NO336451B1

NO336451B1 - Antistoffer mot bindevevsvekstfaktor, farmasøytisk sammensetning omfattende nevnte antistoff, og anvendelser derav, samt par av rekombinante polynukleotider og vertsceller transfektert med nevnte polynukleotider

Info

Publication number: NO336451B1
Application number: NO20060027A
Authority: NO
Inventors: Thomas B Neff; Al Y Lin; Noelynn A Oliver; William R Usinger; Qingjiah Wang; David A Yeowell
Original assignee: Fibrogen Inc
Priority date: 2003-06-04
Filing date: 2006-01-03
Publication date: 2015-08-24
Also published as: US20090017043A1; EP1631591B1; BRPI0410963B8; JP5624707B2; WO2004108764A2; RU2330861C2; AU2004245514A1; JP2012143239A; AU2004245514B2; EP2338914A1; US20190023778A1; US20210230259A1; CA2526509C; DK1631591T3; US20160024198A1; US7405274B2; BRPI0410963A; US20110091468A1; US20040248206A1; RU2005141492A

Abstract

SAMMENDRAG Den foreliggende oppfinnelsen gjelder antistoffer som bindes til CTGF. Antistoffene er spesielt rettet mot områder i CTGF som deltar i biologiske aktiviteter forbundet med fibrose. Oppfinnelsen gjelder også fremgangsmåter for anvendelse av antistoffene for behandling av lidelser forbundet med CTGF innbefattet lokaliserte og systemiske fibrotiske lidelser innbefattet lidelser i lunge, lever, hjerte, hud og nyre.

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Den foreliggende oppfinnelsen gjelder antistoffer som bindes til bindevevsvekstfaktor (CTGF). Antistoffene er nærmere bestemt rettet mot områder i CTGF som deltar i biologiske aktiviteter forbundet med forskjellige lidelser.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Bindevevsvekstfaktor (CTGF)

CTGF er et cysteinrikt heparinbindende utskilt glykoprotein på 36 kD som opprinnelig ble isolert fra dyrkningsmedium fra humane endotelceller fra navlestrengvenen. (Se for eksempel Bradham et al. (1991) J Cell Biol 114: 1285-1294; Grotendorst og Bradham, U.S. patentskrift nr. 5,408,040). CTGF tilhører CCN (CTGF, Cyr61, Nov) -familien av proteiner (utskilte glykoproteiner) som omfatter det seruminduserte umiddelbart tidlige genproduktet Cyr61, det antatte onkogenet Nov, det ECM-assosierte proteinet FISP-12, det scr-induserbare genet CEF-10, det Wnt-induserbare utskilte proteinet WISP-3 og det antiproliferative proteinet HICP/rCOP (Brigstock (1999) Endocr Rev 20: 189-206; 0'Brian et al.

(1990) Mol Cell Biol 10: 3569-3577; Joliot et al. (1992) Mol Cell Biol 12: 10-21; Ryseck et al. (1990) Cell Growth and Diff 2: 225-233; Simmons et al. (1989) Proe Nati Acad Sei USA 86: 1178-1182; Pennica et al. (1998) Proe Nati Acad Sei USA, 95; 14717-14722; og Zhang et al. (1998) Mol Cell Biol 18: 6131-6141). CCN-proteiner særpreges ved 38 konserverte cysteinrester som utgjør over 10% av det totale aminosyreinnholdet og gir opphav en modulær struktur med N- og C-terminale domener. Den modulære strukturen av CTGF omfatter konserverte motiver for insulinlignende vekstfaktorbindende protein (IGF-BP) og von Willebrands faktor (VWC) i det N-terminale domenet og trombospondin (TSP1) og et cysteinknutemotiv i det C-terminale domenet.

CTGF-ekspresjon induseres av medlemmer av transformerende vekstfaktor beta (TGFP) -superfamilien som omfatter TGF/3-1, -2 og -3, beinmorfogenetisk protein (BMP) -2 og aktivin, så vel som en rekke andre regulatoriske modulatorer innbefattet deksametason, trombin, vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF) og angiotensin II; og stimuli fra omgivelsene innbefattet hyperglykemi og hypertensjon. (Se for eksempel Franklin (1997) Int J Biochem Cell Biol 29: 79-89; Wunderlich (2000) Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 238: 910-915; Denton og Abraham (2001) Curr Opin Rheumatol 13: 505-511; og Riewald (2001) Blood 97: 3109-3116; Riser et al. (2000) J Am Soc Nephrol 11: 25-38; og internasjonal patentpublikasjon WO 00/13706). TGFØ-stimulering av CTGF-ekspresjonen er hurtig og langvarig og krever ikke vedvarende tilførsel. (Igarashi et al. (1993) Mol Biol Cell 4: 637-645). En forhøyelse av CTGF-ekspresjonen ved TGFp omfatter transkripsjonen aktivering via regulatoriske DNA-elementer som foreligger i CTGF-promoteren. (Grotendorst et al. (1996) Cell Growth Differ 7: 469-480; Grotendorst og Bradham, U.S. patentskrift nr. 6,069,006; Holmes et al. (2001) J Biol Chem 276: 10594-10601).

CTGF har blitt vist å forhøye "steady-state"-transkripsjonen av al(I)-kollagen-, oc5-integrin- og fribronektin-mRNA så vel som å fremme cellulære prosesser som omfatter proliferasjon og kjemotakse av forskjellige celletyper i kultur. (Se for eksempel Frazier et al. (1996) J Invest Dermatol 107: 406-411; Shi-wen et a. (2000) Exp Cell Res 259: 213-224; Klagsburn (1977) Exp Cell Res 105: 99-108; Gupta et al. (2000) Kidney Int 58: 1389-1399; Wahab et al. (2001) Biochem J 359(Pt 1): 77-87; Uzel et al. (2001) J Periodontol 72: 921-931; og Riser og Cortes (2001) Ren Fail 23: 459-470). Subkutan injeksjon av CTGF i neonatale mus fører til lokal deponering av granulasjonsvev. På tilsvarende måte gir subkutan injeksjon av TGFP granulasjonsvevdannelse og induserer et høyt nivå av CTGF mRNA i lokale fibroblaster. Videre fører kombinasjonsbehandling eller sekvensiell behandling med TGFP og CTGF til utvikling av en mer vedvarende granulom. (Mori et al. (1999) J Cell Physiol 181: 153-159). Således ser CTGF ut til å formidle en undergruppe av virkningene som utløses ved TGFp, nærmere bestemt dannelse og deponering av ekstracellulær matrise (ECM). Videre kan evnen til å respondere på CTGF eller omfanget av CTGF-responsen avhenge av et innledende stimulus som fås ved TGFP-behandling og som muliggjør cellulær "kompetanse". (Internasjonal patentpublikasjon WO 96/08140).

Selv om en overveldende mengde av interagerende faktorer som modulerer vevsorganiseringen er blittkarakterisert, fremstår gradvis en alminnelig enighet om rollen til CTGF når det gjelder regulering av skjelettutvikling, sårheling og ved modulering av ekstracellulær matrise (ECM), fibrose, tumorigenese og angiogenese. For eksempel har forhøyet CTGF-ekspresjon blitt observert i skrumplever, pulmonal fibrose, inflammatorisk tarmsykdom, sklerotisk hud og keloider, desmoplasi og aterosklerotiske plakk. (Abraham et al. (2000) J Biol Chem 275: 15220-15225; Dammeier et al. (1998) Int J Biochem Cell Biol 30: 909-922; diMola et al. (1999) Ann Surg 230(1): 63-71; Igarashi et al. (1996) J Invest Dermatol 106: 729-733; Ito et al. (1998) Kidney Int 53: 853-861; Williams et al. (2000) J Hepatol 32: 754-761; Clarkson et al. (1999) Curr Opin Nephrol Hypertens 8: 543-548; Hinton et al.

(2002) Eye 16: 422-428; Gupta et al. (2000) Kidney Int 58: 1389-1399; Riser et al.

(2000) J Am Soc Nephrol 11: 25-38).

CTGF er også oppregulert i glomerulonefritt, IgA-nefropati, fokal og segmental glomerulosklerose og diabetisk nefropati. (Se for eksempel Riser et al. (2000) J Am Soc Nephrol 11: 25-38). Et forhøyet antall celler som uttrykker CTGF observeres også i seter for kronisk tubulointerstitiell skade og CTGF-nivået korrelerer med omfanget av skaden. (Ito et al. (1998) Kidney Int 53: 853-861). Videre er CTGF- ekspresjonen forhøyet i glomeruli og tubulointerstitium i en rekke nyresykdommer som er forbundet med arrdannelse og sklerose av renalt parenkym. Forhøyet nivå av CTGF har også blitt assosiert med leverfibrose, myokardialt infarkt og pulmonal fibrose. Hos for eksempel pasienter med idiopatisk pulmonal fibrose (IPF), er CTGF kraftig oppregulert i biopsier og celler i bronkeoalveolær lavagevæske. (Ujike et al.

(2000) Biochem Biophys Res Commun 277: 448-454; Abou-Shady et al. (2000) Liver 20: 296-304; Williams et al. (2000) J Hepatol 32: 754-761; Ohnishi et al.

(1998) J Mol Cell Cardiol 30: 2411-22; Lasky et al. (1998) Am J Physiol 275: L365-371; Pan et al. (2001) Eur Respir J 17: 1220-1227; og Allen et al. (1999) Am J Respir Cell Mol Biol 21: 693-700). Således representerer CTGF et gyldig terapeutisk mål ved lidelser som dem beskrevet ovenfor.

En sammenheng mellom CTGF og forskjellige aspekter av disse lidelsene er blitt etablert og fremgangsmåter for behandling av lidelser ved modulering av CTGF er beskrevet. (Se for eksempel Grotendorst og Bradham, U.S. patentskrift nr. 5,783,187; internasjonal patentpublikasjon WO 00/13706; og internasjonal patentpublikasjon WO 03/049773). Modulering av vekstfaktorer, cytokiner og celleoverflatereseptorer kan oppnås ved anvendelse av monoklonale antistoffer og flere terapeutiske monoklonale antistoffer er blitt godkjent eller er under utvikling.

(Se for eksempel Infliximab (Remicade; Maini et al. (1998) Arthritis Rheum 41: 1552-1563; Targan et al. (1997) N Engl J Med 337: 1029-1035); Basiliximab (Simulect) og Daclizumab (Zenapax) (Bumgardner et al. (2001) Transplantation 72: 839-845; Kovarik et al. (1999) Transplantation 68: 1288-1294); og Trastuzumab (Herceptin; Baselga (2001) Ann Oncol 12 Suppl 1: S49-55)).

Det har blitt frembrakt antistoffer mot CTGF, og disse har vist seg effektive in vivo for for eksempel inhibering av angiogenese. (Se for eksempel Grotendorst og Bradham, U.S. patentskrift nr. 5,408,040; internasjonal patentpublikasjon WO 99/07407; og Shimo et al. (2001) Oncology 61: 315-322). Videre ser den modulære natur av CTGF ut til å skille mellom domener som deltar i spesifikke biologiske aktiviteter. For eksempel har den N-terminale halvdelen av CTGF blitt vist å stimulere celledifferensiering og ECM-dannelse, mens den C-terminale halvdelen stimulerer celleproliferasjon. (Se for eksempel internasjonale patentpublikasjonene WO 00/35936 og WO 00/35939; og Brigstock og Harding, U.S. patentskrift nr. 5,876,70). Dette viser at antistoffer rettet mot forskjellige områder i CTGF-molekylet har forskjellige virkninger når det gjelder modulering av biologiske aktiviteter forbundet med CTGF. (Se for eksempel de internasjonale patentpublikasj onene WO 00/35936 og WO 00/35939). Foreløpig har det ikke blitt satt et klart skille mellom anti-CTGF-antistoffer som gir en ønsket virkning og antistoffer som enten gir flere virkninger eller er ikke-nøytraliserende. (Se for eksempel internasjonal patentpublikasjon WO 99/33878).

Det foreligger åpenbart et behov innen faget for midler som effektivt nøytraliserer aktiviteten av CTGF ved sykdom. Antistoffer, fortrinnsvis monoklonale antistoffer, har den spesifisitet og de farmakokinetiske profilene som et terapeutisk middel bør ha og nøytraliserende antistoffer rettet mot spesifikke aktiviteter forbundet med CTGF vil oppfylle et behov innen faget og finne anvendelse i terapeutisk behandling av CTGF-forbundne lidelser innbefattet pulmonale lidelser så som idiopatisk pulmonal fibrose (IPF) osv.; nyrelidelser så som diabetisk nefropati, glomerulosklerose, osv.; og okulære lidelser så som retinopati, makulær degenerering, osv.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

Rammen av den foreliggende oppfinnelse er definert i kravene og enhver informasjon som ikke faller innenfor nevnte krav er tilveiebrakt for informasjon.

Den foreliggende oppfinnelsen angår antistoffer, fortrinnsvis monoklonale antistoffer og deler av disse som spesifikt bindes til et område på det N-terminale fragmentet av et CTGF-polypeptid. Nærmere bestemt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff eller en del derav som spesifikt binder til i det minste en del av en region av humant CTFG som tilsvarer aminosyrene 143 til 154 i SEKV.ID. NR. 2 eller et ortologt område i CTGF avledet fra en annen art.

I ett aspekt bindes et antistoff ifølge oppfinnelsen spesifikt til et område på humant CTGF (SEKV.ID. NR. 2) fra tilnærmet aminosyre 143 til aminosyre 154 (SEKV.ID. NR. 21 eller et ortologt område i CTGF avledet fra en annen art. I spesielle utførelser har antistoffet den samme spesifisitet som et antistoff som dannes av cellelinjen som kan identifiseres ved ATCC aksesjonsbetegnelse PTA-6006. I spesifikke utførelser er antistoffet i alt vesentlig identisk med mAbl som beskrevet nedenfor. Mer foretrukket er antistoffet i alt vesentlig likt CLN1 som beskrevet nedenfor. I nok en utførelse bindes et antistoff ifølge oppfinnelsen kompetitivt med ethvert av de ovenfor nevnte antistoffene til et CTGF-polypeptid.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et antistoff som spesifikt binder til minst en del av et område i humant CTGF som tilsvarer aminosyrene 143 til 154 i SEKV.ID. NR. 2 eller et ortologt område i CTGF avledet fra en annen art, omfattende et første polypeptider valgt fra gruppen bestående av: (a) en immunglobulin tungkjede-sekvens omfattende SEKV.ID. NR. 14; (b) en immunglobulin tungkjede-sekvens omfattende det variable domenet av SEKV.ID. NR. 14; eller (c) en konservativ variant av (a) eller (b);

og et andre polypeptid valgt fra gruppen bestående av:

(d) en immunglobulin lettkjede-sekvens omfattende SEKV.ID.NR. 20; (e) en immunglobulin lettkjede-sekvens omfattende det variable domenet av SEKV.ID.NR. 20; eller

(f) en konservativ variant av (d) eller (e).

Derfor tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen et monoklonalt antistoff eller en del derav som omfatter en immunoglobulin tungkjedesekvens som omfatter SEKV.ID. NR. 14, en immunoglobulin tungkjedesekvens som omfatter det variable domenet i SEKV.ID. NR. 14, eller en konservativ variant derav; og en immunoglobulin lettkjedesekvens som omfatter SEKV.ID. NR. 20, en immunoglobulin lettkjedesekvens som omfatter det variable domenet i SEKV.ID. NR. 20 eller konservative varianter av disse. I en spesifikk utførelse omfatter antistoffet det variable immunoglobulin tungkjededomenet fra aminosyrerest 1 til og med aminosyrerest 167 i SEKV.ID. NR. 14. I en annen spesifikk utførelse omfatter antistoffet det variable immunoglobulin lettkjededomenet fra aminosyrerest 1 til og med aminosyrerest 136 i SEKV.ID. NR. 20. I en spesiell utførelse omfatter antistoffet immunoglobulin tungkjedesekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 14 og immunoglobulin lettkjedesekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 20. I denne utførelsen tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen nærmere bestemt antistoffet CLN1 eller en del derav som omfatter minst aminosyrerestene i det antigenbindende området i CLN1.

I visse aspekter er antistoffet ifølge oppfinnelsen et polyklonalt antistoff. I andre aspekter er antistoffet et monoklonalt antistoff. I visse utførelser er antistoffet et humanisert monoklonalt antistoff; mer foretrukket et humant monoklonalt antistoff. Alle de ovenfor nevnte antistoffene kan i tillegg omfatte forskjellige mengder av glykosylering, innført av cellen som danner antistoffet eller innført og/eller modifisert syntetisk, eller antistoffet kan være fritt for glykosylering. Antistoffet kan om ønskelig være pegylert og/eller modifisert på lignende måte for å forlengde halveringstiden i plasma, osv. I forskjellige utførelser tilveiebringer oppfinnelsen deler av antistoffet, fortrinnsvis hvori delen er et Fab-fragment, et F(ab)2-fragment eller et Fv-fragment.

I visse aspekter er antistoffet eller en del derav dannet av en klonet cellelinje. Cellelinjen kan være avledet fra enhver dyremodell som anvendes for fremstilling av monoklonalt antistoff innbefattet, men ikke begrenset til, mus, geit, kylling, osv. Nærmere bestemt kan cellelinjen være avledet fra mus. Musen kan være en standardmus som anvendes for antistoffremstilling, for eksempel BALB/C eller en modifisert, for eksempel transgen, musestamme optimalisert eller utviklet for fremstilling av spesifikke isotyper, idiotyper eller artsspesifikke monoklonale antistoffer. I en utførelse er cellelinjen en hybridomcellelinje som danner og utskiller mAbl. I andre utførelser danner og utskiller cellelinjen et antistoff eller en del derav som har en egenskap som i alt vesentlig tilsvarer en egenskap forbundet med mAbl. I ytterligere andre utførelser danner og utskiller cellelinjen et antistoff eller en del derav som har en egenskap som i alt vesentlig tilsvarer en egenskap forbundet med CLN1. I en spesiell utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en cellelinje som kan identifiseres ut fra ATCC-betegnelsen PTA- 6006. 1 et annet aspekt er antistoffet eller delen derav avledet fra et ikke-menneskelig transgent dyr, fortrinnsvis et ikke-menneskelig transgent pattedyr som kan danne et humant antistoff. Dyret kan være fra enhver art innbefattet, men ikke begrenset til, mus, kylling, ku, geit, osv. Nærmere bestemt kan dyret være en mus. Slike antistoffer kan erholdes ved å immunisere et ikke-menneskelig transgent pattedyr med et fragment av humant CTGF, for eksempel SEKV.ID. NR. 21, eller mer spesifikt SEKV.ID. NR. 22, eller med et ortologt område fra CTGF avledet fra en ikke-menneskelig art. I visse utførelser erholdes antistoffene ved å immunisere det ikke-menneskelige transgene pattedyret med et fragment av CTGF utvalgt fra gruppen som består av SEKV.ID. NR. 26 til og med 26 eller et ortologt område fra CTGF avledet fra en ikke-menneskelig art. I spesifikke utførelser erholdes antistoffene ved å immunisere en transgen mus med et av de ovenfor nevnte CTGF-fragmentene. I andre utførelser erholdes antistoffene ved å immunisere en transgen mus med funksjonelle ekvivalenter av et hvilket som helst av de ovenfor nevnte CTGF-fragmentene.

Med "spesifikt bindes til et område i CTGF" menes at antistoffene har bindingsspesifisitet for et gitt område i CTGF som kan være definert ved en lineær aminosyresekvens eller en tertiær, det vil si tredimensjonal konformasjon i en del av CTGF-polypeptidet. Bindingsspesifisitet betyr at antistoffenes affinitet overfor den delen av CTGF er vesentlig høyere enn affiniteten overfor andre beslektede polypeptider. Med "vesentlig høyere affinitet" mener vi at det er en målbar økning av affiniteten overfor den angjeldende delen av CTGF sammenlignet med affiniteten overfor andre beslektede polypeptider. Affiniteten er fortrinnsvis minst 1,5 ganger, 2 ganger, 5 ganger, 10 ganger, 100 ganger, IO<3>ganger, IO<4>ganger, 10<5>ganger, IO<6>ganger eller høyere for den angjeldende delen av CTGF enn for andre proteiner. Bindingsspesifiteten bestemmes fortrinnsvis ved affinitetskromatografi immunutfelling eller ved en in vitro bindingsanalyse så som en radioimmunanalyse (RIA) eller enzymkoblet immunabsorpsjonsanalyse (ELISA) eller ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS) -analyse. Mer foretrukket erholdes bindingsspesifisiteten ved RIA eller affinitetskromatografi som beskrevet nedenfor.

I foretrukne utførelser av oppfinnelsen har antistoffene en affinitet som er lik eller høyere enn affiniteten av mAbl, beskrevet nedenfor, bestemt ved for eksempel Scatchard-analyse ifølge Munson og Pollard (1980, Anal Biochem 107: 220). Antistoffaffinitet er definert som styrken av de samlede ikke-kovalente interaksjonene mellom et enkelt antigenbindende sete i et antistoff og en enkelt epitop på et antigen. Affiniteten beregnes ved å måle assosiasjonskonstanten ( Ka) slik at

hvori [ Ab] er konsentrasjonen av fritt antigenbindende sete på antistoffet, [ Ag] er konsentrasjonen av fritt antigen, [ Ab Ag] er konsentrasjonen av antigenbindende sete på antistoffet som er bundet antigen og Kder dissosiasjonskonstanten for antistoff-antigenkomplekset. Antistoffer ifølge oppfinnelsen har fortrinnsvis en affinitet for CTGF som er høyere enn Kd = 10" , fortrinnsvis høyere enn 10" , fortrinnsvis høyere enn 10"<10>, særlig for terapeutisk anvendelse. Et antistoff ifølge oppfinnelsen har med fordel en affinitet som er lik eller høyere enn affiniteten til mAbl (det vil si en Kd < IO"<9>). Antistoffer som binder samme epitop som mAbl, men som har lavere affinitet (det vi, si høyere Kd) enn mAbl, omfattes imidlertid også av den foreliggende oppfinnelsen og kan være anvendbare i forskjellige analyser og diagnostisje anvendelser som beskrevet heri. Slike antistoffer kan i tillefg være anvendbare i terapeutiskd anvendelser, særlig dersom de har høy affinitet for antigen, som beskrevet nedenfor.

Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan være monovalente, bivalente eller multivalente. I visse utførelser av oppfinnelsen foretrekkes det at antistoffene if.lge oppfinnelsen er bivalente eller multivalente. Et hvilket som helst av antistoffene ifølge oppfinnelsen kan manipuleres for å forbedre aviditeten, for eksempel ved å kombinere epitopbindende seter i en en+elt antistoffkonstruksjon, for eksempel et tristoff, osv. Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan være enkeltkjedede antistoffer.

Under noen omstendigheter kan det være nyttig at antistoffer ifølge oppfinnelsen viser egnet affinitet for CTGF fra andre arter, for eksempel for behandling og forebygging av lidelser i disse artene. For eksempel kan et antistoff ifølge oppfinnelsen som viser en egnet Kdfor CTGF fra hund anvendes for å behandle en CTGF-forbundet lidelse i hunder. Antistoffer ifølge oppfinnelsen som viser affinitet på tvers av artene, så som mAbl, er også anvendbare som forsøksverktøy for undersøkelse av CTGF-assosierte lidelser i forskjellige dyremodeller. I et annet aspekt kodes antistoffet eller delen derav av genetisk materiale som opprinnelig er avledet fra et menneske. Antistoffet kan dannes av celler i kultur, for eksempel ved anvendelse av bakteriofagfremvisningsteknikker eller det kan dannes i et dyr, for eksempel et ikke-menneskelig transgent dyr som inneholder immunoglobulingener avledet fra et menneske.

I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen rekombinante konstruksjoner som omfatter deler av et hvilket som helst av antistoffene ifølge oppfinnelsen som beskrevet ovenfor og et protein avledet fra en annen kilde. Spesifikt omfattes utførelser som omfatter kimære antistoffer i følge krav 1 som omfatter et variabelt område avledet fra et antistoff som beskrevet ovenfor og et konstant område avledet fra en annen kilde. Det variable området kan være avledet fra ethvert antistoff definert ved oppfinnelsen og resulterer spesifikt i antistoffer som bindes til et område i humant CTGF fra aminosyre 143 til tilnærmet aminosyre 154 i SEKV.ID. NR. 2, eller til et ortologt område i CTGF avledet fra en annen art. Det konstante området kan være avledet fra en hvilken som helst kilde. I noen utførelser er det konstante området avledet fra et konstant område i et humant immunglobulin.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også et hvilket som helst av antistoffene beskrevet ovenfor hvori antistoffet i tillegg omfatter et merkingsmiddel som kan tilveiebringe et påvisbart signal, enten alene eller sammen med andre forbindelser. Slike merkingsmidler kan være utvalgt blant, men er ikke begrenset til, gruppen som består av et enzym, en fluorescerende forbindelse, en kjemiluminescerende forbindelse, biotin, avidin og en radioaktiv isotop. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også et hvilket som helst av antistoffene beskrevet ovenfor hvori antistoffet i tillegg omfatter et cytotoksisk middel eller enzym.

I andre utførelser nøytraliserer antistoffene ifølge oppfinnelsen som beskrevet ovenfor i tillegg minst én aktivitet forbundet med CTGF. Slike aktiviteter som er forbundet med CTGF omfatter, men er ikke begrenset til, stimulering av cellemigrering, dannelse av ekstracellulær matrise av en celle in vivo eller ex vivo og/eller reduksjon av fibrose i et individ. I spesielle utførelser er den biologiske aktiviteten utvalgt fra gruppen som består av cellevekst, differensiering av fibroblaster og/eller endotelceller og induksjon av ekspresjon av proteiner som deltar i dannelse og remodellering av ekstracellulær matrise, innbefattet for eksempel kollagener innbefattet, men ikke begrenset til, typene I, II, III og IV; og fibronektin.

I visse utførelser inhiberer antistoffene spesifikt cellemigrering i ex vivo analyser. Antistoffene inhiberer fortrinnsvis CTGF-stimulert kjemotaktisk migrering av glatte muskelceller i en Boyden-kammeranalyse. I for eksempel en cellemigreringsanalyse som beskrives nedenfor, inhiberer antistoffer ifølge oppfinnelsen gjentatt og reproduserbart CTGF-indusert migrering. I forskjellige utførelser reduserer antistoffene spesifikt fibrose i dyremodeller. Antistoffene inhiberer fortrinnsvis utvikling av fibrose i dyremodeller for lunge- og nyrefibrose. Antistoffene svekker for eksempel bleomycinindusert lungefibrose i mus med 60-70%, bestemt ved inhibering av hydroksyprolin (kollagen) -akkumulering i lungene og/eller histologisk undersøkelse av vevspreparater, beskrevet nedenfor. Videre reduserer antistoffene akkumulering av kollagen i en rotterestnyre (det vil si 5/6 nefrektomi) modell og i mus etter unilateral urinlederobstruksjon (UUO) som beskrevet nedenfor.

I andre utførelser modulerer antistoffer ifølge oppfinnelsen interaksjonen mellom et CTGF-polypeptid og en cellereseptor og/eller mellom et CTGF-polypeptid og en utskilt eller membranassosiert samfaktor, slik at en biologisk aktivitet forbundet med CTGF nøytraliseres. Samfaktoren kan være et hvilket som helst protein, karbohydrat og/eller lipid, i visse utførelser er samfaktoren et medlem av TGF-Ø-familien av vekstfaktorer, for eksempel TGF-Ø, BMP-4, osv.

I et annet aspekt reduserer antistoffet fibrose i et individ. I forskjellige utførelser er individet et vev eller et organ. I andre utførelser er individet et dyr, fortrinnsvis et pattedyr, mest foretrukket et menneske. Dersom individet er et vev, omfatter oppfinnelsen spesifikt både endogene vev og ex vivo vev, for eksempel transplantatvev, vev dyrket i kultur, osv. I forskjellige utførelser er vevet utvalgt fra gruppen som består av epitelvev, endotelvev og bindevev. Dersom individet er et organ, omfatter oppfinnelsen spesifikt organer utvalgt fra gruppen som består av nyre, lunge, lever, øye, hjerte og hud. I foretrukne utførelser er individet et dyr, fortrinnsvis et dyr fra en pattedyrart innbefattet rotte, kanin, storfe, sau, gris, mus, hest og primatarter. I en mest foretrukket utførelse er individet et menneske.

I spesifikke utførelser, er antistoffet for anvendelse i medisin, nærmere bestemt for behandling eller forebygging av en CTGF-assosiert lidelse i et individ som har eller som er utsatt for å få en CTGF-assosiert lidelse. Slike lidelser omfatter, men er ikke begrenset til, forskjellige kreftformer innbefattet akutt lymfoblastisk leukemi, dermatofibromer, brystkreft, brystcarcinom, gliom og glioblastom, rhabdomyosarkom og fibrosarkom, desmoplasi, angiolipom, angioleiomyom, desmoplastiske kreftformer og prostatakreft, eggstokkreft, kolorektal kreft, bukspyttkjertelkreft, gastrointestinal kreft og leverkreft og andre tumorvekster og metastaser. CTGF-assosierte lidelser omfatter også forskjellige fibrotiske lidelser innbefattet, men ikke begrenset til, idiopatisk pulmonal fibrose, nyrefibrose, glomerulosklerose, okulær fibrose, osteoartritt, skleroderma, hjertefibrose og leverfibrose. Fibrose kan opptre i ethvert organ eller vev innbefattet et organ utvalgt blant, men ikke begrenset til, nyre, lunge, lever, hjerte og hud; eller et vev utvalgt blant, men ikke begrenset til, epitelvev, endotelvev og bindevev. I andre utførelser kan den CTGF-assosierte lidelsen skyldes en hvilken som helst initierende faktor innbefattet, men ikke begrenset til, eksponering overfor kjemikalier eller biologiske midler, en betennelsesrespons, en autoimmun reaksjon, et traume, kirurgisk behandling, osv. CTGF-assosierte lidelser omfatter også, men er ikke begrenset til, lidelser som skyldes hyperglykemi og hypertensjon. Slike lidelser kan for eksempel opptre grunnet diabetes, fedme, osv., og omfatter diabetisk nefropati, retinopati og kardiovaskulær sykdom.

I forskjellige utførelser tilveiebringer oppfinnelsen følgelig antistoffer som kan anvendes for behandling eller forebygging av CTGF-assosierte lidelser i et individ. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse av slike antistoffer for fremstilling av et medikament for behandling av CTGF-assosierte lidelser.

Det beskrives heri også en fremgangsmåte for nøytralisering av en aktivitet som er forbundet med CTGF som omfatter å sette et antistoff ifølge oppfinnelsen i forbindelse med et CTGF-polypeptid slik at en biologisk aktivitet forbundet med CTGF, for eksempel aktivitetene beskrevet ovenfor, nøytraliseres. Den biologiske aktiviteten kan være en hvilken som helst aktivitet forbundet med CTGF innbefattet, men ikke begrenset til, stimulering av cellemigrering og dannelse av ekstracellulær matrise. I forskjellige utførelser skjer nøytraliseringen in vitro. I andre utførelser skjer nøytraliseringen i et individ in vivo.

I nok et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som beskrevet ovenfor for anvendelse i behandling av en CTGF-assosiert lidelse i en pasient med behov for dette ved administrering av antistoffet eller et farmasøytisk preparat derav til pasienten slik at lidelsen behandles. Individet kan være en pasient som er diagnostisert med eller som mistenkes for å ha en CTGF-assosiert lidelse innbefattet for eksempel en lidelse som skyldes overdrevet dannelse av ekstracellulær matrise. I spesielle aspekter er den CTGF-assosierte lidelsen utvalgt blant kreft eller en fibrotisk lidelse. Kreft omfatter, men er ikke begrenset til, akutt lymfoblastleukemi, dermatofibromer, brystkreft, brystcarcinom, gliom og glioblastom, rhabdomyosarkom og fibrosarkom, desmoplasi, angiolipom, angioleiomyom, desmoplastiske kreftformer og prostatakreft, eggstokkreft, kolorektal kreft, bukspyttkjertelkreft, gastrointestinal kreft og leverkreft og fibrotiske lidelser omfatter, men er ikke begrenset til, idiopatisk pulmonal fibrose, nyrefibrose, glomerulosklerose, okulær fibrose, makulær degenerering, osteoartritt, skleroderma, kronisk hjertesvikt, hjertefibrose og leverfibrose. I andre utførelser kan den CTGF-assosierte lidelsen skyldes en hvilken som helst initierende faktor innbefattet, men ikke begrenset til, eksponering overfor kjemikalier eller biologiske midler, en betennelsesrespons, en autoimmun reaksjon, et traume, kirurgisk behandling, osv. CTGF-assosierte lidelser omfatter også, men er ikke begrenset til, lidelser som skyldes hyperglykemi og hypertensjon. Slike lidelser kan for eksempel opptre grunnet diabetes, fedme, osv., og omfatter diabetisk nefropati, retinopati og kardiovaskulær sykdom.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en sammensetning som omfatter et antistoff som beskrevet ovenfor og minst én annen bestanddel. Bestanddelene kan omfatte enhver forbindelse, ethvert molekyl eller ethvert middel innbefattet for eksempel proteiner, nukleinsyrer, karbohydrater, lipider, osv. I tillegg kan bestanddelene omfatte forskjellige løsemidler, salter og andre bærerstoffer og/eller eksipienter. I noen utførelser er sammensetningen en farmasøytisk sammensetning som omfatter et antistoff som beskrevet ovenfor og minst én tilleggsbestanddel utvalgt blant et løsemiddel, en stabilisator og en eksipient. I en spesiell utførelse omfatter den farmasøytiske sammensetningen et antistoff sammenblandet med et farmasøytisk akseptabelt bærerstoff. Den farmasøytiske sammensetningen kan i tillegg inneholde et andre terapeutisk middel, for eksempel en angiotensinkonverterende enzym (ACE) -inhibitor, et fremskredet glykosyleringssluttproduktkløyvende eller -inhiberende middel, osv. Oppfinnelsen tilveiebringer i tillegg medikamenter som omfatter et antistoff som definert ovenfor for behandling av et individ med en CTGF-assosiert lidelse. Slike lidelser omfatter, men er ikke begrenset til, forskjellige kreftformer og fibrotiske lidelser; lidelser som skyldes betingelser så som myokardialt infarkt, artritt og betennelse; og lidelser grunnet diabetes, fedme og lignende, som kan omfatte diabetisk nefropati, retinopati og kardiovaskulær sykdom.

Det beskrives videre heri en polypeptidsekvens utvalgt fra gruppen som består av SEKV.ID. NR. 14, aminosyre 1 til og med aminosyre 167 i SEKV.ID. NR. 14, SEKV.ID. NR. 20 og aminosyre 1 til og med aminosyre 136 i SEKV.ID. NR. 20. Det beskrives også konservative varianter av polypeptidene og spesifikke fragmenter av humant CTGF utvalgt fra gruppen som består av SEKV.ID. NR. 21 til og med 26 og ortologe CTGF-fragmenter erholdt fra en ikke-menneskelig art.

Polypeptidene som det vises til ovenfor kan være "endrede" polypeptider som definert nedenfor.

I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen polynukleotidsekvenser som koder for et antistoff ifølge oppfinnelsen eller en del derav. Derfor tilveiebringer oppfinnelsen et par av polynukleotidsekvenser omfattende en første sekvens valgt fra gruppen bestående av: (a) en polynukleotidsekvens som koder for SEKV.ID. NR. 14; (b) en polynukleotidsekvens som koder for sekvensen fra aminosyre 1 til

aminosyre 167 i SEKV.ID. NR. 14;

(c) SEKV.ID.NR. 13; og

(d) nukleotid 1 til og med nukleotid 501 i SEKV.ID. NR. 13; og en andre polynukleotidsekvens omfattende en sekvens valgt fra gruppen bestående av: (a<1>) en polynukleotidsekvens som koder for SEKV. ID. NR: 20;

(b<1>) en polynukleotidsekvens som koder for sekvensen fra aminmosyre 1 til 136 i SEKV. ID. NR: 20;

(c<1>) SEKV. ID. NR: 19; og

(d<1>) nukleotid 1 til nukleotid 408 i SEKV. ID. NR: 19.

Den første polynukleotidsekvensen utvalgt fra gruppen som består av en polynukleotidsekvens som koder for SEKV.ID. NR. 14, en polynukleotidsekvens som koder for aminosyre 1 til og med aminosyre 167 i SEKV.ID. NR. 14, polynukleotidsekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 13 og et polynukleotid som omfatter nukleotid 1 til og med nukleotid 501 i SEKV.ID. NR. 13. Den andre polynukleotidsekvensen utvalgt fra gruppen som består av en polynukleotidsekvens som koder for SEKV.ID. NR. 20, en polynukleotidsekvens som koder fra aminosyre 1 til og med aminosyre 136 i SEKV.ID. NR. 20, polynukleotidet ifølge SEKV.ID. NR. 19 og et polynukleotid som omfatter nukleotid 1 til og med nukleotid 408 i SEKV.ID. NR. 19.

Polynukleotidene som det vises til ovenfor kan være "endrede" polynukleotider, som definert nedenfor.

Oppfinnelsen omfatter i tillegg et par rekombinante polynukleotider i følge krav 38. I ett aspekt koder det første rekombinante polynukleotidet for aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 14 eller det variable domenet i denne. I et annet aspekt omfatter det første rekombinante polynukleotidet SEKV.ID. NR. 13.1 nok et aspekt koder det andre rekombinante polynukleotidet for aminosyresekvensene ifølge SEKV.ID. NR. 20 eller det variable domenet i denne. I nok et aspekt omfatter det andre rekombinante polynukleotidet SEKV.ID. NR. 19.

Oppfinnelsen tilveiebringer også vertsceller som er transfektert med de rekombinante polynukleotidene som er beskrevet ovenfor. Vertsceller omfatter en hvilken som helst prokaryot og eukaryot vertscelle innbefattet for eksempel klonede cellelinjer som opprettholdes ved dyrkningsfremgangsmåter som er kjente blant fagfolk. Vertsceller omfatter også transgene planter og dyr avledet fra transformerte celler, for eksempel stamceller. I en utførelse omfatter vertscellen en celle som er samtransfektert med et polynukleotid som koder for SEKV.ID. NR. 14 og et polynukleotid som koder for SEKV.ID. NR. 20 og som danner et funksjonelt antistoff med egenskaper som i alt vesentlig er de samme som mAbl har. I spesielle utførelser er antistoffet CLN1.1 en annen spesiell utførelse er vertscellen identifisert ved ATCC-betegnelsen PTA- 6006.

Disse og andre utførelser av den foreliggende oppfinnelsen vil være åpenbare for fagfolk i lys av beskrivelsen heri og alle slike utførelser omfattes spesifikt.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figurene IA og IB viser strukturen av og sekvenskonserveringen i bindevevsvekstfaktor. Figur IA viser den modulære domenestrukturen av CTGF som omfatter konserverte motiver for insulinlignende vekstfaktorbindende protein

(IGF-BP) og Von Willebrands faktor (VWC) i det N-terminale fragmentet og trombospondin (TSP1) og cysteinknutemotivet (CT) i det C-terminale fragmentet.

Figur IB viser en flersekvenssammenstilling mellom N-terminale fragmenter av CTGF-ortologer fra menneske (hCTGF), storfe (bCTGF), gris (pCTGF), rotte (rCTGF) og mus (FISP12). Sammenstillingen ble fremstilt ved anvendelse av programmet CLUSTAL W (v. 1.74; Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res 22: 4673-4680) ved anvendelse av standardparametere. I figuren angir en stjerne (<*>) fullstendig konservering av aminosyreresten blant de representerte artene. Figurene 2A og 2B viser Scatchard-fremstillinger for kompetitiv binding mellom merket og umerket human CTGF til anti-CTGF-antistoffene mAb2 og mAbl henholdsvis. mAbl er et eksemplarisk antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Figur 3A viser Fab-antistoffragment (Mr 45 kD) erholdt etter papainkløyving av det tilsvarende IgG-antistoffet mAbl og påfølgende protein A-sefaroseaffinitetskromatografi (spor 2), vist ved SDS-PAGE. Figur 3B viser binding av et Fab-fragment og det tilsvarende IgG til CTGF over økende konsentrasjoner av et kaotropt middel (tiocyanat). Figurene 4A og 4B viser Scatchard-fremstillinger av kompetitiv binding mellom merket rekombinant humant CTGF og umerket rotte-CTGF til anti-CTGF-antistoffene mAb2 og mAbl henholdsvis. Figurene 5A, 5B og 5C viser de terapeutiske virkningene av et antistoff ifølge oppfinnelsen i en modell for interstitiell fibrose i lungen. Figur 5A viser virkningen av antistoffbehandling på bleomycinindusert økning av hydroksyprolininnholdet i muselunger. Antallet dyr i hver gruppe er vist i parentes under hver søyle og behandlingsgruppene er angitt langs x-aksen. SA: Saltløsning; BL: Bleomycin; AbsJ: Blanding av 3 monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen; mAbl, et eksemplarisk antistoff ifølge oppfinnelsen. Verdiene er uttrykt som middelverdi SE. Figurene 5B og 5C viser hematoksylin- og eosinfargede parafinsnitt av pulmonale proksimale acini fra mus behandlet med bleomycin ved intratrakeal injeksjon og deretter behandlet med saltløsning henholdsvis antistoffer ifølge oppfinnelsen. I figur 5B har den tynne interalveolære septa acinus et unormalt utseende og betennelsesceller og fibrose foreligger. I figur 5C er parenkym stort sett normalt og det er kun en moderat fortykkelse av interalveolære septa. Figurene 6A, 6B og 6C viser de terapeutiske virkningene av et antistoff ifølge oppfinnelsen i en modell for tubulointerstitiell fibrose i nyren. Figur 6A viser reduksjonen i fibrose grunnet unilateral urinlederobstruksjon (UUO) etter behandling med et antistoff ifølge oppfinnelsen, mAbl, eller et antistoff rettet mot C-enden av CTGF, mAb3. Omfanget av fibrose er uttrykt som forholdet mellom hydroksyprolin og prolin i den obstrukterte nyren sammenlignet med den kontralaterale ikke-obstrukterte nyren (middelverdi + SE). Figurene 6B og 6C viser trikromfargede parafinsnitt fra obstrukterte nyrer etter behandling med henholdsvis saltløsning eller antistoff. Figurene 7 A og 7B viser den terapeutiske virkningen av et antistoff ifølge oppfinnelsen i en modell for glomerulær fibrose i nyren. Figurene 7A og 7B viser mikroskopfotografier av trikromfarget restnyrevev etter behandling med henholdsvis saltløsning eller antistoff. Figurene 8A, 8B, 8C, 8D, 8E, 8F og 8G viser induksjonen av lokaliserte subkutane granulomer hos nyfødte mus. Til venstre viser figurene 8A og 8B dannelse av granulom i setet for subkutan injeksjon av TGFP alene eller TGFP og CTGF henholdsvis. Til høyre viser figurene 8C til og med 8G et histologisk sett som representerer poengsystemet (fra 0 [normal] til 4 [fibrotisk]) som anvendes for evaluering av antistoffets terapeutiske virkning. Figur 9 viser graden av fibrose i en lokalisert subkutan granulommodell med og uten behandling med anti-CTGF-antistoffer. mAbl er et eksemplarisk antistoff ifølge oppfinnelsen, mens mAb3 er et anti-CTGF-antistoff som spesifikt bindes til en C-terminal CTGF-epitop. Figurene 10A, 10B, 10C og 10D viser den terapeutiske virkningen av et antistoff ifølge oppfinnelsen i organfibrose ved anvendelse av en modell for systemisk sklerose. Hvert felt viser endringer i kollagenakkumulering i de angjeldende organer etter behandling med saltløsning (kontroll), TGFP og CTGF eller behandling med TGFP og CTGF samtidig med antistoffbehandling. Figurene 11A og 11B viser skjematisk kloningen av immunoglobulin tung- og lettkjede fra et eksemplarisk antistoff ifølge oppfinnelsen, mAbl. Figur 11A viser sammenstillingen av tungkjede PCR-fragmenter som ble anvendt for å bestemme den kodende sekvensen for mAbl (tungkjeden). Figur 11B viser sammenstillingen av lettkjede PCR-fragmenter som ble anvendt for å bestemme den kodende sekvensen (CDS) for mAbl lettkjeden. Figurene 12A og 12B viser bindingsundersøkelser mellom CTGF og TGFp. Figur 12A viser graden av binding mellom TGFP og enten CTGF, et fragment av CTGF som kodes av ekson 3 (ekson 3) eller et fragment av CTGF som kodes av ekson 5 (ekson 5) i nærvær eller fravær av anti-CTGF-antistoff. Figur 12B viser i hvilken grad anti-CTGF-antistoffer inhiberer interaksjonen mellom TGFP og CTGF. I figuren omfatter antistoffene eksemplariske antistoffer ifølge oppfinnelsen, mAbl og mAb4 og et antistoff som spesifikt bindes til en C-terminal CTGF-epitop, mAb3.

BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Før de foreliggende sammensetninger og fremgangsmåter beskrives, bør det forstås at oppfinnelsen ikke er begrenset til de spesielle metodologiene, fremgangsmåtene, cellelinjene, analysene og reagensene som beskrives, da disse kan variere. Det bør også forstås at terminologien som anvendes heri benyttes for å beskrive spesielle utførelser av den foreliggende oppfinnelsen og ikke på noen måte er ment å begrense omfanget av den foreliggende oppfinnelsen, som beskrevet i de vedlagte krav.

Det må bemerkes at som anvendt heri og i de vedlagte krav, omfatter entallsformene "en" og "et" henvisning til flere forekomster, med mindre sammenhengen klart tilsier noe annet. Således omfatter for eksempel en henvisning til "et fragment" et flertall av slike fragmenter, mens en henvisning til "et antistoff" er en henvisning til ett eller flere antistoffer og til ekvivalenter av disse som er kjente blant fagfolk, osv.

Med mindre de er definert annerledes, har alle tekniske og vitenskapelige begreper som anvendes heri den samme betydning som vanligvis forstås av en gjennomsnittsfagperson innen faget som den foreliggende oppfinnelsen tilhører. Selv om hvilke som helst av fremgangsmåter og materialer som ligner eller er ekvivalente med den som beskrives heri kan anvendes ved utførelse eller analyse av den foreliggende oppfinnelsen, beskrives nå de foretrukne fremgangsmåtene, innretningene og materialene. Intet heri skal oppfattes som en innrømmelse av at oppfinnelsen ikke er berettiget til å foreløpe slik beskrivet grunnet tidligere oppfinnelse.

Utførelsen av den foreliggende oppfinnelsen vil, dersom ikke annet er angitt, benytte konvensjonelle fremgangsmåter innen kjemi, biokjemi, molekylærbiologi, cellebiologi, genetikk, immunologi og farmakologi som ligger innenfor teknikkens stand. Slike teknikker er fullt ut forklart i litteraturen. Se for eksempel Gennaro, A.R., red. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utgave, Mack Publishing Co.; Colowick, S. et al., red. Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, bind I-Iv (D.M.Weir og CC. Blackwell, red., 1986, Blackwell Scientific Publications); Maniatis, T. et al., red.

(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, bind I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al., red. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4. utgave, John Wiley & Sons; Ream et al., red. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2. utgave (Newton & Graham, red. 1997, Springer Verlag).

Definisjoner

"Bindevevsvekstfaktor" eller "CTGF" viser til aminosyresekvensene til i alt vesentlig rent CTGF avledet fra en hvilken som helst art, fortrinnsvis en pattedyrart, innbefattet rotte, kanin, storfe, sau, gris, mus, hest og hominid, fortrinnsvis mennesket og fra enhver kilde, enten naturlig, syntetisk, halvsyntetisk eller rekombinant.

Begrepet "N-terminalt fragment" av CTGF viser til et hvilket som helst polypeptid som omfatter sekvenser som er avledet fra den aminoterminale delen av et CTGF-polypeptid eller til enhver variant eller ethvert fragment derav. N-terminale fragmenter kan omfatte hele, intet av eller deler av CTGF fra den innledende metioninresten til det cysteinfrie "hengsel"-området som vist i figurene IA og IB. Videre kan N-terminale fragmenter omfatte hele, intet av eller deler av det insulinbindende vekstfaktorbindende proteinmotivet og/eller von Willebrand type C-domenet (SEKV.ID. NR. 21) som vist i figur IB. N-terminale fragmenter av CTGF kan også omfatte hele, intet av eller deler av det cysteinfrie området. Videre kan N-terminale fragmenter av CTGF være hvilke som helst femten eller flere på hverandre følgende aminosyrer som inngår ethvert N-terminalt fragment som definert ovenfor. 1 ett aspekt viser "N-terminalt fragment" av CTGF til polypeptidsekvenser avledet fra den aminoterminale delen av humant CTGF. Slike fragmenter kan omfatte hele området fra aminosyrerest 1 til tilnærmet aminosyrerest 198 i SEKV.ID. NR. 2 eller fra tilnærmet aminosyre 23 til tilnærmet aminosyre 198 i SEKV.ID. NR. 2. Det N-terminale fragmentets grense i hengselområdet kan om ønskelig defineres ved ett av flere proteasekløyvingsseter som er definert i SEKV.ID. NR. 2 så som kymotrypsinkløyvingsseter mellom aminosyrerestene 179 og 180, mellom aminosyrerestene 182 og 183 og mellom aminosyrerestene 188 og 189; plasminkløyvingsseter mellom aminosyrerestene 183 og 184 og mellom aminosyrerestene 196 og 197; og et beinmorfogenetisk protein-1-kløyvingssete mellom aminosyrerestene 169 og 170. I tillegg kan N-terminale fragmenter av humant CTGF omfatte hele, intet av eller deler av området fra aminosyre 27 til aminosyre 97 i SEKV.ID. NR. 2, aminosyre 103 til aminosyre 166 i SEKV.ID.NR. 2 eller aminosyre 167 til aminosyre 198 i SEKV.ID. NR. 2. Videre kan N-terminale fragmenter av humant CTGF være hvilke som helst femten eller flere på hverandre følgende aminosyrer som inngår i ethvert av de N-terminale fragmentene som er definert ovenfor.

I spesifikke utførelser omfatter de N-terminale CTGF-fragmentene ifølge den foreliggende oppfinnelsen sekvenser som er utvalgt fra følgende områder i humant CTGF (SEKV.ID. NR. 2) og ortologe fragmenter derav avledet fra en annen art, fortrinnsvis en pattedyrart innbefattet rotte, kanin, storfe, sau, gris, mus og hest: Aminosyrerest 23 til aminosyrerest 96 (kodes av ekson 2); aminosyrerest 27 til aminosyrerest 97 (IGF-BP-motiv); aminosyrerest 97 til aminosyrerest 180 (kodes av ekson 3); aminosyrerest 103 til aminosyrerest 166 (VWC-domene); aminosyrerest 167 til aminosyrerest 198 (cysteinfritt hengseldomene); aminosyrerest 23 til aminosyrerest 180 (kodes av eksonene 2 og 3); aminosyrerest 27 til aminosyrerest 166 (IGF-BP og VWC); og aminosyrerest 23 til aminosyrerest 198 (se figur IB).

Begrepet "C-terminalt fragment" av CTGF viser til et hvilket som helst polypeptid som omfatter sekvenser avledet fra den karboksyterminale delen av en CTGF-aminosyrepolypeptidsekvens eller til en hvilken som helst variant eller hvilket som helst fragment derav. C-terminale fragmenter av CTGF kan omfatte hele, intet av eller deler av det cysteinfrie området i CTGF-polypeptidet (aminosyre 167 til aminosyre 198 i SEKV.ID. NR. 2).

De C-terminale fragmentene kan omfatte hele, intet av eller deler av CTGF fra det cysteinfrie hengselområdet til proteinets ende. Videre kan C-terminale fragmenter omfatte hele, intet av eller deler av trombospondinmotivet og/eller cysteinknutemotivet. Videre kan C-terminale fragmenter av CTGF være hvilke som helst femten eller flere på hverandre følgende aminosyrer som inngår i et hvilket som helst av de C-terminale fragmentene som er definert ovenfor.

I noen aspekter kan C-terminale fragmenter omfatte hele området fra aminosyrerest 181 til tilnærmet aminosyrerest 349 i SEKV.ID. NR. 2. Grensen for det C-terminale fragmentet i hengselområdet kan om ønskelig defineres ved ett av flere proteasekløyvingsseter som er definert i SEKV.ID. NR. 2 så som kløyvingssetene for kymotrypsin, plasmin og beinmorfogenetisk protein-1 som er definert ovenfor. I tillegg omfatter C-terminale fragmenter sekvenser utvalgt fra følgende områder i humant CTGF (SEKV.ID. NR. 2) og ortologe fragmenter derav avledet fra en annen art, fortrinnsvis en pattedyrart, innbefattet rotte, kanin, storfe, sau, gris, mus og hest: Aminosyre 201 til aminosyre 242 i SEKV.ID. NR. 2, aminosyre 247 til aminosyre 349 i SEKV.ID. NR. 2, aminosyre 248 til aminosyre 349 i SEKV.ID. NR. 2 eller aminosyre 249 til aminosyre 346 i SEKV.ID. NR. 2. Videre kan C-terminale fragmenter av humant CTGF være hvilke som helst femten eller flere på hverandre følgende aminosyrer som inngår i ethvert C-terminalt fragment som definert ovenfor.

Begrepene "cysteinfritt område" eller "hengselområde" i CTGF viser til ethvert

polypeptid avledet fra tilnærmet aminosyrerest 167 til tilnærmet aminosyrerest 198 i humant CTGF (SEKV.ID. NR. 2) og ortologe fragmenter derav avledet fra en annen art, fortrinnsvis en pattedyrart innbefattet rotte, kanin, storfe, sau, gris, mus og hest.

Begrepene "aminosyresekvens" eller "polypeptid" eller "polypeptider" som anvendt heri, viser til oligopeptid-, peptid-, polypeptid- eller proteinsekvenser og fragmenter av disse, og til naturlig forekommende eller syntetiske molekyler. Et polypeptid- eller aminosyrefragment er en hvilken som helst del av et polypeptid som bibeholder minst én strukturell og/eller funksjonell egenskap ved polypeptidet. CTGF-fragmenter omfatter enhver del av en CTGF-polypeptidsekvens som bibeholder minst én strukturell eller funksjonell egenskap ved CTGF. Dersom "aminosyresekvens" benyttes for å vise til polypeptidsekvensen til et naturlig forekommende proteinmolekyl, er "aminosyresekvens" og lignende begreper ikke ment å begrense aminosyresekvensen til den fullstendige native sekvensen som er forbundet med det angitte proteinmolekylet.

Begrepet "immunogenisitet" gjelder en forbindelses evne til å stimulere immunresponsen og dannelsen av et antistoff ved at den innføres i kroppen. Et middel som har egenskapen immunogenisitet, sies å være immunogen. Immunogene midler kan omfatte, men er ikke begrenset til, en rekke makromolekyler, for eksempel proteiner, lipoproteiner, polysakkarider, nukleinsyre, bakterier og bestanddeler av bakterier og virus og virale bestanddeler. Immunogene midler har ofte en molekylvekt som er høyere enn 10 kDa. Antigene fragmenter viser til fragmenter av CTGF-polypeptid, fortrinnsvis fragmenter med en lengde på tilnærmet fem til femten aminosyrer som bibeholder minst ett biologisk eller immunologisk aspekt ved CTGF-polypeptidaktivitet.

Begrepet "antistoff viser til intakte molekyler så vel som til fragmenter av disse så som Fab-fragmenter, F(ab')2-fragmenter og Fv-fragmenter som kan bindes til den epitopiske determinanten og omfatter polyklonale og monoklonale antistoffer. Antistoffer som bindes til CTGF eller fragmenter av CTGF kan fremstilles ved anvendelse av intakte polypeptider eller ved anvendelse av fragmenter som inneholder små peptider av interesse som det immuniserende antigenet. Polypeptidet eller oligopeptidet som anvendes for immunisering av et dyr (for eksempel en mus, en rotte, en kanin, en kylling, en kalkun, en geit, osv.) kan være erholdt ved translasjon av RNA eller ved kjemisk syntese og kan om ønskelig være konjugert til et bærerprotein. Hyppig anvendte bærere som kan kobles kjemisk til peptider, omfatter for eksempel storfeserumalbumin, tyroglobulin og hemocyanin fra albuskjell (KLH).

Begrepet "monoklonalt antistoff" som anvendt heri, viser til en i alt vesentlig homogen populasjon av antistoffer, det vil si at de enkelte antistoffene som utgjør populasjonen er identiske når det gjelder spesifisitet og affinitet, bortsett fra mulige naturlig forekommende mutasjoner som kan foreligge i mindre mengder. Bemerk at en monoklonalt antistoffsammensetning kan inneholde mer enn ett monoklonalt antistoff.

De monoklonale antistoffene som omfattes av oppfinnelsen omfatter hybride og rekombinante antistoffer (for eksempel "humaniserte" antistoffer) uavhengig av opphavsarten, immunoglobulinklassen eller underklassebetegnelsen, så vel som antistoffragmenter (for eksempel Fab, F(ab')2og Fv) som har minst en av de spesielle egenskapene forbundet med antistoffene som beskrives heri. Foretrukne utførelser omfatter antistoffer som kan bindes til i alt vesentlig samme epitop som gjenkjennes av det monoklonale antistoffet mAbl og/eller som har en affinitet for denne epitopen som er høyere enn eller lik affiniteten av mAbl.

Begrepet "monoklonal" betegner antistoffets egenskap som en i alt vesentlig homogen populasjon av antistoffer og skal ikke oppfattes som at det krever at antistoffet er fremstilt på en spesiell måte. De monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen kan for eksempel fremstilles ved anvendelse av hybridomfremgangsmåten som først ble beskrevet av Kohler og Milstein (1975, Nature 256: 495-497) eller de kan fremstilles ved rekombinante DNA-fremgangsmåter. Se for eksempel Celltech Therapeutics Ltd., europeisk patentskrift EP-0 120 694; Cabilly et al., U.S. patentskrift nr. 4,816,567; eller Mage og Lamoyi (1987; i: Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, sidene 79-97).

Begrepet "nøytraliserende antistoff" som anvendt heri, viser til et antistoff, fortrinnsvis et monoklonalt antistoff, som er i stand til i alt vesentlig å inhibere eller fjerne en biologisk aktivitet forbundet med CTGF. Et nøytraliserende antistoff vil typisk inhibere binding av CTGF til en samfaktor så som TGFP, til en CTGF-spesifikk reseptor som er forbundet med en målcelle eller til et annet biologisk mål. I en spesiell utførelse vil et nøytraliserende antistoff inhibere en biologisk aktivitet forbundet med CTGF i en grad som er tilnærmet lik eller høyere enn den inhiberende virkningen av mAbl. Et nøytraliserende antistoff vil fortrinnsvis inhibere en biologisk aktivitet forbundet med CTGF i en grad som er tilnærmet lik eller høyere enn den inhiberende virkningen av CLN1.

Uttrykket "CTGF-assosierte lidelser" som anvendt heri, viser til tilstander og sykdommer som er forbundet med en unormal eller endret ekspresjon eller aktivitet av CTGF. Unormal ekspresjon av CTGF er assosiert med celleproliferative lidelser så som de grunnet endotelcelleproliferasjon; cellemigrasjon; tumorlignende vekst; generell arrdannelse i vev; og forskjellige sykdommer som særpreges ved uheldig deponering av ekstracellulær matrise.

CTGF-assosierte lidelser omfatter, men er ikke begrenset til, lidelser som omfatter angiogenese og andre prosesser som spiller en sentral rolle i tilstander som proliferativ vitreoretinopati; kreft innbefattet akutt lymfoblastleukemi, dermatofibromer, brystkreft, brystcarcinom, gliom og glioblastom, rhabdomyosarkom og fibrosarkom, desmoplasi, angiolipom, angioleiomyom, desmoplastiske kreftformer og prostatakreft, eggstokkreft, kolorektal kreft, bukspyttkjertelkreft, gastrointestinal kreft og leverkreft; andre tumorvekster og metastaser; osv.

CTGF-assosierte lidelser omfatter også fibrotiske lidelser og beslektede tilstander så som overdrevet arrdannelse som følge av lokalisert eller systemisk fibrose, kronisk eller akutt fibrose i organer så som nyre, lunger, lever, øyne, hjerte, hud, osv.; eller et vev utvalgt fra, men ikke begrenset til, epitelvev, endotelvev og bindevev. Fibrose kan også opptre i øyet og ledd. Slike CTGF-assosierte lidelser omfatter for eksempel hjertefibrose innbefattet reaktiv hjertefibrose eller hjerteremodellering etter myokardialt infarkt eller kongestiv hjertesvikt; pulmonale lidelser innbefattet interstitiell pulmonal fibrose, osv.; fibrose forbundet med dialyse innbefattet peritoneal dialyse, for eksempel kontinuerlig ambulatorisk peritoneal dialyse (CAPD); peridural fibrose; nyrefibrose; pulmonal fibrose; interstitiell fibrose; hudfibrose; og fibrose som følge av akutte eller gjentatte traumer innbefattet kirurgisk behandling, kjemoterapi, strålebehandling, allotransplantatavstøtning, kronisk og akutt transplantatavstøtning (for eksempel nyre, lever eller andre organer); bronkiolitit obliterans, for eksempel etter lungetransplantasjon; og betennelse og infeksjon, for eksempel grunnet sykdom eller skade.

I tillegg omfatter CTGF-assosierte lidelser, men er ikke begrenset til, sklerotiske tilstander innbefattet systemisk sklerose, skleroderma, keloider, hypertrofisk arrdannelse og andre dermatologiske sykdommer og tilstander; aterosklerose så som tilstander som omfatter aterosklerotiske plakk og aterosklerose forbundet med diabetes, peritoneal dialyse, osv.; artritt innbefattet revmatoid artritt, osteoartritt og andre leddbetennelsestilstander, osv.; interstitielle sykdommer innbefattet interstitiell fibrose; Crohns sykdom; inflammatorisk tarmsykdom; retinopatier innbefattet for eksempel proliferativ vitreoretinopati, ikke-proliferativ diabetisk retinopati, proliferativ diabetisk retinopati og makuladegenerering (innbefattet aldersrelatert og juvenil (Stargardts) sykdom og pigmentepitelløsning); nefropatier innbefattet diabetisk nefropati, IgA-assosiert nefropati, nefropati grunnet toksisitet, lupus nyresykdom, osv.; og tilstander forbundet med kjemisk toksisitet og tubulusødeleggelse.

CTGF-assosierte lidelser omfatter også, men er ikke begrenset til, lidelser som skyldes hyperglykemi, hypertensjon, fremskredet glykosyleringssluttprodukt (AGE) -dannelse, osv. Slike lidelser kan for eksempel opptre grunnet diabetes, fedme, osv., og omfatter diabetisk nefropati, retinopati og kardiovaskulær sykdom. Videre kan CTGF-assosierte lidelser skyldes en hvilken som helst initierende faktor innbefattet, men ikke begrenset til, eksponering overfor kjemikalier eller biologiske midler, en betennelsesrespons, en autoimmun reaksjon, traume, kirurgisk behandling, osv. I noen utførelser anvendes fremgangsmåtene for behandling av en pasient som er predisponert for en CTGF-assosiert lidelse grunnet en tilstand som omfatter, men ikke er begrenset til, myokardialt infarkt, artritt og lokal eller systemisk betennelse.

De "proliferative" prosessene og lidelsene som det vises til heri, omfatter patologiske tilstander som særpreges ved kontinuerlig oppformering av celler, noe som fører til overvekst av en cellepopulasjon i et vev. Cellepopulasjonene er ikke nødvendigvis transformerte, tumorigene eller ondartede celler, men kan også omfatte normale celler. For eksempel kan CTGF delta patologisk ved å indusere en proliferativ lesjon i intimalaget i en arterievegg, noe som fører til aterosklerose, eller ved å stimulere neovaskularisering.

"Kreft" viser til enhver autonom vekst av vev innbefattet ukontrollert, unormal vekst av celler, eller enhver ondartet tumor med potensiale for ubegrenset vekst som ekspanderer lokalt ved invasjon og systemisk ved metastase. Kreft viser også til enhver unormal tilstand grunnet kreft.

Begrepet "fibrose" viser unormal prosessering av fibrøst vev eller fibroide eller fibrøs degenerering. Fibrose kan skyldes forskjellige skader eller sykdommer og kan ofte være en følge av kronisk transplantatavstøtning forbundet med transplantasjon av forskjellige organer. Fibrose omfatter typisk unormal dannelse, akkumulering eller deponering av bestanddeler av den ekstracellulære matrisen, innbefattet overproduksjon og forhøyet deponering av for eksempel kollagen og fibronektin. "Fibrose" anvendes heri i sin bredeste betydning for å vise til enhver overdrevet dannelse eller deponering av ekstracellulære matriseproteiner. Det finnes en rekke eksempler på fibrose innbefattet dannelse av arrvev etter et hjerteattakk som svekker hjertets evne til å pumpe. Diabetes gir ofte skader/arrdannelse i nyrene, noe som fører til et gradvis tap av nyrefunksjonen; og i øynene, noe som fører til tap av synet. Etter kirurgisk behandling kan arrvev dannes mellom indre organer og gi kontraktur, smerte og i noen tilfeller ufruktbarhet. Viktige organer så som hjerte, nyre, lever, øye og hud er utsatt for kronisk arrdannelse, ofte forbundet med andre sykdommer. Hypertrofiske arr (ikke ondartet vevsmasse) er en vanlig form for fibrose som skyldes brannsår og andre traumer. I tillegg finnes det en rekke andre fibroproliferative lidelser innbefattet skleroderma, keloider og aterosklerose som er forbundet med generell arrdannelse i vev, tumorlignende utvekster i huden eller vedvarende arrdannelse i blodkar som svekker evnen til å transportere blod.

Begrepene "nukleinsyre" eller "polynukleotid" eller "polynukleotider" viser til oligonukleotider, nukleotidsekvenser eller polynukleotider eller hvilke som helst fragmenter av disse og til DNA eller RNA av naturlig eller syntetisk opphav som kan være enkelttrådet eller dobbelttrådet og kan representere sens- eller antisenstråden, peptidnukleinsyre (PNA) eller ethvert annet DNA-lignende eller RNA-lignende materiale av naturlig eller syntetisk opphav. Polynukleotidfragmenter er en hvilken som helst del av et polynukleotidsekvens som bibeholder i alt vesentlig én strukturell eller funksjonell egenskap forbundet med polynukleotidet. Polynukleotidfragmenter kan ha varierende lengde, for eksempel mer enn 60 nukleotider lange, minst 100 nukleotider lange, minst 1000 nukleotider lange eller minst 10000 nukleotider lange.

"Endrede" polynukleotider omfatter polynukleotider med delesjoner, innsettinger eller substitusjoner av forskjellige nukleotider, noe som fører til et polynukleotid som koder for det samme eller et funksjonelt ekvivalent polypeptid. Innbefattet i denne definisjonen er sekvenser som viser polymorfismer som kan, men ikke må, være lette å påvise ved anvendelse av spesielle oligonukleotidprober eller ved fjerning av ukorrekt eller uventet hybridisering til alleler, med et lokus som er et annet enn det normale kromosomale lokuset for den angjeldende polynukleotidsekvensen.

"Endrede" polypeptider kan inneholde delesjoner, innsettinger eller substitusjoner av aminosyrerester som gir en "taus" endring og fører til et funksjonelt ekvivalent polypeptid. Bevisste aminosyresubstitusjoner kan innføres basert på likhet i polaritet, ladning, løselighet, hydrofobisitet, hydrofilisitet og/eller amfipatiske egenskaper ved aminosyrerestene, så lenge som den biologiske eller immunologiske aktiviteten til det kodende polypeptidet bibeholdes. For eksempel kan negativt ladde aminosyrer omfatte aspartinsyre og glutaminsyre; positivt ladde aminosyrer kan omfatte lysin og arginin; og aminosyrer med uladde polare sidekjeder med hydrofilisitetsverdier som ligner hverandre kan omfatte leukin, isoleukin og valin, glysin og alanin, asparagin og glutamin, serin og treonin og fenylalanin og tyrosin.

En polypeptid- eller aminosyre-"variant" er en aminosyresekvens som er endret i en eller flere aminosyrer relativt til en gitt aminosyresekvens. En polypeptidvariant kan ha konservative endringer hvori en substituert aminosyre har strukturelle eller kjemiske egenskaper som ligner egenskapene til den erstattede aminosyren, for eksempel erstatning av leukin med isoleukin. En variant kan også ha ikke-konservative endringer hvori den substituerte aminosyren har fysiske egenskaper som er forskjellige fra egenskapene til den erstattede aminosyren, for eksempel erstatning av glysin med tryptofan. Analoge mindre variasjoner kan også omfatte aminosyredelesjoner eller -innsettinger eller begge deler. Aminosyrevarianter bibeholder fortrinnsvis visse strukturelle eller funksjonelle egenskaper forbundet med et gitt polypeptid. Retningslinjer vedrørende hvilke aminosyrerester som kan substitueres, innsettes eller deleteres, kan for eksempel finnes ved anvendelse av datamaskinprogrammer som er velkjente innen faget så som programvaren LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI).

En polynukleotidvariant er en variant av en gitt polynukleotidsekvens som fortrinnsvis har minst tilnærmet 80%, mer foretrukket minst tilnærmet 90% og mest foretrukket minst 95% polynukleotidsekvenslikhet med den angjeldende polynukleotidsekvensen. Fagfolk vil forstå at som en følge av den genetiske kodens degenererthet, kan et stort antall polynukleotidsekvens varianter som koder for et gitt protein, noen med minimal homologi med polynukleotidsekvensen til noe kjent og naturlig forekommende gen, fremstilles. Således omfatter oppfinnelsen enhver mulig variasjon av polynukleotidsekvensen som kan fremstilles ved å utvelge kombinasjoner basert på mulige kodonvalg. Disse kombinasjonene utføres i samsvar med de standard kodontriplettene i den genetiske koden og alle slike variasjoner skal anses å være spesifikt beskrevet heri.

En "delesjon" er en endring i en aminosyre- eller nukleotidsekvens som fører til fravær av en eller flere aminosyrerester eller nukleotider.

Begrepene "innsetting" eller "addering" viser til en endring i en polypeptid- eller polynukleotidsekvens som fører til addering av e. eller flere aminosyrerester eller nukleotider, sammenlignet med det naturlig forekommende molekylet.

Begrepet "funksjonell ekvivalent" som anvendt heri, viser til et polypeptid eller polynukleotid som besitter minst én funksjonell og/eller strukturell egenskap forbundet med et gitt polypeptid eller po,ynukleotid. En funksjonell ekvivalent kan inneholde modifikasjoner som muliggjør utførelse av en spesifikk funksjon. Begrepet "funksjonell ekvivalent" er ment å omfatte fragmenter, mutanter, hybrider, varianter, analoger eller kjemiske derivater av et molekyl.

Begrepet "mikromatrise" viser til ethvert arrangement av nukleinsyrer, aminosyrer, antistoffer, osv., på et underlag. Underlaget kan være ethvert egnet støttemiddel, for eksempel kuler, glass, papir, nitrocellulose, nylon eller enhver egnet membran, osv. Et underlag kan være ethvert stivt eller halvstivt støttemiddel innbefattet, men ikke begrenset til, membraner, filtre, plater, brikker, objektglass, fibere, kuler innbefattet magnetiske eller ikke-magnetiske kuler, geler, rør, plater, polymerer, mikropartikler, kapillærer, osv. Underlaget kan omfatte en overflate som kan belegges og/eller ha en rekke forskjellige overflateformer så som brønner, pinner, furer, kanaler og porer, til hvilke nukleinsyrene, aminosyrene, osv., kan bindes.

Begrepet "prøve" anvendes heri i sin bredeste betydning. Prøver kan være avledet fra enhver kilde, for eksempel fra kroppsvæsker, sekreter, vev, celler eller celler i kultur innbefattet, men ikke begrenset til, spytt, blod, u2in, serum, plasma, glasslegeme, synovialvæske, cerebral spinalvæske, amnionvæske og organvev (for eksempel biopsivev); fra kromosomer, organeller eller andre membraner isolert fra en celle; fra genomisk DNA, cDNA, RNA, mRNA, osv.; og fra klarnede celler eller vev eller blot eller avtrykk fra slike celler eller vev. Prøver kan være avledet fra enhver kilde så som for eksempel fra et menneske, fra et ikke-menneskelig pattedyr, osv. Videre omfattes prøver avledet fra enhver dyremodell for sykdom. En prøve kan være i løsning eller for eksempel festet eller bundet til et underlag. En prøve kan vise til ethvert materiale som er egnet for analyse for nærvær av CTGF eller CTGF-fragmenter eller egnet for søk etter molekyler som bindes til CTGF eller fragmenter derav. Fremgangsmåter for erholdelse av slike prøver ligger innenfor kunnskapsområdet innen faget.

Begrepet "hybridisering" viser til en prosess hvori en nukleinsyresekvens bindes til en komplementær sekvens ved baseparring. Hybridiseringsbetingelser kan for eksempel defineres ved konsentrasjonen av salt eller formamid i prehybridiseringsløsningen og hybridiseringsløsningen, eller ved hybridiseringstemperaturen og er velkjente innen faget. Hybridisering kan opptre under betingelser med forskjellig stringens.

Nærmere bestemt kan stringensen økes ved å redusere saltkonsentrasjonen, øke formamidkonsentrasjonen eller heve hybridiseringstemperaturen. For den foreliggende oppfinnelses formål kan for eksempel hybridisering under betingelser med høy stringens skje i tilnærmet 50% formamid ved tilnærmet 37°C til 42°C, og under betingelser med redusert stringens i tilnærmet 35% til 25% formamid ved tilnærmet 30°C til 35°C. Nærmere bestemt opptrer hybridisering generelt i betingelser med den høyeste stringens ved 42°C i 50% formamid, 5X SSPE, 0,3% SDS og 200 ug/ml oppkuttet og denaturert laksemelke-DNA.

Temperaturområdet som tilsvarer et gitt stringensnivå kan videre innsnevres ved fremgangsmåter som er kjente innen faget, for eksempel ved å beregne forholdet mellom purin og pyrimidin i nukleinsyren av interesse og justere temperaturen ut fra dette. For å fjerne uspesifikke signaler, kan blot vaskes i sekvens, for eksempel ved romtemperatur eller opptil og innbefattet 60°C under stadig mer stringente betingelser omfattende opptil 0,1X SSC og 0,5% SDS. Varianter av de ovenfor angitte områder og betingelser er velkjente innen faget.

Oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer antistoffer som spesifikt bindes til bindevevsvekstfaktor (CTGF). Antistoffene er polyklonale eller monoklonale antistoffer, fortrinnsvis monoklonale antistoffer og mer foretrukket humane monoklonale antistoffer. Antistoffene er rettet mot det N-terminale fragmentet av CTGF, vist i figur 1. Nærmere bestemt er antistoffene rettet mot et fragment av CTGF som strekker seg fra aminosyrerest 143 til tilnærmet aminosyrerest 154 i

SEKV.ID. NR. 2.

I spesielle utførelser nøytraliserer antistoffene en biologisk aktivitet forbundet med CTGF. Biologiske aktiviteter forbundet med CTGF omfatter celleproliferasjon, differensiering, genekspresjon, osv. I spesielle utførelser er den biologiske aktiviteten utvalgt fra gruppen som består av cellulær differensiering, for eksempel differensiering eller transdifferensiering av fibroblaster, myofibroblaster, endotelceller, osv., fra forskjellige forløperceller; induksjon av ekspresjon av proteiner som inngår i dannelse og remodellering av ekstracellulær matrise innbefattet for eksempel type I kollagen, fibronektin, osv.; kooperativ induksjon av signalkaskader forbundet med forskjellige faktorer innbefattet, men ikke begrenset til, TGF-P, IGF, VEGF, angiotensin II, endotelin, osv.; og cellulær respons på forskjellige stimuli fra omgivelsene innbefattet, men ikke begrenset til, forhøyet glukosenivå (hyperglykemi), forhøyet mekanisk stress (hypertensjon), osv.

Selv om oppfinnelsen ikke skal begrenses av mekanismen med hvilken antistoffene nøytraliserer CTGF-aktivitet, kan antistoffene bindes til CTGF og forhindre at CTGF interagerer med spesifikke cellereseptorer. Reseptorene kan ha høy bindingsaffinitet for CTGF og ved binding til CTGF stimulere et intracellulært signal som fører til proliferasjon, differensiering, induksjon av genekspresjon og/eller endret cellulær morfologi eller funksjon. Den spesielle biologiske responsen av en celle på CTGF avhenger av cellen og den foreliggende tilstanden i det omgivende miljøet. Alternativt kan reseptorene ha lav bindingsaffinitet for CTGF og ved å bindes til CTGF, for eksempel plassere CTGF relativ til høyaffinitetsreseptorer på en måte som letter gjenkjenning av og respons på CTGF. Alternativt kan antistoffene binde CTGF i vev eller organer og lette titrering eller fjerning av CTGF fra kroppen.

Alternativt eller i forbindelse med mekanismene som er beskrevet ovenfor, kan antistoffene bindes til CTGF og forhindre at CTGF interagerer med utskilte eller membranbundne samfaktorer. Slike samfaktorer omfatter spesifikt medlemmer av TGF(}-superfamilien innbefattet for eksempel TGF/3-1, -2 og 3; aktivin-A, -B, -C og

-E; BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -8a, -8b, -9, -10, -11 og -15; og GDF-3, -5-, -6, -7, -9 og -10. For eksempel har CTGF blitt vist å bindes til TGFp-1 og BMP-4 og modulere aktiviteten av disse. (Abreu et al. (2002) Nat Cell Biol 4: 599-604). Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer bevis for at området i CTGF som bindes til TGFP kodes av ekson 3 (figur IB; nukleotid 418 til nukleotid 669 i SEKV.ID. NR. 1) og at antistoffer som bindes innenfor dette området forhindrer interaksjon mellom CTGF og TGFp. (Eksempel 12 nedenfor). Videre har antistoffer som bindes innenfor dette området i CTGF blitt vist å nøytralisere spesifikke CTGF-assosierte prosesser i dyremodeller. For eksempel har antistoffer som bindes innenfor dette området i CTGF blitt vist å spesifikt inhibere cellemigrasjon i ex vivo analyser og redusere fibrose i dyremodeller. Eksempler på antistoffer ifølge oppfinnelsen er mAbl og CLN1; antistoff CLN1 dannes av cellelinjen som er definert ved ATCC-betegnelsen PTA 6006 hos American Type Culture Collection (Manassus, VA).

Uavhengig av virkningsmekanismen, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen antistoffene for anvendelse i behandling av forskjellige sykdommer og lidelser forbundet med CTGF. Sykdommer og lidelser forbundet med CTGF omfatter, men er ikke begrenset til, nefropatier, pulmonale fibroser, retinopatier, skleroderma, leverfibroser, hjertesvikt, artritt og aterosklerose. I tillegg opptrer lidelser forbundet med CTGF grunnet forskjellige faktorer innbefattet, men ikke begrenset til, hyperglykemi, hypertensjon, diabetes, fedme, osv.; og omfatter diabetisk nefropati, retinopati, kardiovaskulær sykdom og lignende. Siden CTGF overuttrykkes i et bredt utvalgt av sykdommer innbefattet dem opplistet ovenfor, omfatter oppfinnelsen behandling av pasienter med en CTGF-assosiert lidelse med et CTGF-antistoff for å forbedre eller stabilisere sykdomstilstanden, bibeholde eller gjenvinne organfunksjoner, forbedre livskvaliteten og gi forlenget overlevelse.

For eksempel er antistoffene spesielt rettet mot områder i CTGF som deltar i

biologiske aktiviteter forbundet med både fibrotiske og ikke-fibrotiske aspekter ved forskjellige lidelser innbefattet for eksempel interstitiell pulmonal fibrose, diabetisk nefropati og retinopati, makuladegenerering, osv. Oppfinnelsen gjelder antistoffene for anvendelse i behandling av lidelser forbundet med CTGF innbefattet lokaliserte og systemiske fibrotiske lidelser så som de i lunge, lever, hjerte, hud og nyre, osv.; og lokalisert arrdannelse grunnet for eksempel traume, kirurgisk behandling, osv.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes i en hvilken som helst fremgangsmåte som omfatter binding til CTGF. Slike fremgangsmåter omfatter rensing av CTGF eller fragmenter av CTGF, for eksempel ved affinitetskromatografi; påvisning av CTGF eller fragmenter av CTGF i en prøve, for eksempel ved anvendelse av ELISA eller immunohistokjemiske teknikker; diagnose av en CTGF-assosiert lidelse ved anvendelse av fremgangsmåten for påvisning av CTGF for måling av CTGF-nivået i en pasientprøve og sammenligning av CTGF-nivået i prøven med en standard.

Antistoffer rettet mot CTGF

Modulering av mengden og/eller aktiviteten av utskilte cellulære faktorer ved anvendelse av for eksempel monoklonale antistoffer, er blitt demonstrert og flere terapeutiske antistoffer er blitt godkjent eller er under utvikling. (Se for eksempel Abciximab (Reopro; Centocor, Inc., Malvern, PA), Infliximab (Remicade, Maini et al. (1998) Arthritis Rheum 41: 1552-1563; Targan et al. (1997) N Engl J Med 337: 1029-1035); Baziliximab (Simulect) og Daclizumab (Zenapax) (Bumgardner et al.

(2001) Transplantation 72: 839-845; Kovarik et al. (1999) Transplantation 68: 1288-1294); og Trastuzumab (Herceptin; Baselga (2001) Ann Oncol 12 Suppl 1: S49-55)). En rekke fremgangsmåter for fremstilling av antistoffer innbefattet fremstilling i dyr, planter, sopp og bakterier; syntetisk konstruksjon; og ex vivo dyrking; er velkjente og tilgjengelige for fagfolk.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved anvendelse av en hvilken som helst teknikk som gir dannelse av antistoffmolekyler. Teknikker for in vivo og in vitro dannelse av enten monoklonale eller polyklonale antistoffer, er velkjente innen faget. (Se for eksempel Pound (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa, NH; Harlow og Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. 2. utgave, Academic Press; Schook (1987) Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc.). Fremstilling av kimære antistoffer er også velkjent innen faget, likeså fremstilling av enkeltkjedede antistoffer. (Se for eksempel Morrison et al. (1984) Proe Nati Acad Sei USA 81: 6851-6855; Neuberger et al. (1984) Nature 312: 604-608; Takeda et al. (1985) Nature 314: 452-454). Antistoffer med beslektet spesifisitet men med distinkt idiotypisk sammensetning, kan fremstilles på en rekke tilgjengelig måter, for eksempel ved kjedestokking fra tilfeldige kombinatoriske immunoglobulinbibliotek. (Se for eksempel Burton (1991) Proe Nati Acad Sei USA 88: 11120-11123).

Antistoffer kan også fremstilles ved å indusere in vivo dannelse i lymfocyttpopulasjonen eller ved å gjennomsøke immunoglobulinbibliotek eller sett av svært spesifikke bindingsreagenser. (Se for eksempel Orlandi et al. (1989) Proe Nati Acad Sei USA 86: 3833-3837; Winter og Milstein (1991) Nature 349: 293-299). Antistoffragmenter som inneholder spesifikke bindingsseter for målpolypeptidet, kan også fremstilles. Slike antistoffragmenter omfatter, men er ikke begrenset til, F(ab')2-fragmenter som kan fremstilles ved pepsinkløyving av antistoffmolekylet og Fab-fragmenter som kan dannes ved å redusere disulfidbroene i F(ab')2-fragmentend. Alternativt kan det konstrueres Fab-ekspresjonsbibliotek som tillater hurtig og enkel påvisning av monoklonale Fab-fragmenter med den ønskede spesifisitet. (Se for eksempel Huse et al. (1989) Science 254: 1275-1281).

Monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen kan også fremstilles ved anvendelse av hybridomfremgangsmåten (se for eksempel Kohler og Milstein (1975) Nature 256: 495-497) eller ved rekombinante DNA-fremgangsmåter (se for eksempel Celltech Therapeutics Ltd., europeisk patentskrift nr. EP 0 120 694; Cabilly et al., U.S. patentskrift nr. 4,816,657; og Mage og Lamoyi (1987) i: Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, sidene 79-97).

I hybridomfremgangsmåten immuniseres en mus eller et annet egnet vertsdyr med CTGF eller et fragment derav subkutant, intraperitonealt eller intramuskulært, for stimulering av lymfocytter som danner eller kan danne antistoffer som spesifikt vil bindes til polypeptidet som anvendes for immunisering. Alternativt kan vertsdyret være et transgent pattedyr med transgener som koder for humane immunglobulingener og hvori endogene immunglobulinloki er inaktivert. Det transgene pattedyret responderer på immunogener ved å danne humane antistoffer.

(Se for eksempel Lonberg et al., WO 93/12227 (1993), U.S. patentskrift nr. 5,877,397 og Nature 148: 1547-1553( 1994); og Kucherlapati et al. (1991) WO 91/10741). Alternativt kan lymfocytter immuniseres in vi tro og så fusjoneres med myelomceller ved anvendelse av et egnet fusjonsmiddel så som polyetylenglykol, slik at det dannes en hybridomcelle. (Se for eksempel Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2. utgave, Academic Press, sidene 59-103). Alternativt er humane somatiske celler som kan danne antistoff, fortrinnsvis B-

lymfocytter, egnet for fusjon med myelomcellelinjer. Selv om B-lymfocytter fra biopsier av milt, tonsiller eller lymfeknuter fra et individ kan anvendes, foretrekkes de lett tilgjengelige B-lymfocyttene fra perifert blod. I tillegg kan humane B-celler immortaliseres direkte med Epstein-Barr-virus. (Se for eksempel Cole et al. (1995) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy.Alan R. Liss, Inc., sidene 77-96).

Foretrukne myelomcellelinjer for anvendelse i hybridomdannende fusjonsfremgangsmåter er myelomcellelinjer som fusjonerer effektivt, understøtter stabil ekspresjon i høyt nivå av antistoff fra den valgte antistoffproduserende cellen, har enzymmangler som gjør dem ute av stand til å vokse i visse seleksjonsmedier som understøtter veksten av de ønskede hybridomer, og som ikke selv danner antistoff. Eksempler på myelomcellelinjer som kan anvendes for fremstilling av hybridomer i den foreliggende oppfinnelsen omfatter P3X63Ag8, P3X63Ag8-653, NSl/l.Ag 4.1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7, S194/5XX0 Bul, alle avledet fra mus; R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F og 4B210, alle avledet fra rotter; og U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2, UC729-6, alle avledet fra mennesker. (Se for eksempel Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2. utgave, Academic Press, sidene 65-66; og Campbell (1984) i: Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. bind 13 (Burden og Von Knippenberg, red.) Amsterdam, Elseview, sidene 75-83).

Hybridomcellene utsås og dyrkes i et egnet dyrkningsmedium som fortrinnsvis inneholder en eller flere forbindelser som inhiberer vekst eller overlevelse av de ikke-fusjonerte utgangsmyelomcellene. Dersom for eksempel utgangsmyelomcellene mangler enzymet hypoxantinguaninfosforibosyltransferase (HGPRT eller HPRT), vil dyrkningsmediet for hybridomene typisk omfatte en forbindelse som hypoxantin, aminopterin og tymidin (HAT-medium) som forhindrer vekst av HGPRT-manglende celler.

Dyrkningsmediet som hybridomceller dyrkes i, analyseres for produksjon av monoklonale antistoffer rettet mot CTGF eller fragmenter av CTGF. Bindingsspesifisiteten bestemmes fortrinnsvis ved affinitetskromatografi, immunutfelling eller ved en in vitro bindingsanalyse så om radioimmunanalyse (RIA) eller enzymkoblet immunabsorpsjonsanalyse (ELISA) eller ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS) -analyse. De monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen er antistoffene som bindes til CTGF og i tillegg antistoffene som nøytraliserer en biologisk aktivitet forbundet med CTGF, som eksemplifisert nedenfor.

De fremstilte antistoffene, for eksempel fremstilt som beskrevet ovenfor, analyseres om ønskelig for påvisning av antistoffer som i alt vesentlig bindes til det N-terminale fragmentet av CTGF. Aantistoffene rettet mot et fragment av CTGF som strekker seg fra tilnærmet aminosyrerest 143 til tilnærmet aminosyrerest 154 i SEKV.ID. NR. 2. I en spesiell utførelse påviser analysen antistoffer som bindes til i alt vesentlig den samme epitopen som gjenkjennes av antistoff mAbl, bestemt ved for eksempel konkurranseanalyser av den typen som beskrives nedenfor. I en annen spesiell utførelse påviser analysen antistoffer som bindes til i alt vesentlig den samme epitopen som gjenkjennes av antistoff CLN1, bestemt ved for eksempel konkurranseanalyser av den typen som beskrives nedenfor. Man bør huske at "samme epitop" ikke betyr nøyaktig den samme aminosyre eller nøyaktig det samme karbohydrat som antistoffet det sammenlignes med bindes til, bestemt ved for eksempel epitopkartlegging ved anvendelse av alaninskanningsvarianter av CTGF. "Samme epitop" betyr det CTGF-domenet som blokkeres ved binding til CTGF av det native antistoffet det sammenlignet med i intakt form. "Samme epitop" omfatter naturligvis de CTGF-domeneaminosyrerester eller karbohydrater som strukturelt interagerer med eller bindes til de komplementaritetsbestemmende områdene (CDR) det sammenlignes med i mAbl eller CLN1.

I en foretrukket utførelse av oppfinnelsen, vil det monoklonale antistoffet ha en affinitet som er lik eller høyere enn affiniteten av mAbl, bestemt ved for eksempel Scatchard-analyse ifølge Munson og Pollard (1980, Anal Biochem 107: 220).

Etter påvisning av hybridomceller som danner nøytraliserende antistoffer av den ønskede spesifisitet og affinitet, subklones klonene typisk ved grensefortynningsfremgangsmåter og dyrkes ved standardfremgangsmåter. (Goding

(1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2. utgave, Academic Press, sidene 59-104). Egnede dyrkningsmedier for dette formålet omfatter for eksempel Dulbeccos modifiserte Eagles medium eller RPMI-1640-medium. I tillegg kan hybridomcellene dyrkes in vivo som ascitestumorer i et dyr.

De monoklonale antistoffene som utskilles av subklonene separeres fortrinnsvis fra dyrkningsmediet, ascitesvæsken eller serum ved konvensjonelle rensefremgangsmåter for immunoglobulin, for eksempel protein A-sefarose, hydroksylapatittkromatografi, gelelektroforese, dialyse eller affinitetskromatografi.

DNA som koder for de monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen kan lett isoleres og sekvenseres ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter, for eksempel ved anvendelse av oligonukleotidprober som kan bindes spesifikt til gener som koder for tunge og lette antistoffkjeder. Når dette DNA først er isolert, kan det ligeres inn i ekspresjonsvektorer eller kloningsvektorer som så transfekteres inn i vertsceller så som ape-COS-celler, kinahamster eggstokk (CHO) -celler eller myelomceller som ikke ellers danner immunoglobulinprotein. De således transformerte cellene dyrkes under betingelser som er egnet for syntese av monoklonale antistoffer i rekombinant vertscellekultur. Et eksempel på en cellelinje er definert ved ATCC-betegnelsen PTA- 6006.

Om ønskelig modifiseres dette DNA for å endre egenskapene til det kodede immunoglobulinet. Varianter av immunoglobuliner er velkjente. For eksempel fremstilles kimære antistoffer ved å erstatte den kodende sekvensen for tungkjedens og lettkj edens konstante domener fra en art, for eksempel mus, med de homologe sekvensene fra en annen art, for eksempel menneske. (Se for eksempel Boss et al., internasjonal patentpublikasjon WO 84/03712; Cabilly et al., U.S. patentskrift nr. 4,816,567; eller Morrison et al. (1984) Proe Nat Acad Sei 81: 6851). I en spesiell utførelse kan humaniserte former av museantistoffer fremstilles ved å innføre de komplementaritetsbestemmende områdene (CDR), det vil si variable domener, fra et museantistoff inn i et rammeverksdomene, det vil si et konstant område, fra et humant antistoff. (Se for eksempel internasjonal patentpublikasjon WO 92/22653). I noen utførelser innføres også utvalgte rammeverksaminosyrerester fra mus inn i det humane mottakerimmunoglobulinet. I tillegg kan det valgte Fc-domenet være fra en hvilken som helst av lg A, IgD, IgE, IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 eller IgM. Fc-domenet er om ønskelig i stand til å utføre effektorfunksjoner, for eksempel binding av komplement.

Anti-CTGF-antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan også fusjoneres til grupper som gir ekstra muligheter så som påvisning eller cytotoksiske virkninger. Fusjoner av immunoglobulinene ifølge den foreliggende oppfinnelsen og cytotoksiske grupper fremstilles for eksempel ved å ligere til den immunoglobulinkodende sekvensen hele eller en del av den kodende sekvensen for et cytotoksisk ikke-immunoglobulinpolypeptid. Slike ikke-immunoglobulinpolypeptider omfatter polypeptidtoksiner så som ricin, difteritoksin eller Pseudomonas eksotoksin. Konjugatene kan også fremstilles ved in vitro fremgangsmåter. Det kan for eksempel konstrueres immunotoksiner ved å anvende en disulfidutbyttingsreaksjon eller ved å danne en tioeterbinding mellom immunoglobulinet og toksinpolypeptidet. Eksempler på egnede reagenser for dette formålet omfatter iminotiolat og metyl-4-merkaptobutyrimidat. Slike ikke-immunoglobulinfusjonspolypeptider erstatter typisk de konstante domenene i et antistoff ifølge oppfinnelsen. Alternativt erstatter de de variable domenene i et antigenbindende sete i et antistoff ifølge oppfinnelsen.

Innføring av Fv eller CDR fra et antistoff med spesifisitet for et ikke-CTGF-antigen vil danne et kimært antistoff som omfatter ett antigenbindende sete med spesifisitet for CTGF og et annet antigenbindende sete med spesifisitet for et annet antigen. I slike utførelser deleteres lettkj eden og Fv i tungkj eden erstattes med det ønskede polypeptidet. Disse antistoffene betegnes bivalente eller polyvalente, avhengig av antallet immunoglobulin-"armer" som det benyttede Fc-domenet besitter; for eksempel vil IgG være bivalente og IgM polyvalente. Bortsett fra ikke-immunoglobulinene nevnt ovenfor, kan antistoffet også gjøres multivalent ved rekombinasjon av antistoffer med mer enn én spesifisitet. For eksempel er antistoffet i noen utførelser i stand til å binde CTGF som beskrevet andre steder heri, men også i stand til å binde en andre vekstfaktor, for eksempel TGF/3, VEGF, FGF et annet medlem av CCN-familien, for eksempel CYR61 og lignende, eller et cytokin. Eksempler på antistoffer rettet mot disse faktorene er velkjente. De multispesifikke, multivalente antistoffene fremstilles ved å samtransformere en celle med DNA som koder for tungkj eden og lettkj eden fra begge antistoffene og gjenvinning av den andelen av de uttrykte antistoffene som har den ønskede struktur ved immunoaffinitetskromatografi eller lignende. Alternativt fremstilles slike antistoffer fra monovalente antistoffer som rekombineres in vitro på konvensjonell måte.

Monovalente antistoffer fremstilles også ved teknikker som i seg selv er konvensjonelle. Rekombinant ekspresjon av lettkjede og en modifisert tungkjede er egnet. Tungkj eden er generelt avkortet i et hvilket som helst punkt i Fc-området slik at kryssbinding av tungkjeder forhindres. Alternativt er de relevante cysteinrestene erstattet med en annen aminosyrerest eller deletert slik at kryssbinding forhindres. In vitro fremgangsmåter anvendes også for fremstilling av monovalente antistoffer, for eksempel fremstilles Fab-fragmenter ved enzymatisk kløyving av intakt antistoff.

Diagnostiske midler

Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes for kvantitativ og kvalitativ påvisning av CTGF i en prøve. Prøver kan være fra enhver kilde innbefattet kondisjonert medium fra celler dyrket i kultur; vevsprøver, for eksempel vevsbiopsier og organtransplantater; kroppsvæsker innbefattet blod, urin, blemmevæske, cerebrospinalvæske, glasslegeme og synovialvæske; osv. I en utførelse benyttes påvisning av CTGF for å diagnostisere tilstanden til celler dyrket i kultur, for eksempel når det gjelder differensiering, matrisedannelse, osv. CTGF har forskjellige autokrine og parakrine virkninger på dyrkede celler og nivået av CTGF som er assosiert med cellelaget eller som foreligger i kondisjonert medium kan vise cellens nåværende tilstand eller være prediktiv for cellens fremtidige tilstand. (Se for eksempel internasjonal patentpublikasjon WO 96/38168). I andre utførelser anvendes påvisning av CTGF for å bestemme tilstanden til et vev eller organ. For eksempel kan et organ som er beregnet for transplantasjon evalueres ved å måle CTGF-nivået, hvori nivået av CTGF som uttrykkes av celler i organet angir organets relative helsetilstand og egnethet for transplantasjon. CTGF-nivåer kan også bestemmes i vevsbiopsier for å bestemme et organs status eller en kreftforms stadium og mulige metastasepotensial.

I foretrukne utførelser anvendes antistoffene for diagnose av en sykdom eller lidelse forbundet med CTGF (se for eksempel internasjonal patentpublikasjon WO 03/024308). I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer for diagnose av en CTGF-assosiert lidelse ved erholdelse av en prøve, påvisning og kvantifisering av nivået av CTGF i prøven og sammenligning av CTGF-nivået i prøven med nivået av en standardmengde av CTGF hvor en forhøyet eller redusert mengde av CTGF i prøven viser nærvær av en CTGF-assosiert lidelse. Lidelser assosiert med avvikende (for eksempel forhøyet eller redusert) nivå av CTGF omfatter, men er ikke begrenset til, lidelser forbundet med endret ekspresjon og deponering av ekstracellulære matriseassosierte proteiner. Slike lidelser omfatter for eksempel kreft så som brystkreft, bukspyttkjertelkreft og gastrointestinal kreft; aterosklerose, artritt, retinopatier så som diabetisk retinopati; nefropatier så som diabetisk nefropati; hjertefibrose, pulmonal fibrose, leverfibrose og nyrefibrose og sykdommer forbundet med kronisk betennelse og/eller infeksjon. CTGF-assosierte lidelser er også forbundet med tilstander så som myokardialt infarkt, diabetes, peritonal dialyse, kronisk og akutt transplantatavstøtning, kjemoterapi, strålebehandling og kirurgisk behandling.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer for fastslåelse av hvorvidt et individ er predisponert for utvikling av en CTGF-assosiert lidelse. Predisponering kan i utgangspunktet viser ved hyperglykemi, hypertensjon eller fedme i et individ. I tillegg kan predisponering mistenkes grunne en begivenhet, for eksempel et myokardialt infarkt, kirurgisk behandling, ortopedisk eller paralytisk immobilisering, kongestiv hjertesvikt, graviditet eller åreknuter i individet.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer for å følge utviklingen av en CTGF-assosiert lidelse eller følge den terapeutiske virkningen av behandling av en CTGF-assosiert lidelse. En fremgangsmåte for anvendelse av antistoffene kan for eksempel omfatte å erholde prøver fra et individ over tid; påvisning og kvantifisering av nivået av CTGF i hver prøve; og sammenligning av CTGF-nivået i påfølgende prøver med CTGF-nivået i tidligere prøver. Et endret CTGF-nivå mellom prøvene over tid viser utviklingen av en CTGF-assosierte lidelsen eller den terapeutiske virkningen av behandling av den CTGF-assosierte lidelsen.

For diagnostiske anvendelser, vil antistoffene ifølge oppfinnelsen typisk være merket med en påvisbar gruppe. Den påvisbare gruppen kan være enhver gruppe som enten direkte eller indirekte kan gi et påvisbart signal. Den påvisbare gruppen kan for eksempel være en radioaktiv isotop så som<J>H, XX, "P, " S eller<125>I, en fluorescerende eller kjemiluminescerende forbindelse så som fluoresceinisotiocyanat, rhodamin eller luciferin; eller et enzym så som alkalisk fosfatase, beta-galaktosidase eller pepperrotperoksidase.

En hvilken som helst fremgangsmåte som er kjent innen faget for separat konjugering av antistoffet til den påvisbare gruppen, kan benyttes. (Se for eksempel Hunter et al. (1962) Nature 144: 945; David et al. (1974) Biochemistry 13: 1014; Pain et al. (1981) J Immunol Meth 40: 219; og Nygren (1982) J Histochem Cytochem 30: 407). Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan benyttes i en hvilken som helst kjent analysefremgangsmåte så som kompetitive bindingsanalyser, direkte og indirekte "sandwich"-analyser og immunutfellingsanalyser (Zola (1987) i: Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press, Inc., sidene 147-158).

Kompetitive bindingsanalyser bygger på evnen til en merket standard (som kan være CTGF eller en immunologisk reaktiv del derav) til å konkurrere med analyseprøveanalytten (CTGF) om binding til en begrenset mengde antistoff. Mengden av CTGF i analyseprøven er inverst proporsjonal med mengden av standard som bindes til antistoffene. For å lette bestemmelsen av mengden av standard som blir bundet, gjøres antistoffene generelt uløselige før eller etter konkurransen, slik at standarden og analytten som er bundet til antistoffene kan separeres fra ubundet standard og analytt.

"Sandwich"-analyser omfatter anvendelse av to antistoffer som hver kan bindes til hver sin immunogene del eller epitop i proteinet som skal påvises. I en " sandwich" - analyse bindes analyseprøveanalytten av et første antistoff som er immobilisert på et fast støttemiddel, hvoretter et andre antistoff bindes til analytten slik at det dannes et uløselig kompleks bestående av tre deler. (David og Greene, U.S. patentskrift nr. 4,376,110). Det andre antistoffet kan selv være merket med en påvisbar gruppe (direkte "sandwich"-analyse) eller det kan måles ved anvendelse av et antiimmunoglobulinantistoff som er merket med en påvisbar gruppe (indirekte "sandwich"-analyse). En type av "sandwich"-analyse er for eksempel en ELISA-analyse, i hvilket tilfelle den påvisbare gruppen er et enzym. Et eksempel på en analyse hvori antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes, er for eksempel beskrevet i internasjonal patentpublikasjon WO 03/024308).

Antistoffene ifølge oppfinnelsen er også anvendbare for in vivo synliggjøring, hvori et antistoff merket med en påvisbar gruppe så som et middel som ikke slipper gjennom radiobølger, en radioaktiv isotop eller en fluorescerende gruppe så som grønt fluorescerende protein (GFP), administreres til en vert, fortrinnsvis i blodstrømmen, og nærvær og lokalisering av det merkede antistoffet i verten analyseres. Denne synliggjøringsteknikken er anvendbar for bestemmelse av stadiet og behandling av CTGF-assosierte lidelser så som fibrotiske lidelser. Antistoffet kan være merket med en hvilken som helst gruppe som kan påvises i en vert, enten ved kjernemagnetisk resonans, radiologi eller andre påvisningsmidler som er kjente innen faget.

Terapeutiske midler

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer antistoffer for behandling av forskjellige sykdommer og lidelser forbundet med CTGF. Antistoffene ifølge oppfinnelsen har blitt funnet å redusere de skadelige virkningene av CTGF-dannelse eller -aktivitet i flere lidelser, som eksemplifisert nedenfor. Videre viser antistoffene fordelaktige farmakokinetiske egenskaper, noe som gjør dem til overlegne terapeutiske midler for behandling av lidelser forbundet med CTGF.

Anti-CTGF-antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen inhiberer utvikling av fibrose i dyremodeller for for eksempel lunge- og nyrefibrose. Nærmere bestemt reduserer antistoffene bleomycinindusert lungefibrose i mus med 60-70%, bestemt ved inhibering av pulmonal hydroksyprolin (kollagen) -akkumulering og histologisk undersøkelse av vevspreparater. Videre reduserer antistoffene akkumulering av kollagen i en restnyre (det vil si 5/6 nefrektomi) -modell i rotte og i mus etter unilateral urinlederobstruksjon (UUO). Antistoffene reduserer også fibrose indusert ved kombinert subkutan eller intraperitoneal infusjon av CTGF og TGFP i nyfødte mus. I tillegg reduserer antistoffene komplikasjoner forbundet med organsvikt, for eksempel forbedret nyrefunksjon i forskjellige modeller for kronisk og akutt nyresvikt. Ingen toksisitet er blitt observert med disse antistoffene i dyr. Siden CTGF overuttrykkes i et bredt utvalg av fibrotiske sykdommer innbefattet diffus og begrenset skleroderma, osteoartritt, diabetisk nefropati og retinopati, osv., omfatter oppfinnelsen behandling av pasienter med en CTGF-assosiert lidelse med et CTGF-antistoff for å forbedre eller stabilisere sykdomstilstanden, gjenvinne organfunksjon, forbedre livskvaliteten og oppnå forlenget overlevelse.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen er følgelig spesielt anvendbare i terapeutiske anvendelser for forebygging eller behandling av CTGF-assosierte lidelser i et individ. Slike lidelser omfatter, men er ikke begrenset til, angiogenese og andre prosesser som spiller en sentral rolle i tilstander så som aterosklerose, glaukom, osv.; og i kreft innbefattet akutt lymfoblastleukemi, dermatofibromer, brystkreft, brystcarcinom, gliom og glioblastom, rhabeomyosarkom og fibrosarkom, desmoplasi, angiolipom, angioleiomyom, desmoplastiske kreftformer og prostatakreft, eggstokkreft, kolorektal kreft, bukspyttkjertelkreft, gastrointestinal kreft og leverkreft og andre former for tumorvekst og metastaser.

I tillegg er antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendbare i terapeutiske anvendelser for forebygging eller behandling av CTGF-assosierte lidelser, innbefattet fibrose. I ett aspekt er antistoffene ifølge oppfinnelsen for administrasjon til et individ for å forhindre eller forebygge en CTGF-assosiert lidelse innbefattet, men ikke begrenset til, lidelser som viser endret ekspresjon og deponering av ekstracellulære matriseassosierte proteiner, for eksempel fibrotiske lidelser. I forskjellige aspekter kan fibrosen være lokalisert til en bestemt vev så som epitelvev, endotelvev eller bindevev, eller til et organ så som nyre, lunge eller lever. Fibrose kan også opptre i øyet og ledd. I andre aspekter kan fibrosen være systemisk og omfatte flere organer og vevssystemer. CTGF-assosierte lidelser omfatter for eksempel aterosklerose, artritt, retinopatier så som diabetisk retinopati; nefropatier, for eksempel diabetisk nefropati; fibrose i hjertet, lunger, lever og nyrer og sykdommer forbundet med kronisk betennelse og/eller infeksjon.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer for behandling av en CTGF-assosiert lidelse i et individ som er predisponert for utvikling av en slik lidelse. En predisposisjon kan for eksempel omfatte hyperglykemi, hypertensjon eller fedme i individet. Slike lidelser kan for eksempel opptre grunnet diabetes, fedme, osv., og omfatter diabetisk nefropati, retinopati og kardiovaskulær sykdom. I tillegg kan en predisposisjon mistenkes grunnet en begivenhet, for eksempel et myokardialt infarkt, kirurgisk behandling, peritoneal dialyse, kronisk og akutt transplantatavstøtning, kjemoterapi, strålebehandling, traume, ortopedisk eller paralytisk immobilisering, kongestiv hjertesvikt, graviditet eller åreknuter i individet.

I spesiell utførelser som eksemplifisert heri, er antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen for administrasjon til et individ for behandling av fibrose i et organ, for eksempel lunge eller nyre. Antistoffene vises heri å ha gunstige virkninger i forskjellige modeller for lunge- og nyrefibrose (se for eksempel eksemplene 7 til 9). I en annen spesiell utførelse er antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen for administrasjon til et individ for å redusere lokal eller systemisk sklerose (se for eksempel eksemplene 11 og 12). I ytterligere utførelser er antistoffene for administrasjon til et individ for å behandle eller forebygge okulære lidelser så som proliferativ vitreoretinopati, diabetisk retinopati, makuladegenerasjon, osv. Siden CTGF er implisert i et bredt utvalg av lidelser, tilveiebringer oppfinnelsen videre antistoffer for behandling av pasienter med en CTGF-assosiert lidelse for å forbedre eller stabilisere sykdomstilstanden og organfunksjonen, forbedre livskvaliteten og oppnå forlenget overlevelse.

For terapeutiske anvendelser, kan antistoffene ifølge oppfinnelsen administreres til et pattedyr, fortrinnsvis et menneske, i en farmasøytisk akseptabel doseringsform. Antistoffene kan administreres intravenøst som en bolus eller ved kontinuerlig infusjon over et tidsrom og/eller intramuskulært, subkutant, intraartikulært, intrasynovialt, intratekalt, intravitrealt, intrakranialt, oralt, topisk eller ved inhalering. Dersom antistoffet besitter den ønskede aktiviteten, kan intratumoral, peritumoral, intralesjonal eller perilesjonal administrering også benyttes for å oppnå lokale så vel som systemiske terapeutiske virkninger.

Slike doseringsformer omfatter farmasøytisk akseptable bærerstoffer som i seg selv er ikke-toksiske og ikke-terapeutiske. Eksempler på slike bærerstoffer omfatter ionebyttere, alum, aluminiumstearat, lecitin; serumproteiner så som humant serumalbumin; buffere så som fosfat eller glysin; sorbinsyre, kaliumsorbat, partielle glyseridblandinger av mettede vegetabilske fettsyrer, vann, salter; eller elektrolytter så som protaminsulfat, natriumklorid, metallsalter, kolloidal kiselgel, magnesiumtrisilikat, polyvinylpyrrolidon, cellulosepolymerer og polyetylenglykol. Bærerstoffer for topiske eller gelbaserte antistofformer omfatter polysakkarider så som natriumkarboksymetylcellulose eller metylcellulose, polyvinylpyrrolidon, polyakrylater, polyoksyetylen-polyoksypropylen blokkpolymerer, polyetylenglykol og fargeginstalkoholer. Konvensjonelle deponeringsformer omfatter for eksempel mikrokapsler, nanokapsler, liposomer, plastere, sublinguale tabletter og polymere støttemidler så som polylaktid:polyglykolidsampolymerer. Dersom antistoffet foreligger i en vandig doseringsform snarere enn å være frysetørket, vil antistoffet typisk være utformet i en konsentrasjon på fra tilnærmet 0,1 mg/ml til 100 mg/ml, selv om omfattende variasjoner utenfor dette området tillates.

For forebygging eller behandling av sykdom, vil den egnede dosen av antistoff avhenge av hva slags sykdom som skal behandles, som definert ovenfor, sykdommens omfang og forløp, hvorvidt antistoffene administreres for forebyggende eller terapeutiske formål, forløpet av tidligere behandling, pasientens kliniske historie og respons på antistoffet og den behandlende leges vurderinger. Antistoffet kan administreres til pasienten en gang eller over en serie av behandlinger.

Avhengig av sykdommens type og omfang, er fra tilnærmet 0,015 til 15 mg antistoff/kg kroppsvekt en innledende kandidatdose for administrering til pasienten, enten for eksempel ved en eller flere separate administreringer eller ved kontinuerlig infusjon. For gjentatte administreringer over flere dager eller mer, gjentas behandlingen avhengig av tilstanden inntil en ønsket undertrykkelse av sykdomssymptomer opptrer. Andre doseringsskjemaer kan imidlertid være anvendbare og utelukkes ikke fra den foreliggende oppfinnelsen.

Ifølge en annen utførelse av oppfinnelsen, kan virkningen av antistoffet når det gjelder å forebygge eller behandle sykdom forbedres ved å administrere antistoffet serielt eller i kombinasjon med et annet middel som er effektivt for det samme kliniske formålet så som et annet antistoff rettet mot en annen epitop enn hovedantistoffet, eller ett eller flere konvensjonelle terapeutiske midler som er kjente for den påtenkte terapeutiske indikasjonen, for eksempel forebygging eller behandling av tilstander forbundet med overdrevet dannelse av ekstracellulær matrise så som fibrose eller sklerose, inhibering av tumorcellevekst eller metastase, inhibering av neovaskularisering eller reduksjon av betennelse. Slike midler kan lindre symptomer eller forbedre utfallet via en lignende virkningsmekanisme, for eksempel anti-TGF/3-antistoffer eller ved en forskjellig mekanisme, for eksempel interferon-y. Slike midler kan i tillegg direkte eller indirekte lindre symptomer forbundet med en CTGF-assosiert lidelse eller en predisposisjon for utvikling av en CTGF-assosiert lidelse, for eksempel angiotensinkonverterende enzym (ACE)

-inhibitorer og angiotensinreseptorblokkere (Arb).

For eksempel rapporterer sklerodermapasienter som gis infusjoner av den stabile prostasyklinagonisten Iloprost ofte en forbedring av hudens tetthet som er i samsvar med en inhiberende virkning på arrvevsdannelse ved hudfibroblaster. Prostanoider har blitt vist å utøve en inhiberende virkning på kollagensyntese og flere typer bevismateriale viser at Iloprost blokkerer CTGF-induksjon i skleroderma. (Korn et al. (1980) J Clin Invest 65: 543-554; Goldstein og Polger (1982) J Biol Chem 257: 8630-8633; og Stratton et al. (2001) J Clin Invest 108: 241-250). CTGF er syv ganger forhøyet i blemmevæske fra pasienter med skleroderma sammenlignet med friske kontrollindivider, pasienter som gis intravenøs tilførsel av Iloprost viser imidlertid en markant reduksjon av CTGF i blemmevæske. (Stratton et al. (2001) J Clin Invest 108-241-250). Sett under ett, tyder disse resultatene på at noen av fordelene ved Iloprostbehandling ved skleroderma kan skyldes antifibrotiske virkninger som formidles ved reduksjon av CTGF-nivået. Siden det foreligger bekymringer vedrørende anvendelse av en kraftig vasodilatorisk, antiblodplate prostasyklinanalog i kronisk systemisk administrering til sklerodermapasienter, kan en behandling som benytter et anti-CTGF-antistoff alene eller i forbindelse med et redusert nivå av Iloprost, vise seg å være en sikker og effektiv behandling av skleroderma.

Ytterligere anvendelser

Antistoffene ifølge oppfinnelsen er også anvendbare som affinitetsrensemidler. I denne prosessen immobiliseres antistoffene mot CTGF til et egnet støttemiddel så som Sephadex-harpiks eller filterpapir, ved anvendelse av fremgangsmåter som er velkjente innen faget. Det immobiliserte antistoffet settes så i forbindelse med en prøve som inneholder CTGF som skal renses, hvoretter støttemiddelet vaskes med et egnet løsemiddel som vil fjerne i alt vesentlig alt materiale i prøven, bortsett fra CTGF som er bundet til et immobilisert antistoffet. Endelig vaskes støttemiddelet med et annet egnet løsemiddel så som glysinbuffer (pH 5,0) som vil frigjøre CTGF fra antistoffet.

EKSEMPLER

Oppfinnelsen vil forstås bedre ved henvisning til de påfølgende eksemplene som er ment å kun være eksemplariske for oppfinnelsen. Disse eksemplene gis kun for å illustrere oppfinnelsen ifølge kravene. Den foreliggende oppfinnelsen er ikke begrenset i området av de eksemplifiserte utførelsene, som kun er ment som illustrasjoner av enkelte aspekter av oppfinnelsen. Forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til dem som er beskrevet heri, vil bli åpenbare for fagfolk ut fra beskrivelsen ovenfor og de vedlagte figurene. Eksempel 1. Fremstilling av rekombinant humant CTGF

En rekombinant humant CTGF baculoviruskonstruksjon ble fremstilt som beskrevet i Segarini et al. ((2001) J Biol Chem 276: 40659-40667). Kort beskrevet ble et

CTGF cDNA som kun omfattet den åpne leserammen fremstilt ved PCR og anvendelse av DB60R32 (Bradham et al. (1991) J Cell Biol 114: 1285-94) som templat og primerne 5'-gctccgcccgcagtgggatccATGaccgccgcc-3' og 5'-ggatccggatccTCAtgccatgtctccgta-3' som innfører BamHI-restriksjonsenzymseter i endene av det amplifiserte produktet. Det native start- og stoppkodonet er angitt med store bokstaver.

Det resulterende amplifiserte DNA-fragmentet ble kuttet med BamHI, renset ved elektroforese i en agarosegel og subklonet direkte inn i BamHI-setet i baculovirusekspresjonsplasmidet PFASTBAC1 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Ekspresjonskassettens sekvens og orientering ble bekreftet ved DNA-sekvens er ing. Den resulterende CTGF-ekspresjonskassetten ble så overført til bacmid DNA ved setespesifikk rekombinasjon i bakterier. Dette bacmidet ble så anvendt for fremstilling av et fullt ut rekombinant CTGF-baculovirus i Spodoptera frugiperda SF9-insektceller ifølge fremgangsmåter som leveres av produsenten (BAC-TO-BAC ekspresjonssystemhåndbok; Invitrogen). Ekspansjon av rekombinante baculovirustitere i Sf9-insektceller ble utført ved anvendelse av standardfremgangsmåter som er kjente innen faget.

Hi5-insektceller ble tilpasset til vekst i suspensjon ved seriell passasje av celler i risteflaskekultur ledsaget av anrikning på separerte celler i hver passasje. Hi5-celler i suspensjon ble dyrket i 1 1 SF900II SFM-medium (Invitrogen) tilsatt 20 ug/ml gentamycin (Mediatech, Inc., Herndon, VA) og lx lipid (Invitrogen) i 2,8 1 Fernbach dyrkningsflasker for engangs bruk (Corning Inc., Acton, MA) på en risteplattform ved 110 rpm ved 27°C. Når cellene nådde en tetthet på 1,0-1,5 x IO<6>celler/ml med en levedyktighet på >95%, ble de infisert med rekombinant baculovirus ved en infeksjonsmultiplisitet (MOI) på 10. Kulturene ble så innkubert ved 27°C i ytterligere 40 til 44 timer. Det kondisjonerte medium som inneholder rhCTGF ble oppsamlet, avkjølt på is og sentrifugert ved 5000 x g. Supernatanten ble så sendt gjennom et 0,45 mm filter.

Alternativt ble rekombinant rotte-CTGF fremstilt ved innsette klon 2-4-7 som koder for rotte-CTGF (Schmidt et al., US patentskrift nr. 6,348,329) i ekspresjonsvektoren pMK33 (konstruert av Michael Koelle, Stanford University, Ph.D.-avhandling, 1992). Rotte-CTGF-ekspresjonskonstruksjonen ble transfektert inn i Schneider 2-celler (American Type Culture Collection, Manassas, VA; Schneider (1972) J Embryol Exp Morphol 27: 353-365) ved anvendelse av reagensen CELLFECTIN (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Cellene ble dyrket i medium som inneholdt 300Hg/ml hygromycin B i 6 uker og så dyrket uten seleksjon i tre dager. Ekspresjon av CTGF ble indusert ved tilsetning av 500 uM CuS04og 100 uM ZnS04og etter fire dager ble mediet høstet og klarnet ved sentrifugering og filtrering som ovenfor.

CTGF fremstilt ved en av fremgangsmåtene beskrevet ovenfor ble renset som

følger. Fire liter kondisjonert medium ble satt på en 5 ml HI-TRAP heparinkolonne (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ) som på forhånd var ekvilibrert med 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl. Kolonnen ble vasket med 10 kolonnevolumer 350 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 7,5). CTGF ble eluert fra kolonnen med en økende NaCl-saltgradient. Eluerte fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE og fraksjoner som inneholdt CTGF ble slått sammen.

Heparinrenset CTGF ble fortynnet til en endelig ledningsevne på 5,7 mS med ikke-pyrogent dobbeltdestillert vann og pH ble justert til 8,0. En Q-SEPHAROSE kraftig anionbytterkolonne (Amersham Bioscience) inneholdende tilnærmet 23 ml harpiks koblet i tandem til en karboksymetyl (CM) POROS polystyrenkolonne (Applied Biosystems) inneholdende tilnærmet 7 ml harpiks ble benyttet for fjerning av endotoksin og innfanging og eluering av renset rhCTGF. Før påsetting av prøven ble tandemkolonnen vasket med 0,5 M NaOH, fulgt av 0,1 M NaOH og til slutt ekvilibreringsbuffer. Prøven fikk passere gjennom tandemkolonnen, Q-Sepharosekolonnen ble fjernet og CTGF ble eluert fra CM POROS-kolonnen (Applied Biosystems) med en økende gradient fra 350 mM til 1200 mM NaCl. Renheten av de eluerte fraksjonene som inneholdt CTGF ble evaluert ved SDS-PAGE-analyse før en endelig prøveporsjon ble slått sammen.

Eksempel 2. Fremstilling av N-terminale og C-terminale fragmenter av CTGF

N-terminale fragmenter og C-terminale fragmenter av CTGF ble fremstilt som

følger. Rekombinant humant CTGF, fremstilt og renset som beskrevet ovenfor, ble kløyvet ved romtemperatur i 6 timer ved behandling med kymotrypsinkuler (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ved 1,5 mg CTGF pr enhet kymotrypsin. Blandingen ble sentrifugert, kymotrypsinkulene ble fjernet og supernatanten som inneholder enzymatisk kløyvet rhCTGF ble fortynnet 1:5 med 50 mM Tris, pH 7,5. Den fortynnede supernatanten ble satt på en Hi-Trap heparinkolonne. Ubundet materiale som inneholdt N-terminale fragmenter av CTGF ble oppsamlet. Heparinkolonnen ble vasket med 350 mM NaCl og bundne C-terminale fragmenter av CTGF ble eluert med en lineær gradient fra 350 mM til 1200 mM NaCl som beskrevet ovenfor. Fraksjonene ble analysert ved SDS-PAGE og fraksjoner som inneholdt C-terminale fragmenter av CTGF ble slått sammen.

Ubundet materiale fra heparinkolonnen som inneholdt N-terminale fragmenter av CTGF ble juster til 0,5 M ammoniumsulfat/50 mM Tris, pH 7,5 og så satt på en 15 ml fenylsefarose HP-kolonne (Amersham-Pharmacia) som på forhånd var ekvilibrert med 0,5 M ammoniumsulfat/50 mM Tris, pH 7,5. Kolonnen ble vasket med 15 kolonnevolumer 0,5 M ammoniumsulfat/50 mM Tris, pH 7,5 og bundne N-terminale fragmenter av CTGF ble eluert med en lineær gradient fra 0,5 M til 0 M ammoniumsulfat/50 mM Tris, pH 7,5 over tilnærmet 15 kolonnevolumer. Fraksjonene ble analysert ved SDS-PAGE og fraksjoner som inneholdt N-terminale fragmenter av CTGF ble slått sammen. De sammenslåtte fraksjonene ble oppkonsentrert og bufferen utbyttet med 50 mM Tris, 400 mM NaCl (pH 7,2) ved anvendelse av en ULTRACEL AMICON YM10 ultrafiltreringsmembran (Millipore Corp., Bedford, MA).

Eksempel 3. Fremstilling av humane monoklonale anti-CTGF-antistoffer Fullt ut humane monoklonale antistoffer mot humant CTGF ble fremstilt ved anvendelse av HUMAB musestammene HCo7, HCol2 og HCo7+HCol2 (Medarex, Inc., Princeton, NJ). Musene ble immunisert ved opptil 10 intraperitoneale (IP) eller subkutane (Sc) injeksjoner av 25-50 mg rekombinant humant CTGF i komplett Freunds adjuvans over et tidsrom på 2-4 uker. Immunresponsen ble fulgt ved retroorbital tapping av blod. Plasma ble analysert ved ELISA (som beskrevet nedenfor) og mus med et tilstrekkelig titer av anti-CTGF-immunoglobulin ble anvendt for fusjoner. Musene ble gitt intravenøse forsterkingsinjeksjoner av antigen 3 og 2 dager for avliving og uttak av milten.

Enkeltcellesuspensjon av lymfocytter fra milt fra immuniserte mus ble fusjonert til en fjerdedel av antallet av P3X63-Ag8.653 ikke-utskillende musemyelomceller (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA) med 50% PEG (Sigma, St. Louis, MO). Cellene ble utsådd med tilnærmet 1 x 10<5>celler/brønn i flatbunnede mikrotiterplater og innkubert i tilnærmet to uker i DMEM med høy glukosekonsentrasjon (Mediatech, Herndon, VA) tilsatt L-glutamin og natriumpyruvat, 10% f oster kalveserum, 10% P388D1 (ATCC) kondisjonert medium, 3-5% origen (Igen International, Gaithersburg, MD), 5 mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanol, 50 mg/ml gentamycin og 1 x HAT (Sigma). Etter 1-2 uker ble cellene dyrket i medium hvori HAT var erstattet med HT. Enkeltbrønner ble så analysert ved ELISA (beskrevet nedenfor). Antistoffutskillende hybridomer ble utsådd på nytt, analysert på nytt og, dersom de fortsatt var positive for anti-CTGF-antistoffer, subklonet minst to ganger med grensefortynning. De stabile subklonene ble så dyrket in vitro for fremstilling av små mengder antistoff i vevskulturmedium for karakterisering. En klon fra hver hybridom som hadde bibeholdt utgangs cellenes reaktivitet ble anvendt for fremstilling av 5-10 ampullers cellebanker lagret i flytende nitrogen.

ELISA-analysene ble utført som beskrevet av Fishwild et al. (1996, Nature Biotech 14: 845-851). Kort beskrevet ble mikrotiterplater belagt med 1-2 ug/ml renset rekombinant CTGF i PBS med 50 ul/brønn, innkubert ved 4°C over natten og så blokkert med 200 ul/brønn 5% kyllingserum i PBS/Tween (0,05%). Fortynning av plasma fra CTGF-immuniserte mus eller hybridomdyrkningssupernatanter ble tilsatt til hver brønn og innkubert i 1-2 timer ved omgivelsestemperatur. Platene ble vasket med PBS/Tween og så innkubert med polyklonalt anti-humant IgG Fc-antistoff fra geit konjugert til pepperrotperoksidase (HRP) i 1 time ved romtemperatur. Etter vask ble platene fremkalt med 0,22 mg/ml ABTS-substrat (Sigma) og analysert spektrofotometrisk ved 415-495 nm.

Eksempel 4: Antistoffkarakterisering

Hybridomer som dannet antistoffer mot humant CTGF ble fremstilt som beskrevet i eksempel 3. Klonede hybridomceller ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium med høy glukosekonsentrasjon/RPMI 1640 (50:50) med 8 mM L-glutamin, Vi x ikke-essensielle aminosyrer og 10% fosterkalveserum. Celler ekspandert for fremstilling av antistoff ble dyrket i det samme medium med 1,5% fosterkalveserum med lavt IgG-innhold i 4-9 dager ved 37°C og 6% CO2. Det resulterende kondisjonerte medium ble befridd for celler og oppkonsentrert ved anvendelse av et filtrerings/oppkonsentreringssystem med tangentiell gjennomstrømning. Konsentratet fikk passere gjennom en protein-A-kolonne og bundne monoklonale antistoffer ble eluert med 100 mM glysin, pH 3. Eluatet ble nøytralisert med 1 M Tris, pH 8,0 og dialysert mot PBS.

4.1 Epitopkartlegging

Epitopkartlegging av antistoffer ved kompetitive bindingseksperimenter er velkjent blant fagfolk innen feltet immunologi. (Se for eksempel Van Der Geld et al. (1999) Clinical and Experimental Immunology 118: 487-96). Hver av antistoffpopulasjonene som var isolert fra celler oppdyrket fra en unik klonet hybridomcelle ble kartlagt og tilskrevet et spesifikt bindingsdomene på humant CTGF ved anvendelse av standard bindings- og blokkeringseksperimenter. (Se for eksempel Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Harlow og Lane (red.), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2. utgave

(1994) kapittel 10, (Immunochemical Techniques), Saunders; og Clinical Chemistry: Theory, Analysis, Correlation (1984) kapittel 10 (Immunochemical Techniques) og kapittel 11 (Competitive Binding Assays), CV. Mosby, St. Louis). Uavhengige bindingsdomener ble i utgangspunktet definert ved antistoffkonkurranseeksperimenter hvori to forskjellige antistoffer ble innkubert etter hverandre på CTGF-belagte plater. Dersom sterisk hindring fra det første antistoffet forhindret binding av det andre antistoffet til CTGF, ble de to antistoffene tilskrevet samme bindingsdomene. Det bør imidlertid forstås at to antistoffer kan ha forskjellige epitoper, men likevel ligge tilstrekkelig nær hverandre til at de vil anses som medlemmer av samme bindingsdomene.

Bindingsdomener som omfattet alle de fire eksonene i humant CTGF ble påvist. Alle bindingsdomenene er konformasjonsmessig definert slik at antistoffene bindes til CTGF under ikke-reduserende betingelser i western blot-analyser. Noen av antistoffene ble også bundet til CTGF under reduserende betingelser i western blot-analyser, noe som antyder at disse antistoffene bindes til en lineær epitop i CTGF- proteinet. Videre viser antistoffer som representerer en undergruppe av bindingsdomenene krys sr eakti vitet overfor muse-CTGF i western blot-analyser. Antistoff fra gruppene med den høyeste affiniteten for intakt CTGF ble anvendt for videre karakterisering og analyse.

En mer nøyaktig epitopkartlegging ble utført ved ELISA-analyse og anvendelse av spesifikke rekombinant uttrykte fragmenter av CTGF. For eksempel ble antistoffer som gjenkjente epitoper på det N-terminale domenet av CTGF påvist ved ELISA-analyse mot immobiliserte fragmenter erholdt ved rekombinant ekspresjon av ekson 2 og/eller ekson 3 fra CTGF-genet. På denne måten ble antistoffer som spesifikt gjenkjenner N-terminale domener eller N-terminale fragmenter av CTGF utvalgt ogkarakterisertvidere. Antistoffer som spesifikt gjenkjenner C-terminale domener eller C-terminale fragmenter av CTGF ble også utvalgt ogkarakterisertvidere.

Epitopgruppen som er definert ved mAbl bindes til en lineær epitop i det N-terminale fragmentet av CTGF som kodes av ekson 3. En serie av avkortede syntetiske peptider som dekker områder som kodes av polynukleotidet i ekson 3 ble fremstilt og ELISA-analyser ved anvendelse av disse peptidene ble utført for ytterligere å definere epitopen for mAbl. Resultatene er oppsummert i tabell 1; "+" angir binding mellom peptidet og mAbl, mens "-" angir at mAbl ikke ble bundet til peptidet. En "C" med uthevet skrift i kursiv angir en cysteinrest i peptidet som var essensiell for mAbl-binding. En understreket "C" angir en cysteinrest som var innført i enden og som ikke er en del av den native CTGF-sekvensen.

mAbl er følgelig et medlem av en antistoffklasse som bindes til det N-terminale området av CTGF. Den lineære epitopen i CTGF som er nødvendig og tilstrekkelig for binding av mAbl er definert ved aminosyrerest L143 til VI54 i humant CTGF (SEKV.ID. NR. 2). En videre bekreftelse av bindingsspesifisiteten av mAbl overfor dette peptidet ble erholdt ved RIA og affinitetskromatografi. Antistoffer som deler denne epitopen, helt eller delvis, omfattes spesifikt av den foreliggende oppfinnelsen. I tillegg omfattes også antistoffer som konkurrerer med mAbl om binding til CTGF eller et fragment derav også spesifikt av den foreliggende oppfinnelsen.

4.2 Antistoffafflnitet overfor CTGF

Antistoffaffinitet er definert som styrken av de totale ikke-kovalente interaksjonene mellom et enkelt antigenbindende sete i et antistoff og en enkelt epitop på et antigen. Affiniteten beregnes ved å måle assosiasjonskonstanten ( Ka) slik at

hvori [ Ab] er konsentrasjonen av fritt antigenbindende sete på antistoffet, [ Ag] er konsentrasjonen av fritt antigen, [ Ab Ag] er konsentrasjonen av antigenbindende sete på antistoffet som har bundet antigen og Kder dissosiasjonskonstanten av antistoff-antigenkomplekset.

Affiniteten av hver av antistoffpopulasjonene som ble påvist ved epitopkartlegging ble målt ved anvendelse av RIA, hvori intakt rhCTGF ble merket med radioaktivt jod og tilsatt brønner som inneholdt immobilisert monoklonalt antistoff som følger. Rekombinant humant CTGF ble radioaktivt merket med<125>I ved anvendelse av kloramin-T-fremgangsmåten. (Se Greenwood et al. (1963) Biochem J 89: 114-123). Typisk ble minst 60% av det tilsatt<125>I inkorporert og den spesifikke aktiviteten av det merkede CTGF ble minst 1 x 105 cpm/ng, selv om merket CTGF med lavere spesifikk aktivitet kan anvendes i radioimmunanalysen. Et yFc-spesifikt antihumant IgG-innfangingsantistoff fra geit (Jackson ImmunoResearch) i Ca 2+ - og Mg 2+-fritt DPBS (Mediatech, Herndon, VA) ble tilsatt til brønnene i en MAXISORP BREAKAPART mikrotiterplate (Nalge Nunc International, Rochester, NY) og fikk binde seg over natten ved 4°C. Brønnene ble så blokkert med 1% BSA i Ca<2+->og Mg 2_|_-fritt DPBS i minst 4 timer ved 4°C. Blokkeringsløsningen ble fjernet og 100 ul analyseantistoff ved 2-50 ng/ml i Ca<2+->og Mg<2+->fritt DPBS ble tilsatt og fikk binde seg over natten ved 4°C. Blandinger av seriefortynninger av umerket CTGF i en konstant mengde av[12<5>I]rhCTGF ble tilsatt til brønnene og innkubert ved romtemperatur i 4 til 8 timer. Brønnene ble så vasket fire ganger med 0,1% Tween 20 i Ca 2+ - og Mg 2+-fritt PBS (Mediatech) og brønnene i mikrotiterplaten ble skilt fra hverandre og radioaktiviteten målt i en gammateller.

Affiniteten ble estimert grafisk ved fremgangsmåten til Scatchard (1948, Ann NY Acad Sei 51: 660-72). Den totale konsentrasjonen av merket CTGF som ble tilsatt til platen ble beregnet som

hvori cpmtilsatt er tellinger erholdt fra kontrollampuller tilsatt CTGF-blandinger i parallell med brønnene i mitrotiterplaten; cpm/ fmol er den spesifikke aktiviteten av [<125>I]CTGF, CTGF, [ CTGF] kaid iager er konsentrasjonen av umerket CTGF som ble tilsatt til hver brønn og fortynning er bindingsfaktoren for det umerkede CTGF.

Konsentrasjonen av CTGF som ble bundet til antistoff beregnes ut fra andelen av tellinger som ble bundet til brønnene og den totale konsentrasjonen av CTGF som ble tilsatt til brønnene.

Konsentrasjonen av fritt (ubundet) CTGF er differansen mellom den totale tilsatte konsentrasjonen av CTGF og konsentrasjonen av bundet CTGF.

Scatchard-plot for bestemmelse av affiniteten til antistoffer ifølge oppfinnelsen er vist i figur 2. Figur 2A viser binding av et antistoff ifølge oppfinnelsen, mAb2; til [125I] rhCTGF i nærvær av økende konsentrasjoner av umerket rhCTGF. Figur 2B viser binding av et eksemplarisk antistoff ifølge oppfinnelsen, mAbl, til [ 125I] rhCTGF i nærvær av økende konsentrasjoner av umerket rhCTGF. Større vekt gis til punkter hvor mengden bundet og mengden ubundet CTGF er noenlunde like, siden disse punktene vil ha bundet radioaktivitet i vesentlig større grad enn blindprøvene (slik at mengden bundet radioaktivitet bestemmes sikkert), men fortsatt vesentlig mindre enn den totale mengden radioaktivitet tilsatt (følgelig en trygg bestemmelse av fri radioaktivitet). Den maksimale bindingen (Bmax) og Ka er representert som skjæringspunktet med x-aksen henholdsvis y-aksen.

Affiniteten ( Kd) av mAbl for CTGF er lavere enn IO"<9>M, en affinitet som typisk observeres for kommersielt vellykkede antistoffbaserte terapeutiske midler. (Se for eksempel Maini et al. (1998) Arthritis Rheum 41: 1552-1563; Targan et al. (1997) N Engl J Med 337: 1029-1035; Bumgardner et al. (2001) Transplantation 72: 839-45; og Kovarik et al. (1999) Transplantation 68: 1288-94). mAbl er således en egnet kandidat for terapeutisk anvendelse og antistoffer som bindes til samme epitop som mAbl som beskrevet ovenfor og som har en affinitet for CTGF som er lik eller høyere enn mAbl (det vil si en Kd < IO"<9>) er likeså egnede kandidater for terapeutisk anvendelse. Antistoffer som bindes til samme epitop som mAbl men som har lavere affinitet (det vil si høyere Kd) enn mAbl, omfattes også av den foreliggende oppfinnelsen og kan være anvendbare i forskjellige analyser og diagnostiske anvendelser som beskrevet heri. Slike antistoffer kan i tillegg være anvendbare i terapeutisk anvendelser, særlig dersom de har høy aviditet for antigen, som beskrevet nedenfor.

4.3 Antistoff aviditet

For antistoffer med mer enn ett antigenbindende sete (multivalens), gjenspeiler affiniteten i ett bindingssete ikke alltid den virkelige styrken av antistoff-antigeninteraksjonen. Dersom et multivalent antistoff bindes til et antigen med flere gjentatte epitoper, vil interaksjonen mellom antigenet og ett av bindingssetene i antistoffet øke sjansen for en interaksjon mellom antigenet og de andre bindingssetene. Aviditet måler den funksjonelle kombinerte styrken av bindingen mellom et antistoff og dets antigen som er forbundet med både affiniteten av reaksjonen mellom epitopene og paratopene, og antistoffets og antigenets valens. Aviditet gir således et mer nøyaktig mål på et antistoffs tendens til å dissosiere.

Høy aviditet kan kompensere for lav affinitet. For eksempel har antigenbindende seter i IgM generelt lavere affinitet enn i IgG, men multivalensen av IgM gir høy aviditet, noe som muliggjør effektiv binding av antigen.

For å bestemme aviditeten av antistoffer ifølge oppfinnelsen, ble Fab-fragmenter først fremstilt ved konvensjonell papainkløyving av det tilsvarende immunoglobulinet. Immobilisert protein A ble så anvendt for å separere Fab-fragmentene fra Fe og ikke kløyvd antistoff.

Tilnærmet 1 ml immobilisert papainsuspensjon inneholdende 0,5 ml pakket gel, 250 Hg papain og 3,5 BAEE-enheter ble vasket 3 ganger med 1 ml og 1 gang med 10 ml kløyvingsbuffer (DB; 20 mM natriumfosfat, 10 mM EDTA, 20 mM cystein, pH

7,0). Suspensjonen ble så resuspendert med 0,3 ml DB, blandet med 1,1 ml antistoff (tilnærmet 5 mg, pH 7) og omrørt over natten ved 37°C. Antistoffragmentene ble så separert fra harpiksen og Fab-fragmentene ble separert fra Fc-fragmentene og ikke kløyvd antistoff ved affinitetskromatografi ved anvendelse av protein A. Fab-fragmentenes renhet ble målt ved SDS-PAGE (figur 3A).

Det ble skilt mellom monovalent binding og divalent binding ved eluering av antigenbundne antistoffer med varierende konsentrasjoner av tiocyanat. Ved å øke konsentrasjonen av kaotropt ion (tiocyanat) i løsningen, brytes assosiasjoner med lavere affinitet (for eksempel monovalent binding av Fab til antigen) først, mens assosiasjoner med høyere affinitet (for eksempel bivalent binding av IgG til ligand) forblir uforstyrret. Ved å øke tiocyanatkonsentrasjonen kan det således skilles mellom to forskjellige typer binding.

Plater ble belagt med 10 ug/ml CTGF eller CTGF-peptider i 50 mM bikarbonatbuffer (pH 8,5) ved 4°C over natten, blokkert med blokkeringskasein/TBS ved 4°C over natten og så innkubert med 100 ug/ml antistoff eller tilsvarende Fab i blokkeringskasein/TBS ved romtemperatur over natten under omristing. Platene ble så innkubert med fortynninger (1:1) av tiocyanat (0-7,6 M) i 100 mM fosfatbuffer (pH 6,0) i 15 minutter ved romtemperatur under omristing, fulgt av et konjugat mellom alkalisk fosfatase og antihumant (Fab')2fra mus (1:1000 fortynning) ved romtemperatur i 45 minutter. Substrat for alkalisk fosfatase (1 mg/ml; Sigma) i 1 M dietanolamin, 0,5 mM MgCb (pH 9,8) ble tilsatt, platene ble innkubert ved romtemperatur og absorbansen ved 405 nm ble bestemt etter 2, 10, 20 og 60 minutter.

Affinitetsindeksen er den konsentrasjonen av kaotropt middel (tiocyanat) som gir en 50% reduksjon av den opprinnelige absorbansen. For et eksemplarisk antistoff ifølge oppfinnelsen, mAbl, var affinitetsindeksen for dissosiasjon av Fab fra CTGF 0,46 M, mens affinitetsindeksen for dissosiasjon av intakt IgG fra CTGF var 1,8 M (figur 3B). mAbl bindes således hovedsakelig bivalent til antigen (aviditet) og dissosierer fra antigen mye langsommere enn et antistoff som bindes monovalent. Ytterligere antistoffer ifølge oppfinnelsen som har de samme epitopbindende parametere som mAbl, kan også være bivalente eller de kan være mono- eller multivalente. Ethvert av antistoffene ifølge oppfinnelsen kan manipuleres for å forbedre aviditeten, for eksempel ved å kombinere epitopbindende seter i en enkelt antistoffkonstruksjon, for eksempel et tristoff, osv. (Se for eksempel Schoonjans et al. (2000) J Immunol 165: 7050-7057).

4.4 Kryssreaktivitet

Radioimmunanalysen som er beskrevet ovenfor (eksempel 4.2) ble anvendt for å bestemme antistoffenes kryssreaktivitet, bortsett fra at umerket rhCTGF ble erstattet med en annen umerket konkurrent, rotte-CTGF avledet fra normale rottenyreceller (NRK-celler). NRK-celler ble dyrket til konfluens, hvoretter dyrkningsmediet ble endret til serumfritt medium tilsatt 2 ng/ml TGF-02, 50 (xg/ml heparin og 250 (xg/ml BSA. Kondisjonert medium ble oppsamlet etter to dagers dyrking, sentrifugert for fjerning av cellerester og innkubert med heparin-sefarosekuler (1/100 volum/volum kulesuspensjon:medium) i 2 timer ved 4°C under omristing. Blandingen ble så sentrifugert og kulene ble oppsamlet, vasket med PBS og så lysert i SDS-buffer.

Et Scatchard-plot for binding av mAb2 til [ 125IJrhCTGF i nærvær av økende konsentrasjoner av umerket rotte-CTGF er vist i figur 4A; og et Scatchard-plot for

125

binding av mAbl til ["'I]rhCTGF i nærvær økende konsentrasjoner av umerket rotte-CTGF er vist i figur 4B. Som figuren viser, bindes mAbl til CTGF både fra menneske og rotte, mens mAb2 kun bindes til humant CTGF, men ikke til rotte-CTGF.

For mAbl har Scatchard-plottene for konkurranse med rotte-CTGF (figur 4B) lavere vinkelkoeffisient, lavere tilsynelatende affinitet og høyere tilsynelatende Bmaxenn plottene for konkurranse med rhCTGF (figur 2B). Selv om rotte-CTGF kan konkurrere med humant CTGF om binding til mAbl, har således antistoffet høyere affinitet for rekombinant humant CTGF enn for rekombinant rotte-CTGF. mAbl kryssreagerer også med CTGF fra mus og ape (resultater ikke vist). Antistoffer med egnet affinitet for CTGF fra andre arter kan anvendes i behandling og forebygging av lidelser i disse artene. For eksempel kan et antistoff ifølge oppfinnelsen som viser en egnet Kdfor CTGF fra hund anvendes for behandling av en CTGF-assosiert lidelse i hunder. Antistoffer ifølge oppfinnelsen som viser affinitet på tvers av artene, for eksempel mAbl, er også anvendbare som forskningsverktøy for å undersøke CTGF-assosierte lidelser i forskjellige dyremodeller.

4.5 Glykosylering

Radioimmunanalysen som er beskrevet ovenfor (eksempel 4.2) ble anvendt for å bestemme virkningen av glykosylering av antistoffet på antigenbindingsaffiniteten. Antistoff mAbl ble behandlet i 8 dager ved 37°C i PBS, 0,5 M EDTA, pH 8,0 med peptid-N-glykosidase F (PNGase F) som avspalter oligosakkarider fra N-koblede glykoproteiner. Etter innkuberingen ble reaksjonsløsningen enten anvendt direkte eller fraksjonert på en protein A-SEPHAROSE FASTFLOW-kolonne (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) og eluert med 0,1 M glysin-HCl, pH 2,5. Gjenvinning av antistoff etter fraksjoneringen var tilnærmet 87% og endotoksinnivået var 0,30 EU/mg. Deglykosylering ble bekreftet ved SDS-PAGE. Bindingsaktiviteten av deglykosylert antistoff mot humant rekombinant CTGF var identisk innenfor den eksperimentelle feil med bindingsaktiviteten av den glykosylerte formen av antistoffet.

Siden forskjellige celler gir forskjellige glykosyleringsmønstere, kan fremstilling av rekombinante proteiner, for eksempel antistoffer, i dyrkede celler eller ikke-homologe arter gi ikke-nativ glykosylering. Noen proteiner krever spesifikk glykosylering for aktivitet, og endret glykosylering reduserer aktiviteten; for eksempel reduserer affiniteten for antigen når det gjelder antistoffer. Proteinfremstilling i visse systemer, for eksempel planter og hønseegg, kan også gi glykosyleringsmønstere som er immunogene, noe som reduserer muligheten for å anvende proteinene i visse anvendelser. De foreliggende antistoffenes evne til å vise samme aktivitet i glykosylert og ikke-glykosylert form, viser at oppfinnelsen ikke er begrenset av nærværet av glykosylering, nærmere bestemt en artsspesifikk glykosylering.

Eksempel 5. Cellemigrasjonsanalyse

Cellemigrasjon er en normal og viktig cellulær begivenhet, for eksempel under utvikling og sårheling. Cellemigrasjon er også en faktor i forskjellige lidelsers patologi så som dannelse av fibrotiske lesjoner og celler som er isolert fra fibrotiske lesjoner responderer i større grad på kjemotaktiske stimulanser enn celler fra tilsvarende normalt vev.

Antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen ble analysert for deres evne til å inhibere CTGF-stimulert kjemotaktisk migrasjon av glatte muskelceller ved anvendelse av en Boyden kammeranalyse som følger. Glatte muskelceller fra rottearterie (ASMC) i medium tilsatt 0,1% fosterkalveserum (FCS) ble overført til den øvre avdelingen i et Boyden-kammer og medium som inneholdt enten 300 ng/ml rhCTGF, 10% FCS eller 0,1% FCS alene ble tilsatt til den nedre avdelingen. Et kollagenbelagt filter med porer med diameter 8 um separerte det øvre kammeret fra det nedre kammeret. Cellene fikk feste seg til og migrere gjennom filtrere i 2-3 timer. Filteret ble så fjernet, cellene på filteret ble fiksert og farget og celler som migrerte gjennom filteret ble talt. Innkubering med 300 ng/ml rhCTGF ga tilnærmet 5 gangers økning av antallet celler som migrerte gjennom filteret sammenlignet med kontrollen med 0,1% FCS. Økningen i migrasjon stimulert av CTGF var tilnærmet 27% av den kjemotaktiske virkningen som observeres med 10% FCS, som inneholder flere kjemotaktiske faktorer.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen ble analysert for sin evne til å inhibere CTGF-formidlet cellemigrasjon ved anvendelse av analysen som er beskrevet ovenfor, bortsett fra enten anti-CTGF-antistoff (ved 30 og 300 mg/ml) eller blandet humant IgG i tillegg ble tilsatt til nedre kammer. Fire felter av celler fra hvert av 3 separate filtere ble talt for hver prøve i hver analyse. Resultatene er vist i tabell 2.

Som tabell 2 viser, inhiberer antistoffer som bindes til CTGF innenfor epitopen som er definert ved mAbl CTGF-formidlet cellemigrasjon på en doseavhengig måte. Antistoffene i denne epitopgruppen var de eneste anti-CTGF-antistoffene av de analyserte som gjentatte ganger og reproduserbart inhiberte CTGF-indusert migrasjon.

Forskjellige prosesser så som angiogenese, kondrogenese og onkogenese, krever endringer i celletilfesting og cellemigrasjon. CTGF har blitt forbundet med både celletilfesting og cellemigrasjon, og evnen til antistoffer rettet mot CTGF til differensielt å påvirke en aktivitet og ikke en annen, tilveiebringer et omfattende repertoar av terapeutiske midler for behandling av CTGF-assosierte tilstander. Antistoffene som tilveiebringes av den foreliggende oppfinnelsen viser klart differensiell aktivitet når det gjelder nøytralisering av CTGF-aktiviteter. Som eksemplifisert nedenfor, gir disse evnene et unikt terapeutisk potensiale for denne klassen av anti-CTGF-antistoff.

Eksempel 6. Pulmonale lidelser

Intratrakeal (IT) installasjon av bleomycin i mus er et modellsystem som hyppig anvendes for studier av lungefibrose og for analyse av mulige antifibrotiske midler. Antistoffer ifølge oppfinnelsen ble analysert for sin evne til å redusere bleomycinindusert lungefibrose in vivo ved anvendelse av fremgangsmåten som beskrives av Wang et al. (2000) Biochem Pharmacol 60: 1949-1958 som følger.

C57BL/6 hannmus ble tilfeldig oppdelt i to grupper. Musene ble bedøvet med isofluoran og så injisert intratrakealt med en enkelt dose av bleomycin i 0,9% saltløsning ved 0,1 enhet/50 ul/mus eller 0,9% saltløsning alene. Hver gruppe ble behandlet umiddelbart og deretter en gang hver andre dag med i alt syv doser av enten saltløsning eller antistoff, administrert intraperitonealt (IP). Fjorten dager etter IT-installasjonen ble musene avlivet ved tapping av blod fra den nedadgående bukaorta under bedøvelse og lungevev ble tatt ut.

Kollageninnholdet i lungen ble analysert ved å måle nivået av hydroksyprolin og prolin ved anvendelse av fremgangsmåten til Palmerini et al. (1985); J Chromatogr 339: 285-292), bortsett fra at L-azetidin 2-karboksylsyre (Aldrich) ble benyttet i stedet for 3,4-dehydroprolin som intern standard. Kort beskrevet ble vevsprøver hydrolysert i 6 N HC1 i 22 timer ved 105°C. Prøvene gjennomgikk derivatisering med o-ftalaldehyd fulgt av 4-klor-7-nitrobenzofuran (Aldrich) for dannelse av fluorescerende addukter av prolin og hydroksyprolin før analyse på kolonnen. De fluorescerende adduktene ble separert ved reversfase HPLC fulgt av fluorometrisk påvisning.

Figur 5 viser resultatet av terapeutisk administrering av saltløsning (SA), et eksemplarisk antistoff ifølge oppfinnelsen, mAbl og en blanding av CTGF-spesifikke antistoffer (AbsJ), sammenlignet for sin evne til å undertrykke lungefibrose etter behandling med bleomycin. Som figur 5A viser, ga behandling med bleomycin (BL + SA) en signifikant økning av hydroksyprolininnholdet i lunge, 168% høyere enn kontrollgruppen (SA + SA; 220 ±15 ug/lunge). Påfølgende behandling med blandede antistoffer ifølge oppfinnelsen (BL + AbsJ) viste imidlertid en 60% reduksjon av hydroksyprolininnholdet i lunge sammenlignet med bleomycinbehandling alene. På tilsvarende måte viste påfølgende behandling med mAbl (BL + mAbl) en 70% reduksjon av hydroksyprolininnholdet i lunge sammenlignet med bleomycin alene.

En histologisk undersøkelse av muselungene viste normalt pulmonalt parenchymvev i kontrollgruppen (ikke vist). I bleomycinbehandlede lunger kunne imidlertid en økning av områder med fibrose klart observeres (figur 5B; piler). Terapeutisk administrering av et antistoff ifølge oppfinnelsen etter behandling med bleomycin viste en klar reduksjon av fibrose (figur 5C), selv om noen lapper fortsatt viste en mild grad av interstitiell fibrose. Antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen har følgelig terapeutisk nytteverdi ved administrering til pasienter som lider av eller som er utsatt for å få en pulmonal lidelse så som idiopatisk pulmonal fibrose (IPF).

Eksempel 7. Nyrelidelser

7.1. Nyresvikt

Tubulointerstitiell fibrose er en hovedkomponent i flere nyresykdommer forbundet med utvikling til nyresvikt i siste stadium. (Sharma et al. (1993) Kidney Int 44: 774-788). Unilateral urinlederobstruksjon (UUO) som særpreges ved redusert nyrefunksjon og forhøyet interstitiell fibrose, har blitt anvendt som en eksperimentell modell for induksjon av tubulointerstitiell skade og fibrose. (Fern et al. (1999) J Clin Invest 103: 39-46).

Mus ble bedøvet med isofluoran, hvoretter ligering av venstre urinleder ble utført ifølge fremgangsmåten som beskrives av Moriyama et al. (1998; Kidney Int 54: 110-119). Musene ble behandlet umiddelbart etter inngrepet og så en gang hver andre dag med i alt syv doser av enten saltløsning eller antistoff, administrert intraperitonealt (IP). Fjorten dager etter UUO ble dyrene bedøvet og avlivet ved tapping av blod fra den nedadgående bukaorta. Høyre og venstre nyre ble avkapslet hver for seg og veiet. Halvparten av hver nyre ble fiksert i 10% formalin for histologisk undersøkelse (trikromfarging), mens den andre halvparten ble veiet og lagret ved -70°C for bestemmelse av hydroksyprolin. Hydroksyprolin og prolin ble bestemt som beskrevet ovenfor.

Som figur 6A viser, ga UUO en økning av kollageninnholdet i nyre på tilnærmet 4 ganger, målt ut fra forholdet mellom hydroksyprolin og prolin i den obstrukterte venstre nyren sammenlignet med den ikke-obstrukterte høyre nyren i hver mus. Behandling med et antistoff ifølge oppfinnelse, mAbl, førte til en statistisk signifikant, doseavhengig reduksjon av fibrose i den obstrukterte nyren (figur 6A). Imidlertid hadde et antistoff som bindes til den C-terminale epitopen i CTGF, mAb3, ingen signifikant virkning. Trikromfarging av UUO-nyre påviser områder med forhøyet akkumulering av kollagen (figur 6B, piler), mens behandling med et antistoff ifølge oppfinnelsen viser en betydelig reduksjon av farging av kollagen i den obstrukterte nyren (figur 6C).

Alternativt kan nyrefibrose studeres i restnyremodellen i rotte for progressiv nyresvikt. Modellen som omfatter 2/3 unilateral nefrektomi kombinert med fullstendig nyreablasjon kontralateralt (5/6 total nefrektomi) induserer degenerative parenchymendringer som er forbundet med kronisk nyresvikt i restnyren og dyrene blir uremiske og viser markant albuminuri, glomerulosklerose, interstitiell fibrose og tubulær atrofi. (Se for eksempel Frazier et al. (2000) Vet Pathol 37: 328-335; og Gandhi et al. (1998) Kidney Int 54: 1157-1165).

5/6 nefrektomi ble utført ifølge Frazier et al. (2000, Vet Pathol 37: 328-335). Fem uker gamle Sprague-Dawley hannrotter (Harlan, Indianapolis, IN) med gjennomsnittlig kroppsvekt på 120 g ble bedøvet med ketamin og xylazin og den kraniale 1/3 og kaudale 1/3 av venstre nyre ble fjernet. En gassvamp ble påført i kort tid for å oppnå hemostase, bukhulen ble vasket med saltløsning og 0,2 ml butorfenol og dyret ble sydd. En uke etter første inngrep, ble den kontralaterale nyren fjernet fullstendig.

Rottene ble oppdelt i en saltløsningsbehandlet gruppe og en antistoffbehandlet gruppe og behandlingen ble innledet 2 uker etter 5/6 nefrektomi. Saltløsning eller antistoff i en dose på 5 mg/kg ble administrert ved IP-injeksjon (0,5 ml hver gang) hver 3. dag i 15 dager (i alt 5 injeksjoner). Prøver av blod og urin ble tatt ukentlig fra tilfeldig nefrektomiserte rotter for å følge utviklingen av nyresykdom og for å korrelere funksjonelle nyreforstyrrelser med histologiske endringer. Resultatene fra nyrefibroseanalysen, urinanalysen og kjemisk analyse av serum ble sammenlignet mellom gruppene 18 og 28 dager etter innledet behandling.

Nyrefibrose ble evaluert uavhengig av to patologer på blind måte; tre histologiske snitt fra hver nyre ble undersøkt ved anvendelse av tre forskjellige morfologiske fargestoffer; hematoksylin/eosin, Massons trikrom og pikrinsyre-siriusrødt. I tillegg ble en immunhistokjemisk analyse utført på frosne snitt for å anslå typen av kollagendeponering i forskjellige områder av nyren. Kvantitativ kollagenevaluering (forholdet hydroksyprolin/prolin) ble utført og nyrefunksjonen ble anslått ved både urinanalyse og kjemisk analyse av serum på prøver oppsamlet på avlivningstidspunktet.

Histologisk ble moderate forskjeller i fibrose bemerket mellom ubehandlet og antistoffbehandlet restnyre (figur 7). 3 dager etter behandlingen første en blind subjektiv evaluering til en gjennomsnittlig fibrosepoengsum på 12,6 i den saltløsningsbehandlede gruppen sammenlignet med 10,7 i den antistoffbehandlede gruppen (p < 0,05). En statistisk signifikant forskjell i histologisk fibrosegrad mellom antistoffbehandlede og saltløsningsbehandlede rotter kunne fortsatt observeres 14 dager etter behandling med en gjennomsnittlig fibrosepoengsum på 16,9 i den saltløsningsbehandlede gruppen sammenlignet med 14,4 i den antistoffbehandlede gruppen (p < 0,05). Den kvantitative kollagenanalysen basert på hydroksyprolininnhold viste også en tendens mot redusert fibrose i den antistoffbehandlede gruppen sammenlignet med den saltløsningsbehandlede gruppen, men forskjellen var ikke statistisk signifikant.

Kvalitative forskjeller ble også bemerket mellom behandlingsgruppene. Mens det meste av kollagendeponeringen i de antistoffbehandlede gruppene var begrenset til kortikomedulært og medulært interstitium, var fibrosen i de saltløsningsbehandlede rottene multifokalt til diffust fordelt gjennom hele cortex og medulla. De mest markante histopatologiske forskjellene gjaldt mengden glomerulær fibrose. Mange i den saltløsningsbehandlede gruppen hadde moderat til alvorlig glomerulosklerose med perikapsulær fibrose, fortynnet Bowmans membran, syneki og gomerulær aldring. Disse endringene var minimale til milde i de andre gruppene, innbefattet de antistoffbehandlede rottenyrene. Kollagenakkumuleringen ble synliggjort med Massons trikromfarging og pikrinsyre-siriusrødt.

I begge modeller for progressiv nyresvikt, reduserte antistoff ifølge oppfinnelsen vevsdegraderingen og forbedret nyrefunksjon. Således gir antistoffer ifølge oppfinnelsen terapeutiske fordeler ved administrering til pasienter som lider av eller som er utsatt for å få en nyrelidelse så som glomerulonefritt, IgG-nefropati, glomerulosklerose og nyresvikt, tubulusdestruksjon grunnet toksiner, osv.

7.2 Diabetisk nefropati

Diabetes fører til svikt i flere organer innbefattet, men ikke begrenset til, nyre, hjerte og øye. En viktig komponent for patologisk utvikling av diabetisk organsvikt er fibrose. En etablert modell for diabetisk nefropati er en mus med en mutasjon i leptinreseptoren som gir tap av funksjon (Ob-R; kodes av <sfø-genet). Viktige felles egenskaper for db/ db- mus og human diabetisk nefropati omfatter renal hypertrofi, glomerulær forstyrrelse, albuminuri og mesangiummatriseekspansjon.

Antistoffer ifølge oppfinnelsen ble analysert ved anvendelse av db/ db-musemodellen for diabetisk nefropati som følger. Åtte uker gamle db/ db- mus (Harlan, Indianapolis, IN) og deres heterozygote <#>/+-kullkamerater ble behandlet ved intraperitoneal injeksjon med enten antistoff ifølge oppfinnelsen (CLN1; se nedenfor) eller humant kontroll IgG (clgG). I alle dyrene ble en innledende injeksjon av 300 \ ig antistoff fulgt av doser på 100 \ ig administrert 3 ganger ukentlig i 60 dager. Blodprøver ble oppsamlet og kroppsvekten målt ved forsøkets begynnelse og periodisk under behandlingstiden. Kostinntaket ble også målt.

Etter 11 uker forelå det klare forskjeller mellom de diabetiske ( db/ db) dyrene og de ikke-diabetiske ( db/+) dyrene når det gjaldt kroppsvekt, glukosenivå i blodet og forinntak. Behandling med antistoff ifølge oppfinnelsen eller kontrollantistoff påvirket ikke i signifikant grad noen av disse parametrene. Forskjellige målinger av nyrefunksjonen viste imidlertid en klar forskjell mellom diabetiske og ikke-diabetiske mus. Som tabell 3, viste diabetiske mus økt nyrevekt, kreatinin-"clearance" og albuminutskillingshastighet (AER) sammenlignet med ikke-diabetiske mus. Diabetiske dyr behandlet med antistoff ifølge oppfinnelsen viste imidlertid normaliserte verdier for alle disse parametrene. Alle resultater er uttrykt som middelverdi ± SEM. Antall dyr pr gruppe (n) varierte fra 9 til 15.

Siden CTGF induseres av høyt glukosenivå og formidler forskjellige aktiviteter innbefattet ECM-dannelse i vev som følge av skade, for eksempel grunnet dannelse og akkumulering av fremskredet glykosyleringssluttprodukt (AGE) osv., kan sykdomstilstander forbundet med diabetes så som diabetisk nefropati, forhindres ved anvendelse av antistoffene ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 8. Okulære lidelser

Forhøyet ekspresjon av CTGF har blitt forbundet med forskjellige okulære lidelser innbefattet proliferativ vitreoretinopati (PVR), makuladegenerasjon og diabetisk retinopati. (Se for eksempel Hinton et al. (2002) Eye 16: 422-428; He et al. (2003) Arch Ophthalmol 121: 1283-1288; og Tikellis et al. (2004) Endocrinology 145: 860-866). Rollen til CTGF og anvendelse av anti-CTGF terapeutiske midler har blitt foreslått. (Se internasjonal patentpublikasjon WO 03/049773). Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen representerer en enestående, terapeutisk effektiv klasse av anti-CTGF terapeutiske midler for anvendelse i slike okulære lidelser. Evnen til antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen til å lindre komplikasjoner forbundet med okulære lidelser, analyseres i modeller for okulær sykdom som følger.

8.1. Diabetisk retinopati

Dyremodeller for diabetes, for eksempel db/ db- mus, er beskrevet i eksempel 7.2 ovenfor. En hvilken som helst av disse modellene kan anvendes for å vise virkningen av behandling av diabetisk retinopati ved anvendelse av antistoffene ifølge oppfinnelsen. En spesiell modell for diabetisk retinopati gis nedenfor, hvori dyr injiseres med streptozotocin (STZ), et kjent toksin for de insulinutskillende øycellene i bukspyttkjertelen.

Diabetes induseres i rotter (for eksempel Long-Evans, Sprague-Dawley, osv.) ved injeksjon, for eksempel intraperitonealt, av streptozotocin (STZ), for eksempel fra tilnærmet 60 til 85 mg/kg kroppsvekt. For å forbedre overlevelsen, kan rottene gis 10% sukkervann i 24 timer og/eller 2 til 4 enheter insulin pr dag etter STZ-injeksjonen. Forskjellige faktorer innbefattet for eksempel kroppsvekt, utskillingshastigheten for albumin i urin, glukosenivået i blodet, glykosylert hemoglobin, blodtrykk, osv., måles etter for eksempel 4, 8 og 12 uker. Kontrolldyr injisert med buffer alene følges samtidig. Halvparten av de STZ-behandlede rottene og kontrollrottene behandles i tillegg med antistoff ifølge oppfinnelsen, injisert for eksempel intravenøst, intraperitonealt eller intraokulært. Gjennom hele undersøkelsen har dyrene tilgang på for og mat ad libitum. Dyrene avlives etter 12 uker og øynene høstes og undersøkes for histologiske endringer.

En reduksjon av patologiske endringer i antistoffbehandlede dyr sammenlignet med ubehandlede kontrolldyr tyder på en terapeutisk virkning ved diabetisk retinopati. Siden CTGF induseres av høyt glukosenivå og formidler forskjellige aktiviteter innbefattet ECM-dannelse i vev som følge av skade, for eksempel grunnet dannelse og akkumulering av fremskredet glykosyleringssluttprodukt (AGE), kan sykdomstilstander forbundet med diabetes så som diabetisk retinopati, forhindres ved anvendelse av anti-CTGF terapeutiske midler. (Se for eksempel internasjonal patentpublikasjon WO 03/049773). Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen representerer en enestående terapeutisk effektiv klasse av anti-CTGF terapeutiske midler for anvendelse ved okulære lidelser, for eksempel diabetisk retinopati.

8.2 PVR

Retinale pigmenterte epitelceller fra kanin (RPE-celler) isoleres fra voksne kaninøyne og dyrkes i DMEM tilsatt 10% fosterkalveserum. Subkonfluente kulturer (typisk i passasje 2 til 3) anvendes for alle påfølgende injeksjoner. På injeksjonstidspunktet oppsamles dyrkede RPE-celler og suspenderes i PBS til tilnærmet 2,5 x IO<6>celler/ml. Tilnærmet 0,2 ml kammervann fjernes fra øyet til hver mottakerkanin ved anvendelse av en 25 gauge kanyle, hvoretter RPE-celler injiseres gjennom sklera til et punkt tre millimeter bak limbus, like over og ovenfor synsnervepapillen, ved anvendelse av en 27 gauge kanyle. Etter injeksjon av RPE-cellene, injiseres enten 0,1 ml PDGF BB (50-150 ng), CTGF (200-400 ng) eller PDGF og CTGF i PBS gjennom samme inngangssete. Det ikke-injiserte øyet i hvert dyr fungerer som kontroll. Om ønskelig kan CTGF i tillegg injiseres på dag 7 og/eller dag 14 etter første injeksjon. Halvparten av dyrene behandles i tillegg med antistoff ifølge oppfinnelsen, injisert for eksempel intravenøst, intraperitonealt eller intraokulært. Avhengig av administrasjonssetet, kan antistoff administreres daglig eller mindre hyppig, for eksempel på dagene 7, 10, 14, osv.

Dyrene undersøkes ved anvendelse av indirekte oftalmoskopiske fremgangsmåter for å måle utviklingen og omfanget av PVR som klassifiseres ifølge parametere beskrevet av Fastenberg. (Fastenberg et al. (1982) Am J Ophthalmol 93: 565-572). Dyrene avlives så og øynene analyseres ved histologisk undersøkelse for både omfang av membrandannelse og fibrose. I tillegg kan retina og fibrotisk membran oppsamles for måling av kollageninnhold.

Alternativt induseres PVR i kaninøyne ved anvendelse av en subretinal injeksjon av dispase, ved anvendelse av modellen og en tilpasset fremgangsmåte fra Frenzel et al. (1998, Invest Ophthamol Vis Sei 39: 2157-2164). En subretinal blemme dannes ved anvendelse av 50 ml (0,05 U) Dispase (Sigmal Chemical Co.) PBS. Halvparten av dyrene behandles i tillegg med antistoff ifølge oppfinnelsen, injisert for eksempel intravenøst, intraperitonealt eller intraokulært. Retinal løsning induseres hos tilnærmet 75% av de injiserte kaninene som ikke tilføres antistoff ifølge oppfinnelsen en uke etter inngrepet, og hos tilnærmet 100% av dyrene to uker etter inngrepet. Epiretinale membraner undersøkes for omfang av fibrose.

En reduksjon av patologiske endringer i antistoffbehandlede dyr sammenlignet med ubehandlede kontrolldyr viser terapeutisk virkning i PVR. Siden CTGF har blitt forbundet med vevsskade i modeller for PVR, har anti-CTGF-midler blitt foreslått som terapeutiske midler for anvendelse i slike lidelser. (Se for eksempel internasjonal patentpublikasjon WO 03/049773). Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen representerer en enestående terapeutisk effektiv klasse av anti-CTGF terapeutiske midler for anvendelse i okulære lidelser, for eksempel PVR.

Eksempel 9. Sklerose

Sklerose særpreges generelt ved diffus fibrose, degenerative endringer og vaskulære unormaliteter i huden (skleroderma), ledd og indre organer, særlig spiserøret, mage-tarmkanalen, lunge, hjerte og nyre.

9.1. Induksjon av lokalisert granulom

Nyfødte mus utvikler en vedvarende lokalisert fibrose ved administrasjon av en kombinasjon av TGF-P2 og CTGF avledet fra mennesker ved subkutan injeksjon over 7 på hverandre følgende dager. (Mori et al. (1999) J Cell Physiol 181: 153-159; Shinozaki et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun 237: 292-297).

En dag etter fødselen ble musene inndelt i tre behandlingsgrupper og administrert 40 °1 1% museserumalbumin (MSA), PBS tilsatt enten 800 ng TGF-p2, 400 ng CTGF eller både TGF-P2 og CTGF ved subkutan injeksjon i det subkapsulære området på 7 på hverandre følgende dager. Gruppen tilført kombinasjonen av TGF- P2 og CTGF ble videre oppdelt i to grupper, hvor en gruppe i tillegg ble tilført 40 Hg antistoff ifølge oppfinnelsen, mAbl. På dag 11 ble dyrene avlivet og snitt av injeksjonssetene ble prosessert og farget med Masons trikrom for histologisk vurdering. Objektglassene ble randomisert og evaluert kvalitativt på blindet måte av tre forskere; hvor poengvurderingen varierte fra 0 (ingen endring) til 4 (fibrotisk vev), basert på graden av fibrose eller bindevevsekspansjon (se figur 8). Kumulative poeng fra hvert objektglass fra alle de enkelte bedømmerne ble så beregnet og gjennomsnittsverdien ble sammenlignet mellom gruppene ved anvendelse av ANOVA-analyse.

Gjennomsnittlige poengsummer i gruppene for bærerstoffkontroll, TGF-P2 og kombinasjonen av TGF-p2 og CTGF var henholdsvis 0,75, 6,83 og 9,00 (tabell 4).

Den gjennomsnittlige poengsummen for gruppen behandlet med antistoff var 6,17,en statistisk signifikant reduksjon sammenlignet med den tilsvarende kombinasjonen av TGF-P2 og CTGF (p < 0,05), mens behandling med et C-terminalt rettet, ikke-nøytraliserende anti-CTGF-antistoff, mAb3, ikke ga redusert fibrose. Således er antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen spesielt effektive for reduksjon av lokal sklerotisk skade på vev.

9.2. Neonatal systemisk fibrose

Nyfødte mus ble oppdelt i grupper og administrert daglige intraperitoneale injeksjoner på 21 på hverandre følgende dager av 300 ug/kg/dag TGFP, 300Hg/kg/dag CTGF, en kombinasjon av 300 (xg/kg/dag av både TGFP og CTGF, eller kombinasjonen av TGFP og CTGF etter IP administrering av 5 mg/kg antistoff ifølge oppfinnelsen, mAbl, 30 minutter før vekstfaktorbehandlingen. Museungene var sammen med mødrene under behandlingen. På dag 21 ble dyrene avlivet, de viktigste organene ble fjernet og det totale innholdet av prolin og hydroksyprolin målt som beskrevet ovenfor.

Daglige injeksjoner av TGFP induserte mild systemisk fibrose, mens CTGF alene ikke ga noen respons. Kombinasjonen av TGFP og CTGF induserte systemisk fibrose med omfattende deponering av kollagen i flere organer (figur 10) innbefattet lever, lunge, hjerte, mage-tarmkanal, mellomgulv og nyre; omfattende tarmadhesjoner; og en 25% økning av mortaliteten. Administrering av antistoffet ifølge oppfinnelsen i forbindelse med vekstfaktorbehandlingen, reduserte eller forhindret organfibrose (figur 10) og tarmadhesjoner og forhindret dødsfall. Således er antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen i tillegg effektive ved systemisk administrering når det gjelder reduksjon av sklerotisk skade på forskjellige vev og organer. Resultatene som vises i eksemplene 10.1 og 10.2, viser tydelig at antistoffene ifølge oppfinnelsen ved lokal eller systemisk administrering, er terapeutisk effektive for behandling av sklerotiske tilstander.

9.3. Skleroderma

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å lindre fibrose forbundet med skleroderma. Fremgangsmåter som måler omfang og alvorlighet av hudsykdom ved skleroderma er kjente innen faget. (Se for eksempel Rodnan et al. (1979) Arthritis Rheum 22: 130-40; Aghassi et al. (1995) Arch Dermatol 131: 1160-1166; Brennan et al. (1982) Br J Rheumatol 31: 457-460; Kahaleh et al. (1986) Clin Exp Rheumatol 4: 367-369; Falanga og Bucalo (1993) J Am Acad Derm 29: 47-51; Seyger et al. (1997) J Am Acad Derm 37: 793-796; Seyger et al. (1998) J Am Acad Dermatol 39: 220-225; Black (1969) Br J Dermatol 81: 661-666; Ballou et al.

(1990) J Rheumatol 17: 790-794; og Enomoto et al. (1996) J Am Acad Dermatol 35: 381-387).

For eksempel måler modifiserte Rodnan hudpoeng hudens hardhet ved anvendelse av et type OO Rex DD-3 digitalt durometer (Rex Gauge Company, Buffalo Grove, IL) i standardiserte durometerenheter med 0,1 enhets oppløsning. Durometermålinger utføres på de samme hudseter som måles ved Rodnan hudvurdering. Hudpoeng og durometeravlesninger utføres på basalnivå før administrering av et antistoff ifølge oppfinnelsen og hver tredje måned under doseringen og oppfølgingen. Hver måling gjentas fire ganger og en strukturert variansanalyse og beregning av korrelasjonskoeffisienter innen klassene anvendes for å skille mellom repetisjonsvariabiliteten relativt til seter og pasientvariabiliteten.

(Fleiss (1971) Psychol Bull 76: 378-382). Korrelasjonsteknikker anvendes også for å vurdere samsvaret mellom hudpoeng og durometeravlesninger, både for totale poeng og for poeng i undergrupper, på et gitt tidspunkt. Forskjøvne korrelasjonsanalyser (for eksempel å relatere durometerpoeng ved forsøkets begynnelse med hudpoeng på tidspunktet t + 3 måneder eller t + 6 måneders

behandling med antistoff) utføres også. Sykdomsaktiviteten og funksjonell statusinformasjon kan også oppsamles, innbefattet kollagensynteseresultater (PIIINP-målinger). En reduksjon av symptomer og/eller komplikasjoner forbundet med skleroderma, målt ved anvendelse av en hvilken som helst av fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor, viser terapeutisk virkning av antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

Eksempel 10. Osteoartritt

Antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen analyseres i en av de følgende modellene for å vise terapeutisk virkning ved osteoartritt. For de påfølgende eksemplene er konsentrasjonen av antistoff som anvendes i området fra tilnærmet 0,015 til 15 mg antistoff pr kilogram kroppsvekt, for eksempel anses en dose på tilnærmet 5 mg antistoff pr kilogram kroppsvekt å være egnet.

Dyrene, for eksempel 12 uker gamle C57BL/6 hannmus, oppstalles i standardbur og fores med standardkost med springvann ad libitum.

10.1. Intraartikulær injeksjon av AdCTGF i kneledd hos mus En CTGF-holdig adenovirus ekspresjonsvektorkonstruksjon (AdCTGF) fremstilles ved anvendelse av ADEASY-systemet (Qbiogene, Carlsbad, CA) ifølge fremgangsmåter levert av produsenten. Kort beskrevet innsettes et polynukleotid som koder for fullengde humant CTGF i et PSHUTTLE-CMV-plasmid (Qbiogene) ifølge standardteknikker for molekylær kloning. pShuttle-CMV-CTGF-konstruksjonen lineariseres så og samtransfekteres med PADEASY-1-plasmid (Qbiogene) i kompetente E. coli BJ-5183-celler ved elektroporering. AdCTGF amplifiseres og renses ved anvendelse av fremgangsmåter som beskrives av Kim et al. (2001, J Biol Chem 276: 38781-38786); en tom adenovirusvektor anvendes som kontroll. Plakkdannende enheter (i området 1,0-2,1 x 10<10>/ml) og antall viruspartikler (i området 0,9-1,5 x 10<12>/ml) er det samme for AdCTGF og kontrollviruset.

AdCTGF eller kontrolladenovirus (1x10 plakkdannende enheter) injiseres intraartikulært og antistoffer ifølge oppfinnelsen administreres ved intraartikulær, intravenøs, intraperitoneal eller subkutan injeksjon. Antistoff kan injiseres samtidig som adenovirus administreres, eller behandlingen kan alternativt begynne enten før eller etter injeksjon av AdCTGF. Dyrene som tilføres kontrolladenovirus injiseres på tilsvarende måte med enten anti-CTGF-antistoff eller kontrollantistoff. Ikke-injiserte kneledd fungerer som kontroller for virkninger av antistoff.

Kneledd isoleres på forskjellige dager, for eksempel 1, 3, 7, 14 og/eller 28 dager etter AdCTGF-injeksjon, avkalkes i 14 dager i EDTA/polyvinylpyrrolidon og lagres ved -20°C ved anvendelse av fremgangsmåten som beskrives i Stoop et al. (2001, Osteoarthritis Cartilage 9: 308-315). Leddene analyseres histologisk for måling av synovial tykkelse og tap av proteoglykan, in situ hybridisering og immunohistokjemisk analyse utføres for påvisning av CTGF-ekspresjon så vel som ekspresjon av ytterligere faktorer innbefattet kollagen (type I og/eller III), osv. Synovialvæske oppsamles for bestemmelse av nivået av CTGF, metalloproteinaser, osv. Virkningen av behandling med anti-CTGF-antistoffer bekreftes ved en reduksjon av parametere forbundet med osteoartritt sammenlignet med dyr injisert med AdCTGF og behandlet med kontrollantistoff.

10.2. Intraartikulær injeksjon av AdTGFj} i kneledd hos mus Alternativt kan antistoffer analyseres i dyremodellen for osteoartritt som beskrives av Bakker et al. (2001, Osteoarthritis Cartilage 9: 128-136). For eksempel kan antistoff ifølge oppfinnelsen eller kontrollantistoff injiseres samtidig med, før eller etter intraartikulær injeksjon av 1 x IO<7>pfu TGFP-uttrykkende adenoviruskonstruksjoner (AdTGFP). Ikke-injiserte kneledd fungerer som kontroller for virkninger av antistoff. På forskjellige dager, for eksempel dag 3, 7, 14, osv., avlives dyr fra hver gruppe og vev isoleres og prosesseres. Leddenes histologi analyseres for måling av synovial tykkelse, proteoglykantap og osteofyttdannelse, osv.; in situ hybridisering og immunohistokjemisk analyse utføres for påvisning av CTGF-ekspresjon, så vel som ekspresjon av ytterligere faktorer innbefattet kollagen (type I og/eller III), osv. Synovialvæske oppsamles for bestemmelse av nivået av TGFP, CTGF, metalloproteinaser, osv. Virkningen av behandling med antistoffer ifølge oppfinnelsen bekreftes ved en reduksjon av parametere forbundet med osteoartritt sammenlignet med dyr injisert med AdTGFP og behandlet med kontrollantistoff.

10.3. Intraartikulær injeksjon avpapain i kneledd hos mus Alternativt kan antistoffer analyseres ved anvendelse av fremgangsmåten som

beskrives i van der Kraan et al. (1989, Am J Pathol 135: 1001-1014). Intraartikulær injeksjon av papain induserer osteofyttdannelse, fibrose og tap av proteoglykan fra leddbrusk. Papainmodellen innledes ved injeksjon av 1 enhet papainløsning (Sigma, St. Louis, MO) i musens høyre kneledd. Venstre kneledd i hvert dyr fungerer som intern kontroll. Antistoffer ifølge oppfinnelsen administreres ved intraartikulær, intravenøs, intraperitoneal eller subkutan injeksjon, samtidig med, før eller etter intraartikulær injeksjon av papain (0,5%/kne). På forskjellige dager, for eksempel dag 3, 7, 14, osv., avlives dyr fra hver gruppe og vev isoleres og prosesseres. Leddene analyseres histologisk for måling av synovial tykkelse, tap av proteoglykan, osteofyttdannelse, osv.; in situ hybridisering og immunohistokjemisk analyse utføres for påvisning av CTGF-ekspresjon, så vel som ekspresjon av ytterligere faktorer innbefattet kollagen (type I og/eller III), osv. Synovialvæske oppsamles for bestemmelse av nivået av TGF, CTGF, metalloproteinaser, osv.

Virkningen av behandling med anti-CTGF-antistoffer bekreftes ved en reduksjon av parametere forbundet med osteoartritt sammenlignet med dyr injisert med papain og behandlet med kontrollantistoff.

Eksempel 11. Kloning og ekspresjon

Selv om det påfølgende eksempelet illustrerer kloning og ekspresjon av ett bestemt antistoff ifølge oppfinnelsen, er fremgangsmåtene generelt anvendbare for alle antistoffer som beskrives og kreves heri.

Et eksemplarisk antistoff ifølge oppfinnelsen, mAbl, ble først påvist som del av et komplekst humant antistoff utskilt av en hybridomcellelinje (8C12-F10; fremstilt som beskrevet i eksempel 3).

11.1. Kloning og sekvensering av mXbl- tungkjede

Budbringer RNA ble isolert fra en kultur av 8C12-F10-celler ved anvendelse av et MICRO-FAST TRACK-sett (Invitrogen) ifølge fremgangsmåter levert av produsenten. To cDNA-porsjoner ble så fremstilt ved andre tråds syntese ved anvendelse av et cDNA-cellesyklussett (Invitrogen) ifølge fremgangsmåter levert av produsenten og ved anvendelse av en av følgende tungkjede antisensprimere:

Sekvenser fra tungkjedens variable område ble klonet ved PCR-amplifisering av den AB90-primede cDNA-porsjonen ved anvendelse av AB90-primer og en av en serie av V-områdeprimere, innbefattet primere som tilsvarer konserverte sekretoriske signalsekvenser som koder for den 5' enden av de angjeldende kodende områdene, og rammeverksområde 1-sekvenser som koder for begynnelsen av de modne immunoglobulinene. Pfu DNA-polymerase (Stratagene) ble anvendt ifølge produsentens anbefalte fremgangsmåter med følgende variasjoner: Reaksjonene ble typisk utført i et totalvolum på 50 ul inneholdende 1 ul cDNA, 0,75 uM hver av forover og revers primer, 200 uM av hvert dNTP og 1 ul Pfu polymerase (2,5 enheter pr ul). Et program for en programmerbar varmeblokk ble anvendt med en innledende innkubering ved 94°C i 2 minutter før tilsetning av enzym. Følgende syklusparametere ble så benyttet: Ti sykluser bestående av 94°C i 45 sekunder, 65°C i 45 sekunder og 72°C i 1 minutt, tretti sykluser bestående av 94°C i 45 sekunder, 55°C i 45 sekunder og 72°C i 1 minutt; og så en syklus bestående av 72°C i 10 minutter.

Kun én tungkj ede signalsekvensprimer, AB 87 (ATGGAGTTTGGRCTGAGCTG; SEKV.ID. NR. 5) som bindes til tungkjede V-områder fra VH3-familien, ga signifikant produkt. PCR-produktet på 453 nukleotider ble klonet inn i vektoren PCR BLUNT II-TOPO (Invitrogen), kloner ble analysert for korrekt innskuddsstørrelse og tre kloner som tilsvarte PCR-produktene ble sekvensert. Identiske sekvenser ble erholdt for alle de tre klonene.

Sekvenser fra tungkj edens konstante område og UTR-området ble klonet ved PCR-amplifisering av den ml9 H1504R-primede cDNA-porsjonen. Et PCR-fragment på 601 nukleotider som tilsvarte den 5' enden av tungkjedesegmentet ble amplifisert ved anvendelse av sensprimeren VH3-33 29-51F

(CGGCGGTGTTTCCATTCGGTGAT; SEKV.ID. NR. 6) og antisensprimeren for tungkjedens konstante område ml9 H553R (GGGCGCCTGAGTTCCACGACAC; SEKV.ID. NR. 7). Topoisomeraseformidlet kloning ble anvendt for kloning av PCR-produktene i vektoren PCR-BLUNT II (Invitrogen) ifølge produsentens instruksjoner og innskuddet ble så sekvensert. På tilsvarende måte ble et PCR-fragment på 505 nukleotider amplifisert ved anvendelse av sensprimeren ml9 H439F (GTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTC; SEKV.ID. NR. 8) og antisensprimeren ml 9 H943R (CCCGCGGCTTTGTCTTGGCATTAT; SEKV.ID. NR. 9) og PCR-fragment på 503 nukleotider ble amplifisert ved anvendelse av sensprimerml9H1002F (CTGGCTGAATGGCAAGGAGTA; SEKV.ID. NR. 10) og antisensprimer ml9H1504R. De to fragmentene ble hver for seg klonet inn i

vektoren PCR-BLUNT II og sekvensert som beskrevet ovenfor. Et fjerde tungkj ede PCR-fragment på 586 nukleotider ble amplifisert ved anvendelse av sensprimer ml9 H645f (GGGCACCCAGACCTACATC; SEKV.ID. NR. 11) og antisensprimer ml9 H1230R (CTCCGGCTGCCCATTGCTCTCC; SEKV.ID. NR. 12) og sekvensert direkte.

Figur 11A viser et diagram over sammenstillingen av de klonede PCR-fragmentene som ga fullengde nukleotidsekvensen (SEKV.ID. NR. 13) som koder for mAbl tungkjeden (SEKV.ID. NR. 14). Aminosyresekvensen til tungkjedens variable område ligner mest på VH3-kimcellelinjegenet DP-44. Selv om det ikke var mulig å si hvilket D-segment som var benyttet, ligner sekvensen til mAbl mest på DH4-familien. JH-området passer best med kimcellelinjen JH4 og JH5. Tungkjedens konstante område i mAbl stemmer med GenBank aksesjonsbetegnelse BCO 16381, noe som tyder på en allotype av Glm(3).

11.2. Kloning og sekvensering av mAbl- lettkjeden

Budbringer RNA ble isolert fra en kultur av 8C12-F10-celler ved anvendelse av et MICRO-FAST TRACK-sett (Invitrogen) ifølge fremgangsmåter levert av produsenten. To cDNA-porsjoner ble så fremstilt ved andre tråds syntese ved anvendelse av et cDNA cellesyklussett (Invitrogen) ifølge fremgangsmåter levert av produsenten og en av følgende lettkjede antisens cDNA-primere:

Sekvenser fra lettkjedens variable område ble klonet ved PCR-amplifisering av den AB16-primede cDNA-porsjonen ved anvendelse av AB16-primer og en av en serie av V-områdeprimere innbefattet primere som tilsvarer konserverte sekretoriske signalsekvenser som koder for den 5' enden av de angjeldende kodende områdene og rammeverksområde 1-sekvenser som koder for begynnelsen av de modne immunoglobulinene. Pfu DNA-polymerase (Stratagene) ble anvendt ifølge produsentens anbefalte fremgangsmåter med de variasjoner og syklusparametere som er beskrevet ovenfor.

Kun én lettkjede signalsekvensprimer, AB 123

(CCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTG; SEKV.ID. NR. 17) som bindes til tungkj ede V-områder fra VK1-familien, ga signifikant produkt. PCR-produktet på 408 nukleotider ble klonet inn i vektoren PCR BLUNT II-TOPO (Invitrogen), kloner ble analysert for korrekt innskuddsstørrelse og tre kloner som tilsvarte PCR-produktene ble sekvensert. Identiske sekvenser ble erholdt for alle de tre klonene.

Sekvenser fra lettkjedens konstante område ble klonet ved PCR-amplifisering av den Ck-760R-primede cDNA-porsjonen. Hele den kodende sekvensen og 5' UTR-området for lettkjeden ble amplifisert ved anvendelse av lettkjede sensprimeren LI 5 22m (TCAGWCYCAGTCAGGACACAGC; SEKV.ID. NR. 18) og Ck-760R. Fragmentet på 788 nukleotider ble klonet inn i vektoren PCR BLUNT II (Invitrogen) og sekvensert. Det resulterende plasmidet ble betegnet 41m6.

Figur 11B viser et diagram over sammenstillingen av de klonede PCR-fragmentene som ga fullengde nukleotidsekvensen (SEKV.ID. NR. 19) som koder for mAbl-lettkjeden (SEKV.ID. NR. 20). Aminosyresekvensen til lettkjedens variable område stemmer best med områder som kodes av nukleotidsekvenser fra kimcellelinjen VK LI5 og Jk2. Lettkjedens konstante område i mAbl er identisk med den rapporterte humant kimcellelinjen kappa-lettkjede immunoglobulingensekvensen. (Whitehurst et al. (1992) Nucleic Acids Res 20: 4929-4930).

11.3. Fremstilling av ekspresjons konstruksjoner for mAbl- tungkjede og - lettkjede Fullengde mAbl tungkj ede cDNA ble fremstilt ved overlappsforlengelse-PCR i to trinn fra tungkjede PCR-produktene beskrevet ovenfor og vist i figur 1 IA. De to 5' PCR-produktene ble blandet med de distale primerne VH3-33 29-51F og ml9 H943R i en PCR-overlappforlengelsesreaksjon for dannelse av et enkelt fragment på 991 nukleotider. På tilsvarende måte ble de to 3' PCR-produktene blandet med de distale primerne VH3-33 29-51F og ml9 H943R i en PCR-overlappsforlengelsesreaksjon for dannelse av et fragment på 860 nukleotider. Disse to PCR-forlengelsesreaksjonsproduktene ble så gelrenset og amplifisert sammen ved anvendelse av de distale primerne VH3-33 29-51F og ml9 H1504R for dannelse av

cDNA på 1407 nukleotider (nukleotid 441 til og med 1847 i SEKV.ID. NR. 13) omfattende den kodende sekvensen for fullengde mAbl-tungkjede.

Tungkj ede cDNA ble så klonet inn i vektoren PCR-BLUNT II TOPO (Invitrogen) for dannelse av plasmid 43a4. Det kodende området for mAbl-tungkjeden ble så subklonet ved kutting av plasmid 43a4 med restriksjonsendonukleasene BamHI og Xbal, fulgt av ligering av det utkuttede innskuddet til ekspresjonsvektoren PCDNA5-FRT (Invitrogen) som på forhånd var kuttet med restriksjonsendonukleasene BamHI og Nhe. Innskuddet i det resulterende ekspresjonsplasmidet, 44al, ble sekvensbekreftet før det ble subklonet på tilsvarende måte i revers orientering i vektoren PBK-CMV (Clontech) for dannelse av plasmid 47a4 og inn i vektoren pCEP-Pu (E. Kohfeldt, Max-Planck-Institut fur Biochemie), en vektor avledet fra pCEP4-vektoren (Invitrogen), for dannelse av plasmid 49al.

Det 708 nukleotider lange cDNA (restene 415 til og med 1122 i SEKV.ID. NR. 19) som koder den fullengde mAbl lette kjeden ble utkuttet fra plasmid 41m6 som beskrevet ovenfor ved anvendelse av restriksjonsendonukleasene Hindlll og Xhol og ligert inn i PCDNA5-FRT-vektoren (Invitrogen) som på forhånd var kuttet med restriksjonsendonukleasene Hindlll og Xhol, for å danne pattedyrekspresjonsplasmidet 42b2. Innskuddet av plasmid 42b2 ble sekvensbekreftet før det på tilsvarende måte ble subklonet i reversorientering inn i PBK-CMV-vektoren (Clontech) for dannelse av plasmid 47b3 og inn i pCEP-Pu-vektoren (E. Kohfeldt, Max-Planck-Institut fur Biochemie) for dannelse av plasmid 49b 1.

11.4. Transfeksjon og ekspresjon av antistoffkjedekonstruksjoner COS7-celler ble transfektert med plasmidene 44al (mAbl-tungkjede) og 42b2 (mAbl-lettkjede), både hver for seg og i samtransfeksjoner ved anvendelse av standardfremgangsmåter. Kondisjonert dyrkningsmedium ble analysert for nærvær av antistoff som beskrevet i eksempel 4 ( supra). Kun medium fra celler samtransfektert med både 44a 1 og 42b2 uttrykte humant antistoff med CTGF-bindende aktivitet, målt ved ELISA ved anvendelse av fremgangsmåter som er beskrevet ovenfor. Antistoffet, heri betegnet CLN1, som ble dannet av de samtransfekterte COS7-cellene, bindes til den N-terminale halvdelen av CTGF med en affinitet på 0,8 nM.

CLN1 har også blitt uttrykt i genetisk modifiserte kinahamster eggstokkceller (CHO-celler). En CHO-cellelinje som uttrykte det eksemplariske antistoffet CLN1 ble deponert hos American Type Culture Collection (Manassas, VA) og gitt ATCC-aksesjonsbetegnelsen PTA 6006. Cellelinjer kan optimaliseres og antistoff ekspresjonen forsterkes ved anvendelse av forskjellige teknikker som er kjente innen faget, for eksempel ved genamplifisering som beskrevet av Wigler et al. (1980; Proe Nati Acad Sei USA 77: 3567-3570) med modifikasjoner som beskrevet av Ringold et al. (1981; J mol Appl Genet 1: 165-175), Gasser et al.

(1982; Proe Nati Acad Sei USA 79: 6522-6526) og Kaufman et al. (1985; Mol Cell Biol 5: 1750-1759).

Eksempel 12: Interaksjon mellom CTGF og TGFp

Antistoffer ifølge oppfinnelsen bindes spesifikt til områder i CTGF definert ved aminosyrerestene som kodes av ekson 3 (figur IB; nukleotid 418 til nukleotid 669 i SEKV.ID. NR. 1). Dette området omfatter aminosyre 97 til aminosyre 180 i SEKV.ID. NR. 2 og omfatter von Willebrand type C-domenet (aminosyre 103 til aminosyre 164 i SEKV.ID. NR. 2) og epitopen til mAbl (aminosyre 134 til aminosyre 158 i SEKV.ID. NR. 2). Abreu et al. (2002, Nat Cell Biol 4: 599-604) rapporterer at et domene som tilsvarer VWC-domenet i CTGF er viktig for interaksjonen mellom CTGF og TGFP eller BMP-4, og at denne interaksjonen modulerer aktiviteten av TGFP og BMP-4. De påfølgende eksperimentene viser at områder som kodes av ekson 3 er nødvendige og tilstrekkelige for binding av CTGF til TGFp og at antistoffer ifølge oppfinnelsen kan blokkere interaksjonen mellom CTGF og TGFp.

Interaksjonen mellom CTGF og TGFp ble analysert ved anvendelse av følgende fremgangsmåte. Brønnene i en 96 brønners MAXISORP ELISA-plate (Nalge Nunc) ble belagt over natten ved 4°C med 10 (xg/ml av enten CTGF, CTGF-fragmentet som kodes av ekson 3 eller CTGF-fragmentet som kodes av ekson 5 i PBS, eller med PBS alene. Alle brønner ble så blokkert med 1% BSA i PBS fulgt av innkubering i 1 time ved romtemperatur i 50 ul av en løsning inneholdende TGFP i en konsentrasjon på 0, 1, 3,3, 10, 33, 100, 333 eller 1000 ng/ml og det monoklonale anti-TGFp-antistoffet MAB612 eller MAB1835 fra mus (R&D Systems, Minneapolis, MN) i konsentrasjoner på 100, 300 eller 1000 ng/ml i PBS, 0,05% Tween-20. MAB1835 gjenkjenner TGF-pi og -P2 fra storfe, mus og menneske og blokkerer bindingen av TGFP til musetymocytter. MAB612 gjenkjenner TGF-P2, men inhiberer ikke TGFP-aktiviteter. Brønnene ble vasket med PBS, 0,05% Tween-20 og så innkubert i 1 time ved romtemperatur i en løsning inneholdende et anti-muse IgG-antistoff fra geit konjugert til alkalisk fosfatase, fortynnet i PBS, 0,05% Tween-20. Platene ble igjen vasket og p-nitrofenylfosfat (PNPP) i 1 M etanolamin, 1 mM MgSC>4, pH 9,8, ble tilsatt, brønnene ble innkubert i et egnet tidsrom for fremkalling og reaksjonen ble så avsluttet ved tilsetning av NaOH. Absorbansen ved en X på 405 nm ble målt ved anvendelse av et spektrofotometer.

Figur 12 viser at CTGF og CTGF-fragmentet som kodes av ekson 3 kan interagere med TGFP i samme grad, mens CTGF-fragmentet som kodes av ekson 5 ikke viser bindingsaktivitet overfor TGFp. Det er av interesse at anti-TGFP-antistoffet

MAB612 også kunne påvise CTGF-bundet TGFp på en doseavhengig måte, mens det nøytraliserende antistoffet, MAB1835 ikke kunne påvise CTGF-bundet TGFP i noen av de analyserte konsentrasjonene (resultater ikke vist). Dette antyder av CTGF konkurrerer med MAB1835 om binding til TGFp.

Anti-CTGF-antistoffer ble analysert for evne til å blokkere bindingen mellom CTGF og TGFp. Som vist i figur 12, blokkerte antistoffer ifølge oppfinnelsen, eksemplifisert ved mAb4 og mAbl, binding av TGFp til både CTGF og CTGF-fragmentet som kodes av ekson 3, mens et anti-CTGF-antistoff rettet mot det C-terminale fragmentet av CTGF ikke blokkerte bindingen. Disse resultatene understøtter en virkningsmekanisme hvori antistoffer ifølge oppfinnelsen spesifikt blokkerer en interaksjon mellom CTGF og TGFP og muligens mellom CTGF og andre medlemmer av TGFp-superfamilien.

Forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til dem som er vist og beskrev et heri, vil bli åpenbare for fagfolk ut fra beskrivelsen ovenfor.

Claims

1. Antistoff eller en del derav, som spesifikt binder til minst en del av et område i humant CTGF som tilsvarer aminosyrene 143 til 154 i SEKV.ID. NR. 2 eller et ortologt område i CTGF avledet fra en annen art.

2. Antistoff ifølge krav 1, hvori antistoffets affinitet overfor CTGF er tilnærmet 10"<9>M.

3. Antistoff ifølge ethvert av de foregående krav, hvori antistoffet har samme spesifisitet som et antistoff som dannes av cellelinjen som har ATCC-aksesjonsbetegnelse PTA-6006.

4. Antistoff ifølge ethvert av de foregående krav, hvori antistoffet dannes av cellelinjen som har ATCC-aksesjonsbetegnelse PTA-6006.

5. Antistoff ifølge ethvert av de foregående krav, hvori delen er et Fab-fragment, F(ab)2-fragment eller Fv-fragment.

6. Antistoff som spesifikt binder til minst en del av et område i humant CTGF som tilsvarer aminosyrene 143 til 154 i SEKV.ID. NR. 2 eller et ortologt område i CTGF avledet fra en annen art, omfattende polypeptider valgt fra gruppen bestående av: (a) en immunglobulin tungkjede-sekvens omfattende SEKV.ID. NR. 14; (b) en immunglobulin tungkjede-sekvens omfattende det variable domenet av SEKV.ID. NR. 14; eller (c) en konservativ variant av (a) eller (b); og et andre polypeptid valg fra gruppen bestående av: (d) en immunglobulin lettkjede-sekvens omfattende SEKV.ID.NR. 20; (e) en immunglobulin lettkjede-sekvens omfattende det variable domenet av SEKV.ID.NR. 20; eller (f) en konservativ variant av (d) eller (e).

7. Antistoff ifølge krav 6, hvori det variable domenet omfatter et variabelt domene fra en immunglobulin tungkjede som tilsvarer aminosyrene 1 til 167 i SEKV.ID. NR. 14.

8. Antistoff ifølge krav 6, hvori det variable domenet omfatter et variabelt domene fra en immunglobulin lettkjede som tilsvarer aminosyrene 1 til 136 i SEKV.ID. NR. 20.

9. Antistoff ifølge krav 6, hvori det omfatter en immunglobulin tungkj ede med en aminosyresekvens som beskrevet i SEKV.ID. NR. 14 og en immunglobulin lettkjede med en aminosyresekvens som beskrevet i SEKV.ID. NR. 20.

10. Antistoff ifølge ethvert av de foregående krav, hvori antistoffet er i stand til å nøytralisere CTGF-indusert stimulering av cellemigrasjon.

11. Antistoff ifølge ethvert av de foregående krav, hvori antistoffet reduserer fibrose i et individ.

12. Antistoff ifølge krav 11, hvori fibrosen opptrer i et vev utvalgt fra gruppen som består av epitelvev, endotelvev og bindevev.

13. Antistoff ifølge krav 11, hvori fibrosen opptrer i et organ utvalgt fra gruppen som består av nyre, lunge, lever, hjerte og hud.

14. Antistoff ifølge ethvert av de foregående krav, hvori antistoffet er et enkeltkjedet antistoff.

15. Antistoff ifølge ethvert av de foregående krav, hvori antistoffet er et humanisert antistoff.

16. Antistoff ifølge ethvert av de foregående krav, hvori antistoffet er et kimært antistoff.

17. Antistoff ifølge ethvert av de foregående krav, hvori antistoffet er et multivalent antistoff.

18. Antistoff ifølge ethvert av de foregående krav, hvori antistoffet et monoklonalt antistoff.

19. Antistoff ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvori antistoffet er glykosylert.

20. Antistoff ifølge hvilket som helst av krav 1-29, hvori antistoffet ikke er glykosylert.

21. Antistoff ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvori antistoffet er konjugert til et cytotoksisk middel eller et enzym.

22. Antistoff ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvori antistoffet er påvisbart merket.

23. Antistoff ifølge krav 22, hvori den påvisbare merkingen er et enzym, en fluorescerende gruppe, en kjemiluminescerende gruppe, biotin, avidin eller en radioaktiv isotop.

24. Kimært antistoff i følge krav 1, omfattende et variabelt område avledet fra et variabelt område fra et antistoff ifølge ethvert av kravene 1-23 og et konstant område avledet fra en annen kilde.

25. Kimært antistoff ifølge krav 24, hvori det konstante området er avledet fra et konstant område fra et humant immunglobulin.

26. Farmasøytisk sammensetning, omfattende et antistoff ifølge ethvert av de foregående krav.

27. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 26, hvori sammensetningen videre omfatter et andre terapeutisk middel.

28. Antistoff i følge ethvert av de foregående krav 1-25 for anvendelse i medisin.

29. Antistoff i følge ethvert av kravene 1-25 for administrasjon til et individ som er predisponert for eller diagnostisert med hypertensjon, hyperglykemi, diabetes, myokardialt infarkt, artritt eller lokal eller systemisk betennelse.

30. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1-25 for anvendelse i behandling eller forebygging av en celleproliferativ lidelse.

31. Antistoff ifølge krav 30, hvori at den celleproliferative lidelsen er angiogenese, aterosklerose, glaukom eller kreft.

32. Antistoff ifølge krav 31, hvori kreften omfatter akutt lymfoblastisk leukemi, dermatofibromer, brystkreft, brystcarcinom, desmoplasi, angiolipom, angioleimyom, desmoplastisk kreft, prostatakreft, eggstokkreft, bukspyttkjertelkreft, gastrointestinal kreft eller leverkreft.

33. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1-25 for anvendelse i behandling eller forebygging av en fibrotisk lidelse.

34. Antistoff ifølge krav 33, hvori den fibrotiske lidelsen er idiopatisk pulmonal fibrose, diabetisk nefropati, diabetisk retinopati, osteoartritt, skleroderma, kronisk hjertesvikt eller skrumplever.

35. Medikament omfattende antistoffet ifølge ethvert av kravene 1-25, for behandling av et individ med en lidelse valgt fra gruppen som består av idiopatisk pulmonal fibrose, diabetisk nefropati, kronisk hjertesvikt og skrumplever.

36. Medikament omfattende antistoffet ifølge ethvert av kravene 1-25, for behandling av et individ som er predisponert for en lidelse som skyldes en tilstand utvalgt fra gruppen som består av hypertensjon, diabetes, myokardialt infarkt, artritt og lokal eller systemisk betennelse,

37. Par av polynukleotidsekvenser omfattende en første sekvens valgt fra gruppen bestående av; (a) en polynukleotidsekvens som koder for SEKV.ID. NR. 14; (b) en polynukleotidsekvens som koder for sekvensen fra aminosyre 1 til aminosyre 167 i SEKV.ID. NR. 14; (c) SEKV.ID.NR. 13; og (d) nukleotid 1 til og med nukleotid 501 i SEKV.ID. NR. 13; og en andre polynukleotidsekvens omfattende en sekvens valgt fra gruppen bestående av: (a<1>) en polynukleotidsekvens som koder for SEKV. ID. NR: 20; (b<1>) en polynukleotidsekvens som koder for sekvensen fra aminmosyre 1 til 136 i SEKV. ID. NR: 20; (c<1>) SEKV. ID. NR: 19; og (d<1>) nukleotid 1 til nukleotid 408 i SEKV. ID. NR: 19.

38. Par av rekombinante polynukleotider omfattende et første rekombinant polynukleotid omfattende den første polynukleotidsekvensen i følge krav 37 operativt bundet til en vektorsekvens som inneholder replikasjons- og transkripsjonskontrollsekvenser; og et andre rekombinant polynukleotid omfattende den andre polynukleotidsekvensen i følge krav 37 operativt bundet til en vektorsekvens som inneholder replikasjons- og transkripsjonskontrollsekvenser.

39. Rekombinant polynukleotider ifølge krav 38, hvori det første polynukleotidet koder for aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 14 og det andre polynukleotidet koder for aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NR. 20.

40. Rekombinant polynukleotid ifølge krav 51 hvori det første polynukleotidet koder for aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 13 og det andre polynukleotidet koder for aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NR. 19.

41. Vertscelle, hvori vertscellen er transfektert med det rekombinante polynukleotidet ifølge krav 38.

42. Vertscelle omfattende en celle som er kotransfektert med et polynukleotid som koder for SEKV.ID. NR. 14 og et polynukleotid som koder for SEKV.ID. NR. 20 og at den danner et funksjonelt antistoff med samme egenskaper som besittes av antistoffet som dannes av cellelinjen med ATCC-aksesjonsbetegnelse PTA-6006.

43. Vertscelle ifølge krav 42, hvori vertscellen er cellelinjen identifisert ved at den har ATCC-aksesjonsbetegnelse PTA-6006.