NO840289L - Metoder og strukturer som benytter ikke-radioaktive kjemisk merkede polynukleotid-sonder - Google Patents

Description

Ved bestemmelsen av tilstedeværelse eller identitet av genetisk materiale, slik som genetisk DNA-materiale, er det blitt foreslått å denaturere det genetiske materialet for å danne en-kjedet DNA eller en-kjedet genetisk materiale.

Det en-kjedede genetiske materialet festes så til en fast bærer og bringes i kontakt med en sonde, slik som en DNA-sone, som i sin oppbygning har baser som er komplementære til oppbygningen av det fikserte genetiske materialet som skal identifiseres og/eller bestemmes. Sammenføringen av det en-kjedede genetiske materialet med den en-kjedede sonden utføres under betingelser som bevirker hybridisering av det genetiske materialet som skal bestemmes eller identifiseres, og sonden.

Radioaktivt merkede sonder, slik som radioaktivt merkede en-kjedede DNA-sonder, har vært anvendt. US patentskrift nr. 4.358.535 åpenbarer en fremgangsmåte for identifisering av en patogen organisme som er tilstede i en klinisk prøve ved denaturering av det genetiske materialet som er tilstede i den kliniske prøven for å danne en-kjedet genetisk materiale derav, og å feste det oppnådde en-kjedede genetiske materialet som kjennetegner den patogene organismen til en inert bærer eller overflate. Det således fikserte en-kjedede genetiske materialet som kjennetegner eller identifiserer den patogene organismen, bringes i kontakt med en radioaktiv en-kjedet sonde under hybridiseringsbetingelser for å bevirke dupleksdannelse eller dannelse av dobbelt-kjede av det genetiske materialet avledet fra den patogene organismen og sonden. Tilstedeværelsen av den således dannede dupleksen mellom sonden og det genetiske materialet til den patogene organismen ville så kunne påvises og ville kunne bekrefte nærværet og/eller identiteten av den patogene organismen.

Ulempene ved å benytte en radioaktivt merket sonde, slik

som en radioaktivt merket DNA-sonde, for identifiseringen av genetisk materiale, er velkjent for fagfolk. Slike ulem-per omfatter ikke bare foranstaltningene og risikoene som

er involvert i håndteringen av det radioaktive materialet, men også den korte levetiden til slikt radioaktivt materiale og utgifter i tilknytning til håndteringen og bruken av slike radioaktivt merkede DNA-sonder.

Det er kjent å merke nukleotider og polynukleotider kjemisk for å unngå de tilknyttede risikoene og/eller vanskelighetene når slike forbindelser er radioaktivt merket. I artikkelen til P.R. Langer, A.A.Waldrop og D.C.Ward med tittelen "Enzy-matic Synthesis of Biotin-Labeled Polynucleotides: Novel Nucleic Acid Affinity Probes", in Proe. Nati. Acad. Sei.,

USA, vol. 78, nr. 11, sidene 6633-6637, november 1981, - beskrives det f.eks. analoger til dUTP og UTP som inneholder et biotinmolekyl bundet til C-5-stillingen i pyrimidin-ringen over en allylamin-koblerkjede. De biotin-merkede nukleotidene er virksomme substrater for en rekke DNA- og RNA-poly-meraser in vitro. Polynukleotider som inneholder lave nivåer med biotinsubstituering (50 molekyler eller færre pr. kg base), har denaturerings-, reassosierings- og hybridiserings-karakteristika som svarer til de hos usubstituerte kontroller. Biotinmerkede dpolynukleotider, både en- og dobbeltkjedede, bibeholdes selektivt og kvantitativt på amidin-sepharose, selv etter omfattende vasking med 8M urea, 6M guanidinhydro-klorid eller 99% formamid. Dertil kan biotinmerkede nukleotider immunoutfelles selektivt i nærvær av antibiotin-antistoff og protein A fra Staphylococcus aureua. Disse enestående trekkene hos biotinmerkede polynukleotider antyder at de er nyttige affinitetssonder for påvisningen og isoleringen av spesifike DNA- og RNA-sekvenser. Det angis i artikkelen at produkter ifølge artikkelen omfattes av en US patent-søknad .

Det er også blitt fremstilt forbindelser eller nukleotider som kan inkorporeres i DNA, slik som dobbeltkjedet DNA,

og som er nyttige for fremstillingen av ikke-radioaktivt, kjemisk merkede DNA-sonder. Se f.eks. US patentsøknad nr. 255.223, innlevert 17. april 1981, hvor produktet ifølge

den ovenfor nevnte artikkel er åpenbaret, og dertil er det åpenbaret at forbindelsene med formelen:

hvor B er en purin-, deazapurin- eller pyrimidinrest som er kovalent bundet til C 11-stillingen i sukkerresten, forutsatt at når B er purin eller 7-deazapurin, er den bundet i N 9-stillingen i purinet eller deazapurinet, og nar B er pyrimidin, er den bundet i N^-stillingen;

hvor A er en rest bestående av minst 3 karbonatomer som er istand til å danne et påvisbart kompleks med et polypeptid når forbindelsen innlemmes i en dobbeltkjedet ribonukleinsyre, deoksyribonukleinsyre-dupleks eller DNA-RNA-hybrid;

hvor den prikkede linjen er en kjemisk binding som knytter B og A sammen, forutsatt at dersom B er pyrin, er bindingen knyttet til 9-stillingen i pyridinet, dersom B er 7-deazapurin, er bindingen knyttet til 7-stillingen i deazapurinet og dersom B er pyrimidin, er bindingen knyttet til 5-stillingen i pyrimidinet; og

hvor hver av x, y og z er

er i alminnelighet nyttige som sonder i biomedisinsk forskning, og rekombinant DNA-teknologi.

Særlig nyttige er forbindelser som omfattes av denne formelen og som dertil har et eller flere av de følgende kjennetegn: A er ikke-aromatisk; A er minst C^, den kjemiske bindingen som knytter B og A sammen omfatter en ot-olefinbinding, A

er biotin eller iminobiotin, og B er et pyrimidin eller 7-deazapurin.

US patentsøknad nr. 255.223 åpenbarer også forbindelser

med formelen:

hvor hver av B, B<1>og B" er en purin-, 7-deazapurin, eller pyrlmidmrest som er kovalent bundet.til C 11-stillingen i sukkerresten, forutsatt at når B, B' eller B" er purin eller 7-deazapurm, er den knyttet til N 9-stillingen i purinet eller 7-deazapurinet, og når B, B<1>eller B" er pyrimidin, er den knyttet til N^-stillingen;

hvor A er en rest bestående av minst 3 karbonatomer som er istand til å danne et påvisbart kompleks med et polypeptid når forbindelsen innlemmes i en dobbeltkjedet dupleks dannet med et komplementært ribonuklein- eller deoksyribonukleinsyre-molekyl;

hvor den prikkede linjen er en kjemisk binding som knytter B og A sammen, forutsatt at dersom B er purin, er bindingen festet til 8-stillingen i purinet, dersom B er 7-deazapurin, er bindingen festet til 8-stillingen i deazapurinet, og dersom B er pyrimidin, er bindingen festet til 5-stillingen i pyrimidinet;

hvor z er H- elelr H0-; og

hvor m og n er hele tall fra 0 opp til ca. 100 000.

Disse forbindelsene kan fremstilles ved enzymatisk polymeri-sering av en blanding av nukleotider som omfatter de modifiserte nukleotidene ifølge oppfinnelsen. Alternativt kan nukleotider som er tilstede i oligo- eller polynukleotider modifiseres ved å bruke kjemiske fremgangsmåter.

De kjemisk merkede el-ler modifiserte nukleotidene som er beskrevet i den ovenfor anførte PNAS-artikkel og i US-patentsøknad nr. 255.223, har formelen:

hvor B er en purin-, 7-deazapurin- eller pyrimidinrest kovalent bundet til C^-stillingen i sukkerresten, forutsatt at når B er purin eller 7-deazapurin, er den festet ved N -stillingen i purinet eller 7-deazapurinet, og nar B er

pyrimidin, er den festet ved N^-stillingen;

hvor A er en rest bestående av minst 3 karbonatomer som er istand til å danne et påvisbart kompleks med et polypeptid når forbindelsen innlemmes i en dobbeltkjedet ribonukleinsyre, deoksyribonukleinsyredupleks eller et DNA-RNA hybrid;

hvor den prikkede linjen er en sammenbindende gruppe som knytter B og A sammen, forutsatt at dersom B er purin, er bindingen festet til 8-stillingen i purinet, dersom B er 7-deazapurin, er bindingen festet til 7-stillingen i deazapurinet og dersom B er pyrimidin, er bindingen festet til 5-stillingen i pyridinet; og

hvor hver av x, y og z er

Disse forbindelsene er i sin alminnelighet nyttige som sonder i biomedisinsk forskning og rekombinant DNA teknologi.

Selv om alle forbindelene som omfattes av denne strukturelle formelen i prinsippet kan fremstilles og brukes i overensstemmelse med utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, fremstilles og/eller anvendes noen av forbindelsene lettere og er derfor foretrukket for tiden.

Selv om puriner, pyrimidiner og 7-deazapuriner i prinsippet er anvendelige, foretrekkes således pyrimidiner og 7-deazapuriner ettersom purinsubstitusjon i 8-stillingen har en tendens til å gjøre nukleotidene ineffektive som polymerase-substrater. Selv om modifiserte puriner er nyttige i visse henseender, er de således ikke like generelt anvendelige som pyrimidiner og 7-deazapuriner. Videre må ikke pyrimidiner og 7-deazapuriner som er anvendelige i foreliggende

oppfinnelse være naturlig substituerte i henholdsvis 5-

eller 7-stillingene. Følgelig er visse baser, slik som tymin, 5-metylcytosin og 5-hydroksymetylcytosin, ikke anvendelige. For tiden foretrukkede baser er cytosin, uracil, deazaadenin og deazaguanin.

A kan være en hvilken som helst rest som har minst 3 karbonatomer og er istand til å danne et påvisbart kompleks med et polypeptid når det modifiserte nukletidet innlemmes i en dobbeltkjedet dupleks som inneholder enten deoksyribo-nuklein- eller ribonukleinsyre.

A kan derfor være en hvilken som helst ligand som har disse egenskapene, inkludert haptener som er immunogene bare når de er bundet til en egnet bærer, men er istand til å samvirke med passende antistoffer slik at det fremstilles komplekser. Eksempler på rester som er anvendelige omfatter:

Blant disse er biotin og iminobiotin de foretrukkede A-restene .

Ettersom aromatiske rester videre er tilbøyelig til å føyes inn i en base-paret, helisk struktur, er det foretrukket at resten A er ikke-aromatisk. Ettersom mindre rester dessuten kan gi utilstrekkelig gjensidig molekylær virkning med polypeptider, er det foretrukket at A er minst C,-, slik at det kan oppstå tilstrekkelig gjensidig påvirkning til å tillate dannelse av stabile komplekser. Biotin og iminobiotin tilfredsstiller begge disse kriteriene.

Bindingen eller gruppen som knytter resten A til basen B,

kan omfatte en hvilken som helst velkjent binding, inkludert karbon-karbon enkelt-bindinger, karbon-karbon dobbelt-bindinger, karbon-nitrogen enkelt-bindinger eller karbon-oksygen enkelt-bindinger. Det er imidlertid eller vanligvis foretrukket at den kjemiske bindingen omfatter en olefin-binding i a-stillingen i forhold til B. Nærværet av en slik a-olefin-binding tjener til å holde resten A borte fra basen når basen parres med en annen i den velkjente dobbelt-helix konfigurasjonen. Dette tillater gjensidig påvirkning med polypeptid og oppstår lettere, og derved lettes kompleksdannelse. Enkelt-bindinger med større rotasjonsfrihet kan videre ikke alltid holde resten tilstrekkelig borte fra helixen til å tillate gjenkjennelse av og kompleks-dannnelse med polypeptid.

Det er ennå mer foretrukket at den kjemiske bindingsgruppen er avledet fra et primært amin og har strukturen -Cr^-NH-, ettersom slike bindinger lett dannes under anvendelse av en hvilken som helst av de velkjente modifikasjonsreaksjonene for aminer. Eksempler på foretrukne bindinger avledet fra allylamin og allyl-(3-amino-2-hydroksy-l-propyl)etergrupper har henholdsvis formlene -CH=CH-CH_-NH- og -CH=CH-CH -0-

Selv om disse bindingene er foretrukket, kan andre brukes, inkludert især olefinbindingsledd med andre modifiserbare funksjonelle grupper, slik som tiol, karboksylsyre og funksjonelle epoksyder.

Bindingsgruppene er bundet i bestemte stillinger, nemlig

i 5-stillingen til et pyrimidin, 8-stillingen til et purin eller 7-stillingen til et deazapurin. Som angitt tidligere, gir ikke substitusjon i 8-stillingen til et purin et modifisert nukleotid som er anvendelig i alle fremgangsmåtene som her er omtalt. Det kan være slik at 7-stillingene i et purin, hvor det foreligger et nitrogenatom, kan være sammenbindingspunktet. De kjemiske substitusjonsfremgangs-måtene som har vært anvendt hittil og som her er diskutert, er imidlertid ikke egnet for dette formålet.

Bokstavene x, y og z representerer grupper bundet til 5',

3' og 2<1->stillingene i sukkerresten. De kan være hvilke som helst av

Selv om det er mulig, er det usannsynlig at både x, y og

z samtidig vil være det samme. Mer sannsynlig er det at en av x, y og z vil være en fosfatholdig gruppe, enten mono-, di- eller tri-fosfat, og at minst en av dem vil være H0-eller H-. Som det lett vil forstås, eller den mest sann-synlige identiteten til z være HO- eller H-, hvilket indi-

kerer henholdsvis ribonukleotid eller deoksyribonukleotid. Eksempler på slike nukleotider omfatter 5'-ribonukleotid monofosfater, 5'-deoksyribonukleosid trifosfater, 5'p-ribo-nukleosid-3'p, og 5<1>p-deoksyribonukleosid-3'p. Nærmere bestemte eksempler omfatter modifiserte nukleotider av denne type hvor A er biotin eller iminobiotin, den kjemiske bindingen er

og B er uracil eller cytosin.

Den generelle syntetiske fremgangsmåten som er valgt for innføring av bindingsleddet og sonderesten på basen, er omtalt nedenunder. (Se særlig J.L.Ruth og D.E.Bergstrøm,

og M.K.Ogawa, J. Amer. Chem. Soc. 100, 8106, 1978; og CF. Bigge, P. Kalaritis, J.R.Deck og M.P. Mertes, J.Amer. Chem. soc. 102, 2033, 1980). Olefinsubstituentene som her er anvendt, har imidlertid ikke vært brukt tidligere. For å lette festingen av sonderesten A, er det funnet særlig ønskelig å anvende olefiner med primære aminer som funksjonelle grupper, slik som allylamin (AA) eller allyl-(3-amino-2-hydroksy-l-propyl)eter (NAGE), som tillater tilknytning ved hjelp av standard aminmodifiserende reaksjoner, slik som

På grunn av lett fremstilling, er det funnet foretrukket

å bruke NHS-estere til sondeaddisjon. Olefinbindingsledd med andre: modif iserbare, funksjonelle grupper, slik som tioler, karboksylsyrer, epoksyder o.l., kan imidlertid også anvendes. Videre kan både bindingsledd og sonde tilføres i et enkelt trinn dersom det anses som ønskelig.

Det gir betydelig allsidighet å ha biotinsonden direkte bundet til nukleotidderivatene som er istand til å virke som enzymsubstrater, både i de eksperimentelle fremgangsmåtene som kan foretas og i påvisningsfremgangsmåtene (mikro-'skopisk og ikke-mikroskopisk) som kan anvendes for analyse. F.eks. kan biotinnukleotider innføres i polynukleotider

som er i ferd med å bli syntetisert av celler eller rå celle-ekstrakter, og således gjøre det mulig å påvise og/eller isolere nascerende (voksende) polynukleotidkjeder. En slik fremgangsmåte er umulig å utføre ved noen direkte kjemisk modifikasjonsmetode. Videre kan enzymer brukes som reagenser for å innføre sonder slik som biotin på svært selektive eller stedspesifike lokaliseringer i polynukleotider; den

kjemiske syntese av lignende sondemodifiserte produkter vil i beste fall være svært vanskelig å utføre.

Videre er det i søkerens US patentsøknad nr. 391.440, innlevert 23. juni 1982, åpenbart modifiserte ikke-radioaktivt kjemisk merkede nukleotider hvor nukleotidene er modifisert slik som i 5-stillingen i pyrimidin eller 7-stillingen i purin, fremstilt som utgangsmateriale for fremtillingen av nukleotidsonder egnet for tilknytning til eller inkorpo-rering i DNA eller andre nukleinsyrematerialer. Ved fremstillingen av slike modifiserte nukleotider, er nukleotidene,

dvs. nukleinsyrene, fortrinnsvis modifiserte på en ikke-ødeleggende måte, slik at de resulterende modifiserte nukleotidene er istand til å bli inkorporert i nukleinsyrer og når de først er inkorporert i nukleinsyrer, påvirker ikke de modifiserte nukleotidene i noen betydelig grad dannelsen av eller stabiliseringen av dobbelthelixen som dannes av de resulterende nukleinsyrer som inneholder de modifiserte nukleotidene. Den ikke-nedbrytende modifikasjon av nukleotider og nukleinsyrer som inneholder slike modifiserte nukleotider, står i motsetning til de modifikasjonene av nukleotider som er kjennetegnet ved en nedbrytende modifikasjon i betydningen av at de oppnådde nukleotider som er modifisert ved nedbryting og nukleinsyrene som inneholder de samme, stenger for korrekt dobbelt-helix-dannelse. Ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, er det ønskelig at nukleotidene modifiseres i 5-stillingen til pyrimidinet eller 7-stillingen til purinet. De således modifiserte nukleotidene er ikke-nedbrytende modifisert og nukleinsyrene som inneholder slike nukleotider er istand til å danne et dobbelt helix arrangement.

Ved et annet aspekt i utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, er forskjellige fremgangsmåter generelt anvendelige for merkingen av DNA på en ikke-nedbrytende måte. F.eks. tilsettes biotin til enden av et DNA- eller RNA-molekyl. Biotin-addisjonen utføres ved tilsetning av et ribonukleotid. 3', 4'-vicinale hydroksylgrupper oksyderes ved hjelp av perjodatoksydasjon og reduseres deretter med et borhydrid i nærvær av biotinhydrazid. Alternativt kan også karbodi-imid brukes til å koble biotin til aldehydgruppen.

En annen teknikk for å merke nukleinsyrematerialer, slik

som DNA eller RNA, omfatter addisjonen av en stor markør til enden av et DNA- eller RNA-molekyl. Et eksempel på

denne teknikken er addisjonen av et molekyl, f.eks. lycyl-glycin, hvor aminogrupper.e er merket med biotin. Et annet eksempel ville være å følge fremgangsmåten gjengitt ovenfor men anvende karbcdiimid som kryssbindingsmiddel. Nok et annet eksempel på denne teknikken ville være å fremstille en biotinylert dA:dU-dobbelthelisk polymer og å legere denne polymeren til sonden fremstilt i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse.

En annen teknikk for å merke DNA på en ikke-nedbrytende

måte, omfatter isoleringen av dPyrTP som har et putricin eller spermidin i fremstillingen, fra PS16 eller fat-infi-serte celler. Om ønsket, fremstilles dPyrTP fra fag-DNA

og fosforyleres til dPyrTP etterfulgt av modifisering av pclyaminsidekjeden ved hhjelp av standard nukleofilt reager-ende NHS-biotin.

En annen teknikk for å merke DNA på en ikke-nedbrytende

måte, omfatter addisjonen av glukose til 5-hydroksymety1-cytosin (5 HMC) i DNA ved å bruke T4 fag-glykocylerende enzymer etterfulgt av utsortering ved hjelp av en lektin-basert analyse.

Nok en annen fremgangsmåte for å merke DNA på en ikke-nedbrytende måte, omfatter 5 HMC trifosfat fremstilt fra hydro-lyse av R4-DNA etterfulgt av fosforylering av 5HMCMP til 5MMCTP. 5HMCTP innlemmes deretter i DNA ved å bruke poly-merase I. Enhver DNA kan således modifiseres slik at den på en ikke-nedbrytende måte har fått innlemmet 5 HMC.

En fremgangsmåte for å merke DNA på en svakt nedbrytende måte, omfatter å omsette nukleinsyrer i den dobbeltheliske formen med alkylerende reagenser som f.eks. benz(o)pyrendiol-epoksyd eller aflatoksin. Under passende betingelser alky-2 4 4 leres N -gruppen i guanin, N -gruppen i adenosin eller N - gruppen i cytosin. Disse modifiserte nukleotidene kan brukes som bindingsledd for addisjonen av et referensmolekyl, slik som biotin.

Disse spesifikt modifiserte nukleotidene som er egnet som ikke-radioaktive kjemiske merker for DNA-sonder eller DNA-materiale slik som beskrevet i US-patentsøknad nr. 391.440, kan generelt karakteriseres og beskrives som fosforsyre P-rest, et sukker eller monosakkarid S-rest, en base B-rest, et purin eller et pyrimidin og en kjemisk signalrest Sig kovalent bundet til disse:, enten til P-, S eller B-resten.

Av spesiell interesse er de nukleotidene som har en generell formel

hvor P er fosforsyreresten inkludert mono-, di-, tri-, eller tetrafosfat, S er sukker- eller monosakkaridresten, B er baseresten, enten et purin eller et pyrimidin. Fosforsyreresten P er bundet til 3'- og/eller 5'-stillingen i S-resten når nukleotidet er et deoksyribonukleotid og i 2'-, 3'-og/eller 5<1->stillingen når nukleotidet er et ribonukleotid. Baseresten B er bundet fra Nl-stillingen eller N9-stillingen til 1<1->stillingen i S-resten når base-resten er henholdsvis et pyrimidin eller et purin. Sig-resten er kovalent bundet til B-resten i nukleotidet og når den er bundet slik, er den istand til å signalisere sin tilstedeværelse eller gjøre seg selv-påviselig eller sin tilstedeværelse kjent, og tillater ønskelig eller foretrukket innlemmingen av det resulterende nukleotid P - S - B - Sig i, eller til å danne,

en dobbeltkjedet helisk DNA eller RNA, eller et DNA-RNA-

hybrid, og/eller derved bli påvisbar.

Et annet spesielt nukleotid i henhold til foreliggende oppfinnelse, er karakteriseret ved den generelle formel:

Slike nukleotider i henhold til oppfinne].sen kan karakteriseres som ribonukleotider. Fosforsyreresten er bundet i 2'-, 3'- og/eller 5'-stillingen i sukkerresten S og basen B er bundet fra Nl-stillingen eller N9-stillingen til 1'-stillingen i sukkerresten S når basen er henholdsvis et pyrimidin eller et purin. Den kjemiske resten Sig er kovalent bundet til sukkerresten S og er i seg selv istand til å signalisere eller gjøre seg selv-påviselig eller sitt nærvær kjent, og tillater fortrinnsvis innlemmingen av ribo-nukleotidet i dets tilsvarende dobbeltkjedede F.NA eller et DNA-RNA-hybrid.

Det er ønskelig at slike nukleotider som

har den kjemiske Sig-resten bundet til C2'-stillingen i S-resten eller C3<1->stillingen i S-resten. Videre omfatter nukleotidene i henhold til utøvelsen av oppfinnelsen nukleotidene med formelen

hvor P er fosforsyreresten, S er sukkerresten og B er base-resten. I disse spesielle nukleotidene, er P-resten bundet til 3'- og/eller 5'-stillingen i S-resten når nukleotidet er deoksyribonukleotid, og i 2', 3'- og/eller 5'-stillingen nårnukleotidet er et ribonukleotid. Basen B er enten et

purin eller et pyrimidin, og B-resten er bundet fra Nl-eller N9-sti]lingen til 1<1->stillingen i sukkerresten når B-resten er henholdsvis et pyrimidin eller et purin. Den kjemiske Sig-resten er kovalent bundet til fosforsyreresten P via den kjemiske bindingen

idet Sig, når den er bundet til P-resten, i seg selv er istand til å signalisere eller gjøre seg selvpåviselig eller sitt nærvær kjent, og det er ønskelig at nukleotidet er istand til å innlemmes i et dobbeltkjedet polynukleotid, slik DNA, RNA eller DNA-RNA-hybrid, og når det således er innlemmet, fremdeles er selvpåviselig.

Det skal understrekes at de spesielle nukleotidene i henhold til utøvelsen av oppfinnelsen beskrevet, eller definert ovenfor med den generelle formel P - S - B - Sig, også omfatter nukleotider hvor den kjemiske Sig-resten er kovalent bundet til B-resten i N^- eller 6-aminogruppe-sti Ilingen når B-resten er adenin, eller N 2- eller 2-aminogruppe-stillingen nar B-resten er guanm, eller N 4- eller 4-aminogruppe-stillingen når B-resten er cytosin. De resulterende nukleotider som inneholder Sig-resten bundet til seg, er istand til å signalisere seg selv eller gjøre seg selvpåviselig eller sitt nærvær kjent og er påvisbare, er en dobbeltkjedet DNA, RNA eller et DNA-RNA-hybrid.

Som en oppsummering, som angitt ovenfor med hensyn til fremstillingen av de forskjellige spesielle nukleotidene : henhold til oppfinnelser., kan de spesielle nukleotidene beskrives som å omfatte en f osf orsyrerest P, er. sukkerrest S og en baserest B, et purin eller pyrimr.din, hvilken kombina- sjon av P-S-B er velkjent når det gjelder nukleotider og definerer nukleotider, både deoksyribonukleotider og ribonukleotider. Nukleotidene modifiseres så i henhold til utøvelsen av oppfinnelsen ved kovalent å få bundet til P-resten og/eller S-resten og/eller B-resten en kjemisk rest Sig. Den kjemiske resten Sig som således er bundet til nukleotidet P-S-B e. r istand til å gjøre det resulterende nukleotidet, som nå omfatter P-S-B med Sig-resten bundet til en eller flere av de andre restene, selvpåviselige eller få det til å signalisere seg selv eller gjøre det istand til å gjøre sin tilstedeværelse kjent per se, når det inkopo-reres i et polynukleotid, særlig et dobbeltkjedet polynukleotid, slik som en dobbeltkjedet DNA, en dobbeltkjedet RNA eller et dobbeltkjedet DNA-RNA-hybrid. Det er ønskelig at Sig-resten ikke påvirker nukleotidets evne til å danne et dobbeltkjedet polynukleotid som inneholder det spesielle Sig-holdige nukleotidet i henhold til oppfinnelsen, og at det Sig-holdige nukleotidet er istand til å bli påvist, lokalisert eller observert når det således er innlemmet.

Sig-resten som anvendes ved fremstillingen av de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen, kan omfatte en enzym eller enzymatisk materiale, slik som alkalisk fosfatase, glukoseok-sydase, pepperrotperoksydase eller ribonuklease. Sig-resten kan også inneholde en flourescerende bestanddel, slik som fluorescein eller rodamin eller dansyl. Om ønsket, kan Sig-resten omfatte en forbundet eller tilknyttet magnetisk bestanddel, slik som et magnetisk oksyd eller magnetisk jernoksyd, som gjør nukleotidet eller polynukleotidet som inneholder en slik Sig-reste med magnetiske egenskaper, påvisbar ved hjelp av magnetiske hjelpemidler. Sig-

resten kan også omfatte en elektrontetthet-bestanddel, slik som ferritin, for å være tilgjengelig for observasjon. Sig-resten kan også omfatte en radioaktiv isotop-bestanddel, slik som radioaktivt kobolt, som gjør det resulterende nukleotidet observerbart ved hjelp av midler for strålingspåvisning. Sig-resten kan også omfatte en hapten-bestanddel eller per

se være istand til kompleksdannelse med et antistoff som er spesifikt for den. Aller mest nyttig er det når Sig-resten er et polysakkarid eller oligosakkarid eller monosakkarid som er istand til kompleksdannelse med, eller å bli bundet til, et sukker- eller polysakkarid-binder.de protein, slik som et lectin, f.eks. Concanavilin A. Sig-bestanddelen eller resten av de spesielle nukleotidene i henhold til oppfinnelsen kan også omfatte en kjemiluminiserende bestanddel .

Som angitt, kan Sig-bestanddelen i overensstemmelse med utøvelsen av foreliggende oppfinnelse omfatte en hvilken som helst kjemisk rest som lar seg binde til nukleotidet enten direkte eller gjennom en kjemisk binding eller et bindingsledd, slik som til basebestanddelen B, eller sukker-bestanddelen S, eller fosforsyrebestanddelen P.

Sig-bestanddelene i nukleotidene i henhold til oppfinnelsen og nukleotidene cg polynukleotidene innlemmet i nukleotidene ifølge oppfinnelsen, som inneholder Sig-bestanddelen, er ekvivalente med og anvendelige for de samme formål som nukleotidene beskrevet i den ovenfor angitte US-patentsøknad nr. 255.223. Nærmere bestemt er den kjemiske resten A beskrevet i US-patentsøknad nr. 255.223 funksjonelt ekvivalent med Sig-bestanddelen eller den kjemiske resten i de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen. Følgelig kan Sig-bestanddelen eller den kjemiske resten i nukleotider ifølge oppfinnelsen bindes kovalent direkte til P-, S- eller B-restene eller bindes til disse via en kjemisk binding eller et bindingsledd, slik som beskrevet i US patentsøknad nr. 255.223, slik som angitt med den prikkede linjen som forbinder B

og A i nukleotidene i US søknad nr. 255.223. De forskjellige bindingsleddene eller bindingene som er angitt i US søknad nr. 255.223, er anvendbare til og nyttige ved fremstillingen av de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen.

Et særlig viktig og nyttig aspekt ved de spesielle nukleo tidene ifølge oppfinnelsen, er bruken av slike nukleotider i fremstillingen av DNA- eller RNA-sonder. Slike sonder kan inneholde en nukleotidsekvens som i det vesentlige passer til DNA- eller RNA-sekvensen i genetisk materiale som skal lokaliseres og/eller identifiseres. Sonden kc.n inneholde en eller flere av de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen. En sonde med en ønsket nukleotidsekvens, slik som et en-kjedet polynukleotid, enten DNA- eller RNA-sonder, kan så bringes i kontakt med genetisk DNA-materiale eller RNA-materiale som skal identifiseres. Etter lokaliseringen av sonder og dannelsen av et dobbeltkjedet polynukleotid som inneholder sonden og det tilsvarende DNA- eller RNA-materiale som skal identifiseres, kan deretter det således dannede dobbeltkjedede DNA- eller RNA-holdige materialet være observerbart og kan identifiseres. En sonde i henhold til oppfinnelsen kan inneholde praktisk talt ethvert antall nukleotidenheter, fra ca. 5 nukleotider opp til ca. 500 eller mer, alt etter hva som kreves. Det kan synes som om 12 sammenpassende, fortrinnsvis etter hverandre følgende nukleotidenheter vil være tilstrekkelig til å bevirke iden-tifikasjon av mesteparten av DNA- eller RNA-materialet som skal undersøkes eller identifiseres, dersom de 12 nukleotid-sekvensene i sonden passer til en tilsvarende, samvirkende sekvens i DNA- eller RNA-materialet som skal undersøkes eller identifiseres, som angitt kan slike sonder inneholde ett eller flere av de spesielle Sig-holdige nukleotidene i henhold til oppfinnelsen, fortrinnsvis minst ca. et spesielt nukleotid pr. 5-10 av nukleotidene i sonden.

Beskrivelsene i den ovenfor angitte PNAS-artikkel og US patentsøknadene nr. 255.223, innlevert 17. april 1981, og nr. 391.440, innlevert 23. juni 1982, og US patent skrift nr. 4.358.535 innlemmes her og gjøres til en del av denne beskrivelse.

I overensstemrelse med utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, fremstilles ikke-radioaktive, kjemisk merkede polynukleotider slik som ikke-radioaktaive, kjemisk merkede DNA-soner.

Slike sonder bringes så i kontakt med genetisk materiale

som skal identifiseres eller påvises på annen måte:. Før disse sondene bringes i kontakt med det genetiske materialet som skal identifiseres eller undersøkes, denatureres det genetiske materialet for å fremstille eller danne en-kjedet, genetisk materiale, slik sem en-kjedet DNA avledet fra det genetiske materialet. Det er ønskelig at det resulterende en-kjedede genetiske materialet festes til en egnet inert bærer eller overflate, slik som et plastisk materiale, f.eks. polystyren, fortrinnsvis en gjennomsiktig eller gjennomskinnelig overflate, slik som glass. Deretter bringes de spesielle ikke-radioaktive kjemisk merkede sondene, slik som de spesielle ikke-radioaktive kjemisk merkede en-kjedede DNA-sondene ifølge oppfinnelsen, i kontakt med det således fikserte, en-kjedede genetiske: materialet under hybridiserende betingelser. Sonden utvelges slik at den gir tilstrekkelig antall baser, f. eks. minst 7 5 baser, i sin oppbygning, konplement.ært til basene som utgjør det genetiske materialet som skal påvises eller identifiseres. Hybridiseringen av sonden til det en-kjedede genetiske materialet sem skal identifiseres med resulterende dobbeltkjede- eller dupleks-dannelse påvises så ved hjelp av den ikke-radioaktive kjemiske markø-ren festet til sondedelen av det således dannede dobbelt-kjedede hybridet eller duplekshybridet. Det kar; anvendes forskjellige teknikker avhengig av den ikke-radioaktive kjemiske markøaren som anvendes ved fremstillinger: av sonden, for å påvise dannelsen av dobbelt-kjeden eller duplekshybridet. Det er imidlertid foretrukket ved utøvelsen; av oppfinnelsen å anvende spektrofotometriske teknikker og/eller teknikker med enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA)

for bestemmelsen av det dannede hybrid. Spektrofotometriske og ELISA-teknikker tillater ikke bare påvisningen av det resulterende, dannende dobbeltkjedede. hybridet, men tillater også den kvantitative bestemmelsen derav, slik som ved den enzymatiske generering ;-iv et produkt som kan måles kolorimetrisk eller f lucrometrisk . Ved koior i.metrisk bestemmelse, bindes et enzymbundet antistoff, slik som alkalisk fosfatase-

bundet antistoff, til den ikke-radioaktive kjemisk merkede sonden og anvendes til den enzymatiske genereringen av produktet som kan måles koiorimetrisk eller spektrofotometrisk.

En annen egnet spektrofotometrisk eller koiorimetrisk teknikk omfatter immunofluorescens hvor fluorescein-merket antistoff anvendes ved oppbyggingen før, eller er bundet til den ikke-radioaktive kjemiske markøren etter hybrid-dannelsen, og det fluorescein-merkede antistoffet bundet eller fiksert til sonden måles fluorometrisk.

I tillegg til å gi de ovenfor angitte kvantitative resultater, gjør spektrofotometrisk eller kolorimetriske teknikker også nytte ved å gi en ganske hurtig visuell manifestasjon eller frembringelse av den ikke-radioaktive kjemiske markør i det dannede dobbeltkjedede hybrid. Andre ELISA-lignende eller beslektede teknikker er også nyttige for påvisnigen av den ikke-radioaktive, kjemiske markør i den dannede dupleks, slike andre teknikker kan også omfatte anvendelsen av enzymer, f.eks. immunoperoksydase, eller anvendelsen av elektrontetthetsmarkører, f.eks. immunoferritin, eller andre kjemiske og/eller fysiske markører, som lar seg binde eller er bundet til sonden. Generelt gir utøvelsen av oppfinnelsen teknikker som er sammenlignbare med enzymbundne immunosorbentanalyseteknikker, ikke bare med hensyn på kvali-tet, men også ved den kvantitative bestemmelsen av hybrid-dannelse.

Som angitt er det foretrukket å bruke ELISA-teknikker for

å bevirke eller bringe tilveie ekspresjon eller, kvalitativt eller kvantitativt, indikasjon på den ikke-radioaktivt kjemisk merkede sonden i det dannede dobbeltkjedede eller hybridiserte materialet, slik som dupleksen eller hybridet dannet med den ikke-radioaktive kjemisk merkede DNA-sonden og dens i det vesentlie komplementære genetiske DNA materiale avledet fra det denaturerte, genetiske DNA-materialet som skal identifiseres. I den foretrukkede ELISA-teknikken ifølge oppfinnelsen, festes en-kjedet genetisk materiale, f.eks. DNA,

etter denaturering av DNA-materialet som skal identifiseres for å danne det en-kjedede DNA materialet, til et substrat. Ved utøvelsen av oppfinnelsen er det foretrukket at substratet er et gjennomsiktig substrat, slik som et glass-substrat eller en glassoverflate. Ved å anvende et gjennomsiktig substrat, slik som et glass-substrat, hvortil det en-kjedede DNA-materialet er festet og hybridisert, gir ELISA-teknikken kvalitativ og kvantitativ bestemmelse av DNA-materialet som skal identifiseres. Ved å anvende et gjennomsiktig substrat hvortil DNA-materialet er festet, er fullstendig gjennomførelse av fordelene og allsidigheten ved ELISA-teknikken som anvendes ved utøvelsen av oppfinnelsen, oppnåelig.

Det er kjent å feste enzymer og lignende til kieselholdige materialer og å påvise antistoffer o.l. ved binding av slike materialer som enzymer, antistoffer og antigener til forskjellige substrater, slik som kieselholdige substrater. Se f.eks. US patentskrift nr. 3.669.841, 3.715.278, 3.949,064, 4.001.583, 4.059.685, 4.120.945 og 4.280.992. Ved utøvelsen av oppfinnelsen er det svært ønskelig at fikseringen av det denaturerte en-kjedede genetiske DNA-materialet avledet fra DNA-materialet som skal identifiseres, festes hurtig til substratet, slik som et gjennomsiktig substrat, f.eks.

en glassoverflate. Hurtig fiksering av en-kjedet DNA-materiale til et gjennomsiktig glass-substrat vil tillate hurtig undersøkelse av tallrike prøver som omfatter ELISA-teknikker. F.eks. vil glassplater som er forsynt med en nedsenket pil eller brønner ha prøver på de forskjellige denaturerte genetiske materialene som skal identifiseres, deponert deri, og det en-kjedede DNA-materialet festet til overflaten i brønnene. Deretter deponeres DNA-sonder forsynt med en ikke-radioaktiv kjemisk markør i hver av brønn-ene for hybridisering til et hvilket som helst komplementært enkjedet DNA-materiale som foreligger der. Etter vasking for å fjerne eventuelle ikke-hybridiserte sonder, påvises tilstedeværelsen av eventuelt hybrid-DNA materialet som inneholder det en-kjedede DNA-materialet som skal identifi-

seres og ikke-radioaktive kjemisk merkede sonden, slik som her beskrevet omfattende tilsetningen av et enzymbundet antistoff eller annen egnet ting for binding til den kjemiske markøren i sonden. Deretter tilsettes et passende substrat for å frembringe en fargeendring eller kjemisk reaksjon som så kan måles kolorimetrisk eller fotometrisk.

For å bevirke hurtig fiksering av DNA-materialet, slik som denaturert en-kjedet DNA, til glass, prepareres glasset eller forbehandles ved oppvarming eller koking av glasset, slik som et borsilikatglass, i en tilstrekkelig lang tid f.eks. ca. 45 minutter, i nærvær av en fortynner, f.eks.

5%, vandig salpetersyre. Denne forbehandlingen med salpetersyre tjener til å vaske ut bor-rester fra glassoverflaten. Det behandlede glasset vaskes så eller skylles med vann, fortrinnsvis med destillert vann, og tørkes, slik som ved en temperatur på ca. 115°C i ca. 24 timer. Deretter tilsettes en 10% oppløsning av gamma-aminopropyltrietoksysilan fremstilt ved å oppløse det ovenfor angitte silan i destillert vann etterfulgt av tilsetning av 6N saltsyre inntil en pH på ca. 3,45, til glassoverflaten, og glassoverflaten inkuberes så i kontakt med den ovenfor angitte silan-oppløs-ning i ca. 2-3 timer ved en temperatur på ca. 45°C. Glassoverflaten vaskes så med et like stort volum vann og tørkes over natten ved en temperatur på ca. 100°C. Den resulterende behandlede glassoverflaten har tilgjengelig alkylamin på overflaten som er egnet for immobiliering eller fiksering av en hvilken som helst negativ ladet polyelektrolytt som tilføres. I tilknytning til det ovenfor nevnte, ses Weetal, H.H. og Filbert., A.M. "Porous Glass for Affinity Chromato-graphy Applications", Methods in Wnzymology, vol. XXXIV,Affinity Technigues Enzymes Purification; Part B, side 59-72, W.B.Jakoby og M.Wilchek, red.

For å illustrere utøvelsen av oppfinnelsen ble det fremstilt forskjellige DNA-materialer. F.eks. ble DNA fra bakteriofag T. isolert fra E.coli CR63-kulturer infisert med fag T. AM824 ^4

(44 62 ) og renset for å fjerne alt kromosomalt DNA. Det ble erholdt høyrenset kalvetymus-DNA fra en biologisk lever-andørtjeneste. Bakteriofag lambda ble erholdt ved varme-induksjon av E.coli stamme W3350 lysogent for XC^857 fag og ble anvendt ved fremstillingen av DNA fra lambda-fag. Radioaktiv DNA ble også fremstilt ved hjelp av "skår"-translasjon med ( H) dATP, og DNA fra lambda-fag ble også "skår"-translatert med maltose-triose-dUTP for å innføre glukosyl- eller sakkaridrester i DNA-en. Andre reagenser ble skaffet til veie eller fremstilt, f.eks. lektiner som lett og villig danner et kompleks med glukosylgrupper. Særlig ble Concanavalin A (ConA) erholdt og oppløseliggjort

i 2,OM NaCl ved en konsentrasjon på 50 mg/ml. Det ble også fremstilt fluorescein-merket ConA ved å omsette ConA med fluorescein-isotiocyanat ved et molart forhold mellom FITC

og protein på 3 i 0,IM natriumboratoppløsning ved en pH

på 9,2 og ved en temperatur på 37°C i 60 minutter. Alt ikke-omsatt FITC ble fjernet ved hjelp av gelfiltrering på Sephadex G-50.

Un glassoverflate behandlet slik som beskrevet ovenfor,

ble anvendt ved påvisningen av lektinbinding til glukosylert DNA. Ved denne fremgangsmåten ble glykosylert DNA (T4 DNA) eller ikke-glukosylert DNA (kalvetymus-DNA) tilsatt i porsjoner på 100^1 til behandlede glassrør i triplikatsett. Etter 15-30 minutter ved værelsestemperatur ble oppløsningen fjernet og rørene skyllet forsiktig med PBS.Mg<++->buffer (100 mM Na-K-P04, pH 6,5, 150 mM NaCl og 10 mM MgCl2).

Et sett med rør ble undersøkt etter nærvær av DNA ved farging med etidiumbromid (100[il med 1 mg/ml oppløsning, 30 minutter i mørke, ved værelsestemperatur). Fargingsoppløsningen ble fjernet og rørene skylt og undersøkt under UV-lys.

Vil et annet sett med rør, ble det tilsatt fluorescent-merket ConA (100 ul med 0,1 mg/ml i PBS.Mg<++->buffer). Etter 60 minutter ved værelsestemperatur ble oppløsningen fjernet og rørene ble fylt og undersøkt under UV-lys.

Til det tredje settet med rør ble det tilsatt 100 ul umerket ConA i PBS.Mg<++->buffer. Etter 60 minutter ved værelsestemperatur ble rørene skylt fri for ConA med 0,2M inidazol buffer, pH 6,5.

Så ble sur fosfatase tilsatt (0,005 enheter i 100 ul ved

0,2% fosfatase-fri BSA) og rørene ble inkubert ved værelsestemperatur i 30 minutter. Etter skylling med 0,15 M NaCl (for å fjerne alt ubundet enzym), ble substrat (paranitro-fenylfosfat 0,1 mM i 0,2M Inidazol pH 6,5) tilsatt og inkuba-sjonen fortsatt i 60 minutter ved 37°C. Enzymreaksjonen ble avsluttet ved å tilsette 1,0 ml 0,5% natriumbikarbonat og absorbans ble bestemt ved A3qq-

Ved det observerte røde fluorescenskjennetegn av etidiumbromid indikerte prøveresultatene at både glukosilert og ikke-glukosilert DNA bant seg til den aktiverte glassoverflaten. Dessuten bandt ConA seg bare til glukosilert DNA

som det legges merke til ved den grønne fluorescensen i rør som inneholder T^-DNA, men ikke i rør som hadde kalvetymus-DNA. Videre ga sur fosfatase som er et glukoprotein, positiv reaksjon bare i rør som inneholdt T^DNA og ConA,

men ble vasket ut fra rørene som inneholdt bare ConA eller ConA og kalvetymus-DNA.

Aktiverte glassrør ble også anvendt ved påvisningen av lektinbinding til glukoliserte DNA-sonder hybridisert til DNA

som allerede var immobilisert på glassoverflate. Ved disse prøvene ble DNA fra lambda-fag immobilisert på glassoverflaten. Etter skylling med buffer, ble rørene dekket med 100

ul beleggoppløsning (50% formamid, 5X SSC, 100 ug lakse-sperm-DNA, 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,1% triton X-100,

0,2% BSA og 0,05% SDS) ved 42°C i 90-120 minutter. Belegg-oppløsningen ble fjernet og overflaten ble dekket med 100

ul beleggoppløsning som inneholdt glukosilert "skår"-trans-latert DNA-sonde. Sonden var blitt denaturert ved 80°C

i 3 minutter og avkjølt hurtig på isbad umiddelbart før bruk. Rørene ble så inkubert ved 42°C i 24 timer. Oppløs-

ningen ble fjernet og rørene ble skylt med PBS.MG<++->buffer. Lektin-enzym påvisningssystemet ble avlevert som beskrevet tidligere. Resultatene indikerte at sur fosfatase ikke ble vasket bort fra rørene som inneholdt glukosilert DNA-sonde, mens rør som inneholdt ikke-glukosilert sonde ikke visste noen enzymakaktivitet.

I disse prøvene tjener glukosyl (monosakkarid)-resten av

den glukosylerte DNA-sonden som den ikke-radioaktive kjemiske markør og reagerer med eller tiltrekkes sterkt til lektinet, ConA, og utgjør kombinasjonen mellom lektin-enzym (sur fosfatase) og sondepåvisningssystemet.

I den ovenfor nevnte prøven hvor det anvendes glukosilertt DNA som sonde, mens glukosyl- eller monosakkarid-resten

av den glukosilerte DNA-sonden tjener som den ikke-radioaktaive kjemiske markør, er også sammenlignbare resultater oppnåelige ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelsen under anvendelse av biotinmerket DNA-sonde. Når biotin anvendes som den ikke-radioaktive kjemiske markør i DNA-sonden, og ettersom avidin er sterkt reaktiv med eller sterkt bundet til biotin, vil tilstedeværelsen av den biotinmerkede DNA-sonden bringes for dagen eller påvises ved hjelp av avidin eller streptavidin-merket enzym. F.eks. vil en biotinmerket DNA-sonde lett påvises ved hjelp av et enzymkompleks av typen avidin-biotin-alkalisk fosfatase. Nærmere bestemt vil tilstedeværelsen av den biotinmerkede DNA-sonden lett bringes for daget eller påvises ved å bringe hybridet som inneholder den biotinmerkede sonden i kontakt med enzymkomplekset avidin-biotin-alkalisk fosfatase, etterfulgt av å bringe den resulterende biotinmerkede DNA-sonden med tilknyttet avidin-biotin-alkalisk fosfatasekompleks i kontakt med et egnet substrat som ved fargereaksjon eller bunnfall-dannelse frembragt ved hjelp av den alkaliske fosfatasen, lett ville bli lagt merke til eller være istand til å bli påvist, både kvalitativt og kvantitativt, ved hjelp av fotometriske og/eller kolorimetriske hjelpemidler i overensstemmelse med ELISA-teknikk. Om ønsket, kunne det istedet for

et avidin-biotin-enzym kompleks, brukes et antistoff mot biotin for binding til biotinresten i den biotinmerkede DNA-sonden, etterfulgt av et kompleks som omfatter anti-antistoff-enzym på den måten som er beskrevet ovenfor.

Fordelene ved utøvelsen av oppfinnelsen lar seg også oppnå når DNA-sonden er festet til en plastoverflate, slik som en polystyrenoverflate. Når en plastoverflate anvendes,

er det noen ganger ønskelig for å øke effektiviteten eller enhetligheten av den tilførte DNA, inkludert den ikke-radioaktive kjemisk merkede DNA-sonde, å behandle plastoverflaten, slik som en polystyrenoverflate, for å fremme og ellers forbedre fikseringen eller immobiliseringen av genetisk materiale til den, slik som en-kjedet denaturert DNA eller en ikke-radioaktiv kjemisk merket sonde eller et hybrid-

DNA som inneholder DNA-sonden. Det er f.eks. funnet at adhe-sjonen eller fikseringen av DNA til en polystyrenoverflate forbedres ved å behandlet overflaten slik som indikert ovenfor med en aminosubstituert hydrofob polymer eller materiale, slik som duodekadiamin. En annen teknikk for forbedring av fikseringen eller ensartetheten av plastoverflaten for fiksering av DNA, omfatter behandling av overflaten med polylycin (PPL) .

I prøver som omfatter fikseringen av DNa til en plastoverflate, ble biotinylert DNA denaturert og delt opp i like

TM

store porsjoner i Dynatech, Immulon II fjernbare brønner. Prøver fikk tørke på plastoverflaten ved 37°C. Mengden

av bundet b-DNA ble bestemt ved sekvenstilsetning av anti-biotin antistoff fra geit og anti-geit-antistoff fra kanin bundet i kompleks til alkalisk fosfatase, etterfulgt av fremakalling med p-nitrofenylfosfat i dietanolaminbuffer,

pH 9,6. Enzymaktiviteten ble overvåket ved 405nm under anvendelse av den automatiske Dynatech Micro ELISA Scanner. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for den som foretar undersøkelsen å kvantifisere mengden av bundet DNA og for-siktigvis graden av biotinylering.

For å øke påvisningsfølsomheten, kan et fluorogent substrat, slik som 4-metylumbelliferyl-fosfat eller dets analoger,

med tilhørende enzymer brukes.

Tilleggsprøver ble utført hvor flere alikvoter med denaturert DNA fra adenovirus 2 var bundet til polystyrenplater slik som beskrevet ovenfor. Etter blokkering med Denhardt's formamid-blokkeringsbuffer, ble flere biotinylerte sonder hybridisert til den immobiliserte DNA; disse var B-adeno-2-DNA og lambda DNA. Til et sett immobilisert DNA ble det ikke nedsatt noen sonder. Utstrekningen av hybridisering ble bestemt ved hjelp av antistoff-enzymreaksjonen, slik som beksrevet ovenfor. Det ble funnet at bare den homologe adeno-2-sonden hybridiserte. Denne teknikken viste at in vitro hybridiseringen ved disse betingelser er spesifike og kan overvåkes kvantitativt.

Polystyren fra forskjellige satser eller kilder oppviser forskjellige bindingskapasiteter. Tidligere eksperimenter hadde vist at tilsetningen av duodekadiamin (DDA) til polystyren resulterte i en enhetlig bindingskoeffesient for polystyrenplater fra forskjellige satser.

Ved ytterligere prøver, ble radioaktivt merket, ikke biotinylert denaturert DNA (200 ng til 5 ng) tilført DDA-belagte polystyrenplater. Prøvene eller platene fikk ikke tørke. Etter inkubering ved 37°C i 30 minutter, 1 time, 2 timer, 3 timer, 4 timer og 18 timer, ble prøvene telt. Binding var maksimale etter 2 timer med inkubering, imidlertid bandt 50% av det opprinnelige tilførte DNA uavhengig av konsentra-sjonen og indikerte derved at det er en likevekt mellom bundet og ikke-bundet DNA.

Ved andre prøver ble polystyrenmikrofilterbrønner nitrert ved å bruke en fremgangsmåte til Filipsson og Hornby (Biochem J. 120 215 (1970)). Polystyrenbrønnene ble senket ned i

en blanding av konsentrert salpeter- og svovelsyre (41%,

volum/volum) i 20 minutter og avkjølt til 0°C. Brønnene ble så vasket grundig med vann og deretter oppvarmet til 70°C i en 6% oppløsning av natriumditionat i 2M kaliumhydrok-syd. Etter 4 timer ble brønnene vasket grundig med 0,5M saltsyre og destillert vann.

For å fremstille 6-aminoheksan bundet polystyren, ble 6-aminokaproinsyre-N-hydroksysuccinimidester.hydrobromid (5

mg av denne oppløst i 0,2M dimetylformamid fremstilt ved omsetning av 6-aminokaproinsyre.hydrobromid med N-hydroksy-succinimid og dicykloheksylkarbodiimid i dimetylformamid og rekrystallisert fra isopropylalkohol) tilsatt til 0,IM natriumborat (0,4 ml). Mikrofilterbrønner av aminoderivati-sert polystyren fylt med denne oppløsningen fikk reagere ved værelsestemperatur i 4 timer og ble deretter grundig vasket med destillert vann. De resulterende behandlede brønner absorberte 3 ri-merket DNA fra vandig oppløsning ved pH mindre enn 9,5.

Som angitt ovenfor, forbedres kieselholdige substrater,

slik som glass-substrater, og plastsubstrater, slik som polystyrensubstrater, med hensyn til evnen til fiksering eller immobilisering av DNA ved behandling med eller ved å forsyne dem med et belegg av en epoksyharpiks. F.eks. forbedres glass- og polystyrenoverflater med hensyn til fikseringen eller immobiliseringen av DNA ved behandling av glass- eller polystyrenoverflater med epoksylim som er tilgjengelig i handelen, slik som en oppløsning av epoksylim i etanol (1% vekt/volum). Disse epoksyoppløsningene tilføres glasset, f.eks. Pyrex, glassoverflater eller poly-styrenoverf later , eller brønner, og oppløsningsmidlet, etanol, avdampes deretter ved en temperatur på 37°C, for derved å gi et polyamin-polymert belegg på den således behandlede overflate. Disse overflatene ble funnet å absorbere 3 H-merket DNA fra vandig oppløsning ved pH mindre enn 9,5.

Fremgangsmåtene beskrevet ovenfor med hensyn til ELISA-lign ende teknikker for den kolorimetriske eller fotometriske bestemmelse av de hybridiserte sondene, omfatter enzymbundne reagenser som gir en fargeendring i et substrat eller et bunnfall. Forskjellige kombinasjoner av enzymer og farge-produserende substrater kan anvendes. Se f.eks. tabellene nedenunder, tabell I og tabell II, som viser kombinasjonen av enzymer og kromogener. I tabell I er kromogenet i substratet reativt med det anvendte enzymet på en slik måte at det bringer for dagen eller bestemmer nærværet av ikke-radioaktiv kjemisk merket sonde. Fotnoten (F) angir at kromogenet fluoresceres. I tabell II nedenfor er det vist de kromogene som gir et uoppløselig produkt, slik som når de anvendes med avidin/streptavidin-systemet. Disse kombina-sjonene av enzym-kromogen er særlig nyttige i ELISA-teknikker for bestemmelsen, både kvalitativt og kvantitativt, av hybrid-DNA-en eller annet genetisk materiale som inneholder den spesielle ikke-radioaktive kjemisk merkede sonde i henhold til oppfinnelsen.

Som det vil være åpenbart for fagmenn innen teknikken, i

lys av beskrivelsen ovenfor, er mange forandringer, modifika-sjoner og substitusjoner mulige ved utøvelsen av oppfinnelsen uten å forlate ånden eller omfanget av oppfinnelsen.

Claims (21)

1. Substrat, karakterisert ved at det til substratet er festet et dobbelt-kjedet polynukleotid hvor en av kjedene i det dobbelt-kjedede polynukleotidet er et ikke-radioaktivt, kjemisk merket polynukleotid eller omfatter et ikke-radioaktivt, kjemisk merket nukleotid som en nukleotidbestanddel i kjeden.

2. Substrat ifølge krav 1, karakterisert ved at det kjemisk merkede nukleotidet er forbindelsen

hvor B er en purin-, 7-deazapurin- eller pyrimidin-rest som er kovalent bundet til C 1 -1stillingen i sukkerresten, forutsatt at når B er purin eller 7-deazapurin, er den bundet i N 9-stillingen i purinet eller deazapurinet, og nar B er pyrimidin, er den bundet i N^-stillingen; hvor A er en rest som består av minst 3 karbonatomer som er istand til å danne et påvisbart kompleks med et polypeptid når forbindelsen innlemmes i en dobbelt-kjedet ribonukleotid-syre, deoksyribonukleinsyredupleks eller et DNA-RNA-hybrid; hvor den prikkede linjen er en binding eller gruppe som knytter B og A sammen, forutsatt at dersom B er purin, er bindingen festet i 8-stillingen i purinet, dersom B er 7-deazapurin, er bindingen festet i 7-stillingen i deazapurinet, og dersom B er pyrimidin, er bindingen festet i 5-stillingen i pyrimidinet; og hvor hver av x, y og z er

3. Substrat ifølge krav 1, karakterisert ved at det kjemisk merkede nukleotidet har formelen

hvor hver av B, B <1> og B" er en purin-, deazapurin- eller pyrimidinrest som er kovalent bundet til C 1 '-stillingen i sukkerresten, forutsatt at når B, B <1> eller B" er pyrin eller deazapurin, er den festet i N 9-'stillingen i purinet eller deazapurinet, og når B, B' eller B" er pyrimidin, er den festet i N^-stillingen; hvor A er en rest bestående av minst 3 karbonatomer som er istand til å danne et påvisbart kompleks med et polypeptid når forbindelsen innlemmes i en dobbeltkjedet dupleks dannet med et komplementært ribonuklein- eller deoksyribonuklein-syremolekyl; hvor den prikkede linjen er en kjemisk binding eller gruppe som knytter B og A sammen, forutsatt at dersom B er purin, er bindingen festet i 8-stillingen i purinet, dersom B er 7-deazapurin, er bindingen festet i 7-stillingen i deazapurinet og dersom B er purimidin, er bindingen festet i 5-stillingen i pyrimidinet; hvor z er H- eller H0-; og hvor m og n er hele tall fra 0 og opp til ca. 100 000.

4. Substrat ifølge krav 1, karakterisert ved at det kjemisk merkede nukleotidet har den generelle formel

hvor P er fosforsyreresten, S er sukker- eller monosakkarid-resten og B er baseresten, idet nukleotidet har kovalent festet til P- eller S- eller B-resten en kjemisk rest Sig, idet når den kjemiske Sig-resten er festet til P-resten, er den festet via den kjemiske bindingen

og når Sig er festet til S-resten, er S-resten en ribose-gruppe, idet når den kjemiske resten Sig er festet til P, S eller B, er den istand til å signalisere seg selv eller gjøre seg selvpåvisbar eller sin tilstedeværelse kjent.

5. Substrat ifølge krav 1, karakterisert ved at det kjemisk merkede polynukleotidet omfatter eller har bundet til seg en aminosyre eller et polypeptid som omfatter en kovalent bundet kjemisk Sig-rest, idet den kjemiske Sig-resten er istand til å signalisere seg selv eller gjøre seg selv påvisbar eller sin tilstedeværelse kjent.

6. Substrat ifølge krav 5, karakterisert ved at den kjemiske Sig-resten omfatter en sakkarid-bestanddel.

7. Substrat ifølge krav 1, karakterisert ved at det kjemisk merkede polynukleotidet omfatter eller har bundet til set et monosakkarid eller polysakkarid som omfatter en tilknyttet kjemisk Sig-rest, idet den kjemiske Sig-resten er istand til å signalisere seg selv eller gjøre seg selv påviselig eller sin tilstedeværelse kjent.

8. Substrat ifølge krav 1, karakterisert ved at substratet er gjennomsiktig og hvor substratet er tilpasset for transmisjon av lys gjennom det for fargestemmelse eller kolorimetrisk bestemmelse av det dobbelt-kjedede polynukleotidet.

9. Fremgangsmåte for å bestemme tilstedeværelsen av et utvalgt genetisk materiale, karakterisert ved at den omfatter å behandle en prøve som inneholder det utvalgte genetiske materialet for å denaturere dette og derved gi en enkelt kjede avledet fra det genetiske materialet, feste den oppnådde enkeltkjeden av genetisk materiale til en overflate, bringe den således fikserte enkelt-kjeden med genetisk materiale under hybridiserende betingelser i kontakt med en ikke-radioaktiv kjemisk merket polynukleotidsonde som i det vesentlige er komplementært til nukleotidbestanddelene som kjennetegner det genetiske materialet som skal bestemmes, og påviser dupleksdannelse mellom enkelt-kjeden med genetisk materiale og den ikke-radioaktive kjemisk merkede polynukleotidsonden.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at overflaten er en glassoverflate og hvor det en-kjedede genetiske materialet er festet til en brønn som er anordnet på overflaten, idet overflaten er tilpasset transmisjon av lys for den fotometriske eller kolorimetriske bestemmelse av dupleksdannelsen mellom det en-kjedede genetiske materialet og polynukleotidsonden.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at dupleks- eller dobbeltkjede-dannelse eller hybridisering mellom det en-kjedede genetiske materialet og den ikke-radioaktive kjemisk merkede polynukleotid-sonden bestemmes ved å tilføre den kjemiske markøren festet til polynukleotidsonden, før eller etter dupleksdannelse, med et gelateringsmiddel og synliggjøre tilstedeværelsen av gelateringsmidlet ved å bringe gelateringsmidlet i kontakt med et substrat som gjennomfør en kjemisk reaksjon eller fargeendring når det kommer i kontakt med gelateringsmidlet.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at synliggjøringen av tilstedeværelsen av gelateringsmidlet utføres ved å bringe gelateringsmidlet i kontakt med et substrat som gjennomfør en kjemisk reaksjon når det kommer i kontakt med gelateringsmidlet.

13. Gjennomsiktig glassoverflate egnet for fiksering av genetisk DNA-materiale, karakterisert ved at det til glassoverflaten er bundet eller fiksert aminogrup-per .

14. Fremgangsmåte for å fremstille en overflate valgt fra gruppen bestående av en glassoverflate eller en plastoverflate for fiksering av genetisk materiale, karakterisert ved å bringe overflaten i kontakt med amin- og herdingsbestanddelene i et epoksylim for å danne et belegg av epoksylim.

15. Planformet, gjennomsiktig glassplate, karakterisert ved at den er forsynt med rekker av brønner eller nedsenkninger dannet på overflaten, idet det til overflaten i brønnene eller nedsenkningene er fiksert dobbeltkjedet polynukleotid, hvor en av kjedene i det dobbeltkjedede nukleotidet er et ikke-radioaktivt kjemisk merket polynukleotid eller omfatter et ikke-radioaktivt kjemisk merket nukleotid som en nukleotidbestanddel i den ene kjeden.

16. Gjennomsiktig glassbeholder eller kyvette, karakterisert ved at den er forsynt med plane vegger, hvor det til den indre overflaten i beholderen er festet dobbeltkjedet polynukleotid, idet en av kjedene i det dobbeltkjedede polynukleotidet er et ikke-radioaktivt, kjemisk merket polynukleotid eller omfatter et ikke-radioaktivt kjemisk merket nukleotid som en nukleotidbestanddel i den ene kjeden.

17. Fremgangsmåte for å påvise tilstedeværelsen eller identiteten av genetisk DNA materiale, karakterisert ved å avsette en prøve av genetisk materiale på en inert gjennomsiktig eller gjennomskinnelig bæreroverflate, behandle prøven for å feste det genetiske DNA materialet til bæreren, hovedsakelig i en-kjedet form, bringe det fikserte en-kjedede, genetiske DNA-materialet i kontakt med en ikke-radioaktiv kjemisk merket sonde som har en nukleotidsekvens med minst ca. 25 baser, i det minste hovedsakelig komplementær med nukleotidsekvensen i det genetiske DNA-materialet, idet den kjemisk merkede sonden inneholder et kjemisk merket nukleotid ifølge krav 5, og idet kontaktbringelsen skjer under hybridiserende betingelser ved en på forhånd bestemt stringens, og påvise dupleksdannelse av det genetiske DNA-materialet som er festet til bæreroverflaten ved hjelp av den kjemisk merkede sonden.

18 . Substrat ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte substrat velges blant gruppen bestående av glass, glass-belagte stoffer, plaster, plastbelagte stoffer, silisiumholdige materialer, cellulose, nitrocellu-lose eller dekstran og der den kjemisk merkede del av det ikke-radioaktive kjemisk merkede nukleotid omfatter en enzym-komponent som ved kontakt med et kromogen gir et uoppløselig, farget bunnfall eller produkt for å indikere, definere eller å påvise nærværet og/eller posisjonen for det dobbelt-stren-gede polynukleotid på substratet.

19. Fremgangsmåte for å påvise eller bringe for dagen tilstedeværelsen av en patogen i en klinisk prøve som misten-kes for å inneholde patogenen, karakterisert ved å deponere prøven på et substrat, behandle prøven for å feste genetisk materiale fra en hvilken som helst av patogenene som er tilstede i prøven til substratet, hovedsakelig i en-kjedet form, bringe det festede en-kjedede genetiske materialet i kontakt med en ikke-radioaktiv kjemisk merket polynukleotidsonde som har en nukleotidsekvens som i det vesentlige er komplementær med nukleotidsekvensen til det en-kjedede genetiske materialet festet til substratet, idet kontaktbringelsen skjer under hybridiserende betingelser ved en på forhånd bestemt stringens for å bevirke dupleksdannelse mellom det en-kjedede genetiske materialet og den ikke-radioaktive kjemisk merkede polynukleotidsonden, tilsette eller feste til den kjemiske markørresten fra den ikke-radioaktive kjemisk merkede polynukleotidsonden et kompleks som omfatter en enzymbestanddel som etter kontakt med et kromogen gir en uoppløselig farget utfelling eller produkt, og bringe det således dannede dupleks som omfatter den kjemisk merkede polynukleotidsonden og det en-kjedede genetiske materialet i kontakt med kromogenet for å gi den uoppløselige fargede utfellingen eller produktet, for derved å påvise eller bringe for dagen eller definere tilstedeværelsen av det en-kjedede genetiske materialet avledet fra patogenen på substratet.

20. Fremgangsmåte for å bestemme tilstedeværelsen av et utvalgt en-kjedet genetisk materiale som er blitt fiksert til et substrat, karakterisert ved å bringe det fikserte en-kjedede genetiske materialet i kontakt under hybridiserende betingelser med en kjemisk merket en-kjedet polynukleotidsonde som har en nukleotidsekvens tilstrekkelig komplementær med nukleotidsekvensen som kjennetegner det utvalgt en-kjedede genetiske materialet, for å bevirke hybridisering av den en-kjedede polynukleotid-sonden med det en-kjedede genetiske materialet, tilsette for binding til den kjemiske markør-resten i den kjemisk merkede polynukleotid-sonden en kjemisk bestanddel som etter kontakt med et kromogen er istand til å gi en uoppløselig farget utfelling eller produkt, og bringe det resulterende dannede hybridet som omfatter den kjemisk merkede polynukleotid-sonden og det en-kjedede genetiske materialet, i kontakt med kromogenet, slik at den uoppløselige, fargede utfellingen eller produktet produseres, og derved bestemme eller bringe for dagen eller definere tilstedeværelsen på substratet av det utvalgte en-kjedede, genetiske materialet.

21. Innretning eller system for å påvise eller måle en fargeendring eller kjemisk reaksjon kolorimetrisk eller fotometrisk, karakterisert ved at den eller det omfatter et gjennomsiktig substrat hvortil det er bundet eller festet en en-kjedet,.kjemisk merket DNA-sonde hybridisert til et komplementært en-kjedet DNA-materiale, idet det til den kjemiske markøren er bundet et enzymkompleks, midler for å tilsette et kjemisk substrat for å bringe enzymkomplekset bundet til den kjemiske markøren i den hybridiserte en-kjedede DNA-sonen som er bundet til eller festet til det gjennomsiktige substratet, i kontakt for å generere en fargeendring eller en fotometrisk påvisbar, kjemisk reaksjon ved omsetning mellom enzymkomplekset og det kjemiske substratet, midler for å belyse eller sende lys mot eller gjennom det gjennomsiktige substratet som inneholder enzymkomplekset som er involvert i fargeendringen eller den kjemiske reaksjonen, som omfatter midler for kolorimetrisk eller fotometrisk påvisning av fargeendringen, eller fotometrisk påvisbar kjemisk reaksjon tilveiebragt ved kontakt mellom enzymkomplekset og det kjemiske substratet.