NO793501L - Fremgangsmaate for fremstilling av et antihemofilifaktorpreparat fra menneskeblodplasma - Google Patents

Abstract

"Fremgangsmåte for fremstilling av et antihemofili-faktorpreparat fra menneskeblodplasma".

Description

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde af den i

krav l's indledning angivne art til fremstilling af et antihæmofilifaktorpræparat (AHF).. "

En meget væsentlig egenskab ved normalt blod er dets evne til

at koagulere, når det kommer uden for de kar, dets kredsløb forløber i, d.v.s. ved blødning. Der-er gennem årene udført omfattende arbejde for at klarlægge de mekanismer, der virker ved blodets koagulering. Man antager, at der findes et antal komponenter, som deltager i blodets koaguleringssystem, og at deres antal er tolv. Komponenterne benævnes normalt koagula-tionsfaktorer med et vedføjet rpmertal I - XII..

Koagulationsfaktor VIII, som denne opfindelse omhandler, benævnes også antihæmofilifaktoren (forkortet AHF) og er et protein med stor molekylvægt. Det er til stede i meget små mængder i blodplasma, idet den normale koncentration deraf er ca. 10

mg/l plasma.

Den kendte og arvelige blødersygdom, også kaldet hæmofili A,

er karakteriseret ved fraværet af den biologisk aktive koagulationsfaktor VIII (AHF). Kraftig hæmofili viser sig som stærkt forøget blødningstendens, ved hvilken det mindste sår giver anledning til livstruende blødning. Sygdommen viser sig i meget ung alder, og der kan optræde mange forskellige komplikationer. Det er for eksempel meget almindeligt, at patienterne får gentag-ne ledblødninger, som fører til betændelse i leddene-, hvilket i det lange løb indebærer invaliditet. På den måde kan alvorligt angreone hæmofili-patienter allerede i 20 års alderen være in-vaiiderede, hvis ikke de til stadighed behandles med præparater, der indeholder AHF.

Det er kendt at fremstille AHF dels som lavkoncentrerede præparater (kryopræcipitat/intermediær purity) og dels som høj-koncentrerede præparater (high purity præparater).

De lavkoncentrerede præparater er især de såkaldte kryopræci pitater, d.v.s. den ved nedfrysning opnåede uopløselige frakt ion, der findes i blodplasma, og som under genoptøning-<*>ved lav temperatur forbliver uopløselig. Kryopræcipitatet indeholder væsentligst AHF og store mængder fibrinogen.

En sådan optøning udføres sædvanligvis ved anvendelse af vandbad eller ved langsom optøning i rum, hvor temperaturen holdes på 4°C. Efter optøning udføres kun simple operationer, såsom filtrering, centrifugering samt frysetørring, jfr. J. Pool, .-. E.K. Hershgold og A. Pappenhagen, Nature 203, 1964, s. 312.

Et nogenlunde tilsvarende præcipitat kan opnås ved at anvende den kendte Cohns fraktionering (fraktion 1-0). Her sker fæld-ningen ved tilsætning af alkohol, og det opnåede produkt indeholder væsentligt mere fibrinogen end. kryopræcipitatet..

Cohns fraktion 1-0 er beskrevet af M. Blomback i Arkiv Kemi

12 (1958, side 387). En kombination af disse to principper er beskrevet i U.S.A. patentskrift nr. 3.652.530..;._>..»

Ved disse metoder får man et bundfald, der som nævnt især indeholder AHF og fibrinogen, det sidste i ret stor mængde. På grund af den enkle, men dog ret tidskrævende proces kan man opnå et nogenlunde godt udbytte på 30-40% af det totale indhold af AHF i plasmaet, men som følge af anvendelsen af alkohol og en langsom optøning af det frosne plasma, udsættes AHF i nogen grad for denaturering, således at den biologiske aktivitet, og:dermed halveringstiden, hvorved forstås den tid, der forløber, indtil den biologiske aktivitet er faldet til halvdelen af initialaktiviteten,-nedsættes.

Den væsentlige mangel ved disse præparater er imidlertid deres ringe opløselighed, der bevirker, at der kræves 35-100 ml væske for at opløse en mængde af præparatet, som svarer til 500 enheder AHF, og derfor kræves lægelig assistance til infusionen.

En hensigtsmæssig behandling af hæmofilipatienter vil allerede idag og fremover i stigende grad kræve, at patienten selv kan injicere en dosis af den manglende blodfaktor (AHF). Da injek-tionsvolumener, som skal indtages uden lægehjælp, ikke bør overstige 20-30 ml, kræver dette, at produktet har stor oplø-selighed, således at der i et opløsningsvolumen på 20-30 ml kan indeholdes ca. 500 enheder AHF.

Dette kan opnås med de højkoncentrerede præparater (high purity), der kan fremstilles ud fra kryopræcipitater eller Cohns fraktion 1-0, som ovenfor beskrevet, idet man i flere trin oprenser det udvundne fældningsprodukt, d.v.s. i det væsentlige fjerner fibrinogen, jfr. f.eks. U.S.A. patentskrift nr. 3.652.530.

Hea disse metoder kan man ganske vist opnå præparater med en genneagående meget stor opløselighed, idet det til opløsning af 500 enheder AHF fornødne opløsningsvolumen, alt efter den anvendte metode, varierer fra 15-25 ml, men metoderne er b.ehæf-tet med meget væsentlige ulemper, nemlig et væsentligt forrin-get udb3'-tte, idet man kun kan isolere 10-20% af det i blodplasmaet indeholdte AHF, og en væsentligt nedsat halveringstid, der kun er på 4-5 timer, mens halveringstiden for "nativt" AHF er 12 timer. På grund af udgangsmaterialets begrænsede mængde er dette naturligvis særdeles uhensigtsmæssigt.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at angive en enkel og hurtig fremgangsmåde til fremstilling af et AHF-præparat i højt udbjrcte og med stor opløselighed ved optøning af dybfros-sent plasma og dannelse af et kryopræcipitat, hvorfra AHF iso-leres.

Opfindelsen hviler på den erkendelse, at omfattende og langva-rige bearbejdninger af blodplasmaet og dets fraktioner har en nedbrydende virkning på plasmaproteinerne, og at udbyttet og opløseligheden derfor forbedres, hvis man gennemfører optønin-gen og isolerer kryopræcipitatet på kortest mulig tid under nøje temperaturkontrol og i fravær af kemiske midler, idet man

herved kan minimere nedbrydningen af AHF. Det har vist sig,

at disse krav på fordelagtig vis tilfredsstilles ved at gennem-føre optøningen eller i det mindste den sidste del af denne ved bestråling med elektromagnetiske bølger, fortrinsvis mikro-bølger eller bølger i det infrarøde område. Behandlingen gen-nemføres, mens plasmaet endnu befinder sig under sterile betin-gelser i den pose, hvori det er nedfrosset, hvilket fortrinsvis er en 200 ml pose.

Af det ovenfor anførte fremgår det, at den hurtige optøning har betydning ikke alene for AHF, men at alle plasmaproteiner skånes, således at processer, der rettes mod andre plasmaproteiner, også begunstiges af metoden.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er af den i kravets indledning anførte art, er derfor ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte. Det har overraskende vist sig, dels at det opnåede produkt gav et meget højt udbytte,

op til 50% af det i blodplasmaet indeholdte AHF, dels at halveringstiden er forøget, og dels at produktet er karakteriseret ved en meget stor opløselighed. Det er således muligt at op-løse 500 enheder i et opløsningsvolumen på 25 ml. Det antages, at en medvirkende faktor ved dette forhold er, at den fore-slåede optøning kun medfører en ringe denaturering af såvel AHF som fibrinogen, hvorfor disses opløselighedsegenskaber ikke forringes.

Man har ganske vist tidligere erkendt, at visse kliniske situa-tioner, såsom massive blødninger under åbne hjerteoperationer, kræver at man hurtigt kan disponere over store mængder blodplasma, samt at tilførsel af specifikke plasmakomponenter, såsom kryopræcipitat, ikke altid er tilstrækkelig til at overvinde en hæmostatisk mangel hos patienten. Af denne årsag er man nødt til at have store mængder.. optøet plasma stående klar til brug, idet det tager lang tid aVtø plasmaet op. Dette bevirker en uønsket ødelæggelse bl.a. af plasmaets koagulations-faktorer ved henstanden i optøet tilstand. For at råde bod her-på foreslås det af Sherman og Dorner, Transfusion, Nov.-Dec. 1974, vol. 14, no. 6, p. 595-97 at foretage en mikrobølgeop-tøning af det nødvendige plasma inden brugen, så det umiddelbart kan indgives i patienten, eller med andre ord bibringes en temperatur, der ligger i omegnen af patientens legemstemperatur (37°C). Sherman og Dorner har ganske vist ved bestemmelse umiddelbart efter optøningen påvist, at plasmaets koagulationsfakto-rer ikke ødelægges i højere grad end ved en traditionel optø-ning ved 37°C, hvilket dog for AHF-faktorens (VIII) vedkommende er så højt som ca. 25% i forhold til den oprindelige mængde. Sherman et al. har imidlertid alene sigtet på at dokumentere, . at det optøede hele plasma risikofrit kan indgives ved et akut opstået behov, og har end ikke antydet, at plasmaet skulle være anvendeligt til udvinding af faktorerne, men tværtimod fremhæ-vet, at det kan være påkrævet yderligere at. tilsætte specifikke faktorer i specielle tilfælde.

Til sammenligning kan anføres, at man ved en faktor Vlll-bestemmelse analogt med Sherman på et plasma optøet ifølge opfindel-sén genfinder 90-100% af det totale indhold af faktor VIII i plasmaet. Heraf går ca. 60-70% i kryopræcipitatet, mens res-ten forbliver i opløsning i kryosupernatanten.

Sherman sigter, som det vil forstås, på en helt anden opgave-løsning end AHF-fremstilling, og indeholder således ikke nogen direkte inspiration hertil. Fagmanden ville ikke kunne forudse, at det overhovedet var muligt at styre en mikrobølgeoptøning af blodplasma, så man opnår et kryopræcipitat, idet han måtte på-regne, at den optøede del af plasmaet ville opvarmes til kogning på grund af den store forskei i dielektricitetskonstanten for vand (optøet plasma) og is (endnu frosset plasma). Sådanne vold- somme temperaturforskelle gør det a priori utænkeligt, at man kan overholde de for kryopræcipitatdannelse nødvendige kontrol-lerede temperaturbetingelser. Sherman skal nødvendigvis hur-tigst muligt bringe samtlige faktorer i opløsning og behøver ikke at interessere sig for temperaturforskelle i plasmaet under optøningen. Specielt ville fagmanden ikke kunne forven-te, at det var muligt at opnå et letopløseligt kryopræcipitat : i godt udbytte.

Den i krav 1 angivne temperatur på 10°C repræsenterer den prak-tiske overgrænse for bevarelsen af ét kryopræcipitat, idet dette ved højere temperaturer vil gå i opløsning.

Et egnet temperaturområde er -KL - 6°C, idet man med fordel påser, at temperaturen under bestrålingen intetsteds overstiger 4°C. Ved denne temperatur opnås en passende afbalance-ret lav opløselighed af kryopræcipitatet og samlet bestrålings-tid, der kan :indskrænkes til ca. 4-5 minutter.

For at lette behandlingen med elektromagnetiske bølger kan man med fordel foretage en forvarmning, f.eks. til henimod 0°C, eksempelvis ved at lade posen med det frosne plasma henligge en passende tid, f.eks. ca. 1/2 time ved stuetemperatur, eller i køleskab eller i et vandbad. Forvarmningen kan også foretages ved at udsætte plasmåposen for en bestråling med elektromagnetiske bølger i kortere eller længere tid. Disse bestrålin-ger kan dog om ønsket også anvendes under hele optønings-processen, hvorunder man kan anvende bølger med samme eller forskellige frekvenser.

Mikrobølgeopvarmningen kan foretages i en kommercielt tilgænge-lig mikrobølgeovn, eksempelvis Husquarna model 105, der afgiver mikrobølger ved en frekvens på.2450 MHz, hvilket giver en tilstrækkelig indtrængningsdybde til at optøningen foregår i løbet af et passende kort tidsrum. Afgørende er blot, at den samlede bestråling gennemføres på en sådan måde, at den gen-nemsnitlige antenneeffekt er tilstrækkelig lav til at temperaturen på intet tidspunkt overstiger 10°C. Efter omstændig-hedeme kan bestråling derfor gennemføres periodevis eller kontinuerligt.

Den hensigtsmæssige opvarmningstid varierer i øvrigt med den anvendte ovntype, specielt dennes antenneeffekt, og den anvendte frekvens, samt plasmaets form, findelingsgrad \ dg : udgangs-temperatur, og kan fastlagges ved forsøg. Den foretrukne frekvens er 2 x IO<9>- 3 x 10<l0>Hz.

Det under optøningen udfældede bundfald,. kryopræcipitatet, op-arbejdes på i og for sig kendt måde ved centrifugering ved lav temperatur (-KL - -j-4°C), genopløsning i en passende fysiolo-gisk anvendelig puffer, f.eks. en citrat-glucose puffer,

pH ca. 6,5.

Det genopløste kryopræcipitat filtreres og kan derefter dispenseres på infusionsflasker i mængder svarende til ca. 500 enheder AHF, og kan med fordel frysetørres. Det færdige præparat gen-opløses før brugen fuldstændigt i 25 ml vand og er derfor vel-egnet til injektion ved hjemmebrug.

I nedenstående tabel er præparatet fremstillet ifølge opfindelsen sammenlignet med gængse kommercielle præparater. Det ses af

tabellen, at præparatet fremstillet ifølge opfindelsen, sammenlignet med kryopræcipitat/intermediær purity præparaterne, abso-lut står på højde med de bedste produkter, for så vidt angår udbytte og halveringstid. Med hensyn til opløselighed opnås med det omhandlede præparat værdier, der er næsten 3 gange bedre end de nævnte kendte produkter. Sammenlignet med high purity præparaterne har præparatet fremstillet ifølge opfindelsen en opløselighed, der er på højde med disses, mens værdien for udbytte og halveringstid er ca. 3 gange bedre end for high purity præparaterne.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere ved nedenstående eksempler.

Eksemoel 1 Som udgangsmateriale anvendes human blodplasma i frossen tilstand og indeholdt i plasticposer å 200 ml. De dybfrosne poser forvarmes ved henstand i stuetemperatur i 3/4 time, hvorefter indholdet findeles ved mekanisk bearbeidning. Posen anbringes demæst i en mikrobølgeovn, Husquarna mikrobølgeovn model 105 (2450 MHz). Der anbringes 4 poser a 200 ml i hver ovn af oven-nævnte type. Efter en samlet optøningstid på 4 1/2 minut (7 cykler å 15 sek. puls og 30 sek. pause) er posernes indhold op-tøet uden at temperaturen oversteg 4°C. Det herved udfældede bundfald, kryopræcipitatet, fracentrifugeres (10.000 g, T = 4°C, 15-20 min.), hvorefter det genopløses i en citrat-glucose puffer indeholdende 0,5 g citrat/l.og 25 g glucose/1. pH =

6,5 indstilles med saltsyre.

Til hvert fracentrifugeret bundfald anvendes et volumen puffer, der svarer til ca. 1/25 af det oprindelige blodplasmavolumen.. Det genopløste kryopræcipitat filtreres dernæst gennem et 8<y>um filter. Efter filtreringen dispenseres opløsningen i 100 ml infusionsflasker med 50 ml pr. flaske.

Demæst spinfryses opløsningen (-4o°C), hvorefter der fryse-tørres i en v/KF frysetørrer i 24 timer.

Det færdige præparat indeholder 500 E faktor VIII (±20%) pr. flaske, som kan genopløses inden brug i 25 ml vand.

Eksempel 2

Optøningen og oparbejdningen foretages som i eksempel 1 med undtagelse af, at det dybfrosne plasma forvarmes ved en kort-varig optøning i mikrobølgeovnen (2 cykler å 30 sek. puls og 1 minut pause). Eiter oparbejdningen opnåedes et frysetørret præparat med samme gode opløseligheds- og styrkeegenskaber som i eksempel 1.

Eksempel 5

Poser af samme type som anvendt i eksempel 1 anbragtes fra

dybfrossen tilstand i mikrobølgeovnen og optøs helt ved lang-varig bestråling med kortvarige mikrobølgeimpulser (32 cykler a 5 sek. puls og 55 sek. pause). Det herved dannede kryopræcipitat oparbejdedes som i eksempel 1 og førte til et præparat med samme gode opløseligheds- og styrkeegenskaber som i eksempel 1 og 2.

Eksempel k ■■ Poser af samme type som i eksempel 1 anbragtes fra dybfrossen tilstand i en mikrobølgeovn, der var ombygget til at afgive en antenneeffekt på ca. 10% af den i eksempel 1 anvendte ovns antenneeffekt. Poseme optøedes ved kontinuert mikrobølgebestrå-ling i ca. 1/2 time. Det dannede kryopræcipitat oparbejdedes som i eksempel 1 og førte til et præparat med samme gode opløselig-heds- og styrkeegenskaber som i eksempel 1.

Eksempel 5

En plasticpose med ca. 200 ml dybfrossen plasma forvarmes, idet den udsættes for elektromagnetisk stråling i det infrarøde område i 5 minutter og med en intensitet af 2 W/cm 2.

Efter forvarmningen findeles posens indhold ved mekanisk be-arbejdning, hvorefter posen igen udsættes for infrarød stråling og nu med en intensitet af 0,5 W/cm . Efter ca. 15 minutter er posens indhold passende optøet, og der fortsættes som i eksempel 1. Det opnåede præparat havde samme gode opløselig-heds og styrkeegenskaber som i eksempel 1.

Eksempel 6

En plasticpose med ca. 200 ml plasma forvarmedes analogt med eksempel 5 ved infrarød bestråling i 5 minutter ved 2 W/cm 2.

Efter forvarmningen findeles posens indhold og posen anbringes i den i eksempel 1 anvendte mikrobølgeovn og optøs analogt med eksempel 1. Den videre oparbejdning som i eksempel 1 førte til et præparat med samme gode opløseligheds- og styrkeegenskaber.

Claims (7)

1. Fremgangsmåde til fremstilling, af et antihæmofilifaktorpræparat (AHF) ved optøning af dybfrosset humant blodplasma, centrifugering af det optøede produkt til dannelse af et kryopræcipitat, genopløsning af præcipitatet i en puffer og isolering af en koncentreret opløsning, der om ønsket frysetørres, kendetegnet ved, at man helt eller delvis optør det frosne plasma ved bestråling med elektromagnetiske bølger med en frekvens på ca. IO <8> - lO1^ Hz i et sådant tidsrum og med en sådan energiindstråling,. at temperaturen i det optøede blodplasma intetsteds overstiger 10°C.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bestrålingen udføres således, at temperaturen i det optøede plasma intetsteds overstiger 4°C.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at bestrålingen sker med mikrobølger med en frekvens på 10S - 3 x 10 <11> Hz, fortrinsvis 2 x IO <9> - 3 x 10 <10> Hz.

4. Antihæmofilifaktorpræparat (AHF) med høj opløselighed og lang halveringstid fremstillet ved optøning af dybfrosset humant blodplasma, centrifugering af det optøede produkt til dannelse af et kryopræcipitat, genopløsning af præcipitatet i en puffer og isolering af en koncentreret opløsning, der om ønsket frysetørres, kendetegnet ved, at optøningen af det frosne plasma helt eller delvis er gennemført ved bestråling med elektromagnetiske bølger med en frekvens på ca.

10 - 10 Hz i et sådant tidsrum og med en sådan energiindstråling, at temperaturen i det.optøede blodplasma intetsteds overstiger 10°C.

5. Antihæmofilifaktorpræparat ifølge krav 4, kendetegnet ved, at ontøningen er. gennemført ved bestråling med mikro-8 11 bølger med en frekvens på 10 - 3 x 10 Hz, fortrinsvis

2 x IO <9> - 3 x 10 <10> Hz.

6. Antihæmofilifaktorpræparat fremstillet ved. fremgangsmåden ifølge krav 1-3.

7. Antihæmofilifaktorpræparat fremstillet som beskrevet i eksemplerne 1-5.