HU203795B - Process for identificating dns and for producing polynucleotides as test materials - Google Patents

Process for identificating dns and for producing polynucleotides as test materials Download PDF

Info

Publication number
HU203795B
HU203795B HU855064A HU506485A HU203795B HU 203795 B HU203795 B HU 203795B HU 855064 A HU855064 A HU 855064A HU 506485 A HU506485 A HU 506485A HU 203795 B HU203795 B HU 203795B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
dna
core
sequence
fragments
fragment
Prior art date
Application number
HU855064A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT46078A (en
Inventor
Alec John Jeffreys
Original Assignee
Lister Preventive Med
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27449602&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU203795(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GB848428491A external-priority patent/GB8428491D0/en
Priority claimed from GB858505744A external-priority patent/GB8505744D0/en
Priority claimed from GB858518755A external-priority patent/GB8518755D0/en
Priority claimed from GB858522135A external-priority patent/GB8522135D0/en
Application filed by Lister Preventive Med filed Critical Lister Preventive Med
Publication of HUT46078A publication Critical patent/HUT46078A/hu
Publication of HU203795B publication Critical patent/HU203795B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás olyan polinukleotidok előállítására, amelyek hibridizációs tesztanyagként (a továbbiakban próbaként) szolgálhatnak humán vagy állati genomok vizsgálatához, valamint eljárás genomi DNS azonosítására ilyen hibridizációs próbákkal. Az azonosítási módszer hasznos - például - apasági és anyasági vizsgálatoknál, a törvényszéki orvostanban, valamint a genetikai betegségek és a rák diagnosztizálásában.
A genetikai változatosság kimutatására szolgáló legelterjedtebben használt módszer a restrikciós fragmentek méretbeli polimorfizmusának vizsgálatán alapúi (RFLP-restriktion fragment length polymorphism). Lásd, például, a Huntington szindróma kialakulásáért felelős hibás DNS-lókusz azonosítását (J. F. Gusella és mtsai, Natúré 306, 234-238, 1983), valamint a retinoblasztomára való hajlam elemzését (W. K. Cavanee és mtsai, Natúré 305,779-784,1983).
A legtöbb RFLP olyan kismértékű DNS-szerkezetváltozásokon - általában báziskicserélődésen - alapul, amelyek új specifikus restrikciós endonukleáz-hasítóhelyeket hoznak létre, vagy meglévő hasítóhelyeket szüntetnek meg. Mivel a humán DNS átlagos heterozigoticitása alacsony (kb. 0,001 bázispáronként), egy adott lókuszon belül ritkán lehet RFLP-t kimutatni.
Ha egy RFLP-t egyáltalán sikerül kimutatni, a heterozigótaság akkor is többnyire csak dimorfizmusként jelentkezik (egy restrikciós endonukleáz-hasítóhely megléte vagy hiánya), s mivel a heterozigótaság az allélok gyakoriságától függ, ezért a heterozigótaság ilyen esetekben sohasem haladhatja meg az 50%-ot, de általában annál lényegesen alacsonyabb. Emiatt az ilyen RFLP-k kevés információt nyújtanak családfavizsgálatoknál minden olyan esetben, ha egy kritikus személy homozigóta.
A genetikai analízis nagymértékben egyszerűsíthető, amennyiben olyan DNS-szakaszokhoz rendelkezünk hibridizációs próbákkal, amelyek multiallelikus variációt, és ennek következtében magas heterozigoticitást mutatnak. Ilyen régiót először A. R. Wyman és mtsai izoláltak véletlenszerűen egy emberi DNS-ből előállított génkönyvtárból (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 67546758, 1980). Ebben a lókuszban a multiallelikus varáció szerkezeti alapjai még tisztázatlanok. Ezt követően - ismét véletlenszerűen - több más rendkívül variábilis régiót is felfedeztek a humán inzulingén közelében (G. J. Bell és mtsai, Natúré 295, 31-35, 1982), a zétaglobin-gének közelében (N. J. Proudfoot és mtsai, Cell 31, 553-563, 1982 és S. E. Y. Goodboum és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,5022-5026), valamint a c-Ha-ras-1 onkogén közelében (D. J. Capon és mtsai, Natúré 302, 33-37, 1983). A variábilis régió minden esetben egy rövid szekvenciarészlet tandem ismétlődéséből áll (ún. „miniszatellit”-szekvencia), és a polimorfizmust az ismétlődések számának allelikus különbözősége okozza. Ez az allelikus különbség feltehetően a mitózis vagy meiózis során lejátszódó egyenlőtlen DNS-kicserélődés, vagy a replikáció alatti DNS-csúszás következménye. Az így kialakuló miniszatellithossz-variáciő bármely olyan restrikciós endonukleáz segítségével kimutatható, amelynek az ismétlődési egységen belül nincs hasítóhelye.
A feltaláló és munkatársai 1984-ben beszámoltak egy 33 bázispáros szekvenciarészlet négyszeres tandem ismétlődéséből álló miniszatellit-régió felfeldezéséről, amely a humán mioglobingén egyik intronjában található (P. Weller és mtsai, EMBO J. 3, 439-446, 1984). Kimutatták, hogy a 33 bázispáros ismétlődő egység csekély szekvencia-homológiát mutat a fent említett, mások által jellemzett többi humán miniszatellittel. A cikkben hangot adtak annak a feltételezésnek, hogy a miniszatellit-régiók transzpozíciós események során is keletkezhettek. Amennyiben a 33 bázispáros ismétlődő egység transzponábilis elem lenne, akkor ezt az egységet hibridizációs próbaként használva lehetőség nyílna új tandemismétlődéseket tartalmazó régiók felfedezésére a humán genomban, s ezek a régiók gyakran kapcsolatosak multiallelikus polimorfizmussal, az ismétlődések számának különbözősége miatt.
A feltaláló és munkatársai hibridizációs vizsgálatokat végeztek humán genomi DNS-en a mioglobingénből származó 33 bázispáros szekvenciarészlet tandemismétlődéseit tartalmazó hibridizációs próba segítségével. Három személy (apa, anya, leányuk) genomi DNSének több különböző régiójában polímorfikus variáció meglétét mutatták ki. A varicáió a nagyobb fragmentek (2-6 kilobázis) tartományában jeletkezett. Az adatok több miniszatellit-régió hosszának változékonyságában megnyilvánuló, stabilan öröklődő polimorfizmusra utalnak.
További vizsgálatok azt mutatták, hogy lehetséges olyan hibridizációs próbával vizsgálni a genomi DNS-t, amely sokkal hatékonyabban mutatja ki a miniszatellit, vagy hipervariábilis régiók változékonyságát, mint a mioglobingénből származó, 33 bázispáros ismétlődő egységet tartalmazó próba.
A találmány azon a felfedezésen alapul, hogy az emberi és állati genomi DNS-ek sok miniszatellit-régiója tartalmaz egy olyan szekvenciarészletet, amely nagy homológiát mutat a többi miniszatellit megfelelő részletével. Ez a közös, ún. „core”-régió rövid, kb. 16 bázispár hosszúságú. Azt találtuk, hogy egy hibridizációs próba, melynek fő alkotórésze egy olyan szekvenciarészlet, amely legalább háromszoros tandemismétlődésként tartalmaz egy rövid „core”-szekvenciát, sok különböző miniszatellit-régiót képes azonosítani a genomi DNS-ben, olyan nagy pontossággal, ami lehetővé teszi az egyének „ujjlenyomat megbízhatóságú” genetikai azonosítását, DNS-ük megfelelő régióiban található különbözőségük alapján. Ez a kiváló eredmény rendkívül váratlan volt, mivel a korábbi kutatások csak olyan hibridizációs próbákat eredményeztek, amelyek mindössze egy-egy miniszatellit-régió kimutatását tették lehetővé. Ezek a korai hibridizációs próbák is jobb lehetőséget adtak a genetikai azonosításra, mint az RFLP-vizsgálatok, de ez az azonosítás nem volt „ujjlenyomat pontosságú, egyénenként tökéletesen jellemző és különböző. Jellemzően azt találtuk, hogy a jelenleg használt „core-hibridizációs próba képes különb-21
HU 203 795 Β séget tenni különböző DNS-minták között több különböző miniszatellit, vagy hipervariábilis fókusz alapján, s ez az a felfedezés, amely a találmányt szokatlan mértékben újszerűvé és fontossá teszi, valamint alapvető tudományos újdonsággal ruházza fel.
Az ún. „core”-szekvencia ismerete lehetővé teszi, hogy olyan DNS-hibridizációs próbákat állítsunk elő, melyek egyidejűleg képesek hibridizálni a genom több különböző fókuszából származó miniszatellit-régiókkal. Mindazáltal a „core”-szekvencia felismerése és azonosítása önmagában nem elegendő egy jól használható hibridizációs próba előállításához. Ehhez az is szükséges, hogy olyan polinukleotidokat állítsunk elő, amelyek a „core”-szekvenciának vagy származékainak tandemismétlődéseit tartalmazzák. Ilyen hibridizációs próbákhoz juthatunk humán vagy állati DNS miniszatellit-régióinak izolálása által, de szintetikusan is előállíthatjuk azokat. Az is fontos, hogy ismerjük azokat a járulékos feltételeket, melyek a hibridizációs kísérletek sikerét befolyásolhatják. Szükséges például ismernünk, hogy milyen mértékű homológiát kell mutatnia a hibridizációs próba ismétlődő egységének a konszenzus„core”-szekvenciával, valamint azt is, hogy milyen hosszú „nem-core”-szekvenciarészlet fordulhat elő a hibridizációs próba ismétlődő egységében, akár a „core”-szekvenciába ékelődve, akár azt szegélyezve.
A találmány tehát magában foglalja azon felismeréseket, (1) hogy bármely „core”-szekvencia ismerete a fent leírt módon hasznosítható, ezen belül (2) a genom különböző hipervariábilis fókuszainak vizsgálata során különböző „core”-szekvenciákat találhatunk, amelyek bizonyos, meghatározott mértékű homológját mutatnak egy elméletileg megadható konszenzus-„core”-szekvenciával;
(3) előállítható DNS-hibridizációs próbáknak egy olyan családja, melynek minden tagja különböző polimorfizmus-spektrumot ismer fel egy adott genomban;
(4) egy bizonyos szempont szerinti genetikai osztályozásra a különböző hibridizációs próbák különböző mértékben alkalmasak;
(5) amennyiben bármely szempont szerinti genetikai osztályozáshoz egynél több hibridizációs próbát alkalmazunk, az azonosítás valószínűsége megnő;
(6) a sikerrel alkalmazható hibridizációs próbák első generációjának további tanulmányozása által egyszerűbb és jobban használható hibridizációs próbák állíthatóak elő, például szintetikus úton.
A találmány tárgya tehát egyrészt egy olyan eljárás, melynek segítségével polimorfikus, miniszatellithosszspecifikus kötési sajátosságokkal rendelkező polinukleotid hibridizációs próbákat állíthatunk elő. Az eljárás a következő főbb lépéseket foglalja magában:
a) természetes, tandemismétlődést mutató DNSszekvencia azonosítása, amely kis mértékben hibridizálni képes más polimorfikus DNS-régiókhoz,
b) a kismértékű hibridizációéit feltehetően feleld®, természetes konszenzus-„core”-szekvencia azonosítása az ismétlődő egységen belül
c) olyan, a természetes konszenzus-„core”-szekvenciából származó, tökéletes vagy nem tökéletes tandemismétlődéseket tartalmazó polinukleotid hibridizációs próbák izolálása vagy mesterséges felépítése, melyek miniszatellitkötő képessége kisebb genomlókusz-specifitást és nagyobb polimorfikus fragmentumtűrést mutat, mint a természetes ismétlődő szekvenciáé.
A hibridizációs próba „core”-szekvenciáját többféle definícióval is meg lehet határozni bizonyos alapvető irányelvek alapján. A legfontosabb ilyen alapelv az, hogy a hibridizációs próba ismétlődő egysége részben vagy egészében tartalmazzon egy közös „core”-régiót, amely megtalálható az emberi vagy állati genomi DNS különböző miniszatellit-régióban. A közös „core”-régió abban az értelemben „közös”, hogy a különböző miniszatellitekben található „core”-részletek nagy mértékben konszenzus (azaz megegyező) szekvenciák, például legalább 80%-os homológia van közöttük. Ezek a miniszatellit-régiók kimutathatóak például úgy, hogy a genomi DNS-fragmentumokat a mioglobingén 33 bázispáros ismétlődő szekvenciájával hibridizáltatjuk. Az ily módon hibridizáló fragmentumokat a leírásban „λ33 pozitív” fragmentumoknak nevezzük. Ezek a fragmentumok és a mioglobingén 33 bázispáros ismétlődő egysége kb. 16 bázispár hosszú közös „core”szekvenciát tartalmaznak. A λ33 pozitív fragmentumok maguk is használhatók hibridizációs próbaként, és amennyiben ezeket genomi DNS-hez hibridizáltatjuk, újabb olyan fragmentumokat azonosíthatunk, melyek szintén tartalmazzák a közös „core”-szekvenciát, bár lehetséges hogy kisebb-nagyobb eltéréssel.
Egy másik alapelv az, hogy a „core”-nukleotid-szekvenciaiészlet nem lehet olyan rövid, hogy ne hibridizáljon hatékonyan a minta-DNS miniszatellit-régióihoz, de olyan hosszú sem lehet, hogy ne mutassa jól ki a polimorfizmusokat Ez például akkor fordul elő, ha a próba túlságosan hasonló a mioglobingén 33 bázispáros tandemismétlődéseket tartalmazó szakaszához. Általánosan: a „core”-szekvencia hossza 6 bázispártól 16 bázispárig kell hogy tegedjen, mivel a miniszatellit-régiók közös „core”-szekvenciája maximálisan kb. 16 bázispár hosszú. A hibridizációs próba ismétlődő egysége nem szükséges, hogy teljes egészében tartalmazza a közős „core-szekvenciát, és tartalmazhat szegélyező „fanking” nukleotidokat a „core”-szekvenciarészlet mindkét oldalán. Nem szükséges, hogy az isiöétlődő egységek egy hibridizációs próbán belül tökéletesen azonosak legyenek, lehetnek kis különbségek az égységek között mind a bázispárok számában, mind azok milyenségében, a „core”- és „nem-core”-szekvenciarészletekben egyaránt. Az egyszerűség szempontjából mégis célszerű az egységeket ismétlődő egységeknek nevezni, megjegyezve azonban, hogy ez csak megközelítő meghatározás. Egy n darab ismétlődő egységet tartalmazó szekvenciarészletet mindkét oldaláról szegélyezhet bármilyen nukleotidszekvencia, s a szegélyezőszekvenciák mérete és milyensége általában lényegtelen.
A találmány szerinti polinukleotidok a következő definíciók bármelyikével megadhatóak;
HU 203 795 Β
ELSŐ DEFINÍCIÓ
A következő általános képlettel megadható polinukleotidok, ahol a leolvasás iránya 5’->3’:
H.(J.core.K)„.L (1) ahol:
a „core” olyan, legalább 6 egymást követő nukleotidból álló szekvenciát jelent, amely a következő fentivel megegyező leolvasási irányban megadott szekvenciák egyike:
GGAGGTGGGCAGGAXG (2)
AGAGGTGGGCAGGTGG (3)
GGAGGYGGGCAGGAGG (4)
T(C)mGGAGGAXGG(G)pC (5A)
T(C)mGGAGGA(A),GGGC (5B) ahol:
X=A vagy G, Y-C vagy T, m-0,1 vagy 2, p-0 vagy 1, n-legalább 3;
J és K együttesen 0-15 nukleotidhosszúságú szegélyezőszekvenciát jelent az ismétlődő egységen belük,
H és L értéke 0, vagy legalább 1 további nukleotidot jelent, melyek az ismétlődő egységet szegélyezik, azzal a kiegészítéssel, hogy
a) „core”, J és K nem feltétlenül azonos hosszúságú és összetételű szekvenciarészletet jelöl minden egyes (J.core.K) ismétlődő egységben;
b) „core” jelenthet egy variáns „core”-szekvenciát is,
c) az n darab ismétlődő egységben ténylegesen jelen lévő összes „core”-szekvencia legkevesebb 70% homológiát mutat az n darab ismétlődő egységben található összes „valódi core”-szekvenciával, melyet a fent megadott képletek (2-5) segítségével definiálhatunk;
és a fentiekben definiált összes polinukleotid komplementere.
MÁSODIK DEFINÍCIÓ
A következő általános képlettel megadható polinukleotidok:
H.(J.core.K)„.L (1) ahol:
a „core” olyan 6-16 db egymást 5*—>3* irányban követő nukleotidból álló szekvenciát jelent, amely megtalálható
a) egy emberi vagy állati miniszatellit közös „core”szekvenciájában (5 *—>3’ irányban), melyet úgy nyerhetünk, hogy humán vagy állati genomi DNS-t olyan hibridizációs próbával vizsgálunk, amely tartalmazza a mioglobingénből származó tandemismétlődést mutató szekvenciaiészletet, ahol az ismétlődő egység közelítőleg 33 nukleotidból áll,
b) egy második humán vagy állati miniszatellit közös „core”-szekvenciájában (5’-+3’ irányban), melyet úgy nyerhetünk, hogy a humán vagy állati DNS-t olyan hibridizációs próbával vizsgáljuk, ami olyan tandemismétlődő szekvenciát tartalmaz, melyben megtalálható az előbbi miniszatellit közös „core”-régiója, vagy
c) egy harmadik humán vagy állati miniszatellit közös „core”-szekvenciájában (5’-»3’ irányban), melyet úgy nyerhetünk, hogy á humán vagy állati DNS-t olyan hibridizációs próbával vizsgáljuk, ami olyan tandemis4 métlődő szekvenciát tartalmaz, melyben megtalálható a második miniszatellit közős „core”-régiója, ahol minden említett tandemismétlődő szekvencia legalább 3 ismétlődő egységet tartalmaz, és a fentiekben definiált összes polinukleotid komplementere.
HARMADIK DEFINÍCIÓ
A következő általános képlettel megadható polinukleotidok:
H.(J.core.K)„.L (1) a „core” bármely olyan, legalább 6 egymást követő nukleotidból álló szekvenciát jelent, mely egy humán vagy állati genomi DNS-ből származó miniszatellit közös „core”-régiójának belsejében megtalálható, amely miniszatellit legalább 75%-ban, előnyösen 80%-ban konszenzus;
a „core” nem feltétlenül jelöl minden ismétlődő egységben azonos szekvenciát, minden más jel a fent megadottak szerint értelmezendő, és a fentiekben definiált összes polinukleotid komplementere.
NEGYEDIK DEFINÍCIÓ
Olyan polinukleotidok, melyek legalább háromszoros ismétlődésben tartalmaznak egy 6-16 nukleotidból álló szekvenciát, amely magában foglal egy egymást követő (5’—>3’) nukleotidokból álló „core”-szekvenciát, amely a következő általános képlettel adható meg:
(5’) GPGGGCWGGWXG (3’) (6) ahol: P-nem G, W-A vagy T és X-A vagy G a fenti „core”-szekvencia a képlettel megadottól kissé el is térhet, feltéve, hogy az Összes ismétlődésben jelen lévő teljes „core”-szekvencia legalább 70%-os homológiát mutat ugyanannyi ismétlődő egység esetén, a (6) képlet alapján felírható „igazi core-szekvenciával, és a fentiekben definiált összes polinukleotid komplementere.
A fenti képletekben és mindenütt a továbbiakban a szekvenciák a szokásos 5*—»3* irányban vannak megadva.
A találmány vonatkozik minden DNS, RNS és bármely más olyan polinukleotidra, amely képes hibridizálni DNS-hez. A fentiekben definilált polinukleotidok jelöletlenek és lehetnek mind kettős szálú (ds) mind egyes szálú (ss) formában.
A találmány vonatkozik mind egyes szálú jelölt polinukleotidokra - melyek hibridizációs próbaként használhatóak - mind azok jelölt, kettős szálú prekurzoraira, amiből az egyes szálú hibridizációs próbák előállíthatóak.
Az oligonukleotidok előnyösen 32P izotóppal jelölhetőek bármely hagyományos eljárás szerint, de más egyéb, a hibridizációs irodalomban jól ismert módon is jelölhetőek, például biotinnal vagy hasonló vegyűlettel D. C. Ward és mtsai módszere szerint, melynek leírása következő kötetben található: Procecdings of the 1981. ICN-UCLA Symposium on Developmental Biology using Purified Genes held in Keystone, Colorado on
HU 203 795 Β
March 15-20,1981 ΧΠΙ. kötet (1981) 647-658. oldal, Academic Press; szerkesztő: Donald D. Brown és mtsai., de jelölhetők enzimmel is, A. D. B. Malcolm és mtsai módszere szerint: Abstracts of the 604 th Biochemical Society Meeting, Cambridge, England (az 1983. július 1-i konferencia anyaga).
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan polinukleotid hibridizációs próbák, amelyek emberi vagy állati eredetű DNS- tartalmú minták eredetének meghatározására használhatóak, a találmány tehát e másik szempont szerint olyan polinukleotid hiridizációs próbákat ír le, jelzett, illetve marker komponenst is beleértve, amelyek emberi vagy állati eredetű DNS-tartalmú minták genetikai származásának meghatározásához használhatók. A hibridizációs próba olyan polinukleotidból áll, amely (a variánsokat is beleértve) legalább háromszoros tandemismétlődésben tartalmaz olyan szekvenciákat, melyek az emberi vagy állati genom valamely miniszateilit-régiójával olyan mértékű homológiát mutatnak, ami tehetővé teszi, hogy a hibricizációs próba egy megfelelő DNS-fragmentumhoz hibridizáljon, melyet a minta-DNS restrikciós endonukleázzal történő emésztése útján nyerünk, oly módon, hogy:
a) minden ismétlődés tartalmaz egy ún. „core”-szekvenciát, amely legalább 70%-ban homológ egy hasonló hosszúságú ún. konszenzus-„core”-szekvenciával, amely a különböző genomi lókuszokból származó miniszatellitek többségében jelen van;
b) a „core”-szekvencia 6-16 nukleotidhosszúságú;
c) egy ismétlődő egységen belül a „core”-szekvenciához nem tartozó nukieotidok száma összesen nem haladja meg a 15-öt.
A találmány magában foglal egy emberi vagy állati genomi DNS-minta azonosítására szolgáló eljárást is, miszerint az említett DNS-mintát a találmány tárgyát képező próbával hibridizáltatjuk, majd a hibridizáló fragmenteket kimutatjuk.
A találmány eszerint magában foglalja: a cellurális anyagból származó teljes DNS-minta restrikciós endonukleázzal történő emésztését, a rendkívül variábilis DNS-fragmentumok hibridizációját a fent definiált hibridizációs próbával, amely jelölt, vagy marker komponenst és egy ismétlődő „core”-komponenst tartalmaz, és a különböző hosszúságú DNS-fragmentumokhoz kötődött jel, vagy marker mennyiségének meghatározását, vagy általánosabban: a különböző molekulaméreteknek megfelelő csíkokhoz kötött jel, vagy marker mennyiségének meghatározását.
Általában a fragmentált DNS-mintát hibridizáció előtt a fragmentumok lánchosszúsága alapján szétválasztjuk, illetve csoportosítjuk, például gélelektroforézis útján, és a marker koncentrációját úgy választjuk meg, hogy a kapott mintázat, melynek egyes elemei jellemző genetikai eredetűek, jellegzetes legyen.
Definíciók
A leírásban és a fenti meghatározásokban használt fogalmakat az alábbiakban határozzuk meg.
Hipervariábilis
A humán, vagy állati DNS egy azonosított lókuszának, vagy helyének bizonyos régióját akkor nevezzük hipervariábilisnak, ha az sok különböző formában fordul elő, például hosszát, vagy szekvenciáját tekinteve.
Restrikciós fragmentumhossz-polimorfizmus (RELP)
Az RFLP elektrofoiézissel elválasztott humán, vagy állati DNS-fragmentumok és egy bizonyos próba hibridizációja útján kimutatott mintázat genetikai variációja.
Polimorfikus
Azt a gént, vagy más DNS-szakaszt, amely egyénről egyénre különböző, polimorfikusnak nevezzük.
Ismétlődés, vagy tandemismétlődés (tandemismétlődő szekvencia)
Olyan polinukleotid-szekvencia, amely pontosan, vagy pontatlanul többszörösen ismétlődik.
Miniszatellit
A humán, vagy állati DNS olyan régiója, amely egy rövid DNS-szekvencia tandemismétlődéseiből áll. Nem szükséges, hogy minden ismétlődő egység tökéletesen azonos tegyen.
Tökéletes ismétlődés (tökéletes ismétlődéses szekvencia)
Olyan szekvenciarészlet, amely egy adott szekvencia pontos másolataiból áll, ez általában egy „core”szekvencia, vagy egy olyan ismétlődő egység, amelyik „core -szekvenciát tartalmaz.
Konszenzus-,, core” -(szekvencia)
Az a szekvencia, amellyel több különböző ismétlődő szekvencia a tehető legnagyobb egyezést mutatja; általában két, vagy több különböző fókuszból származó restrikciós fragmentum ismétlődési egységeinek összevetése alapján határozzák meg.
Pontatlan ismétlődés (pontatlan ismétlődéses szekvencia)
Olyan szekvencia, amelyben nem tökéletesen ismétlődik az ismétlődési egység a nukieotidok számát, vagy milyenségét illetően, de észrevehetően egy konszenzus-szekvencia ismétlődéseiből áll; mégpedig egy „core”-szekvencia, vagy egy „core”-t tartalmazó ismétlődési egység ismétlődéseiből.
Variáns
Olyan szekvencia, amely egy bizonyos ismétlődő szekvenciától kismértékben különbözik (több mint 50%-os a homológia).
„ Core ” -(szekvencia)
Eredeti jelentése szerint a konszenzus ismétlődő szekvencián belüli rövid, egyértelmű DNS-szekvenciarészlet, amely minden olyan restrikciós fragmentumban megtalálható, melyeket a konszenzus ismétlődő szekvencia meghatározásánál felhasználtunk, és jelen van az ezekkel hibridizálő miniszatellitben is. Értelme5
HU 203 795 Β zését kiterjesztettük az előbbiek alapján származtatott további ismétlődő szekvenciákra is, lásd pl. kifejezett „core- szekvencia (következő definíció).
Kifejezett „core-(szekvencia)
Olyan „core”-szekvencia, amely teljes hosszában pontosan megegyezik a (2)-(8) képletekkel megadott szekvenciák valamelyikével.
%-os homológia
Két szekvenciarészlet összehasonlításakor azon bázispárok számát, melyeket az egyik szekvenciában ki kell cserélni, hogy pontosan megkapjuk a másikat, kivonjuk az összes bázispárok számából, s a kapott eredményt az összes bázispárok százalékában adjuk meg.
A nukleotid (nt) és bázispár (bp) kifejezéseket azonos jelentéssel használjuk. Mindkettő vonatkozhat DNS-re és RNS-ie egyaránt. A C, A, G, T rövidítéseket a hagyományos módon, a következő értelemben használjuk: C-(dezoxi)citidin, A-(dezoxi)adenozin, G-(dezoxi)guanozin, T-(dezoxi)timidin vagy uridin.
Ezek alapján tehát a tandemismétlődő szekvencia (akár mesterséges, akár természetes eredetű) lehet tökéletes ismétlődés is, de jellemzőbben pontatlan ismétlődés. Jellemezőén legalább két ismétlődés a konszenzus-„core”-szekvencia pontatlan ismétlődése. A hibridizációs próba jellemezőén legalább három ismétlődést tartalmaz, és még jellemezőbben legalább hetet.
A hibridizációs próba előállítása történhet egy természetes miniszatellit-szekvencia izolálásával, klónozás és DNS- szekvenálással történő azonosítás útján. Az előállítás magában foglalhatja a kívánt „core”-szekvencia kivágását és tandemismétlődéssé alakítását. Pontatlan ismétlődések kialakulását úgy segíthetjük elő, ha az eljárás során különböző eredetű „core”-szekvenciákat építünk össze. Az eljárást a kialakított polinukleotid klónozását is magában foglalhatja. Másrészt, a felépítő lépés magában foglalhatja az azonosított konszenzus-„core”-szekvenciának, vagy valamely fragmentumának szintézisét is. A konszenzus-„core”szekvencia jellemzőén nem kevesebb mint 6 bázispárt, és jellemzően nem több mint 16 bázispárt tartalmaz. A szintetikus „core”-szekvenciából ezután tandemismétlődéseket hozunk létre.
Természetesen a kialakított polinukleotid a jól és kevésbé jól használható köztitermékek klónozását követő különböző időben végrehajtott műveletek sorozatának lehet eredménye, és tartalmazhat mind természetes, mind szintetikus eredetű fragmentumokat is, így lehet, hogy végül meglehetősen csekély hasonlóságot mutat az eredeti miniszatellit-fragmentummal.
A találmány tárgyát képező hibridizációs próbák a következő területeken hasznosíthatóak:
1. Emberi apasági és anyasági vizsgálatok.
2. Családcsoport-azonosítás, pl. bevándorlási és örökösödési viták eldöntése.
3. Egy-, vagy többpetéjűség eldöntése ikreknél.
4. Emberi vérfertőzés kimutatása.
5. Általános emberi családfavizsgálatok.
6. Öröklődő emberi betegségekért felelős lókuszok azonosítása, ami lehetővé teszi a genetikai hiba kimutatására alkalmas specifikus hibridizációs próbák kialakítását
7. Törvényszéki orvostan
a) nemi erőszak áldozatául esett nőkből származó ondóminták azonosítása genetikai „ujj lenyomat”-készítéssel,
b) beszennyezett ruháról, vagy máshonnan származó vér-, haj- és ondóminták azonosítása, genetikai ujjlenyomat-készítéssel,
c) emberi maradványok azonosítása.
8. Kimérasejtek tanulmányozása, pl. a recipiens-sejtek donorsejtek elleni reakciójának vizsgálata, csontvelőátültetés után.
9. Haszonállat-tenyésztés és pedigrévizsgálat, hitelesítés. (Például állati törzsek genetikai tisztaságának rutinellenőrzése, és pedigrévizsgálat versenyló-, és kutyatenyésztéssel kapcsolatos peres ügyekben.) A módszer szolgáltathat olyan genetikai markért, ami kapcsoltan öröklődik valamely gazdaságilag hasznos tulajdonsággal·
10. Állati sejttenyészetek minőségi rutinellenőrzése, a sejtvonalak genetikai tisztaságának vizsgálata, sejtvonalak azonosítása.
11. Különböző daganatok és daganatos sejtek vizsgálata, molekuláris rendellenességek kimutatása.
12. Várható, hogy a találmány tárgyát képező oligonukleotidok, vagy a belőlük előállított hibridizációs próbák hasznosak lehetnek a növénytermésztésben is.
Az ábrák rövid leírása:
Az 1. ábrán a mioglobingén 33 bázispáros ismétlődő szekvenciájának plazmidban történő klónozását láthatjuk sematikus ábrázolásban.
A 2. ábrán különböző próbákhoz hibridizáló genomi DNS-fragmentumokról készített autoradiogrammról készített fénykép fotókópiáját látjuk Az ábra bemutatja azoknak a rokonoknak a családfáját is, akiknek a DNSvizsgálatáról készült az autoradiogrammok közül kettő.
A 3. ábra olyan autoradiogrammokat mutat be, melyeket három - nem rokon - embertől származó DNSminta három különböző - a találmány tárgyát képező próbával történő hibridizációjával állítottak elő.
A 4. ábra olyan autoradiogrammokat mutat be, melyeket kilenc különböző embertől származó DNS-mintáknak a találmány tárgyát képező egyik próbával történő hibridizációjával állítottak elő. A kilenc ember közül néhányan rokonok, kettő közülük pedig egypetéjűiker.
Az 5. ábra 2 emberi és 17 állati eredetű DNS-minta - találmány tárgyát képező próbával történő - hibridizációjáról készült autoradiogrammot mutat be.
A 6. ábra egy bevándorlási vitában érintett ghánai család tagjaitól származó DNS-mintákból, a találmányban leírtak szerint készített autoradiogrammokat mutat be.
A 7. ábra egy neurofibromatózist hordozó család tagjaitól származó DNS-mintákról készített autoradiogrammokat mutat be.
HU 203 795 Β
A 8. ábra egy gujerati család tagjaitól származó DNS-mintákról készített autoradiogrammokat mutat be, melyeket azért készítettek, hogy különböző miniszatellit-fragmentumok és a magzati hemoglobin örökletes fennmaradása (HPFH) nevű betegség öröklődésének esetleges kapcsoltságát kimutassák.
A 9. A és 9. B ábra pedig két genetikai diagramm, melyek a HPFH és különböző miniszatellitek öröklődését mutatják be, egy soktagú rokonságban.
A 10. ábra egy olyan diagramm, amely egy klónozott mesterséges miniszatellit előállítását mutatja be.
A 11. ábra két különböző - nem rokoni eredetű placentából származó DNS-mintából, új szintetikus hibridizációs próbák segítségével készített autoradiogrammokat mutat be.
A 12. ábra egy sokgyermekes család tagjaitól származó DNS-minták hibridizációjáról készített autoradiogrammokat mutat be.
A 13. ábra ikrek DNS-ének különböző hibridizációs próbákkal készített különböző DNS-sáv mintázatait mutatja be.
A 14. ábra egy olyan autoradiogrammot mutat be, mely ugyanazon DNS-mintán, egyes, illetve kettős szálú DNS-hibridizációs próbával előállított mintázat összehasonlításának céljából készült.
A 15. és 15. A ábra törvényszéki mintákból készített DNS-ujjlenyomatok autoradiogrammjait mutatja be.
A 16. ábra egy kutyacsaládból származó DNS-ujjlenyomatokról készített autoradiogrammot mutat be.
A 17. ábra egy rövidszőrű házimacska-családról készített DNS-ujjlenyomatokat bemutató autoradiogramm.
A 18. ábra különböző juhokról két különböző hibridizációs próbával készített DNS-ujjlenyomatok autoradiogrammját mutatja be.
A 19. ábra egy olyan autoradiogramm, mely három különböző sertésről készített DNS-ujjlenyomatokat mutat be.
A 20. ábra egy tehéncsaládról és egyéb lábas jószágokról készített DNS-ujjlenyomatokról készített autoradiogrammot mutat be, míg a 21. ábra a 20. ábrán bemutatotthoz hasonlóan készített autoradiogrammot mutat be, melyet az előzőtől különböző hibridizációs próbával állítottuk elő.
Egy 10-20 kilobázis hosszúságú fragmentumokat tartalmazó humán genomi génkönyvtárat - melyet emberi DNS Sau3A-val történő részleges emésztése után, ZL47.1 fágban [Gene 20, 249 (1980)] klónoztunk - a „pAV33.7” jelű hibridizációs próbával teszteltünk, melyet a mioglobingén 33 bázispáros ismétlődéséből állítottunk elő. Több mint 40 különböző mértékben hibridizáló plakkot azonosítottunk a 3ΊΟ5 db rekombináns plakkot tartalmazó könyvtárból. A hibridizáló plakkok közül véletlenszerűen kiválasztottunk nyolcat (X33.115), belőlük DNS-t izoláltunk, majd Southern blott analízis [J. Molec. Bioi. 98, 503 (1975)] segítségével kimutattuk, hogy minden rekombináns fág esetében annak csak egy bizonyos (0.2-2 kilobázis méretű) régiója mutat hibridizációt az eredeti próbával. A kérdéses szekvenciák meghatározása alapján kiderült, hogy minden hibridizáló régió egy-egy miniszatellitet tartalmaz, melyek 16 bázispár (λ33.15) és 64 bázispár (λ33.4) közé eső méretű ismétlődő szekvenciák 329-szeres tandemismétlődéseiből állnak. A legtöbb miniszatellit különböző számú belső ismétlődést is tartalmazott. A X33.6 jelű fágban talált 37 bázispáros ismétlődő egység például egy 12 bázispáros alapegység háromszoros pontatlan ismétlődéséből tevődött össze. Mivel az izolált nyolc miniszatellitet minden esetben különböző DNS-szekvenciák szegélyezték, megállapítható, hogy mindegyik λ33 jelű rekombináns fág a humán genom különböző régiójából származó inszertumot tartalmaz.
A nyolc klónozott miniszatellit-régió 0,5-2,2 kilobázis méretű HinfI restrikciós fragmentumokon volt található, s mindegyik kisebb méretű volt azoknál a 2-6 kilobázis nagyságú, polimorfikus fragmentumoknál, melyeket a humán DNS Hinfl-es emésztése után a pAV33.7 jelű hibridizációs próbával detektálni lehetett. Annak érdekében, hogy eldöntsük, vajon a megklónozott miniszalellit-régiók szintén polimorfikusak-e, 32P jelzett, egyes szálú DNS-hibridizációs próbákat állítottuk elő mindegyik miniszatellit megfelelő M13 szubklónjából, majd a próbákat igen szigorú körülmények között hibridizáltattuk 14 - nem rokon - kaukázusi eredetű brit állampolgártól származó, Hinfl-gyel emésztett DNS-mintákkal. A kapott tipikus hibridizációs mintázat azt mutatta, hogy az alkalmazott hii^dizációs körülmények között minden próba a humáa^genomnak csak egy-egy meghatározott régióját ismeri fel, és ezen régiók közül három meglehetősen polimorfikus.
A fenti eljárás pontosabban részletezett leírása megtalálható a példák között. »
A polinukleotidoknak a fentiekben megadott definícióiról tehát elmodhatjuk, hogy mindegyik definíció eleget tesz a következő általános képletnek:
H.(J.C.K.)„.L (8) ahol C egy ún. „core”-szekvenciát jelent a többi betű pedig a fentiekben megadottak szerint értendő. Az összes definíció szerint az egyik ismétlődő egység „core”-szekvenciája lehet azonos a következő egységben találhatóval, de különbözhet is attól. A „core”-szekvencia például tartalmazhat egy vagy két plusz nukleotidot, hiányozhat is belőle egy-két nukleotid, de szekvenciája különbözhet is (mondjuk) 1-4 nukleotidban az összes ismétlődő egységre vonatkozó konszenzusszekvenciától. A „core -szekvencia definíciója többféleképpen is megadható. Az egyik általános definícióhoz úgy juthatunk el, ha megvizsgáljuk azt az eljárást, amellyel egy „core”-szekvenciát kimutathatunk. Ez úgy történik, hogy a genomi DNS egy miniszatellit-régióját olyan szekvenciarészlettel hasonlítjuk össze, mint például
GGAGGTGGGCAGGAXG (2)
A miniszatellitnek azt az x nukleotidhosszúságú szakaszát tekintjük „core”-szekvenciának, amely a lehető legnagyobb homológiát mutatja a (2) képlettel jelölt szekvenciából kiválasztható összes lehetséges x nukleotidhosszú szekvenciarészletek közül az egyikkel. Ez
HU 203 795 Β természetesen a „core” fogalmának meglehetősen szűk értelmezése, mivel így minden esetben egy, vagy egynéhány olyan „core”-t kapunk, amely 6,7...16 nukleotidhosszúságú (azért „egynéhányat”, mert bizonyos esetekben több mint egy azonos hosszúságú szekvenciarészlet is mutathatja a legnagyobb, például 100%-os homológiát). Mivel felfedeztük, hogy az így definiált „core”-szekvenciák meglehetősen különbözhetnek egymástól, tágabb értelemben a „core”-szekvenciák különbözhetnek egymástól oly mértékben, hogy az összes n darab ismétlődő egységben található „core”szekvencia átlagosan legalább 70%-os homológiát mutasson a fenti értelemben definiált „core”-szekvenciával. Az ismétlődő egységen belül található szegélyezőszekvenciákat (J és K) nem vesszük figyelembe a homológia kiszámításánál, az összehasonlítás kizárlólag a „core”- szekvenciarészletekre vonatkozik. Az ily módon definiált „core”-ok különböző hosszúságúak lehetnek, és „keverten” is előfordulhatnak, ami azt jelenti, hogy egy miniszatellit-fragmentumon belül a „core” az egyik ismétlődő egységen belül (mondjuk) a (2) képlettel megadott GGGCAGGAXG szekvenciával homológ, míg a másik egység „core”-ja (mondjuk) a (3) képlettel megadott GGGCAGGTGG szekvencia homológja. „Core”-variánsokról tehát inkább a különböző (core) a szekvenciák közötti homológiák kapcsán beszélhetünk, nem pedig kizárólag a „core”-ok összehasonlításakor.
A fentiekben megadott „első” definíciót tehát a fenti meggondolások alapján adtuk meg, annyiban egyszerűsítve, hogy a „core” 6-tól 12-16 nukleotidig bármilyen hosszúságú szekvenciarészlet lehet, ahogy azt a (2)-(5) képletek mutatják. Hasonlók vonatkoznak a variánsok definiálására is.
A „második” definíció a „core”-t egymást követő hibridizációs lépések alapján definiálja, melyek mindegyike új miniszatellit-fragmentumok azonosítását eredményezheti. Könnyen belátható, hogy amennyiben elégséges számú hibridizációs vizsgálatot hajtunk végre humán genomi DNS-ből előállított, megfelelően sok mintát tartalmazó génkönyvtárakon, és megfelelő számú hibridizálő fragmentet vetünk alá vizsgálatnak, ezekből hibridizációs próbákat készítünk, majd a készített próbákkal ismét hibridizációs vizsgálatokat végzünk az eredeti génkönyvtárakon, majd ezeket a lépéseket elméletileg végtelenszer megismételjük, egy olyan konszenzus-„core”-szekvenciacsaládhoz kell hogy jussunk, melyek széleskörűen előfordulnak miniszatellit-DNS-régiókban. A gyakorlatban nem szükséges a fenti lépéseket nagyon sokszor megismételni, és nagyon sok DNS-mintát sem kell ahhoz megvizsgálni, hogy eljussunk egy megfelelően széleskörűen elterjedt konszenzus-„core-régióhoz, ezért a definícióba (önkényesen) csak 3 hibridizációs lépést foglaltunk bele.
A „harmadik” definícióban W jelenti a „core”-szekvenciát, és a definíció megfogalmazása annak lehetőségét veti fel, hogy eljuthatunk egy meglehetősen kiterjedten előforduló „core”-hoz oly módon is, hogy a konszenzus-„core”-szekvenciában olyan változtatásokat hajtunk végre, amely a szekvenciának legfeljebb 25%-át érinti (például 16 nukleotid közül legfeljebb 4-et). Amennyiben a „core”-régiót ily módon egy legfeljebb 16 nukleotidból álló és legfeljebb 25%-os eltérést tartalmazó szekvenciarészletként definiáljuk, akkor a W jelű „core” (definíció szerint) ennek a régiónak egy legalább 6 egymást követő nukleotidból álló szekvenciarészletét jelenti.
A „negyedik” definíció a konszenzus-„core” képletének egy megváltoztatott meghatározását (6) tartalmazza, amelyhez szintetikus polinukleotidokkal folytatott vizsgálataink során jutottunk.
Ezek a vizsgálatok további, rövidebb „core”-szekvenciákra vonatkozó meghatározásokhoz vezettek.
Ezek szerint, előnyösen a következő egymást követő (5’—>3’) nukleotidokból álló szekvencia:
PGGGCWG (7) minden ismétlődő egységben konzervált P és W jelentése pedig azonos a fenti negyedik definícióban megadottal. P előnyösen T; W pedig előnyösen A.
Szintén előnyösen az egymást követő (5’-»3’) nukleotidokból álló szekvencia:
TGGGCA (8) konzervált minden ismétlődő egységben.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan polinukleotidok, melyek legalább három olyan ismétlődő egységet tartalmaznak, melyek magukban foglalják a következő 5’->3’ irányban egymást követő nukleotidokból álló „core”-szekvenciát
GGPGGGCWGGWXG (7) ahol P-nem G, W-A vagy T és X-A vagy G, vagy ezek változatait, feltéve hogy az Összes előforduló „core”-szekvencia, minden ismétlődő egységet beleértve legalább 70%-os homológiát mutat az összes „valódi core”-szekvenciával, melyet azonos számú ismétlődésre a (7) képlet alapján határozhatunk meg, és minden olyan polinukleotidot, melyek szekvenciája komplementer a fentiekben megadottakkal.
Minden fenti meghatározásban a „core”-szekvencia legalább 6 nukleotidhosszú, előnyösen legalább 7 vagy 8, és legelőnyösebben 12 vagy több, például 14—16 nukleotidhosszúságú. A (2) képletben megadott GGCAGGAXG-szekvencia (a 3’ vég felőli 10 nukleotid) nagymértékben konszenzus, és különösen ígéretesnek látszik. A „core” előnyösen legalább 6, és még előnyösebben mind a 10 nukleotidját tartalmazza a fenti szekvenciának.
A „core”-variánsok előnyösen legalább 75% homológiát tartalmaznak, és még előnyösebben legalább 80, vagy 85%-os homológiát
A J és K jelű szegélyezőszekvenciákat előnyösen elhagyjuk, vagy rövidnek választjuk, pl. 0,1 vagy 2 nukleotidnak mindkét oldalon, és J és K együttesen ne haladja meg a 20-at, előnyösebben a 15-öt. A J+core+K összeg által megadott nukleotidszám, egy ismétlődő egységen belül, előnyösen nem haladja meg a 36-ot, előnyösebben a 31-et, és legelőnyösebben a 25-öt.
Az ismétlődő egységek száma n, előnyösen legalább 10, célszerűen 10 és 40 közötti, de n elvileg bármely szám lehet egészen 10 000-ig.
A H-val és L-lel jelölt szegélyezőszekvenciák szerepe elhanyagolható. El is hagyhatóak, de bármekkorák
HU 203 795 Β lehetnek pl. egészen 20 000-ig, bár ilyen nagyméretű hibridizációs próbával dolgozva, általában romlik az érzékenység. Ezek a szegélyezőszekvenciák még akkor is tartalmazhatnak kettős szálú DNS-t amikor az ismétlődő szekvenciák egyes szálú DNS-ből állnak
Az azonosítási módszer bármely ismert hibridizációs technikán alapulhat, legáltalánosabban a DNS-mintát olyan restrikciós enzim(ek)kel emésztjük, (egy, vagy több enzimmel, az igények szerint), melyek nem hasítanak bele a tandemismétlődő szekvenciákba, vagy csak olyan kis mértékben hasítják azokat, ami a hibridizációs vizsgálat hatékonyságát nem rontja.
A találmány tárgyát az alábbi példák szemléltetik, anélkül, hogy igényünket ezekre korlátoznánk A hőmérséklet mindenütt ’C-ban van megadva.
I. példa (1) A humán mioglobingénből származó, hosszú tandemismétlődő szekvenciákat tartalmazó hibridizációs próba előállítása
Az 1. ábra sematikus ábrázolásban, öt lépésben mutatja be a fenti hibridizációs próba előállítását, az egyes lépéseket (a), (b), (c), (d), (e)-vel jelölve. A kiindulásnál felhasznált mioglombingén (a) leírása P. Weller és mtsai cikkében található (EMBO J. 3, 439-446,1984). Ahogy az az említett cikkből kitűnik, a gén első intronjában található egy olyan régió, amely egy 33 bázispáros szekvencia négyszeres ismétlődését tartalmazza, s az ismétlődő egységen belül található 9 bázispáros szegélyezőszekvencia is csaknem pontosan ismétlődik (I. ábra). Ezt a génszakaszt egy 169 bázispáros HinfI fragmentumon izoláltuk, majd sokszorozás céljából, végfeltöltés után, a pUC13-as plazmid Smal helyére klónoztuk, lásd J. Vieira és mtsai. (Gene 19, 259-268, 1982). A harmadik és negyedik ismétlődő egységben történő Avall (A) hasítás után izoláltuk a monomer ismétlődő egységet (c). [Az 1-es és 2-es ismétlődő egységben 1-1 bázispár kicserélésével megszüntettük az Avall hasítási helyeket, és helyettük Ddel (D) helyeket alakítottunk ki.] Mivel az izolált fragmentum két végén keletkezett Avall ragadós végek egymástól különböznek, a monomer fragmentum ligációjával Jejláb” illeszkedésű, ismeretlen (n) számú ismétlődő egységet tartalmazó polimert (d) tudtunk előállítani. Azokat a polimereket, melyek legalább 10 ismédlődő egységet tartalmaztak, preparatív agaróz gélelektroforézis útján izoláltuk, majd végfeltöltés után a pUC13 plazmid Smal helyére ligáltuk, és E.coli JM83-ban klónoztuk, lásd J. Vieire és mtsai fent idézett cikkét. A leírt módon nyert pAV33.7 (e) plazmid polimer inszertjének szerkezetét a következő módon határoztuk meg: az inszertumot BamHI-EcoRI kettős emésztéssel kivágtuk a plazmid polilinkeréből, az így nyert fragmentumot a-33P-dCTP segítségével rádioaktívan megjelöltük, a BamHI helyen történő feltöltéses jelöléssel, majd Avall enzimmel részlegesen megemésztettük. A végjelölt, részlegesen emésztett fragmentumokat egymástól 2%os agarózgélen történő gélelektroforézis segítségével választottuk el. Azt találtuk, hogy a pAV33.7 jelű plazmid, a 767 bázispár-hosszúságú BamHI-EcoRI fragmentumán (c) a 33 bázispáros monomer egység 23szoros ismétlődését tartalmazta, ahogy az ábra is mutatja.
(2) A humán genomból, a 33 bázispáros mioglobinismétlődést tartalmazó hibridizációs próbával azonosított miniszatellit-régiók szekvenciaanalízise.
Egy λ47.1 fágban klónozott, 10-20 kilobázisos fragmentumokat tartalmazó humán génkönyvtárat (lásd P. Weller és mtsai idézett cikkét, valamint W. A. M. Loenen és mtsai Gene 20,249-259,1980) teszteltünk a pAV33.7 plazmid 767 bázispáros inszertjéből készített próbával [lásd (1) lépés, fent] történő hibridizáció útján, a próbákat 32P izotóppal jelöltük, P. Weller és mtsai módszere segítségével (idézet lásd fent). Nyolc pozitív plakkot izoláltunk, és 33.1-15 jellel láttunk el. Minden plakkból DNS-t izoláltunk, majd a mintákat külön-külőn Hinfl-gyel, vagy Haelü-mal emésztettük, majd 1,5% agarózgélben elektroforetizáltuk. Ezután a mioglobingén 33 bázispáros ismétlődésével homológ szekvenciákat Southern blott hibridizációval azonosítottuk, a pAV33.7-ből származó próba segítségével. Mindegyik rekombináns fág DNS egyetlen „X33-pozitív” fragmentumot tartalmazott, mind Hinfl-gyel, mind pedig Haein-mal történő emésztés után, kivéve a λ33.4 és X33.ll jelű fág DNS-eket, amelyekben nem volt azonosítható HaelII fragmentum (ez annak köszönhető, hogy ezen rekombináns fágokban található ismétlődő régiókban volt HaelII hasítóhely). A X33-pozitív HinfI és HaelII fragmentumokat preparatív gélelektro-,. forézis segítségével izoláltuk, szükség esetén feltöltés?f? sel tompa végeket alakítottunk ki, majd a kettős szálú, M13mp8 DNS (J. Messing és mtsai, Gene 19, 269276, 1982) Smal helyére ligáltuk. Pozitív egyes szálú M13 rekombinánsokat izoláltunk E.coli JMlOI-be történő transzformáció után, majd ezeket a dideoxinukleotidos láncterminációs módszer segítségével szekvenáltuk. Mindegyik X33-pozitív fragment tartalmazott tandemismétlődő régiót, melyet néhány esetben közvetlenül meg lehetett szekvenálni. A többi esetben, amikor az ismétlődő régió túl messzire volt a szekvenáló primertől, az M13 inszerteket restrikciós hasítással megrövidítettük, majd újra szekvenáltuk.
A X33-pozitív fragmentumok szeikezetét az alábbiakban nyolc térkép segítségével fogjuk bemutatni, melyeket X33.1, X33.3, X33.4, X33.5, X33.6, X33.1O, X33.ll és X33.15 jelekkel láttunk el. A bemutatott fragmentumok hosszát (nukleotidban) és a használt restrikciós enzimeket a következőkben adjuk még:
X33.1: HaUI, 2000; X33.3: HinfI, 465; X33.4: HinfI, 2000; X33.5: HinfI, 1600; X33.6: Haem, 720; X33.10: HaeHI, 720; X33.ll: HinfI, 1020; X33.15: HinfI, 1220. Minden télkép megad egy ismétlődő nukleotidszekvenciát, nagybetűvel egy téglalap alakú keret fölé írva. Az „ismétlődések” nem teljesen azonosak egymással, sem a nukleotidok számát, sem a bázisok minőségét tekintve. Éppen ezért a megadott ismétlődő szekvencia mindig egy olyan konszenzus-(con)-szekvencia, mellyel az elvégzett szekvenciaanalízisek eredménye a lehető legnagyobb összhangban van. A kereten belül azt láthatjuk, hogy az ismétlődések miben térnek el a
HU 203 795 Β konszenzustól. A kereten belül az üres helyek a konszenzussal való egyezést jelölik. Az A, C, G, T betűk a keretben azt jelentik, hogy az ismétlődés megfelelő helyén a jelölt bázis található a konszenzus-szekvenciában megadott bázis helyett. X-A vagy G, Y-C vagy T, —hiányzó nukleotid (a konszenzushoz viszonyítva). A (halszálka) jel olyan helyet jelöl, ahol a szekvenciát pontosan még nem határoztuk meg, de a szekvenáló gélek autoradiogrammjain világosan látszik, hogy a jelölt szekvencia a konszenzus „ismétlődése” (az „ismétlődés” kifejezést itt természetesen a fentiekben megadott közelítő értelemben használjuk). A X33.3, X33.5, X33.10, X33.ll és X33.15 jelű fragmentumokat teljesen, a többit részlegesen szekvenáltuk meg. A „con” alatt, a keret baloldalán látható számok a kérdéses ismétlődő szekvencia sorszámát jelentik. Az oszlop legalsó száma a fragmentumban található összes ismétlődések számával egyezik meg. így pl. a X33.1 egy 62 nukleotidből (nt) álló szekvencia - melyet a keret fölött nagybetűvel tüntettünk fel - 26-szoros ismétlődését tartalmazza. Az egyes térképek fölött és alatt kisbetűvel feltüntetett szekvenciák szegélyezőszekvenciák, melyek az ismétlődéseket tartalmazó blokkot sorrendben az 5’, illetve a 3’ oldalon szegélyezik. Ezek a szegélyezőszekvenciák nem ismétlődnek. Más szavakkal ez a szerkezet olyan random kopolimerrel analóg (ezt a szegélyezőszekvenciák képviselik), amelybe blokk kopolimer egységek (ezek a tandemismétlődések) ékelődtek.
(3) Az összes X33-pozitív fragmentum ismétlődő szekvenciájában meglévő rövid, közös „core”-szekvencia felfedezése és azonosítása.
Az összes ismétlődő régió ismétlődő egységének szekvenciáját pontmátrix-analízis segítségével, összehasonlítottuk a pAV33.7 jelű plazmidban klónozott 33 bázispáros mioglobinismétlődő egységgel, és annak révére komplementerével. Találtunk egy rendkívül szembetűnő, rövid egyedi régiót a 33 bázispáros mioglobinismétlődő egségben, amely szekvencia homológiát mutatott a X33-pozitív fragmentumokból levezetett konszenzusismétlődő szekvenciával. Ugyanez a régió megtalálható volt mind a nyolc X33-pozitív fragmentum ismétlődő egységében, s ezt a régiót ezentúl „közös core”-nak nevezzük. A lenti ábra az összehasonlítás eredményét mutatja.
Az ábra egészében bemutatja a (2) lépésben meghatározott összes konszenzus-szekvenciát Ezek azok a szekvenciarészletek, amelyek tandemismétlődésként fordulnak elő a 33 bázispáros mioglobin-hibridizációs próbában és a humán genomból izolált X33- pozitív fragmentumokban. Az ábrán a 16 nukleotidhosszúságúnak talált közös „core”-régiő nagybetűvel van jelölve.
közös core-régió bp mioglobin
X33.1
X33.3
X33.4
X33.5
X33.6*
X33.1O
X33.ll
X33.15 közös core-régió ctaaagct ccctgtcttgtcctggaaactca ” xxgggccg catctggggccacaggatgcaggg g
aggaagggct gtaggaggtggct cctgggct
5’GGAGGTGGGCAGGAAG aagGGTGGGCAGGAAG
GGAGGTGGGCAGGAAX tGgGGaGGGCAGaAAG
GGAGGYGGGCAGGAGG
GGAGGaGGGCtGGAGG
GGA-GTGGGCAGGcAG
GGtGGTGGG’cAGGAAG aGAGGTGGGCAGGtGG
GGAGGTGGGCAGGAXG gaccgaggt tggagtgtgtgcctgcttccctt gggtggag v aacccccgcgtgxaggggcaccca agggctccgg gactgtccccgaa cagtgaggc
-3’
X-A vagy G, Y-C vagy T, —hiányzó nukleotid * Ez egy trimer szekvencia, ezért a szegélyezőrégiók is hozzájárulnak a „core”-hoz.
Az ábrán látható, hogy a bekeretezett 16 nukleotidos részlet jó egyezést mutat a különböző szekvenciák között. A 16 nukleotid közül 8 az összes felsorolt szekvenciában azonos helyen megtalálható (100%-os homológja), s egy kilencedik X is mindenhol közös, ami azt jelenti, hogy ezen a helyen az összes szekvenciában vagy A, vagy G szerepel. Ezt a kilenc nukleotidot a közös „core”-régiót bemutató utolsó sorban aláhúzással jelöltük. Kisbetűkkel jelöltük az egyes tandemismétlődő szekvenciák további részét képező szegélyezőrégiókat. Az egyes konszenzusismétlődő szekvenciák kezdő/végpontját ” jellel jelöltük; a X33.4 és X33.15 fragmentumokban az ismétlődés kezdő- és végpontja nem esik egybe, ezért ezeket külön-külön „7 ” jellel jelöltük. Belátható, hogy a közös „core-régió meghatározása csak rendkívül kifinomult számítógépes analízis segítségével volt lehetséges, mivel az sok esetben nem található meg a 33-pozitív fragmentumok egyetlen konszenzusismétlődő egységén belül, és a mioglobingén ismétlődő szekvenciájában is pontosan két egymást követő 33 bázispáros ismétlődés határán található.
A következő táblázat (1. táblázat) megadja a fent említett polinukleotidok jellemző adatait, s ezzel azt is illusztrálja, hogy a megadott definíciók milyen mértékben szűkítik a találmány tárgyát képező polinukleoti; dók körét
-101
HU 203 795 Β
1. táblázat
Polínukleotid „Core-hosszúság Képlet sz. %-os homológía Az ismétlődő egység hossza J+K n A találmány tárgyát képezi-e
33 bp mioglobin 16 2 100 33 17 4 X
33.1 16 2 81 62 46 26 X
33.3 16 2 100 32 16 6 X
33.4 16 2 75 64 48 14 X
33.5 16 4 100 17 1 14 y
33.6 11 5A4B 100 18 0 18 ν'
33.10 15 2 88 41 26 5 X
33.11 16 2 94 33 17 3 X
33.15 16 3 100 16 0 29 t/
az aláhúzott számok nem megengedett hoszzúságot jelölnek (4) Annak felismerése, hogy az egyes X33-pozitív fragmentumokból készített hibridizációs próbák segítségével, polimorfikus humán genomi DNS-fragmentumokat lehet azonosítani.
Ahogy az a 2. ábrán látható, hat nem rokon kaukázusi eredetű brit állampolgár fehér vérsejtjeiből DNS-t izoláltunk (1-6), s hasonlóképpen egy nagy, ázsiai eredetű brit család különböző tagjaitól származó mintákból is (7-18). A családfában a szokásnak megfelelően a férfiakat négyzettel jelöltük, a nőket körrel, és a körök és négyzetek közötti vonalak házasságot jelentenek. Két, első unokatestvérek között kötött vérfertőző házasságot a partnereket összekötő kettős vonallal jelöltünk. A DNS-mintákból 10-10 pg-ot HinfI emésztésnek vetettünk alá, 20 cm hosszú, 1%-os agarőzgélben elektroforetizáltuk őket, in situ denaturálást hajtottunk végre, majd a mintákat blott eljárással Sartorius nitrocellulóz filterre vittük át. Miniszatellit (tandemismétlődő) régiókat tartalmazó, rekombináns M13 fágokból, 32P jelzett, egyes szálú hibridizációs próbákat állítottunk elő. Az alkalmazott hibridizációs próbákat a későbbiekben pontosan jellemezzük. A hibridizációs próbákat az alábbiak szerint állítottuk elő. Körülbelül 0,4 pg egyes szálú M13 DNS-hez 4 pg 17-tagú szekvenciázó primer oligonukleotidot hibridizáltattunk (M. L. Duckworth és mtsai, Nucleic Acids Rés. 9,1691-1706, 1981) 10 pl 10 mM MgQ2-ot tartalmazó - 10 mM-os Tris-HCl (pH 8,0) pufferben, 60 ’C-on, 30 percig. A reakcióelegyhez a primer meghosszabbítás céljából hozzáadtunk: 16 pl 80 pM dATP-t, 80 pM dGTP-t, 80 pM dTTP-t, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)-t és 0,1 mM EDTA-t tartalmazó elegyet, valamint 3 pl (30 pCi) a-32P-dCTP-1 (3000 Ci/mmól) és 1 pl 5 egység/pl-es Klenow enzimet (Boehringer), és az elegyet 15 percig 37 ’C-on inkubáltuk, A láncnövekedés befejeződését
2,5 pl 04 mM-os dCTP hozzáadása után, további 15 perces, 37 ’C-on történő inkubálással segítettük elő. (Ez az ún. „chase”-reakció lehetővé teszi, hogy az egyes szálú M13 templátokon teljes hosszában megszintetizálódjék a komplementer DNS-szál.) Ezután a fág DNS-t egy megfelelő restrikciós endonukleázzal hasítottuk, vagy az inszerten belül, vagy az M13 polilinker inszerten túli régiójában, a kapott lineáris DNSmintát 1/10 térfogat 14 M NaOH hozzáadásával denaturáltuk, majd a primer meghosszabbításaként keletkezett 32P jelzett, egyes szálú DNS-fragmentumot 14%os, alacsony olvadáspontú agarózból (Sea Plaque) készült gélben történd elektroforézis útján izoláltuk. A gélből kivágott DNS-sávot (specifikus aktivitás >10’ cpm/pg DNS) 1 mg lúgosán hidrolizált humán placenta canier (hordozó) DNS jelenlétében, 100 ’Con megolvasztottuk, majd közvetlenül a hibridizációs kamrához vittük. (A canier DNS hidrolízise 0,3 M NaOH és 20 mM EDTA jelenlétében, 100 ’C-on, 5 percig történt, majd a mintát HCl-dal semlegesítettük.) A carrier DNS a későbbiek során, a hibridizációs próba repetitív DNS-szekvenciákhoz történő hibridizációját is szupresszálta.
Az alkalmazott hibridizációs próbák pontos specifikációja a következő:
(A) 33.1: egy körülbelül 2000 nukleotidhosszúságú szubklónozott HaelII fragmentum, amely egy miniszatellit régiót (egy 62 nukleotidból álló ismétlődő egység 26-szoros ismétlődését-1612 nukleotidot) és körülbelül 350 nukleotidnyi humán eredetű szegélyező DNS-t tartalmazott; (B) 33.4: egy 695 nukleotidhosszúságú nem-miniszatellit EcoRI fragmentum, amely egy 2015 nukleotidhosszúságú HinfI fragmentumon klónozott miniszatellit, primer közeli régióját tartalmazta; és (C, D, E) 33.15: egy 592 nukleotidhosszúságú szubklónozott fragmentum, amely a X33.15 fág miniszatellit-régióját (egy 16 nukleotidos szekvenciarészlet 29-szeres ismétlődését, ahol az ismétlődő régió átlagosan 2 nukleotidban tér el a fent bemutatott közös „core”-szekvenciától), valamint 128 nukleotidnyi humán eredetű, szegélyező DNS-t tartalmazott.
A hibridizációs kísérleteket Jeffreys és mtsai módszere szerint végeztük (Cell 21,555-564,1980), azzal a különbséggel, hogy dextránszulfát helyett 6%-os (vegyes százalék) polietilénglikol 6000-et használtunk a háttér-jelölődés csökkentése érdekében. Az A és B filtereket egy éjszakán keresztül 04*SSC oldatban 65 ’Con hibridizáltattuk, majd 0,2«SSC-ben 65 ’C-on mostuk. A C-E filtereket 65 ’C-on bSSC-ben hibridizáltat11
-111
HU 203 795 Β tűk és mostuk. A filtereket 1-3 napig, erősítő fólia („fást tungstate”) jelenlétében -80 °C-on autoradiografáltuk.
Amint az a 2. ábrán látható, a 33.15 jelű, „core”-ismétlódéseket tartalmazó próba segítségével HinfI emésztett humán DNS-ben, hibridizáló fragmentumok rendkívül összetett mintázatát lehetett kimutatni. Csak a legnagyobb (4-20 kilonukleotid nagyságú) fragmentumokat lehetett teljesen elkülöníteni egymástól, és ezek olyan mértékű, rendkívüli polimorfizmust mutatnak, hogy a hibridizációs mintázat egyénre jellemző, DNS „ujjlenyomatnak” tekinthető.
A családfavizsgálat megerősítette a rendkívüli polimorfikus variáció tényét, amely olyan nagymértékű, hogy még egy elsőfokú unokatestvérek között kötött házasságból származó gyermekek (2. ábra, 16-18) DNS „ujjlenyomata” is különbözik egymástól. A 2. ábrán (D, E) bemutatott családvizsgálatokból kitűnt, hogy a legtöbb nagy HinfI fragmentum mindkét szülőtől csak bvizonyos utódoknak adódott át, amiből az következik, hogy a legtöbb ilyen fragmentum heterozigóta állapotú, valamint az, hogy ezen nagy, hipervariábilis fragmentumok heterozigoticitása meg kell hogy közelítse a 100%-ot. Fordított megközelítésben: az utódokban található összes ilyen fragmentum (összesen egy kivételtől eltekintve) visszavezethető az egyik, vagy a másik szülőre, ily módon ezek a fragmentumok egy stabilan öröklődő, genetikai markerkészletet alkotnak. Egyetlen fragmentum sem adódik át specifikusan apáról fiúra, vagy apáról lányra (lásd 2. ábra D filter). Ez kizárja a fragmentumok Y, illetve X kromoszómához való kapcsoltságát, és megerősíti azt a feltételezést, hogy ezek a miniszatellit-fragmentumok főleg autoszomális eredetűek. Az még nem tisztázott, hogy az autoszómakészleten belül honnan erednek ezek a DNS-fragmentumok, az azonban biztos, hogy nem egy bizonyos autoszóma egy meghatározott régiójából. Kimutathatók ugyanis olyan szülői fragmentumpárok, melyek az utódokban függetlenül szegregálódnak (lásd D filter, 2. ábra). Pontosabban fogalmazva: az egyik szülőnél megtalálható olyan AB fragmentumpár, ami a másik szülőnél hiányzik, nem lehet allelikus pár, amennyiben található legalább egy AB vagy — utód; az A- vagy -B rekombináns leszármazottak megjelenése pedig tovább valószínűsíti az A és B fragmentumok közötti szoros kapcsoltság hiányát. A 2. D ábrán bemutatott, eredeti autoradiogramm alapos vizsgálata lehetővé teszi, hogy a fenti kritériumok alapján, az anyától származó DNS-„uijlenyomatban” azonosítsunk legalább 10 sávot, melyek közül 8 páronként nem allélikus és nem mutat szorosan kapcsolt öröklődést A két másik sáv bármelyike lehet a 8 nem kapcsolt fragmentum közül valamelyik alléi párja, mivel ezekre vonatkozóan csak A- és -B leszármazottakat találtunk, mivel azonban a leszármazottak száma nem elég nagy, ez a megállapítás nem bizonyíthatja, hogy a vizsgált fragmentumpárok valóban egy fókuszban található alléi párok-e. Mindebből az következik, hogy a felhasznált, „core”-ismétlődéseket tartalmazó hibridizációs próba képes egyidejűleg hasznos információt szolgáltatni legalább egynéhány különböző, nem kapcsoltan öröklődő hipervariábilis fókuszról. Ezt a következtetést részletesen megvizsgáljuk a 8. példában.
Ezzel szemben a találmány tárgyát nem képező másik két hibridizációs próba (2. ábra A és B filterek) csak egy-két hibridizáló fragmentumot eredményezett, és jól láthatóan nem alkalmas arra, hogy egyidejűleg azonosítson több különböző polimorfikus régiót, s így ezeknek nincs általános diagnosztikai jelentőségük.
2. példa
További variáns („core-t tartalmazó) hibridizációs próbák felhasználása a humán DNS újabb hipervariábilis régióinak kimutatására.
Két további hibridizációs próbát állítottunk elő a X33.5 és X33.6 jelű klónozott X33-pozitív fragmentumokból, az 1. példa (4) pontjában leírtak szerint. A
33.5 jelű hibridizációs próba egy M13 mp 8 fágban klónozott 308 nukleotidhosszúságú DNS-fragmentumból állt, amely a fent bemutatott konszenzus-szekvencia 14-szeres ismétlődését tartalmazta, amely valójában a közös „core”-szekvencia 17 nukleotidhosszúságú változata, valamint 70 nukleotidnyi humán eredetű szegélyező DNS-t A 33.6 jelű próba egy 37 nukleotidhosszú egység 18-szoros ismétlődését tartalmazta, az ismétlődő egység pedig egy kb. 12 nukleotidos szekvenciarészlet 3-szoros. ismétlődéséből és egy járulékos, az 5’ végi TC-szekvenciából állt (a 12 nukleotidos belső mag a közös „core” rövidített változata volt). A 18*37 nukleotidból álló ismétlődő blokkot 95 nukleotidnyi humán eredetű DNS szegélyezte. A 37 nukleotidos ismétlődő egység szerkezete a következő képpel adható meg:
TGGAGGAGGGGC
TGG AGG A-G GGC (vagy TGG AGG AGG G-C) TCCGGAGGAGGGGC.
Ezt a hibridizációs próbát is M13mp8 fágban klónoztuk.
A továbbiakban ezt a próbát a következő, 11 nukleotidból álló konszenzus-szekvenciával jellemezzük:
AGGGCTGGAGG.
Mindkét próbát - az 1. példa 4. pontjában leírtak szerint - 32P-vel jelöltük, majd 14 nem rokon, kaukázusi eredetű brit állampolgártól származó DNS-mintákkal hibridizáltattuk. Mindkét próbával hibridizáló fragmentumok összetett mintázatát sikerült azonosítanunk, s az azonosított fragmentumok közül sok, rendkívüli polimorfíkus variációt mutatott. A 33.5 jelű próbával azonosított fragmentumok közül néhány új volt, abban az értelemben, hogy ezeket a 33.15 jelű „core-hibridizációs próba nem mutatta ki. A 33.6 jelű próba egy csaknem teljesen új miníszatellit-családot mutatott ki, melyek pontos öröklődésmenetét családfa-analízissel derítettük fel (lásd 8. példa).
A további példák méginkább bemutatják és alátámasztják a találmány hasznosíthatóságát.
A DNS-minták emésztését előnyösen olyan restrikciós endonukleázzal hajtjuk végre, melynek 4 bázispáros felismerőhelye van. Azt találtuk, hogy a leghoszszabb hipervariábilis fragmentumok esetén az ujjle-121
HU 203 795 Β nyomat mintázata nagymértékben független attól, hogy milyen 4 bázispárt felismerő restrikciós endonukleázt használunk. Ebből nagy valószínűséggel következik, hogy ezek a nagy fragmentumok nem még hosszabb rniniszatellit-ffagmentumok hasítási termékei, hanem mindegyik egy teljes, hosszú miniszatelüt-régiót tartalmaz, melyekben nem található restrikciós hasítási hely, és ezeket a régiókat olyan DNS-szakaszok szegélyezik, amelyekben a humán DNS-re általánosan jellemző, nagy sűrűséggel fordulnak elő 4 bázispáros restrikciós hasítási helyek. Ez a megállapítás összhangban van a korábbi példákban bemutatott eredményekkel, valamint a 8. példa adataival, amely bemutatja, hogy a legtöbb ilyöl nagy miniszatellit-fragmentum nem kapcsoltan öröklődik, és függetlenül szegregálódik a családfán belül.
A találmány szerint előnyösen minden DNS-mintáról kétszeres „ujjlenyomatot” készítünk: két különböző hibridizációs próba felhasználásával, a két hibridizációs kísérlet különböző DNS-ujjlenyomatokat eredményez, alkalmas erre például a 33.15 és 33.6 jelű fragmentumokból készített hibridizációs próbák kombinációja. Ily módon annak - eleve csekély - valószínűsége, hogy két nem rokon egyén DNS-ujjlenyomata azonos lenne, tovább csökkenthető. A 4. példa szerint például, ennek valószínűsége 10”, még abban az esetben is, ha a nehezen azonosítható, 4 kilobázisnál kisebb fragmentumokat előnyösen számításon kívül hagyjuk.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy apasági vizsgálati eljárás is. Egy utód polimorfikus miniszatellit-fragmentumainak kb. fele az apától származik, és ezek az apai fragmentumok az anya és az utód DNSujjlenyomatának összehasonlítása alapján azonosíthatóak. Általában valamennyi így azonosított apai fragmentum megtalálható az apa DNS-ujjlenyomatában. Becslések szerint annak valószínűsége, hogy egy utód 33.15 jelű hibridizációs próbával készített DNS-ujjlenyomatából azonosított, mind a-4 kilobázisnál nagyobb - apai DNS-fragmentum véletlenül szerepeljen a feltételezett apa DNS-ujjlenyomatában, nagyságrendileg 10-5, és amennyiben mind a 33.6, mind a 33.15 jelű hibridizációs próbát alkalmazzuk, ez a valószínűség 10’ nagyságrendűé csökken. Természetesen egy adott esetben a pontos valószínűség a kapott DNS-ujjlenyomat feloldóképességétől és összetettségétől függ, de a kapott valószínűség tovább növelhető (illetőleg csökkenthető) hogyha 4 kilobázisnál kisebb apai fragmentumokat is figyelembe veszünk, vagy pedig harmadik hibridizációs próbát is felhasználunk.
A DNS-ujjlenyomat készítéséhez szükséges mennyiségű DNS (0,5-5 pg) gyorsan előállítható egyetlen csepp emberi vérből is. Ily módon több véletlenszerűen kiválasztott emberről készítettünk DNS-ujjlenyomatokat, ezek között volt két olyan személy, akikről megelőzőleg már készült DNS-ujjlenyomat, és volt közöttük két leánytestvér is. A készített DNS-ujjlenyomatok vizsgálata alapján könnyen és egyértelműen azonosítani tudtuk a két ismert DNS-ujjlenyomatú személyt, ugyanígy a két leánytestvért is, akiknek nagyszámú közös miniszatellit fragmentum volt található a DNSujjlenyomatukban.
Egy adott személy esetén egy egész sor különböző sejtből lehet DNS-t izolálni, s az összes DNS-minta teljesen azonos DNS-ujjlenyomatot ad. Hy módon például a spermiumból és vérből készített DNS-ujjlenyomat egymástól megkülönböztethetetlen, csakúgy, mint az egypetéjű ikrek DNS-ujjlenyomata. Ezenfelül úgy tűrik, hogy az ujjlenyomatok DNS-mintázata változatlanul fennmarad sejttenyészetekben, amint az látható is, ha összehasonlítjuk egy adott személy vérből izolált DNS-ének ujjlenyomatát az ugyanezen személytől származó, Epstein-Barr vírussal transzformált limfoblasztoid sejtvonalból készített DNS- ujjlenyomattal.
A találmány tárgyát képező eljárás a következő állatfajokra is alkalmazható: a legtöbb emlősre, madarakra, kétéltűekre és halakra. A vizsgált példák a következők: csirkék, hörcsögök, nyulak, egerek, verebek, vércsék, békák, tarajos gőték, halak. Csirkék esetén rendkívül komplex, kenődött hibridizációs mintázatot kaptunk. HaelH restrikciós endonukleázzal történő emésztéssel megszüntethető volt a kenődés, és előtűnt a „tiszta” ujjlenyomat. Ebből az következik, hogy a csirke-DNS valószínűleg tartalmaz egy hosszú, „core”-tartalmú szatellitet, melynek ismétlődő egységében található egy vagy több Haein hasítóhely, ezért a HaelH emésztés ezt a szatellitet olyan kisméretű fragmentumokká;, darabolja, melyek az elektroforézis során kifutnak a bigéiből. Valószínű, hogy egyéb állatok DNS-ujjlenyo-~ mataiban is előfordulhat hasonló kenődés, amely megfelelő enzimekkel - melyek a hosszabb fragmentumo- ? kát elhasítják - történő emésztéssel megszüntethető.
A következő további példákban a hőmérsékletek ’Cban vannak megadva.
3. példa
Friss humán placentából DNS-t izoláltunk A. J. Jeffreys módszere szerint (Cell 18, 1-10, 1979). Három különböző placcntát használtunk, 1-3 jellel ellátva.
gg-os DNS-mintákat HinfI és/vagy Sau3 A emésztésnek vetettünk alá, 4 mM spermidin-triklorid jelenlétében, a teljes emésztés elősegítése érdekében; a DNSmintákat fenolos extrakciót követő etanolos kicsapással tisztítottuk, majd 20 cm hosszú, 0,6%-os agarózgélben 30 V feszültséggel, kb. 24 órán keresztül elektroforetizáltuk, egészen addig, míg minden 1,5 kilobázisnál kisebb méretű fragmentum ki nem futott a gélből. A DNS-mintákat ezután, blott eljárással, Sartorius nitrocellulóz filterre vittük át Nagy specifikus aktivitású (nagyobb, mint 109 cpm 3JP/pg DNS), egyes szálú M13 DNS hibridizációs próbákat állítottunk elő az 1. példa
4. pontjában leírtak alapján. Konkrétan a következő hibridizációs próbákat használtuk: (a) a 33.5 jelű próbát, amely egy 220 nukleotidhosszúságú HaelII fragmentumból tűit, amely csaknem egészében tartalmazza a X33.5 jelű miniszatellitet (17 nukleotid»14 ismétlődés), valamint 60 nukleotidnyi emberi eredetű szegélyezőrégiót, a fragmentum az M13mp8 fág Smal helyére volt szubklónozva; (b) a 33.6 jelű próbát, amely egy 720 nukleotidhosszúságú HaelH fragmentumból
-131
HU 203 795 Β állt, amely a megfelelő miniszatelliten kívül kb. 50 nukleotidnyi humán eredetű szegélyezőrégiót tartalmazott, az M13mp8 Smal helyére szubklónozva; és (c) az 1. példa 4. pontjában leírt 33.15 jelű próbát, amely egy 592 nukleotidos Pstl-Ahaül fragmentumból állt, amely a megfelelő miniszatelliten kívül 128 nukleotid emberi eredetű szegélyező DNS-t tartalmazott, az M13mpl9 fág Pstl+Smal helyeire szubklónozva. A Southern blott hibridizációt az 1. példa 4. pontjában a C-E filterekre megadott körülmények között, 65 ’C-on l»SSC-ben hajtottuk végre. A filtereket szobahőmérsékleten, erősítőfólia nélkül, 4 napig autoradiografáltuk.
Mindegyik hibridizációs próba különböző mintázatot eredményezett, melyek összetettsége nagyban független volt attól, hogy milyen 4 nukleotidos felismerőhelyű enzimmel emésztettük a DNS-mintát A kapott mintázatokat a 3. ábrán láthatjuk. A 4 kilobázisnál rövidebb polimorfikus fragmentumok azonosíthatóságát Hinfl-Sau3A kettős emésztéssel növeltük, mivel így a háttér-hibridizáció megszüntethető volt, melyet valószínűleg olyan különböző hosszúságú és invariáns HinfI miniszatellit-fragmentumok okoztak, melyeknek egy vagy több ismétlődő egysége tartalmazott Sau3A hasítóhelyeket. A kettős emésztés segítségével a 33.15 jelű próba által azonosított polimorfikus fragmentumok száma személyenként kb. 15-ről kb. 23-ra volt növelhető, ugyanakkor a kettős emésztés az egyszeres emésztés során keletkezett hosszú miniszatellit- fragmentumok kb. 20%-át megszüntette, melyek valószínűleg a legtöbb - vagy az összes - ismétlődő egységükben tartalmaztak Sau3A hasítóhelyet.
4. példa
Véletlenszerűen kiválasztott, 20 nem rokon, kaukázusi eredetű brit állampolgár véréből származó DNSminták 8-8 pg-ját HinfI emésztés után, Southern blott hibridizációnak vetettük alá a 33.6 és 33.15 jelű miniszatellit-hibridizációs próbákkal, a 3. példában leírtak szerint. Mindegyik kapott DNS-ujjlenyomatot (A személy) összehasonlítottuk a vele szomszédos gélsávban készült ujjlenyomattal (B személy), és meghatároztuk az A sávban jelen lévő, de B sávból hiányzó fragmentumok, valamint az A és B sávban hasonló helyen meglévő, közel azonos autoradiográfiás intenzitást mutató fragmentumok számát. Az összes ilyen összehasonlításból kapott eredmények átlaga a következő táblázatban látható. Az A sávokban találtunk néhány (kb. 6%) olyan gyengén hibridizáló csíkot, mellyel a B sávokban azonos helyen erősen hibridizáló csík volt látható. Mivel az ilyen esetekben nem megállapítható, hogy az A sávban látható halvány csík valójában jelen van-e B sávban is (elfedve), vagy nem, az ilyen fragmentumokat a számításnál nem vettük figyelembe. Amennyiben az A és B sávokban együtt mozgó csíkok minden esetben ugyanazon miniszatellit-lókusz azonos alléljeitől származnak, akkor annak átlagos valószínűsége (x), hogy egy A-ban jelen lévő fragmentum B-ben is megtalálható, a következő összefüggést mutatja az átlagos allélgyakorisággal (homozigoticitás: q):
x-2q-q2, ahol: q-l-(l-x)w.
A gyakorlatban az együtt mozgó csíkok egy bizonyos (ismeretlen) hányada különböző miniszatellit-lókuszból származik, azért a fenti becsléssel a maximális allélgyakoriságot, illetve homozigoticitást kaphatjuk meg, amely érték ennek értelmében a miniszatellitfragmentumok elektroforetikus megkülönböztethetőségének is függvénye.
A 2. táblázatban megadott valószínűségek csak a megadott mérettartományba tartozó fragmentumokra vonatkoznak, így ahhoz, hogy az egész jól értékelhető mintázatra, (azaz a 4 kilobázisnál nagyobb fragmentumokra) vonatkozó, átlagos valószínűségeket kapjunk, a három megadott értéket kombinálnunk kell. Ezért annak átlagos valószínűsége, hogy például A személy, 33.15-ös próbával készített, DNS-ujjlenyomatának minden egyes fragmentuma B személy hasonlóan készített ujjlenyomatában is jelen van, a következőképpen számítható: 0,08^0,20^^0,27^-34041.
Annak a valószínűsége pedig, hogy az A személynél, a 33.15 és 33.6 jelű hibridizációs próbákkal egyaránt elkészített ujjlenyomatokban azonosított valamennyi fragmentum megtalálható B személy hasonló ujjlenyomataiban is: 5404’.
2. táblázat
Hibridiz. próba DNS-ffagm. mérete, kilobázis Személyenként előford. fragm. sz. + S.D. Annak valósz. (x), hogy az A-ban jelen levő fragm. B-ben is van Max. átlagos allélgyakoriság (homozigoticitás)
33.6 10-20 2,8±l,0 0,11 0,06
6-10 5,1±1,3 0,18 0,09
4-6 5,9±1,6 0,28 0,15
33.15 10-20 2,9±l,0 0,08 0,04
6-10 5,111,1 0,20 0,11
4-6 6,7±l/2 0,27 0,15
-141
HU 203 795 Β
5. példa
Ez a példa a DNS-ujjlenyomatok szomatikus stabili* tását mutatja be, valamint azok hasznosíthatóságát apasági vizsgálatokban.
Egy EB vírussal transzformált limfoblasztoid sejtvonalat 2 évig folyékony nitrogénban tároltunk, majd folyadékkultúrában, ismét tenyészteni kezdtük. A tenyésztett limfocitákat kétszer megmostuk fiziológiás sóoldatban, majd a limfocita-üledékből, valamint fehérvérsejtekből DNS-t izoláltunk A. J. Jeffreys módszere alapján (Cell 18, 1-10, 1979). Hasonlóképpen izoláltunk DNS-t spermiumból is, azzal a különbséggel, hogy az ondófolyadékból összegyűjtött spermiumokat az SDS-es lízis előtt, 5 percig, 1 M 2-merkaptoetanollal, szobahőmérsékleten előkezeltük. A DNSujjlenyomatokat a 3. példában leírtak szerint állítottuk elő, a DNS-minták 5-5 pg-ját Hinfl-gyel emészve, és a
33.6 (a), valamint a 33.15 (b) hibridizációs próbákat használva.
6. példa
Ez a példa a találmány tárgyát képező egyik hibridizációs próba hasznosíthatóságát mutatja be, különböző gerincesektől származó DNS-minták erősen polimorfikus régióinak kimutatására.
DNS-mintákat készítettünk csirkék, verebek és vércsék véréből, nyúl- és egérmájból, emberi placentából, valamint békák és halak teteméből. A DNS-minták 8-8 pg-ját HinfI enzimmel emésztettük, kivéve a csirkeDNS-mintákat, melyeket HaelII emésztésnek vetettünk alá. A restrickiósan emésztett DNS-mintákat 0,6%-os agarózgélben elektroforetizáltuk, denaturáltuk, átvittük Sartorius nitrocellulóz filterre és hibridizáltuk, ahogy azt korábban az emberi eredetű 33.15 jelű hibridizációs próbával kapcsolatban már leírtuk. A hibridizációs körülmények a következők voltak: 65 “C, 1«SSC. A kísérlet eredményét az 5. ábra mutatja be, ahol a következő mintákat láthatjuk:
I, 2: nem rokon emberi placenták
3: nyúl-DNS, az Alaszkai és Bécsi Fehér törzsek F, hibridjétől
4: nyúl-DNS, az alaszkai törzsből
5,6: egér (Mus musculus) DNS: két vadon fogott görög egértől
7: egér (Mus musculus) DNS: a DBA-2 jelű beltenyésztett törzsből
8: egér (Mus musculus) DNS: a C57/BL10 jelű beltenyésztett törzsből
9,10: csirke-DNS, megj.: a DNS-t HaelII-mal emésztettük
II, 12: veiéb-DNS
13,14,15: vércse-DNS
16,17: béka (Xenopus tropicalis) DNS
18,19: fürge cselle (hal) DNS.
Az ábrán látható, hogy csaknem minden vizsgált gerincesről sikeres, változatos DNS-ujjlenyomatot lehetett készíteni, melyek ránézésre az emberi DNS-ujjlenyomatokhoz hasonlóan informatívak.
A Hinfl-gyel emésztett csirke-DNS-rŐl készített DNS-ujjlenyomatban megjelent egy rendkívül összetett, kenődött (bár kevéssé intenzív) hibridizáló háttér (az ábrán nincs bemutatva), ami azonban HaelII emésztéssel megszüntethető vök, s így előtűnt a tiszta, polimorfikus ujjlenyomat-mintázat.
A két beltenyésztett egértörzs DNS-ujjlenyomata kevésbé összetett, mint a vadon fogott egereké. Ez várható is volt, mivel a vadon élő egerek esetében a legtöbb hipervariábilis miniszatellit-lókusz feltehetően heterozigóta, míg a beltenyésztés során ezek homozigótákká válnak, s emiatt a beltenyésztett törzsek DNSujjlenyomalában a különböző hibridizáló fragmentumok száma a felére csökken.
A következő példák tovább szemléltetik az egyes fent említett hibridizációs próbák hasznosíthatóságát.
7. példa
Ez a példa a DNS-ujjlenyomatvizsgálat hasznosíthatóságát egy bevándorlási ügy kapcsán szemlélteti, melynek megoldása a hagyományos genetikai módszerekkel rendkívül nehéz, vagy teljesen lehetetlen tett volna.
A szóban forgó ügy egy olyan ghánai fiú esete, aki Nagy- Britanniában született, kivándorolt Ghánába, édesapjához, majd egyedül visszatért Nagy-Britanniában, hogy édesanyjával és három testvérével éljen együtt Mindazáltal olyan bizonyítékok merültek fel,, melyek arra utaltak, hogy a visszatért fiú nem azonos azzal, aki kivándorolt, hanem vagy az anya vagy valamelyik leánytestvérének (akik mind Ghánában élnek) a — fia, vagy pedig nem is rokon. Emiatt a visszatért fiú.,:, nem kapta meg a letelepedési engedélyt Nagy-Britan- „ niában. A család ügyvédjének kérésére DNS-ujjlenyomatvizsgálatot hajtottunk végre a fiú anyasági kérdésének tisztázására. Az ügyet tovább bonyolította, hogy sem az apa, sem az anya leánytestvérei nem voltak elérhetőek vizsgálat céljából. Ezenfelül: az anya biztos volt abban, hogy a fiú az ő gyermeke, de hogy ki a gyermek apja, afelől kétségei voltak. Ezért a család elérhető tagjainak (anya: M, fiútestvér: B, leánytestvérek: SÍ és S2, és a vitatott fiú: X) véréből izolált DNS-mintákból Southern blott hibridzációjával DNSujjlenyomatokat készítettünk a fent leírt 33.6 és 33.15 jelű hibridizációs próbák segítségével, melyek mindegyike különböző hipervariábilis miniszatellit-mintázatot ismer fel az emberi DNS-ben.
Az anya (M), a vitatott fiú (X), fiútestvére (B), leány testvérei (SÍ, S2) és egy nem rokon személy (U) véréből izolált DNS-minták 8-8 pg-ját HinfI emésztésnek vetettük alá, 0,7%-os agarózgélben elektroforetizáltuk, majd próbákkal Southern blott hibridizációnak vetettük alá. A készített autoradiogrammokat a 6. ábrán mutatjuk be. Az utódok DNS-ujjlenyomataiban az anya ujjlenyomataiban (M) is előforduló fragmentumokat rövid vízszintes vonallal jelöltük, míg az apai fragmentumokat, amelyek M-ből hiányoztak legalább egy vitán felül állűutód ujjlenyomatában (B, SÍ, S2) megtalálhatóak voltak, hosszabb vonallal jelöltük. Az X ujjlenyomataiban is megjelenő „anyai” és apai fragmentumokat ponttal jelöltük. X DNS-ujjlenyomatai ezeken a fragmentumokon kívül egyetlen azonosítható fragmentu15
-151
HU 203 795 Β mot sem tartalmaztak. Minden fragmentumot a különböző expozíciós időkkel készített eredeti autoradiogrammok alapján vettünk számításba, a nem teljesen szétvált, halványabb csíkokat, különösen a gél alsó része közelében - mivel ezek nem voltak megbízhatóan azonosíthatóak - figyelmen kívül hagytuk.
Az első lépés X apaságának megállapítása volt, a hipervariábilis fragmentummin tázatok alapján. Annak ellenére, hogy az apa DNS-e nem volt hozzáfélhető, DNSujjlenyomatának legnagyobb részét rekonstruálni lehetett azokból a specifikus apai fragmentumokból, melyek M ujjlenyomataiból hiányoztak, de legalább az egyik vitán felüli utód (B, SÍ, S2) ujjlenyomatában jelen voltak. Az ily módon azonosított 39 fragmentumnak kb. fele jelen volt X ujjlenyomataiban is. Mivel nem rokon személyek DNS- ujjlenyomataiban ritkán vannak közös fragmentumok (lásd U személy, 6. ábra) ez az eredmény erősen arra utal, hogy X apja azonos B, SÍ és S2 apjával. Ha ezeket a specifikus apai fragmentumokat nem vesszük figyelembe X ujjlenyomataiban, azokból még 40 különböző azonosított fragmentum marad, melyek mindegyike megtalálható volt M ujjlenyomataiban. Ez viszont erős bizonyíték amellett, hogy X-nek M az édesanyja, vagyis B, S1 és S2 édestestvérek.
Az előzőekben már kimutattuk, hogy annak átlagos valószínűsége, hogy egy személy DNS-ujjlenyomatában előforduló egyik fragmentum, egy másik véletlenszerűen kiválasztott személy ujjlenyomatában is előforduljon, észak-európaiak esetén: kb. 0,2. A megfelelő becsült érték az apa és M viszonylatában 0,26, ami arra utal, hogy a vizsgált ghánaiak esetén a DNS-ujjlenyomatok változatossága nem mutat szignifikáns különbséget az észak-európaiakéhoz képest. A következő becslések elvégzésekor azt az erősen általánosított feltételezést alkalmaztuk, hogy minden fragmentum véletlenszerű, kettős előfordulásának valószínűsége 0,26 (a számításokat a következőkben adjuk közre).
Az első kérdés az, hogy vajon X rokona-e családjának. X DNS-ujjlenyomatai 61 értékelhető fragmentumot tartalmaznak, melyek mindegyike jelen van M és/vagy az apa ujjlenyomataiban. Amennyiben X nem rokon, akkor annak valószínűsége, hogy ujjlenyomatának bármelyik csíkja ezekben a szülőkben jelen van: 1-(1-0,26/-0,45; annak valószínűsége pedig, hogy M és/vagy az apa ujjlenyomataiban X mind a 61 csíkja véletlenül előforduljon: 0,45SI-7*10“. Tehát X nyilvánvalóan a család rokona.
A következő kérdés az, hogy lehet-e X anyja olyan nő, aki nem rokona M-nek. X ujjlenyomatai 40 „anyai” fragmentumot tartalmaztak, melyek közül, becsléseink szerint, kb. 25 származik specifikusan az anyától, a többi fragmentum valószínűleg az apánál és az anyánál egyaránt előfordul, s ezért nem használható fel M anyaságának bizonyítására. X mind a 25 anya-specifikus fragmentuma megtalálható M DNS-ében. Annak valószínűsége tehát, hogy M és X nem rokonok, de véletlenül van 25 közös fragmentumuk: 0,26^-2^10-13. Tehát X és M nyilvánvalóan rokonok
Az utolsó és legnehezebb kérdés, hogy vajon M valamelyik leánytestvére, akinek DNS-e nem volt hoz16 záféihető, lehetett-e X anyja (az apa ebben az esetben természetesen M férje kellett, hogy legyen). Amennyiben annak átlagos valószínűsége, hogy egy fragmentum két nem rokon személy ujjlenyomatában egyaránt előfordul: 0,26, akkor annak valószínűsége, hogy két testvér ujjlenyomatában ugyanaz a fragmentum előfordul: 0,62. Annak valószínűsége tehát, hogy Μ X valódi anyjának testvére, és ujjlenyomataiban véletlenül fordul elő X mind a 25 anya-specifikus fragmentuma: 0,62^-340^.
Ebből arra következtettünk, hogy minden ésszerű kétséget kizáróan, Μ X valódi anyja. Ezeket a bizonyítékokat a bevándorlási hatóság elé tártuk, akik ezután megszüntették a vizsgálatot X ügyében, és megadták számára a letelepedési engedélyt Nagy-Britanniában, lehetővé téve, hogy a fiú családjával maradjon.
Ez a bonyolult eset jól szemlélteti, hogy DNS-ujjlenyomatok rokonsági kérdésekben még olyan esetekben is képesek egyértelmű, pozitív bizonyítékot szolgáltatni, amikor a család bizonyos kritikus tagjai nem elérhetőek. A bemutatott esetet egyszerűbbé tette az a tény, hogy X apja azonos volt a többi vizsgált testvérével, valamint az, hogy X egyetlen olyan apai fragmentumot sem örökölt, ami csak az ő DNS-ujjlenyomatában fordult volna elő, és testvéreiében nem (szabályos eloszlás esetén az apai fragmentumok 1/16-od része így kellett volna, hogy öröklődjön). Az ilyen csak X-re jellemező fragmentumok léte nyilvánvalóan gyengítette volna az X és M közötti rokonság melletti bizonyítékokat, de a gyakorlatban nem feltétlenül tette volna lehetetlenné a bizonyítást X DNS-e valószínűleg semmiképpen sem tartalmazna 5 ilyen apai fragmentumnál többet, a 25 anya-specifikus fragmentum mellett Annak a valószínűsége, hogy 30 azonosított fragmentum közül 25 véletlenül egyezzék meg X és M ujjlenyomatában, ha nem rokonok: 84041. Ugyanez a valószínűség 940Λ ha Μ X nagynénje. Ez a vizsgálat tehát rendkívül meggyőző, és képes világos bizonyítékokat szolgáltatni a legtöbb ilyen esetben az állítólagos rokonság mellett, vagy ellene. Hasonló esetekben általában a család összes érintett tagja elérhető a vizsgálat céljából, ilyenek például az apasági ügyek és a bevándorlással történő családegyesítések. A DNS- ujjlenyomatok csaknem minden ilyen esetben alkalmasak a vitás kérdések eldöntésére.
A DNS-ujjlenyomatok mennyiségi elemzése
M ujjlenyomataiban 61 azonosítható DNS-fragmentumot vettünk számításba, míg 39 specifikusan apai fragmentum létét tudtuk kimutatni az utódoknál. Mivel az apa heterozigóta DNS-fragmentumainak 1/8-a nem jelenik meg sem B, sem SÍ, sem S2 DNS-ében, így az örökölhető apa-spcifikus fragmentumok számának korrigált, becsült értéke: 39*8/7-45. Mivel M és az apa DNS-ujjlenyomataiban közel azonos számú értékelhető fragmentum kell, hogy legyen, ezért azoknak a fragmentumoknak a száma, melyek M és az apa DNS-ujjlenyomataiban egyaránt előfordulnak 61-45-16. Annak valószínűsége (x) tehát, hogy egy tetszőleges fragmentum az apa és M ujjlenyomataiban egyaránt előfor-161
HU 203 795 Β dúl: 16/61—0,26, ami összeegyeztethető a nem rokon észak-európaiakra vonatkozó korábbi becsléssel (x-0,2, 2. hivatkozás).
A 45 apa-specifikus fragmentumnak körülbelül fele adódott át B- re, Sl-re, és S2-re (sorrendben: 18, 24, 18), ahogy az heterozigóta-fragmentumok esetén várható. A 61 anyai fragmentumnak több mint a felét örökölte valamennyi leszármazott (B:32, Sl:38, S2:39, átlagosan: 36,3), ami várható volt, mivel az M ujjlenyomatában található fragmentumok egy része az apa DNS- ében is megvolt, s ezért ezeket a legtöbb (vagy az összes) utód örökli. Ha M DNS-ujjlenyomatai n apával közös - minden utódra átadódó és (61-n) heterozigóta - az utódok felére átadódó - fragmentumot tartalmaznak, akkor n+0,5(61-n)-36,3, ahonnan N-12, ami összeegyeztethető azzal a korábbi becsléssel, hogy az apa és M DNS-ujjlenyomataiban 16 közös fragmentum van (lásd fent). X DNS-ujjlenyomatai 21 apa-specifikus fragmentumot és 40 M-mel közös fragmentumot tartalmaznak. Az anya-specifikus fragmentumok száma, melyek az apa DNS-ujjlenyomataiban nincsenek jelen, kétféleképpen is becsülhető. Először: az anya-specifikus fragmentumok száma durván, meg kell, hogy egyezzen az apa-specifikus fragmentumok számával, azaz 45/2-22,5. Másodszor, X 40 „anyai” fragmentuma közül n (kb. 12) az apa DNS-ében is megtalálható, így X DNS-ében 28 anya-specifikus fragmentum marad. Ezért az X által örökölt, anya-specifikus fragmentumok száma kb. 25.
A DNS-vjjlenyomatok csíkjai közös előfordulásának valószínűsége:
Annak átlagos valószínűségét, hogy egy DNS-ujjlenyomat egy fragmentuma egy másik, véletlenszerűen kiválasztott személy DNS-ujjlenyomatában is előforduljon (azonos elektroforetikus mobilitással és autoradiográfíás intenzitással) x-szel jelöljük (x-0,2-0,26, lásd fent). A nagyobb miniszatellit-fragmentumok ritkábban fordulnak elő véletlenszerűen 2 ujjlenyomatban egyszerre, ami valószínűleg a kisebb allélgyakoriságnak és a jobb elektroforetikus felbontóképességnek köszönhető, ezért a fragmentumok közös előfordulásának x valószínűsége mérettől függően heterogén. Mivel majdnem mindegyik fragmentum függetlenül öröklődik, annak maximális valószínűsége, hogy 2 véletlenszerűen kiválasztott személy DNS-ujjlenyomatának mind az n fragmentuma közös legyen x; és x értékének minden heterogenitása tovább csökkenti ezt a valószínűséget.
Közös csíkok előfordulása testvérek
DNS-ujjlenyomataiban:
Amennyiben a közös csíkok minden esetben ugyanazon hipervariábilis lókusz azonos alléljét jelentik, akkor x a következő módon függ az átlagos allélgyakoriságtól (q): x-2q-qJ, amiből levezethető, hogy annak valószínűsége, hogy egy személy DNSujjlenyomatában jelen lévő valamely fragmentum testvére ujjlenyomatában szintén megtalálható: (4+5q-6qJ+q3)/4(2-q).
Mivel x-0,26, q-0,14, így két testvér DNS-ujjlenyomatának csíkjai 0,62 részben közösek. Ez a valószínűség egy kicsit kisebbnek adódik, ha feltételezzük, hogy a különböző véletlenszerűen kiválasztott emberek DNS-ujjlenyomatainak közős csíkjai sohasem azonos alléleket jelentenek, vagyis sok miniszatellit-régiónak vannak azonos méretű alléljei.
A DNS-ujjlenyomatok alkalmazása öröklődő betegségek vizsgálatában
Annak eldöntése céljából, hogy a DNS-ujjlenyomatok alkalmasak-e emberi öröklődésbeli kapcsoltságok vizsgálatára, különös tekintettel olyan hipervariábilis DNS-fragmentumok azonosítására, melyek nagy családokban együtt szegregálódnak bizonyos betegségekért felelős fókuszokkal, két nagy család DNS-ujjlenyomatait vizsgáltuk meg. Az egyik családban a neurofibromatózis szegregációját kísértük figyelemmel, a másik családban pedig a magzati hemoglobin örökletes fennmaradásának szegregációját, amely valószínűleg egy olyan domináns, autoszomális génhez kötött, amelyik nem mutat kapcsoltságot a β-globin-gén klaszterrel.
8. példa
Hipervariábilis miniszatellit-fragmentek szegregációja egy neurofibromatózist hordozó családról készített DNS-ujjlenyomatokban.
A vérből származó DNS-mintákat HinfI restrikciós endonukleázzal emésztettük, 35 cm hosszú 0,7%-os;·, agarózgél-lapon elektroforetizáltuk, majd Southern blott analízisnek vetettük alá a 33.6 és 33.15 jelű miniszatellit-hibridizációs próbák segítségével. A 7. ábrán bemutatjuk a betegséget nem hordozó apáról (F), 5 fiáról (S) és 6 lányáról (D) készült DNS-ujjlenyoroatokat; a betegséget hordozű anyáról nem volt lehetőségünk DNS-ujjlenyomatot készíteni. A neurofibromatózist többszörösen hordozó leszármazottakat (+) jellel jelöltük, a többi leszármazott a neurofibromatózis semmi jelét sem mutatta. Az azonosított heterozigóta apai (·) és anyai (o) eredetű DNS-fragmentumdcat megjelöltük, és ezeknek az utódokban történő elkülönülését közvetlenül az eredeti autoradiogrammok alapján detektáltuk, úgy, hogy azokat minden esetben rövid, közepes és hosszú ideig is exponáltuk. Csak azokat a fragmentumokat vettük számításba, melyeknek mind a pozíciója, mind a relatív radioaktív intenzitása minden utódban megegyezett a megfelelő szülői fragmentummal. Az olyan kapcsolt AB DNS-fragmentumokat, melyeknek utódokbeli szegregációja AB vagy — alléleket eredményezett, folyamatos vonallal kötöttük össze, míg pontozott vonal kapcsolja össze azokat a fragmentumokat, melyek szegregációja A- és -B alléleket is eredményez. Csillaggal jelöltünk egy olyan anyagi fragmentumot, melynek öröklődése kapcsoltságot mutat a neurofibromatózis öröklődésével; mind a hat megbetegedett utód örökölte ezt a fragmentumot, az öt egészséges gyermek közül pedig négyben nincs meg ez a fragmentum, így e fragmentum és a neurofibromatózis öröklődése között 10/11 arányú összhang áll fenn.
-171
HU 203 795 Β
Anyagok és módszerek
DNS-izolálás
A friss vért egyenlő térfogatú 1»SSC oldattal meghígítottuk (SSC-sós nátrium-citrát, 0,15 M NaCl, 15 mM trinátrium-citrát, pH 7,0), Histopaque-1077 (Sigma) fölé rétegeztúk, majd a magvas sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze. Más esetben a fagyasztott vért kétszeres térfogatú 1«SSC pufferben olvasztottuk fel, és a magvas sejteket, valamint a sejtmagokat 15 percig 10 000 g-mal végzett centrifugálással ülepítettük ki. A nagy molekulasúlyű DNS-t Jeffreys, A. J. módszere szerint izoláltuk (Cell 18,1-10,1979).
Southern blatt hibridizációs analízis 5 pg humán DNS-mintát 20 egység HinfI endonukleázzal emésztettünk 37 ’C-on, 2 órán keresztül 4 mM spermidin-triklorid jelenlétében, majd fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítottuk. Az emésztett DNS-mintát ezután 16 pl víz, 4 pl felvivő puffer (12,5% ficoll 400,0(2% brómfenolkék, 0,2 M Tris-acetát, 0,1 M Na-acetát, 1 mM EDTA, pH 8,3) és 2 pl 5 mg/ml ethidium-bromid elegyében feloldottuk, majd vízszintesen futtatott agarózgél-lapra vittük (0,7% Simga Type I agaróz, 40 mM Tris-acetát, 20 mM Naacetát, 0,2 mM EDTA, 0,5 pg/ml ethidium-bromid, pH 25 8,3; a géllapok 0,7 cm vastagok és 20 vagy 35 cm hosszúak voltak). A géllapot 10 percig ekvilibráltuk, majd 24-48 órán át elektroforetizáltuk 2 V/cm feszültségeséssel mindaddig, amíg minden 14 kilobázisnál rövidebb DNS-fragmentum ki nem futott a gélből. A 30 DNS-t ezután blott technikával nitrocellulóz filterre (Sartorius, pórusméret 0,45) vittük át. A 3IP-jelzett, egyszálú DNS-hibridizációs próbákat a 33.6 és 33.15 jelű, rekombináns M13 fágokból állítottuk elő, melyek humán miniszateilit-DNS-t tartalmaztak. A próbákat a 35 Southern blott mintákhoz hibridizáltuk 65 ’C-on, bSSC pufferben, és a bejelentés fő részében leírtak szerint autoradiografáltuk.
Az adatok kiértékelése
A szegregációs adatok tárolását és kiértékelését egy BBC model B típusú mikroszámítógép segítségével oldottuk meg.
A 3. táblázat a neurofibromatózist hordozó családban előforduló miniszatellit-markereket foglalja össze.
3. táblázat apa anya
hibridizációs próba 33.6 33.15 33.6 33.15
detektált fragmentek
száma (n) 24 17 16 16
allelikus párok száma (a) 3 3 2 4
kapcsolt párok száma (b) 1 0 1 0
a különböző azonosított
lókuszok száma (c) 20 14 13 12
az összes lókusz becsült
száma (N) 43 23 27 16
A különböző azonosított lókuszok (c) számát a következő képlettel írhatjuk le: n-a-b. A teljes DNS-ujjlenyomat, amely az azonosíthatatlan fragmentumokat is tartalmazza, N darab heterozigóta lókuszból származik (2N ffagment). Feltételezve, hogy az (n-b) számú azonosított különálló fragmentum véletlenszerűen választott ki az ujjlenyomat összes (2N számú) fragmentuma közül, a hipervariábilis lókuszok becsült teljes értéke (N) a következőképpen függ az adott hibridizációs próba által azonosított allelikus párok számától (a):
(n-b) (w-fe-1) (
2a
4. táblázat
A hipervariábilis fragmentumok szegregációja, a neurofibromatózist hordozó családban
átadódás hány gyerekre egy adódott át az adott Apa fragmentum ffagmentumpár 10 talált Anya egy fragmentum fragmentumpár (AB vagy—)
várt talált (AB vagy -) 20 várt talált U
fragmentum (r) talált U várt 30 30 várt 20 10
0 0 0,02 (0) 0 1 2 9 (0) 0,02 (0) 0 0 1 6
1 0 0,2 4 3 5 8 19 1 0,2 0 2 3 5 13
2 1 14 16 15 18 22 31 2 0,9 5 8 10 13 19
3 1 3,3 48 45 47 49 51 3 2,6 26 24 26 27 28
4 5 6,7 90 90 89 85 76 5 52 48 48 47 45 38
5 8 9(2 113 127 121 114 95 6 7(2 61 68 64 59 45
6 12 9(2 120 127 121 114 95 5 7(2 77 68 64 59 45
7 10 6,7 89 90 89 85 76 6 52 52 48 47 45 38
8 4 3,3 58 45 47 49 51 4 2,6 23 24 26 27 28
9 0 1,1 19 15 18 22 31 0 0,9 7 8 10 13 19
10 0 0(2 4 3 5 8 19 0 0,2 1 2 3 5 13
11 (0) 0,02 (0) 0 1 2 5 9 (0) 0,02 (0) 0 0 1 6
átadódási
gyakoriság 53,0±2,4% 47,7±2,7%
-181
HU 203 795 Β
A hipervariábilis fragmentumok (7. ábra) átadódási gyakorisága tanulmányozásának céljából, a 33.6 és
33.15 jelű hibridizációs próbák által azonosított n darab fragmentum közül azoknak a számát, melyeket a 11 utód közül pontosan r darab örökölt, összevetettük a binominális eloszlás alapján számítható várható érték50% átadódást feltételezve (4. táblázat). Azok a fragmentumok, amelyek minden utódnál megtalálhatóak, feltehetően homozigóta-lókuszokból származnak, így ezeket figyelmen kívül hagytuk. Azokat az anyai fragmentumokat, amelyek egyik gyermeknek sem adódtak át, nem tudtuk azonosítani, mivel anyai DNS-minta nem állt rendelkezésünkre. A táblázatban feltüntettük az átlagos átadódási gyakoriságokat (-S.E.M.) is.
Az AB fragmentumpárok közötti kapcsoltságot úgy vizsgáltuk, hogy megszámoltuk, hogy hány leszármazottnál öröklődött kapcsoltan az AB pár (AB vagy —), minden lehetséges apai-anyai fragmentumpárosítást figyelembe véve; először a kizárt alléleket majd a csatolt sávokat vettük számításba (eszerint minden szülő esetén a darab lókuszt lásd 3. táblázat, s így c(c-l) különböző párt vizsgáltunk). Azok a fragmentumpárok, amelyek sorrendben 0, illetve 11 utódnak adódtak át, alléleket, illetve szoros kapcsoltságban öröklődő párokat jelentenek, a definíció értelmében tehát egy pár sem esik ezekbe a kategóriákba. A megfigyelt megoszlást egyrészt összehasonlítottuk azzal a várható értékkel, amit akkor kapnánk, ha mind a c darab lókusz függetlenül öröklődne (U). Ebben az esetben azoknak a pároknak a számát, melyekre nézve pontosan r darab (AB vagy —) utód van, a binominális eloszlás alapján a következő módon kaphatjuk meg:
Cr c(c-l)
2“ ’ 2
A megfigyelt megoszlást oly módon számított várható értékkel is összevetettük, ahol a c darab lókusz egymástól egyenlő távolságra lévő klaszterekbe kapcsoltan öröklődik, ahol a szomszédos fókuszokat egymástól 0 rekombinációs gyakoriság választja el (Θ-10,20 vagy 30 cM). A klaszter ily módon (c-l)’1' térképegységgel fog szétterjedni, ahol ψ-1/2 1 η (1-2Θ). Ily módon azoknak a pároknak a számát, melyekre nézve c darab fókuszt figyelembe véve (véletlenszerűen az egyik, illetve másik alléiból mintát véve), pontosan r darab (AB vagy—) utód van, 11 utód esetén, a következő képlet adja meg:
£fcT>(c-í) ahol Xi az egymástól i térkép egység távolságra lévő lókusz rekombinációs hányadosa; Xi a térkép függvény alapján számítható:
Xi-jd-e**)
Eredmények
DNS-ujflenyomatkészítő hiridizációs próbák
Az ebben a példában használt két miniszatellit-hibridizációs próbát a bejelentés fő részében már pontosan ismertettük. A 33.15 jelű hibridizációs próba egy klónozott humán miniszatellit-régiót tartalmaz, amely a „core”szekvencia egy 16 bázispáros variánsának 29-szeres ismétlődéséből áll. A 33.6 jelű hibridizációs próba ismétlődő egysége egy nem teljesen szabályos trimer, amely a „core”-szekvencia leginkább konzervált 3'végi 11 bázispáros részletének háromszoros ismétlődése, s ez az egység ismétlődik 18-szor. A következőkben megadjuk a „core” és a hibridizációs próbák ismétlődő egységeinek szekvenciáit A
A core GGAGGTGGGCAGGAGG
33.15 AGAGGTGGGCAGGTGG
33.16 AGGGCTGGAGG
Mivel a 33.6 és a 33.15 jelű hibridizációs próbák mind szekvenciájukban, mind az ismétlődő egységek hosszában különböznek, a HinfI enzimmel emésztett humán DNS-ben különböző hosszú hipervariábilis miniszatellit-fragmentumokat detektálnak, s így egymástól különböző mintázatot adnak. A HinfI restrikciós endonukleáz felismerőhelye 4 bp hosszúságú, s így használata rendkívül megnöveli a módszer feloldóképességét, mivel emésztéskor olyan fragmentumok keletkeznek, melyeken a hosszú tandemismétlődéseket tartalmazó miniszatellit-régió mellett kevés kísérőszek- ? vencia található.
A DNS-ujjlenyomatok vizsgálata egy nagy családon belül
A különböző miniszatellit-ffagmentumok szegregációjának megfigyelése érdekében 11 angol nemezetiségű testvéren és édeapjukon végeztünk vizsgálatokat, a családban a neurofibromatózis öröklődését kísértük figyelemmel. A neurofibromatózis (von Recklinghausen kór) egy autoszomális, domináns rendellenesség, amely a perifériás és centrális idegrendszer daganatos megbetegedésével jár együtt. Mind ez ideig semmilyen genetikai markert nem találtak, ami a betegséggel kapcsoltan öröklődne.
All gyermek (6 beteg és 5 egészséges) véréből, a
33.6 és 33.15 jelű hibridizációs próbák segítségével készített DNS-ujjlenyomatokat összehasonlítottuk egészséges édesapjuk hasonlóan készített DNS-ujjlenyomatával (7. ábra). A miniszatellit-DNS-fragmentumok lehető legjobb szétválasztását 35 on hosszú agarózgélben történő eiektroforézissel biztosítottuk.
Mivel a hipervariábilis miniszatellitek közül - a várakozásnak megfelelően - sok kis allélgyakoriságú (különösen a legnagyobb fragmentumok), és megoszlásuk rokonságban nem álló személyek között véletlenszerű, ezek közül a fragmentumok közül sok heterozigőta formában van jelen a neurofibromatózist hordozó családban, ezért ezek a fragmentumok csak a leszármazottak egy részének adódtak át. Bár a beteg édesanya DNS-e nem volt hozzáférhető, mégis könnyen azono19
-191
HU 203 795 Β síthattunk olyan anyai eredetű miniszatellit-fragmentumokat, melyek több utódban jelen vannak, de az édesapából hiányoznak. Hasonlóképpen tudtuk azonosítani az apai eredetű fragmentumokat is. A 33.6 és 33.15 jelű hibridizációs próbákat egyaránt felhasználva 41 apai eredetű és 32 anyai eredetű DNS-fragment szegregációját tudtuk az utódok között kimutatni (7. ábra, 3. táblázat). Ennél jóval több polimorf fragment létezik, de ezek vagy kifutottak a gélből az elektroforézis során, vagy nem tökéletesen váltak szét egymástól, s ezért nehezen azonosíthatóak.
A heterozigóta apai eredetű DNS-fragmentumok átlagosan 53%-ban adódtak át az udódoknak. Az anyai eredetű fragmentumok hasonló mértékben, 48%-osan adódtak át, ami megfelel az 1:1 arányú megoszlásnak (lásd 4. táblázat). Továbbá azon gyerekek száma, melyek megkaptak egy bizonyos fragmentumot, követte a várt binomiális eloszlást, amely szerint az apai eredetű fragmentumok aránya, mely all gyermek közül pontosan r darabban található meg llCr
211 (lásd 4. táblázat). így feltehető volt, hogy a fenti DNSfragmentumok követik a Mendel-féle öröklődést, és a szülői eredetű sávok értékelését, (különösen a kicsi és rosszul elválasztható fragmentumokét), nem befolyásolja szignifikánsan kettő vagy több egymásra eső fragmentum szegregációja, ami 75%-nál nagyobb átadődási gyakoriságot eredményezne. Az utódok apaságának, illetve anyaságának korrekt megállapítása szintén ezekre a DNS-ujjlenyomatokra támaszkodik.
A példa szerinti sokgyermekes családban az apai és anyai eredetű DNS-fragmentumok szegregációs mintázatainak páronkénti összevetése lehetőséget nyújt allelikus fragmentpárok és olyan további párok azonosítására, amelyek szoros kapcsoltságot mutatnak. (Egy adott sávpár véletlen koszegregációjának a valószínűsége 1/1024 ebben a családban.) Számos esetben mind az anyai, mind az apai fragmentumok alléi párjai mindkét próbával meghatározhatóak voltak. (Lásd 7. ábra.) A 33.6 próbával mind az anyában, mind az apában találtunk kapcsolt párt Hasonló kapcsolódást találtunk egy másik családfában (lásd alább). Ennek alapján feltételezhetjük, hogy a 33.6 próbában legalább egy olyan hipervariábilis régió is hibridizál, amely közbülső Hinfl hasítóhely(ek)et tartalmazó miniszatellit (vagy szatellit), így a hasítás két vagy több olyan fragmentumot eredményez, amely a családban mint „haploid típusú” miniszatellit koszegregál. A 33.15 próbával meghatározott polimorf DNS-fragmentumok egyike sem volt fellelhető a 33.6 próbával meghatározottak között. Azok a fragmentek, amelyek mindkét próbával hibridizáltak volna, egyforma helyzetű csíkként jelentkeztek volna, mint ugyanattól a szülőtől ugyanannak a gyereknek átadott fragmentek (azaz kapcsolt fragmentek). Vagyis a két próba teljesen más részét hibridizálja az emberi miniszatellit-régiónak.
Az allelikus és a kapcsolt fragmentumok elhagyásával 23 különböző apai, illetve 25 különböző anyai lőkuszt azonosítottunk. (Lásd 3. táblázat.) A lókuszok kb. 80%-ánál a két alléi közül csak az egyik került azonosításra, míg a megfelelő alléi párok feltehetően a rosszul elkülöníthető rövidebb miniszatellit-fragmentumok közé kerültek. Ez arra utal, hogy a miniszatellitallélok hosszában nagy különbségeknek kell lenniük, feltehetően a tandemismétlődő régiókban lévő eltérések miatt A 7. ábrában látható azonosított alléi párok közül sok valóban lényeges hosszúságbeli különbséget mutat. Azoknak a sávoknak az arányából, melyek alléi párokhoz rendelhetők, meg lehet becsülni a 33.6 és
33.15 próbákkal detektált összes DNS-ujjlenyomatban található lókuszok számát Ez kb. 43-66 darab, amelyeknek nagyjából a fele apai, illetve anyai eredetű (lásd 3. táblázat). Az utódokba átadódott anyai, illetve apai fragmentumok között nem lehetett alléi kapcsolatot megállapítani.
Az összes apai lókusz autoszomális eredetű és sem a lányok, sem a fiúk irányában nem mutattak specifikus átadódást Továbbá az összes apai DNS-ből származó AB fragmentumpár nyilvánvalóan független módon szegregálódott az utódokba, lényegében azonos arányban szolgáltatva AB, — és A-, -B leszármazottakat. A pontos értékek követték a várt binomiális eloszlást (lásd 4. táblázat). Az anyai DNS-fragmentumok hasonlóképpen viselkedtek. A részletesebb vizsgálatok azt sugallták, hogy ezek között a lókuszok között a minimális távolság nagyobb mint 30 cM [46 térképegység („map units”)]. Kisebb távolság esetén szignifikánsan jelentkeznének olyan fragmentpárok, melyek koszegregációra (párba kapcsolódásra) lennének hajlamosak, vagy mint pszeudó allélek szegregálnának (vagylagos kapcsoltságban). (Lásd 4. táblázat.) A meghatározható miniszatellitek a 3000 cM hosszú emberi DNS-nek legalább a felében szétszórtan megtalálhatóak, és sok, esetleg az összes emberi autoszómán is jelen kell lenniük.
Az anyai fragmentumok egyike (lásd 7. ábra) laza kapcsoltságot mutat a neurofíbromatózissal, mivel a 11 gyerek közül 10-nél megfigyelhető volt a fragmentum és a betegség közti kapcsoltság (0-10 cM, p-0,006). Mivel azonban 25 különböző anyai lókuszt azonosítottunk, igen nagy (p—0,24) a valószínűsége annak, hogy legalább az egyik ilyen fókusznak az egyik allélja véletlenszerűen mutatja a kapott mértékű páros vagy vagylagos kapcsoltságot.
9. példa
Egy nagy család több generációjának DNS-ujjlenyomatai: a HPFH-val való esetleges kapcsoltság vizsgálata
Egy nagy, négygenerációs ázsiai gujerati családra is alkalmaztuk a DNS-ujjlenyomat-analízist, amelyben mind β-thalassemia, mind az örökletesen fennmaradó magzati hemoglobint eredményező betegség (HPFH) szegregációja megfigyelhető volt
A 8. A és 8. B ábrákon bemutatott jellemző szegregációs mintázatok autoradiogrammjait a következő módon kaptuk.
pg vérből nyert DNS-t HinfI enzimmel emésztettünk, és a 7. ábra szerinti DNS-ujjlenyomatokat állítot-201
HU 203 795 Β tűk elő a 33.6 (A) vagy a 33.15 (B) próbát használva.
Az elektroforézist egy viszonylag rövid (20 cm) agarózgélben végeztük. Az egyének közötti rokonság a 9. ábrán van megadva. A 9. A ábrán az a, b és c hipervariábilis fragmentumok szorosan kapcsoltak: vagy mind- 5 egyik megtalálható, vagy mindegyik hiányzik a család tagjainál. A 9. B ábra a „g” sáv és a HPFH koszegregációját illusztrálja. A IV 7 és IV 8 egyének egypetéjű ikrek, és a DNS-ujjlenyomatuk megkülönböztethetetlen. 10
A felhasznált anyagok és módszerek a 8. példában leírtakkal egyezők.
A koszegregáció analízisét a 9. A és 9. B ábra szemlélteti.
A 9. A ábrán a Π 4 egyén 30 hipervariábilis frag- 15 mentjének és a Π 5 egyén 27 hipervariábilis fragmentjének a III 1-11 utódokba történt szegregációját vizsgáltuk meg, az esetleges szülői AB fragmentek kapcsoltságára nézve. A kapcsoltság lehetséges példáit, melyek legalább 6/7-es öröklődést gyakoriságot mutat- 20 tak (AB és —), további rokonoknál is megvizsgáltuk. A következőkben a kapcsoltság két legvilágosabb példáját mutatjuk be (a-f: a-f fragmentek megléte egy egyénben; · : fragmenthiány). Az a-c és e-f fragmentek tökéletes koszegregációt mutatnak. A d fragment tendencia- 25 jellegű koszegregációt mutat az a-c fragmentekkel, de a IV 1-4 generáció mintázata ebből a szempontból nem informatív és IV 7-8 egypetéjű ikrek a vizsgált fragmentumokra nézve rekombinánsak, mert ók csak az a-c fragmenteket örökölték, a d-t nem. A B ábrarészen a 30 β-thalassaemia öröklöttségének a jelei:© , D , a HPFH jele a H, a „g” pedig egy miniszatellit- fragment. Az egyéneket a HPFH-betegség szempontjából aszerint különítettük el, hogy HbF>l% (normális), vagy HbF>3% (β-thalassaemiára jellemző). A HPFH és a 35 β-thalassaemia jellemzői függetlenül szegregálódtak a ΠΙ 1-11 és a IV 5-8 utódokba, és nemkapcsolt lókuszokként azonosítottuk őket. A g fragment tökéletesen koszegregált a HPFH-val a vizsgált személyeknél.
Eredmények
Amint a 9. A ábra mutatja, a HbF szint emelkedése a β-thalassaemia tulajdonságtól függetlenül adódik át, és nyilvánvalóan egy autoszomális domináns fókusz által determinált, ami nem kapcsolódik a β-globin-génklasz- 45 terhez. Egy hasonló szardíniái családfát ismertet a Gianni et al, EMBO J. 2. 921-925 (1983) cikk.
A 8. A és 8. B ábrán 30 variábilis fragmentet értékeltünk a nagypapában (Π 4), és 27 fragmentet a nagymamában (Π 5). Az ő hét leszármazottjuk (ΠΙ1-11) vizs- 50 gálatából következett, hogy ezek a fragmentek legalább 22 különböző, nem kapcsolódó apai, illetve 18 ilyen anyai autoszomális fókuszból származtak - az alkalmazott kritériumok a neurofibromatózisos családnál leírtakkal egyezők. A maradék DNS-fragmentumok 55 nyilvánvaló allelizmust vagy kapcsoltságot mutattak más fragmentekkel, noha a bizonyítás ilyen a kis rokonságon belül nem lehetséges. (Annak, hogy egy szülői DNS-fragmentpár allelikus, vagy kapcsolt párként adódik át 1:64 az esélye egy héttagú családban.) A 60 családfa további tagjainál kerestünk további bizonyítékokat a kapcsoltságra, és a két legnyilvánvalóbb kapcsoltságot a 8., illetve 9. példában ismertettük. Az a, b és c fragmentumokat a 33.6 próbával detektáltuk, melyek a Π 4 egyéntől kivétel nélküli kapcsoltságot mutatva adódtak át gyermekeinek (ΙΠ 1-11), illetve unokáinak (TV 1-8), a 14 kiértékelhető leszármazott közül egyik sem volt rekombináns (^4409 három koszegreáló sávra). A fentiek azt sugallják, hogy az a-c fragmentek egy azonos hipervariábilis fókuszból származó „haploid típusú” miniszatellitet reprezentálnak. A
33.15 próbával detektált d sáv szintén nyilvánvaló kapcsoltságot mutat az a-c fragmentekkel, habár a IV 1-4 generáció ujjlenyomatai ebből a szempontból nem informatívak, mivel mindkét szülő rendelkezik a d fragmenttel, és a IV 5-8 generációban pedig rekombinánsok is előfordulnak (a IV 7-8 egypetéjű ikrek). Ennélfogva az a-c csoport és a d fragment közti kapcsoltság bizonyítottsága gyenge (Θ-10 cM, p-0,01). Az anyai eredetű e sáv (a 33.6 próbával készült), illetve f sáv (a
33.15 próbával készült), szintén szoros kapcsoltságot mutat mind II 4 és Π 5 utódainál, mind a további, egymással rokon ΙΠ 15-20 és IV 17-22 generációkban (20 informatív utód, nincs rekombináns, 0-0 cM, p-106). Mivel a 33.6 és a 33.15 próbák más miniszatellit-régiókat ismernek fel, és nem történt kereszthibridizáció az e és f fragmentek esetén, ezek a fragmentek autentikus példaként szolgálnak két különböző fókusz. kapcsoltságára. Végezetül, a két kapcsoltságot mutató ? csoport (a-c és e-f fragmentek) nem egy-egy fókusznak : az alléljai. A ΠΙ 1 személy heterozigóta hordozója mind az a-c csoportnak, mind az anyai e-f párnak. Mindkét csoport két gyermekének adódott át a négy közül, ez azt bizonyítja, hogy nem alléi szegregációról van szó, hanem a fenti csoportok két nem kapcsolt hipervariábilis régióból származnak.
A Π 5 anyai miniszatellit-fragmentek közül egyik sem mutatott szignifikáns kapcsoltságot a β-thalassaemia jellemzőjével, ennélfogva nincs közeli kapcsoltság a 11-es kromoszóma β-globin-géncsoportjával sem. Ezzel szemben a 8,6 kilobázisos g anyai fragment 7 közvetlen leszármazottban és 3 kiértékelhető unokanemzedékben koszegregált a HPFH-val (lásd 9. ábra). Nem volt rekombináns a 12 leszármazott között, ami igen szoros kapcsoltságot sejtet (6-0 cM, p-2404). Annak ellenére, hogy a Π 5 egyénnél 17 különböző fókuszt vizsgáltunk egyidejűleg, a kapcsoltság még mindig szignifikáns (0,004 annak a valószínűsége, hogy a 17 figyelembe vett fókuszok egyikének allélja véletlen koszegregációt mutasson a HPFH-val). További vizsgálatokkal bizonyítottuk, hogy a Π 5 egyén g fragmentje egyetlen miniszatellit-allélt képvisel, és nem két egymásra került DNS-fragmentum. A 9. ábrán bemutatott összes egyén DNS-ujjlenyomatát előállítottuk úgy is, hogy DNS-üket HinfI helyett Sau3A enzimmel emésztettük. Minden g-re pozitív DNS-ujjlenyomat rendelkezett egy g fragmentnek megfelelő hasonló méretű (8,6 kB helyett 8,2 kB) Sau3A ffagmenttel, ami arra utal, hogy egyetlen miniszatellit- fragmentumról van szó.
-211
HU 203 795 Β
Eredmények értékelése
Az emberi családfa-analízis megmutatta, hogy a miniszatellit-próbákkal detektált DNS-ujjlenyomatok megbízhatóan használhatók erősen heterozigóta DNSfragmentumok szegregációjának vizsgálatára, még akkor is, ha az egyik szülő nem áll rendelkezésre a vizsgálatokhoz. Egy személynél, két próbát felhasználva, 34 hipervariábilis fókusz egyidejű analízise is elvégezhető, ami a genetikai markereknek egy olyan nagy csoportja, mely messze meghaladja a hagyományos módszerekkel egyidejűleg vizsgálható markerek számát, beleértve az RFLP vizsgálatokat is. A variábilis miniszatellit-fragmentek stabil öröklődése, valamint az egyes fragmentumok alacsony populációs gyakorisága ideálisan alkalmassá teszi őket kapcsoltság vizsgálatára, mint ahogy azt láthattuk a két családfánál feltárt kapcsoltságoknál. Ki szeretnénk hangsúlyozni azt, hogy bár lehetséges, hogy ezek hipervariábilis miniszatellitek rekombinációs centrumok (rekombinációra erősen hajlamos részek), a hosszú miniszatellitiészekben előforduló nem ekvivalens cserék becsült gyakorisága (kb. 0,001 gamétánként) nem elég nagy ahhoz, hogy szignifikánsan befolyásolja a miniszatellit-lókusz és a szomszédos, betegséget hordozó lókusz közti kapcsoltság kimutathatóságát.
A 33.6 és a 33.15 próbákkal együttesen meghatározott lókuszok számát 60-ra becsülték. Mivel körülbelül a lókuszok felénél legalább az alléi párok egyike azonosítható egy adott DNS-ujjlenyomatban, ezért a különböző DNS-ujjlenyomatok általában azonos a 16kuszspektrumot érintenek. A legtöbb (esetleg az öszszes) vizsgált lókusz genetikailag nem kapcsolt, ezért ezek a humán genom nagyrészén, szétszórtan kell hogy elhelyezkedjenek. A pontos helyzetük nem ismert, megismerésükhöz meg kell várni az egyes hipervariábilis lókuszok klónozását és környezetük meghatározását. Érdekességként említjük azt, hogy az eddig vizsgált családfák egyikénél sem találtak az X, illetve az Y kromoszómákon miniszatelliteket. Becsléseik szerint megközelítőleg 43 különböző lókuszt vizsgáltunk meg a lehetséges szexuális kapcsoltságra vonatkozóan a neurofibromatózisos család családfőjénél és HPFH-betegséggel terhelt család Π 4 jelű tagjánál Mivel az X és az Y kromoszómák a férfiak DNS-ének kb. 5%-át teszik ki, annak a valószínűsége, hogy a véletlenszerűen elosztó lókuszok egyike se helyezkedjen el ezeken a kromoszómákon 0,9543-0,l, így a nemmel kapcsoltságot mutató miniszatellitek tapasztalt hiánya nem szignifikáns.
Ezek a szétszórt hipervariábilis miniszatellitek jól alkalmazhatók olyan markerek keresésére, melyek valamilyen betegséget hordozó fókuszhoz kacsoltak. Ezt be is mutattuk esetlegesen választott példáinkban, ahol a neurofibromatózis, illetve a HPFH kapcsoltságát vizsgáltuk. Ellentétben a hagyományos egylőkuszos genetikai analízisekkel, a DNS-ujjlenyomatok kapcsoltsági adatait nem lehet bővíteni több, rokonságban nem álló családok vizsgálatával, mivel minden családban valószínűleg különböző miniszatellit-allél kapcsolt a betegséget hordozó fókuszhoz. Ezzel szemben a
DNS-ujjlenyomatokon alapuló meghatározás csak kiterjedt családfa esetén megfelelő módszer a kapcsoltság vizsgálatára (különösen domináns rendellenességek esetén), legideálisabb pedig a sokgyermekes családok esetén.
Végül is a 33.6 és a 33.15 próbák egyénenként 34 darab autoszomális hipervariábilis lókusz meghatározását tették lehetővé. 20% a valószínűsége annak, hogy legalább az egyik ilyen lókusz szoros kapcsoltságot mutasson egy adott betegséget hordozó fókusszal (10 cM-en belül), feltételezve azt, hogy a miniszatellitek véletlenszerűen oszolnak el a 3000 cM hosszúságú emberi géntérképen. Több generációs családfáknál, mint péládul a HPFH-betegséget hordozó családnál, ez a valószínűség kb. 10%-ra csökken, mivel a legtöbb fókusznak csak az egyik allélje kiértékelhető, és ahhoz, hogy kimutathassuk a kapcsoltságot, ennek az alléinak párkapcsoltságot kell mutatni a betegségfókusszal. Ahhoz, hogy ezt a valószínűséget 50% fölé emelhessük, több mint 104 hipervariábilis lókuszt kéne azonosítanunk egy sokgyermekes családban, és több mint 204-et egy több generációs családfa esetén. Ezek a számok meghaladják a két felhasznált miniszatellit-próbával meghatározott összes lókuszok számát Azonban a 33.6 és a 33.15 próbákkal alapvetően különböző hipervariábilis miniszatellit-csoportokat detektáltunk, ami azt sugallja, hogy a „core”-szekvencia variánsait tartalmazó humán miniszatellitek száma igen nagy lehet.
A konvencionális humán családfa-analízisnél meghatározott egylőkuszos genetikai markeleket használnak, amennyiben vizsgált marker és a betegséglókusz közötti kapcsoltságot sikerül kimutatni, abból következtetni lehet a betegségért felelős génnek a DNS-en belüli körülbelüli elhelyezkedése, ami tovább pontosítható további családfák analízisével. A fentiek ellentéte igaz a DNS-ujjlenyomatokra. Egy hipervariábilis DNS-fragment és egy betegség közti esetleges kapcsoltság további vizsgálata csak a fragment preparatív gélelektroforézissel történő izolációja és klónozása után lehetséges. Az izolált miniszatellitből kiindulva a lókuszspecifikus hibridizációs próbákat tervezhetünk, akár egy jellemző, az izolált miniszatellitet közvetlenül szegélyező DNS-szekvenciarészlet felhasználásával, akár a teljes miniszatellittel történő, szigorú körülmények között végrehajtott hibridizáció segítségével. Ezek a lókuszspecifikus próbák felhasználhatók mind a kapcsoltsági adatok további családokra való kiterjesztésére, mind a miniszatelliteknek a humán DNS-en belüli helyének meghatározására. Ennek a megközleítésnek a bizonyítása folyamatban van egy 8(2 kB nagyságú Sau3A enzimmel végzett hasítással kapott miniszatellit-fragment klónozásával, amely fragment nyilvánvaló kapcsoltságot mutatott a Gujerati családban a HPFH-lókusszal.
Amint azt a korábbiakban leírtuk, a 333, 33.6 és a
33.15 próbák mindegyike olyan miniszatelliteket tartalmaz, amelyek a „core”-szekvencia különféle variánsait tartalmazzák, eltérő DNS-ujjlenyomatokat eredményeznek és a humán vagy egyéb gerincesek DNS-ének különböző hipervariábilis miniszatelit-csoportjait de-221
HU 203 795 Β tektálják (lásd A. J. Jeffreys, V. Wilson, S. L. Thein, D. J. Weatherall és B. A. J. Ponder szerzők harmadik bejelentésében leírtak), annak köszönhetően, hogy a különböző próbákban az alkalmazott „core”-szekvenciák mind hosszúságukban, mind pontos szekvenciájukban eltérnek egymástól.
A különböző, variáns „core”-szekveneiákat tartalmazó tandemismétlődő fragmentek segítségével történő hipervariábiüs régiómeghatározás megvalósíthatóságának vizsgálatához számos miniszatellit-régiót állítottunk elő szintetikus úton.
10. példa
Mesterséges miniszatellitek szintetizálása és klónozása
A „policore”-próbák szintézisének vázlata a 10. ábrán látható, amely az E.coli baktériumból származó „crossover” iniciátor-szekvenciát (Chi, GCTGGTGG) tartalmazó tandemismétlődő fragmentum klónozás útján történő előállítását illusztrálja. A poli-Chi-próba előállítása során standard DNS-technikákat alkalmaztunk, az előállítás lépései a következőek voltak*
1. A 8 nukleotidhosszú Chi-szekvenciát tandemismétlődésként tartalmazó szintetikus oligonukleotidokat a H. W. D. Matthes et al. (1984) EMBO J. 4,561568. műben leírtak alapján állítottuk elő. Szintén előállíottunk egy olyan második oligonukleotidot, amely dimerként tartalmazta a Chi-szekvencia komplementerét.
2. A fenti két oligonukleotidet 37 *C-on egymáshoz hibridizáltuk MgCh-ra és Tris-HCl-ra nézve 10 mM-os közegben (pH-8,0), ily módon rövid kétszálú DNS-fragmentumot alakítottunk ki. A második oligonukleotid-szekvenciát úgy választottuk meg, hogy egy olyan 3-nukleotidnyi 5’ túlnyúló véget tartalmazó molekulát eredményezzen, amely fej-láb ligálást tesz tehetővé.
3. Az 5’ vég foszforilálását T4 polinukleotid-kináz és ATP segítségével végeztük.
4. Az összekapcsolt DNS-fragmentek fej-láb ligálását T4 DNS-ligázzal és ATP-vel végeztük, így kaptuk meg a Chi-ismétlődéseket tartalmazó polimert.
5. A ligáit polimereket 1,5%-os agarózgélben történt elektroforézissel választottuk el, és a 150 bázispárosnál nagyobb polimereket DE81 papírra futtatva izoláltuk (Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corri, P. és Chambon, P., 1981. Anl. Biochem. 112, 295298).
6. A kapott hosszú polimereket E.coli DNS-polimeráz I Klenow fragmentjével történő feltöltéssel alakítottuk tompa végűvé, majd az M13mpl9 RF DNS Sma I hasítóhelyre ligáltuk (J. Messing és J. Vierra, 1982. Gene 19,269-276.). A ligáit DNS-t E.coli JMlOl-be transzformáltuk, és a különálló fehér plakkokból egyszálú fág DNS-t izoláltunk.
7. Minden izolált klón DNS inszertjét dideoxynukleotid módszerrel szekvenáltuk meg (M. D. Biggin, T. J. Gibson és H. F. Hong, 1983. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80, 3963-3965) az inszertált polinukleotid hosszának, irányultságának és szekvenciájának meghatározása céljából. Találtunk egy olyan rekombináns M13 fágot - M13.core A-nak neveztük el amely 50-szeres ismétlődésben tartalmazta az 5’—>3’ irányultságú Chi-szekvenciát az érett egyszálú fág DNS-ben (azaz „poli-Chi” rész volt inszertálva és nem „poli-Chi-komplementer”).
8. A MP-vel jelzett egyszálú hibridizációs próbát primer meghosszabbítással állítottuk elő, s ugyanazokat a módszereket használtuk, melyeket a 33.6 és
33.15 fágok előállításánál.
11-15. példák öt további új mesterséges miniszatellit előállítása A fenti technika alkalmazásával a „core”-szekvencia öt további változatát szintetizáltuk, majd ezeket M13 fágba klónoztuk. Az így kapott „policore” rekombinánsokat M13 .core A-F névvel jelöltük. A „core”-variánsokat úgy választottuk ki, hogy azok mind hosszúságukban, mind szekvenciájukban különbözzenek. Az 5. táblázat az Ml 3.core A-F kiónok ismétlődő szekvenciáit, a „core”szekvenciát, valamint - a további alkalmazásoknál részletezett - 335,33.6 és 33.15 hibridizációs próbák szekvenciáit hasonlítja össze. A leginkább invariáns bázisokat aláhúztuk. Az összes inszert M13mpl9 vektoron belüli orientációja is meg van adva. (-> jelentése: az inszert „policore”; «- jelentése: az inszert „policore” komplementere.) A „core”- szekvenciáktól való eltéréseket kisbetűvel jelezzük. A megjegyzés rovatban röviden jellemezzük az összes megadott szekvenciát. -λ''•yj/.
16. példa
Az M13.core A-F próbák hibridizációja Hinfl enzimmel emésztett humán DNS-sel
Kezdeti vizsgálatként két nem rokon egyén emésztett DNS-ét a 33.15, illetve az M13.core A-F próbákkal hibridizáltuk. Két nem rokon eredetű placentából (1,2) vett, 8 pg DNS-mintát Hinfl enzimmel emésztettünk, a mintákat 0,7%-os agarózgélben elektroforetizáltuk, majd Southern blott analízisnek vetettük alá mindegyik hibridizációs próbánál. A próbákat a leírás fő részében megadottak szerint, “P-vel jeleztük. A kapott autoradiogrammokat all. ábra mutatja be. Mindegyik próba mindegyik személynél számos DNS-fragmentet detektált.
Eredmények
A „B, C és D” próbák mindegyike olyan DNS-fragment ujjlenyomatot detektált, amely lényegein különbözött a két eltérő személynél. A különböző hibridizációs próbák azonos személy esetén is eltérő ujjlenyomatot szolgáltattak, bár sok fragmentumot nemcsak egy próba mutatott ki, és bizonyos fokú átfedés volt a
33.15 próbával meghatározott hipervariábiüs fragmentcsoporttal is. Úgy találtuk, hogy a B-D próbák alkalmasak megfelelő DNS-ujjlenyomatok előállítására, és növelik az emberekben és más gerincesekben vizsgálható hipervariábilis miniszatellitek számát Figyelemre méltó, hogy a „core”-szekvenciábőFcsak a 7 legállandóbb központi bázist tartalmazó C próbával is sikerült nyert ujjlenyomatot nyernünk.
-231
HU 203 795 Β
A „core”-rész további csonkítása, mely az E próba 6 bázispáros ismétlődő egységhez vezet, teljesen megváltoztatta a próbával kapott DNS-ujjlenyomat-mintázatokat, s az azonosított mintázat nagyban megegyezett a vizsgált személyeknél (vagyis az azonosított fragmentumok nem mutattak extrém polimorfikus variációt). Az E jelű próbánál a „core”-szekvencia tehát feltehetően nem annyira megfelelő DNS-ujjlenyomat-analízishez, mint a korábban használt 33.5, 33.6 és 33.15 hibridizációs próbák „core”-szekvenciái. Ez arra utal, hogy a „core”-szekvencia hosszának praktikus alsó határa 7 bázispár, amely még általánosan alkalmas lehet
DNS-ujjlenyomat-analízishez. A „core” központi, legállandóbb részének szétdarabolásával kapott M13.core F „core” alkalmazása szintén csökkentette a DNSujjlenyomatmintázat komplex és variábilis jellegét.
5. táblázat
A hat mesterséges miniszatellit-próba (M13.core A-F) jellemzése bp ismétlődések irányultság %-os homologicitás száma megjegyzés
A
core GGAGGTGGGCAGGA G 16 100
33.6 \j (a)aGGGCtGG AGG 11 (12) 348 <- (82)
33.15 aGAGGTGGGCAGGtGG p 16 29 <- (87,5)
333 gGGAGGTGGGCAGGAGG 17 14 <- (91)
M13.core A TGGGCtGG 8 50 —> 87,5 Chl
M13.core B GTGGGCAGGAAG 12 7 <- 100 rövid „core”
M13.core C TGGGCAG 7 47 100 nagyon rövid „core”
M13.coreD GGTGGGCAGG tGG 13 5 (- 92 rövid 33.15
M13.core E aGGGCA 6 34 -» 83 nagyon rövid 33.6/33.15 hibrid
M13.core F AGG caGG tAGGtGG 14 9 <- 71 rövid 33.15, TGGGCA megszakítva
Az M13.core A („poli-Chi”) alkalmazása új és intenzíven hibridzáló DNS-fragmentum mintázatot eredményez. Sok igen nagy és kevéssé elválasztható fragmentumot kaptunk (>15 kilobázis), melyek feltehetően egy szokásos hosszú - HinfI hasítóhelyet véletlenszerűen tartalmazó - szatellit-szekvenciából származnak. Az azonosított DNS-fragmentumok egy része egyénre jellemző variabilitást mutatott
17. példa
Az A „core további vizsgálata
Az M13.core A hibridizációs próbával nyerhető mintázatokat tovább analizáltuk a neurofibromatózissal terhelt család segítségével, mely családot részletesen vizsgáltunk a 33.6 és a 33.15 próbákkal (lásd 8. példa és 7. ábra). A 12. ábra bemutatja a apától (F), hat lányától (D) és öt fiától (S) származó, HinfI enzimmel emészetett DNS-ből kapott ujjlenyomatokat Az autoszomális eredetű, dominánsan öröklődő betegséggel a neurofibromatózissal - terhelt egyéneket + jellel láttuk el. A beteg anya DNS-e nem volt hozzáférhető. A szegregálódott apai eredetű csíkokat · -val, az anyaiakat o -val jelöltük. A folyamatos vonallal összekötöttek kapcsolt módon, a pontozott vonallal összekötöttek pe24 dig allelikus módon szegregálódtak. Az x-szel jelölt csíkokat már korábban detektáltuk a 33.15 próbával.
Eredmények
Eltérően a 33.6 és 33.15 próbákkal nyert ujjlenyomatoktól, a viriabilitás foka viszonylagosan kicsi, mivel sok fragment átadódott valamennyi utódnak (vagyis ezek a fragmentek közösek, nem ritkák a populációban, gyakorta előfordulnak homozigótaként). Hat apai eredetű és kilenc anyai eredetű heterozigótacsík szegregációját tudtuk azonosítani a 11 gyereknél. Egyik apai eredetű csíkot és az egyik anyai eredetű allelikus párt már korábban detektáltuk a 33.15 próbával. A kapcsolt és alléi párok elhagyása után 2 új apai és 6 új anyai eredetű lókusz maradt, amelyeket a 33.6 és 33.15 hibridizációs próbák nem mutattak ki, összehasonlítva a korábban azonosított 34 apai és 25 anyai eredetű fókusszal. így a „poli-Chi”-próba csak korlátozottan alkalmas humán genetikai analízisre.
A16. és 17. példák eredményei kiemelik a korábban tárgyalt 5. táblázat felső sorában aláhúzott kilenc domináns nukleotid jelentőségét. Ezek a példák segítették annak - a leíró részben említett - feltételezésnek a bizonyítását is, mely szerint minimálisan 6 nukleotidos
-241
HU 203 795 Β szekvenciát kell tartalmazniuk a sikeres „core” részeknek. így az E „core” reprezentálja a felhasználhatóság alsó határát, és feltehető, hogy más 6 nukleotidos szekvenciák alkalmazása csak lényegtelen előnyökkel jár, amint azt későbbiekben tárgyalandó TGGGCA szekvenciánál is láthatjuk. Hét nukleotidos szekvencia alkalmazása, a kutatás jelenlegi állása szerint, egészen drámai minőségi változást okoz.
A „core-szekvencia esszenciális részletei meghatározásának érdekében célszerű, ha az X és Y variánsait, melyeket az eddigiekben alternatív nukleotidok jelzésére használtunk, az alábbiak szerint teljes logikai csoporttá egészítjük ki:
X-A vagy G P-nem G
Y-C vagy T (Q-nem A)
W-A vagy T (R-nem C)
V-C vagy G (S-nem T) (O-bármi)
A zárójelben szereplőket nem használjuk a következő diszkusszióban.
A találmányt egy bizonyos megközelítésben egy polinukleotiddal jellemezhetjük, amely többszörösen tartalmazza az alábbi „core”- szekvenciát - a képletben a fenti terminológiát használjuk:
GPGGGCWGGWXG (6)
A fenti képlet természetesen a legjellemzőbb tizenkét nukleotidos szekvenciát jelöli. Azt már a korábbiakban bemutattuk, hogy a hétnukleotidos C „core” is igen nagy jelentőségű, ezért belevéve a fenti 12 nukleotidot tartalmazó szekvencia megengedett variánsait is az alábbi (7) szekvenciát kapjuk. A találmányt egy bizonyos megközelítésben jellemezhetjük egy olyan polinukleotiddal, amely többszörösen tartalmazza az alábbi hetes „core”-szekvenciát:
PGGGCWG (7)
Előnyösen P természetesen T-vel egyenlő, mint ahogy az a C „core”-ban megfigyelhető. A másik legkedvezőbb eset az, ha P jelentése A.
Az egyértelműség kedvéért a homologicitást százalékosan is megadtuk a 3. táblázatban. Ami a leírásban megadott mesterséges hibridizációs próbákat illeti, meg kell jegyeznünk, hogy az ismétlődések pontos ismétlődések, így az egész miniszatellit homologicitása megadható „core”-szekvenciájának homologicitásával. Ez nem szükségszerűen igaz a korábbi 33.6, 33.15 és 33.5 próbákra - amelyeknél a megadott homologicitást zárlójetek közé tettük -, mivel ezekben variáns ismétlődő egységek is előfordulnak. Feltehetően az F „core”-homologicitása jelzi a felhasználhatósághoz szükséges minimális homologicitást, bár lehetséges, hogy a konszenzustól való eltérést a „core” részét képező alábbi központi rész megszakítása túlságosan felerősítette:
TGGGCA (8)
Figyelemre méltó az, hogy a fenti csoport jelen van a sikeres B, C, D hibridizációs próbákban, meg van szakítva az összes kevésbé hatékony próbában: A, E és F. A fentiek alapján várható, hogy további, még használhatóbb hibridizációs próbákat lehet előállítani, melyek minimum 70%-os összhomológiát kell hogy mutassanak a (6) képlet alapján felírható szekvenciával.
Figyelemre méltó az is, hogy a (8) képletű TGGGCA központi 6 polinukleotid szintén megszakítva van jelen az E „core”-ban. így feltételezhető, hogy a fenti hatnukleotidos szekvencia folytonosan hatékonyabb lehet, habár a hosszúságnak hatról hétre való növelése fontosabb sajátosságnak bizonyulhat
A találmányt egy bizonyos megközelítésben jellemezhetjük egy olyan polinukleotiddal is, amely többszörösen tartalmazza a TGGGCA „core”-szekvenciát.
A találmányt jellemezhetjük általánosabban egy olyan (6) képletű „első” defeníció szerinti polinukleotiddal, amelyben mindegyik ismétlődő szekvenciában jelen van a TGGGCA szekvencia.
A találmánynak egy másik megközelítése szerint azt mondhatjuk, hogy a találmány magában foglalja a fenti „első” definíció szerinti polinukleotidok módosított változatait, melyekben a „core”-rész a korábbi (2) képlet szerinti szekvencia 5’-43’ irányban olvasott legalább 6 egymást követő nukleotidját tartalmazza. A „core”-oknak nem kell egyezőknek lenniük minden ismétlődő egységben, amennyiben mindegyik tartalmazza a TGGGCA szekvenciát.
Előnyösen az összes ismétlődő egység további nukleotidjai legalább 70%-os egyezést mutatnak a (6), még előnyösebb esetében a (2) képletű szekvenciából levezethető összes ismétlődő egységre számított totál „core”-szekvenciával.
Egy-, illetve kétpetéjűség meghatározása születéskor
Az egy-, illetve kétpetéjűség meghatározása ikreknél nemcsak epidemiológiai, genetikai és szülészeti szempontból fontos, hanem az egy-, illetve kétpetéjűek prognózisának különbsége miatt is. A kétpetéjű ikrekhez képest az egypetéjű ikrek kisebb születési súlyúak, több komplikáció lép fel náluk, és mortalitásuk is magasabb. A kaukázusiaknál az újszülött ikrek kb. 30%-a különnemű, vagyis kétpetéjű. A magzatburok vizsgálata azt mutatja, hogy az esetek további 20%-a egy chorionos, ezek mindig egypetéjűek. A maradék 50%-ban (relatíve állandó arány a populációk között) az ikrek azonos neműek, a placenta diamnális, két chorionos, így ezek lehetnek akár egy-, akár kétpetéjűek. Ezekben az esetekben több módszerrel is kísérleteztek a zigoticitás megállapítására, beleértve az általános megjelenés, ujjlenyomat, bőrátültetés- és izlelésvizsgálatát és genetikai maikerek meghatározását. Ez utóbbiak a legmegbízhatóbbak, 95-98%-os biztonságúak. Mindazonáltal gyakorta sok ilyen maikert kell egyidjűleg vizsgálni, minthogy a legtöbb fehérje és antigénvariáns közül relatíve kevés mutat heterozigoticitást.
A következő példákban 12 újszülött ikerpárból származó DNS-mintát vizsgáltunk a fentiekben ismertetett miniszatellit-DNS-próbák felhasználásával. A kapott DNS-ujjlenyomatok olyan variabilitást mutattak az egyedek között, hogy kizárólag csak az egypetéjű ikrek mutattak egyező mintákat. Annál a hét esetnél, aminél a zigoticitást a nem vagy a placenta vizsgálatával megállapítható volt, a DNS-vizsgálat eredménye megfelelt a találtaknak. A másik öt ikerpárnál és két hármasiker
-251
HU 203 795 Β esetében a DNS-analízis gyors zigoticitás-meghatározást tett lehetővé. A DNS-hibridizációs próbák tehát - a találmányban leírtaknak megfelelően - egy olyan egyszerű genetikai vizsgálatot tesznek lehetővé, ami minden többgyerekes terhesség esetén biztosítja a zigotici- 5 tás meghatározását.
18. példa
A 33.6 és 33.15 egyszálú DNS-próbákat használtuk 12 újszülött ikerpár zigoticitásának meghatározására. A kapott eredmények a 6. táblázatban láthatók.
6. táblázat
Eset Gesztációs kor Nem Placenta* DNS-mintázat
1. 38 hét NN 1 chorion megegyező
2. 38 hét FN 2 chorion nem egyező
3. 30 hét FF 2 chorion megegyező
4. 33 hét NN 1 chorion megegyező
5. 40 hét NN 2 chorion nem egyező
6. 37 hét FN 2 chorion nem egyező
7. 32 hét NN 2 chorion megegyező
8. 34 hét FN 2 chorion nem egyező
9. 39 hét FF 2 chorion nem egyező
10. 38 hét FN 2 chorion nem egyező
11. 27 hét FF 2 chorion megegyező
12. 35 hét NF 2 chorion nem egyező
* mindegyik placenta diamnális
A DNS-extrakcióhoz születéskor vett köldökzsinórvért, vagy a születés utáni napon nyert vénás vérmintát (0,5-1,0 ml) használtunk minden csecsemő esetében. A placentákat megvizsgáltuk, hogy egy vagy két amnionnal, illetve chorionnal rendelkeznek-e. A DNS-t standard módszerrel nyertük (Old, J. M., Higgs, D. R. Gene analysis. In: D. J. Weatherall, ed. The Thalassaemias. Method in Haematology, Churchill Livingstone, 1983), és 10-15 pg-nyi mennyiséget HinfI enzimmel emésztettünk. A mintákat 22 cm hosszú 0,6%-os agarózgélben, 45 V feszültséggel, kb. 36 óráig elektrofoietizáltuk, amíg minden 15 kilobázis hosszúságúnál rövidebb fragmentum ki nem futott a gélből. A DNS-t blott eljárással átvittük nitrocellulóz filterre, majd 80 *C-on vákuumban 2 óráig inkubáltuk. Az egyszálú 33.6 és
33.15 próbákat 32P-vel megjelöltük, amint azt a korábbiakban ismertettük.
Az eredményeket a 13. ábra mutatja be.
A 13. ábrán az 1. és 2. sor az 1. esetszámú ikrekből nyert DNS- sávmintázatot mutatja, melyet a 33.6 egyszálú miniszatellit-próba felhasználásával kaptunk. A 3-19. sorok az egyszálú 33.15 próbával nyert ujjlenyomatokat mutatják be: 1. eset: 3-4. sáv; 2. eset: 5-6. sáv;
3. eset: 7-8. sáv; 4. eset: 9-10. sáv; 5. eset 11-12. sáv;
6. eset 13-14. sáv; 7. eset 15-16. sáv. A17-19. sávok hármasikreknek felelnek meg, lány, fiú, lány sorrend szerint. Az 1. és 2. sor a 3. és 4. sorral összevetve azt mutatja, hogy a két próba - a 33.6 és a 33.15 - különböző miniszatallit-csíkinintázatot detektál A méretmarkerek nagysága kilobázisban van megadva.
Hét esetben (lásd 6. táblázat) a zigoticitás meghatározható volt egyszerűen az ikrek neme és a magzatburok vizsgálata alapján. Mindegyik egy chorionnal (vagy egy amnionnal) rendelkező iker (pl. 1. eset) egypetéjű, habár az egypetéjű ikreknek mindössze kb. 50%-a egychorionos placentájú (2). Emiatt az 1. eset ikreinek egypetéjűeknek kell lenniük, és náluk valóban egyező DNS-mintákat találtunk mind a 33.15, mind a
33.6 próbával (lásd 1. ábra). Öt esetben az ikrek különneműek voltak, és sávmintájuk különbözőnek is mutatkozott mind a 33.15, mind a 33.6 próbával vizsgálva. A
3., 5., 7., 9. és 11. esetben az ikrek azonos neműek voltak, és két chorionnal rendelkeztek, így ezek lehettek egy-, illetve kétpetéjűek is. A DNS-analízis azt mutatta, hogy két ikerpár (5. és 9. eset) különböző csíkmintázattal rendelkezett, tehát kétpetéjűek voltak, míg a többi három esetben (3., 7. és 11. eset) a megegyező csíkmintázat egypetéjűségre utalt
Két újszülött hármasiker esetét vizsgáltuk hasonló módon. Mindkét esetben az anya fertilitást elősegítő gyógyszereket szedett a terhesség redukálására, és mindegyik gyereknek egyedülálló csíkmintázata volt (pl.: 13. ábra 17-19. sor).
Az eredmények a 14. ábrán láthatók. Az 1. és 2. sáv az egyszálú 33.15 próbával nyert eredményeket, a 3. és
4. sáv a kettős szálú 33.15 próbával nyert eredményeket mutatja be.
19. példa
Bár mind az egyszálú, mind a kettős szálú próba megfelelő volt bármelyik diagnózis felállításához, de a radioaktív egyszálú próbákkal több csík volt megkülönböztethető (lásd 14. ábra).
Az egyszálú próbák melletti alternatívaként tanulmányoztuk a megfelelőkettős szálú próbák használatának lehetőségét, amely módszer használatosabb a kü-261
HU 203 795 Β lönbőző laboratóriumokban. A használt kettős szálú DNS-minták a következőek voltak: 1., egy kettős szálú 600 bázispáros Pstl-AHaHI fragmentum, ami tartalmazza a λ33.15-ből származó „core”-miniszatellitet,
2., egy kettős szálú 720 bázispáros Haein fragmentum, ami a X33.6-ból származó „core”-miniszatellitet tartalmazza. Ezeket a nick-transzlációval jelöltük meg, így 0,5-1,0409 cpm 3íP/pg specifikus aktivitású DNS-t kaptunk. A prehibridizáció és a hibridizáció körülményei megegyeztek a korábban tárgyalt standard módszerekével, kivéve, hogy l*SSC-t és 10%-os dextránszulfátot használtunk hibridizációs pufferben a kettős szálú próbáknál. A filtereket 1 órán keresztül mostuk l«SSC-ben és 1-3 napon keresztül - erősítőfólia jelenlétében - -70 ’C-on autoradiografáltuk őket
A18. és 19. példák diszkussziója
Abban a hét esetben, ahol a zigoticitás a DNS-vizsgálatoktól függetlenül meghatározó volt a DNS-ből kapott eredmények egyezőek voltak a nem- és placentavizsgálaton alapulókkal. A másik öt párban a zigoticitás egyértelmű meghatározására lehetőség nyílt a miniszatellit-próbák segítségével. A hasonló módon tanulmányozott hármasikrek trizigótáknak bizonyultak.
Az esetek 50%-ában az ikrek zigoticitását sem a különböző nemek alapján (dizigótaság), sem az egychorionos placenta alapján (monozigótaság) nem lehetett megállapítani, így genetikai vizsgálatot kellett elvégezni. Az ilyen tesztek információtartalma arányos a vizsgált genetikai lókusz polimorfizmusának a mértékével, illetve a vizsgált lókuszok számával. Többszörös vörösvértest antigén- és enzimvizsgálatokkal a zigoticitás meghatározásának pontossága elérheti a kívánatos 95-98%-os értéket, de csak akkor, ha a populációban az odatartozó allélgyakoriság ismert (Nylander, Ρ. P. S. The phenomenon of twinning. In: Barron, S. L. Thomson, A. M. eds. Obstetrical Epidemiology. London. Academic Press, 1983: 143— 165). Hasonló módon, a restrikciós enzimhelyek polimorfizmusán alapuló vizsgálat több hibridizációs próba esetén is egypetéjűség helytelen diagnózisát jelentős százalékban mutatta (Derom, C., Bakker, E., Vlietineck, R., Derom, R., Van dér Berghe, H., Thiery, M., Pearson, P. Zyhosity determination in newbom twins using DNA variants. J. Med. Génét., 1985, 22: 279-282). A találmány szerinti miniszatellit-próbák áthidalják ezt a problémát az általuk vizsgált hipervariábilis DNS-fragmentumok nagy száma és jelentős variabilitása folytán. A korábban leírtak szerint a hibridizáló miniszatellit-fragmentumok ritkán azonosak véletlenszerűen kiválasztott egyedek között. (Vesd össze: 13. ábra, nem rokon személyekkel). A fentiekben megmutattuk, hogy annak a valószínűsége, hogy két rokoni kapcsolatban nem álló személy egyező DNS-ujjlenyomatot adjon mind a 33.6, mind a 33.15 próbáknál - melyek különböző részeit detektálják a hipervariábilis fókuszoknak -, elképzelhetetlenül kicsi (pcdO18, lásd 4. példa). Rokonoknál, akiknél a fragmentumoknak körülbelül a fele egyező, az egypetéjűség helytelen diagnózisának a valószínűsége <104. Ennélfogva a 33.6 és 33.15 próbák kombinált használata nagyságrendekkel megbízhatóbb eredményt szolgáltat, mint a korábbról ismert tesztek bármelyike. Az általánosabban használt kettős szálú miniszatellit-próbák sok olyan gyengébb csíkot nem képesek detektálni, amit a egyes szálú próbák igen (lásd 14. ábra). Ennek ellenére elég információ nyerhető segítségükkel ahhoz, hogy az egypetéjűség téves megállapításának valószínűségét 10*4 alá szorítsuk.
A zigoticitás meghatározás ezen módszerének további előnye az, hogy nagyon kevés minta szükséges az analízishez. Vénás vagy köldökzsinórvér fél milliliteré mindig elegendő DNS-t biztosít. A zigoticitás meghatározásnak ezen direkt módszere által - akár újszülöttekről, akár idősebb ikrekről, akár hármasikrekről van szó - a többes terhességek különböző típusainak megállapítására, illetve azok meghatározóinak és következményeinek pontosabb epidemiológiai vizsgálataira volna tehetőség. A következő példákban a molekulatömegre utaló adatok nem szerepelnek, de a hatásos mérettartomány az 1,5-20 kilobázisos tartományban volt most is, akárcsak az előző eredményeknél.
A DNS-ujjlenyomatok felhasználása a törvényszéki orvostanban
A 33.6 és 33.15 próbákkal detektált DNS-ujjlenyomatok egyéni specifitása kiválóan alkalmas személyek.·azonosítására a törvényszéki orovostanban. Az egyetlen kérdéses pont az, hogy vajon fennmarad-e a DNS, például beszáradt vérben, vagy ondőfoltban olyan megfelelő, nem degradált állapotban, hogy még DNSujjlenyomat-analízisre alkalmas legyen. A törvényszéki eseteknél történő felhasználás megvalósíthatóságának vizsgálatát dr. Peter Gill (Home Office Central Research Establishment, Aldermaston) által szolgáltatott DNS-mintákon végeztük el.
20. példa
Ruházaton beszáradt vér- és ondófoltot különböző időtartamokig hagytunk szobahőmérsékleten állni, miután dr. Gill extrakciót végzett (lízis SDS-sel, IM DTT jelenlétében, amit fenolos extrakció, majd etanolos kicsapás követett). A DNS-t hasonló módon vontuk ki friss hajhagymákból és hüvelykenetből, amit szexuális érintkezés előtt és után vettek. A mintákat Hinf^ozimmel emésztettük, 0,8%-os agarózgélben elektmíoretizáltuk, majd nitrocellulóz filterre vittük át Afiltert ^P-vei jelzett, egyszálú 33.15 próbával hibridizáltuk a fentiekben leírt standard technika szerint
Az elektroforizált minták:
1. 40 μΐ ondófolt ruhán, 4 hetes
2. 40 μΐ friss ondó
3. 60 pl friss vér
4. 60 pl vérfolt ruhán, 4 hetes
5. 60 pl vérfolt ruhán, 2 éves
6. 15 db hajhagyma (1-6 db származott ugyanattól a személytől)
7. 60 pl vérfolt ruhán, férfitől származó, friss
-271
HU 203 795 Β
8. Hüvelykenet a 11-es személytől véve, 1 órával a 7-es személlyel történt közösülés után.
9. Lásd 8. pont, de 7 órával a közösülés után.
10. Hüvelykenet 11-es személytől.
11. 60 μΐ vérfolt ruhán, nőtől származó, friss
A vizsgált DNS-ujjlenyomatokat a 15. ábra mutatja. Elégséges mennyiségű DNS-t (kb. 05-3,0 pg) nyertünk minden mintából az analízis elvégzéséhez. Beszáradt vérfoltban 2 évig, beszáradt ondóban 1 hónapig nem szenvedett lényeges károsodást a DNS, és azonos DNS-ujjlenyomatot mutatott az azonos személytói nyert friss véréből, illetve ondójából nyert DNS-ujjlenyomatával. A kenetminták elsősorban a nők, és nem a férfiak vérmintáinak feleltek meg, ami arra utal, hogy a kenetből gyűjtött legtöbb DNS a kenetvétel során lekapart hüvelyhámsejtből származott, nem a spermiumból. Mindemellett 3 nem női eredetű sávot sikerült detektálni a közösülés utáni mintákban. Ezek megfeleltek a férfi véréből kapott fő sávoknak, így a spermiumból kellett származniuk. Ezek a sávok kimutathatók a közösülés után 7 órával vett mintában is.
Diszkusszió
A fenti előzetes vizsgálatok azt mutatják, hogy bizonyos törvényszéki esetekben a minták épek maradnak, ezért a DNS-ujjlenyomatvizsgálat azonosítási célra alkalmazható bizonyos bírósági esetekben is. Például ezzel a módszerrel lehetséges nemi erőszakot elkövető ember azonosítása az áldozat ruháján talált ondófolt alapján. A nemi erőszak áldozatainak hüvelykenete esetében kevésbé egyértelmű a meghatározás a vaginális DNS-szennyeződés miatt. Mindazonáltal, amennyiben a szennyező, női eredetű DNS-t a spermium 2DDT-s, vagy merkaptoetanolos redukciója (erre a spermium-DNS izolálásához van szükség) előtt, SDS-lízissel eltávolítjuk, - tisztább spermium-DNS-ujjlenyomatokat kaphatunk. Vagyis a nemi erőszakot elkvövetők azonosítása lehetséges lesz az ondófolt és/vagy hüvelykenet-DNS-ujjlenyomat vizsgálatával. Dr. Gill-lel együttműködve azóta további vizsgálatokkal erősítettük meg, hogy tiszta spermium-DNS-ujjlenyomat nyerhető a közösülés után vett hüvelykenetből, a fent leírt, előzetes elkülönítő technika segítségével. A 15/A ábra két hüvelykenetből nyert DNS-ujjlenyomatot mutat be, amelyeket a közösülés után 65 órával vettek (3. sáv). Az 1. sáv a férfi partner vérmintáiból készült ujjlenyomatokat mutatja, a 2. sáv pedig a női partner véréből készített DNS-ujjlenyomatot. A kenet női sejtmagvait előnyösen SDS/proteniáz K keverékkel történő előzetes inkubációval oldottuk fel. A spermiumsejtmagok ellenállnak ennek a behatásnak, és emiatt centrifugálással elkülöníthetők a női eredetű komponenstől. A spermiumsejtmagok későbbi lízise egy SDS/proteináz K/DTT keverék hatására következett be.
Nyilvánvaló, hogy ez az elválasztási eljárás teljesen sikeres volt. Az ondószennyezett hüvelykenetbdl nyert spermium-ujjlenyomatok teljességgel megegyeztek a férfi partner véréből nyert ujjlenyomatokkal.
Gazdasági szempontból fontos állatok humán miniszatellit- próbákkal kapott DNS-ujjlenyomatai
21-25. példák
Kutya, macska, birka, sertés, ló és szarvasmarha véréből preparáltunk DNS-mintákat. 8 pg-os mintákat emésztettünk egy megfelelő restrikciós endonukleázzal (ha nincs más kiírva, akkor Hinfi-ről van szó), és a restrikciósán emésztett DNS-t fenolos extrakció után etanolos kicsapással nyertük ki. Az emésztett DNS-t vízben űjraoldottuk, 0,7%-os agarózgélben elektroforetizáltuk, denaturáltuk, Schleicher-Schuell nitrocellulóz filterre vittük át, majd hibridizáltuk, ahogy azt korábban leírtuk a 32P-jeIzett 33.6 és 33.15 humán miniszatellit-próbáknál.
21. példa
A 16. ábra a 33.6 próbával vizsgált kutyacsaládból származó DNS-ujjlenyomatokat mutatja be. Az elektroforetizált minták:
1. sáv: vadászkopó apa
2. sáv: agár anya
3., 4., 5. sáv: a fenti szülők „greagle” kölykei (nőstény, hím, hím sorrendben).
A humán DNS-ből nyerthez hasonló bonyolultságú, részletes DNS-ujjlenyomatokat kaptunk mindegyik kutyánál. A DNS-ujjlenyomatok lényeges variabilitást mutattak, amint az az apából, illetve az anyából nyert minták összehasonlításából látható (1,2 sávok). Mindhárom leszármazottnak különböző a DNS-ujjlenyomata, minden esetben csak olyan sávokat tartalmaznak, melyek visszavezethetők az apára és/vagy az anyára. Ezért a DNS-ujjlenyomatok ugyanúgy alkalmasak apasági vizsgálatokra és családfa-analízisre, mint az embereknél.
A DNS-minták az 1-3 esetekben kissé degradáltak voltak, ezáltal leginkább a nagyobb csíkoknak (a leglassabban vándorlóknak) csökkent az intenzitásuk. A degradáció ellenére a csíkoknak a szülőkből az utódokba való átadódása egyértelműen meghatározható volt.
22. példa
Macskák
A 17. ábra egy rővidszőrű házimacska-családból a
33.6 próbával (bal oldalon), illetve a 33.15 (jobb oldalon) próbával kapott DNS-ujjlenyomatokat mutatja be.
1. sáv: apa
2. sáv: anya
3. sáv: kölyök
Mindkét próba - a 33.6 és a 33.15 próba is - informatív DNS-ujjlenyomatot adott. A kölyökmacska legtöbb sávja anyai vagy apai eredetű volt, így ezek a DNS-ujjlenyomatok macskáknál is használhatók akár családfavizsgálatra, akár egyéni azonosításra.
23. példa
Birkák
A 18. ábra különféle birkákból a 33.6 próbával (bal oldalon), illetve a 33.15 (jobb oldalon) próbával kapott DNS- ujjlenyomatokat mutatja be. A minták:
1. sáv: keresztezett nőstény
2. sáv: keresztezett nőstény
3. sáv: Dorset nőstény
-281
HU 203 795 Β
4. sáv: Hampshire x Dorset nőstény
5. sáv: Dorset hím
Mindkét próbával mindegyik birkából egyedspecifikus DNS-ujjlenyomatokat nyertünk. A DNS-ujjlenyomatok halványabbak és kevésbé összetettek, mint a humán DNS-ujjlenyomatok, de még mindig használhatók azonosítási célokra. A 33.6 próba egy vagy két igen intenzív polimorf csíkot mutat minden birkában, egy sor halványabb mellett Ezek a csíkok valószínűleg egy közös miníszatellitről származnak, ami véletlenül nagymértékben homlológ a 33.6 próbával.
24. példa
Sertések és lovak
A 19. ábra 3 különböző sertésből (1-3. sáv) és 3 különböző lóból (4-6. sáv) származó DNS-ujjlenyomatokat mutat be. (A nem és a fajta nem meghatározott.) A 33.6 és 33.15 próbák mindegyike minden állatnál egyedspecifikus DNS-ujjlenyomatot eredményezett A DNS-ujjlenyomatok, különösképpen a 33.15 próbával kapottak, halványak voltak és a humán DNSujjlenyomatokhoz képest nagyon kevés sávot tartalmaztak. Mindezek ellenére a két próba kombinált használata használható lesz egyedi azonosításra.
25. példa
Szarvasmarhák
A 20. ábra a HinfI enzimmel emésztett DNS-ből a
33.6 próbával nyert DNS-ujjlenyomatokat mutatja be. A DNS-mintákat egy tehéncsaládból és további szarvasmarhákból nyertük. A példák:
(l.sáv: emberi)
2. sáv: Dam
3. sáv: Síre
4. sáv: az 1. és 2. borja
5. sáv: Angus bika
6. sáv: Fresian bika
Ahogy a birkáknál, sertéseknél és lovaknál is megfigyelhettük, egy elég egyszerű, de mindazonáltal egyedspecifikus DNS-ujjlenyomatot kaptunk mindegyik állatnál. A borjúban minden csík visszavezethető volt a Dam és/vagy a Shire szülőre, ami megerősítette ennek az állatnak a származását
A 21. ábra a 33.15 próbával nyert eredményeket mutatja be ugyanazon a marha-DNS-en. Az egyes sorok jelölése:
1. sáv: Dam
2. sáv: Síre
3. sáv: az 1. és 2. borja
4. sáv: Angus bika
5. sáv: Fresian bika (6. sáv: emberi)
A HinfI enzimmel emésztett marha-DNS-en a 33.15 próbával történt hibridizációja egy intenzív és megfejthetetlenül bonyolult mintázatot eredményezett. A BglII enzimes emésztésnél ez az intenzív jel főleg a nagy DNS-fragmentumokra korlátozódik, azt sugallva, hogy ez a jel egy klaszterszekvenciából vagy régióból származik - legvalószínűbben egy szokásos méretű szatellit-DNS-ből. A rövid expozíciós idővel autoradiografált HinfI enzimes emésztés létraszerű mintázatot mutat a gék alján, ahol a „fokok” közötti távolság 45-50 bázispár (ez az adat nincs feltüntetve). így az intenzív jel legvalószínűbben egy 45-50 bázispáros ismétlődő egységet tartalmazó szatellittől származik. A marha- DNSujjlenyomatok intenzitása jelentősen csökkent Pvull, Ddel vagy Alul enzimmel való emésztés során, ami -iarra utal, hogy a szatellit-DNS ismétlődő egysége tar- < talmazza ezen restrikciós endonukleázok hasítóhelyeit, ?» de nem tartalmaz HinfI és BglI hasítóhelyet. Ezek pontosan a marha 1.720 szatellit jellemezői (E. Poschl and R. E.‘Streek „Prototype sequence of bovine 1.720 satellite DNA”. J. Mól. Bioi. 143; 1980), ami egy 46 bázispáros ismétlődő egység 100 000-szeres tandemismétlődéséből áll. Az 1.720 szatellit ismétlődő egységének és a 33.6 és 33.15 próbák ismétlődő egységeinek összehasonlítását az alábbiakban láthatjuk:
„core” GGAGGTGGGCAGGAXG Hhal Ddel * ******* *
1.720 CTGGCGAGTATCAGGCAGATGAGCGGGCAGGTGTCGCGCGGCTCAG * « *********
33.15 AGAGGTGGGCAGGTGG · Alul **** ** *
33.6
Amint az látható, az 1.720 szatellit ismétlődő egysége csaknem tökéletes másolatát tartalmazza a „core”szekvencia 3’ régiójának (a megfeleléseket *-gal jelöltük). Az 1.720 szatellit ezen területe kiváló egyezést mutat a 33.15 próba ismétlődő egységével, de kevésbé jót a 33.6 próbáéval. Ez a magyarázata annak, hogy az 1.720 szatellit-DNS-t a 33.15 próba detektálta, a 33.6 próba pedig nem (lásd 20. ábra). Az 1.720 miniszatellit ismétlődő egysége (hasonlóan a mioglobin λ33 miniszatellithez) a „core” mindkét oldalán túl sok nukleotidot tartalmaz [az (1) képlet szerinti J és K összege
AGGGCTGGAGG PvuH nagyobb mint 15] ahhoz, hogy a találmány szerinti multilókusz felismerhető próbaként működjék
Annak érdekében, hogy a 33.15 próbával hibridizáló marha miniszatelliteket detektáljunk, a marha-DNS-t Alul és Ddel enzimekkel emésztettük, így az 1.720 szatellitet 46 bázispáros monomerekké degradáltuk, s ezeket a gélből „kielektroforetizáltuk”. A 21. ábrán látható, hogy borjú-DNS-ből valóban tiszta DNS-ujjlenyomatok nyerhetők mindkét restrikciós enzim segítségével (3-as szám), azonban a kapott csíkok csaknem mindegyike az 1.720 szatellit-DNS olyan blokkjaiból
-291
HU 203 795 Β származik, melyekben az összes ismétlődd egységből hiányoznak az Alul és Ddel hasítóhelyek (talán az egyik vagy másik fent aláhúzott bázis mutációt szenvedett, ami elrontotta az egymást átfedő Alul és Ddel hasítóhelyeket). Ez megmagyarázná a következő tényeket
a) Látszólagosan egyező borjú-DNS-ujjlenyomatot nyertünk Alul és Ddel enzimet használva.
b) A legnagyobb fragmentumok következetesen intenzívebben hibridizáltak, mint a kisebbek (mivel ezek természetesen több 1.720 szatellit ismétlődő egységet tartalmaztak; a legnagyobb borjú-DNS-fragmentum 440 ilyen ismétlődő egységet tartalmazott). Emberekben a csíkintenzitás nem nő párhuzamosan a mérettel (lásd 21. ábra).
c) Majdnem mindegyik borjú-DNS-ujjlenyomatfragmentumot eliminálja a Hhal enzim, amelyik egyszeresen has&ja az 1.720 szatellit ismétlődő egységeit. (Adatok nincsenek ábrán feltüntetve, lásd feljebb.)
d) Az apaállatnak Alul enzimmel történt emésztés után alig van hibridizáló fragmentje. Ez arra utal, hogy az 1.720 szatellit-DNS azon területe, amely ezeket az ismétlődő blokkokat tartalmazza, ennél az állatnál deléciós.
e) Az anyaállat (1. számú) és a borjú (2. számú) ujjlenyomata közel azonos. Az anyaállat valószínűleg heterozigóta arra a delécióra nézve, amit az apaállatnál láthattunk, és véletlenszerűen a nemhiányos kromoszómáját (és Így az összes csíkot) adta át a borjúnak. így ezen csíkok mindegyike kapcsoltságot mutat, és nem független módon transzmittálódtak az utódba, mint az embereknél.
Mindazonáltal mind az öt szarvasmarhánál különböző szatellit-DNS-ujjlenyomatmintázatot kaptunk, így ezek a nem szokásos ujjlenyomat típusok is használhatók lehetnek egyéni azonosításhoz, de nem szolgáltatnak multilókusz eredetű információt.
Bizonyos próbák sikeresen működtek olyan esetekben is, amikor az (1) képletben szereplő n értéke nem volt kötelezően 3. Ezekben a próbákban legalább egy pár (J.core.K) ismétlődő egységet „core”- régiót nem tartalmazó DNS-szekvencia választhat el legalább két további ismétlődő egységtől. Ily módon lehetséges megfelelően hosszú próbát úgy szerkeszteni, hogy a (J.core.K) szekvenciákat párba rendezzük és a párok közé „core”-régiót nem tartalmazó szekvenciákat iktatunk be.

Claims (6)

1. Eljárás genomiális DNS-minták meghatározására, azzal jellemezve, hogy a DNS-minta restrikciós endonukleázzal végzett hasítása útján kapott fragmentumokat olyan, izolált vagy klónozott formájú polinukleotiddal, amely az (I) általános képlettel adható meg, ahol a leolvasás iránya 5>3
H.(J.core.K)„.L (1)
- a képletben a „core” olyan, legalább 6 egymást követő nukleotidből álló szekvenciát jelent, amely a következő - a fenti30
vei egyező leolvasási irányban megadott - szekvenciák egyike: GGAGGTGGGCAGGAXG (2) AGAGGTGGGCAGGTGG (3) GGAGGYGGGCAGGAGG (4) T(C)„GGAGGAXGG(G)pC (5A) T(C)mGGAGGA(A)qGGGC (5B)
ahol:
X-A vagy G, Y-C vagy T, m-0,1 vagy 2, p-0 vagy 1, n-legalább 3, q-0 vagy 1;
J és K együttesen 0-15 nukleotidhosszúságú szegélyezőszekvenciát jelent az ismétlődő egységen belül;
H és L egymástól függetlenül 0 vagy legalább 1 további nukleotidot jelent, amelyek az ismétlődő egységet szegélyezik;
azzal a kiegészítéssel, hogy „core”, J és K nem feltétlenül azonos hosszúságú és összetételű szekvenciarészletet jelöl minden egyes (J.core.K) ismétlődő egységben, azzal a feltétellel azonban, hogy a polinukleotidnak felismerhetően ismétlődő konszenzus-szekvenciája van, és „core” egy variáns core-szekvenciát is jelenthet, feltéve, hogy az n darab ismétlődő egységben ténylegesen jelen lévő összes „core’’-szekvencia legkevesebb 70% homológiát mutat az n darab ismétlődő egységben található összes „valódi core”-szekvenciákkal, amelyek a (2), (3), (4), (5A) és (5B) képleteknek felelnek meg -, vagy az (1) általános képletű polinukleotidéval komplementer szekvenciájú polinukleotiddal hibridizálunk, mimellett olyan polinukleotidot alkalmazunk, amely a DNS-mintának egy vagy több, a mintát a (J.core.K) ismétlődő egységnek megfelelő szekvencián belül nem releváns mértékben hasító restrikciós enzimmel végzett hasítása során képződő fragmens egynél több miniszatellit- régiójával vagy hipervariálható lókuszával hibridizálódni képes, és a hibridizáló DNS-fragmentumokat detektáljuk. (Elsőbbsége: 1984.11.12.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (1) képletű polinukleotidot használunk, amelyben a (J.core.K) ismétlődő szekvenciák egyikében sincs 25-néI több nukleotid. (Elsőbbsége: 1984.11.
12.)
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (1) képletű polinukleotidot használunk, amelyben a „core” maximálisan 16 nukleotidból áil. (Elsőbbsége: 1984.11.12.)
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (1) képletű polinukleotidot használunk, amelyben a „core” a megadott szekvenciáknak minimálisan 7 egymást követő nukleotidból álló része. (Elsőbbsége: 1984.11.12.)
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (I) képletű polinukleotidot használunk, amelyben „core” a megadott szekvenciáknak minimálisan 12 egymást követő nukleotidból álló része. (Elsőbbsége: 1984.11.12.)
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan (1) képletű polinukleotidot használunk, amelyben a „core” olyan 14—16 egymást követő nukleotidokból álló szekvencia, amely a (2), (3), (4) szekven-30-
HU855064A 1984-11-12 1985-10-17 Process for identificating dns and for producing polynucleotides as test materials HU203795B (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB848428491A GB8428491D0 (en) 1984-11-12 1984-11-12 Polynucleotide probes
GB858505744A GB8505744D0 (en) 1985-03-06 1985-03-06 Repeat sequence dna
GB858518755A GB8518755D0 (en) 1985-07-24 1985-07-24 Repeat sequence dna
GB858522135A GB8522135D0 (en) 1985-09-06 1985-09-06 Repeat sequence dna
PCT/GB1985/000477 WO1986002948A1 (en) 1984-11-12 1985-10-17 Polynucleotide probes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT46078A HUT46078A (en) 1988-09-28
HU203795B true HU203795B (en) 1991-09-30

Family

ID=27449602

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU855064A HU203795B (en) 1984-11-12 1985-10-17 Process for identificating dns and for producing polynucleotides as test materials

Country Status (28)

Country Link
US (1) US5413908A (hu)
EP (1) EP0186271B1 (hu)
JP (1) JP2750228B2 (hu)
KR (1) KR880700078A (hu)
CN (1) CN1014429B (hu)
AU (1) AU581582B2 (hu)
BR (1) BR8507049A (hu)
CY (1) CY1427A (hu)
DE (2) DE3584957D1 (hu)
DK (1) DK331886D0 (hu)
ES (1) ES8800349A1 (hu)
FI (1) FI862915A0 (hu)
GB (1) GB2166445B (hu)
GR (1) GR852708B (hu)
HK (1) HK13989A (hu)
HU (1) HU203795B (hu)
IE (1) IE62864B1 (hu)
IL (1) IL76668A0 (hu)
IS (1) IS1355B6 (hu)
KE (1) KE3800A (hu)
MY (1) MY102570A (hu)
NO (1) NO862825L (hu)
NZ (1) NZ213762A (hu)
PL (1) PL256209A1 (hu)
PT (1) PT81468B (hu)
SG (1) SG12688G (hu)
WO (1) WO1986002948A1 (hu)
YU (1) YU176985A (hu)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5635389A (en) * 1985-05-02 1997-06-03 Institut Pasteur Antibodies which recognize and bind human villin
GB8606719D0 (en) * 1986-03-19 1986-04-23 Lister Preventive Med Genetic probes
FR2603047B1 (fr) * 1986-08-19 1990-03-02 Vassart Gilbert Sonde d'hybridation pour la detection de sequences nucleotidiques polymorphes contenues dans un echantillon d'adn humain ou animal, procede de detection de sequences d'adn polymorphes utilisant une telle sonde, ses applications biologiques
US4987066A (en) * 1986-11-07 1991-01-22 Max Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Process for the detection of restriction fragment length polymorphisms in eukaryotic genomes
EP0294098A1 (en) * 1987-05-29 1988-12-07 City Of Hope Synthetic DNA probes
US4880750A (en) * 1987-07-09 1989-11-14 Miragen, Inc. Individual-specific antibody identification methods
GB8716367D0 (en) * 1987-07-10 1987-08-19 Reeders S T Genetic identification
GB8720855D0 (en) * 1987-09-04 1987-10-14 Oxford University Of Chancello Probe
US5064948A (en) * 1988-02-12 1991-11-12 The United States Of America As Represented By The Department Of Energy Chromosome specific repetitive dna sequences
JPH05501946A (ja) * 1988-02-18 1993-04-15 ユニバーシティ・オブ・ユタ 可変数タンデム反復座のｄｎａプローブを使用する遺伝的同定
GB8906945D0 (en) * 1988-04-13 1989-05-10 Ici Plc Probes
IT1230152B (it) * 1988-06-10 1991-10-14 Ici Plc Sequenze di nucleotidi.
NZ225513A (en) * 1988-07-21 1990-11-27 Nz Scientific & Ind Res Biotech Div Polynucleotides useful for identifying polymorphism in animals by genetic fingerprinting
AU630888B2 (en) * 1988-09-08 1992-11-12 Lifecodes Corporation Probes for the detection of rflp in eucaryotic genomes
US5766847A (en) * 1988-10-11 1998-06-16 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Process for analyzing length polymorphisms in DNA regions
DE3834636A1 (de) 1988-10-11 1990-04-19 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur analyse von laengenpolymorphismen in dna-bereichen
GB8824531D0 (en) * 1988-10-20 1988-11-23 Ici Plc Polynucleotide probes
FR2638464B1 (fr) * 1988-10-28 1992-01-03 Pasteur Institut Fragments d'acide nucleique specifiques du gene de la villine humaine, leur utilisation aux fins de diagnostic
GB2228086A (en) * 1988-11-25 1990-08-15 Ici Plc Characterisation of genomic DNA
FR2641792A1 (fr) * 1988-12-28 1990-07-20 Pasteur Institut Sequences de nucleotides codant pour la calmoduline chez l'homme et leurs applications biologiques
US5032501A (en) * 1989-02-10 1991-07-16 Virginia Mason Research Center DNA probes to vntr loci
FR2645877B1 (fr) * 1989-04-12 1991-07-05 Pasteur Institut Molecules comportant au moins une sequence peptidique porteuse d'un, ou plusieurs, epitope caracteristique d'une proteine produite par p. falciparum au niveau du stade sporozoite et dans les hepatocytes
US5097024A (en) * 1989-09-25 1992-03-17 Hodes Marion E DNA probes for fingerpint analysis without tandem repeats
US5273878A (en) * 1990-08-30 1993-12-28 John Groffen Nucleic acid probes that reveal hypervariable restriction fragment length polymorphisms within the ABR gene
EP0509089A4 (en) * 1990-11-06 1993-03-10 The Lubrizol Corporation Compositions and methods for analyzing genomic variation
US5364759B2 (en) * 1991-01-31 1999-07-20 Baylor College Medicine Dna typing with short tandem repeat polymorphisms and identification of polymorphic short tandem repeats
FR2680520B1 (fr) * 1991-08-22 1995-09-22 France Etat Armement Procede de detection de nouvelles regions hypervariables dans une sequence d'adn, sequences de nucleotides constituant des sondes d'hybridation et leur application biologique.
AU4800693A (en) * 1992-08-07 1994-03-03 Battelle Memorial Institute Low c0t dna as dna fingerprinting probe, and method of manufacture
AU4174397A (en) 1996-08-30 1998-03-19 Life Technologies, Inc. Methods for identification and isolation of specific nucleotide sequences in cdna and genomic dna
US6306588B1 (en) 1997-02-07 2001-10-23 Invitrogen Corporation Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof
WO1999014369A1 (en) * 1997-09-05 1999-03-25 Affymetrix, Inc. Techniques for identifying, confirming, mapping and categorizing polymers
US7099777B1 (en) 1997-09-05 2006-08-29 Affymetrix, Inc. Techniques for identifying confirming mapping and categorizing nucleic acids
US6238863B1 (en) 1998-02-04 2001-05-29 Promega Corporation Materials and methods for indentifying and analyzing intermediate tandem repeat DNA markers
AUPP421798A0 (en) * 1998-06-18 1998-07-09 Kazamias, Christian Process of identification
US6187540B1 (en) * 1998-11-09 2001-02-13 Identigene, Inc. Method of newborn identification and tracking
WO2000068411A1 (en) * 1999-05-12 2000-11-16 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis
GB9913556D0 (en) * 1999-06-11 1999-08-11 Zeneca Ltd Assays
AU2001245650A1 (en) 2000-03-10 2001-09-24 Ana-Gen Technologies, Inc. Mutation detection using denaturing gradients
DK2258172T3 (en) * 2000-05-09 2017-08-07 Xy Llc Flow cytometer for differentiation of X-chromosome-bearing and Y-chromosome-bearing populations of spermatozoa
US7957907B2 (en) * 2001-03-30 2011-06-07 Sorenson Molecular Genealogy Foundation Method for molecular genealogical research
US20050196767A1 (en) * 2001-05-18 2005-09-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of GRB2 associated binding protein (GAB2) gene expression using short interfering nucleic acis (siNA)
US20050233997A1 (en) * 2001-05-18 2005-10-20 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of matrix metalloproteinase 13 (MMP13) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050124566A1 (en) * 2001-05-18 2005-06-09 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of myostatin gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050203040A1 (en) * 2001-05-18 2005-09-15 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular cell adhesion molecule (VCAM) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP2415486B1 (en) * 2001-05-18 2017-02-22 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US20050159382A1 (en) * 2001-05-18 2005-07-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of polycomb group protein EZH2 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050288242A1 (en) * 2001-05-18 2005-12-29 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of RAS gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050176025A1 (en) * 2001-05-18 2005-08-11 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of B-cell CLL/Lymphoma-2 (BCL-2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050158735A1 (en) * 2001-05-18 2005-07-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050159381A1 (en) * 2001-05-18 2005-07-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of chromosome translocation gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050196765A1 (en) * 2001-05-18 2005-09-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of checkpoint Kinase-1 (CHK-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US6593091B2 (en) 2001-09-24 2003-07-15 Beckman Coulter, Inc. Oligonucleotide probes for detecting nucleic acids through changes in flourescence resonance energy transfer
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
KR100459106B1 (ko) * 2002-03-21 2004-12-03 한국해양연구원 시간 유전자 인트론의 염기서열을 ｄｎａ 지문으로 이용한생물체 식별 방법
US8855935B2 (en) * 2006-10-02 2014-10-07 Ancestry.Com Dna, Llc Method and system for displaying genetic and genealogical data
WO2005055805A2 (en) * 2003-12-02 2005-06-23 Shraga Rottem An artificial intelligence and device for diagnosis, screening, prevention and treatment of materno-fetal conditions
US20070266003A1 (en) * 2006-05-09 2007-11-15 0752004 B.C. Ltd. Method and system for constructing dynamic and interacive family trees based upon an online social network
WO2008052344A1 (en) * 2006-11-01 2008-05-08 0752004 B.C. Ltd. Method and system for genetic research using genetic sampling via an interactive online network
US20080130778A1 (en) * 2006-12-04 2008-06-05 Samsung Electronics Co., Ltd. System and method for wireless communication of uncompressed high definition video data using a transfer matrix for beamforming estimation
EP2632472B1 (en) 2010-10-29 2017-12-13 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acids (sina)
CN105296473A (zh) * 2015-08-27 2016-02-03 苏州新海生物科技股份有限公司 一种分子量内标及其应用
US11631477B2 (en) 2017-09-07 2023-04-18 Dmitry Shvartsman System and method for authenticated exchange of biosamples
US11238957B2 (en) 2018-04-05 2022-02-01 Ancestry.Com Dna, Llc Community assignments in identity by descent networks and genetic variant origination

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57182650A (en) * 1981-05-06 1982-11-10 Mitsubishi Chem Ind Ltd Detection method for gene by oligoliponucleotide
ATE53862T1 (de) * 1982-01-22 1990-06-15 Cetus Corp Verfahren zur charakterisierung von hla und die darin benutzten cdns-testmittel.
DK105582A (da) * 1982-03-11 1983-09-12 Nordisk Insulinlab Fremgangsmaade til bestemmelse af humane hla-d(r) vaevstyper og gensonde til brug ved fremgangsmaaden
US4556643A (en) * 1982-07-26 1985-12-03 Agracetus Assay method and probe for polynucleotide sequences
IL71064A (en) * 1983-02-28 1989-10-31 Lifecodes Corp Paternity and forensic test involving analysis of dna polymorphic genetic regions
EP0135108A3 (en) * 1983-08-12 1988-07-13 Rockefeller University Nucleotide hybridization assay for protozoan parasites
WO1985002862A1 (en) * 1983-12-23 1985-07-04 Monash University PRODUCTION OF HUMAN INTERFERON-alpha
GB8606719D0 (en) * 1986-03-19 1986-04-23 Lister Preventive Med Genetic probes
US4963663A (en) * 1988-12-23 1990-10-16 University Of Utah Genetic identification employing DNA probes of variable number tandem repeat loci

Also Published As

Publication number Publication date
JPH06253844A (ja) 1994-09-13
FI862915A (fi) 1986-07-11
PL256209A1 (en) 1986-09-23
IS3047A7 (is) 1986-05-13
ES548749A0 (es) 1987-11-01
IS1355B6 (is) 1989-04-19
EP0186271B1 (en) 1991-12-18
KR880700078A (ko) 1988-02-15
DK331886A (da) 1986-07-11
KE3800A (en) 1988-04-29
GB2166445A (en) 1986-05-08
CN85109013A (zh) 1986-07-30
IE62864B1 (en) 1995-03-08
NO862825L (no) 1986-09-15
HUT46078A (en) 1988-09-28
DE186271T1 (de) 1988-12-15
GR852708B (hu) 1986-03-10
DK331886D0 (da) 1986-07-11
CN1014429B (zh) 1991-10-23
NO862825D0 (no) 1986-07-11
PT81468A (en) 1985-12-01
IE852619L (en) 1986-05-12
PT81468B (pt) 1987-11-11
CY1427A (en) 1988-09-02
SG12688G (en) 1988-07-08
GB2166445B (en) 1987-11-11
IL76668A0 (en) 1986-02-28
NZ213762A (en) 1989-03-29
AU581582B2 (en) 1989-02-23
JP2750228B2 (ja) 1998-05-13
DE3584957D1 (hu) 1992-01-30
EP0186271A1 (en) 1986-07-02
WO1986002948A1 (en) 1986-05-22
AU4962685A (en) 1986-06-03
YU176985A (en) 1991-06-30
GB8525252D0 (en) 1985-11-20
ES8800349A1 (es) 1987-11-01
BR8507049A (pt) 1987-03-10
MY102570A (en) 1992-07-31
HK13989A (en) 1989-02-24
FI862915A0 (fi) 1986-07-11
US5413908A (en) 1995-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU203795B (en) Process for identificating dns and for producing polynucleotides as test materials
Marwal et al. Molecular markers: tool for genetic analysis
Taylor et al. Candidate gene analysis of GH1 for effects on growth and carcass composition of cattle
US5851762A (en) Genomic mapping method by direct haplotyping using intron sequence analysis
Georges et al. Characterization of a set of variable number of tandem repeat markers conserved in Bovidae
JPS62282600A (ja) 遺伝的特性決定方法
Womack Comparative gene mapping: A valuable new tool for mammalian developmental studies
AU647806B2 (en) Genomic mapping method by direct haplotyping using intron sequence analysis
JP2719337B2 (ja) Ｙ‐染色体特異的ポリヌクレオチドを用いた反芻動物の性別判定
KR100441471B1 (ko) 돼지의외피색유전자형결정방법
Murakami et al. Polyploid-specific repetitive DNA sequences from triploid ginbuna (Japanese silver crucian carp, Carassius auratus langsdorfi)
EP0342717A2 (en) Polynucleotide probes
GB2206586A (en) Polynucleotide probes
Graves Background and overview of comparative genomics
Georges Hypervariable minisatellites and their use in animal breeding
Mattapallil et al. Parentage assessment of an IVF calf from Bubalus bubalis by DNA fingerprinting
JPH0463680B2 (hu)
WO1993017104A1 (en) Dna sequence of myotonic distrophy gene and uses thereof
Daley et al. Stock delineation of the pink ling (Genypterus blacodes) in Australian waters using genetic and morphometric techniques
Castaneda Dissecting Genomic Factors of Stallion Fertility
Mohammed Genetic diversity in some Iraqi sheep breeds using molecular techniques
Graves kMS Marshall Graves. Ph D is Professor and Head of the School of Genetics and Human Variation, LaTrobe University, Melbourne, Australia|
Hobbs DNA fingerprinting for the diagnosis of diseases and crimes
Schmulian Identification of the polled trait in Bonsmara cattle using microsatellite markers
Whatley et al. The cell, molecular biology and the new genetics