DK143837B - Fremgangsmaade til fremstilling af et antihaemofilifaktorpraeparat ud fra dybfrosset humant blodplasma - Google Patents

Description

143837

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde af den i krav l’s indledning angivne art til fremstilling af et anti-hæmofilifaktorpræparat (AHF).

En meget væsentlig egenskab ved normalt blod er dets evne til 5 at koagulere, når det kommer uden for de kar, dets kredsløb forløber i, d.v.s. ved blødning. Der er gennem årene udført omfattende arbejde for at klarlægge de mekanismer, der virker ved blodets koagulering. Man antager, at der findes et antal komponenter, som deltager i blodets koaguleringssystem, og.at 10 deres antal er tolv. Komponenterne benævnes normalt koagulationsfaktorer med et vedføjet romertal I - XII.

Koagulationsfaktor VIII, som denne opfindelse omhandler, benævnes også antibæmofilifaktoren (forkortet AHF) og er et protein med stor molekylvægt. Det er til stede i meget små mængder i 15 blodplasma, idet den normale koncentration deraf er ca. 10 mg/1 plasma.

Den kendte og arvelige blødersygdom, også kaldet hæmofili A, er karakteriseret ved fraværet af den biologisk aktive koagulationsfaktor VIII (AHF). Kraftig hæmofili viser sig som stærkt 20 forøget blødningstendens, ved hvilken det mindste sår giver anledning til livstruende blødning. Sygdommen viser sig i meget ung alder, og der kan optræde mange forskellige komplikationer.

Det er for eksempel meget almindeligt, at patienterne får gentagne ledblødninger, som fører til betændelse i leddene, hvilket i 25 det lange løb indebærer invaliditet. På den måde kan alvorligt angrebne hæmofili-patienter allerede i 20 års alderen være invaliderede, hvis ikke de til stadighed behandles med præparater, der indeholder AHF.

Det er kendt at fremstille AHF dels som lavkoncentrerede præ-30 parater (kryopræcipitat/intermediær purity) og dels som højkoncentrerede præparater (high purity præparater).

De lavkoncentrerede præparater er især de såkaldte kryopræci- 2 143837 pitater, d.v.s. den ved nedfrysning opnåede uopløselige fraktion, der findes i blodplasma, og som under genoptøning' ved lav temperatur forbliver uopløselig. Kryopræcipitatet indeholder væsentligst AHF og store mængder fibrinogen.

5 En sådan optøning udføres sædvanligvis ved anvendelse af vandbad eller ved langsom optøning i rum, hvor temperaturen holdes på 4°C. Efter optøning udføres kun simple operationer, såsom filtrering, centrifugering samt frysetørring, jfr. J. Pool, E.K. Hershgold og A. Pappenhagen, Nature 203, 1964, s. 312.

10 Et nogenlunde tilsvarende præcipitat kan opnås ved at anvende den kendte Cohns fraktionering (fraktion 1-0). Her sker fældningen ved tilsætning af alkohol, og det opnåede produkt indeholder væsentligt mere fibrinogen end kryopræcipitatet.

0

Cohns fraktion 1-0 er beskrevet af M. Blombåck i Arkiv Kemi 15 12 (1958, side 387). En kombination af disse to principper er beskrevet i U.S.A. patentskrift nr. 3.652.530.

Ved disse metoder får man et bundfald, der som nævnt især indeholder AHF og fibrinogen, det sidste i ret stor mængde. På grund af den enkle, men dog ret tidskrævende proces kan man 20 opnå et nogenlunde godt udbytte på 30-40?é af det totale indhold af AHF i plasmaet, men som følge af anvendelsen af alkohol og en langsom optøning af det frosne plasma, udsættes AHF i nogen grad for denaturering, således at den biologiske aktivitet, og dermed halveringstiden, hvorved forstås den tid, 25 der forløber, indtil den biologiske aktivitet er faldet til halvdelen af initialaktiviteten,· nedsættes.

Den væsentlige mangel ved disse præparater er imidlertid deres ringe opløselighed, der bevirker, at der kræves 35-100 ml væske for at opløse en mængde af præparatet, som svarer til 500 en-30 heder AHF, og derfor kræves lægelig assistance til infusionen.

En hensigtsmæssig behandling af hæmofilipatienter vil allerede 3 143837 idag og fremover i stigende grad kræve, at patienten selv kan injicere en dosis af den manglende blodfaktor (AHF). Da injektionsvolumener, som skal indtages uden lægehjælp, ikke bør overstige 20-30 ml, kræver dette, at produktet har stor oplø-5 selighed, således at der i et opløsningsvolumen på 20-30 ml kan indeholdes ca. 500 enheder AHF.

Dette kan opnås med de højkoncentrerede præparater (high purity), der kan fremstilles ud fra kryopræcipitater eller Cohns fraktion 1-0, som ovenfor beskrevet, idet man i flere trin oprenser det 10 udvundne fældningsprodukt, d.v.s. i det væsentlige fjerner fibrinogen, jfr. f.eks. U.S.A. patentskrift nr. 3.652.530.

Med disse metoder kan man ganske vist opnå præparater med en gennemgående meget stor opløselighed, idet det til opløsning af 500 enheder AHF fornødne opløsningsvolumen, alt efter den 15 anvendte metode, varierer fra 15-25 ml, men metoderne er behæftet med meget væsentlige ulemper, nemlig et væsentligt forringet udbytte, idet man kun kan isolere 10-20% af det i blodplasmaet indeholdte AHF, og en væsentligt nedsat halveringstid, der kun er på 4-5 timer, mens halveringstiden for "nativt" AHF er 12 20 timer. På grund af udgangsmaterialets begrænsede mængde er dette naturligvis særdeles uhensigtsmæssigt.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at angive en enkel og hurtig fremgangsmåde til fremstilling af et AHF-præparat i højt udbytte og med stor opløselighed ved optøning af dybfros-25 sent plasma og dannelse af et kryopræcipitat, hvorfra AHF isoleres.

Opfindelsen hviler på den erkendelse, at omfattende og langvarige bearbejdninger af blodplasmaet og dets fraktioner har en nedbrydende virkning på plasmaproteinerne, og at udbyttet og 30 opløseligheden derfor forbedres, hvis man gennemfører optøningen og isolerer kryopræcipitatet på kortest mulig tid under nøje temperaturkontrol og i fravær af kemiske midler, idet man 4 143837 herved kan minimere nedbrydningen af AHF. Det har vist sig, at disse krav på fordelagtig vis tilfredsstilles ved at gennemføre optøningen eller i det mindste den sidste del af denne ved bestråling med elektromagnetiske bølger, fortrinsvis mikro-5 bølger eller bølger i det infrarøde område. Behandlingen gennemføres, mens plasmaet endnu befinder sig under sterile betingelser i den pose, hvori det er nedfrosset, hvilket fortrinsvis er en 200 ml pose.

Af det ovenfor anførte fremgår det, at den hurtige optøning 10 har betydning ikke alene for AHF, men at alle plasmaproteiner skånes, således at processer, der rettes mod andre plasmaproteiner, også begunstiges af metoden.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er af den i krav l’s indledning anførte art, er derfor ejendommelig ved det i 15 kravl's kendetegnende del anførte. Det har overraskende vist sig, dels at det opnåede produkt gav et meget højt udbytte, op til 50% af det i blodplasmaet indeholdte AHF, dels at halveringstiden er forøget, og dels at produktet er karakteriseret ved en meget stor opløselighed. Det er således muligt at op-20 løse 500 enheder i et opløsningsvolumen på 25 ml. Det antages, at en medvirkende faktor ved dette forhold er, at den foreslåede optøning kun medfører en ringe denaturering af såvel AHF som fibrinogen, hvorfor disses opløselighedsegenskaber ikke forringes.

25 Man har ganske vist tidligere erkendt, at visse kliniske situationer, såsom massive blødninger under åbne hjerteoperationer, kræver at man hurtigt kan disponere over store mængder blodplasma, samt at tilførsel af specifikke plasmakomponenter, såsom 5 143837 kryopræcipitat, ikke altid er tilstrækkelig til at overvinde en hæmostatisk mangel hos patienten. Af denne årsag er man nødt til at have store mængder optøet plasma stående klar til brug, idet det tager lang tid at tø plasmaet op. Dette bevir-5 ker en uønsket ødelæggelse bl.a. af plasmaets koagulationsfaktorer ved henstanden i optøet tilstand. Por at råde bod herpå foreslås det af Sherman og Domer, Transfusion, Nov.-Dec.

1974, vol. 14, no. 6, p. 595-97 at foretage en mikrobølgeoptøning af det nødvendige plasma inden brugen, så det umiddelbart 10 kan indgives i patienten, eller med andre ord bibringes en temperatur, der ligger i omegnen af patientens legemstemperatur (37°C). Sherman og Domer har ganske vist ved bestemmelse umiddelbart efter optøningen påvist, at plasmaets koagulationsfaktorer ikke ødelægges i højere grad end ved en traditionel optø-15 ning ved 37°C, hvilket dog for AHF-faktorens (VIII) vedkommende er så højt som ca. 25% i forhold til den oprindelige mængde. Sherman et al. har imidlertid alene sigtet på at dokumentere, at det optøede hele plasma risikofrit kan indgives ved et akut opstået behov, og har end ikke antydet, at plasmaet skulle være 20 anvendeligt til udvinding af faktorerne, men tværtimod fremhævet, at det kan være påkrævet yderligere at tilsætte specifikke faktorer i specielle tilfælde.

Til sammenligning kan anføres, at man ved en faktor VTII-bestem-melse analogt med Sherman på et plasma optøet ifølge opfindel-25 sen genfinder 90-100% af det totale indhold af faktor VIII i plasmaet. Heraf går ca. 60-70% i kryopræcipitatet, mens resten forbliver i opløsning i kryosupernatanten.

Sherman sigter, som det vil forstås, på en helt anden opgaveløsning end AHF-fremstilling, og indeholder således ikke nogen 30 direkte inspiration hertil. Fagmanden ville ikke kunne forudse, at det overhovedet var muligt at styre en mikrobølgeoptøning af blodplasma, så man opnår et kryopræcipitat, idet han måtte påregne, at den optøede del af plasmaet ville opvarmes til kogning på grund af den store forskel i dielektricitetskonstanten for 35 vand (optøet plasma) og is (endnu frosset plasma). Sådanne vold- 6 143837 somme temperaturforskelle gør det a priori utænkeligt, at man kan overholde de for kryopræcipitatdannelse nødvendige kontrollerede temperaturbetingelser. Sherman skal nødvendigvis hurtigst muligt bringe samtlige faktorer i opløsning og behøver 5 ikke at interessere sig for temperaturforskelle i plasmaet under optøningen. Specielt ville fagmanden ikke kunne forvente, at det var muligt at opnå et letopløseligt kryopræcipitat i godt udbytte.

Den i krav 1 angivne temperatur på 10°C repræsenterer den prak-10 tiske overgrænse for bevarelsen af et kryopræcipitat, idet dette ved højere temperaturer vil gå i opløsning.

Et egnet temperaturområde er -HL - 6°C, idet man med fordel påser, at temperaturen under bestrålingen intetsteds overstiger 4°C. Ved denne temperatur opnås en passende afbalance-15 ret lav opløselighed af kryopræcipitatet og samlet bestrålingstid, der kan indskrænkes til ca. 4-5 minutter.

For at lette behandlingen med elektromagnetiske bølger kan man med fordel foretage en forvarmning, f.eks. til henimod 0°C, eksempelvis ved at lade posen med det frosne plasma henligge en 20 passende tid, f.eks. ca. 1/2 time ved stuetemperatur, eller i køleskab eller i et vandbad. Forvarmningen kan også foretages ved at udsætte plasmaposen for en bestråling med elektromagnetiske bølger i kortere eller længere tid. Disse bestrålinger kan dog om ønsket også anvendes under hele optønings-25 processen, hvorunder man kan anvende bølger med samme eller forskellige frekvenser.

Mikrobølgeopvarmningen kan foretages i en kommercielt tilgængelig mikrobølgeovn, eksempelvis Husquama model 105, der afgiver mikrobølger ved en frekvens på 2450 MHz, hvilket giver en 30 tilstrækkelig indtrængningsdybde til at optøningen foregår i løbet af et passende kort tidsrum. Afgørende er blot, at den 7 143837 samlede bestråling gennemføres på en sådan måde, at den gennemsnitlige antenneeffekt er tilstrækkelig lav til at temperaturen på intet tidspunkt overstiger 10°C. Ved antenneeffekten forstås den del af den tilførte effekt, som om-5 dannes til mikrobølgeenergi og via ovnens antenne eller applikator indstråles i ovnen eller reflektionsrummet. Antenneeffekten kan således karakteriseres som den nyttig-gjorte effekt eller strålingseffekten. Efter omstændighederne kan bestråling derfor gennemføres periodevis eller 10 kontinuerligt.

Den hensigtsmæssige opvarmningstid varierer i øvrigt med den anvendte ovntype, specielt dennes antenneeffekt, og den anvendte frekvens, samt plasmaets form, findelingsgrad og 15 udgangstemperatur, og kan fastlægges ved forsøg. Den hyppigst

8 IX

forekommende frekvens ligger i området 10 - 3 x 10 Hz, og 9 10 det foretrukne frekvensområde er 2 x 10^ - 3 x 10 Hz.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan man også anvende 20 infrarød stråling. Energien fra denne stråling fordeler sig 13 ις over et meget bredt frekvensspektrum fra ca. 10 - 10 J Hz, og med et maksimum, der kan fastlægges ved konstruktionen 14 af den anvendte lampe, og f.eks. kan være 2,5 x 10 Hz.

25 Det under optøningen udfældede bundfald, kryopræcipitatet, oparbejdes på i og for sig kendt måde ved centrifugering ved lav temperatur (-HL - +4°C), genopløsning i en passende fysiologisk anvendelig puffer, f.eks. en citrat-glucose puffer, pH ca. 6,5· 30

Det genopløste kryopræcipitat filtreres og kan derefter dispenseres på infusionsflasker i mængder svarende til ca. 500 enheder AHF, og kan med fordel frysetørres. Det færdige præparat genopløses før brugen fuldstændigt i 25 ml vand og er derfor vel-35 egnet til injektion ved hjemmebrug.

8 143337 I nedenstående tabel er præparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen sammenlignet med gængse kommercielle præparater. Det ses af tabellen, at præparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, sammen-5 lignet med kryopræcipitat/intermediær purity præparaterne, absolut står på højde med de bedste produkter, for så vidt angår udbytte og halveringstid. Med hensyn til opløselighed opnås med det omhandlede præparat værdier, der er næsten 3 gange bedre end de nævnte kendte produkter. Sammen-10 lignet med high purity præparaterne har præparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen en opløselighed, der er på højde med disses, mens værdien for udbytte og halveringstid er ca. 3 gange bedre end for high purity præparaterne.

9 143837 •Η -Ρ

CQ

00 Ρ ^

d Φ Ν'» KN

•he cm ρ ή er« m h

Φ -P

> III

H -pH

cd CO -4- O

Λ H ^

p-N NA

H & I—l

ho CM

d in I -h *}

β β Η H

Φ W E

> s\ o cd -

xS Η · O trv s O

® ft,P H cm ω cm β o fi in co cm

CD I I CM H

β H ft · φ -pH o m in oh E -P o m h op 3 in h !>

H 00 rQ

Ο H ft . ^ J! fe § g 3 i § P> ρβ •s CM - Φ p—. Η Η 00 CM ^ g p β ε -π g φ β β oh -ο ο β •Η S ·Η β Φ ρ\ -Ρ Λ co β ιη ο “ - ο

β Φ Η -4- W) X CD

-Ρ d ο β ω ft β Φ I I CM ·Η ·Η φ χ! β Ρ ο c ιη ο ο ft ft β φ CM > · Ο Η Η Crf fcrf in γΗ ίπ β φ

Φ ·ρΗ I—I

Η d ft ·η

β X S

cd < Φ Ο Ο Ο -Ρ -Ρ <t cm in co ή erf -p >S H CO · >> II I ·Η „ ϋ pQ ·Ρ -Ρ -Ρ id ο ο ο ο - d en η -4 = d si κ* I—I -Ρ •pH O ·ρΗ ρ ρ ε I Φ cd d ft Ε 00 β β \ Φ Ή = Ή · •Ρ I β Ό- , „ Κ φ ε ft ft ·η ιι -ρ Φ -η Ρ) •Ρ β !>> Ρ d Ρ ft "Ο ft ίΒ β -ρβ ft Φ β Φ ft £ Φ ·ρ·ρφ ·ρΗ φ > φ cq <! ft ΟΟ Ο d -Ρ β -Ρ -Ρ d Η βΗ

-Ρ ffi φ cd β cd cd -Ρ °Φ Φ β Φ S

χ β ε ;>, ρ ftp βφββ ο 'η ρ ftp-Pco cd cdHwd ft Η η τ) Ο Φ ·Η ft Ρ ft ftH 60·γΗ ο >,·ρ β® οο æ æ-Hdft β ββββ τΗ β β-Pcda ^ ^· ο· ΡΜ Μ Η ft ft . ft ft ftCQfaOo H CM m 143837 10

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere ved nedenstående eksempler.

Eksempel 1

Som udgangsmateriale anvendes human blodplasma i frossen til-5 stand og indeholdt i plasticposer å 200 ml. De dybfrosne poser forvarmes ved henstand i stuetemperatur i 3/4 time, hvorefter indholdet findeles ved mekanisk bearbejdning. Posen anbringes dernæst i en mikrobølgeovn, Husquama mikrobølgeovn model 105 (2450 MHz). Der anbringes 4 poser å 200 ml i hver ovn af oven-10 nævnte type. Efter en samlet optøningstid på 4 1/2 minut (7 cykler å 15 sek. puls og 30 sek. pause) er posernes indhold optøet uden at temperaturen oversteg 4°C. Det herved udfældede bundfald, kryopræcipitatet, fracentrifugeres (10,000 g, T = 4°C, 15-20 min.), hvorefter det genopløses i en citrat-glucose 15 puffer indeholdende 0,5 g citrat/1 og 25 g glucose/l. pH = 6,5 indstilles med saltsyre.

Til hvert fracentrifugeret bundfald anvendes et volumen puffer, der svarer til ca. 1/25 af det oprindelige blodplasmavolumen.

Det genopløste kryopræcipitat filtreres dernæst gennem et 8yum 20 filter. Efter filtreringen dispenseres opløsningen i 100 ml infusionsflasker med 50 ml pr. flaske.

Dernæst spinfryses opløsningen (-4o°C), hvorefter der frysetørres i en WKF frysetørrer i 24 timer.

Det færdige præparat indeholder 500 E faktor VIII (±20%) pr.

25 flaske, hvilket kan genopløses inden brug i 25 ml vand.

Eksempel 2

Optøningen og oparbejdningen foretages som i eksempel 1 med undtagelse af, at det dybfrosne plasma forvarmes ved en kortvarig optøning i mikrobølgeovnen (2 cykler å 30 sek. puls og 30 1 minut pause). Efter oparbejdningen opnåedes et frysetørret præparat med samme gode opløseligheds- og styrkeegenskaber som i eksempel 1.

143837 11

Eksempel 3

Poser af samme type som anvendt i eksempel 1 anbragtes fra dybfrossen tilstand i mikrobølgeovnen og optøs helt ved langvarig bestråling med kortvarige mikrobølgeimpulser (32 cykler 5 å 5 sek. puls og 55 sek. pause). Det herved dannede kryopræci-pitat oparbejdedes som i eksempel 1 og førte til et præparat med samme gode opløseligheds- og styrkeegenskaber som i eksempel 1 og 2.

Eksempel 4 10 Poser af samme type som i eksempel 1 anbragtes fra dybfrossen tilstand i en mikrobølgeovn, der var ombygget til at afgive en antenneeffekt på ca. 10% af den i eksempel 1 anvendte ovns antenneeffekt. Poserne optøedes ved kontinuert mikrobølgebestråling i ca. 1/2 time. Det dannede kryopræcipitat oparbejdedes som 15 i eksempel 1 og førte til et præparat med samme gode opløselig-heds- og styrkeegenskaber som i eksempel 1.

Eksempel 5

En plasticpose med ca. 200 ml dybfrossen plasma forvarmes, idet den udsættes for infrarød stråling med en frekvens på 14 2 2,5 x 10 Hz i 5 minutter og med en intensitet af 2 W/cm .

Efter forvarmningen findeles posens indhold ved mekanisk bearbejdning, hvorefter posen igen udsættes for infrarød strå-• 14 lmg med frekvensen 2,5 x 10 Hz, men nu med en intensitet af 2 0,5 W/cm . Efter ca. 15 minutter er posens indhold passende optøet, og der fortsættes som i eksempel 1. Det opnåede præ-25 parat havde samme gode opløseligheds og styrkeegenskaber som i eksempel 1.

Eksempel 6

En plasticpose med ca. 200 ml plasma forvarmedes analogt med eksempel 5 ved infrarød bestråling i 5 minutter ved 2 W/cm .

30 Efter forvarmningen findeles posens indhold og posen anbringes i den i eksempel 1 anvendte mikrobølgeovn og optøs analogt med eksempel 1. Den videre oparbejdning som i eksempel 1 førte til et præparat med samme gode opløseligheds- og styrkeegenskaber.