NO773531L - Fremgangsmaate for fremstilling av aristolochinsyre fra holurtarer - Google Patents

Abstract

"Fremgangsmåte for fremstilling av aristolochinsyre fra holurtarter"

Description

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av aristolochinsyrer fra holurtarter ved ekstraksjon.

Aristolochinsyrer er naturlige stoffer fra planter og

har en nitrogruppe' på et f enantrensk jelett. De eksisterer som nitrofenantren-karboksylsyrer i en rekke medlemmer av holurtfamilien. Det er tale om en blanding av syrer, og de syrer som'forekommer i holurt (aristolochia clematitis) er i omfattende utstrekning identifisert kjemisk med hensyn til sin struktur.

Aristolochinsyrene er meget interessante både.l kjemisk og farmakologisk henseende og er verdifulle midler for mange anvendelsesområder. Således hemmer de særlig tumorvekst og stimulerer fagocytose.

For fremstilling av større mengder aristolochinsyrer anvendes på de nordlige breddegrader hovedsakelig holurt som utgangsmateriale. Det er særlig roten som har et høyt innhold av aristolochinsyre. Røttene inneholder ca. 5 til 6 ganger så

mye av syrene-som bladene og andre deler av planten, men innholdet er imidlertid gjenstand for sterke variasjoner med årstidene.

En god kommersiell'plante kan inneholde opptil 0,6%

aristolochinsyrer.

Aristolochinsyrene med formlene I og II utgjør hoved-mengden av blandingen av aristolochinsyrer.

Aristolochinsyre I er en 3,4^metylendioksy-8-metoksy-10-nitrofenantren-l-karboksylsyre med formelen:

Aristolochinsyre II adskiller seg fra aristolochinsyre I ved at. den ikke har noen metoksygruppe„ Den.er en 3,4-metylendioksy-10-nitrofenantren-i-karboksylsyre med formelen:

På grunn av de ovennevnte gunstige farmakologiske virkninger foreligger et stort behov for aristolochinsyrer.' Det er tidligere.kjent'forskjellige fremgangsmåter for isolering av den aktive bestanddel fra planten. Dette er særlig påpekt i de følgende publikasjoner: Ifølge W. Schuna.ck et al, Pharmazie 20,

s. 685-688 (1965) ekstraheres radix aristolochia longae først med petroléter og behandles derefter med etanol eller et mindre polart oppløsningsmiddel • (benzen, metylenklorid) . Den sure ekstraksjon med metylenklorid/fortynnet svovelsyre eller metylenklorid/maursyre er angitt å være særlig gunstig. Den erholdte ekstrakt ristes med 2% kaustisk soda og surgjøres derefter med fortynnet svovelsyre. Denne fremgangsmåte har betydelige ulemper eftersom den er meget avhengig av planten og fører noen ganger til fettaktige produkter.

I Japansk patentpublikasjon 27834/71 er beskrevet en fremgangsmåte for ekstraksjon av aristolochia debilis. I henhold til denne publikasjon' fremstilles en ekstrakt med ammoniakalsk vann fra planten, ekstrakten underkastes kolonnekromatografi, hvor eluéringsmidlet hovedsakelig består av kloroform og tilsetninger av butanol og eddiksyre, produktfraksjonen fraskilles, og produktet isoleres fra fraksjonen.

Denne fremgangsmåte, og særlig den kjente fremgangsmåte for ekstrahering av planter med vandig kaustisk soda, er ufordelaktig på grunn av den raske svelling av planten slik at

de ønskede syrer ikke utskilles tilstrekkelig raskt som salt og holder seg for lenge i alkalisk medium hvor de utsettes, for spaltning som tidligere beskrevet av Pailer.

I. henhold til tys"k utlegningsskrift 1.186.980 ekstraheres r

JRadix aristolochiae med kloroform, metylenklorid eller eter,

og fra den således erholdte oppløsning ekstraheres aristolochih-i syrene som salt ved risting med en alkalisk, vandig oppløsning, produktet utfelles igjen ved.surgjøring og omkrystalliseres eventuelt.

Denne fremgangsmåte har den uiempe at den i stor utstrekning er avhengig av tørringsgraden og tilstanden for den anvendte plante.. Vanligvis får man en blanding av fettaktige. stoffer som er mettet med spaltningsprodukter.

I henhold til tysk utlegningsskrift 1.768.090 ekstraheres Radix aristolochiae ved forhøyet temperatur med en vann-blandbar alkohol eller et keton inneholdende 40 til 60% vann,. den erholdte oppløsning som inneholder vann, avsuges i varm til-stand, avkjøles derefter, og oppløsningen blandes med 3-5%. dimetylformamid'og. surgjøres med en mineralsyre til en pH-verdi •på 2-3, hvorefter aristolochinsyrene får stå og bringes således til krystallisasjon.

Ved denne fremgangsmåte er det ufordelaktig, å arbeide med . blandinger av vann og organiske, vann-blandbare oppløsnitrgsmidler slik at de organiske oppløsningsmidler i stor<N>utstrekning går tapt. Videre påvirkes felnings- og krystallisasjonsbetingelsene meget lett fordi det igjen dannes spaltningsprodukter, særlig ved for sterkt-sur pH-verdi.

Foreliggende oppfinnelse er basert på en ny fremgangsmåte for isolering av aristolochinsyrer fra holurtarter, og denne fremgangsmåte er uten de ulemper som de tidligere fremgangsmåter har vært beheftet med, og fører til et særlig rent produkt, med høyere utbytte på en enklere måte.:

Dette problem løses ved:

- a) svakt alkalisk ekstraksjon av planten,

b) surgjøring av ekstrakten,

c) oppløsning av bunnfallet i et organisk oppløsningsmiddel som ikke er blandbart med vann,

d) ekstrahering av den erholdte oppløsning med vandig alkali,

e) , surgjøring av ekstrakten, og

f) fraskillelse av det utfelte produkt og eventuelt

omkrystallisering.

En foretrukket utførelsesform for fremgangsmåten er:

a) ekstrahering av planten ved en pH-verdi på 8-8,5 med en vandi.g, alkalisk, fortrinnsvis en vandig oppløsning av

Na2HP04•n H20,

b) surgjøring av ekstrakten med en mineralsyre til en.pH på 5-3,

c.) oppløsning av bunnfallet i en ester av en alifatisk karboksyl syre med 1-10 karbonatomer og en alkohol med 1-10 karbonatomer, og derefter frafiltrering av uoppløselige bestanddeler,

d) ekstrahering av den erholdte oppløsning med vandig alkali,

e) surgjøring av ekstrakten med en mineralsyre til en pH. på

5-3, og

f) omkrystalllsering av det utfelte produkt fira di.metylf ormamid, tilsetning av en blanding av en alkohol med 1-10 karbonatomer

og en ester av en karboksylsyre med 1-10 karbonatomer og en alkohol også med 1-10 karbonatomer, i et bestemt mengdeforhold, fortrinnsvis 2:1.

Bunnfallet, ved trinn c) ved den ovenfor beskrevne, fremgangsmåte er en blanding av rå syrer med et vanninnhold på omtrentlig mellom 60 og 90%, særlig 80%. Denne rå syre som inneholder vann, suspenderes i et organisk oppløsningsmiddel, fortrinnsvis i en ester som angitt ovenfor, av en karboksylsyre med 1-10 karbonatomer og en alkohol med 1-10 karbonatomer, og omrøres kraftig, f.eks., med en såkalt "turrax" . Gunstige estere er metylacetat, etylacetat, propylacetat, butylac.etat og isobutyl-acetat, såvel som de tilsvarende maursyreestere, propionsyre-estere, smørsyreestere og valeriansyreestere, og særlig fordelaktig er etylacetat.

Bunnfallet oppløses i 100 til 200 vektdeler av de nevnte estere, fortrinnsvis etylacetat, pr. vektdel vannholdig bunnfall. Det foretrekkes særlig å anvende 150-200 vektdeler etylacetat

pr. vektdel bunnfall.

Som forklart innledningsvis ekstraheres planten svakt alkalisk tre ganger ialt, og vaskes derefter en gang. med vann.

Denne alkaliske ekstraksjon kan foretas med en vandig oppløsning

av et alkalisk reagerende stoff, fortrinnsvis i en fortynnet oppløsning. Alkalisk reagerende stoffer er sekundære og tertiære, alkalifosfater, alkalihydrogenkarbonater og vandige oppløsninger

av etanolamin og trietanolamin og lignende. Særlig foretrekkes

en fortynnet vandig oppløsning av Ha^ HPC)^•2 f^O, og det er fordelaktig å anvende en 0,03 til 0,3, særlig en 0,06 molar oppløsning av dette salt. Ekstraksjonen kan også foretas med en vandig oppløsning av natriumbikarbonat, fortrinnsvis sekundært eller tertiært natriumfosfat o.i..

Prinsipielt kan det anvendes vandige, basiske eller

svakt basiske oppløsninger for den primære ekstraksjon av aristolochinsyrene fra roten, som nevnt ovenfor. Ved de kjente metoder oppstår imidlertid betydelige vanskeligheter under den videre rensning og krystallisasjon. Bare på grunn av det passende valg av behandlingstrinn i henhold til foreliggende oppfinnelse har det vært mulig' å overkommer disse vanskeligheter ved å unngå dannelse av spaltningsprodukter.

For ekstraksjon anvendes en finmalt rot som ikke er avfettet. En forutgående avfettning er■overflødig på grunn'av ekstraksjonen i et pH-område fra 8-9, fortrinnsvis 8-8,5 i vandig medium.

Overraskende nok fører ekstraksjonsbetingelsene som anvendes ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, ikke til dekarboksylering av aristolochinsyrene, i motsetning til hva som ble antatt i henhold til den tidligere kjennskap til reaktiviteten av aristolochinsyrer.

Forholdet mellom plante og ekstråksjonsmiddel reguleres til. ca. 1:5 til 1:10 (vekt/volum) . Ekstraksjonen kan foretas i henhold til. hvirvelstrømprinsippet med kontinuerlig tilmatning og tilbakeføring av det aktive middel under, delvis fjernelse av det ekstraherte materiale via en delstrøm til et dekanteringskar.

Ekstraksjonen av oppløsningen beskrevet i pkt. d) kan^ , hensiktsmessig foretas som en motstrømsekstraksjon.

Ekstrakten erholdt fra planten i henhold til trinn^a) surgjøres med en syre, fortrinnsvis med en mineralsyre, særlig svovelsyre. I henhold til en særlig foretrukket utførelsesform for oppfinnelsen surgjøres den med svovelsyre til en pH-verdi på 3-5, fortrinnsvis pH 4,0-4,5 under omrøring. På dette trinn faller de rå syrer ut som et fint bunnfall. De behandles derefter videre som-beskrevet ovenfor. ■ .

Surgjøringen i henhold til trinn e) av ekstrakten erholdt i henhold til trinn d) utføres fortrinnsvis med en mineralsyre, særlig svovelsyre under kraftig omrøring-. Det foretrekkes å la den surgjorte ekstrakt stå en stund for å fremme veksten av partiklene av de rensede aristolochinsyrer... Bunnfallet fraskilles derefter, f.eks. ved sentrifugering eller filtrering, og tørres'

i vakuum under oppvarmning til f.eks..70 til 80°C.

Det erholdte gule produkt kan anvendes direkte.som sådant eller kan underkastes en ytterligere rensning ved omkrystallisering. 'Denne omkrystallisering utføres hensiktsmessig, ved anvendelse av en blanding av dimetylformamid og vann, og det foretrekkes å fore-ta omkrystallisering fra dimetylformamid som inneholder en viss mengde av en blanding av en C^-C^-alkohol og en ester av en Cj^-C^q karboksylsyré og en C^-C^-alkohol, fortrinnsvis i forholdet 2:1.

Særlig foretrekkes dimetylformamid til hvilket er satt 10-30%, fortrinnsvis 20% av en blanding av metanol:etylacetat - 2:1.

Utbyttene av krystalliserte syrer varierer i stor utstrekning avhengig av det anvendte plantemateriale, og de er generelt mellom 0,1 og 0,5% av utgangsmaterialet.

De krystalliserte syrer utgjør i det vesentlige aristolochinsyre I og aristolochinsyre II i et forhold 2:1,

idet avvikelser på t 20% kan forekomme i planten.

Betegnelsen "mineralsyrer" som her er anvendt, omfatter alle uorganiske, ikke-oksyderende syrer som normalt anvendes. F.eks. skal nevnes svovelsyre, fosforsyre, saltsyre o.l.

Alle arter av holurtfamilien som inneholder aristolochinsyrer, er egnet som utgangsmateriale. Dette omfatter f.eks. _Radiz aristolochia longae, aristolochia clematitis, aristolochia debilis, aristolochia contorta, aristolochia kaempfer, aristolochia manschuriensis, aristolochia fangdu, aristolochia westlandi, aristolochia griffithii og aristolochia argentina.

Særlig foretrekkes å anvende holurt (aristolochia

clematitis).

Sammenlignet med de tidligere kjente fremgangsmåter har foreliggende fremgangsmåte den. fordel at den på en enklere måte

fører til et utbytte på opptil 100% av de aktive stoffer med en bedre kvalitet enn tidligere.

Oppfinnelsen skal illustreres i det følgende eksempel:

Eksempel på utvinning av aristolochinsyre

100 g finmalt plante, radix aristolochia clematitis, ekstraheres i 1 time på en såkalt "turrax" ved romtemperatur .med en vandig oppløsning av sekundært natriumfos fat (11,9 g Na2HP0^•2 H^O/liter). Den første og annen ekstraksjon foretas

hver med 2 liter av denne.oppløsning, og den tredje ekstraksjon foretas med 1 liter. Efter tre ekstråksjoner foretas sentrifugering . og derefter vasking med 1 liter vann. Ekstraktoppløsningene og .vaskevannet samles, og efter klaring reguleres de til- pH 4 med svovelsyre under kraftig omrøring. Bunnfallet får stå natten over og sentrifugeres derefter. Derefter røres residuet inn i 600 ml etylacetat og ekstraheres i 1/2 time på den såkalte ."turrax" ved romtemperatur. Etylacetatfasen klares derefter og ekstraheres tre ganger med 300 ml hver gang av en 0,1N natriumhydroksyd-oppløsning i motstrøm. Aristolochinsyrene utfelles fra de samlede alkaliske oppløsninger ved surgjøring med svovelsyre til. pH 4. Bunnfallet, som får stå. na.tten over, sentrifugeres og tørres-. Utbytte : .0, 540 g.

Det er ikke nødvendig å regulere pH-verdien påny under, ekstraksjonen med den vandige natriumfosfatoppløsning. Efter første og annen ekstraksjon er pH-området mellom 7 og 7,5 og øker til pH 8 under tredje ekstraksjon.

Den erholdte rå syre omkrystalliseres fra N,N-dimetylformamid ved tilsetning■av 20% (svarende til det anvendte N,N-dimetylformamid) av en blanding av metanol:etylacetat - 2:1.

Smelteområde: 273-280°C (spaltning)

IR-spektrum: se fig. 1.

Claims (6)

1. h1'o. lurtarteFrr emvegd angalsmkaåtle isk fore- ksfrtermaksstsjiolnli, ng kav araraisktotlocehrinsi yrseer rfrat

   n

   ved at'

   a) det aktive stoff ekstraheres i svakt alkalisk miljø,

   b) ekstrakten surgjøres,

   c) bunnfallet oppløses i et organisk oppløsningsmiddel som ikke er blandbart med vann,

   d) den erholdte oppløsning ekstraheres med vandig alkali/

   e) ekstrakten surgjøres, og

   f) det utfelte produkt fraskilles og eventuelt omkrystalliseres.
2. 2. Fremgangsmåte som an gi tiit i krav 1,

   P

   karakterisert ved at ,

   a) det aktive stoff ekstraheres;med vandig Na2HP0^-oppløsning ved en pH-verdi på 8 til 8,5,

   b) ekstrakten surgjøres med en mineralsyre til en pH-verdi på 5-3,

   c) - bunnfallet oppløses i en ester av en karboksylsyre med 1 til 10 karbonatomer,

   d) den erholdte oppløsning ekstraheres med vandig natrium-hydroksydoppløsning,

   e) ekstrakten surgjøres med svovelsyre til en pH-verdi på 5-3, og

   f) det utfelte produkt dmkrystaliliseres fra N ,N-dimetylformamid under tilsetning av en blandiin'1g av en alkohol med 1 til 10 karbonatomer og en ester aven karboksylsyre med 1 til 10 karbonatomer og en alkohol me'd 1 til 10 karbonatomer i et ' <i> j bestemt mengdeforhold, fortrinnsvis 2:1.
3. 3. Fremgangsmåte som' angittjj i krav 1 og 2 , karakterisert ved at bunnfallet i trinn c) oppløses i etylacetat.
4. 4. Fremgangsmåte som angitt-, i krav 3,

   karakterisert ved I. at bunnfallet oppløses i 150 til 200 vektdeler etylacetat pr. vektdel vannholdig bunnfall i trinn c) .. <:> ,'
5. 5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 til 4,

   karakterisert ved at ekstraksjonen beskrevet i trinn a) utføres ved en pH-verdi på 8,0 til 9,0, fortrinnsvis ved 8,5.
6. 6. Fremgangsmåte som angitp i krav 2, karakterisert - v e | at omkrystalliseringen foretas under anvendelse av N,N-dimetylformamid tilsatt 20%.av en blanding av 2 deler metanol og 1 Idel etylacetat.

   ku7n. daerr atrkinFn rtembeg) arnogg ismeså) ete forrst otm rinannvsgveiitd t s i foakrt eratsv uars g2vj,øerd inpH gen 4, bteisl kr4e,v5e.t