JPH06253844A - 遺伝的特性決定用ポリヌクレオチド - Google Patents

遺伝的特性決定用ポリヌクレオチド

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JPH06253844A
JPH06253844A JP3149288A JP14928891A JPH06253844A JP H06253844 A JPH06253844 A JP H06253844A JP 3149288 A JP3149288 A JP 3149288A JP 14928891 A JP14928891 A JP 14928891A JP H06253844 A JPH06253844 A JP H06253844A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 動物の遺伝子の多数の遺伝子座のミニサテラ
イト又は超可変領域間に共通な塩基配列を含有し、複数
のゲノムから制限酵素により切り出された複数のミニサ
テライト断片又は超可変領域断片とハイブリダイズする
ことができるＤＮＡ断片及びＤＮＡプローブが提供され
る。前記共通配列として、次の配列： GGAGGTGGGCAGGAXG AGAGGTGGGCAGGTGG GGAGGYGGGCAGGAGG T(C)m GGAGGAXGG(G)p C T(C)m GGAGGA(A) q GGGC の全部又は一部が使用される。 【効果】 法医学、家族関係の証明等において、個人を
ポジティブに特定するために用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ヒト又は動物のゲノ
ムを探索(probing) するのに有用なプローブとして役立
つようにラベルすることができるポリヌクレオチド、及
びこのプローブを使用してゲノムＤＮＡを同定する方法
に関する。この同定方法は、例えば、父系及び母系試
験、法医学、並びに遺伝性疾患及び癌の診断において有
用である。
【０００２】
【従来の技術】ゲノムＤＮＡ中の遺伝子の相違を同定す
るための主要な従来方法は、制限断片長の多型性(restr
iction fragment length polymorphisms；RFLP) を検出
することによるものである。例えば、 J.F.Gusella等、
Nature 306, 234−238(1983)によるハンチングトン舞
踏病を生じさせるＤＮＡ欠損の遺伝子座の同定、および
W.K.Cavanee等、 Nature 305, 779−784(1984) による
網膜芽腫の素因の分析を参照のこと。
【０００３】ほとんどのRFLPは、ＤＮＡ中の小規模な変
化、通常、制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を形成し又
は破壊する塩基置換から生ずる。ヒトＤＮＡの平均ヘテ
ロ接合性(mean heterozygosity) は低い（塩基対当り約
0.001)であるから、制限エンドヌクレアーゼは所与の遺
伝子座におけるRFLPを稀にしか検出しないであろう。
【０００４】検出される場合でさえ、ほとんどのRFLP
は、決して50％を超えずそして通常は非常に低い、対立
遺伝子頻度によって決定される、ヘテロ接合性を伴う２
形成(dimorphic)(制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の存
在及び不存在) に過ぎない。結果として、このようなす
べてのRFLPは個体がホモ接合的である場合は常に血統分
析において情報性に欠ける。
【０００５】遺伝的分析は、多数対立遺伝子変化を示す
超可変領域のプローブの入手可能性により、そして対応
して高いヘテロ接合性(heterozygosity)により相当に単
純化され得るであろう。このような第１の領域は、 A.
R.Wyman等、 Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 77, 6754−6758
(1980)により、偶然に、ヒトＤＮＡのランダムセグメン
トのライブラリーから単離された。この遺伝子座の多数
対立遺伝子変化(multiallelic variation)の構造的基礎
がまだ不明である。
【０００６】その後、そしてやはり偶然に、幾つかの他
の高可変領域がヒトインシュリン遺伝子〔G.J.Bell等、
Nature 295 31−35(1982)〕、ゼータ・グロビン遺伝子
〔 N.J.Proudfoot等、 Cell 31, 553−563(1982) 、及
び S.E.Y.Goodbourn等、 Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 80,
5002−5026(1983)〕、及びｃ−Ha−ras −１発癌遺伝子
〔 D.J.Capon等、Nature 302, 33−37(1983)〕 の近傍
で見出された。
【０００７】各場合において、可変領域は短い配列("ミ
ニサテライト")のタンデム反復から成り、そして多型性
(polymorphism)は、有系分裂性もしくは減数分裂性非同
等交換(unequal exchange)により、又は複製中のＤＮＡ
の滑り(slippage)により生ずる反復数の対立遺伝子的相
違に基く。生ずるミニサテライトの長さの相違は、反復
単位を開裂しない制限エンドヌクレアーゼを用いて検出
され得る。
【０００８】本発明者及びその共同研究者はすでにヒト
−ミオグロビン遺伝子のイントロン中の33bp配列の４個
のタンデム反復を含んで成る短いミニサテライトを記載
している〔P.Weller等、EMBO J. ３， 439−446(1984)
〕。この33bp反復はすでに特徴付けられている上記の
他のヒト−ミニサテライトに対して、配列における弱い
類似性を示すことが注目された。
【０００９】この報文はミニサテライト領域が転位(tra
nsposition) により生ずることを推定した。ヒト−ミオ
グロビン遺伝子の33bp反復が転位性(transposable)であ
れば、このものは、反復数の相違に基き多数対立遺伝子
多型性としばしば関連するヒト−ゲノムのタンデム反復
領域のためのプローブを提供することができよう。
【００１０】
【追加の未公表背景情報】ヒト−ゲノムＤＮＡがミオグ
ロビン遺伝子からの33bp配列のタンデム反復を含んで成
るＤＮＡプローブにより探索(probing) された。多型性
の相違が３人の個体（父、母、及び娘）のゲノムＤＮＡ
中の幾つかの異る領域において観察され、この相違は一
層大きな断片（２〜６kb）のサイズにおいて生ずる。デ
ーターは１個より多くのミニサテライト領域の長さの相
違に基く安定に遺伝される多型性と一致した。
【００１１】
【発明の概要】一層の研究が、ミオグロビン遺伝子の33
bp−反復プローブを使用するのよりもはるかに効果的に
ミニサテライト又は超可変領域中の変化性を表示する方
法でゲノムＤＮＡを探索することが可能であることを示
した。
【００１２】この発明は、ヒト又は動物のゲノムＤＮＡ
中の多くのミニサテライトが異るミニサテライト間で高
度の相同性を有するＤＮＡ領域を含有するという発見に
基いている。この共通のコアー領域は短かく、約16塩基
対である。今や、少なくとも３回タンデムに反復される
ヌクレオチドの短コアー配列をその必須構成成分として
有するプローブが、ゲノムＤＮＡ中の多くの異るミニサ
テライト領域を、そしてこれらの領域中のそれらのＤＮ
Ａの相違に言及することにより個体が同定され又は識別
され得る程の精密さをもって検出するために役立つであ
ろうことが見出された。
【００１３】これらの従来のプローブはRFLPにより与え
られるのよりも良好な程度の識別に通じるが個体につい
て本質的に特異的であるフィンガープリント(fingerpri
nt)には通じない。注目すべきことには、１個より多く
のミニサテライト領域又は超可変遺伝子座への言及によ
ってこの発明のコアープローブはＤＮＡをフィンガープ
リントすることができることが見出され、そして通常で
ない程度の非自明性を発明性に加えているのはこの発見
であり、これが基本的で科学的新規性と重要性を有する
発明にしている。
【００１４】コアー配列の知見から、ゲノム中の種々の
遺伝子座からのミニサテライト領域とハイブリダイズす
る性質を有するＤＮＡプローブを製造することができ
る。しかしながら、特定のコアー配列の単なる認識又は
同定は、それ自体では、役立つプローブの製造のために
不十分である。コアー領域のタンデム反復配列を含有す
るポリヌクレオチド又はその誘導体を製造することも必
要である。
【００１５】このようなプローブは、ヒト又は動物のＤ
ＮＡからのミニサテライトとして単離することができ、
又はこれとは異り合成技法によって造成することができ
る。好結果のハイブリダイゼーションを行う追加の条件
を達成することも重要である。これらは、許容され得る
コンセンサス−コアーとの相同性の程度及び全体として
反復単位の内及び外の非−コアーＤＮＡの許容される長
さの知見を包含する。
【００１６】こうして、この発明は次の認識及び発見を
用いる： （１）任意の１つのコアー配列の知識がこの方法におい
て使用され得ること。これはさらに次の認識を含む： （２）ゲノム中の異る超可変遺伝子座を研究することに
よって、必要な程度のコンセンサスを有する異るコアー
配列が見出され得ること； （３）多型性の異るスペクトルを認識するであろうＤＮ
Ａプローブの一群が蓄積され得ること； （４）特定の遺伝子分類があるプローブによって、他の
プローブによるよりも好結果に達成され得ること； （５）任意の１つの分類における１個より多くのプロー
ブの使用により、同定の確率が増幅されること； （６）好結果のプローブの第１世代の一層の研究によ
り、より簡単で且つより好結果なプローブが、例えば合
成により製造され得ること。
【００１７】こうして、この発明の第１の観点に従え
ば、多型性ミニサテライト−長さ特異的結合特性を有す
るポリヌクレオチドの製造方法が提供され、この方法
は： （ｉ）他の多型性ＤＮＡ領域への限定されたハイブリダ
イゼーションを行うことができる、ＤＮＡ中の天然タン
デム反復配列を同定し、 （ii) そのような結合を担当することが推定される該反
復配列の天然コンセンサス−コアー配列を同定し、そし
て （iii)天然反復配列よりも低いゲノム−遺伝子座−特異
性及び高い多型性断片受容性を有する、ミニサテライト
結合性を有する天然コンセンサス−コアー配列由来の完
全な又は不完全なタンデム反復配列を単離するか又は人
工的に造成する、ことを含んで成る。
【００１８】プローブのコアー成分は同じ基礎原理に基
く種々の方法により定義され得る。最も基本的な基礎原
理はプローブの反復配列がヒト又は動物のゲノムＤＮＡ
のミニサテライトに共通の、共通コアー領域からのヌク
レオチド配列から成るか又はそれを含むべきことであ
る。この共通コアー配列は、１つのミニサテライトと他
のものとの間に高度の、例えば80％以上のコンセンサス
を示すという意味において“共通”である。
【００１９】これらのミニサテライトは、例えば、ミオ
グロビン遺伝子33bp反復配列によりゲノムＤＮＡを探索
して、この明細書において“λ33−陽性”断片と称する
ハイブリダイズした断片を得ることにより検出される。
これらの断片及びミオグロビン遺伝子の33bp反復は約16
bpの共通コアー配列を含む。このλ33−陽性断片を、や
はり共通コアー配列を有する他の断片を形成するための
ゲノムＤＮＡのプローブとしてそれ自体として使用する
ことができるが、そのなんらかの小変化を伴うこともで
きる。
【００２０】他の原理は、コアーヌクレオチド配列が、
サンプルＤＮＡのミニサテライト領域に効果的にハイブ
リダイズすることができない程短くなく、多型性をうま
く検出できない程長くないこと、例えばミオグロビン遺
伝子中の33bpタンデム反復に非常に類似することであ
る。一般に、コアーはミニサテライトの共通コアー中に
見出される６ヌクレオチドないし最大約16を有すべきで
ある。
【００２１】プローブの反復配列はもっぱらコアーから
成る必要はなく、コアー配列のいずれかの端に少数のフ
ランキングヌクレオチドを含有することができる。反復
単位は、ヌクレオチドの数又は種類のいずれについて
も、及び反復単位のコアー又は非コアー成分のいずれに
ついても正確な反復である必要はない。
【００２２】しかしながら、これがおよその用語である
としても、この明細書において反復単位として記載しそ
して定義するのが便利である。ｎ反復単位のブロックは
いずれかの末端に任意のヌクレオチド配列を有していて
もよく、その程度及び種類は通常重要でない。この発明
のポリヌクレオチドは、次の方法のいずれかにおいて定
義されるものを特に包含する。
【００２３】第１の定義 ５′→３′の意味に読まれる次の一般式 Ｈ．（Ｊ．コアー．Ｋ）ｎ．Ｌ （１） 〔式中、“コアー”は少なくとも６個の連続するヌクレ
オチドを有する配列を表わし、このヌクレオチドは同じ
意味で読まれる次の配列： GGAGGTGGGCAGGAXG （２） AGAGGTGGGCAGGTGG （３） GGAGGYGGGCAGGAGG （４） T(C)m GGAGGAXGG(G)p C （５Ａ） T(C)m GGAGGA(A) q GGGC （５Ｂ） のいずれかの中から選択され、ここで、ＸはＡ又はＧで
あり、ＹはＣ又はＴであり、ｍは０，１又は２であり、
ｐは０又は１であり、ｑは０又は１であり、ｎは３以上
であり；Ｊ及びＫは一緒になって反復単位内の０〜15個
の追加のヌクレオチドを表わし；そして、Ｈ及びＬはそ
れぞれ反復配列を挟む０又は１以上の追加のヌクレオチ
ドであり；そして次のこと、すなわち： （ｉ）“コアー”並びにＪ及びＫは各（Ｊ．コアー．
Ｋ）反復ユニットで同じ配列又は長さを必ずしも有する
わけではなく； （ii）“コアー”はさらに異るコアー配列を表わすこと
もでき； （iii)全ｎ反復単位中の実際の合計コアー配列は、同じ
数ｎの反復単位における式２〜５について上に定義した
“真の”合計コアー配列と70％以上の相同性を有する；
ことを条件とする〕を有するポリヌクレオチド；並びに
これに対して相補的な配列を有するポリヌクレオチド。
【００２４】第２の定義 次の一般式： Ｈ．（Ｊ．コアー．Ｋ）ｎ．Ｌ （１） 〔式中、“コアー”は同じ５′→３′の意味に読まれる
６〜16個の連続するヌクレオチドの配列を表わし、
（１）反復単位当り約33ntのミオグロビンタンデム反復
配列を含有するプローブＤＮＡを用いてヒト又は動物の
ゲノムＤＮＡを探索することによって得られる第１のヒ
ト又は動物のミニサテライトの５′→３′共通コアー領
域、（２）第１のミニサテライトの共通コアー領域を含
んで成るタンデム反復配列を含有するプローブＤＮＡを
用いてヒト又は動物のＤＮＡを探索することによって得
られる第２のヒト又は動物のミニサテライトの５′→
３′共通コアー領域、及び（３）第２のミニサテライト
の共通コアー領域を含んで成るタンデム反復配列を含有
するプローブＤＮＡを用いてヒト又は動物のＤＮＡを探
索することにより得られる第３のヒト又は動物のミニサ
テライトの５′→３′共通コアー領域から選択され、上
記の各タンデム反復配列は３単位以上の反復である〕を
有するポリヌクレオチド；並びに、これに対して相補的
な配列のポリヌクレオチド。
【００２５】第３の定義 次の一般式： Ｈ．（Ｊ．コアー．Ｋ）ｎ．Ｌ （１） 〔式中、“コアー”は、75％以上、好ましくは80％のコ
ンセンサスを示すヒト又は動物のゲノムＤＮＡのミニサ
テライトの共通コアー領域内からの６個以上の連続する
ヌクレオチドを有する配列のいずれかを表わし；“コア
ー”は各反復単位中で必ずしも同じ配列を有するわけで
はなく、そして他のすべての記号は上に定義した通りで
ある〕を有するポリヌクレオチド；並びにこれに対して
相補的な配列のポリヌクレオチド。
【００２６】第４の定義 次の式： (5′) GPGGGCWGGWXG(3′) （６） （式中、ＰはＧではなく、ＷはＡ又はＴであり、そして
ＸはＡ又はＧである）で表わされる配列、又はその変形
体から選択される連続する（５′→３′）コアー配列を
含む６〜35ntの配列の３以上の反復を有するポリヌクレ
オチド（全反復中の実際の合計コアー配列は、同じ数の
反復における式（６）について定義した“真の”コアー
配列に対する70％以上の相同性を有することを条件とす
る）; 並びにこれに対して相同な配列のポリヌクレオチ
ド。上記の式中で、そしてあまねく、配列は通常の表記
法５′→３′で示される。
【００２７】この発明は、ＤＮＡの、ＲＮＡの、及びＤ
ＮＡとハイブリダイズし得る任意の他の種類のポリヌク
レオチドを包含する。上に定義されたポリヌクレオチド
はラベルされておらず、そして２本鎖 (ds) 形又は単鎖
(ss) 形であることができる。この発明は、プローブと
して使用するためのｓｓ形のラベルされたポリヌクレオ
チド、及びこれらのラベルされた前駆体であってそれか
らｓｓ−プローブを製造することができるものを包含す
る。
【００２８】これらは好ましくは任意の常法において33
Ｐ−放射性ラベルされるが、しかしこの方法に代って、
ハイブリダイゼーション技術においてよく知られている
他の手段により放射性ラベルされることができ、 Proce
edings of the 1981 ICN−UCLA Symposium on Developm
ental Biology using Purified Genes, キーストン,コ
ロラド, 1981年３月15〜20日、 Vol XXIII 1981, 647−
658 頁、アカデミック・プレス、Donald D.Brown等編、
に記載されているD.C.Ward等の方法によりビオチンもし
くは同様の種でラベルされることができ、又は A.D.B.M
alcolm等、Abstracts of the 604th Biochemical Soci
ety Meeting, ケンブリッジ, 英国 (1983年７月１日の
会）の方法により酵素ラベルされることさえできる。
【００２９】そして、この発明の他の観点に従えば、ヒ
ト又は動物のＤＮＡを含有するサンプルの遺伝子の由来
の決定に有用なポリヌクレオチドプローブが提供され、
このものは、ラベルされた成分又はマーカー成分を含む
と共に、サンプルＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼによ
り断片化することにより得られ対応するＤＮＡ断片への
プローブのハイブリダイゼーションを可能にする程度に
ヒト又は動物のゲノムのミニサテライト領域と相同であ
る配列の３回以上のタンデム反復（変形体を包含する）
を含んで成るポリヌクレオチドを含んで成り、そして次
のこと、すなわち： ａ）各反復が、異るゲノム遺伝子座からの多数のミニサ
テライト中に存在する同様な長さのコンセンサス−コア
ー領域と70％以上相同であるコアーを含有し； ｂ）コアーが６〜16ヌクレオチドの長さを有し； ｃ）コアーに寄与しない、反復単位内のヌクレオチドの
合計数が15以下である；ことを特徴とする。
【００３０】この発明はさらに、ヒト又は動物のゲノム
ＤＮＡのサンプルの同定方法を包含し、この方法は、こ
の発明のプローブにより該ＤＮＡを探索し、そしてＤＮ
Ａのハイブリダイズした断片を検出することを含んで成
る。
【００３１】この発明のこの観点は：細胞性材料のサン
プルからの全ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼを用いて
断片化し、高可変ＤＮＡ断片を、ラベル化された成分又
はマーカー成分に加えて反復コアー成分を含有する上に
定義したプローブとハイブリダイズせしめ、そして異る
長さのＤＮＡ断片に、又はさらに一般的には異る分子サ
イズのバンドに結合したラベル又はマーカーの濃度を決
定する、ことを含む。
【００３２】通常、断片化されたＤＮＡは、ハイブリダ
イゼーションの前に、鎖長に従って、例えば電気泳動に
より分別又は分離し、そしてマーカー濃度を検知してそ
の個々の要素が遺伝的由来に特異的である特徴的パター
ンを得る。
【００３３】定義 この発明及び今までの記載中に使用される下記の定義が
助けとなろう。超可変的 １つの認められた遺伝子座又は部位におけるヒト又は動
物のＤＮＡの領域が長さ又は配列について多くの異る形
態で存在する場合、それは超可変的であると言われる。
【００３４】制限断片長多型性(RFLP) これは、電気泳動後に分離されそしてプローブにより検
出されたヒト又は動物のＤＮＡ断片のパターンにおける
遺伝子的多様性である。
【００３５】ミニサテライト これは、短いＤＮＡ配列のタンデム反復から構成される
ヒト又は動物のＤＮＡの領域である。すべての反復単位
が完全な同一を示すことは必ずしも必要でない。（この
発明のプローブは多型性であるミニサテライトを含んで
成る。）
【００３６】多型性 個体ごとに相違を示す遺伝子、又はＤＮＡの他のセグメ
ントは多型性であると言われる。
【００３７】コアー（配列） 本来、コンセンサス−コアー配列の意味に用いられる
が、しかしそれに由来する任意の反復される配列又は変
形配列に拡張される。
【００３８】コンセンサス−コアー（配列） 由来又は遺伝子座を異にする２以上のミニサテライトの
反復単位間で実質的な又は完全にマッチするものとして
同定され得る配列である。
【００３９】反復（配列） 所与のコアー配列はコアー配列を含有するセグメントの
完全な又は不完全なタンデム反復たる配列である。
【００４０】定義されたコアー（配列） それ自体の長さ内で式（２）〜（８）の１つと完全に一
致するコアー配列である。
【００４１】変形体（コアー配列） 定義されたコアー配列からわずかな程度異る（相同性50
％以上）実際のコアー配列である。
【００４２】完全反復（配列） 所与のコアー配列の又はコアー配列を含有するセグメン
トの正確なタンデム複製たる配列である。
【００４３】不完全反復（配列） 少なくとも１つの単位が塩基対置換及び／又は長さにお
いて少なくとも１つの他の単位から異る配列である。
（通常、１つのプローブ配列中に少なくとも３個のタン
デム配列が存在し、プローブ配列内に少なくとも１つの
定義されたコアー配列及び少なくとも１つの変形体が存
在するであろう。）
【００４４】相同性％ 同じ長さの２つの配列の比較において、塩基対（bp）の
数からbp置換数を差引きしたもののbp数に対する％であ
る。
【００４５】ヌクレオチド（nt) 及び塩基対（bp）は同
義に使用される。両者はＤＮＡ又はＲＮＡに当てること
ができる。略号Ｃ，Ａ，Ｇ，Ｔは常用通り（デオキシ）
シチジン、（デオキシ）アデノシン、（デオキシ）グア
ノシン、及びデオキシチミジン又はウリジンのいずれか
を意味する。
【００４６】タンデム反復配列（人工的な、又は天然単
離体）は完全反復であることができるが、しかしさらに
好ましくは不完全反復である。好ましくは少なくとも２
個の反復がコンセンサス−コアー配列の不完全反復であ
る。好ましくは、３個以上の反復、そしてさらに好まし
くは７個以上の反復がプローブ配列中に存在する。
【００４７】プローブの製造は、クローニングによる天
然ミニサテライトの単離及びＤＮＡ配列決定による同定
を含むことができる。これはまた、必要とされるコアー
の切り出し及びそれに続くそのタンデム反復への転換、
又は由来を異にする断片との非同一交換の促進を含むこ
とができる。これはまた、ポリヌクレオチドのクローニ
ングを含むことができる。
【００４８】他方、造成段階は同定されたコンセンサス
−コアー配列又はその断片の合成を含むことができる。
コンセンサス−コアー配列は好ましくは６bp以上を含有
しそして好ましくは16bp以下を含有する。次に合成コア
ーのタンデム反復を造成する。
【００４９】言うまでもなく、ポリヌクレオチドは、好
結果の又は部分的に好結果の中間体のクローニングの後
の異る時における操作の連続の結果であることができ、
そして最終ポリヌクレオチドが親ミニサテライトへのわ
ずかな類似性を有するように天然起原又は合成起原の断
片を含むことができる。
【００５０】この発明のプローブは次の分野において有
用である。 1. ヒトにおける父系及び母系試験。 2. 例えば入植紛争及び相続紛争における家族群の立
証。 3. 双生児におけるチゴシティー(Zygasity)試験。 4. ヒトにおける血族結婚についての試験。 5. ヒトにおける一般的血統分析。
【００５１】6. ヒトにおける遺伝的疾患の遺伝子座の
同定。これにより遺伝的欠点を検出するための特異的プ
ローブの造成が可能となる。 7. 法医学（ａ）強姦の犠牲者からの精液の特定、
（ｂ）例えば汚れた衣類からの血液、髪及び精液の特
定、（ｃ）ヒトの遺体の特定。 8. セル・チメラリズム(Cell Chimaerism) の研究、例
えば骨髄移植後の提供細胞対受容体細胞の追跡。
【００５２】9. 家畜の育種及び血統分析／証明。（こ
れは例えば動物の純系の日常的調節及び点検、並びに例
えば競争馬及び犬の繁殖に係る訴訟事件における血統の
点検を含むことができよう。）さらに、経済的に重要な
遺伝的形質との関係を示すであろう遺伝マーカーを提供
すること。
【００５３】10. 純粋なセルラインの汚染及び日常的同
定作業を点検する、培養された動物セルラインの日常的
品質管理。 11. 腫瘍細胞及び腫瘍の分子異常についての分析。 12. ポリヌクレオチド又はそれに由来するプローブは植
物育種における潜在的用途を有するものと期待される。
【００５４】
【好ましい態様の記載】ファージλＬ47.1中にクローン
化されたヒトＤＮＡの10〜20kb Ｓau3A部分のヒトゲノ
ムライブラリーを、33bpミオグロビン反復プローブ pAV
33.7とのハイブリダイゼーションによりスクリーニング
した。３×105 組換体のライブラリー中に40以上の強く
ないし弱くハイブリダイズするプラークが同定された。
【００５５】これらの陽性プラークの８個の無作為選択
物を精製し（λ33.1−15) 、そしてファージＤＮＡのサ
ザンブロット分析を用いて、各組換体においてハイブリ
ダイズするＤＮＡが組換体のユニーク短（0.２〜２kb)
領域内に位置することが示された。配列分析は、８個の
組換体の各々のこの領域が反復配列の３〜29タンデムコ
ピーを含んで成るミニサテライトを含有し、該反復配列
の長さはλ33.15 中の16bp〜λ33.4中の64の範囲である
ことを示した。
【００５６】ほとんどのミニサテライトは整数個の反復
を含有していた。次に、λ33.6においては、37bp反復が
基本的12bpユニットの分岐したトリマーから成ってい
た。各λ33組換体は、各ミニサテライトを挟むクローン
特異的ＤＮＡ配列により判定した場合ヒトゲノムの異る
領域を代表していた。
【００５７】８個のクローン化ミニサテライト領域は、
ヒトＤＮＡのHinfＩ消化物中で pAV33.7により検出され
得る多型性２〜６kb DNA断片より小さい0.５〜2.２kbHi
nfＩDNA断片内に位置していた。
【００５８】クローン化されたミニサテライト領域のい
ずれかも多型性であるか否かを決定するため、32Ｐ−ラ
ベル化単鎖ＤＮＡプローブを各ミニサテライトの適当な
Ｍ13サブクローンから調製し、そして高厳重さで、Hinf
Ｉで消化された14人の親類関係にない英国白人のＤＮＡ
のパネルにハイブリダイズせしめた。
【００５９】典型的なハイブリダイゼーションパターン
は、これらのハイブリダイゼーション条件下で各プロー
ブがヒトゲノムのユニーク領域を検出すること、及びこ
れらの領域の３個は高度に多型性であることを示す。上
記の手順の、これ以上の詳細は例に記載する。
【００６０】今や、前記のポリヌクレオチドの定義に関
し、定義は次の一般式 Ｈ．（Ｊ．Ｃ．Ｋ．）ｎ．Ｌ （８） （式中Ｃはコアー配列を示し、そして他の記号は上記の
通りである、）と一致する。すべての定義において、１
つの単位のコアー配列は次のものと同じでも異っていて
もよい。例えば、全体として反復単位に当てはまるコン
センサス配列と比べて１もくしは２個の余分のヌクレオ
チドを含有し、１もしくは２個のヌクレオチドを欠き、
又は（例えば）１〜４個のヌクレオチドが異なっていて
もよい。
【００６１】コアーは種々の方法で定義され得る。一般
的定義はコアー配列を同定することができる手順に言及
することにより得ることができる。ゲノムＤＮＡのサテ
ライト領域は例えば、 GGAGGTGGGCAGGAXG （２） のごとき配列と比較される。
【００６２】式（２）に含まれるすべての可能なＸ−ヌ
クレオチド長配列から選択されるＸ−ヌクレオチドと最
大の相同性を示すミニサテライトから取られるＸ−ヌク
レオチド長配列は、コアー配列であるとされる。言うま
でもなく、これはコアーを定義する非常に狭い方法であ
り、そして１又は少数のコアーの６ヌクレオチド長、１
又は少数の７ヌクレオチド長、そして16までのヌクレオ
チド長をもたらすべきである（最高の、例えば 100％相
同性の１より多くが存在するであろうから“少数”であ
る）。
【００６３】このように定義されたコアーに対するこれ
らのコアーの平均70％以上の相同性を全ｎ反復単位が有
する程度に多様性が存在し得ることが仮定される。反復
配列内のフランキング配列ＪおよびＫは相同性について
の計算には含まれず、コアー間でのみ比較される。
【００６４】定義されるコアーは種々の長さを有するこ
とができ、そして“混合”され得る。すなわち、幾つか
の反復単位においては例えば式（２）のGGGCAGGAXGと相
同でありそして他においては例えば式（３）のGGGCAGGT
GGと相同である。従って、変形体は、必然的に“コア
ー”自体との相同性ではなく（コアー）ｎとの相同性と
して考慮すべきである。
【００６５】前に定義された“第１の”定義は、上記の
考慮に由来するが、しかし示されている式（２）〜式
（５）中、事情次第で、６〜最高12〜16のいずれかの長
さの配列としてコアーが定義される点において単純化さ
れる。変形体について同様の規定が存在する。
【００６６】第２の定義は、それぞれが追加のミニサテ
ライト断片を生成し得る連続するハイブリダイゼーショ
ン段階としてコアーを定義する。ヒトゲノムＤＮＡの広
範なライブラリーに対して十分な数のハイブリダイゼー
ションを行い、十分な数のハイブリダイズした断片を試
験し、これらからプローブを作り、ゲノムＤＮＡを再び
探索し、そして理論的にはこれを無限回行うことによ
り、ミニサテライトＤＮＡ中で広く象徴されるコンセン
サスコアー配列の範囲に到達することが可能であること
が容易に理解されよう。
【００６７】実際には、十分に広いコンセンサスコアー
領域に到達するために非常に多数回そして大規模にこれ
らの操作が行われなければならないとは予想されず、そ
してそれ故に（勝手に）３回のみの探索操作が定義内に
含まれる。
【００６８】“第３の”定義において、Ｗがコアーを表
わし、そして25％（例えば16ヌクレオチド中４ヌクレオ
チド）より多く異らない多様性を伴う広く共有されるコ
ンセンサスコアー領域の可能性に頼る。25％以下の可能
性ある可変性を伴う約16ヌクレオチド以上のコアー領域
をこのように定義すれば、コアーＷはその領域内からの
６以上の連続するヌクレオチドの配列として定義され
る。
【００６９】“第４”の定義は、合成ポリヌクレオチド
に係る研究から得られた再定義されたコンセンサスコア
ー式（６）を含む。これらの研究は、一層短いコアー配
列の他の定義を導く。従って、好ましくは連続する
（５′→３′）配列： PGGGCWG （７） がすべての反復単位中に保存され、ここでＰ及びＷは上
の第４の定義において与えられた意味を有する。Ｐは好
ましくはＴであり、Ｗは好ましくはＡである。
【００７０】好ましくはまた、連続する（５′→３′）
配列： TGGGCA （８） が全反復単位に保存される。他の観点に従えば、連続す
る５′→３′コアー配列： GGPGGGCWGGWXG （７） （式中、ＰはＧではなく、ＷはＡ又はＴであり、そして
ＸはＡ又はＧである）を含む３以上の反復を有するポリ
ヌクレオチド、又はその変形体（全反復中の実際の合計
コアー配列が同じ数の反復中式（７）に関して定義され
た“真の”合計コアー配列と70％以上の相同性を有する
ことを条件とする）、及び上記のものと相補的な配列の
ポリヌクレオチドが提供される。
【００７１】上記のすべての定義において、コアーは少
なくとも６ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは７
又は８ヌクレオチドであり、そして最も好ましくは12又
はそれより大で例えば14〜16である。式（２）の配列GG
GCAGGAXG（３′末端の末端10ヌクレオチド) は高コンセ
ンサスであり、そして特に有望なようである。変形体コ
アーは、好ましくは70％以上、そしてさらに好ましくは
80又は85％以上の相同性を有する。
【００７２】各反復単位内のフランキング配列Ｊ及びＫ
は好ましくは各端において省略され、又は短かく、例え
ば0.１又は２ヌクレオチドにされ、そして好ましくはＪ
及びＫは一緒になって20を超えるべきではなく、さらに
好ましくは20を超えるべきではない。反復単位内のＪ＋
コアー＋Ｋの合計中の全ヌクレオチド数は好ましくは36
を、そしてさらに好ましくは31を、そして最も好ましく
は25を超えるべきでない。
【００７３】反復単位の数ｎは好ましくは少なくとも1
0、便利には10〜40であるが、しかし原理的には任意の
数であることができ、10,000までの数でさえ可能であ
る。
【００７４】フランキング配列Ｈ及びＬは無関係であ
る。これらは省略されることができ、又は任意の数の、
例えば20,000までのヌクレオチドとして存在することが
できるが、このような長いプローブを用いることはあま
り賢明ではない。反復配列がss−DNA である場合でも、
これらはds−DNA を含有することができる。
【００７５】同定方法は任意の既知の探索技法を用いる
ことができ、その最も通常の方法はサンプルＤＮＡを、
タンデム配列を開裂せしめないか又はそれらの探索され
る能力を妨害しない無意味な程度に開裂せしめるに過ぎ
ない制限酵素（適当であれば１種類又は複数種類）によ
り開裂せしめることである。
【００７６】
【実施例】例１ ヒト−ミオグロビン遺伝子からの、長いタンデム
反復配列を含有するプローブの造成 このプローブの造成が（ａ）〜（ｅ）で表示される５段
階を示す図１中に模式的に説明されている。出発ミオグ
ロビン遺伝子（ａ）はP.Weller等、EMBO J. ３, 439−
446(1984) により記載されている。そこに示されている
ように、該遺伝子は、ほとんど同一の９bp配列（図１中
ｒ）に挟まれた33bp配列の４個の反復から成る、第１イ
ントロン中に位置する領域を有する。
【００７７】この領域を169bp ＨinfI断片（ｂ）中に単
離し、それを末端修復しそしてプラスミドpUC13 のＳma
Ｉ部位にクローニングすることにより増幅した〔J.Viei
ra等、 Gene 19, 259−268(1982) を参照のこと〕。制
限エンドヌクレアーゼＡvaII（Ａ）により第３及び第４
反復を開裂せしめることによりモノマーを単離した
（ｃ）。（反復１及び２中の１基置換がこの部位を除去
し、そして代りにＤdeＩ（Ｄ) 部位を形成する。）
【００７８】非−同一ＡvaII接着末端を介する33bpモノ
マーの連結により反応単位数不明の頭：尾ポリマー
（ｄ）が生成した。少なくとも10個の反復を含むポリマ
ーを分取用アガロースゲル電気泳動により単離し、末端
を修復し、 pUC13のＳmaＩ部位に連結し、そしてＥ．コ
リJM83中にクローン化した (J.Vieira等、前掲を参照の
こと）。
【００７９】pAV33.7と称する生じたプラスミド（ｅ）
中のポリマーＤＮＡ挿入部の構造を、ＢamHI＋ＥcoRIに
よりポリリンカーにおいて該挿入部を切り出し、α−32
Ｐ−dCTPによりＢamHI部位においてフィル−インラベル
化し、そしてＡvaIIにより部分消化することにより確認
した。
【００８０】ラベルされた部分消化生成物を２％アガロ
ースゲル上での電気泳動により分離した。 pAV33.7は
（ｅ）に示すように767bp ＢamHI＋ＥcoRI断片中に含ま
れる33bpモノマーの23反復を含有することが見出され
た。
【００８１】（２）ミオグロビン33bp反復プローブによ
るヒト−ゲノムのミニサテライト領域の選択物の配列決
定 バクテリオファージλＬ47.1中にクローン化された10〜
20kbヒトＤＮＡ断片のライブラリー〔P.Weller等、前
掲、及びW.A.M.レネン等、 Gene 20, 249−259(1980)
〕を、P.Weller等、前掲、の方法により32Ｐ−ラベル
された、前記段階（１）中に記載した 767bp pAV33.7挿
入部とのハイブリダイゼーションによりスクリーニング
した。
【００８２】８個の陽性プラークの選択物を精製してλ
33.1−15と称する組換体を得た。これらのファージＤＮ
ＡのそれぞれをＨinfI又はＨaeIII により消化し、1.５
％アガロースゲルを通して電気泳動し、そしてその中の
33−反復関連配列を pAV33.7DNAとのサザン・ブロット
・ハイブリダイゼーションにより位置決定した。
【００８３】各組換体は１個の“λ33−陽性”ＨinfI及
びＨaeIII 断片を与えたが、λ33.4及び11は検出可能な
ＨaeIII 断片を与えなかった（これらの組換体中の反復
領域中にＨaeIII 開裂部位が存在するため）。λ33−陽
性ＨinfI及びＨaeIII 断片を分取用ゲル電気泳動により
単離し、所望により末端修復し、そして２本鎖DNA M133
mp8 のＳmaＩ部位に平滑末端連結した〔 J.Messing等、
Gene 19, 269−276(1982) 〕。
【００８４】Ｅ．コリ(E.coli) JM101に形質転換した後
陽性ss−M13 組換体を単離し、そしてジデオキシヌクレ
オチド・チェイン−ターミネーション法により配列決定
した。すべてのλ33−陽性断片がタンデム反復領域を含
有しており、これは幾つかの場合には直接配列決定する
ことができた。反復領域が配列決定プライマー部位から
遠すぎる他の場合には、Ｍ13挿入部を制限エンドヌクレ
アーゼによる開裂によって短縮し、そして再度配列決定
した。
【００８５】λ33−陽性断片の構造を、λ33.1, 33.3,
33.4, 33.5, 33.6, 33.10, 33.11及び33.15 と称する８
個の地図の形で後に示す。使用された実際の制限酵素及
びヌクレオチド中の断片の長さはλ33.1：ＨaeIII, 20
00；33.0：ＨinfI, 465；33.4：ＨinfI, 2000；33.5：
ＨinfI, 1600；33.6：ＨaeIII, 720； 33.10：ＨaeII,
720； 33.11：ＨinfI, 1020；λ33.15 ：ＨinfI, 1220
であった。
【００８６】各地図は、長方形箱上に大文字スクリプト
で塩基の反復配列を示す。“反復”は塩基の数について
常に完全というわけではなく、そして塩基の置換によっ
て幾分異る。箱はコンセンサスから異る反復を示す。箱
内の空白は一致が見出されたことを示す。
【００８７】箱内の塩基記号Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔは、コンセ
ンサス配列中のその上に示されているものがそれにより
置き換えられていることを示す。ＸはＡ又はＣである。
ＹはＣ又はＴである。−はコンセンサスに比較して欠け
ているヌクレオチドである。>>> <<<(矢はず) 記号は、
配列決定はまだなされていないが、配列決定ゲルのオー
トラジオグラフからその配列がコンセンサスの“反復”
である（言うまでもなく“反復”なる語を上記と同様に
用いる）ことが明らかであることを示す。
【００８８】断片λ33.3, 33.5, 33.10, 33.11及び33.1
5 は完全に配列決定されており、他は部分的に配列決定
されている。箱の左側の"conの下方の数値は配列の反復
数である。この列の底部の番号は反復の数を示す。すな
わち、λ33.1は箱の上の大文字スクリプトで示された62
ヌクレオチド (nt) 配列の26反復を含む。
【００８９】各地図の頂部及び底部の小文字スクリプト
で示された配列は反復配列ブロックのそれぞれ５′側及
び３′側に存在するフランキング配列であり、そしてこ
れらのフランキング配列は反復されない。言い換えれ
ば、この構造はフランキング配列により示されるランダ
ムコポリマーのそれに類似し、そこではタンデム反復に
より示されるブロックコポリマーの単位が現われる。
【００９０】
【化１】
【００９１】
【化２】
【００９２】
【化３】
【００９３】
【化４】
【００９４】
【化５】
【００９５】
【化６】
【００９６】
【化７】
【００９７】
【化８】
【００９８】（３）各λ33−陽性断片の反復配列内に位
置しそしてそれに共有される共通短“コアー”配列の発
見および同定 各領域の反復配列を、ドットマトリクス分析を用いて、
pAV33.7中のミオグロビン33bp反復配列と、及びその逆
方向相補体と比較した。非常に顕著に、ミオグロビン33
bp反復配列とλ33−陽性断片のコンセンサス反復配列と
の間に配列類似性の１つの小さい明瞭な領域が見出され
た。同じ領域が８個のすべてのλ33断片の反復により共
有されており、そして“共通コアー”と称されよう。下
記のチャートはその比較を示す。
【００９９】このチャートにおいて、前記段階（２）に
おいて決定された各コンセンサス配列の全体が示され
る。これらは、ミオグロビン33bpプローブ中及びヒト−
ゲノムＤＮＡから単離されたλ33−陽性断片中のタンデ
ムに反復する部分である。このチャートは共通コアー領
域を大文字スクリプトの16ヌクレオチド長として示す。
【０１００】
【化９】
【０１０１】＊この配列はトリマーであり、従ってフラ
ンキング領域はコアーに寄与する。
【０１０２】やはり、ＸはＡ又はＧであり、ＹはＣ又は
Ｔであり、−は欠けたヌクレオチドである。これら16ヌ
クレオチドについて実質的な程度の一致が存在し、その
８個は 100％の一致を示し、そして９番目の“Ｘ”はＡ
又はＧのいずれかである範囲で一致する。
【０１０３】これら９ヌクレオチドには底列にアンダー
ラインが付されており、共通コアー領域のヌクレオチド
を示す。小文字スクリプトで示されたタンデム反復配列
の残基が共通コアー領域の縁に存在する。各反復コンセ
ンサスの始／終端が記号▼により特定され；λ33.4及び
λ33.15 の場合には非一整数の反復が存在し、そしてそ
のために別々の反復開始及び終端が異る記号▽で示され
ている。
【０１０４】共通コアー領域は複雑な分析によってのみ
同定され得たことが認識されよう。なぜなら、これはし
ばしばλ33−陽性断片の１個のコンセンサス配列に全体
として属さず、そしてミオグロビン遺伝子33bp反復の２
個の連続する配列にまたがるからである。この発明の範
囲内にあるものとして定義されるポリヌクレオチドとの
一致の程度を説明するため、種々の決定要素を次の表１
に示す。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】（４）多型性ヒト−ゲノムＤＮＡ断片が個
々のλ33−陽性断片のプローブとのハイブリダイゼーシ
ョンにより検出され得るという発見 図２に関し、英国系白人（１〜６）の無作為サンプル及
び大きな英アジア家系（７〜18）の選ばれた構成員から
採取された白血球からＤＮＡを調製した。血統は便宜上
男性を示す正方形、女性を示す円形、及びこれらの間の
線による結婚により示される。いとこ間の２件の近親結
婚を両親間の２本線で示す。
【０１０７】ＤＮＡの10μｇのサンプルをＨinfIで消化
し、20cm長の２％アガロースゲルを通して電気泳動し、
その場で変性し、そしてブロッティングによりサルトリ
ウス(Sartorius) ニトロセルロースフィルターに移し
た。単鎖の32Ｐ−ラベル化ハイブリダイゼーションプロ
ーブを、ミニサテライト（タンデム反復）領域を含有す
るＭ13組換体から調製した。使用した正確なプローブは
後で記載する。
【０１０８】手順は次の通りとした。約0.４μｇの単鎖
ＤＮＡを４ngのノクーマー配列決定プライマー〔 M.L.D
ockworth等、Nucleic Acids Res.９，1691−1706(198
1)〕と、10μｌの10mM MgCl2, 10mM Tris−HCl(pH8.0)
中で60℃にて30分間アニールした。
【０１０９】プライマー延長を、16μｌの80μM dATP,
80μM dGTP, 80μM dTTP, 10mM Tris−HCl(pH8.0), 0.
1mM EDTA及び３μl(30μCi) α−32Ｐ−dCTP(3000Cimmo
le-1) 及び１μｌの５ユニットμｌ-1Klenow断片（ベー
リンダー）を添加し、そして37℃にて15分間インキュベ
ートすることにより行った。延長は2.５μｌの0.５mMdC
TPを添加しそして37℃にてさらに15分間チェージング(c
hasing) することにより完成した。("チェージング"(Ch
asing)とは M13ss DNAの鋳型上にds DNAの輪を完成する
ためにdNTP混合物を添加することを意味する。
【０１１０】ＤＮＡを、挿入部中又は挿入部に対して遠
位のＭ13ポリリンカー中の適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位において開裂せしめ、１／10容量の1.５M NaOH,
0.１M DKTAを添加することにより変性し、そしてプライ
マーから伸びる32Ｐ−ラベル化単鎖ＤＮＡ断片を1.５％
低融点アガロースゲル（シー・プラク）による電気泳動
によって回収した。
【０１１１】切り出されたバンド（比活性＞109cpm／μ
ｇ DNA) を１mgのアルカリ奪取(sheare)したキャリャー
ヒト胎盤ＤＮＡ（0.3M NaOH, 20mM EDTA中で 100℃にて
５分間奪取し次に HClにて再中和) の存在下で 100℃に
て溶融せしめ、そしてハイブリダイゼーションチャンバ
ーに直接加えた。キャリャーＤＮＡはまた反復ＤＮＡ配
列へのその後のハイブリダイゼーションを抑制するため
にも役立った。
【０１１２】使用した正確なハイブリダイゼーションプ
ローブは、（Ａ）33.1、ミニサテライト (62nt配列の26
反復＝1612nt) ＋約360nt のフランキングヒトＤＮＡを
含む約2000ntサブクローン化ＨaeIII 断片；（Ｂ）33.
4, 2015nt ＨinfI断片中に含まれるミニサテライトの
プライマー近位側の695nt 非−ミニサテライトＥcoRI断
片；及び（Ｃ，Ｄ，Ｅ） 33.15, λ33.15 ミニサテライ
ト配列（上に示した共通コアー領域から平均２ヌクレオ
チド異る、16nt配列の29反復) ＋128nt フランキングヒ
トＤＮＡを含む 592ntサブクローン化断片、であった。
【０１１３】A.J.Jeffreys等、 Cell 21, 555−564(19
80) により記載されているようにしてハイブリダイゼー
ションを行った。但し、バックグラウンドラベル化を低
くするためデキストランサルフェートを６％(W／V)ポリ
エチレングリコール6000により置き換えた。フィルター
Ａ及びＢを0.５×SSC 中で65℃にて一夜ハイブリダイズ
せしめ、そして65℃にて0.２×SSC 中で洗浄した。
【０１１４】フィルターＣ〜Ｅはハイブリダイズせし
め、そして１×SSC 中で65℃にて洗浄した。フィルター
を固定したタングステン酸強化スクリーンを用いて−80
℃にて１〜３日間オートラジオグラフ処理した。
【０１１５】図２に示すように、反復コアープローブ3
3.15 はＨinfIで消化されたヒトＤＮＡにおいてハイブ
リダイズする断片の極めて複雑なプロフィールを検出し
た。最大（４〜20knt)ＨinfI断片のみが十分に分離され
得、そしてこれらはハイブリダイゼーションプロフィー
ルが個体特異的ＤＮＡ“フィンガープリント”を提供す
る程度に極度の多型性を示した。
【０１１６】血統分析は、いとこ結婚の単一の血縁関係
（図２の16〜18) の間でさえ、すべての個体が識別され
得る程の、極度の多型性の多様性を確認した。
【０１１７】図２中の家族（Ｄ，Ｅ）は、大ＨinfI断片
のほとんどが各親からの子孫のいくらかにのみ伝達され
ることを示し、これによって、これらの断片のほとんど
がヘテロ接合状態で存在すること、及びこれらの大きな
超可変断片のヘテロ接合性は100％に達しなければなら
ないことが示される。
【０１１８】これに対して、子孫中のすべての断片は一
方又は他方親に起因せしめることができ（唯一の例外を
伴って）、そしてそれ故に１セットの安定に遺伝される
遺伝マーカーを提供する。特異的に父からむすこに、又
は母からむすめに伝達されるバンドはなかった（フィル
ターＤ、図２を参照のこと）。
【０１１９】これはそれぞれＹ及びＸリンケージを除外
し、そしてこれらのミニサテライト断片が主として常染
色体に由来することを意味する。これらのＤＮＡ断片が
常染色体のセット中のどこに由来するかはまだ知られて
いないが、これらは１つの常染色体の単一の領域に由来
するのではない。そうではなく、子孫中で独立して分離
する親断片の対が同定され得る（フィルターＤ、図２を
参照のこと）。
【０１２０】正確には、少なくとも１のＡＢ又は−−子
孫が存在すれば、一方の親における（そして他方から欠
けている）１対のバンドＡＢは対立遺伝子的ではあり得
ず；Ａ−又は−３組換子孫の存在はさらに、Ａ及びＢ間
の密接なリンケージの欠如を確立する。
【０１２１】図２Ｄ中に示される家族のもとのオートラ
ジオグラフの注意深い検討は、それらの規準により、母
における少なくとも10個の分離可能なバンドを示し、そ
の内の８個は相互に非対立遺伝子的であり、そして密接
にリンクしていない。
【０１２２】他の２個のバンドはそれぞれ８個の非リン
ク断片の１つの対立遺伝子であるかもしれず、ここでＡ
−及び−Ｂ子孫のみが分析される子孫の限定された数に
おいてのみ観察され、但しこのような少数のサンプル
は、このような断片対が単一遺伝子座の対立遺伝子であ
ることを証明するには十分でない。
【０１２３】結論として、コアープローブは、少なくと
も幾つかの非リンク超可変遺伝子座上で同時に有用な情
報を与えることができる。この結論は例８においてさら
に詳細に検討される。
【０１２４】他方、他の２つのプローブ（フィルターＡ
及びＢ、図２）は、この発明に従わず、１個又は２個の
バンドを与えるに過ぎず、そして多くの異る多型性領域
を同時に検出することができず、そしてそれ故に一般的
診断に用いることができない。
【０１２５】例２ ヒトＤＮＡ中の新たなセットの超可変領域を検出するた
めのプローブ中の追加の変形体（コアー）の使用 クローン化λ33−陽性断片λ33.5及びλ33.6に由来する
他の２つのプローブを例１、段階（４）と同様にして調
製した。33.5プローブはM13mp8中にクローン化された 3
08nt DNA断片から成りそして上記のコンセンサス配列の
14反復を含んで成り、これは70ntフランキングヒトＤＮ
Ａと共に共通コアー配列の17nt長の変形体である。
【０１２６】33.6プローブは18反復の37nt配列を含み、
今度はこの配列は共通コアー領域由来の約12ntの短縮配
列の３反復＋その５′−末端における追加のＴＣを含ん
で成る。18×17nt反復ブロックは97ntヒトＤＮＡに挟ま
れていた。37nt配列の構造は次のように表わすことがで
きる。
【０１２７】 このプローブは同様にしてM13mp8にクローン化された。
後の記載において、11ntコンセンサス配列AGGGCTGGAGG
がこのプローブのために与えられる。
【０１２８】両プローブを32Ｐによりラベルし、そして
例１．段階（４）と同様にして14の親類関係にない白人
のパネルからのヒトＤＮＡにハイブリダイズせしめた。
両プローブは複雑な１セットのハイブリダイズする断片
を検出し、その多くは極度に多型性の変化を示した。
【０１２９】33.5により検出される幾つかの断片は新規
であり、そして 33.15コアープローブによっては今まで
検出されていないものである。33.6プローブはほとんど
完全に新しいセットのミニサテライトを検出し、そして
これらの正しいうけ継ぎが血統分析により証明された
（例８を参照のこと）。
【０１３０】次の例はこの発明をさらに証明しそして例
示する。サンプルＤＮＡの消化は好ましくは、ヌクレオ
チドの４塩基対を認識する制限エンドヌクレアーゼを用
いて行われる。最も長い超可変断片についてのＤＮＡフ
ィンガープリントパターンが使用される４bp認識制限エ
ンドヌクレアーゼから大きく独立していることが見出さ
れた。
【０１３１】このことは、これらの大断片がより長いミ
ニサテライトに由来するのではなく、そしてそれぞれ
が、制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を欠きそして正常
な高密度の４bp開裂部位を含有するヒトＤＮＡに挟まれ
た完全長の均一なミニサテライトを含有することを強く
示唆する。これは、これらの大ミニサテライト断片のほ
とんどがリンクしておらずそして独立して血統中に分か
れることを示す前記の例及び例８において示される結果
と一致する。
【０１３２】好ましい態様においては、ＤＮＡのサンプ
ルを、２つの異るフィンガープリントをもたらす別々の
ハイブリダイゼーションにおいて、２つの異るプロー
ブ、例えばラムダ 33.15及び33.6断片からのプローブを
用いて、二重フィンガープリントを採取する。
【０１３３】２人の無関係の個体が同じフィンガープリ
ントを有する、すでに低い確率が、この手段によりさら
に低下する。例えば、例４は、好ましくは４kb末端の長
さの不完全に分離するハイブリダイズＤＮＡ断片が無視
される場合でさえ10-19 という低い確率を示す。
【０１３４】この発明は父系試験の方法を含む。子にお
ける多型性ミニサテライト断片の約半分が父に由来し、
そしてこれらの父系断片は母及び子のＤＮＡフィンガー
プリントの比較により同定することができる。これらの
父系断片のすべてが通常父のＤＮＡ中に存在するであろ
う。
【０１３５】プローブ33.15 及び４kb以上の長さのＤＮ
Ａ断片を用いて、仮定の父が子において典型的に同定さ
れる６つすべての父系特異的ＤＮＡ断片を偶然に有する
確率は10-5のオーダーであり、そして両プローブ33.6及
び33.15 の使用はそれを10-8のオーダーに低下せしめる
ことが予想される。
【０１３６】当然、正確な確率は正確な分離及び得られ
るＤＮＡパターンの複雑さに依存し、そして４kb未満の
長さの追加の父系断片が分析され、又は第３のプローブ
が用いられれば、改善されるであろう。
【０１３７】ＤＮＡフィンガープリントのため、１滴の
ヒト血液から十分なＤＮＡ(0.5〜５マイクログラム）を
迅速に単離することができる。そして、そのＤＮＡがす
でにフィンガープリントを採取されている２人＋２人の
姉妹を含む個体の無作為パネルからＤＮＡフィンガープ
リントが作成された。２人のあらかじめ特徴付けられた
個体はＤＮＡフィンガープリント比較に基いて容易に且
つ明瞭に同定することができ、実質的な数のミニサテラ
イト断片を共通に有する２人の姉妹も同様であった。
【０１３８】ＤＮＡは所与の個体の種々の細胞から採取
することができ、すべて同じフィンガープリントを与え
る。従って精子及び血液のＤＮＡについてＤＮＡフィン
ガープリントは識別されず、一卵性双生児のパターンも
同様である。
【０１３９】さらに、血液ＤＮＡのＤＮＡフィンガープ
リントと、同じ個体に由来するエプスタイン−バールウ
イルスで形質転換されたリンポブラストイドセルライン
から単離されたＤＮＡとの比較により示されるように、
パターンは培養細胞においても維持されるようである。
【０１４０】この発明を適用することができるヒト以外
の動物にはほとんどの哺乳類、鳥、両棲類及び魚が含ま
れる。例えば鶏、ハムスター、ラビット、マウス、スズ
メ、マグソダカ、カエル、イモリ及び魚である。鶏の場
合、ハイブリダイズするＤＮＡ断片の非常に複雑な不鮮
明な部分が生成した。
【０１４１】ＨaeIII による消化が“明瞭”なフィンガ
ープリントを残して不鮮明部分を除去した。従って、鶏
のＤＮＡはまた、その反復単位が１又は複数のＨaeIII
開裂部位を含有する長いコアー含有サテライトを含有
し、従ってＨaeIII による開裂が、ＤＮＡ電気泳動中に
ゲルの底部に泳動除去される非常に小さいＤＮＡ断片に
このサテライトを縮小すると考えられる。
【０１４２】時おり、他の動物が不鮮明なバンドを生成
し、そしてこれらは、一層長い断片を開裂せしめる適当
な酵素によりＤＮＡが消化される場合、分離可能となる
であろうと考えられる。次の追加の例において、温度は
℃である。
【０１４３】例３ A.J.Jeffreys, Cell 18, １−10(1979)により記載され
ているようにして新鮮なヒト胎盤からＤＮＡを単離し
た。３つの個々の胎盤を使用し、１〜３と標識した。Ｄ
ＮＡの８マイクログラムのサンプルを、完全消化を助け
るため４mMスペルミジントリクロリドの存在下でＨinfI
及び／又はＳau3Aで消化し、フェノール抽出後にエタノ
ール沈澱により回収し、そして20cm長の0.６％アガロー
スゲルを通して30Ｖにて約24時間、1.５kb長未満のすべ
てのＤＮＡ断片がゲルから泳動除去されるまで電気泳動
した。
【０１４４】次に、ＤＮＡをブロッティングによりサル
トリウム−ニトロセルロースフィルターに移した。高比
活性（109cpm32Ｐ／マイクログラムＤＮＡより大）単鎖
M13DNA 。プローブを例１、段階１に記載されているよ
うにして調製した。使用された正確なプローブは：
（ａ）λ33.5ミニサテライト (17nt×14反復) のほとん
ど＋約60ntフランキングヒトＤＮＡを含んで成る、M13m
p8のＳmaＩ部位にサブクローニングされた、220nt Ｈae
III DNA 断片から成る33.5プローブ；（ｂ）ミニサテラ
イト＋約50ntフランキングヒトＤＮＡから成る、 M18m8
のＳmaＩ部位にサブクローン化された、720nt ＨaeIII
断片から成る33.6プローブ；及び（ｃ）例１、段階
（４）と同じ 33.15プローブ（これは、ミニサテライト
＋ 128ntフランキングヒトＤＮＡを含む、ＰstＩ＋Ｓma
Ｉで消化された M13mp19 DNA中にサブクローン化され
た、599nt ＰstＩ−ＡhaIII 断片である) であった。
【０１４５】サザンブロットハイブリダイゼーション及
び洗浄は、１×SSC 中で65℃にて、例１、段階（４）に
おいてフィルターＣ−Ｅについてすでに記載したように
して行った。フィルターを、室温にて強化スクリーンを
用いないで４日間オートラジオグラフ処理した。
【０１４６】各プローブは異る断片パターンを生成し、
その複雑さは使用されるテトラヌクレオチド制限エンド
ヌクレアーゼから大いに独立である。
【０１４７】図３は得られたパターンを示す。４kb長未
満の多型性断片の分離はＨinfI＋Ｓau3Aによる二重消化
において改良され、これは、１又は複数の反復単位内に
蓄積されたＳau3A開裂部位を有する比較的分かれたそし
て不変のＨinfIミニサテライト断片によりおそらく生ず
るバックグラウンドハイブリダイゼーションの除去に基
く。
【０１４８】二重消化においては、プローブ33.15 によ
り検出される分離可能な多型性断片の数は、ほとんどの
又はすべての反復単位中にＳau3A開裂部位をおそらく含
有する長い単消化化ミニサテライト断片の約20％を失う
という犠牲において、個体当り約15から約23に増加する
ことができる。
【０１４９】例４ 20人の血縁のない英国の白色人種の無作為抽出試料から
採取したヒト血液DNA８マイクログラムの試料をＨinfI
で消化し、例３に記載したミニサテライトプローブ33.6
又は33.15 を用いてサザン法によりハイブリッドを形成
した。各ＤＮＡのフィンガープリント（個体Ａ）を隣接
ゲルトラックにおけるパターン（個体Ｂ）と比較し、Ｂ
には明らかに存在しない、Ａにおけるバンドの数及びＢ
におけるほぼ同じオートラジオグラフ強度の同時泳動対
応部を有するバンドの数を記録した。
【０１５０】下記の表に示した結果は、すべて対での比
較に関する平均値である。Ａにおける少量（約６％）の
付加的な弱いハイブリッド形成断片は、Ｂにおける強い
ハイブリッド形成断片と一致した。
【０１５１】このような場合には、Ａにおけるバンドが
Ｂにも存在するか否かを決定することができないので、
このような断片を無視した。Ａ及びＢにおける同時泳動
バンドが、常に同一のミニサテライト座の同一対立遺伝
子である場合には、Ａにおける対立遺伝子がＢにも存在
する平均確率ｘは、＝２ｑ−ｑ2 、従ってｑ＝１−（１
−ｘ)1／２によって平均対立遺伝子頻度（同型接合性）
ｑに関係する。
【０１５２】実際、Ａ及びＢにおける同時泳動バンドの
（未知）割合は、異なるミニサテライト座から偶然に誘
導され、従って平均対立遺伝子頻度及び同型接合性の概
算値は最大であり、ミニサテライト断片の電気泳動分離
に左右される。
【０１５３】表２に示した確率は、示したＤＮＡの個々
のサイズ断片に関するものである。フィンガープリント
の最も読みやすい部分、すなわち、大きさが４kb以上の
すべてのＤＮＡに関する全体的確率を得るため、３個の
数値を組合せなければならない。
【０１５４】例えば、個体Ａ中のプローブ33.15 によっ
て検出されるすべての断片がＢにも存在する平均確率は
0.082．９×0.205.1 ×0.276.7 ＝３×10-11 である。
Ａにおける２種のプローブ 33.15及び33.6によって検出
されるすべての断片がＢにも存在する確率は、５×10
-19 である。
【０１５５】
【表２】
【０１５６】例５ この例は、ＤＮＡフィンガープリントの体細胞安定性及
び父子鑑別への用途を説明するものである。ＥＢウイル
スによって形質転換され、液体窒素中に貯蔵されたリン
パ芽球細胞系統を２年後に液体培養で再び株化した。こ
れらの培養したリンパ球を生理食塩液で２回洗浄し、リ
ンパ球ペレット及び白血球からのＤＮＡをA.J.Jeffreys
によってCell, 18巻１〜10(1979)に記載されるようにし
て製造した。
【０１５７】精液から集めた精子を、ＳＤＳで溶解する
前に、室温で５分間１Ｍ 2−メルカプトエタノールで処
理した以外は同様にして精子ＤＮＡを製造した。HinfＩ
で消化し、プローブ33.6（ａ）又は33.15(ｂ）でハイブ
リッド形成したＤＮＡの５マイクログラムの試料を使用
して例３に記載したようにしてＤＮＡフィンガープリン
トを調製した。
【０１５８】例６ この例は、種々の脊椎動物のＤＮＡにおける極めて多形
の領域を検出するための本発明のプローブの使用を説明
するものである。
【０１５９】鶏、すずめ及びちょうげんぼうから採取し
た血液、うさぎ及びマウスの肝臓、ヒトの胎盤並びに蛙
及び魚の消化管を除去した死体からＤＮＡ試料を製造し
た。８μｇのＤＮＡ試料をＨinfIで消化したが、鶏のＤ
ＮＡについてはＨinfIで消化した。
【０１６０】制限消化物を0.６％アガロースゲルを通し
て電気泳動し、変性し、サルトリウス(Sartorius) ニト
ロセルロースフィルターに転移させ、ヒトミニサテライ
トプローブ33.15 を用いて前記のようにしてハイブリッ
ドを形成した。ハイブリッド形成の厳格さ (ストリンジ
エンシー) は１×SSC 中で65℃であった。結果を、下記
の試料について図５に示す。
【０１６１】１，２：血縁のないヒト胎盤ＤＮＡ ３ ：アラスカ及びウィーンホワイト種のＦ1 ハイブ
リッドからのウサギＤＮＡ ４ ：アラスカ種からのウサギＤＮＡ ５，６：野性で捕獲された２匹のギリシャマウスからの
マウス (Mus musculus）ＤＮＡ ７ ：近交系 DBA−２からのマウス (Mus musculus）
ＤＮＡ ８ ：近交系 C57−BL10からのマウス (Mus musculu
s）ＤＮＡ ９，10：鶏ＤＮＡ：注、ＤＮＡをＨaeIII で消化した。 11, 12：すずめＤＮＡ 13, 14, 15：ちょうげんぼうＤＮＡ 16, 17：蛙(Xenopus tropicalis)ＤＮＡ 18, 19：小魚ＤＮＡ
【０１６２】試験したほとんどすべての脊椎動物から有
効な種々のＤＮＡフィンガープリントが得られ、明らか
にヒトＤＮＡフィンガープリントと同程度に情報を与え
ることが判る。
【０１６３】また、ＨinfIで開裂したニワトリＤＮＡ
は、ハイブリッド形成ＤＮＡのあまり強くないが、極め
て複雑な不明瞭部分（図示せず）を生じた。しかしなが
ら、ＨaeIII で消化すると、この汚点は除去され、きれ
いな多形フィンガープリントパターンを生じた。
【０１６４】２つの近交系のマウスは、野性マウスより
簡単なフィンガープリントを有する。これは、野性で
は、ほとんどの超可変ミニサテライト座がヘテロ接合性
であるが、近親交配すると、ホモ接合性であり、近交系
ではハイブリッド形成ＤＮＡ断片の数を半減するからで
あると考えられる。下記の例は、前記の特定のプローブ
の適用を更に説明するものである。
【０１６５】例７ この例では、従来の遺伝的方法では、解決が不可能では
ないにしても、極めて困難であった移民の場合へのＤＮ
Ａフィンガープリント分析の使用を記載する。
【０１６６】この事例は、英国で生まれ、父親と再会す
るためガーナへ移民し、その後、母親、兄弟及び２人の
姉妹と再び一緒になるため一人で英国へ戻ったガーナ人
の少年に関する。しかし、そこに、血縁のない少年又は
全員がガーナで生活している母親の姉妹のうちの一人の
息子とすり換えが起こったことを示唆する証拠があっ
た。
【０１６７】その結果、帰国する少年は、英国への居住
を許可されなかった。その家族の弁護士の請求により、
少年の母親を決定する分析が行われた。事を複雑にする
ので、父親も、母親の姉妹も分析に利用されなかった。
更に、母親は、少年が彼女の息子であることを確信して
いたが、彼女は息子の父親については確かでなかった。
【０１６８】従って、家族の利用しうる人員（母親Ｍ、
兄弟Ｂ、姉妹Ｓ１及びＳ２並びに問題の少年Ｘ）から採
取した血液ＤＮＡ試料からのＤＮＡフィンガープリント
を、それぞれ、ヒトＤＮＡにおいて超可変ミニサテライ
トの異なる組み合わせを検出する、前記の２種のミニサ
テライトプローブ33.6及び33.15 に対するサザン法によ
るハイブリッド形成によって製造した。
【０１６９】母親（Ｍ）、問題の少年（Ｘ）、彼の兄弟
（Ｂ）、姉妹（Ｓ１，Ｓ２）及び血縁のない個体（Ｕ）
からの血液ＤＮＡの８μｇの試料をＨinfIで消化し、0.
７％アガロースゲルにより電気泳動し、プローブに対し
てサザン法でハイブリッドを形成させた。オートラジオ
グラフを図６に示す。
【０１７０】母親（Ｍ）のＤＮＡフィンガープリントに
存在する断片を短い水平線で示す。Ｍには存在しない
が、問題となっていない同胞（Ｂ，Ｓ１，Ｓ２）の少な
くとも一人に存在する父性断片は、長い線で示されてい
る。
【０１７１】Ｘに伝達された“母性”断片及び父性断片
は、点で示されている。ＸのＤＮＡフィンガープリント
は、付加的分離断片を含まない。種々の照射で取ったオ
リジナルオートラジオグラフからすべての断片を記録し
た。確実には記録できず、特にゲルの底部に向かう、部
分的に分解された、比較的に弱いバンドは無視した。
【０１７２】第一工程は、超可変断片のパターンからＸ
の父性を確定することであった。父親を利用できなかっ
たが、彼のＤＮＡフィンガープリントの大部分は、３人
の問題になっていない同胞（Ｂ，Ｓ１，Ｓ２）の少なく
とも一人に存在するが、Ｍには存在しない父特異性ＤＮ
Ａ断片から再構成することができた。
【０１７３】こうして同定された39の父性断片のうち約
半分が、ＸのＤＮＡフィンガープリントに存在した。Ｄ
ＮＡ断片は、血縁のない個人のＤＮＡフィンガープリン
ト（図６における個人Ｕ参照）の間で共有されるのは希
であるので、これは、ＸがＢ，Ｓ１及びＳ２と同一の父
親を持つことを極めて強く示唆する。
【０１７４】これらの父特異性ＤＮＡ断片を除外した
後、Ｘには40個の断片が残りそのすべてがＭに存在して
いた。このことは、ＭがＸの母親であり、従ってＸ，
Ｂ，Ｓ１及びＳ２は真実の同胞であることを強く証明す
る。
【０１７５】一人の人のＤＮＡフィンガープリントにお
ける断片が無作為に選択した第二の個体中に存在する平
均確率は、北ヨーロッパ人では約0.２であることは、既
に上記した。父及びＭに関する対応する数値は0.26であ
り、これらのガーナ人におけるＤＮＡフィンガープリン
ト変異性は、北ヨーロッパ人のそれと有意には異ならな
いことを確定する。下記の確率概算において、すべての
バンドが0.26の均一な確率で共有されるという極めて控
え目な仮定を行う（以下に、数量化する）。
【０１７６】第一の問題は、Ｘがこの家族の血縁である
か否かである。ＸのＤＮＡフィンガープリントは、61の
記録可能な断片を含み、そのすべてがＭ及び／又は父親
に存在する。Ｘが血縁を有しない場合には、彼のバンド
のそれぞれがこれらの両親に存在する確率は、１−（１
−0.26)2＝0.45である。従って、Ｍ及び／又は父親がＸ
のバンドの61全部を偶然に有する確率は、0.4561＝７×
10-22 である。Ｘは、明らかにこの家族の血縁である。
【０１７７】次の問題は、Ｍでない、血縁のない婦人が
Ｘの母親でありうるか否かである。ＸのＤＮＡフィンガ
ープリントは40の“母性”断片を含み、そのうち、われ
われは約25が特に母親から受け継いだものと評価してい
る。残りの断片は、母親と父親との間で共有され、従っ
てＭの母性についての証拠を挙げるため使用することは
できない。
【０１７８】Ｘにおける25の母特異性断片はすべて、Ｍ
に存在している。ＭがＸと血縁でないが、25の断片をす
べて共有する機会は、0.2625＝２×10-15 である。従っ
て、Ｘ及びＭは血縁を有しなければならない。
【０１７９】最後の、最も困難な問題は、分析に利用さ
れなかったＭの姉妹がＸの母でありうるか否かである
（父親はもちろん、Ｍの夫でなければならない）。バン
ドが0.26の平均確率で任意の人に共有される場合、一人
の人の断片が同胞にも存在する対応する可能性は0.62で
ある。
【０１８０】ＭがＸの真実の母の姉妹であり、偶然にＸ
の母特異性バンドを25個すべて含む可能性は、従って、
0.2625＝３×10-6である。従って、われわれは、なんら
合理的な疑いをいれる余地もなく、ＭはＸの真実の母で
なければならないと結論する。この証拠を、移民当局に
提供したところ、当局はＸに対する論争を止め、彼の英
国居住を許可し、彼が彼の家族とともに残ることを許し
た。
【０１８１】この困難な事例は、ＤＮＡフィンガープリ
ントが、重要な家族の人員が見つからない場合でさえ、
親族関係の明白な積極的証拠を与えることができること
を示す。この事例は、Ｘが彼の同胞と同じ父親を有し、
この父親がＸにだけ与えたバンドはなかった（平均し
て、１／16の父性バンドが伝達される）という事実によ
って簡素化された。
【０１８２】このようなＸに独特な断片は、ＸとＭとの
家族関係に関する証明を明らかに弱めるが、実際には、
必ずしも分析を無効にするものではない。Ｘは25の母特
異性断片の他に、このような父性断片を５個より多数有
するとは思われない。ＸとＭに血縁関係がない場合又は
ＭがＸの叔母である場合に、30の特定のバンドのうち少
なくとも25個がＸとＭとで偶然に一致する可能性は、そ
れぞれ８×10-11 及び９×10-3である。
【０１８３】従って、この分析は、強いものであり、こ
のような事例のほとんどにおいて主張された親族関係を
肯定又は否定する明白な証拠を与える。通常は、もちろ
ん、家族の関係者の全員を、例えば父親論争に又は移民
によって家族が再び一緒になるのが困難な場合に、利用
できるであろう。ＤＮＡフィンガープリントは、ほとん
ど常にこのような問題を解決することができる。
【０１８４】ＤＮＡフィンガープリントの数量化 父親から特異的に受け継いだ断片が39個であるのに対
し、Ｍには61のＤＮＡ断片が記録されていた。父親のヘ
テロ接合性ＤＮＡ断片の１／８はＢ，Ｓ１又はＳ２に伝
達されておらず、従って父特異性断片の数に対する補正
値は、39×８／７＝45である。
【０１８５】Ｍ及び父のＤＮＡフィンガープリントにお
ける断片の総数はほぼ等しいので、父の共有する、Ｍに
おける断片の数は、約（61−45) ＝16である。Ｍ及び父
親におけるバンド共有の平均確率ｘは、従って、16／61
＝0.26であり、北ヨーロッパ人の無作為試料をスクリー
ニングすることから求めた予備概算値と一致する（ｘ＝
0.２、対照２）。
【０１８６】45の父性バンドの約半分は、ヘテロ接合性
バンドについて予測されるように、Ｂ，Ｓ１及びＳ２に
（それぞれ18, 24及び18個）伝達された。Ｍのバンドの
若干が父親にも存在し、従って子供のほとんど又は全員
に伝達されていることから予測されるように、Ｍの61の
バンドのうち、半分より多くがＢ，Ｓ１及びＳ２によっ
て（それぞれ32, 38及び39個) 受け継がれた。
【０１８７】ＭのＤＮＡフィンガープリントが子供全員
に伝達されたｎ個の共有バンド、及び半数の子供に伝え
られた（61−ｎ）個のヘテロ接合性バンドを含む場合に
は、ｎ＋0.５（61−ｎ）＝36.3であり、ｎ＝12の場合、
Ｍ及び父親に共通の16個のバンド（上記参照）の概算値
と一致する。
【０１８８】ＸのＤＮＡフィンガープリントは、21の父
特異性断片と40のＭと共有するバンドからなる。母特異
性であり、父と共有でない後者のバンドの割合は、２つ
の方法で算出される。第一に、母特異性バンドの数は、
父特異性の数とほぼ等しく45／２＝22.5である。第二
に、Ｘにおける40の母性バンドのうちｎ個（約12) は、
共有の母性／父性バンド (前記参照) であり、Ｘに28の
母特異性バンドを残す。Ｘが彼の母親から特異的に獲得
した断片の数は従って、約25である。
【０１８９】バンド共有の確率 １個人における断片が第二の任意の人における同様な電
気泳動移動度及びオートラジオグラフ強度のバンドによ
って一致する平均確率は、ｘ（ｘ＝0.２−0.26、前記参
照）と定義される。
【０１９０】ミニサテライト断片が大きい程、恐らく、
対立遺伝子頻度が低くなり、電気泳動分離が良くなるの
で、共有される頻度は少なくなり、従って断片共有確率
ｘは不均一である。ほとんどすべての断片は、独立して
受け継がれるので、個人におけるｎ個すべての断片が第
二の任意の個人に存在する最高確率は、従って、ｘnで
ある。ｘにおける不均一性は、この確率を低下する。
【０１９１】同胞間のバンド共有 共有されるバンドが、常に、同じ超可変座の同一の対立
遺伝子を表す場合には、ｘはｘ＝２ｑ−ｑ2 によって平
均対立遺伝子頻度ｑに関係し、これにより個人における
所定のバンドが同胞にも存在する確率は（４＋５ｑ−６
ｑ2 ＋ｑ3)／４（２−ｑ）であることが示される。
【０１９２】ｘ＝0.26であるから、ｑは0.14であり、記
録により共有されている、第一の同胞に存在するバンド
の割合は、0.26である。この確率は、任意の人によって
共有されるバンドが決して同一の対立遺伝子でない、即
ち、多数のミニサテライトが同一の大きさの対立遺伝子
を有すると仮定すると、僅かに低下する。
【０１９３】遺伝病の分析へのＤＮＡフィンガープリン
トの適用 ヒトにおける連鎖分析、特に、大きい家系における病気
の座と一緒に分離される超可変ＤＮＡ断片の研究のた
め、ＤＮＡフィンガープリントを使用する可能性を測定
するため、２つの大家族の、ＤＮＡフィンガープリント
を調査した（一方は神経線維腫症に関して分離し、他方
はβ−グロビン遺伝子集団に連鎖しない常染色体優性遺
伝子によって明らかに測定される胎盤ヘモグロビンの遺
伝的残存に関して分離した）。
【０１９４】例８ 神経線維腫症に罹病した同胞群のＤＮＡフィンガープリ
ントにおける超可変ミニサテライト断片の分離 Ｈin fIで消化した血液ＤＮＡ試料の長さ35cmの0.７％ア
ガロースゲル上で電気泳動し、ミニサテライトプローブ
33.6及び33.15 に対してサザン法でハイブリッドを形成
させた。
【０１９５】罹病していない父親（Ｆ）、５人の息子
（Ｓ）及び６人の娘（Ｄ）について、ＤＮＡフィンガー
プリントを図７に示す。罹病した母親は研究に利用しな
かった。多数の神経線維腫にかかった子孫は（＋）で示
し、残りの子孫は、神経線維腫症の徴候を示さなかっ
た。分離した父性（●）及び母性（○）ヘテロ接合性Ｄ
ＮＡ断片を示し、短期間、中期及び長期照射でとったオ
リジナルオートグラフから直接、子孫への分離を記録し
た。
【０１９６】それぞれの子孫における位置及び相対的強
度が両親のものと一致するＤＮＡ断片だけを記録した。
ＡＢ又は−−を子孫に分離するＤＮＡ断片の連鎖対ＡＢ
は、連続線によって結合されている。Ａ−及び−Ｂを分
離する対立遺伝子は点線で結合されている。
【０１９７】神経線維腫症に対する相引状態での連鎖の
証拠を示す一つの母性断片は、星印で示し、罹病した６
比の子孫全員は、この断片を受け継ぎ、罹病していない
子供５人のうち４人はこのバンドを持たず、このバンド
の遺伝と神経線維腫症との間に10／11の一致を生じる。
【０１９８】材料及び方法 ＤＮＡ単離 新鮮な血液を等容量の１×SSC (SSC、クエン酸ナトリウ
ム食塩水、0.15M NaCl, 15mMクエン酸三ナトリウム、pH
7.0)、ヒストペーク(Histopaque-1077)(Sigma)上に積層
し、遠心分離により有核細胞を集めた。
【０１９９】或いは、凍結した血液を二倍容量の１×SS
C 中で解凍し、10,000ｇで15分間、遠心分離することに
より有核細胞及び核をペレット化した。 Jeffreys,A.J.
著、(1979), Cell, 18, １〜10に記載されているように
して高分子量ＤＮＡを製造した。
【０２００】サザン法による分析 ヒトＤＮＡの試料５μｇを４mMのスペルミジントリクロ
リドの存在で20単位のＨinfIを用いて37℃で２時間消化
し、フェノール抽出及びエタノール沈澱によって回収し
た。
【０２０１】制限消化物を16μｌの H2O＋４μｌのゲル
負荷混合物（フィコール400 12.5％、ブロモフェノール
ブルー0.２％、トリスアセテート0.２Ｍ、酢酸ナトリウ
ム0.１Ｍ，EDTA 1mM，pH8.3)及び５mg／mlエチジウムブ
ロミド２μｌ中に溶解し、水平アガロースゲル（トリス
アセテート40mM、酢酸ナトリウム20mM, EDTA 0.2mM、エ
チジウムブロミド0.５μｇ／ml(pH8.3) 中の0.７％シグ
マ(Sigma）Ｉ型アガロース、厚0.７cm×長さ20cm又は35
cmのゲル) 上に置いた。
【０２０２】10分間平衡化した後、長さ1.５kb未満のＤ
ＮＡ断片すべてがゲルから電気泳動除去されるまで、２
Ｖ／cmで24〜48時間ゲルを電気泳動した。ニトロセルロ
ースフィルター(Sartorius、孔径0.45μｍ) 上にブロッ
ティングさせることによりＤＮＡを移転させた。
【０２０３】ヒトミニサテライトＭ13組換え型33.6及び
33.15 から、32Ｐでラベルした一本鎖プローブＤＮＡを
製造し、１×SSC 中で65℃でサザン法によるブロットに
対してハイブリッド形成をし、主たる用途に記載したよ
うにオートラジオグラフィする。
【０２０４】データ分析 ＢＢＣモデルＢマイクロコンピューターに分離データ及
び連鎖の分析を記憶させた。表３には、神経線維腫症の
家族におけるミニサテライト標識をまとめる。
【０２０５】
【表３】
【０２０６】記録された種々の遺伝子座の数（ｃ）は、
ｎ−ａ−ｂによって得られる。未分離、従って未記録の
断片を含むＤＮＡフィンガープリント全体を、Ｎ個のヘ
テロ接合性遺伝子座（２Ｎ断片）から誘導する。記録さ
れた（ｎ−ｂ）の明らかな断片がＤＮＡフィンガープリ
ントにおける２Ｎのバンドの無作為試料であると仮定す
ると、所定のプローブによって検出される超可変座の概
算の総数Ｎは、下記の式により対立遺伝子対の数に関係
する：
【０２０７】
【数１】
【０２０８】
【表４】
【０２０９】超可変断片の伝達頻度（図７）を研究する
ため、11人の同胞における正確にｒ人の子供に伝達さ
れ、記録されたｎ個のうち、プローブ33.6及び33.15 に
よって検出される断片の数を、伝達率50％ (表４）と仮
定して、二項分布
【０２１０】
【数２】
【０２１１】によって得られる予測数と比較した。子供
全員に存在する断片は同型接合性座からのものであって
よく、無視された。どの子供にも伝達されなかった母性
断片は、母性ＤＮＡを利用できなかったので、記録でき
なかった。平均伝達頻度（＋S.E.M.) も得られる。最初
に除外された対立遺伝子及び連鎖したバンドを有する父
性又は母性断片の可能なすべての対での比較を使用し
て、ＡＢ（ＡＢ又は−−）に関して一致する子孫の数を
記録することによって断片の対ＡＢの間の連鎖を調べた
（即ち、ｃ座を各両親について分析した。表３参照、ｃ
（ｃ−１）／２の対照比較を得る）。
【０２１２】０又は11人の子供群中に現れる断片の対
は、それぞれ対立遺伝子又は緊密にリンクした対を表
す。定義により、対はどの群にも属さない。観察された
分布をｃ座のすべてがリンクしていない場合（Ｕ）の予
測値と比較する。この場合、正確にｒ（ＡＢ又は−−）
の子孫を与える対による比較の数は、二項分布
【０２１３】
【数３】
【０２１４】によって得られる。更に、ｃ遺伝子座が密
集し、均一に離れており、隣接する遺伝子座が組換え頻
度θによって分離されている（10, 20又は30cM離れてい
る）場合に予測されるものと分布を比較する。従って、
集団は、（ｃ−１）Ψ遺伝子座単位〔式中、Ψ＝−１／
２ ln(１−２θ）〕にわたって広がっているであろう。
ｃ遺伝子座（一方又は他方の対立遺伝子のところで無作
為に抽出）に関して、11人の同胞群中の正確にｒ（ＡＢ
又は−−）の子孫を生じる対による比較の数は、下記の
式によって得られる：
【０２１５】
【数４】
【０２１６】〔式中ｘi はｉ図単位離れた２個の遺伝子
座の間の組換えフラクションであり、ｘi はマッピング
関数： ｘi ＝1/2(１−ｅ-2i Ψ) によって得られる〕。
【０２１７】結果 ＤＮＡフィンガープリントプローブ この研究に使用する２種のミニサテライトハイブリダイ
ゼーションプローブを、主な用途で詳述する。プローブ
33.15 は、コアー配列の16bp変異体が29反復して成るク
ローン化したヒトミニサテライトから成る。プローブ3
3.6におけるミニサテライトの反復単位は、コアー配列
の最も保存された11bp 3′末端の種々の三量体であり、
18個反復される。コアー及びプローブ反復単位の配列
は、下記のとおりである：
【０２１８】
【０２１９】プローブ33.6及び33.15 プローブの配列及
び反復長における差異により、ヒトＤＮＡのＨinfI消化
物中の長い超可変ミニサテライト断片の異なるパターン
を検出することになる。この４bp制限エンドヌクレアー
ゼは、小さなフランキングＤＮＡを有するＤＮＡ断片に
おける長いタンデム−反復性ミニサテライトを放出する
ことによって種々のミニサテライトの分離を最大にす
る。
【０２２０】大きい同胞群におけるＤＮＡフィンガープ
リントの分析 個々のミニサテライトＤＮＡ断片の分離を調べるため、
11人の英国人の大きい同胞群を神経線維腫症〔レックリ
ングハウゼン(Recklinghausen)氏病の〕、末梢及び中枢
神経系の腫瘍に伴う常染色体優性障害について分離し
た。遺伝的標識形質は、まだ、この病気にリンクしてい
なかった。
【０２２１】11人の子供（６人は罹病、５人は未罹病）
の、プローブ33.6及び33.15 で検出される血液ＤＮＡフ
ィンガープリントを、図７において、かれらの未罹病の
父親と比較した。ミニサテライトＤＮＡ断片の分離を、
長さ35cmのアガロースゲルでの電気泳動によって最大に
した。
【０２２２】これらの超可変ミニサテライトの多く、特
に極めて大きいＤＮＡ断片は、低い対立遺伝子頻度を有
し、前記のように血縁のない個体には、ほとんど受け継
がれないので、神経線維腫症の家族におけるこれらの断
片の多くは、ヘテロ接合状態で存在し、後代の若干の者
にのみ伝達される。罹病した母親のＤＮＡを入手できな
い場合でさえ、母に由来するミニサテライト断片を、若
干の子孫には存在するが、父親には存在しない断片とし
て容易に同定することができた。
【０２２３】父性断片も同様にして同定することができ
た。プローブ33.6及び33.15 を用いて、この同胞群にお
ける41の父性ＤＮＡ断片及び32の母性ＤＮＡ断片の分離
（図７、表３）を記録することができた。多数の付加的
多形断片も存在するが、ゲルから電気泳動で除去される
か又は不完全に分離され、従って、確実には記録できな
かった。
【０２２４】この大きい同胞群におけるすべての父性又
は母性ＤＮＡ断片の分離パターンを対で比較することに
よって、断片の対立遺伝子対及び相引状態での緊密な連
鎖を示す対を同定することができる（この同胞群におけ
るバンドの所定の対の同時分離の可能性は１／1024であ
る）。
【０２２５】父性及び母性断片の対立遺伝子対の若干の
例を、両方のプローブで同定することができた（図
７）。また、プローブ33.6は母親及び父親に断片の連鎖
対を検出した。
【０２２６】同様なリンクは、第二の家系（以下に示
す）に見られ、これは、プローブ33.6にハイブリッド形
成する少なくとも１つの超可変領域が、ＨinfIに関する
内部開裂部位を含み、従って、開裂して家系におけるミ
ニサテライト“ハプロタイプ”として同時に分離する２
個以上の断片を生じる長いミニサテライト／サテライト
であることを示唆する。プローブ33.15 を用いて記録し
た多形ＤＮＡ断片は、33.6によって検出される断片の組
み合わせには存在しなかった。
【０２２７】両方のプローブにハイブリッドを形成し
た、このような断片は、同じ親から同じ子供へ伝達され
た（即ち、“リンクした")等しい大きさのバンドとして
検出されたであろう。従って、これらの２種のプローブ
は、ヒトミニサテライトの本質的に完全に異なるサブセ
ットにハイブリッドを形成する。
【０２２８】対立遺伝子及びリンクした断片を排除する
ことによって、父親及び母親にそれぞれ34及び25の明瞭
な座が記録される（表３）と結論された。座の約80％に
関して、２個の対立遺伝子の１個だけが分離され、第二
の対立遺伝子は恐らく比較的短いミニサテライト断片の
あまり分離されていない複合体に存在する。
【０２２９】このことは、恐らく、これらのタンデム反
復領域における等しくない交換によって起こる、ミニサ
テライト対立遺伝子長に大きい差異が存在することを意
味する。図７において確認された数個の対立遺伝子対
は、実際に、実質的な長さの差異を示す。
【０２３０】対立遺伝子中に対合しうるバンドの割合か
ら、プローブ33.6及び33.15 によって検出される全ＤＮ
Ａフィンガープリントに存在するヘテロ接合性座の総数
は、約43〜66であると概算することができ、このうち約
半分は父親及び母親に記録される（表３）。この同胞群
における父性断片と母性断片との間の対立性を測定する
ことはできない。
【０２３１】記録された父性遺伝子座のすべては、常染
色体性であり、娘（Ｘリンク）又は息子（Ｙリンク）へ
の特別な伝達を示さない。更に、父性ＤＮＡ断片のすべ
ての対ＡＢは、明らかに独立して子孫に分離して、平均
して同数の（ＡＢ，−−）又は（Ａ−，−Ｂ）後代を生
じる。正確な数は、リンクしない座に関する予測される
二項分布に従う。母性ＤＮＡ断片は同様な挙動を示し
た。
【０２３２】更に詳細に分析すると、これらの遺伝子座
に関する最小の遺伝子座−遺伝子座間隔は、≦30cM（46
マップ単位）でなければならないことが判る。それより
間隔が狭いと、同時分離（カップリング状態でリンク）
するか、又は偽対立遺伝子として分離（相反状態でリン
ク）する傾向のある断片の対を相当数生じる（表４）。
【０２３３】従って、分離可能なミニサテライト遺伝子
座は、長さ3000cMのヒトゲノムの少なくとも半分にわた
って広がっていなければならず、従って、ヒトの常染色
体の多数又は全部にわたって散乱していなければならな
い。
【０２３４】一つの母性ミニサテライト断片（図７）
は、神経線維腫症とのカップリングにおけるリンクの弱
い証拠を示し、10／11人の子供はこの断片及び病気に関
して一致している (θ＝10cM, ｐ＝0.006)。しかしなが
ら、25個の異なる母性遺伝子座が記録されたので、これ
らの遺伝子座の少なくとも１個の対立遺伝子が、偶然
に、カップリング又は相反状態での観察されるリンク度
を示す確率は高い（ｐ＝0.24) 。
【０２３５】例９ 広い家系のＤＮＡフィンガープリント：HPFHへの可能な
リンク β−地中海貧血症及び遺伝性高胎児ヘモグロビン血症(H
PFH)について分離するグジャラート・アジア人の広範な
４世代家系にＤＮＡフィンガープリントの分析を広げ
た。
【０２３６】図８のＡ及びＢに示した標識分離パターン
のオートラジオグラフを下記のようにして調製した。血
液ＤＮＡの10μｇの試料をＨinfIで消化し、プローブ3
3.6（Ａ）又は33.15(Ｂ）を使用して、図７に記載した
ようにしてＤＮＡフィンガープリントを調製した。。
【０２３７】比較的短い（20cm）のアガロースゲルで電
気泳動を行った。個人の間の関係を図９に示す。Ａで
は、超可変断片ａ，ｂ及びｃは緊密にリンクし、家系の
各個人にすべて存在するか又はすべて存在しない。Ｂで
は、バンドｇ及びHPFH（Ｈ）が同時分離する。個人IV７
及びIV８は、一卵性双生児であり、区別できないＤＮＡ
フィンガープリントを有する
【０２３８】材料及び方法は、例８と同じであった。同
時分離分析を図９Ａ及び図９Ｂに示す。図９Ａにおい
て、II４からの30個の超可変断片及びII５からの27個の
断片の、子孫 III１〜11への分離を、両親の断片の対Ａ
Ｂの可能な連鎖についてスクリーニングした。少なくと
も６／７の（ＡＢ，−−）子孫を示すリンクの可能な例
を更に付加的血縁関係で調べた。
【０２３９】２つの極めて明瞭なリンク例を示す（ａ−
ｆ、個人における断片ａ−ｆの存在；・断片不存在）。
断片ａ−ｃ及びｅ，ｆはそれぞれ完全な同時分離を示
し、断片ｄは、ａ−ｃと同時に分離する傾向を有する
が、同胞IV１−４は、情報を与えず、一卵性双生児IV
７，８は、遺伝したａ−ｃを有するが、ｄを有しない組
換え型である。
【０２４０】図９Ｂには、β−地中海貧血症形質（半分
黒い円、半分黒い四角形）、HPFH（Ｈ）及びミニサテラ
イト断片ｇの遺伝を示す。個人が＞１％HbF(正常) 又は
＞３％HbF(β−地中海貧血症形質）を示した場合、その
個人は、HPFHを有するものと記録する。HPFH及びβ−地
中海貧血症形質は、 III１〜11及びIV５−８に独立して
分離し、リンクしない遺伝子座によって決定される。断
片ｇは、試験した個人においてHPFHと完全に同時分離す
る。
【０２４１】結果 図９Ａ及びＢに示したように、 HbFの上昇は、β−地中
海貧血症形質とは独立して伝達され、明らかにβ−グロ
ビン遺伝子集団にリンクしていない常染色体優性遺伝子
座によって決定される。同様なサルデーニャ人の家系は
Gianniらによって EMBO J., 2, 921〜925(1983) に報告
されている。
【０２４２】図８Ａ及び図８Ｂには、祖父（II４）にお
ける30の種々の断片及び祖母 (II５）における27の断片
を記録した。彼らの７人子孫(III１〜11) の研究によ
り、神経線維腫症家族に関して記載した基準を使用し
て、これらの断片は少なくとも22の明瞭な非リンク父性
常染色体遺伝子座及び18の母性常染色体遺伝子座に由来
することが分かった。
【０２４３】残りのＤＮＡ断片は、対立性又は他の断片
へのリンクを証明するが、この小さい同胞群での証明は
可能ではない（両親のＤＮＡ断片の所定の対は、７の同
胞群にリンクして又は対立遺伝子として偶然に伝達され
る１／64の可能性を有する）。
【０２４４】更に、家系の追加の人員において、リンク
の証拠を探し、２つの極めて強いリンクの例を図８及び
図９に示す。プローブ33.6によって検出される断片ａ，
ｂ及びｃは、II４からその子供(III１〜11）及びそれか
ら孫（IV１〜８）に完全なリンクで伝達される。組換え
型は、14人の情報を与える後代に見られる（同時に分離
するバンドに関してｐ＝４×11-9) 。
【０２４５】上記のように、これは、断片ａ−ｃが一つ
の超可変遺伝子座に由来するミニサテライト“ハプロタ
イプ”を表すことを意味する。また、プローブ33.15 に
よって検出されるバンドｄは、バンドａ−ｃへリンクし
たことを証明する。
【０２４６】しかしながら、一方の同胞群 (IV１〜４）
は、両親が断片ｄを有するので、情報を与えない、そし
て、他方（IV５〜８）は組換え型を含む（一卵性双生児
IV７，８）。バンドｄとａ−ｃ集団との間のリンクの証
明は、従って弱い（θ＝10cM, ｐ＝0.01) 。
【０２４７】母性バンドｅ（33.6によって検出される)
及びｆ(33.15によって検出される）はII４及びII５の子
孫及び付加的血縁同胞群 III15〜20及びIV17〜22におい
て緊密なリンクを示す (20人の情報を与える後代、組換
え型なし、θ＝０cM, ｐ＝10-6）。プローブ33.6及び3
3.15 がミニサテライトの種々の組み合わせを検出し、
断片ｅ及びｆに交叉ハイブリダイズしないので、これら
の断片は２つの異なる常染色体ミニサテライト遺伝子座
の間の確実なリンクの例を表す。
【０２４８】最後に、２個のリンク群（断片ａ−ｃ及び
ｅ−ｆ）は、同一の遺伝子座の対立遺伝子ではない。個
人の III１は、父性ａ−ｃ集団と母性ｅ−ｆ対とを有す
る複合ヘテロ接合体である。両方の集団は、彼の４人の
子供のうち２人に伝達され、対立遺伝子として分離せ
ず、その代わりに、２つのリンクしていない超可変領域
から誘導されなければならないことを確認する。
【０２４９】母性（II５）ミニサテライト断片は、β−
地中海貧血症形質への著しいリンクを示さず、従って、
染色体11上のβ−グロビン遺伝子集団へ緊密にリンクし
ていない。これに反して、長さ8.６kbの母性断片（ｇ）
は７人の子孫及び孫の３人の情報を与える同胞群におい
てHPFHと同時に分離した（図９）。緊密なリンクを示す
（θ＝０cM, ｐ＝２×10-4) 12人の後代においては、組
換え型は認められなかった。
【０２５０】II５における17個の遺伝子座を調べたとい
う事実を考慮しても、このリンクは、なお有意である
(17の記録された遺伝子座の少なくとも一つの遺伝子座
の対立遺伝子が偶然にHPFHと同時分離を示す確率は、
0.004である) 。
【０２５１】更に、II５の断片ｇがただ１個のミニサテ
ライト対立遺伝子であり、上記の２つの分離ＤＮＡ断片
でないことを、ＨinfIの代わりにＳau3Aで消化した、図
９に示した全個人のＤＮＡフィンガープリントを調査す
ることによって検討した。すべての積極的フィンガープ
リントは、ただ一つのミニサテライト断片について予測
されたように、断片ｇと同様の大きさの対応するＳau3A
断片（8.２kb対8.６kb）を含んでいた。
【０２５２】考察 ヒトの家系分析は、ミニサテライトプローブによって検
出されるＤＮＡフィンガープリントが、一方又は他方の
両親を研究に利用できない家族においてさえ、多数のヘ
テロ接合性ＤＮＡ断片の分離を研究するため確実に使用
できることを示す。
【０２５３】このような２つのプローブを使用して、１
個人において同時に34個までの超可変遺伝子座を分析す
ることができ、ヒトの遺伝学において、RFLPを含めて、
従来法で得られるよりはるかに高い遺伝的標識形質生成
速度を分析することができる。個々の断片の低い集団頻
度と一緒に種々のミニサテライト断片の安定の遺伝によ
り、分析された２つの家系に発見されたリンク例に示さ
れるように、それらの断片はリンク分析に理想的に好適
になる。
【０２５４】これらの超可変ミニサテライトは組換えホ
ットスポットでありうるが、長いミニサテライトで起こ
る不等交換の予想率（１配偶子当たり約0.001)は、ミニ
サテライト遺伝子座と近隣遺伝、例えば病気の遺伝子座
との間のリンクを著しく混乱させるには充分ではない。
【０２５５】ミニサテライトプローブ33.6及び33.15 に
よって一緒に検出される超可変遺伝子座の総数は約60で
あると算定される。これらの遺伝子座の約半分の２個の
対立遺伝子の少なくとも１個は、所定のＤＮＡフィンガ
ープリントで分離することができ、従って、ＤＮＡフィ
ンガープリントが異なれば、試験した遺伝子座のスペク
トルは同一ではない。
【０２５６】これらの遺伝子座のほとんど又は全部は、
遺伝的にはリンクしておらず、従って、ヒトゲノムの相
当な割合にわたって散乱していなければならない。それ
らの正確な位置は、分かっていないので、クローニング
及び個々の超可変ミニサテライト遺伝子座の領域的位置
決定を待たねばならない。
【０２５７】奇妙にも、研究したどちらの家系において
も、Ｘ又はＹ染色体上にミニサテライトはまだ認められ
なかった。約43の異なる遺伝子座を、HPFH家族における
個人II４と一緒に、神経線維腫症家族の父親における可
能な伴性について記録した。Ｘ及びＹ染色体は一緒に雄
のゲノムの約５％を構成するので、43のランダムに分散
した遺伝子座がこれらの染色体上に存在しない確率は、
(0.95)43＝0.１である。従って、伴性ミニサテライトの
見かけ上の欠損は有意ではない。
【０２５８】これらの分散した超可変ミニサテライト遺
伝子座は、神経線維腫症及びHPFHへのリンクの仮の例に
よって示したように、病気の遺伝子座に連鎖した標識の
研究に好適である。従来の単座遺伝分析とは異なり、異
なるミニサテライト対立遺伝子は、各家系における病気
の遺伝子座と関連していると思われるので、血縁のない
小さい家系の間では、リンクデータを集めることができ
ない。その代わりに、ＤＮＡフィンガープリントだけ
が、広範な家系において及び最も理想的には、ただ一つ
の大きい同胞群において、特に優性障害のリンクの研究
に適当である。
【０２５９】今まで、プローブ33.6及び33.15 は、個人
において34までの常染色体超可変遺伝子座を記録させ
る。これらの遺伝子座の少なくとも一つが所定の病気の
遺伝子座に緊密にリンクする可能性は、長さ3000cMのヒ
トリンケージマップにわたるミニサテライトのランダム
な分散を仮定して、20％である。
【０２６０】HPFH家族のような広範な家系については、
ほとんどの遺伝子座のただ１個の対立遺伝子が記録され
うるので、この確率は約10％になり、リンクを検出する
には、この対立遺伝子は病気の遺伝子座にカップリング
状態でリンクしなければならない。これらの確率を50％
以上に上げるには、一つの大きい同胞群において 104を
越える超可変遺伝子座の記録及び広範な家系において 2
08を越える遺伝子座の記録が必要である。
【０２６１】これらの数は、これまで使用した２種のミ
ニサテライトプローブによって検出される遺伝子座の総
数を越える。しかしながら、プローブ33.6及び33.15
は、超可変遺伝子座の異なる組み合わせを本質的に全体
として検出し、これは、種々のコアー配列を含むヒトミ
ニサテライトの総数が大きいことを示唆する。
【０２６２】定義された単遺伝子座標識を使用する従来
のヒト家系分析においては、標識と病気の遺伝子座との
間のリンクの証明は、通常直接的に、病気の遺伝子のお
よそのゲノム位置を与え、追加の家系を分析することに
よって更に確立することができる。ＤＮＡフィンガープ
リントに関しては、逆も真である。
【０２６３】超可変ＤＮＡ断片と病気との間の可能なリ
ンクを更に分析することは、分取用ゲル電気泳動及びク
ローニングによって断片を単離することにより可能にな
る。ミニサテライトを直接はさむ特異配列ＤＮＡセグメ
ントを使用するか、又は高ストリンジエンシーハイブリ
ダイゼーションにおける全体ミニサテライトを使用する
ことによって、単離したミニサテライトから座特異性ハ
イブリダイゼーションプローブを設計することができ
る。
【０２６４】このような遺伝子座特異的プローブは、リ
ンクデータを追加の家族に広げるため及びヒトゲノム内
にミニサテライトを局在化させるため使用することがで
きる。このアプローチは、グジャラート人の家系におけ
る、明らかにHPFHをリンクした8.2kb Ｓau3Aミニサテラ
イト断片をクローニングすることによって現在確認され
ている。
【０２６５】前記のように、それぞれがコアー配列の異
なる変異体を含むヒトミニサテライトから成るプローブ
33.5, 33.6及び33.15 は、異なるＤＮＡフィンガープリ
ントを生じ、従って、ヒト及び他の脊椎動物のＤＮＡに
おける超可変ミニサテライト領域の種々の組み合わせを
検出する。
【０２６６】特に、プローブ33.6及び33.15 は、各プロ
ーブに存在する反復コアーの長さ及び正確な配列に差異
がある結果として、ミニサテライトの種々の組み合わせ
を大部分又は全部検出する（第三の用途及びA.J.Jeffre
ys, V.Wilson, S.L.Thein, D.J.Weatherall & B.A.J.Po
nderによる“ＤＮＡ‘フィンガープリント’及びヒトの
家系におけるリンク分析”参照）。
【０２６７】他のコアー配列のタンデム反復を使用して
追加の超可変領域を検出する可能性を試験するため、一
連の合成ミニサテライトを製造した。
【０２６８】例10 人工ミニサテライトの合成及びクローニング 多コアープローブを製造するアプローチを図10に概説す
る。図10はＥ．コリ(E.coli)のクロスオーバーホットス
ポットイニシエーター配列(Chi, GCTGGTGG) のクローン
化したタンデム反復を製造する方法を説明するものであ
る。
【０２６９】ポリ−Chi プローブを作る工程は、標準Ｄ
ＮＡ技法を使用し、下記のとおりである： 1. 長さ８ヌクレオチドの Chi配列のタンデム反復を含
む合成オリゴヌクレオチドを、H.W.D.Mattesらの(1984)
(EMBO J., ３, 801〜805)及びD.G.Brenner &W.V.Shaw
(1985) EMBO J.４, 561〜568 の方法によって製造し
た。 Chiの相補配列のダイマーから成る第二のオリゴヌ
クレオチドを合成した。
【０２７０】2. これらの２種のオリゴヌクレオチドを
10mM MgCl2, 10mMトリス−HCl(pH8.0)中で37℃で一緒に
アニールして、ＤＮＡの短い二本鎖セグメントを形成し
た。第二のオリゴヌクレオチドの配列を、頭−尾連結に
適当な３−ヌクレオチド長の５′突出末端を有するアニ
ールした分子を生じるように選択した。
【０２７１】3. Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びＡ
ＴＰを用いて５′末端を燐酸化した。 4. アニールしたＤＮＡ断片をT4 DNAリガーゼ及びＡＴ
Ｐを用いて頭−尾法で一緒に連結させて反復した Chiポ
リマーを製造した。
【０２７２】5. 連結したポリマーを1.５％アガロース
ゲルでの電気泳動により大きさで分離し、長さ 150塩基
対より大きいポリマーをDE81ロ紙上での電気泳動により
単離した(Dretzen,G., Bellard,M., Sassone-Corri,P.
& Chambon,P., 1981年、Anal.Biochem., 112, 295〜29
8)。
【０２７３】6. 回収した長いポリマーをＥ．コリＤＮ
ＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を使用してフィルイン
修復によりブラント末端とし、M13mp19 RF DNA(J.Messi
ng &J.Vieira, 1982. Gene 19, 269〜276)のＳmaＩ部
位中に連結した。連結したＤＮＡをＥ．コリJM 101中に
形質転換し、個々の白色プラークから一本鎖ファージＤ
ＮＡを単離した。
【０２７４】7. 各クローン化単離物のＤＮＡ挿入部を
ジデオキシヌクレオチド法 (M.D.Biggin, T.J.Gibon &
H.F.Hong, 1983. Proc.Nat.Acad.Sci.USA 80, 3963〜39
65)によって配列させて、ポリマー挿入部の長さ、方向
及び配列を決定した。成熟一本鎖ファージＤＮＡ中に
５′→３′に指向する Chi配列の50のタンデム反復を含
む組換え型Ｍ13ファージが見出され、これをＭ13・コア
ーＡと言う〔即ち、挿入部は、ポリ(Chi) であり、ポリ
(Chiの相補体) ではない〕。
【０２７５】8. 32Ｐ−標識一本鎖ハイブリダイゼーシ
ョンプローブを、ファージ33.6及び33.15 からプローブ
を製造するのと同じ方法を用いて、プライマー・エクス
テンション法により製造した。
【０２７６】例11〜15 ５個の更に新しい人工ミニサテライトの製造 上記の技法を用いて、更に５種のコアー配列を合成し、
Ｍ13に多コアー組換え型としてクローン化して、組換え
型Ｍ13・コアーＡ−Ｆを得た。コアーの長さ及び正確な
配列を変えるようにコアー変異体を選択した。
【０２７７】表５には、クローンＭ13・コアーＡ−Ｆに
おける反復配列をコアー配列及び初期の用途で記載し
た、前に使用したプローブ33.5, 33.6及び33.15 と比較
してまとめる。コアー配列における極めて変化しない塩
基に下線を付ける。
【０２７８】ベクターM13mp19 中の各挿入部の指向も示
す〔→は、挿入部がポリ（コアー）であり、←は、挿入
部がポリ（コアー）の相補配列であることを示す。〕小
文字で書かれた塩基は、コアー配列からの離脱を示す。
各配列の簡単な特性を“注釈”にまとめる。
【０２７９】
【表５】
【０２８０】例16 ＨinfIで消化したヒトＤＮＡへのＭ13・コアーＡ−Ｆの
ハイブリダイゼーション 初期スクリーニングにおいて、２人の血縁のない個人の
ＤＮＡ消化物を 33.15及びプローブＭ13・コアーＡ−Ｆ
のそれぞれで探索した。
【０２８１】２個の血縁のない胎盤（１，２）からのＤ
ＮＡの８μｇの試料をＨinfIで消化し、0.７％アガロー
スゲルで電気泳動し、サザン法でブロットし、主用途に
記載した操作により32Ｐでラベルした各プローブに対し
てハイブリダイゼーションさせた。生じるオートラジオ
グラフを図11に示す。全プローブは、各個人における多
数のＤＮＡ断片を検出した。
【０２８２】結果 プローブＢ，Ｃ及びＤは、それぞれ、２人の個人の間で
実質的に異なるＤＮＡ断片のフィンガープリントを検出
した。フィンガープリントは、プローブによって変動す
るが、若干の断片は１個より多数のプローブによって選
出され、プローブ33.15 によって検出される超可変断片
の組み合わせとある程度重なった。
【０２８３】プローブＢ−Ｄは、すべてＤＮＡフィンガ
ープリント作製に適当であり、一緒に、ヒト及び他の脊
椎動物において試験することができる超可変ミニサテラ
イトの数を拡張すると結論される。ここで、コアー配列
の中心の最も保存される７塩基対セグメントだけを含む
コアーＣを用いて得られる有効なフィンガープリントが
重要である。
【０２８４】コアーの先端を更に切断してコアーＥにお
ける６塩基対反復を生成させると、ＤＮＡフィンガープ
リントパターンは、完全に変化して、試験した２人の個
人によってほとんど共有されている断片の組み合わせを
示した（即ち、これらの断片は極端な多形変化を示さな
い）。従って、コアーＥは、ＤＮＡフィンガープリント
分析に対して、前に使用したプローブ33.5, 33.6及び3
3.15 と同程度に有用なプローブであるとは思われな
い。
【０２８５】このことは、また、一般に有効なＤＮＡフ
ィンガープリント作製には、実際に最低７塩基対のコア
ー配列が必要であることを示唆する。また、コアー（Ｍ
13・コアーＧ）の中心の最も保存的領域の破壊は、ＤＮ
Ａフィンガープリントパターンの複雑さ及び変動性を低
減すると思われる。
【０２８６】Ｍ13・コアーＡ（ポリChi)は、ハイブリッ
ド形成ＤＮＡ断片の新規かつ強いパターンを生じる。こ
れらの断片の多くは、極めて大きく（＞15kb) 、あまり
分離されず、場合によっては存在するＨinfI開裂部位を
含む従来の長いサテライト配列から誘導されるであろ
う。幾つかのＤＮＡ断片は個々の可変性を示す。
【０２８７】例17 コアーＡの詳細な試験 プローブ33.6及び33.15 を使用して広範に特性決定した
神経線維腫症に罹病した家族で、Ｍ13・コアーＡによっ
て製造されたパターンを更に分析した（例８及び図７参
照）。図12には、父親（Ｆ）、６人の娘（Ｄ）及び５人
の息子（Ｓ）からのＤＮＡのＨinfI消化物からのＤＮＡ
フィンガープリントを示す。
【０２８８】常染色体優性遺伝癌である神経線維腫症に
罹病した個人は、＋で示す。罹病した母親からのＤＮＡ
は入手できなかった。分離する父性（●）及び母性
（○）バンドを示す。実線で結合したバンドは、リンク
され、点線で結合されたバンドは対立遺伝子として分離
する。（ｘ）を付けたバンドは、プローブ33.15 を用い
て予め検出された。
【０２８９】結果 プローブ33.6及び33.15 を用いて得られたＤＮＡフィン
ガープリントとは異なり、変動性のレベルは比較的低
く、多数の断片がすべての子孫に伝達される（即ち、こ
れらの断片はその集団において一般的であり、まれでは
なく、しばしばホモ接合状態で存在する）。６個のヘテ
ロ接合性父性バンド及び９個のヘテロ接合性母性バンド
の分離が、11人の子供の同胞群で記録された。父性バン
ドの一つ及び母性バンドの対立遺伝子対をプローブ33.1
5 で予め検出した。
【０２９０】バンドの対立遺伝子対及びリンクした対を
排除した後、２個の新しい父性遺伝子座及び６個の新し
い母性遺伝子座をプローブ33.6及び33.15 で予め記録さ
れないまま残し、予め記録された34個の父性遺伝子座及
び25個の母性遺伝子座と比較する。従って、ポリChi プ
ローブは、ヒトの遺伝分析に限られた用途を有する。
【０２９１】例16及び17の結果は、表５の最上列に下線
を付け、主用途の個所に論じた９個の優性ヌクレオチド
の重要性を確認させる。これらは、また、有効なプロー
ブコアーには、ヌクレオチド６個の最小配列が必要であ
るという、主用途において行った予言を確認するのに大
いに有効である。
【０２９２】従って、コアーＥは、最小利用性を表し、
ヌクレオチド６個の他の配列、例えば以下に論じる配列
TGGGCAは、限界的に改良さた利用性を示すことができ
る。ヌクレオチド７個への増加は、調査の枠内で極めて
劇的である。
【０２９３】有用なコアー配列の本質的要素を明確にす
る試みにおいて、代わりのヌクレオチドを示すため上に
使用した変異体Ｘ及びＹを、下記のように完全な理論に
有用に広げることができる： Ｘ＝Ａ又はＧ Ｐ＝Ｇではない Ｙ＝Ｃ又はＴ （Ｑ＝Ａではない） Ｗ＝Ａ又はＴ （Ｒ＝Ｃではない） Ｖ＝Ｃ又はＧ （Ｓ＝Ｔではない） （Ｏ＝任意） （ ）＝下記の考察には利用していない。
【０２９４】この用語を使用すると、本発明の態様は、
下記の反復コアー配列： GPGGGCWGGWXG （６） を含むポリヌクレオチドを含むと言うことができる。前
記の配列は、もちろん、最も代表的な12のヌクレオチド
の配列を示す。
【０２９５】しかしながら、７ヌクレオチドのコアーＣ
も著しい利用性を有することが判り、上記の12コアー配
列からの“許容された”変異体を有するものを含めるた
め、一つの態様は、下記の７コアー配列： PGGGCWG （７） の反復を含むポリヌクレオチドをも含むと言うことがで
きる。もちろん、ＰはコアーＣにおけるのと同様にＴに
等しいのが好ましい。他の最も好適なものは、Ａであろ
う。
【０２９６】明瞭にするため、相同パーセンテージは表
３に既に示した。この用途の人工プローブに関しては、
反復は正確な反復であって、全体としてのミニサテライ
トの相同性はコアー配列の相同性によって示すことがで
きる。このことは、相同性を括弧内に示した前記のプロ
ーブ 33.6, 33.15及び33.5には必ずしも真実でない。こ
れは、反復間に生じる変異体による。コアーＦは、恐ら
く、有用性に関して最低相同率を示す。
【０２９７】しかしながら、この不一致は、恐らく、コ
アー中に存在する中心基： TGGGCA （８） の破壊によって誇張された。前記の基が最も有効なプロ
ーブＢ，Ｃ及びＤ中に存在し、あまり有効でないプロー
ブＡ，Ｅ及びＦのすべてにおいては破壊されていること
は注目に値する。
【０２９８】従って、式（６）を有する最低70％の全相
同率を有する更に有効なプローブが得られることが予想
される。式（８）: TGGGCA （８） の中心６ポリヌクレオチドがコアーＥ中でも破壊されて
いることは注目に値する。恐らく、前記の６ヌクレオチ
ドコアー配列は、更に有効であるが、長さをヌクレオチ
ド６から７に増加すると、更に優性な特性が証明される
ことが予想される。
【０２９９】従って、本発明の態様は、コアー配列TGGG
CAの反復を含むポリヌクレオチドを含むと言うことがで
きる。更に一般的には、本発明は、一態様として、すべ
ての反復配列中に配列TGGGCAが存在する前記の“第一
の”定義によるポリヌクレオチドを含むと言うことがで
きる。
【０３００】別の態様から見れば、本発明は、コアー
が、式（２）に示した配列から選択された、同じ５′→
３′の意味で読まれる、少なくとも６個の連続したヌク
レオチドの配列を表す前記の“第一の”定義のポリヌク
レオチドの変性を含むと言うことができる。“コアー”
は、すべての単位が配列TGGGCAを含む限り、各反復単位
に同じ配列を必ずしも有しない。各単位の残りの基は、
全単位長の束縛の範囲内で式（６)(又は更に好ましくは
（２))の配列と少なくとも70％の相同率を有する。
【０３０１】出生時の双生児の接合性の決定 双生児における接合性の決定は、疫学的、遺伝的及び産
科学的研究のためばかりでなく、一卵性と二卵性双生児
との予測に差異があるので、重要である。一卵性双生児
は、二卵性双生児より出生率が低く、体重が低く、医学
的合併症が多く、死亡率が高い。カフカズ人では、新生
児の約30％が異なる性を有し、従って二卵性である。
【０３０２】胎盤膜を試験すると、別の20％の事例が単
絨毛膜性であり、これらは常に一卵性であることが判
る。残りの50％は、集団のうちで比較的一定な割合であ
り、同じ性を有し、二絨毛膜二羊膜胎盤を有し、一卵性
又は二卵性でありうる。
【０３０３】これらの場合の接合生殖性を測定するた
め、一般的外観の評価、指紋、皮膚移植片、味覚試験及
び遺伝的標識形質の測定を含めて種々の方法が使用され
た。後者は、95〜98％の精度で、最も信頼性がある。し
かし、ほとんどの蛋白質及び抗原変異体の平均ヘテロ接
合性が比較的低いので、通常、このような標識形質を多
数調べなければならない。
【０３０４】下記の例では、12組の新生双生児からのＤ
ＮＡを、前記のようなミニサテライトＤＮＡプローブを
用いて試験した。得られたＤＮＡ“フィンガープリン
ト”は、個人ごとに変化し、一卵性双生児だけが同一の
パターンを示すことを証明する。性観察又は胎盤試験か
ら接合性を決定することのできた７例においては、ＤＮ
Ａの結果はこれらの所見と一致した。
【０３０５】他の５組の双生児対及び２組の三つ子につ
いて、ＤＮＡ分析により接合性を迅速に測定することが
できた。従って、本発明によるＤＮＡプローブは、多胎
妊娠のすべての場合に、接合性を積極的に測定すること
ができる一つの遺伝的試験を提供する。
【０３０６】例18 一本鎖ＤＮＡプローブ33.6及び33.15 を使用して、12組
の新生双生児の接合性を測定した。その詳細を表６に示
す。
【０３０７】
【表６】
【０３０８】出産時に集めた臍帯血液の試料又は誕生の
翌日に各乳児から得た末梢血液の試料（0.５〜1.０ml）
をＤＮＡ抽出のため使用した。胎盤を試験して、胎盤が
単又は二羊膜性及び単又は二絨毛膜性であるかを測定し
た。
【０３０９】ＤＮＡを標準法 (Old,J.M., Higgs,D.R.
著、遺伝子分析、D.J.Weatherall、編集、 The Thalass
aemias. 血液学における方法、チャーチル・リビングス
トーン、1983) によって抽出し、10〜15μｇをＨinfIで
消化した。
【０３１０】試料を長さ22cmの0.６％アガロースゲルで
45Ｖで約36時間、長さ1.５kb未満のＤＮＡ断片がすべ
て、電気泳動によりゲルから除かれるまで、電気泳動し
た。ＤＮＡをニトロセルロースフィルターへブロッティ
ングによって転移させ、真空下に80℃で２時間ベーキン
グした。一本鎖ＤＮＡプローブ、 33.15及び33.6を前記
のように32Ｐでラベルした。
【０３１１】結果を図13に示す。図13において、列１及
び２は、33.6一本鎖ミニサテライトプローブを用いて、
症例１の各双生児に関して得られたＤＮＡバンドパター
ンを示す。例３〜19は、一本鎖 33.15プローブを用いて
得られた“フィンガープリント”を示し、症例１は、列
３及び４に、症例２は、列５及び６に、症例３は、列７
及び８に、症例４は、列９及び10に、症例５は、列11及
び12に、症例６は、列13及び14に、症例７は、列15及び
16に示す。
【０３１２】列17〜19は、女性、男性及び女性の３人の
三つ子を示す。列１及び２を列３及び４と比較すると、
２種のプローブ33.6及び33.15 がミニサテライトバンド
の種々の組み合わせを検出することが判る。大きさの標
識は、キロ塩基で示す。
【０３１３】７つの症例（表６参照）では、双生児の性
及びその胎盤膜の試験によって簡単に接合性を測定する
ことができた。単絨毛膜性（又は単羊膜性）胎盤を有す
る双生児（例えば、症例１）はすべて一卵性であるが、
一卵性双生児の約50％が単絨毛膜性胎盤（２）を有する
にすぎなかった。
【０３１４】従って、症例１における双生児は、一卵性
でなければならず、 33.15及び33.6プローブにより同一
のＤＮＡパターンを示した（図１）。５つの症例におい
ては、双生児は異なる性を有し、 33.15及び33.6プロー
ブにより異なるバンドパターンを示した。症例３，５，
７，９及び11において、双生児は同じ性を有し、二絨毛
膜性胎盤を有し、一卵性又は二卵性でありうる。
【０３１５】ＤＮＡ分析により、２組の双生児（症例５
及び９）が異なるバンドパターンを有し、従って、二卵
性であったが、他の３組（症例３，７及び11) では同一
のバンドパターンを有し、一卵性を示すことが判った。
２組の新生三つ子を同様に研究した。両方の場合に、母
親は妊娠を誘発するため受精剤を服用していた。各三つ
子は、特異なバンドパターンを示した（例えば、図13、
列17〜19）。
【０３１６】結果を図14に示す。図14において、列１及
び２は、一本鎖33.15 を用いた結果を示し、列３及び４
は、二本鎖33.15 を用いた結果を示す。
【０３１７】例19 一本鎖又は二本鎖プローブは、それぞれの診断をするの
に適切であるが、多数の放射性一本鎖プローブを用いて
多数のバンドを区別することができた（図14）。これら
の一本鎖プローブの代替物として、ほとんどの実験室で
一層親しまれている対応する二本鎖プローブを使用する
可能性を調べた。
【０３１８】使用した二本鎖プローブは、ｉ）λ33.15
からの“コアー”ミニサテライトを含む二本鎖600bp Ｐ
stＩ−ＡhaIII 断片及び ii)λ33.6からの“コアー”ミ
ニサテライトを含む二本鎖720bp ＨaeIII 断片であっ
た。これらをDNA １μｇ当たり0.５−1.０×109cpmの比
活性になるまでニックトランスレーションによってラベ
ルした。
【０３１９】予備ハイブリダイゼーション及びハイブリ
ダイゼーション条件は、二本鎖プローブ用のハイブリダ
イゼーション緩衝液に１×SSC 及び10％デキストラン硫
酸を使用した以外は、前記の標準法に記載したとおりで
あった。フィルターを65℃で１×SSC 中で１時間洗浄
し、増強スクリーンを用いて−70℃で１〜３日間、電気
泳動した。
【０３２０】例18及び19の考察 接合性を独立に測定することができた７つの症例におい
て、ＤＮＡの結果は、性の観察及び胎盤試験に基づく結
論と一致した。他の５組においては、ミニサテライトプ
ローブを用いて接合性の明快な測定が可能であった。同
様に、研究した２組の三つ子は三卵性であることが判っ
た。
【０３２１】性の相違（二卵性）又は単絨毛膜性胎盤
（一卵性）によっては双生児の接合性を測定できない症
例の50％において、遺伝子分析を使用しなければならな
い。このような試験による情報量は、試験する遺伝子座
における多型性の程度及び試験する遺伝子座の数に比例
する。
【０３２２】多数の赤血球抗原及び酵素測定より、集団
における関係対立遺伝子頻度が既知である場合にだけ、
95〜98％程度の接合性の精度を達成できる(Nylander,P.
P.S.著、双生児出産現象、Barron,S.L., Thomson,A.M.
編集、Obstetrical Epidemiology. ロンドン, Academic
Press, 1983： 143〜165)。
【０３２３】同様に、数種の異なるＤＮＡプローブを用
いる多数の制限酵素部位多型性を分析すると、一卵性の
“誤った陽性”の診断がかなりのパーセンテージで生じ
る(Derom,C., Bakker,E., Vlietineck,R. Derom,R., Va
n der Berghe,H., Thiery,M., Pearson,P.著、ＤＮＡ変
異体を用いる新生双生児の接合性測定、J.Med.Genet.,
1985, 22： 279〜282)。
【０３２４】本発明によるミニサテライトプローブは、
この問題を克服している。それというのは、検出する超
可変ＤＮＡ分節が多数で、著しく変化しうるからであ
る。前記のように、ハイブリッド形成ミニサテライト断
片は、無作為に選択された個人の間ではほとんど共有さ
れない。血縁のない二人の個人が、超可変座の種々の組
み合わせを検出するプローブ33.6及び33.15 で同一のＤ
ＮＡフィンガープリントを示す可能性は、従って、天文
学的であることは既に示した（ｐ<<10-18 、例４参
照）。
【０３２５】断片の約半分を共有する同胞においては、
遺伝的同一性をこのように“誤った陽性”に診断する確
率は、＜10-8である。従って、一本鎖ハイブリッド形成
プローブ33.6及び33.15 を組み合わせて使用すると、従
来の遺伝的試験より高い精度が得られる。
【０３２６】一本鎖プローブによって検出される比較的
弱いバンドの若干のものにハイブリッドを形成しない、
一層普通の二本鎖ミニサテライトプローブを使用してさ
え（図14）、ＤＮＡフィンガープリントから、“誤った
一卵性”の割合を＜10-4に低下するのに充分な情報を得
ることができる。
【０３２７】この接合性測定法の別の利点は、分析には
極めて僅かな試料しか必要でないことである。通常、半
mlの末梢血液又は臍帯血液で、充分なＤＮＡが得られ
た。新生並びにそれより年令の高い双生児及び三つ子に
おける接合性を測定する、この明瞭な手段を利用しうる
ことにより、種々の型の多胎妊娠の決定要素及び影響に
関する一層正確な疫学的研究が可能である。
【０３２８】下記の例では、分子量標識はオートラジオ
グラフでは得られないが、他の結果におけるように、有
効な一般的範囲は、1.５〜20kbであった。
【０３２９】法医学へのＤＮＡフィンガープリントの適
用 ミニサテライトプローブ33.6及び33.15 によって検出さ
れるＤＮＡフィンガープリントの個体特異性により、Ｄ
ＮＡフィンガープリントは法医学において個人の確認に
理想的に適当になる。ただ一つ不確かなことは、ＤＮＡ
が例えば乾いた血液又は精液の瘢痕中でＤＮＡフィンガ
ープリント分析を行うのに充分な未分解状態で生存する
か否かである。
【０３３０】法医学検体の分析可能性を測定するため、
Home Office Central Research Establishment, Alder
mastonのPeter Gill博士によって供給されたＤＮＡ試料
について予備研究を実施した。
【０３３１】例20 布上の乾いた血液及び精液の瘢痕を、Gill博士によって
実施されたＤＮＡ抽出（１M DTT の存在でＳＤＳで溶解
し、次いでフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ
る）の前に、種々の時間室温で放置した。同様に、新鮮
な毛根及び性交の前後に採取した膣スワブからＤＮＡを
抽出した。
【０３３２】ＤＮＡ試料をＨinfIで消化し、0.８％アガ
ロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースフィルター
上にブロットした。フィルターを前記の本発明の標準技
法を用いて32Ｐ−ラベル一本鎖プローブ33.15 でハイブ
リッドとした。
【０３３３】電気泳動した試料は、下記のとおりであっ
た： 1. 布上の精液瘢痕40μｌ、４週間後のもの。 2. 新鮮な精液40μｌ。 3. 新鮮な血液60μｌ。 4. 布上の血液瘢痕60μｌ、４週間後のもの。 5. 布上の血液瘢痕60μｌ、２年間後のもの。 6. 毛根15個。 注．１−６は、同じ人から採取した。 7. 布上の血液瘢痕60μｌ、男性、新鮮。 8. ７と性交後１時間に11から採取した膣スワブ。 9. 性交後７時間に採取した以外は８と同じ。 10. 11から採取した膣スワブ。 11. 布上の血液瘢痕60μｌ、女性、新鮮。
【０３３４】得られたＤＮＡフィンガープリントを図15
に示す。各試料からの分析のため充分なＤＮＡ（約0.５
〜３μｇ）を抽出した。ＤＮＡは、乾いた血液瘢痕では
２年経過したものまで、乾いた精液では２ヶ月経過した
ものまで、あまり分解していず、同じ個人の新鮮な血液
及び精液から得られるものと同一のＤＮＡフィンガープ
リントを生じた。15個の毛根程度の小さいものからも同
様にＤＮＡフィンガープリントを得ることができた。
【０３３５】性交後に採取した膣スワブも、分解してい
ないＤＮＡフィンガープリントを生じた。しかしなが
ら、スワブパターンは、主として、男性の血液ではな
く、女性の血液のものに一致した。このことは、スワブ
から集められるＤＮＡはほとんど、綿棒で採取する間に
剥離した膣上皮細胞からのものであり、精液からのもの
ではなかったことを示す。
【０３３６】それにもかかわらず、性交後の試料におい
ては、３個の付加的な女性のものではないバンドが検出
された。これらは、男性の血液における主バンドに一致
し、精液から誘導されたものでなければならない。この
ようなバンドを、性交後７時間に採取した試料で検出す
ることができた。
【０３３７】考察 これらの予備実験の結果は、ＤＮＡが種々の法医学検体
中で損なわれずに維持され、従って、同定の目的でＤＮ
Ａフィンガープリントを少なくとも若干の法医学的試料
に適用しうることを示す。例えば、被害者の着衣の精液
瘢痕から強姦犯人の積極的確認が可能になる。強姦被害
者からの膣スワブを用いる場合は、膣ＤＮＡが混入する
点であまり確実ではない。
【０３３８】しかし、精液ＤＮＡの単離に必要な精液の
２−DTT 又はメルカプトエタノール−媒介還元の前に s
ds溶解によってこの女性のＤＮＡを除去すると、一層明
白なＤＮＡフィンガープリントが生じる。この場合に、
強姦犯人の同定は、精液瘢痕及び／又は膣スワブのＤＮ
Ａフィンガープリント分析によって可能になる。
【０３３９】その後、Gill博士と協力して行った最近の
研究で、一般的に上述した予備分離技法を使用して、性
交後の膣スワブから精液ＤＮＡの明瞭な“フィンガープ
リント”が得られることが確認された。
【０３４０】図22は、性交後6.５時間に採取した２つの
膣スワブからのＤＮＡフィンガープリント（列３）を示
す。列１には、相手の男性の血液試料からのフィンガー
プリントを示し、列２には、女性から得た血液からのＤ
ＮＡフィンガープリントを示す。スワブからの女性の細
胞核を、ＳＤＳ／プロテイナーゼＫ混合物中での予備培
養によって優先的に溶解させた。
【０３４１】精液核は、この処理に影響されず、従っ
て、遠心分離によって女性の成分から分離することがで
きる。その後、精液核をＳＤＳ／プロテイナーゼＫ／Ｄ
ＴＴ混合物で処理することにより溶解させた。この分離
操作が完全に有効であったことは明らかである。精液で
汚染された膣スワブからの精液ＤＮＡフィンガープリン
トは、相手の男性の血液から得られたフィンガープリン
トと完全に一致した。
【０３４２】ヒトのミニサテライトプローブを用いて得
られた経済的に重要な動物のＤＮＡフィンガープリント 例21〜25 犬、猫、羊、豚、馬及び牛から採取した血液からＤＮＡ
試料を製造した。８μｇの試料を適当な制限エンドヌク
レアーゼ（特に断らない限り、ＨinfI）で消化し、制限
消化物をフェノール抽出後にエタノール沈澱によって回
収した。
【０３４３】制限消化物を水中に再溶解し、0.７％アガ
ロースゲルで電気泳動し、変性し、Schleicher-Schuell
ニトロセルロースフィルターに転移させ、前記のように
32Ｐ−ラベルヒトミニサテライトプローブ33.6又は33.1
5 を用いてハイブリッドを形成させた。
【０３４４】例21 犬 プローブ33.6を用いて犬の家族から得られたＤＮＡフィ
ンガープリントを図16に示す。電気泳動した試料は、下
記のとおりであった： 列１ ピーグル犬の父親 列２ グレーハウンドの母親 列３，４及び５ これらの両親の“グリーグル(Greagl
e)"の子犬（それぞれ雌、雄、雄）。
【０３４５】ヒトＤＮＡから得られたものと同様に複雑
な、詳細なＤＮＡフィンガープリントが各犬から得られ
た。父親及び母親（列１，２）から得られたパターンを
比較することによって判るように、ＤＮＡフィンガープ
リントは著しい変異性を示した。３匹の子犬はすべて、
それぞれ、すべて父親及び／又は母親に由来をたどるこ
とのできるバンドから成る、異なるＤＮＡフィンガープ
リントを有する。従って、これらのＤＮＡフィンガープ
リントは、人の場合と同様に、犬における父性試験及び
家系分析に有用である。
【０３４６】試料１〜３のＤＮＡは、僅かに分解してお
り、それにより、最大（最も緩徐に泳動する）バンドの
強度を優先的に減少した。この分解にもかかわらず、両
親から子孫へのバンドの伝達は、容易に測定できた。
【０３４７】例22 猫 図17は、（左）プローブ33.6及び（右）プローブ33.15
を用いて、毛の短い家猫の家族からのＤＮＡフィンガー
プリントを示す。 列１ 母親 列２ 父親 列３ 小猫
【０３４８】プローブ33.6及び33.15 は、情報に富むＤ
ＮＡフィンガープリントを生じる。小猫のほとんどのバ
ンドは、母性又は父性であると記録することができ、従
って、これらのＤＮＡフィンガープリントは、猫におけ
る家系試験並びに個体の同定に適当である。
【０３４９】例23 羊 プローブ33.6（左）及び33.15(右) を用いて種々の羊か
ら得たＤＮＡフィンガープリントを図18に示す。試料は
下記のものであった： 列１ 雑種雌 列２ 雑種雌 列３ ドーセット種の雌 列４ ハンプシャー×ドーセット種の雌 列５ ドーセット種の雄
【０３５０】両方のプローブにより各羊から個体特異性
ＤＮＡフィンガープリントが得られた。ＤＮＡフィンガ
ープリントは、ヒトのＤＮＡフィンガープリントより弱
く、それほど複雑ではないが、同定及び遺伝学的目的に
はなお有用である。プローブ33.6は、弱いバンドの範囲
の他に、各羊において１又は２個の極めて強い多形バン
ドを検出する。これらのバンドは、恐らく、極めて高い
プローブ33.6相同性を示す、ただ一つのミニサテライト
遺伝子座から誘導されたものである。
【０３５１】例24 豚及び馬 図19は、３頭の異なる豚（列１〜３）及び３頭の異なる
馬（列４〜６）〔性別及び育種は、特定されていない〕
からのＤＮＡフィンガープリントを示す。プローブ33.6
及び33.15 は、各種と個体特異性ＤＮＡフィンガープリ
ントを生じる。特にプローブ33.15 によるＤＮＡフィン
ガープリントは、弱く、対応するヒトＤＮＡフィンガー
プリントと比べて極めて少ないバンドを含むが、それで
も両方のプローブの併用は、個体の同定に有用である。
【０３５２】例25 牛 図20は、牛家族及び追加の牛について、プローブ33.6を
用いて得られたＨinfIDNA消化物のＤＮＡフィンガープ
リントを示す。試料は、下記のとおりである： 〔列１ ヒト〕 列２ 母牛 列３ 父牛 列４ １及び２の子牛 列５ アンガス雄牛 列６ フレシアン雄牛
【０３５３】羊、豚及び馬の場合と同様に、かなり簡単
であるが、それでも個体特異性のＤＮＡフィンガープリ
ントが各動物から得られた。子牛では、すべてのバンド
は、母牛及び／又は父牛に由来をたどることができ、こ
の動物の家系を確認することができた。
【０３５４】図21は、同じウシＤＮＡについてプローブ
33.15 を用いた結果を示す。個々の列は、下記のものを
示す。 1. 母牛 2. 父牛 3. １及び２の子牛 4. アンガス雄牛 5. フレシアン雄牛 〔6. ヒト〕
【０３５５】プローブ33.15 は、ＨinfIで消化したウシ
ＤＮＡにおけるハイブリッド形成ＤＮＡバンドの強く
て、分離できない程、複雑なパターンを生じる。ＢglII
消化物においては、この強いシグナルは、主として極め
て大きいＤＮＡ断片に限られ、このシグナルが、ふさ状
配列又は領域、恐らく従来のサテライトＤＮＡから誘導
されたものであることを示唆する。
【０３５６】ＨinfI消化物を短時間、オートラジオグラ
フィに付すと、45−50塩基対の間の“横木”の間で周期
性をもって（データは示さない）、ゲルの底部に向かう
“はしご”状バンドを示す。従って、強いシグナルは、
恐らく長さ45−50塩基対の反復単位を有するサテライト
から誘導されたものである。
【０３５７】強いシグナルは、ＰvuII、ＤdeＩ又はＡlu
Ｉで消化されたウシＤＮＡにおいて著しく破壊されてお
り、サテライトＤＮＡ反復単位がこれらの制限エンドヌ
クレアーゼのそれぞれに対する１個以上の部位を含む
が、ＨinfI又はＢglII対する部位を含まないことを示唆
する。
【０３５８】これらは、正確に、46塩基対反復単位の10
0000タンデム列反復から成る 1.720ウシサテライト (E.
Poschl及びR.E.Streek著、“ウシ 1.720サテライトＤＮ
Ａのプロトタイプ配列”、J.Mol.Biol. 143, 147〜153
: 1980) の性質である。1.720反復単位の配列とコアー
プローブ33.6反復単位及び 33.15反復単位との比較を、
以下に示す：
【０３５９】
【化10】
【０３６０】前記の式から明らかなとおり、 1.720サテ
ライト反復単位は、コアー配列の３′領域のほぼ完全な
複写を含む（一致部を＊で示した）。 1.720反復におけ
るこの領域は、 33.15の反復単位と優れた一致を示す
が、33.6とはあまり完全でない一致を示す。
【０３６１】これは、 1.720サテライトＤＮＡがプロー
ブ33.15 によって検出されるが、33.6によっては検出さ
れない（図20) 理由を説明する〔 1.720サテライト反復
単位(ミオグロビンλ33ミニサテライトの反復単位と似
ている) は、コアー (式（１）におけるＨ＋Ｊ＞15) の
各側にあまり多数のミクレオチドを含みすぎて、本発明
による多座プローブとして作用しない〕。
【０３６２】プローブ33.15 にハイブリッドを形成する
ウシミニサテライトを検出するため、ＤＮＡをＡluＩ又
はＤdeＩで消化して、 1.720サテライトをこのゲルの底
部から電気泳動により除かれる46塩基対モノマーに還元
した。図21は、ウシＤＮＡからのこれらの制限酵素のそ
れぞれについて明瞭なＤＮＡフィンガープリントが実際
に得られたことを示す(No.３）。
【０３６３】しかしながら、これらのバンドのほとんど
全部は、各反復においてＡluＩ及びＤdeＩ部位を失った
（恐らく、前記の下線を付した塩基の一方又は他方の突
然変異により、重なるＡluＩ及びＤdeＩ部位が破壊され
ることによって）、正常な 1.720 DNA内に埋めこまれた
1.720サテライトＤＮＡの変異体ブロックから誘導され
たものである。
【０３６４】このことは、下記の事実を証明するであろ
う： ａ．ＡluＩ及びＤdeＩを用いて、実際に同一のウシＤＮ
Ａフィンガープリントが得られた。 ｂ．極めて大きい断片は、一貫して、小さいものより強
力にハイブリッドを形成する（これらは対応して多くの
1.720サテライト反復単位を含むからである。極めて大
きいウシＤＮＡ断片は、これらの単位を 440個含む) 。
ヒトにおいては、バンド強度は、大きさと共に連続して
増加しない（図21) 。
【０３６５】ｃ．ウシＤＮＡフィンガープリント断片の
ほとんど全部は、 1.720反復単位内で１度で切断するＨ
haＩによって除去される（前記参照、データを示さな
い）。 ｄ．父牛(No.２）は、ＡluＩ消化物中にハイブリッド形
成断片をほとんど有しない。このことは、これらの変異
体反復ブロックを含む 1.720サテライトＤＮＡの領域
が、この動物では欠失したことを示唆する。
【０３６６】ｅ．母牛(No.１）及び子牛(No.５）のＤＮ
Ａフィンガープリントは、ほとんど同一である。母牛
は、恐らく欠失に関してヘテロ接合性で、父牛に見られ
るのと同等で、非欠失染色体（及び従って、全部のバン
ド）を偶然、子牛に伝達していた。従って、これらのバ
ンドはすべてリンクし、ヒトにおいて起こるのと同様に
子孫に独立して伝達されない。
【０３６７】それにもかかわらず、試験した５頭のウシ
は、異なる“サテライト”ＤＮＡフィンガープリントパ
ターンを示し、これらの異常な型のフィンガープリント
は、個体の同定に有用であるが、多座標識情報を得るに
は使用できない。
【０３６８】式（１）において、ｎが必ずしも３に等し
くない場合にも、あるプローブは有効に機能することが
できる。このようなプローブにおいては、コアーを含ま
ないＤＮＡ配列によって少なくとも１対の（Ｊ．コア
ー．Ｋ）の反復を少なくとも更に２個の反復から分離す
ることができる。従って、“非コアー”ＤＮＡ配列によ
って隔てられた対中に（Ｊ．コアー．Ｋ）配列が配列さ
れている充分に長いプローブを構成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ミオグロビン遺伝子の33bp反復配列を
プラスミドに挿入しそしてそれをクローニングする、そ
の製造方法の模式的説明である。
【図２】図２は種々のＤＮＡプローブにハイブリダイズ
するゲノムＤＮＡの断片のオートラジオグラフの写真の
フォトコピーであり、そしてさらにそのＤＮＡが２つの
オートラジオグラフにおいて同定された親類個体血統を
示し、電気泳動の結果を示す図面に代る写真である。
【図３】図３は、この発明の３種類の異るプローブによ
り探索された、親類関係にない３人のヒトの個体からの
ＤＮＡサンプルのオートラジオグラフを示し、電気泳動
の結果を示す図面に代る写真である。
【図４】図４は、この発明のプローブにより探索され
た、９人のヒトの個体からのＤＮＡサンプルのオートラ
ジオグラフを示し、その数人は親類関係にあり、そして
２人は一卵性双生児である。これは電気泳動の結果を示
す図面に代る写真である。
【図５】図５は、この発明のプローブにより探索され
た、２人のヒト及び17のヒト以外の動物からのＤＮＡサ
ンプルのオートラジオグラフを示し、電気泳動の結果を
示す図面に代る写真である。
【図６】図６は、この発明に従って探索された、入植紛
争にまき込まれたガーナ人家族の構成員からのＤＮＡサ
ンプルの１連のオートラジオグラフであり、電気泳動の
結果を示す図面に代る写真である。
【図７】図７は神経線維腫症に罹患した血縁者からのＤ
ＮＡサンプルのオートラジオグラフであり、電気泳動の
結果を示す図面に代る写真である。
【図８】図８は、ミニサテライト断片の可能性ある共同
受け継ぎ及び胎児性ヘモグロビンの遺伝的存続(HPFH)の
試験のために作られたGujerati血統からのＤＮＡのオー
トラジオグラフであり、電気泳動の結果を示す図面に代
る写真である。
【図９】図９のＡ及びＢは、大きな親類関係におけるHP
FH及び種々のミニサテライトの受け継ぎを示す遺伝的ダ
イアグラムである。
【図10】図10はクローン化された人工的ミニサテライト
の調製を示すダイアグラムである。
【図11】図11は、新規な合成プローブにより探索され
た、親類関係にない２個体の胎盤からのＤＮＡサンプル
の１連のオートラジオグラフであり，電気泳動の結果を
示す図面に代る写真である。
【図12】図12は大きな親類関係からの探索されたＤＮＡ
サンプルの１連のオートラジオグラフであり，電気泳動
の結果を示す図面に代る写真である。
【図13】図13は異る２つのプローブを用いて双生児につ
いて得られる種々のＤＮＡバンドパターンを示すオート
ラジオグラフであり，電気泳動の結果を示す図面に代る
写真である。
【図14】図14は単鎖プローブ及び２本鎖プローブを用い
て形成されるバンドパターンを比較するオートラジオグ
ラフであり，電気泳動の結果を示す図面に代る写真であ
る。
【図15】図15は、法医学サンプルから得られるＤＮＡフ
ィンガープリントを示すオートラジオグラフであり，電
気泳動の結果を示す図面に代る写真である。
【図16】図16はイヌの一族から得られたＤＮＡフィンガ
ープリントを示すオートラジオグラフであり，電気泳動
の結果を示す図面に代る写真である。
【図17】図17は短毛家庭用ネコの一族からのＤＮＡフィ
ンガープリントを示すオートラジオグラフであり，電気
泳動の結果を示す図面に代る写真である。
【図18】図18は２つの異るプローブを用いて種々のヒツ
ジから得られたＤＮＡフィンガープリントを示すオート
ラジオグラフであり，電気泳動の結果を示す図面に代る
写真である。
【図19】図19は３頭の異るブタからのＤＮＡフィンガー
プリントを示すオートラジオグラフであり，電気泳動の
結果を示す図面に代る写真である。
【図20】図20はウシの一族及び追加のウシについてのＤ
ＮＡフィンガープリントを示すオートラジオグラフであ
り，電気泳動の結果を示す図面に代る写真である。
【図21】図21は異るプローブを用いる図20に類似するオ
ートラジオグラフであり，電気泳動の結果を示す図面に
代る写真である。
【図22】図22は、図15と同様、法医学サンプルから得ら
れるＤＮＡフィンガープリントを示すオートラジオグラ
フであり，電気泳動の結果を示す図面に代る写真であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ８５２２１３５ (32)優先日 1985年９月６日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (72)発明者 ジェフリーズ，アリク，ジョン イギリス，レスター エルイー２ ６エフ エー， アスクウィス ブールバード 14

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 遺伝的特性決定用ポリヌクレオチドであ
    って、 ５′→３′の意味に読まれる次の一般式： Ｈ．（Ｊ．コアー．Ｋ）n ・Ｌ （１） 〔式中、 “コアー”は６個以上の連続するヌクレオチドを有する
    配列を表わし、該ヌクレオチドは同じ意味に読まれる次
    の配列： GGAGGTGGGCAGGAXG （２） AGAGGTGGGCAGGTGG （３） GGAGGYGGGCAGGAGG （４） T(C)m GGAGGAXGG(G)p C （５Ａ） T(C)m GGAGGA(A) q GGGC （５Ｂ） （式中、ＸはＡ又はＧであり、ＹはＣ又はＴであり、ｍ
    は０，１又は２であり、ｐは０又は１であり、ｑは０又
    は１であり、ｎは３以上である）のいずれかの中から選
    択され；Ｊ及びＫは一緒になって、反復単位内の０〜15
    個の追加のヌクレオチドを表わし；そしてＨ及びＬはそ
    れぞれ、反復配列の端に位置する０又は１以上の追加の
    ヌクレオチドを表わし；そして次のこと、すなわち： （ｉ）“コアー”並びにＪ及びＫは各（Ｊ．コアー．
    Ｋ）反復単位中同じ配列又は長さを有することは必ずし
    も必要でなく； （ii）“コアー”はまた変形体コアー配列を表わすこと
    もでき； （iii)全ｎ反復配列中の実際の合計コアー配列は、同じ
    数ｎの反復単位において、式２〜５について上に定義し
    た“真の”合計コアー配列に対して70％以上の相同性を
    有する〕を有するポリヌクレオチド、並びにこれに対し
    て相補的な配列のポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 各（Ｊ．コアー．Ｋ）反復配列中に存在
    するヌクレオチドの合計数が25を超えない、請求項１に
    記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 コアーが最高16のヌクレオチドを有す
    る、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 コアーが７個以上の連続するヌクレオチ
    ドの配列を表わす、請求項１に記載のポリヌクレオチ
    ド。
  5. 【請求項５】 コアーが12個以上の前記連続するポリヌ
    クレオチドの配列を表わす請求項１に記載のポリヌクレ
    オチド。
  6. 【請求項６】 コアーが、前記式（２), (３）又は
    （４）中に示された配列から選択される14〜16個の前記
    連続するヌクレオチドの配列を表わす、請求項１に記載
    のポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 実際のコアー配列が真のコアー配列に対
    して80％以上の相同性を有する、請求項１に記載のポリ
    ヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 Ｊが０又は１であり、そしてＫが０又は
    １である、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
  9. 【請求項９】 各（Ｊ．コアー．Ｋ）反復単位中に存在
    するヌクレオチドの合計数が20を超えない、請求項１に
    記載のポリヌクレオチド。
  10. 【請求項10】 次の式： (5′) GPGGGCWGGWXG(3′) （６） （式中ＰはＧではなく、ＷはＡ又はＴであり、そしてＸ
    はＡ又はＧである）内から選択される連続する（５′→
    ３′）コアー配列を含有する６〜36ntの配列の３以上の
    反復を有するポリヌクレオチド、又はその変形体（全反
    復中の実際の合計コアー配列は、同じ数の反復内の式
    （６）について定義された“真の”合計コアー配列に対
    して70％以上の相同性を有する）; 並びにこれに対して
    相同な配列のポリヌクレオチドである請求項１に記載の
    ポリヌクレオチド。
  11. 【請求項11】 各反復又は変形体反復が式（６）の配列
    を含む、請求項10に記載のポリヌクレオチド。
  12. 【請求項12】 連続する（５′→３′）配列： PGGGCWG （７） がすべての反復単位中に保存されており、Ｐ及びＷが請
    求項10において与えられた意味を有する、請求項１に記
    載のポリヌクレオチド。
  13. 【請求項13】 連続する（５′→３′）配列： TGGGCA （８） がすべての反復単位中に保存されている、請求項１に記
    載のポリヌクレオチド。
  14. 【請求項14】 ＰがＴである、請求項10〜13のいずれか
    １項に記載のポリヌクレオチド。
  15. 【請求項15】 ＷがＡである、請求項10〜13のいずれか
    １項に記載のポリヌクレオチド。
  16. 【請求項16】 前記連続するコアー配列又は保存された
    配列が反復配列と同一である、請求項10〜15のいずれか
    １項に記載のポリヌクレオチド。
  17. 【請求項17】 次の連続する５′→３′コアー配列： GGPGGGCWGGWXG （７） （式中ＰはＧではなく、ＷはＡ又はＴであり、そしてＸ
    はＡ又はＧである）を含む３以上の反復を有するポリヌ
    クレオチド、又はその変形体（全反復中の実際の合計コ
    アー配列が同じ数の反復中の式（７）について定義した
    “真の”合計コアー配列に対して70％以上の相同性を有
    する）、並びにこれに対して相補的な配列のポリヌクレ
    オチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  18. 【請求項18】 Ｗが５′末端においてＡであり、そして
    ３′末端においてＴである、請求項17に記載のポリヌク
    レオチド。
  19. 【請求項19】 前記コアーが、５′→３′と連続する配
    列： PGGGCWG （７） 又は TGGGCA （８） （式中、ＰはＧではなく、ＷはＡ又はＴである）を含有
    する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  20. 【請求項20】 次の式（相補的配列を含めて）: （式中、ＴはＴ又はＵである）から選択された配列の３
    以上の反復から本質上成る、請求項１に記載のポリヌク
    レオチド。
  21. 【請求項21】 次の配列（相補的配列を含めて）: (33.6) (A)A G G G C T G G A G G (33.15) A G A G G T G G G C A G G T G G から選択された配列の３以上の反復から本質上成る、請
    求項１に記載のポリヌクレオチド。
  22. 【請求項22】 遺伝的特性決定用ポリヌクレオチドプロ
    ーブであって、標識成分又はマーカー成分と共にポリヌ
    クレオチドを含んで成り、該ポリヌクレオチドが、５′
    →３′の意味に読まれる次の一般式： Ｈ．（Ｊ．コアー．Ｋ）n ・Ｌ （１） 〔式中、 “コアー”は６個以上の連続するヌクレオチドを有する
    配列を表わし、該ヌクレオチドは同じ意味に読まれる次
    の配列： GGAGGTGGGCAGGAXG （２） AGAGGTGGGCAGGTGG （３） GGAGGYGGGCAGGAGG （４） T(C)m GGAGGAXGG(G)p C （５Ａ） T(C)m GGAGGA(A) q GGGC （５Ｂ） （式中、ＸはＡ又はＧであり、ＹはＣ又はＴであり、ｍ
    は０，１又は２であり、ｐは０又は１であり、ｑは０又
    は１であり、ｎは３以上である）のいずれかの中から選
    択され；Ｊ及びＫは一緒になって、反復単位内の０〜15
    個の追加のヌクレオチドを表わし；そしてＨ及びＬはそ
    れぞれ、反復配列の端に位置する０又は１以上の追加の
    ヌクレオチドを表わし；そして次のこと、すなわち： （ｉ）“コアー”並びにＪ及びＫは各（Ｊ．コアー．
    Ｋ）反復単位中同じ配列又は長さを有することは必ずし
    も必要でなく； （ii）“コアー”はまた変形体コアー配列を表わすこと
    もでき； （iii)全ｎ反復配列中の実際の合計コアー配列は、同じ
    数ｎの反復単位において、式２〜５について上に定義し
    た“真の”合計コアー配列に対して70％以上の相同性を
    有する〕を有するポリヌクレオチド、あるいはこれに対
    して相補的な配列のポリヌクレオチドであることを特徴
    とするプローブ。
  23. 【請求項23】 少なくとも反復単位が単鎖形である、請
    求項22に記載のポリヌクレオチドプローブ。
  24. 【請求項24】 全体として単鎖形である、請求項22に記
    載のポリヌクレオチドプローブ。
  25. 【請求項25】 ヒト又は動物のＤＮＡ含有試料の遺伝的
    由来の決定において有用なプローブの製造方法であっ
    て、標識又はマーカーをポリヌクレオチドに導入するこ
    とを含んで成り、該ポリヌクレオチドが、５′→３′の
    意味に読まれる次の一般式： Ｈ．（Ｊ．コアー．Ｋ）n ・Ｌ （１） 〔式中、 “コアー”は６個以上の連続するヌクレオチドを有する
    配列を表わし、該ヌクレオチドは同じ意味に読まれる次
    の配列： GGAGGTGGGCAGGAXG （２） AGAGGTGGGCAGGTGG （３） GGAGGYGGGCAGGAGG （４） T(C)m GGAGGAXGG(G)p C （５Ａ） T(C)m GGAGGA(A) q GGGC （５Ｂ） （式中、ＸはＡ又はＧであり、ＹはＣ又はＴであり、ｍ
    は０，１又は２であり、ｐは０又は１であり、ｑは０又
    は１であり、ｎは３以上である）のいずれかの中から選
    択され；Ｊ及びＫは一緒になって、反復単位内の０〜15
    個の追加のヌクレオチドを表わし；そしてＨ及びＬはそ
    れぞれ、反復配列の端に位置する０又は１以上の追加の
    ヌクレオチドを表わし；そして次のこと、すなわち： （ｉ）“コアー”並びにＪ及びＫは各（Ｊ．コアー．
    Ｋ）反復単位中同じ配列又は長さを有することは必ずし
    も必要でなく； （ii）“コアー”はまた変形体コアー配列を表わすこと
    もでき； （iii)全ｎ反復配列中の実際の合計コアー配列は、同じ
    数ｎの反復単位において、式２〜５について上に定義し
    た“真の”合計コアー配列に対して70％以上の相同性を
    有する〕を有するポリヌクレオチド、あるいはこれに対
    して相補的な配列のポリヌクレオチドであることを特徴
    とする方法。
  26. 【請求項26】 適当な緩衝液、包装及び／又は使用説明
    書と共にポリペプチドを含んで成るキットであって、該
    ポリペプチドが、 ５′→３′の意味に読まれる次の一般式： Ｈ．（Ｊ．コアー．Ｋ）n ・Ｌ （１） 〔式中、 “コアー”は６個以上の連続するヌクレオチドを有する
    配列を表わし、該ヌクレオチドは同じ意味に読まれる次
    の配列： GGAGGTGGGCAGGAXG （２） AGAGGTGGGCAGGTGG （３） GGAGGYGGGCAGGAGG （４） T(C)m GGAGGAXGG(G)p C （５Ａ） T(C)m GGAGGA(A) q GGGC （５Ｂ） （式中、ＸはＡ又はＧであり、ＹはＣ又はＴであり、ｍ
    は０，１又は２であり、ｐは０又は１であり、ｑは０又
    は１であり、ｎは３以上である）のいずれかの中から選
    択され；Ｊ及びＫは一緒になって、反復単位内の０〜15
    個の追加のヌクレオチドを表わし；そしてＨ及びＬはそ
    れぞれ、反復配列の端に位置する０又は１以上の追加の
    ヌクレオチドを表わし；そして次のこと、すなわち： （ｉ）“コアー”並びにＪ及びＫは各（Ｊ．コアー．
    Ｋ）反復単位中同じ配列又は長さを有することは必ずし
    も必要でなく； （ii）“コアー”はまた変形体コアー配列を表わすこと
    もでき； （iii)全ｎ反復配列中の実際の合計コアー配列は、同じ
    数ｎの反復単位において、式２〜５について上に定義し
    た“真の”合計コアー配列に対して70％以上の相同性を
    有する〕を有するポリヌクレオチド、並びにこれに対し
    て相補的な配列のポリヌクレオチドであることを特徴と
    するキット。
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