskilt fra minst to ytterligere gjentagelser ved en sekvens som ikke inneholder noen kjerne, hvorved n ikke nødvendigvis er lik tre, idet alle andre begrensninger er til stede.