RU2330861C2 - Антитела к ростовому фактору соединительной ткани - Google Patents
Антитела к ростовому фактору соединительной ткани Download PDFInfo
- Publication number
- RU2330861C2 RU2330861C2 RU2005141492/13A RU2005141492A RU2330861C2 RU 2330861 C2 RU2330861 C2 RU 2330861C2 RU 2005141492/13 A RU2005141492/13 A RU 2005141492/13A RU 2005141492 A RU2005141492 A RU 2005141492A RU 2330861 C2 RU2330861 C2 RU 2330861C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- ctgf
- antibodies
- seq
- antibody according
- Prior art date
Links
- 108010039419 Connective Tissue Growth Factor Proteins 0.000 title description 392
- 102000015225 Connective Tissue Growth Factor Human genes 0.000 title description 391
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 132
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 98
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims abstract description 74
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 claims abstract description 70
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 61
- 101000777550 Homo sapiens CCN family member 2 Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 30
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 21
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 102100031168 CCN family member 2 Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 133
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 109
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 78
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 64
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 49
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 45
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 44
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 37
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 31
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 31
- 102000047612 human CCN2 Human genes 0.000 claims description 29
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 27
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 27
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 26
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 25
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 25
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 25
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 25
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 25
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 21
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 21
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 21
- 208000007342 Diabetic Nephropathies Diseases 0.000 claims description 20
- 208000033679 diabetic kidney disease Diseases 0.000 claims description 20
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 claims description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 claims description 15
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 claims description 14
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 13
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 claims description 11
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 11
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 11
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 11
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 10
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 claims description 10
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 claims description 10
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 10
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 claims description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 10
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 8
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 claims description 7
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 claims description 7
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 7
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 6
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims description 6
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims description 6
- 206010053717 Fibrous histiocytoma Diseases 0.000 claims description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 6
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims description 6
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 6
- 208000009887 angiolipoma Diseases 0.000 claims description 6
- 208000001119 benign fibrous histiocytoma Diseases 0.000 claims description 6
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 6
- 201000010305 cutaneous fibrous histiocytoma Diseases 0.000 claims description 6
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 5
- 206010007558 Cardiac failure chronic Diseases 0.000 claims description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 claims description 4
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 3
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 claims description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000013155 positive regulation of cell migration Effects 0.000 claims description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 2
- 102000050019 Membrane Cofactor Human genes 0.000 claims 3
- 108700031312 Membrane Cofactor Proteins 0.000 claims 3
- 102000043168 TGF-beta family Human genes 0.000 claims 3
- 108091085018 TGF-beta family Proteins 0.000 claims 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims 2
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 claims 2
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 claims 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 70
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 40
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 25
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 23
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 7
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract description 2
- LVXLCZPTUBQNHH-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-[[1-(carboxymethylamino)-3-(2-chloro-1,1,2-trifluoroethyl)sulfanyl-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(CSC(F)(F)C(F)Cl)C(=O)NCC(O)=O LVXLCZPTUBQNHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 108700008242 S-(2-chloro-1,1,2-trifluoroethyl)glutathione Proteins 0.000 abstract 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 84
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 80
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 57
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 56
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 50
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 49
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 49
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 45
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 38
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 38
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 36
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 36
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 33
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 26
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 26
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 26
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 25
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 25
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 25
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 24
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 20
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 19
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 15
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 15
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 15
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 15
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 14
- 101000574223 Homo sapiens Palmitoyl-protein thioesterase 1 Proteins 0.000 description 14
- 102100025824 Palmitoyl-protein thioesterase 1 Human genes 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 14
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 description 13
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 208000002158 Proliferative Vitreoretinopathy Diseases 0.000 description 12
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 12
- 101100219980 Rattus norvegicus Ccn2 gene Proteins 0.000 description 12
- 206010038934 Retinopathy proliferative Diseases 0.000 description 12
- 208000021971 neovascular inflammatory vitreoretinopathy Diseases 0.000 description 12
- 230000006785 proliferative vitreoretinopathy Effects 0.000 description 12
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 11
- 208000004608 Ureteral Obstruction Diseases 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 11
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 11
- -1 for example Proteins 0.000 description 11
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 11
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 11
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 10
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 10
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 10
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 10
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 10
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 10
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 10
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 10
- 201000002793 renal fibrosis Diseases 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 9
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 8
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 8
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 8
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 8
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 7
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 7
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 7
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 7
- 206010061989 glomerulosclerosis Diseases 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 7
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 7
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 7
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 238000013059 nephrectomy Methods 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 7
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 6
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 6
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 6
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 6
- 101100075829 Caenorhabditis elegans mab-3 gene Proteins 0.000 description 5
- 101100476210 Caenorhabditis elegans rnt-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 5
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 5
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 5
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 5
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 5
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 5
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 5
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 5
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960002240 iloprost Drugs 0.000 description 5
- HIFJCPQKFCZDDL-ACWOEMLNSA-N iloprost Chemical compound C1\C(=C/CCCC(O)=O)C[C@@H]2[C@@H](/C=C/[C@@H](O)C(C)CC#CC)[C@H](O)C[C@@H]21 HIFJCPQKFCZDDL-ACWOEMLNSA-N 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 5
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 5
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 5
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 5
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 210000003583 retinal pigment epithelium Anatomy 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 230000002784 sclerotic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 5
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 5
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 5
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 5
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 4
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 4
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 4
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 4
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 4
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 4
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 4
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 4
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 4
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 4
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 4
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 4
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 4
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 4
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 4
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 4
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 4
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 4
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 4
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 3
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 208000002260 Keloid Diseases 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 3
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 description 3
- 208000008558 Osteophyte Diseases 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 3
- 230000009787 cardiac fibrosis Effects 0.000 description 3
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 210000001117 keloid Anatomy 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 3
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 3
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 3
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- IADUEWIQBXOCDZ-VKHMYHEASA-N (S)-azetidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCN1 IADUEWIQBXOCDZ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 1-[1-[2-[[5-amino-2-[[1-[5-(diaminomethylideneamino)-2-[[1-[3-(1h-indol-3-yl)-2-[(5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbon Chemical compound C1CCC(C(=O)N2C(CCC2)C(O)=O)N1C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C1CCC(=O)N1 UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100024406 60S ribosomal protein L15 Human genes 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010000050 Abdominal adhesions Diseases 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 206010001580 Albuminuria Diseases 0.000 description 2
- 102000005862 Angiotensin II Human genes 0.000 description 2
- 101800000733 Angiotensin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 2
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100028728 Bone morphogenetic protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 108090000654 Bone morphogenetic protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 238000007809 Boyden Chamber assay Methods 0.000 description 2
- 101150042405 CCN1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010019668 Hepatic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- CZGUSIXMZVURDU-JZXHSEFVSA-N Ile(5)-angiotensin II Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=[NH2+])NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC([O-])=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 CZGUSIXMZVURDU-JZXHSEFVSA-N 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 2
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 2
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 102000004270 Peptidyl-Dipeptidase A Human genes 0.000 description 2
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 description 2
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 2
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000269319 Squalius cephalus Species 0.000 description 2
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 206010046996 Varicose vein Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 229950006323 angiotensin ii Drugs 0.000 description 2
- 230000003510 anti-fibrotic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000702 aorta abdominal Anatomy 0.000 description 2
- 229960004669 basiliximab Drugs 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 2
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960002806 daclizumab Drugs 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 2
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001123 epoprostenol Drugs 0.000 description 2
- KAQKFAOMNZTLHT-VVUHWYTRSA-N epoprostenol Chemical compound O1C(=CCCCC(O)=O)C[C@@H]2[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)[C@H](O)C[C@@H]21 KAQKFAOMNZTLHT-VVUHWYTRSA-N 0.000 description 2
- 238000010228 ex vivo assay Methods 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 2
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 2
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 201000010260 leiomyoma Diseases 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000001769 paralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxomolybdenum Chemical compound O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.OP(O)(O)=O DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 208000005069 pulmonary fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 2
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 2
- 229940115586 simulect Drugs 0.000 description 2
- 230000015590 smooth muscle cell migration Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 2
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 2
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 2
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 208000027185 varicose disease Diseases 0.000 description 2
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ITFICYZHWXDVMU-IPTZIORSSA-N (2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-amino-4-carboxybutanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ITFICYZHWXDVMU-IPTZIORSSA-N 0.000 description 1
- IADUEWIQBXOCDZ-UHFFFAOYSA-N (2S)-azetidine-2-carboxylic acid Natural products OC(=O)C1CCN1 IADUEWIQBXOCDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OCUSNPIJIZCRSZ-ZTZWCFDHSA-N (2s)-2-amino-3-methylbutanoic acid;(2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O.CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O OCUSNPIJIZCRSZ-ZTZWCFDHSA-N 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-KPBUCVLVSA-N (3'r,3as,4s,4'r,5'r,6r,6'r,7s,7as)-4-[(1r,2s,3r,5s,6r)-3-amino-2,6-dihydroxy-5-(methylamino)cyclohexyl]oxy-6'-[(1s)-1-amino-2-hydroxyethyl]-6-(hydroxymethyl)spiro[4,6,7,7a-tetrahydro-3ah-[1,3]dioxolo[4,5-c]pyran-2,2'-oxane]-3',4',5',7-tetrol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2OC3([C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@@H](N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-KPBUCVLVSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 2,4-Hexadienoic acid, potassium salt (1:1), (2E,4E)- Chemical compound [K+].CC=CC=CC([O-])=O CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZBHSAYWIYAVUOP-UHFFFAOYSA-N 2-(benzylamino)-1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]ethanol Chemical compound C=1C=CC(C(F)(F)F)=CC=1C(O)CNCC1=CC=CC=C1 ZBHSAYWIYAVUOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- SPBKEYGNLBGTTJ-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-7-nitro-1-benzofuran Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(Cl)C2=C1OC=C2 SPBKEYGNLBGTTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-L 4-nitrophenyl phosphate(2-) Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 1
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 201000000153 Angiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 208000031873 Animal Disease Models Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 208000037157 Azotemia Diseases 0.000 description 1
- 108010081589 Becaplermin Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101000800130 Bos taurus Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 102000039854 CCN family Human genes 0.000 description 1
- 108091068251 CCN family Proteins 0.000 description 1
- 102100031171 CCN family member 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150036984 CCN3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100025175 Cellular communication network factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 101710118748 Cellular communication network factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 108010019961 Cysteine-Rich Protein 61 Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000003066 Diffuse Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000002045 Endothelin Human genes 0.000 description 1
- 108050009340 Endothelin Proteins 0.000 description 1
- 206010071309 Epidural fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000001351 Epiretinal Membrane Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 1
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Polymers OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090293 Growth Differentiation Factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100035364 Growth/differentiation factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101500025614 Homo sapiens Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101500025624 Homo sapiens Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 102100026818 Inhibin beta E chain Human genes 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 108010041014 Integrin alpha5 Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010023421 Kidney fibrosis Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000003088 Limited Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 208000024140 Limited cutaneous systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101000777548 Mus musculus CCN family member 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010062575 Muscle contracture Diseases 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000031074 Reinjury Diseases 0.000 description 1
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 1
- 206010038468 Renal hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 1
- 206010062104 Renal mass Diseases 0.000 description 1
- 206010038848 Retinal detachment Diseases 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010050207 Skin fibrosis Diseases 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035896 Twin-reversed arterial perfusion sequence Diseases 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000446 abciximab Drugs 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 1
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K aluminium tristearate Chemical compound [Al+3].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940063655 aluminum stearate Drugs 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 208000020716 angioleiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002333 angiotensin II receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940125364 angiotensin receptor blocker Drugs 0.000 description 1
- 229940044094 angiotensin-converting-enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000011558 animal model by disease Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 230000009831 antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N azocan-1-yl-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)N2CCCCCCC2)=C1 WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000007917 background diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004045 bowman membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 101150049735 clsA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000014581 connective tissue growth factor production Effects 0.000 description 1
- 208000006111 contracture Diseases 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002826 coolant Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000005786 degenerative changes Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000000188 diaphragm Anatomy 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GXGAKHNRMVGRPK-UHFFFAOYSA-N dimagnesium;dioxido-bis[[oxido(oxo)silyl]oxy]silane Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[O-][Si](=O)O[Si]([O-])([O-])O[Si]([O-])=O GXGAKHNRMVGRPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 208000028208 end stage renal disease Diseases 0.000 description 1
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 description 1
- ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N endothelin-1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]2CSSC[C@@H](C(N[C@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2)=O)NC(=O)[C@@H](CO)NC(=O)[C@H](N)CSSC1)C1=CNC=N1 ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical group NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000011124 ex vivo culture Methods 0.000 description 1
- 238000004299 exfoliation Methods 0.000 description 1
- 201000010934 exostosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000000893 fibroproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005995 glycated hemoglobin Proteins 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000037313 granulation tissue formation Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007919 intrasynovial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000008627 kidney hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 108010037248 lantibiotic Pep5 Proteins 0.000 description 1
- SRCAXTIBNLIRHU-JJKPAIEPSA-N lantibiotic pep5 Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N\C(=C/C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N\C(=C/C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N\C(=C(/C)S)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=O)CC SRCAXTIBNLIRHU-JJKPAIEPSA-N 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 102000005861 leptin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010019813 leptin receptors Proteins 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical class [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 208000018769 loss of vision Diseases 0.000 description 1
- 231100000864 loss of vision Toxicity 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000391 magnesium silicate Substances 0.000 description 1
- 229940099273 magnesium trisilicate Drugs 0.000 description 1
- 229910000386 magnesium trisilicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019793 magnesium trisilicate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- DFTAZNAEBRBBKP-UHFFFAOYSA-N methyl 4-sulfanylbutanimidate Chemical compound COC(=N)CCCS DFTAZNAEBRBBKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229940054441 o-phthalaldehyde Drugs 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000010363 phase shift Effects 0.000 description 1
- RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N phenanthrene-3,4-diol Chemical compound C1=CC=C2C3=C(O)C(O)=CC=C3C=CC2=C1 RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920002503 polyoxyethylene-polyoxypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 235000010241 potassium sorbate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004302 potassium sorbate Substances 0.000 description 1
- 229940069338 potassium sorbate Drugs 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010034596 procollagen Type III-N-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 201000007914 proliferative diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127293 prostanoid Drugs 0.000 description 1
- 150000003814 prostanoids Chemical class 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 229940107685 reopro Drugs 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000004264 retinal detachment Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000036573 scar formation Effects 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 238000013390 scatchard method Methods 0.000 description 1
- 210000003786 sclera Anatomy 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000012488 skeletal system development Effects 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- HSFQBFMEWSTNOW-UHFFFAOYSA-N sodium;carbanide Chemical group [CH3-].[Na+] HSFQBFMEWSTNOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000006190 sub-lingual tablet Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 230000008354 tissue degradation Effects 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 229960001479 tosylchloramide sodium Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 208000009852 uremia Diseases 0.000 description 1
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 1
- 238000002562 urinalysis Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000005353 urine analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006496 vascular abnormality Effects 0.000 description 1
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/35—Valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/54—F(ab')2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
Abstract
Изобретение относится к антителам, которые связываются с CTGF. Антитела, в частности, направлены на области CTGF, участвующие в различных видах биологической активности, связанной с фиброзом. Изобретение также относится к способам применения антител в составе фармацевтических композиций для лечения расстройств, связанных с CTGF, включая локализованные и системные фибротические расстройства, в том числе расстройства легких, печени, сердца, кожи и почек, для осуществления способа нейтрализации биологической активности CTGF и способа лечения или профилактики заболеваний, связанных с CTGF. Изобретение охватывает полинуклеотидную последовательность и ее варианты, кодирующую указанное антитело, а также клетку-хозяин и клеточную линию №РТА-6006 (АТСС), продуцирующие указанное антитело. Использование изобретения обеспечит новыми специфическими средствами - антителами, которые эффективно нейтрализуют конкретные виды активности CTGF при патологии и обеспечивают специфичность и фармакинетический профиль, подходящий для терапевтического средства. 12 н. и 69 з.п. ф-лы, 12 ил., 4 табл.
Description
Эта заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 60/475598, поданной 4 июня 2003 г., приведенной здесь в качестве ссылки в полном объеме.
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с фактором роста соединительной ткани (CTGF). Эти антитела в частности направлены на области CTGF, вовлеченные в биологическую активность, связанную с различными заболеваниями.
Предпосылки изобретения
Фактор роста соединительной ткани (CTGF)
CTGF представляет собой богатый цистеином связывающий гепарин, секретируемый гликопротеид с молекулярной массой 36 кДа, первоначально выделенный из культуральной среды эндотелиальных клеток пупочной вены человека (см. например, Bradham et al. (1991) J Cell Biol 114:1285-1294; Grotendorst and Bradham, патент США № 5408040). CTGF относится к семейству белков CCN (CTGF, Cyr61, Nov) (секретируемых гликопротеидов), к которому относится индуцируемый сывороткой ранний генный продукт Cyr61, предполагаемый онкоген Nov, связанный с ECM белок FISP-12, src-индуцибельный ген CEF-10, Wnt-индуцибельный секретируемый белок WISP-3 и антипролиферативный белок HICP/rCOP (Brigstock (1999) Endocr. Rev. 20: 189-206; O'Brian et al. (1990) Mol. Cell Biol., 10: 3569-3577; Joliot et al. (1992) Mol Cell Biol., 12: 10-21; Ryseck et al. (1990) Cell Growth and Diff., 2: 225-233; Simmons et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1178-1182; Pennica et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 14717-14722; и Zhang et al. (1998) Mol. Cell Biol., 18: 6131-61416). Белки CCN отличаются тем, что у них консервативны 38 цистеиновых остатков, которые составляют более 10% общего содержания аминокислот и обеспечивают возникновение модулярной структуры с N- и C-концевыми доменами. Модулярная структура CTGF включает консервативные мотивы для белка, связывающего подобный инсулину фактор роста (IGF-BP), и фактора фон Виллебранда (VWC) в N-концевом домене и тромбоспондин (TSP1) и мотив цистеинового узла в С-концевом домене.
Экспрессия CTGF индуцируется членами суперсемейства трансформирующего фактора роста бета (TGFβ), которое включает TGFβ-1, -2 и -3, костный морфогенетический белок (ВМР)-2 и активин, а также различными другими регуляторными модуляторами, включая дексаметазон, тромбин, сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и ангиотензин II; и стимулами окружающей среды, включая гипергликемию и гипертонию (см. например, Franklin (1997) Int. J. Biochem. Cell Biol., 29: 79-89; Wunderlich (2000) Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol, 238: 910-915; Denton and Abraham (2001) Curr. Opin. Rheumatol, 13: 505-511 и Riewald (2001) Blood, 97: 3109-3116; Riser et al. (2000) J. Am. Soc. Nephrol, 11: 25-38 и международную публикацию WO 00/13706). Стимуляция экспрессии CTGF под действием TGFβ является быстрой и длительной и не требует продолжительного применения (Igarashi et al. (1993) Mol. Biol. Cell, 4:637-645). Усиленная экспрессия CTGF TGFβ включает транскрипционную активацию посредством регуляторных элементов ДНК, присутствующих в промотере CTGF (Grotendorst et al. (1996) Cell Growth Differ, 7: 469-480; Grotendorst and Bradham, патент США №6069006; Holmes et al. (2001) J. Biol. Chem., 276: 10594-10601).
Было показано, что CTGF увеличивает стационарную транскрипцию коллагена α1 (I), интегрина α5 и мРНК фибронектина, а также промотирует клеточные процессы, включая пролиферацию и хемотаксис различных типов клеток в культуре (см. например, Frazier et al. (1996) J. Invest. Dermatol., 107: 406-411; Shi-wen et al. (2000) Exp. Cell Res., 259: 213-224; Klagsburn (1997) Exp. Cell Res., 105: 99-108; Gupta et al. (2000) J. Kidney Int., 58: 1389-1399; Wahab et al. (2001) Biochem. J., 359 (Pt 1): 77-87; Uzel et al (2001) J. Periodontol., 72: 921-931 и Riser and Cortes (2001) Ren. Fail., 23: 459-470). Подкожная инъекция CTGF новорожденным мышам приводит к местному отложению грануляционной ткани. Аналогичным образом подкожная инъекция TGFβ генерирует формирование грануляционной ткани и вызывает высокие уровни мРНК CTGF в местных фибробластах. Более того, комбинированное или последовательное лечение TGFβ и CTGF приводит к развитию более стойкой гранулемы (Mori et al. (1999) J. Cell Physiol., 181: 153-159). Таким образом, представляется, что CTGF опосредует подгруппу эффектов, вызываемых TGFβ, в частности, продукцию и отложение внеклеточного матрикса (ЕСМ). Кроме того, способность реагировать на CTGF или степень реакции на CTGF может зависеть от стимула примирования, обеспечиваемого обработкой TGFβ, что обеспечивает возможность клеточной "компетентности" (Международная публикация WO 96/08140).
Хотя было охарактеризовано множество взаимодействующих факторов, которые модулируют тканевую организацию, в настоящее время появляется согласие в отношении роли CTGF в регуляции развития скелета, заживлении ран и перестройке внеклеточного матрикса (ЕСМ), фиброзе, развитии опухолей и ангиогенезе. Например, повышенная экспрессия CTGF наблюдалась в печени при циррозе, при пневмосклерозе, воспалительных кишечных заболеваниях, в склеротической коже и келоидах, при десмоплазии и атеросклеротических бляшках (Abraham et al. (2000) J. Biol. Chem., 275: 15220-15225; Dammeier et al. (1998) Ind. J. Biochem. Cell Biol., 30: 909-922; diMola et al. (1999) Ann. Surg. 230(1): 63-71; Igarashi et al. (1996) J. Invest. Dermatol., 106: 729-733; Ito et al. (1998) Kedney Int., 53: 853-861; Williams et al. (2000) J. Hepatol., 32: 754-761; Clarkson et al (1999) Curr. Opin. Nephrol. Hypertens, 8: 543-548; Hinton et al. (2002) Eye, 16: 422-428; Gupta et al. (2000) Kidney Int., 58: 1389-1399; Riser et al. (2000) J. Am. Soc. Nephrol., 11: 25-38).
Стимулирующая регуляция CTGF также происходит при гломерулонефрите, нефропатии, вызванной IgA, очаговом и сегментарном гломерулосклерозе и диабетической нефропатии (см. например, Riser et al. (2000) J. Am. Soc. Nephrol., 11: 25-38). Увеличение количества клеток, экспрессирующих CTGF, также наблюдается в участках хронического канальцево-интерстициального повреждения, и уровни CTGF коррелируют со степенью повреждения (Ito et al. (1998) Kidney Int., 53: 853-861). Кроме того, экспрессия CTGF увеличивается в клубочках и интерстиции канальцев при различных почечных заболеваниях в связи с рубцеванием и склерозом почечной паренхимы. Повышенные уровни CTGF также связаны с фиброзом печени, инфарктом миокарда и пневмосклерозом. Например, у пациентов с идиопатическим пневмосклерозом (IPF) наблюдается сильная стимулирующая регуляция CTGF в биопсиях и клетках жидкости бронхоальвеолярного лаважа (Ujike et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun., 277: 448-454; Abou-Shady et al. (2000) Liver, 20: 296-304; Williams et al. (2000) J. Hepatol., 32: 754-761; Ohnishi et al. (1998) J. Mol. Cell Cardiol., 30: 2411-22; Lasky et al. (1998) Am. J. Physiol., 275: L365-371; Pan et al. (2001) Eur. Respir. J., 17: 1220-1227 и Allen et al. (1999) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 21: 693-700). Таким образом, CTGF является обоснованной мишенью при лечении расстройств, таких как описанные выше.
Была установлена связь CTGF с различными аспектами этих расстройств, и были описаны способы лечения расстройств посредством модуляции CTGF (см. например, Grotendorst and Bradham, патент США № 5783187; Международная публикация № WO 00/13706; и Международная публикация № WO 03/049773). Модуляцию факторов роста, цитокинов и рецепторов клеточной поверхности можно осуществить, используя моноклональные антитела, и несколько терапевтических антител были разрешены к применению или находятся в процессе разработки (см. например, Infliximab (Remicade; Maini et al. (1998) Arthritis Rheum., 41: 1552-1563; Targan et al. (1997) N. Engl. J. Med., 337: 1029-1035); Basiliximab (Simulect) and Daclizumab (Zenapax) (Bumgardner et al. (2001) Transplantation, 72: 839-845; Kovarik et al. (1999) Transplantation, 68: 1288-1294); и Transtuzumab (Herceptin; Baselga (2001) Ann. Oncol., 12 Suppl. 1: S49-55)).
Были генерированы антитела против CTGF, и они оказались эффективными in vivo, например, ингибируя ангиогенез (см. например, Grotendorst and Bradham, патент США № 5408040; международная публикация WO 99/07407 и Shimo et al. (2001) Oncology 61:315-322). Кроме того, оказалось, что модулярная природа CTGF различает домены, участвующие в специфических видах биологической активности. Например, было показано, что N-концевая половина CTGF стимулирует клеточную дифференциацию и продукцию ЕСМ, тогда как С-концевая половина стимулирует клеточную пролиферацию (см. например, Международные публикации WO 00/35936 и WO 00/35939; Brigstock and Harding, патент США № 587670). Это демонстрирует, что антитела, направленные на различные области молекулы CTGF, проявляют различные эффекты в отношении модулирования видов биологической активности CTGF (см. например, Международные публикации WO 00/35936 и WO 00/35939). К настоящему времени не было установлено четкого различия между антителами против CTGF, которые продуцируют желательный эффект, и антителами, которые или продуцируют множественные эффекты, или являются ненейтрализующими (см. например, Международную публикацию WO 99/33878).
Существует явная необходимость в данной области в средствах, которые эффективно нейтрализуют активность CTGF при патологии. Антитела, в частности моноклональные антитела, обеспечивают специфичность и фармакокинетический профиль, подходящий для терапевтического средства, и нейтрализующие антитела, нацеленные на конкретные виды активности CTGF, удовлетворили бы потребность в данной области и могли бы найти применение в терапевтическом лечении связанных с CTGF расстройств, включая легочные расстройства, такие как идиопатический пневмосклероз (IPF) и т.д.; почечные расстройства, такие как диабетическая нефропатия, гломерулосклероз и т.д.; и глазные расстройства, такие как ретинопатия, дегенерация желтого пятна и т.д.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам, в частности к моноклональным антителам, и их частям, которые специфически связываются с областью на N-концевом фрагменте полипептида CTGF.
В одном из аспектов антитело по изобретению специфически связывается с областью человеческого CTGF (SEQ ID NO:2), что соответствует аминокислотам от примерно 103 до примерно 164 (SEQ ID NO:21); более конкретно, от аминокислоты примерно 135 до примерно аминокислоты 157 (SEQ ID NO:22) и, еще более конкретно, от примерно аминокислоты 142 до примерно аминокислоты 154 (SEQ ID NO:25); или ортологичной областью CTGF, полученного от другого вида. В определенных вариантах осуществления изобретения антитело имеет такую же специфичность, что и антитело, продуцируемое клеточной линией, обозначенной номером доступа в АТСС (Американской коллекции типовых культур) РТА-6006 (депонирована в АТСС 20 мая 2004 г.). В определенных вариантах осуществления изобретения антитело по существу идентично mAb1, как описано ниже. Предпочтительнее антитело по существу аналогично CLN1, как описано ниже. В еще одном варианте осуществления антитело по изобретению конкурентно связывается с любым из указанных выше антител к полипептиду CTGF.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его части, содержащим по меньшей мере один член группы, состоящей из последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина, включающей SEQ ID NO:14, последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина, включающей вариабельный домен SEQ ID NO:14, последовательности легкой цепи иммуноглобулина, включающей SEQ ID NO:20, последовательности легкой цепи иммуноглобулина, включающей вариабельный домен SEQ ID NO:20, или их консервативных вариантов. В определенном варианте осуществления антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 167 SEQ ID NO:14. В другом определенном варианте осуществления антитело содержит вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 136 SEQ ID NO:20. В конкретном варианте осуществления антитело содержит последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO:14 и последовательность легкой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO:20. В пределах этого варианта осуществления настоящее изобретение, в частности, относится к антителу CLN1 или его части, содержащей по меньшей мере остатки связывающей антиген области CLN1.
В определенных аспектах антитело по изобретению представляет собой поликлональное антитело. В других аспектах антитело представляет собой моноклональное антитело. В определенных вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, более предпочтительно человеческое моноклональное антитело. Любое из указанных выше антител может дополнительно иметь различную степень гликозилирования, что осуществляется клеткой, продуцирующей антитело, или применяется и/или модифицируется синтетически; или антитело может быть лишено гликозилирования. Антитело может быть необязательно пегилировано и/или модифицировано аналогичным образом для увеличения периода полувыведения из плазмы и т.д. В различных вариантах осуществления изобретение относится к фрагментам антитела, особенно когда фрагмент представляет собой фрагмент Fab, F(ab)2 или Fv.
В определенных аспектах антитело или его часть продуцируется клонированной клеточной линией. Клеточная линия может быть получена из любой модели на животных, используемой для продукции моноклонального антитела, включая, но не ограничиваясь этим, мышей, коз, кур и т.д. В частности клеточная линия может быть получена у мышей. Мыши могут являться стандартными мышами, используемыми для продукции антител, например, BALB/C, или модифицированной, например, трансгенной мышиной линии, оптимизированной или разработанной для продукции специфического изотипа, идиотипа или видоспецифических моноклональных антител. В одном варианте осуществления изобретения клеточная линия является линией клеток гибридомы, которая продуцирует и секретирует mAb1. В других вариантах осуществления линия клеток продуцирует и секретирует антитело или его часть, которые имеют свойство, по существу эквивалентное mAb1. В еще одних вариантах осуществления линия клеток продуцирует и секретирует антитело или его часть, которые имеют свойство, по существу эквивалентное CLN1. В конкретном варианте осуществления изобретение относится к линии клеток, обозначенной номером доступа в АТСС РТА-6006 (депонирована 20 мая 2004 г.).
В соответствии с другим аспектом изобретения антитело или его часть получены у трансгенного животного, отличного от человека, в частности трансгенного млекопитающего, отличного от человека, способного продуцировать человеческое антитело. Животное может быть любого вида, включая, но не ограничиваясь этим, мышь, курицу, корову, козу и т.д. В частности животное может представлять собой мышь. Такие антитела могут быть получены иммунизацией трансгенного млекопитающего, отличного от человека, фрагментом человеческого CTGF, например, SEQ ID NO:21 или, более конкретно, SEQ ID NO:22, или к ортологичной области CTGF, полученного от видов, отличных от человека. В определенных вариантах осуществления изобретения антитела получают иммунизацией трансгенного млекопитающего, отличного от человека, фрагментом CTGF, выбранным из группы, состоящей из последовательностей с SEQ ID NO:23 по SEQ ID NO:26, или к ортологичной области CTGF, полученного от видов, отличных от человека. В определенных вариантах осуществления антитела получены иммунизацией трансгенной мыши любым из указанных выше фрагментов. В других вариантах осуществления антитела получены иммунизацией трансгенной мыши функциональными эквивалентами любого из указанных выше фрагментов CTGF.
Термин "специфически связывается с областью CTGF" подразумевает, что антитела имеют специфичность связывания к определенной области CTGF, которая может быть определена первичной аминокислотной последовательностью или третичной, т.е. трехмерной, конформацией части полипептида CTGF. Специфичность связывания означает, что аффинность антител к части CTGF по существу больше, чем их аффинность к другим родственным полипептидам. Под термином "по существу большей аффинностью" заявители подразумевают, что имеется измеримое увеличение аффинности к части CTGF по сравнению с аффинностью к другим родственным полипептидам. Предпочтительно аффинность по меньшей мере в 1,5 раз, 2 раза, 5 раз, 10 раз, 100 раз, 103 раз, 104 раз, 105 раз, 106 раз больше к определенной части CTGF, чем к другим белкам. Предпочтительно специфичность связывания определяется с помощью аффинной хроматографии, иммунопреципитации или анализа связывания in vitro, такого как радиоиммуноанализ (RIA) или иммуноферментный анализ (ELISA), или анализ сортировки клеток с активацией флуоресценции (FASC). Более предпочтительно специфичность связывания определяется с помощью RIA или аффинной хроматографии, как описано ниже.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антитела имеют аффинность, которая равна или больше, чем аффинность mAb1, описанная ниже, как определено, например, анализом Скэтчарда Munson and Pollard (1980, Anal Biochem 107:220). Аффинность антитела определяется как сила всех нековалентных взаимодействий между одним антигенсвязывающим сайтом антитела и одним эпитопом антигена. Аффинность рассчитывается путем измерения константы ассоциации (Ka), так что
где [Ab] представляет собой концентрацию свободного антигенсвязывающего сайта антитела, [Ag] представляет собой концентрацию свободного антигена, [Ab·Ag] представляет собой концентрацию антигенсвязывающего сайта антитела, занятого антигеном, и Kd представляет собой константу диссоциации комплекса антитело-антиген. Предпочтительно антитела по изобретению имеют аффинность к CTGF, которая больше чем Kd=10-8, предпочтительно больше чем 10-9, предпочтительно больше чем 10-10, особенно для терапевтического применения. Преимущественно антитело в соответствии с изобретением имеет аффинность, аналогичную или большую, чем аффинность mAb1 (то есть Kd-9). Однако антитела, разделяющие эпитоп, связывающийся с mAb1, но имеющие более низкую аффинность (т.е. более высокое значение Kd), чем mAb1, также входят в объем изобретения и могут потенциально использоваться в различных анализах и диагностических видах применения, как описано в настоящем описании. Такие антитела могут дополнительно использоваться в терапевтических видах применения, особенно если они обладают высокой авидностью к антигену, как описано ниже.
Антитела в соответствии с изобретением могут быть одновалентными, двухвалентными или они могут быть многовалентными. В определенных вариантах осуществления изобретения предпочтительно, чтобы антитела по изобретению были двухвалентными или многовалентными. Любыми антителами по изобретению можно манипулировать для улучшения авидности, например, объединением связывающих эпитоп сайтов в один конструкт антитела, например, тритело, и т.д. Антитела в соответствии с изобретением могут представлять собой одноцепочечные антитела.
В некоторых случаях может быть полезно, чтобы антитела по изобретению проявляли подходящую аффинность к CTGF от других видов, например, для лечения и предотвращения расстройств у этих видов. Например, антитело по изобретению, которое проявляет подходящий Kd к собачьему CTGF, можно использовать для лечения связанного с CTGF расстройства у собак. Антитела по изобретению, которые проявляют перекрестно-видовую аффинность, такие как mAb1, также можно использовать в качестве инструментов исследования для изучения связанных с CTGF расстройств на различных моделях у животных. В другом аспекте антитело или его часть кодируется генетическим материалом, первоначально полученным у человека. Антитело может быть генерировано клетками в культуре, например, с использованием техники фагового дисплея, или оно может продуцироваться у животного, например, трансгенного животного, отличного от человека, содержащего гены иммуноглобулина, полученные у человека.
Кроме того, изобретение относится к рекомбинантным конструктам, содержащим части любых антител по изобретению, как описано выше, и белок, полученный из другого источника. Конкретно предусмотрены варианты осуществления, охватывающие химерные антитела, содержащие вариабельную область, полученную из моноклонального антитела, которое специфически связывается с областью на N-концевом фрагменте CTGF, и константную область, полученную из другого источника. Вариабельная область может быть получена из любого антитела, определенного изобретением, и, в частности, охватываются антитела, которые связываются с областью человеческого CTGF от примерно аминокислоты 97 до примерно аминокислоты 180 SEQ ID NO:2, или, более конкретно, от примерно аминокислоты 103 до примерно аминокислоты 164 SEQ ID NO:2, или, более конкретно, от примерно аминокислоты 134 до примерно аминокислоты 158 SEQ ID NO:2, или, еще более конкретно, от примерно аминокислоты 143 до примерно аминокислоты 154 SEQ ID NO:2, или к ортологичной области CTGF, полученного от другого вида. Константная область может быть получена из любого источника. В некоторых вариантах осуществления константную область получают из константной области человеческого иммуноглобулина.
Настоящее изобретение также относится к любому из описанных выше антител, где антитело дополнительно включает метку, способную обеспечить выявляемый сигнал, одно или вместе с другими веществами. Такие средства, осуществляющие мечение, могут быть выбраны из группы, состоящей из фермента, флуоресцентного вещества, хемилюминесцентого вещества, биотина, авидина и радиоактивного изотопа, но не ограничиваются ими. Настоящее изобретение также относится к любому из описанных выше антител, где антитело дополнительно включает цитотоксическое средство или фермент.
В других вариантах осуществления изобретения описанные выше антитела по изобретению дополнительно нейтрализуют по меньшей мере одну активность, связанную с CTGF. Такие виды активности, связанные с CTGF, включают, но не ограничиваются этим, стимуляцию клеточной миграции, продукцию внеклеточного матрикса клеткой in vivo или ex vivo и/или уменьшение фиброза у индивидуума. В конкретных вариантах осуществления биологическая активность выбрана из группы, состоящей из клеточного роста, дифференциации фибробластов и/или эндотелиальных клеток и индукции экспрессии белков, участвующих в формировании и перестройке внеклеточного матрикса, включая, например, коллагены, включающие, но не ограничивающиеся ими, типы I, II, III и IV, и фибронектин.
В определенных вариантах осуществления изобретения антитела специфически ингибируют миграцию клеток в анализах ex vivo. Предпочтительно антитела ингибируют стимулированную CTGF миграцию гладкомышечных клеток в анализе в камере Boyden. Например, в анализе миграции клеток, описанном ниже, антитела по изобретению повторно и воспроизводимо ингибируют вызванную CTGF миграцию. В различных вариантах осуществления антитела специфически уменьшают фиброз в случае моделей на животных. Предпочтительно антитела ингибируют развитие в случае моделей на животных пневмосклероза и фиброза почек. Например, антитела ослабляют вызванный блеомицином пневмосклероз у мышей на 60-70%, как было определено путем ингибирования легочного накопления гидроксипролина (коллагена) и/или гистологического исследования препаратов ткани, описанных ниже. Кроме того, антитела уменьшают накопление коллагена в случае модели остатка почки крысы (т.е. после нефрэктомии на 5/6) и у мышей после односторонней обструкции мочеточника (UUO), как описано ниже.
В других вариантах осуществления антитела по изобретению модулируют взаимодействие между полипептидом CTGF и секретируемым или ассоциированным с мембраной кофактором, нейтрализуя посредством этого биологическую активность CTGF. Кофактор может представлять собой любой белок, углеводород и/или липид; в определенных вариантах осуществления кофактором является член семейства ростовых факторов TGF-β, ВМР-4 и т.д.
В другом аспекте антитело уменьшает фиброз у субстанции. В различных вариантах осуществления субстанция представляет собой ткань или орган. В другом варианте осуществления субстанцией является животное, предпочтительно млекопитающее, наиболее предпочтительно человек. Когда субстанция представляет собой ткань, изобретение, в частности, предусматривает как эндогенные ткани, так и ткани ex vivo, например ткани трансплантата, ткань, выращенную в культуре и т.д. В различных вариантах осуществления ткань выбрана из группы, состоящей из эпителиальной, эндотелиальной и соединительной ткани. Когда субстанция представляет собой орган, изобретение, в частности, предусматривает органы, выбранные из группы, включающей почку, легкое, печень, глаз, сердце и кожу. В предпочтительных вариантах осуществления субстанцией является животное, в частности животное вида млекопитающих, включая вид крыс, кроликов, коров, овец, свиней, мышей, лошадей и приматов. В самом предпочтительном варианте осуществления субстанцией является человек.
В определенных вариантах осуществления изобретения антитело используется для лечения или профилактики связанного с CTGF расстройства у субъекта, у которого есть связанное с CTGF расстройство или риск его развития. Такие расстройства включают, но не ограничиваются этим, различные виды рака, включая острый лимфобластический лейкоз, дерматофибромы, рак молочной железы, глиому и глиобластому, рабдомиосаркому и фибросаркому, десмоплазию, ангиолипому, ангиолейомиому, десмопластические формы рака и рост и метастазы рака предстательной железы, яичников, толстой и прямой кишки, поджелудочной железы, желудочно-кишечного тракта и печени и других опухолей. Связанные с CTGF расстройства также включают различные фибротические расстройства, включая, но не ограничиваясь этим, идиопатический пневмосклероз, фиброз почек, гломерулосклероз, глазной фиброз, остеоартрит, склеродермию, сердечный фиброз и фиброз печени. Фиброз может возникнуть в любом органе или ткани, включая орган, выбранный из почки, легкого, печени, сердца и кожи, но не ограничиваясь ими; или в ткани, выбранной из эпителиальной, эндотелиальной и соединительной ткани, но не ограничиваясь ими. В других вариантах осуществления связанное с CTGF расстройство может быть вызвано любым инициирующим фактором, включая, но не ограничиваясь этим, контакт с химическими веществами или биологическими агентами, воспалительную реакцию, аутоиммунную реакцию, травму, хирургические процедуры и т.д. Связанные с CTGF расстройства также включают, но не ограничиваются этим, расстройства вследствие гипергликемии и гипертонии. Такие расстройства могут возникнуть, например, вследствие сахарного диабета, ожирения и т.д., и включают диабетическую нефропатию, ретинопатию и сердечно-сосудистые заболевания.
Поэтому в различных вариантах осуществления изобретение относится к антителам, которые могут использоваться для лечения или профилактики связанных с CTGF расстройств у индивидуума. Настоящее изобретение также относится к применению таких антител при изготовлении лекарственного средства для лечения связанных с CTGF расстройств.
В другом аспекте изобретение относится к способу нейтрализации активности, связанной с CTGF, включающему контактирование антитела по изобретению и полипептида CTGF, нейтрализуя посредством этого биологическую активность CTGF, такую как виды активности, описанные выше. Биологическая активность может представлять собой любую активность CTGF, включая, но не ограничиваясь этим, стимуляцию миграции клеток и продукцию внеклеточного матрикса. В различных вариантах осуществления нейтрализация происходит in vitro. В других вариантах осуществления нейтрализация происходит у индивидуума in vivo.
В еще одном аспекте изобретение относится к способам применения антитела, как описано выше, для лечения связанного с CTGF расстройства у нуждающегося в нем пациента, где способ включает введение антитела или его фармацевтической композиции пациенту, осуществляя посредством этого лечение расстройства. Индивидуум может представлять собой пациента с диагностированным или предполагаемым связанным с CTGF расстройством, включая, например, расстройство, возникающее в результате избыточной продукции внеклеточного матрикса. В определенных аспектах связанное с CTGF расстройство выбрано из рака или фибротического расстройства. Виды рака включают, но не ограничиваются этим, острый лимфобластический лейкоз, дерматофибромы, рак молочной железы, карциному молочной железы, глиому и глиобластому, рабдомиосаркому и фибросаркому, десмоплазию, ангиолипому, ангиолейомиому, десмопластические формы рака и рак предстательной железы, яичников, толстой и прямой кишки, поджелудочной железы, желудочно-кишечного тракта и печени, и фибротические расстройства включают, но не ограничиваются этим, идиопатический пневмосклероз, фиброз почек, гломерулосклероз, глазной фиброз, дегенерацию желтого пятна, остеоартрит, склеродермию, хроническую сердечную недостаточность, сердечный фиброз и фиброз печени. В других вариантах осуществления связанное с CTGF расстройство может быть вызвано любым инициирующим фактором, включая, но не ограничиваясь этим, контакт с химическими веществами или биологическими агентами, воспалительную реакцию, аутоиммунную реакцию, травму, хирургические процедуры и т.д. Связанные с CTGF расстройства также включают, но не ограничиваются этим, расстройства вследствие гипергликемии и гипертонии. Такие расстройства могут возникнуть, например, вследствие сахарного диабета, ожирения и т.д., и включают диабетическую нефропатию, ретинопатию и сердечно-сосудистые заболевания.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей антитело, как описано выше, и по меньшей мере один другой компонент. Компоненты могут включать любое соединение, молекулу или вещество, включая, например, белки, нуклеиновые кислоты, углеводороды, липиды и т.д. Кроме того, компоненты могут включать различные растворители, соли и другие носители и/или эксципиенты. В некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую антитело, как описано выше, и по меньшей мере один дополнительный компонент, выбранный из растворителя, стабилизатора или эксципиента. В определенном варианте осуществления фармацевтическая композиция включает антитело в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать второе терапевтическое средство, например ингибитор ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ), средство для расщепления или ингибирования конечного продукта гликирования и т.д. Изобретение, кроме того, относится к лекарственным средствам, содержащим антитело, как определено выше, для лечения индивидуума, имеющего связанное с CTGF расстройство. Такие расстройства включают, но не ограничиваются этим, различные формы рака и фибротические расстройства; расстройства, возникающие в результате таких состояний, как инфаркт миокарда, артрит и воспаление; и расстройства вследствие сахарного диабета, ожирения и им подобных, которые могут включать диабетическую нефропатию, ретинопатию и сердечно-сосудистые заболевания.
В другом варианте осуществления изобретение относится к полипептидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:14, аминокислот 1-167 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:20, и аминокислот 1-136 SEQ ID NO:20. Изобретение также охватывает консервативные варианты полипептидов. В другом варианте осуществления изобретение относится к специфическим фрагментам CTGF человека, выбранным из группы, состоящей из последовательностей от SEQ ID NO:21 до SEQ ID NO:26, и ортологичным фрагментам CTGF, полученным от видов, отличных от человека.
Указанные выше полипептиды могут представлять собой "измененные" полипептиды, как определено ниже.
В другом варианте осуществления изобретение относится к полинуклеотидной последовательности, кодирующей антитело по изобретению, или его часть. В определенных вариантах осуществления изобретения полинуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из полинуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO:14, полинуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислоты 1-167 SEQ ID NO:14, полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO:13, и полинуклеотида, включающего нуклеотиды 1-501 SEQ ID NO:13. В другом варианте осуществления полинуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из полинуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO:20, полинуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислоты 1-136 SEQ ID NO:20, полинуклеотида SEQ ID NO:19, и полинуклеотида, включающего нуклеотиды 1-408 SEQ ID NO:19.
Указанные выше полинуклеотиды могут представлять собой "измененные" полинуклеотиды, как определено ниже.
Изобретение, кроме того, относится к рекомбинантным полинуклеотидам, содержащим любую из полинуклеотидных последовательностей, описанных выше, операбельно связанных с последовательностью вектора, которая содержит последовательности регулировки репликации и траскрипции. В одном из аспектов рекомбинантный полинуклеотид кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14 или вариабельный домен в ней. В другом аспекте рекомбинантный полинуклеотид включает SEQ ID NO:13. В еще одном аспекте рекомбинантный полинуклеотид кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20 или вариабельный домен в ней. В еще одном аспекте рекомбинантный полинуклеотид включает SEQ ID NO:19.
Изобретение также относится к клеткам-хозяевам, трансфецированным по меньшей мере одним из описанных выше рекомбинантных полинуклеотидов. Клетки-хозяева включают любую прокариотическую и эукариотическую клетку-хозяина, включая, например, клонированные клеточные линии, поддерживаемые способами культивирования, известными специалистам в данной области. Клетки-хозяева также включают трансгенные растения и животных, полученных из трансформированных клеток, например, стволовых клеток. В одном варианте осуществления клетка-хозяин включает клетку, совместно трансфецированную полинуклеотидом, кодирующим SEQ ID NO:14, и полинуклеотидом, кодирующим SEQ ID NO:20, и которая продуцирует функциональное антитело с характеристиками, по существу такими же как у mAb1. В определенных вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой CLN1. В другом конкретном варианте осуществления клетка-хозяин обозначена номером доступа в АТСС РТА-6006 (депонирована 20 мая 2004 г.).
Эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения будут легко понятны специалистам в данной области в свете представленного описания, и все такие варианты осуществления конкретно предусмотрены настоящим изобретением.
Краткое описание чертежей
На фиг.1А и 1В показано, что структура и последовательности фактора роста соединительной ткани сохраняются. На фиг.1А показана модулярная структура домена CTGF, который включает консервативные мотивы для белка, связывающего подобный инсулину фактор роста (IGF-BP), и фактора фон Виллебранда (VWC) в N-концевом фрагменте и мотив тромбоспондина (TSP1) и узла цистеина (СТ) в С-концевом фрагменте. На фиг.1В показано упорядочение множественных последовательностей между N-концевыми фрагментами ортологов человеческого (hCTGF), коровьего (bCTGF), свиного (pCTGF), крысиного (rCTGF) и мышиного (FIPS12)CTGF. Упорядочение было создано с использованием программы CLUSTAL W (версия 1.74; Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680) с использованием параметров по умолчанию. На чертеже звездочка (*) показывает полное сохранение аминокислотного остатка среди представленных видов.
На фиг.2А и 2В показаны графики Скэтчарда конкурентного связывания между меченым и немеченым человеческим CTGF соответственно с антителами против CTGF, mAb2 и mAb1. mAb1 представляет собой иллюстративное антитело по настоящему изобретению.
На фиг.3А показан фрагмент антитела Fab (Mr 45 кДа), полученный после расщепления папаином соответствующего IgG антитела mAb1 и последующей аффинной хроматографии на белке А-сефарозе (полоса 2), что было показано с помощью SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). На фиг.3В показано связывание фрагмента Fab и соответствующего IgG с CTGF в зависимости от увеличивающейся концентрации хаотропного агента (тиоцианата).
На фиг.4А и 4В показаны графики Скэтчарда конкурентного связывания между меченым рекомбинантным человеческим CTGF и немеченым крысиным CTGF соответственно с антителами против CTGF, mAb2 и mAb1.
На фиг.5А, 5В и 5С представлены терапевтические благоприятные эффекты антитела по изобретению в случае модели интерстициального фиброза в легком. На фиг.5А показан эффект лечения антителом в случае вызванного блеомицином увеличения содержания гидроксипролина в легких мышей. Количество животных в каждой группе показано в скобках под каждым столбцом, а группы лечения указаны по оси х. SA: солевой раствор; BL: блеомицин; AbsJ: пул из 3 моноклональных антител по изобретению; mAb1, иллюстративное антитело по изобретению. Величины выражены в виде средней величины ± SE (стандартная ошибка). На фиг.5В и 5С показаны окрашенные гематоксилином и эозином парафиновые срезы легочных проксимальных ацинусов от мышей, подвергнутых воздействию блеомицина при внутритрахеальной инъекции, и последующему лечению соответственно солевым раствором или антителами по изобретению. На фиг.5В тонкие межальвеолярные перегородки ацинуса имеют патологический внешний вид, и присутствуют воспалительные клетки и фиброз. На фиг.5С паренхима в основном нормальная и имеется лишь умеренное утолщение межальвеолярных перегородок.
На фиг.6А, 6В и 6С представлены терапевтические благоприятные эффекты антитела по изобретению в случае модели канальциево-интерстициального фиброза почки. На фиг.6А показано уменьшение фиброза благодаря односторонней обструкции мочеточника (UUO) после лечения антителом по изобретению, mAb1, или антителом mAb3, направленным на С-конец CTGF. Степень фиброза выражена в виде соотношения между гидроксипролином и пролином в почке с обструкцией по сравнению с почкой без обструкции (средняя величина ± SE). На фиг.6В и 6С показаны окрашенные трихромом парафиновые срезы почки с обструкцией, в случае лечения соответственно солевым раствором или антителом.
На фиг.7А и 7В представлен терапевтический благоприятный эффект антитела по изобретению в случае модели клубочкового фиброза в почке. На фиг.7А и 7В показаны микрофотографии окрашенной трихромом ткани остатка почки после получения лечения соответственно солевым раствором или антителом.
На фиг.8А, 8В, 8С, 8D, 8E, 8F и 8G показана индукция локализованных подкожных гранулем у новорожденных мышей. Слева на фиг.8А и 8В показано образование гранулемы в участке подкожной инъекции одного TGFβ или TGFβ и CTGF, соответственно. Справа на фиг.8С-G показана гистологическая панель, представляющая систему балльной оценки (от 0 [нормальная] до 4 [фибротическая]), используемую для оценки терапевтического благоприятного эффекта антитела.
На фиг.9 показана степень фиброза в модели локализованной подкожной гранулемы с лечением антителом против CTGF и без него. mAb1 представляет собой иллюстративное антитело по изобретению, тогда как mAb3 представляет собой антитело против CTGF, которое специфически связывается с С-концевым эпитопом CTGF.
На фиг.10А, 10В, 10С и 10D представлен терапевтический благоприятный эффект антитела по изобретению при фиброзе органа в случае использования модели системного склероза (склеродермии). На каждой панели представлено изменение накопления коллагена в соответствующих органах после лечения солевым раствором (контроль), TGFβ и CTGF или лечения TGFβ и CTGF в сочетании с лечением антителом.
На фиг.11А и 11В показано графическое изображение клонирования тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина иллюстративного антитела по изобретению, mAb1. На фиг.11А показано упорядочение фрагментов тяжелой цепи PCR (полимеразной реакции синтеза цепи), используемых для определения кодирующей последовательности тяжелой цепи (CDS) mAb1. На фиг.11В показано упорядочение фрагментов легкой цепи PCR, используемых для определения кодирующей последовательности легкой цепи (CDS) mAb1.
На фиг.12А и 12В представлены результаты исследования связывания между CTGF и TGFβ. На фиг.12А показана степень связывания между TGFβ и либо CTGF, фрагментом CTGF, кодируемым экзоном 3 (Экзоном 3), либо фрагментом CTGF, кодируемым экзоном 5 (Экзоном 5), в присутствии или в отсутствие антитела против CTGF. На фиг.12В показана степень, до которой антитела против CTGF ингибируют взаимодействие TGFβ и CTGF. На фигуре антитела включают иллюстративные антитела по изобретению, mAb1 и mAb4 и антитело, которое специфически связывается с С-концевым эпитопом CTGF, mAb3.
Описание изобретения
Прежде чем описывать настоящие композиций и способы, следует понимать, что изобретение не ограничивается описанными конкретными методологиями, последовательностями операций, линиями клеток, анализами и реагентами, поскольку они могут варьироваться. Следует также понимать, что используемая в настоящем описании терминология предназначена для описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения и никоим образом не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, как изложено в прилагаемой формуле изобретения.
Пока нет других определений, все используемые в настоящем описании технические и научные термины имеют такие же значения, которые обычно понятны среднему специалисту в данной области, для которого предназначено это изобретение. Хотя в практике или тестировании настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем изобретении, здесь описаны предпочтительные способы, устройства и материалы. Все приведенные в настоящем описании публикации приведены здесь в качестве ссылки с целью описания и раскрытия методологий, реагентов и инструментов, о которых сообщалось в публикациях, которые могут использоваться в связи с изобретением. В настоящем описании ничто не следует толковать как допущение того, что изобретение не дает право предвосхищать такое раскрытие на основании предыдущего изобретения.
При отсутствии иных указаний при осуществлении настоящего изобретения используются обычные способы химии, биохимии, молекулярной биологии, клеточной биологии, генетики, иммунологии и фармакологии в пределах навыков в данной области. Полное объяснение таких методик имеется в литературе (см. например, Gennaro A.R., ed. (1990) Remington`s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.; Colowinck S. et al, Eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Maniatis T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel F.M. et al., eds. (1999) Short Protocols on Molecular Biology, 4th edition, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag).
Определения
"Фактор роста соединительной ткани" или "CTGF" относится к аминокислотным последовательностям по существу очищенного CTGF, полученного у любого вида, в частности вида млекопитающих, включая крысу, кролика, корову, овцу, свинью, мышь, лошадь и человекообразную обезьяну, предпочтительно у человека, и из любого источника, натурального, синтетического, полусинтетического или рекомбинантного.
Термин "N-концевой фрагмент" CTGF относится к любому полипептиду, содержащему последовательности, полученные из амино-концевой части полипептида CTGF, или к любому его варианту или фрагментам. N-концевые фрагменты могут не включать или включать весь CTGF или его части от начального метионинового остатка до лишенного цистеина шарнира, как показано на фиг.1А и 1В. Далее, N-концевые фрагменты могут не включать или включать весь белковый мотив, связывающий инсулиновый фактор роста, и/или домен фон Виллебранда типа С (SEQ ID NO:21) или их части, как показано на фиг.1В. N-концевые фрагменты CTGF могут также не включать или включать всю свободную от цистеина область или её части. Далее, N-концевые фрагменты CTGF могут представлять собой любые 15 или более соседних аминокислот, содержащихся в пределах любого определенного выше предшествующего N-концевого фрагмента.
В одном аспекте "N-концевой фрагмент" CTGF относится к полипептидным последовательностям, полученным из амино-концевой части человеческого CTGF. Такие фрагменты могут охватывать всю область от аминоксилотного остатка 1 до примерно аминокислотного остатка 198 SEQ ID NO:2 или от примерно аминокислоты 23 до примерно аминокислоты 198 SEQ ID NO:2. Граница N-концевого фрагмента в пределах шарнира может быть необязательно определена одним из нескольких сайтов расщепления протеазы, определенных в SEQ ID NO:2, таких как сайты расщепления химотрипсина между остатками 179 и 180, между остатками 182 и 183 и между остатками 188 и 189; сайты расщепления плазмина между остатками 183 и 184 и между остатками 196 и 197; и сайт расщепления костного морфогенетического белка-1 между остатками 169 и 170. Кроме того, N-концевые фрагменты человеческого CTGF могут не включать или включать всю или части области аминокислот 27-97 SEQ ID NO:2, аминокислот 103-166 SEQ ID NO:2 или аминокислот 167-198 SEQ ID NO:2. Далее, N-концевые фрагменты человеческого CTGF могут представлять собой любые 15 или более соседних аминокислот, содержащихся в пределах любого определенного выше предшествующего N-концевого фрагмента.
В определенных вариантах осуществления изобретения N-концевые фрагменты CTGF настоящего изобретения содержат последовательности, выбранные из следующих областей человеческого CTGF (SEQ ID NO:2) и его ортологичных фрагментов, полученных от различных видов, в частности вида млекопитающих, включая крысу, кролика, корову, овцу, свинью, мышь, лошадь: аминокислотные остатки 23-96 (кодируемые экзоном 2); аминокислотные остатки 27-97 (мотив IGF-BP); аминокислотные остатки 97-180 (кодируемые экзоном 3); аминокислотные остатки 103-166 (домен VWC); аминокислотные остатки 167-198 (лишенный цистеина шарнир); аминокислотные остатки 23-180 (кодируемые экзонами 2 и 3); аминокислотные остатки 27-166 (IGF-BP и VWC); и аминокислотные остатки 23-198 (см. фиг.1В).
Термин "С-концевой фрагмент" CTGF относится к любому полипептиду, содержащему последовательности, полученные из карбокси-концевой части аминокислотной полипептидной последовательности CTGF, или к любым его вариантам или фрагментам. С-концевые фрагменты CTGF могут не включать или включать всю или части лишенной цистеина области полипептида CTGF (аминокислоты 167-198 SEQ ID NO:2).
С-концевые фрагменты могут не включать или включать всю или части CTGF от лишенного цистеина шарнира до конца белка. Далее, С-концевые фрагменты могут не включать или включать всю или части мотива тромбоспондина и/или мотива цистеинового узла. Далее, С-концевые фрагменты CTGF могут представлять собой любые 15 или более соседних аминокислот, содержащихся в пределах любого определенного выше предшествующего С-концевого фрагмента.
В некоторых аспектах изобретения С-концевые фрагменты могут охватывать всю область от аминокислотного остатка 181 по примерно аминокислотный остаток 349 SEQ ID NO:2. Граница С-концевого фрагмента внутри шарнира может быть необязательно определена одним из нескольких сайтов расщепления протеазы, определенных в SEQ ID NO:2, таких как определенные выше сайты расщепления химотрипсина, плазмина и костного морфогенетического белка-1. Кроме того, С-концевые фрагменты включают последовательности, выбранные из следующих областей человеческого CTGF (SEQ ID NO:2) и их ортологичных фрагментов, полученных у различных видов, в частности видов млекопитающих, включая крысу, кролика, корову, овцу, свинью, мышь и лошадь: аминокислоты 201-242 SEQ ID NO:2, аминокислоты 247-349 SEQ ID NO:2, аминокислоты 248-349 SEQ ID NO:2 или аминокислоты 249-346 SEQ ID NO:2. Далее, С-концевые фрагменты человеческого CTGF могут представлять собой любые 15 или более соседних аминокислот, содержащихся внутри любого определенного выше предшествующего С-концевого фрагмента.
Термины "лишенная цистеина область" или "шарнир" CTGF относятся к любому полипептиду, происходящему от примерно аминокислотного остатка 167 до примерно аминокислотного остатка 198 человеческого CTGF (SEQ ID NO:2), и его ортологичным фрагментам, полученным от различных видов, в частности вида млекопитающих, включая крысу, кролика, корову, овцу, свинью, мышь, лошадь.
Используемые в настоящем описании термины "аминокислотная последовательность" или "полипептид" или "полипептиды" относятся к олигопептидным, пептидным, полипептидным или белковым последовательностям и их фрагментам и к природным или синтетическим молекулам. Полипептидный фрагмент или аминокислотный фрагмент представляет собой часть полипептида, которая сохраняет по меньшей мере одну структурную и/или функциональную характеристику полипептида. Фрагменты CTGF включают любую часть полипептидной последовательности CTGF, которая сохраняет по меньшей мере одну структурную и/или функциональную характеристику CTGF. Когда "аминокислотная последовательность" указывается для обозначения полипептидной последовательности природной молекулы белка, термин "аминокислотная последовательность" и подобные термины не предназначены для ограничения аминокислотной последовательности полной нативной последовательностью, связанной с указанной молекулой белка.
Термин "иммуногенность" относится к способности вещества при введении в организм стимулировать иммунный ответ и продукцию антитела. Средство, проявляющее свойство иммуногенности, назывется иммуногенным. Иммуногенные средства могут включать, но не ограничиваются этим, разнообразные макромолекулы, такие как, например, белки, липопротеиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты, бактерии и бактериальные компоненты и вирусы и вирусные компоненты. Иммуногенные средства часто имеют молекулярную массу более чем 10 кДа. Антигенными фрагментами именуются фрагменты полипептида CTGF, предпочтительно фрагменты длиной примерно от 5 до 15 аминокислот, которые сохраняют по меньшей мере один биологический или иммунологический аспект активности полипептида CTGF.
Термин "антитело" относится к интактным молекулам, а также к их фрагментам, таким как Fab, F(ab')2 и Fv, которые способны связывать эпитопную детерминанту, и включают поликлональные и моноклональные антитела. Антитела, которые связывают CTGF или фрагменты CTGF, можно получить с использованием интактных полипептидов или с использованием фрагментов, содержащих мелкие интересующие пептиды в качестве иммунизирующего антигена. Полипептид или олигопептид, используемый для иммунизации животного (например, мыши, кролика, курицы, индюшки, козы и т.д.), может быть получен в результате трансляции РНК или синтезирован химически, и при желании он может быть конъюгирован с белком-носителем. Обычно используемые носители, химически соединенные с пептидами, включают, например, бычий сывороточный альбумин, тиреоглобулин и гемоцианин лимфы улитки (KLH).
Используемый в настоящем описании термин "моноклональное антитело" относится по существу к однородной популяции антител, т.е. к отдельным антителам, включающим популяцию, которая является идентичной по специфичности и аффинности, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Следует отметить, что композиция моноклонального антитела может содержать более одного моноклонального антитела.
Моноклональные антитела, включенные в пределы объема изобретения, включают гибридные и рекомбинантные антитела (например, "гуманизированные" антитела), независимо от видов происхождения или обозначения класса или подкласса иммуноглобулина, а также фрагменты антител (например, Fab, F(ab')2 и Fv), имеющие по меньшей мере одну из определенных характеристик антител, описанных в настоящем описании. Предпочтительные варианты осуществления включают антитела, способные связываться по существу с тем же эпитопом, что и эпитоп, распознаваемый моноклональным антителом mAb1, и/или имеющие аффинность к этому эпитопу, которая больше или равна аффинности mAb1.
Термин "моноклональное" указывает на характер антитела как по существу однородной популяции антител и не должен трактоваться как требующий продукцию антитела каким-либо определенным способом. Например, моноклональные антитела по изобретению могут быть изготовлены методом гибридомы, впервые описанным Kohler and Milstein (1975, Nature 256:495-497), или могут быть изготовлены методами рекомбинантной ДНК (например, см., Celltech Therapeutics Ltd., европейский патент EP-0120694; Cabilly et al, патент США № 4816567 или Mage and Lamoyi (1987; In: Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 79-97).
Используемый в настоящем описании термин "нейтрализующее антитело" относится к антителу, предпочтительно моноклональному антителу, которое способно существенно ингибировать или устранить биологическую активность CTGF. Обычно нейтрализующее антитело ингибирует связывание CTGF с кофактором, таким как TGFβ c CTGF-специфичным рецептором, связанным с клеткой-мишенью или с другой биологической мишенью. В определенном варианте осуществления нейтрализующее антитело ингибирует биологическую активность CTGF в степени, приблизительно равной или большей, чем mAb1, предпочтительно нейтрализующее антитело ингибирует биологическую активность CTGF в степени, приблизительно равной или большей, чем CLN1.
Используемая в настоящем описании фраза "связанные с CTGF расстройства" относится к состояниям и заболеваниям, связанным с аномальной или измененной экспрессией или активностью CTGF. Аномальная экспрессия CTGF связана с клеточными пролиферативными расстройствами, такими как расстройства, вызванные пролиферацией эндотелиальных клеток; клеточная миграция, виды роста, подобные опухолевому росту; общее рубцевание ткани и различные заболевания, характеризуемые несоответствующим отложением внеклеточного матрикса.
Расстройства, связанные с CTGF, включают, но не ограничиваются этим, расстройства, вовлекающие ангиогенез и другие процессы, которые играют центральную роль при таких состояниях как пролиферативная витреоретинопатия, рак, включая острый лимфобластический лейкоз, дерматофибромы, рак молочной железы, карцинома молочной железы, глиома и глиобластома, рабдомиосаркома и фибросаркома, десмоплазия, ангиолипома, ангиолейомиома, дермопластические раковые опухоли, и рак предстательной железы, яичников, толстой и прямой кишки, поджелудочной железы, желудочно-кишечного тракта и печени; другой опухолевой рост и метастазы и т.д.
Расстройства, связанные с CTGF, также включают фибротические расстройства и связанные с ними состояния, такие как избыточное рубцевание, возникающее в результате локализованного или системного фиброза, хронический или острый фиброз органов, таких как почка, легкие, печень, глаза, сердце, кожа и т.д.; или ткани, выбранной, но не ограничивающейся этим, из эпителиальной, эндотелиальной и соединительной ткани. Фиброз может также возникнуть в глазах и суставах. Такие расстройства, связанные с CTGF, включают, например, сердечный фиброз, включая сердечный реактивный фиброз или сердечная перестройка после инфаркта миокарда или застойной сердечной недостаточности, легочные расстройства, включая интерстициальный легочный фиброз и т.д.; фиброз, связанный с диализом, включая перитонеальный диализ, например постоянный амбулаторный перитонеальный диализ (CAPD); перидуральный фиброз, почечный фиброз, легочный фиброз, интерстициальный фиброз, кожный фиброз и фиброз, возникающий в результате острых или повторных травм, включая хирургические операции, химиотерапию, лучевое лечение, отторжение аллотрансплантата, хроническое и острое отторжение трансплантата (например, почки, печени или другого органа), облитерирующий бронхиолит, например, после трансплантации легких, и воспаление и инфекция, например, вследствие болезни или повреждения.
Кроме того, расстройства, связанные с CTGF, включают, но не ограничиваются этим, склеротические состояния, включая системный склероз, склеродермию, келоиды, гипертрофическое рубцевание и другие дерматологические заболевания и состояния; атеросклероз, такой как состояния, включающие атеросклеротические бляшки. И атеросклероз, связанный с сахарным диабетом, перитонеальным диализом и т.д.; артрит, включая ревматоидный артрит, остеоартрит и другие суставные воспалительные состояния и т.д.; интерстициальные заболевания, включая интерстициальный фиброз; болезнь Крона; воспалительное заболевание кишечника; ретинопатии, включая, например, пролиферативную витреоретинопатию, непролиферативную диабетическую ретинопатию, пролиферативную диабетическую ретинопатию и дегенерацию желтого пятна, включая связанную с возрастом и ювенильную болезнь (Stargardt), и отслоение пигментного эпителия; нефропатии, включая диабетическую нефропатию, нефропатию, связанную с IgA, нефропатию, связанную с токсичностью, волчаночное почечное заболевание и т.д.; и состояния, связанные с химической токсической деструкцией канальцев.
Расстройства, связанные с CTGF, также включают, но не ограничиваются этим, расстройства вследствие гипергликемии, гипертонии, образование конечного продукта гликирования (AGE) и т.д. Такие расстройства могут возникнуть, например, вследствие сахарного диабета, ожирения и т.д. и включают диабетическую нефропатию, ретинопатию и сердечно-сосудистые заболевания. Кроме того, расстройства, связанные с CTGF, могут быть вызваны любым инициирующим фактором, включая, но не ограничиваясь этим, контакт с химическими или биологическими веществами, воспалительную реакцию, аутоиммунную реакцию, травму, хирургические процедуры и т.д. В некоторых вариантах осуществления используются способы для лечения пациента, предрасположенного к расстройству, связанному с CTGF, вследствие состояния, включающего, но не ограничивающегося этим, инфаркт миокарда, артрит и локальное или системное воспаление.
Указанные в настоящем описании "пролиферативные" процессы и расстройства включают патологические состояния, характеризуемые постоянным размножением клеток, приводящим к избыточному росту клеточной популяции в пределах ткани. Клеточные популяции необязательно представляют собой трансформируемые вызывающие рост опухолей или злокачественные клетки, но они могут также включать нормальные клетки. Например, CTGF может участвовать патологически при пролиферативном поражении слоя интимы артериальной стенки, приводя к атеросклерозу или стимуляции неоваскуляризации.
Термин "рак" относится к любому автономному росту ткани, включая неконтролируемый, аномальный рост клеток, или к любой злокачественной опухоли с потенциально неограниченным ростом, которая распространяется локально путем внедрения и системно - метастазированием. Рак также относится к любому аномальному состоянию, обозначаемому раком.
Термин "фиброз" относится к аномальному процессингу фиброзной ткани или к фиброидной или фиброзной дегенерации. Фиброз может возникнуть в результате различных травм или заболеваний, и он может часто возникнуть в результате хронического отторжения трансплантата, связанного с трансплантацией различных органов. Фиброз обычно вовлекает аномальную продукцию, накопление или отложение компонентов внеклеточного матрикса, включая избыточную продукцию и увеличенное отложение, например, коллагена и фибронектина. Термин "фиброз" используется в настоящем описании в его самом широком смысле, и он относится к любой избыточной продукции или отложению белков внеклеточного матрикса. Имеются многочисленные примеры фиброза, включая образование рубцовой ткани после сердечного приступа, что нарушает способность сердца нагнетать кровь. Сахарный диабет часто вызывает повреждение/рубцевание в почках, что ведет к прогрессирующей потере почечной функции; и в глазах, что вызывает потерю зрения. После операции рубцовая ткань может образовываться между внутренними органами, вызывая контрактуру, боль и, в некоторых случаях бесплодие. Основные органы, такие как сердце, почка, печень, глаз и кожа склонны к хроническому рубцеванию, обычно связанному с другими заболеваниями. Гипертрофические рубцы (конгломерат незлокачественной ткани) представляют собой обычную форму фиброза, вызванного ожогами и другой травмой. Кроме того, существует ряд других фибропролиферативных расстройств, включая склеродермию, келоиды и атеросклероз, которые связаны соответственно с общим рубцеванием ткани, видами роста, подобными опухолевому росту, в коже, или стойкое рубцевание кровеносных сосудов, которое нарушает способность переносить кровь.
Термины "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" или "полинуклеотиды" относятся к олигонуклеотидам, нуклеотидным последовательностям или полинуклеотидам или к любым их фрагментам и к ДНК и РНК природного или синтетического происхождения, которые могут быть одно- или двухнитевыми и могут представлять смысловую или антисмысловую нить, к пептидной нуклеиновой кислоте (PNA), или к любому материалу, подобному ДНК или РНК, природному или синтетическому по происхождению. Полинуклеотидные фрагменты представляют собой любую часть полинуклеотидной последовательности, которая сохраняет по меньшей мере одну структурную или функциональную характеристику полинуклеотида. Фрагменты полинуклеотидов могут быть вариабельной длины, например длиной более чем 60 нуклеотидов, длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов, длиной по меньшей мере 1000 нуклеотидов, или длиной по меньшей мере 10000 нуклеотидов.
"Измененные" полинуклеотиды включают полинуклеотиды с делециями, инсерциями или заменами различных нуклеотидов, приводящими к получению полинуклеотида, который кодирует такой же или функционально эквивалентный полипептид. В это определение включены последовательности, проявляющие полиморфизм, который может быть или не быть легко выявляемым с использованием определенных олигонуклеотидных зондов, или посредством делеции дефектной или неожиданной гибридизации в аллели при локусе, отличном от нормального хромосомного локуса для данной полинуклеотидной последовательности.
"Измененные" полипептиды могут содержать делеции, инсерции или замены аминокислотных остатков, которые вызывают молчащее изменение и приводят к получению функционально эквивалентного полипептида. Умышленные замены аминокислот можно осуществить на основании аналогии полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков, пока сохраняется биологическая или иммунологическая активность кодируемого полипептида. Например, отрицательно заряженные аминокислоты могут включать аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты могут включать лизин и аргинин; а аминокислоты с незаряженными полярными головными группами, имеющие одинаковые величины гидрофильности, могут включать лейцин, изолейцин и валин, глицин и аланин, аспарагин и глутамин, серин и треонин и фенилаланин и тирозин.
"Вариант" полипептида или аминокислотный "вариант" представляет собой аминокислотную последовательность, которая изменена одной или несколькими аминокислотами из определенной аминокислотной последовательности. Вариант полипептида может иметь консервативные изменения, при которых замещающая аминокислота имеет структурные или химические свойства, подобные замещенной аминокислоте, например, замещение лейцина изолейцином. Вариант может также иметь неконсервативные изменения, при которых замещающая аминокислота имеет физические свойства, отличные от свойств замещенной аминокислоты, например, замещение глицина триптофаном. Аналогичные небольшие изменения могут также включать делеции или инсерции аминокислот или оба эти изменения. Предпочтительно аминокислотные варианты сохраняют определенные структурные или функциональные характеристики определенного полипептида. Руководство в определении, какие аминокислотные остатки могут быть заменены, инсертированы или подвергнуты делеции, можно получить, например, с использованием компьютерных программ, хорошо известных в данной области, таких как программное обеспечение LASERGENE (DNASTAR Inc., MADISON, WI).
Вариант полинуклеотида представляет собой вариант определенной полинуклеотидной последовательности, полинуклеотидная последовательностиь которого предпочтительно на по меньшей мере примерно 80%, более предпочтительно на по меньшей мере примерно 90%, и, наиболее предпочтительно на по меньшей мере примерно 95% аналогична определенной полинуклеотидной последовательности. Специалистам в данной области понятно, что в результате вырожденности генетического кода может быть продуцировано множество вариантных полинуклеотидных последовательностей, кодирующих определенный белок, где некоторые несут минимальную гомологию с полинуклеотидными последовательностями любого известного и природного гена. Таким образом, изобретение предусматривает каждое и любое возможное изменение полинуклеотидной последовательности, которое может быть произведено выбором комбинаций на основе возможных выборов кодона. Эти комбинации производятся в соответствии со стандартным триплетным генетическим кодом кодона, и все такие изменения также следует рассматривать как являющиеся определенно раскрытыми.
"Делеция" представляет собой изменение аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которое приводит к отсутствию одного или нескольких аминокислотных остатков или нуклеотидов.
Термины "инсерция" или "добавление" относятся к изменению полипептидной или полинуклеотидной последовательности, приводящему к добавлению соответственно одного или нескольких аминокислотных остатков или нуклеотидов по сравнению с природной молекулой.
Используемый в настоящем описании термин "функциональный эквивалент" относится к полипептиду или полинуклеотиду, который обладает по меньшей мере одной функциональной и/или структурной характеристикой определенного полипептида или полинуклеотида. Функциональный эквивалент может содержать модификации, которые обеспечивают возможность выполнения определенной функции. Термин "функциональный эквивалент" предназначен для включения фрагментов, мутантов, гибридов, вариантов, аналогов или химических производных молекулы.
Термин "микронабор" относится к любому расположению нуклеиновых кислот, аминокислот, антител и т.д. на субстрате. Субстрат может представлять собой любую подходящую подложку, например шарики, стекло, бумагу, микроцеллюлозу, нейлон или любую соответствующую мембрану и т.д. Субстрат может представлять собой любую жесткую или полужесткую подложку, включая, но не ограничиваясь этим, мембраны, фильтры, тонкие диски, стружки, покровные стекла, волокна, шарики, включая магнитные или немагнитные шарики, гели, трубки, пластины, полимеры, микрочастицы, капилляры и т.д. Субстрат может обеспечить поверхность для покрытия и/или может иметь множество форм поверхности, такие как лунки, штифты, бороздки, каналы и поры, с которыми могут связываться нуклеиновые кислоты, аминокислоты и т.д.
Термин "образец" используется в настоящем описании в его самом широком смысле. Образцы могут быть получены из любого источника, например из биологических жидкостей, выделений, тканей, клеток или клеток в культуре, включая, но не ограничиваясь этим, слюну, кровь, мочу, сыворотку, плазму, стекловидное тело, синовиальную жидкость, спинномозговую жидкость, амниотическую жидкость, и ткань органа (например, ткань, взятую при биопсии); из хромосом, органелл или других мембран, выделенных из клетки; из геномной ДНК, кДНК, РНК, мРНК и т.д.; и из очищенных клеток или тканей или из блотов и импринтингов таких клеток или тканей. Образцы могут быть получены из любого источника, такого как, например, человек или млекопитающее, отличное от человека, и т.д. Предусмотрены также образцы, полученные из любой модели на животных заболевания. Образец может быть в растворе или может быть, например, фиксирован или связан с субстратом. Образец может относиться к любому материалу, подходящему для тестирования для выявления присутствия CTGF или фрагментов CTGF, или подходящему для скрининга молекул, которые связываются с CTGF или с его фрагментами. Способы получения таких образцов находятся в пределах навыков в данной области.
Термин "гибридизация" относится к способу, посредством которого последовательность нуклеиновой кислоты связывается с комплементарной последовательностью посредством спаривания оснований. Условия гибридизации можно определить, например, по концентрации соли или формамида в прегибридизационном и гибридизационном растворах или по температуре гибридизации, и они хорошо известны в данной области. Гибридизация может происходить в условиях различной строгости.
В частности, строгость может увеличиваться при уменьшении концентрации соли, увеличении концентрации формамида или повышении температуры гибридизации. Например, в целях настоящего изобретения гибридизация в очень жестких условиях может происходить в примерно 50% формамиде при температуре примерно от 37°С до 42°С и в менее жестких условиях - в формамиде в концентрации примерно от 35% до 25% при температуре примерно от 30°С до 35°С. В частности, гибридизация в целом происходит в самых жестких условиях при 42°С в 50% формамиде, 5Х SSPE, 0,3% SDS и 200 мкг/мл фрагментированной и денатурированной ДНК спермы лосося.
Температурный диапазон, соответствующий определенному уровню строгости условий, можно дополнительно уменьшить способами, известными в данной области, например, расчетом соотношения между пурином и пиримидином интересующей нуклеиновой кислоты и соответствующей регулировкой температуры. Для удаления неспецифических сигналов блоты можно последовательно промывать, например, при комнатной температуре или выше вплоть до 60°С, во все более жестких условиях вплоть до 0,1Х SSC и 0,5% SDS. Изменения указанного выше диапазона и условий хорошо известны в данной области.
Изобретение
Настоящее изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с фактором роста соединительной ткани (CTGF). Антитела представляют собой поликлональные или моноклональные антитела, предпочтительно человеческие моноклональные антитела. Антитела направлены к N-концевому фрагменту CTGF, показанному на фиг.1. Более конкретно антитела направлены к фрагменту CTGF, простирающемуся от примерно остатка 97 до примерно остатка 180 SEQ ID NO:2. В определенных вариантах осуществления изобретения антитела направлены к фрагменту CTGF, простирающемуся от примерно остатка 103 до примерно остатка 164, а конкретнее к фрагменту от примерно остатка 134 до примерно остатка 158 SEQ ID NO:2. Конкретнее антитела направлены к фрагменту CTGF, простирающемуся от примерно остатка 143 до примерно остатка 154 SEQ ID NO:2.
В определенных вариантах осуществления изобретения антитела нейтрализуют биологическую активность CTGF. Виды биологической активности CTGF включают клеточную пролиферацию, дифференциацию, генную экспрессию и т.д. В определенных вариантах осуществления биологическая активность выбрана из группы, состоящей из клеточной дифференциации, например дифференциации или трансдифференциации фибробластов, миофибробластов, эндотелиальных клеток и т.д., из различных клеток-предшественников; индукции экспрессии белка, участвующего в формировании и перестройке внеклеточного матрикса, например коллагена I типа, фибронектина и т.д.; совместной индукции каскадов передачи сигналов, связанных с различными факторами, включая, но не ограничиваясь этим, TGF-β, IGF, VEGF, ангиотензин II, эндотелин и т.д.; и клеточной реакции на различные стимулы окружающей среды, включая, но не ограничиваясь этим, увеличенное содержание глюкозы (гипергликемия), увеличенное механическое напряжение (гипертония) и т.д.
Хотя изобретение не должно ограничиваться механизмом, которым антитела нейтрализуют активность CTGF, антитела могут связываться с CTGF и предотвращать его взаимодействие со специфическими клеточными рецепторами. Рецепторы могут иметь высокую аффинность связывания с CTGF и путем связывания с CTGF стимулируют внутриклеточный сигнал, который ведет к пролиферации, дифференциации, индукции экспрессии генов и/или изменению клеточной морфологии или функции. Определенная биологическая реакция клетки на CTGF зависит от клетки и текущего состояния окружающей микросреды. Альтернативно рецепторы могут иметь низкую аффинность связывания с CTGF и, путем связывания с CTGF, могут, например, располагать CTGF относительно рецепторов с высокой аффинностью для содействия распознавания CTGF и реакции на него. Альтернативно антитела могут связывать CTGF внутри тканей или органов и содействовать титрованию или удалению CTGF из организма.
Альтернативно или в сочетании с описанными выше механизмами антитела могут связываться с CTGF и предотвращать его взаимодействие с секретируемыми или связанными с мембранами кофакторами. Такие кофакторы, в частности, включают члены суперсемейства TGFβ, включая, например, TGFβ-1, -2 и -3; активин-А, -В, -С и -Е; BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -8a, -8b, -9, -10, -11 и -15; и GDF-3, -5, -6, -7, -9 и -10. Например, было показано, что CTGF связывается с TGFβ-1 и BMP-4 и модулирует их активность (Abreu et al. (2002) Nat Cell Biol 4:599-604). Настоящее изобретение предоставляет доказательство того, что область CTGF, которая связывается с TGFβ, кодируется экзоном 3 (фиг.1В; нуклеотиды 418-669 SEQ ID NO:1), и антитела, которые связываются в пределах этой области, предотвращают взаимодействие между CTGF и TGFβ (см. пример 12 ниже). Кроме того, было показано, что антитела, которые связываются в пределах этой области CTGF, нейтрализуют специфические связанные с CTGF процессы в случае моделей на животных. Например, было показано, что антитела, которые связываются в пределах этой области CTGF, специфически ингибируют клеточную миграцию в анализах ex vivo и уменьшают фиброз в случае моделей на животных. Иллюстративными антителами по изобретению являются mAb1 и CLN1; CLN1 продуцируется линией клеток, обозначенной номером доступа РТА-6006 в АТСС, депонированном в Американской коллекции типовых культур (Manassus VA) 20 мая 2004 г.
Независимо от механизма действия настоящее изобретение относится к способам применения антител для лечения различных заболеваний и расстройств, связанных с CTGF, включая, но не ограничиваются этим, нейропатии, пневмосклерозы, ретинопатии, склеродермию, печеночные фиброзы, сердечную недостаточность, артрит и атеросклероз. Кроме того, расстройства, связанные с CTGF, возникают вследствие различных факторов, включая, но не ограничиваясь этим, гипергликемию, гипертонию, сахарный диабет, ожирение и т.д.; и включают диабетическую нефропатию, ретинопатию, сердечно-сосудистые заболевания и им подобные. Поскольку избыточная экспрессия CTGF имеется при широком разнообразии заболеваний, включая перечисленные выше, изобретение предусматривает лечение пациентов, имеющих расстройство, связанное с CTGF, антителом против CTGF для улучшения или стабилизации патологии, сохранения или восстановления функции органов, улучшения качества жизни и удлинения выживаемости.
Например, антитела, в частности, направлены на области CTGF, участвующие в видах биологической активности, связанных как с фибротическим, так и с нефибротическим аспектами различных расстройств, включая, например, интерстициальный пневмосклероз, диабетическую нефропатию и ретинопатию, дегенерацию желтого пятна и т.д. Изобретение также относится к способам применения антител для лечения расстройств, связанных с CTGF, включающих локализованные и системные фибротические расстройства, такие как расстройства легких, печени, сердца, кожи и почек и т.д.; и локализованное формирование рубца вследствие, например, травмы хирургических процедур и т.д.
Антитела по изобретению могут также использоваться в любом способе, который включает связывание с CTGF. Такие способы включают очистку CTGF или фрагментов CTGF, например, аффинной хроматографией; выявление CTGF или фрагментов CTGF в образце, например, с использованием ELISA или иммуногистохимических методик; диагностику расстройства, связанного с CTGF, путем использования способа выявления CTGF для измерения уровней CTGF в образце от пациента и сравнения уровня CTGF в образце со стандартом.
Антитела, направленные против CTGF
Была продемонстрирована модуляция количества и/или активности секретируемых клеточных факторов с использованием, например, моноклональных антител, и были разрешены к применению или проходят разработку несколько терапевтических антител (см. например, Abciximab (Reopro; Centocor, Inc., Malvern PA), Infliximab (Remicade; Maini et al. (1998) Arthritis Rheum., 41: 1552-1563; Targan et al. (1997) N. Engl. J. Med., 337: 1029-1035); Basiliximab (Simulect) and Daclizumab (Zenapax) (Bumgardner et al. (2001) Transplantation, 72: 839-845; Kovarik et al. (1999) Transplantation, 68: 1288-1294); и Transtuzumab (Herceptin; Baselga (2001) Ann. Oncol., 12 Suppl., 1: S49-55)). Специалистам в данной области известны и доступны многочисленные способы продукции антител, включая продукцию у животных, растений, грибов и бактерий; синтетическую конструкцию и культуру ex vivo.
Антитела по изобретению можно получать, используя любую методику, которая обеспечивает продукцию молекул антител. Методики для продукцию in vivo и in vitro или моноклональных, или поликлональных антител хорошо известны в данной области (см. например, Pound (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ; Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd Edition, Academic Press; Schook (1987) Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc). Продукция химерных антител также хорошо известна в данной области, как и продукция одноцепочечных антител (см. например, Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. USA, 81: 6851-6855; Neuberger et al. (1984) Nature, 312: 604-608; Takeda et al. (1985) Nature, 314: 452-454). Антитела с аналогичной специфичностью, но разного идиотипического состава можно генерировать разнообразными имеющимися средствами, например, "перетасовкой" цепи из случайных комбинационных библиотек иммуноглобулина (см. например, Burton (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:11120-11123).
Антитела могут быть также получены индукцией продуцирования in vivo в популяции лимфоцитов или скринингом библиотек или панелей иммуноглобулинов реагентов высокоспецифичного связывания (см. например, Orlandi et al. (1989) Proc. Natl. Acad. USA, 86: 3833-3837; Winter and Milstein (1991) Nature, 349: 293-299). Можно также генерировать фрагменты антител, которые содержат специфические сайты связывания полипептида-мишени. Такие фрагменты антител включают, но не ограничиваются этим, фрагменты F(ab')2, которые могут продуцироваться расщеплением пепсином молекулы антитела, и фрагменты Fab, которые могут генерироваться восстановлением дисульфидных мостиков фрагментов F(ab')2. Альтернативно могут быть сконструированы библиотеки экспрессии Fab для обеспечения возможности быстрой и легкой идентификации фрагментов моноклонального Fab с желательной специфичностью (см. например, Huse et al. (1989) Science, 254:1275-1281).
Моноклональные антитела по изобретению можно также получить, используя способ гибридомы (см. например, Kohler and Milstein (1975, Nature 256:495-497) или методы рекомбинантной ДНК (например, см., Celltech Therapeutics Ltd., европейский патент EP-0120694; Cabilly et al, патент США №4816567 или Mage Lamoyi (1987; In: Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 79-97).
В способе гибридомы мышь или другое соответствующее животное-хозяин иммунизируется CTGF или его фрагментом подкожным, внутрибрюшинным или внутримышечным путем для того, чтобы выявить лимфоциты, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые специфически связываются с полипептидом, используемым для иммунизации. Альтернативно животное-хозяин может представлять собой трансгенное млекопитающее, имеющее трансгены, кодирующие гены человеческого иммуноглобулина, и имеющие инактивированные локусы эндогенного иммуноглобулина. Трансгенное млекопитающее реагирует на иммуногены продукцией человеческих антител (см. например, Lonberg et al., WO 93/12227 (1993), патент США №5877397 и Nature, 148: 1547-1553 (1994) и Kucherlapati et al. (1991) WO 91/10791). Альтернативно лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro и затем слиты с клетками миеломы с использованием подходящего средства гибридизации, такого как полиэтиленгликоль, для формирования клетки гибридомы (см. например, Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd Edition, Academic Press, pp.59-103). Альтернативно человеческие соматические клетки, способные продуцировать антитело, в частности В лимфоциты, подходят для слияния с линиями клеток миеломы. Хотя можно использовать В-лимфоциты из биопсий селезенок, небных миндалин или лимфоузлов индивидуума, более легко доступные В-лимфоциты периферической крови являются предпочтительными. Кроме того, В-клетки человека могут быть непосредственно иммортализованы вирусом Эпштейна-Барра (см. например, Cole et al. (1995) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96).
Предпочтительными линиями клеток миеломы для использования в продуцирующих гибридому процедурах слияния являются те, которые эффективно сливаются, поддерживают устойчивый высокий уровень экспрессии антитела отобранной продуцирующей антитело клеткой, имеют дефицит ферментов, что делает их неспособными к росту в определенных селективных средах, которые поддерживают рост желательных гибридом и которые сами не продуцируют антитело. Примеры линий клеток миеломы, которые можно использовать для продукции гибридом в настоящем изобретении, включают (P3X63Ag8, P3X63Ag8-653, NS1/1.Ag 4.1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7, S194/5XX0 Bul, все получены у мышей; R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F и 4B210, все получены у крыс; и U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMY2, UC729-6, все получены у людей. (см. например, Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd Edition, Academic Press, pp.65-66 и Campbell (1984) In: Monoclonal Antibody technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13 (Burden and Von Knippenberg, eds.) Amsterdam, Elseview, pp. 75-83).
Клетки гибридомы высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых, материнских клеток миеломы. Например, если в материнских клетках миеломы отсутствует фермент гипоксантин-гуанин-фосфорибозил-трансфераза (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом обычно будет содержать вещество, такое как гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда НАТ), что предотвращает рост клеток с дефицитом HGPRT.
Культуральную среду, в которой растут клетки гибридомы, анализируют для выявления продукции моноклональных антител, направленных против CTGF или фрагментов CTGF. Предпочтительно специфичность связывания определяется аффинной хроматографией, иммунопреципитацией или анализом связывания in vitro, таким как радиоиммуноанализ (RIA) или ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), или анализом сортировки активируемой флуоресценции клеток (FASC). Моноклональные антитела по изобретению представляют собой антитела, которые связываются с CTGF, и, кроме того, антитела, которые нейтрализуют биологическую активность CTGF, как проиллюстрировано ниже.
Необязательно проводится скрининг антител, продуцированных, например, как описано выше, для выявления антител, которые связываются по существу в N-концевым фрагментом CTGF. В одном варианте осуществления антитела направлены против фрагмента CTGF, простирающегося от примерно остатка 24 до примерно остатка 180 SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления антитела направлены против фрагмента CTGF, простирающегося от примерно остатка 96 до примерно остатка 180 SEQ ID NO:1. В определенном варианте осуществления скрининг выявляет антитела, которые связываются по существу с тем же эпитопом, который распознается антителом mAb1, что определяется, например, с помощью конкурентных анализов описанного выше типа. В другом определенном варианте осуществления скрининг выявляет антитела, которые связываются по существу с тем же эпитопом, который распознается антителом CLN1, что определяется, например, с помощью конкурентных анализов описанного выше типа. Следует учитывать, что "тот же эпитоп" не означает точную аминокислоту или углеводород, с которым связывается эталонное антитело, что можно определить, например, картированием эпитопа с использованием сканированных аланином вариантов CTGF. "Тот же эпитоп" означает домен CTGF, который блокирован связыванием с CTGF нативного эталонного антитела в интактной форме. Конечно, "тот же эпитоп" включает остатки домена CTGF или углеводород, который структурно взаимодействует или связывается с эталонными определяющими комплементарность областями (CDR) mAb1 или CLN1.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения моноклональное антитело должно иметь аффинность, которая равна или больше, чем аффинность mAb1, что определяется, например, анализом Скэтчарда Munsin and Pollard (1980, Anal. Biochem., 107:220).
После идентификации клеток гибридомы, которые продуцируют нейтрализующие антитела желательной специфичности и аффинности, клоны обычно субклонируют с помощью процедур органичивающего разведения и выращивают стандартными способами (Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd Edition, Academic Press, pp.59-104). Подходящие для этой цели культуральные среды включают, например, Модифицированную Дульбекко среду Игла или среду RPMI-1640. Кроме того, клетки гибридомы могут выращиваться in vivo в виде асцитических опухолей у животного.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно выделить из культуральной среды, асцитической жидкости или сыворотки обычными методами очистки иммуноглобулина, такими как, например, белок А-сефароза, хроматография на гидроксиапатите, гель-электрофорез или аффинная хроматография.
ДНК, кодирующая моноклональные антитела по изобретению, легко выделяется и секвенируется с использованием обычных процедур, например использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антител. После выделения ДНК может быть лигирована в векторы экспрессии или клонирования, которые затем трансфецируются в клетки-хозяева, такие как обезьяньи клетки COS, клетки яичников китайского хомячка (CHO), или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют белок иммуноглобулина. Клетки, трансформированные таким образом, культивируются в условиях, подходящих для синтеза моноклональных антител в культуре рекомбинантных клеток-хозяев. Иллюстративная линия клеток представлена в АТСС под номером доступа PTA-6006, депонированная в АТСС 20 мая 2004 г.
ДНК необязательно модифицируется для изменения характера кодированного иммуноглобулина. Варианты иммуноглобулинов хорошо известны. Например, химерные антитела получают замещением кодирующей последовательности для константных доменов тяжелой и легкой цепи от одного вида, например мыши, гомологичными последовательностями от другого вида, например человека (см. например, Boss et al., международная публикация WO 84/03712; Cabilly et al., патент США № 4816567 или Morrison et al. (1984) Proc. Nat. Acad. Sci, 81: 6851). В определенном варианте осуществления гуманизированные формы мышиных антител могут быть получены замещением определяющих комплементарность областей (CDR), т.е. вариабельных доменов, мышиного антитела, каркасным доменом, т.е. константной областью, человеческого антитела (см. например, международную публикацию WO 92/22653). В некоторых вариантах осуществления выбранные мышиные каркасные участки замещаются человеческим реципиентным иммуноглобулином. Кроме того, выбранный домен Fc может представлять собой IgA, IgD, IgE, IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 или IgM. Домен Fc необязательно способен к эффекторным взаимодействиям, таким как связывание комплемента.
Антитела против CTGF настоящего изобретения могут также слиты с частями, которые обеспечивают дополнительные возможности, такие как выявление или цитотоксические эффекты. Слияния иммуноглобулинов настоящего изобретения и цитотоксических частей получают, например, путем лигирования в кодирующую последовательность иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности цитотоксического неиммуноглобулинового полипептида. Такие неиммуноглобулиновые полипептиды включают полипептидные токсины, такие как рицин, дифтерийный токсин или экзотоксин Pseudomonas. Конъюгаты могут также быть получены способами in vitro. Например, иммунотоксины могут быть сконструированы с использованием реакции дисульфидного обмена или путем формирования тиоэфирной связи между иммуноглобулином и полипептидом токсина. Примеры подходящих реагентов для этой цели включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат. Обычно такие неиммуноглобулиновые слитые полипептиды заменяют константными доменами антитела по изобретению. Альтернативно они заменяются вариабельными доменами одного антигенсвязывающего сайта антитела по изобретению.
Замена Fv или CDR антитела, имеющего специфичность к антигену, не являющемуся CTGF, создаст химерное антитело, содержащее один антигенсвязывающий сайт, имеющий специфичность к CTGF, и другой антигенсвязывающий сайт, имеющий специфичность к другому антигену. В таких вариантах осуществления происходит делеция легкой цепи и Fv тяжелой цепи заменяется желательным полипептидом. Эти антитела называются бивалентными или поливалентными в зависимости от количества "плеч" иммуноглобулина, которыми обладает используемый домен Fc; например, IgG будут бивалентными, а IgM будут поливалентными. Помимо указанных выше иммуноглобулинов, антителу также придается мультивалентность путем рекомбинации антител, которые имеют более одной специфичности. Например, антитело в некоторых вариантах осуществления способно связывать CTGF, как уже описано в настоящем описании, но оно также способно связывать второй фактор роста, например TGFβ, VEGF, FGF, другие члены семейства CCN, например CYR61 и им подобные, или цитокин. Иллюстративные антитела, направленные против этих факторов, хорошо известны. Мультиспецифические, мультивалентные антитела получают путем совместной трансформации клетки ДНК, кодирующей тяжелую и легкую цепи обоих антител и часть экспрессированных антител, имеющих желательную структуру, получают иммуноаффинной хроматографией или подобным способом. Альтернативно такие антитела получают из моновалентных антител, которые распознаются in vitro обычным образом.
Моновалентные антитела также получают способами, которые сами по себе являются обычными. Подходящей является рекомбинантная экспрессия легкой цепи и модифицированной тяжелой цепи. Тяжелая цепь является усеченной обычно в любой точке в области Fc с тем, чтобы предотвратить поперечную сшивку тяжелой цепи. Способы in vitro также используются для получения моновалентных антител, например, фрагменты Fab получают ферментным расщеплением интактного антитела.
Диагностика
Антитела настоящего изобретения можно использовать для количественного и качественного выявления CTGF в образце. Образцы могут быть из любого источника, включая кондиционированные среды из клеток, выращенных в культуре; образцы ткани, например биопсии ткани и трансплантатов органов; биологические жидкости, включая кровь, мочу, жидкость пузырьковых высыпаний, спинномозговую жидкость, стекловидное тело и синовиальную жидкость, и т.д. В одном варианте осуществления выявление CTGF используется для диагностики состояния клеток, выращенных в культуре, например, в отношении дифференциации, продукции матрикса и т.д. CTGF оказывает различные аутокринные и паракринные эффекты на культивируемые клетки, и уровень CTGF, связанного с клеточным слоем, или присутствующим в кондиционированных средах, может быть показателем текущего состояния клетки или прогнозировать будущее состояние клетки (см. например, международную публикацию WO 96/38168). В других вариантах осуществления выявление CTGF используется для определения состояния ткани или органа. Например, орган, предназначенный для трансплантата, можно оценить путем измерения уровней CTGF, причем уровень CTGF, экспрессируемый клетками в органе, указывает на относительное здоровье органа и пригодность для трансплантата. Уровни CTGF можно также определять в биопсии ткани для определения состояния органа или стадии и возможного метастатического потенциала рака.
В предпочтительных вариантах осуществления антитела используются для диагностики заболевания или расстройства, связанного с CTGF (см. например, международную публикацию WO 03/024308). В одном из аспектов изобретение относится к антителам для диагностики связанного с CTGF расстройства путем получения образца, выявления и количественной характеристики уровня CTGF в образце, и сравнения уровня CTGF в образце с уровнем стандартного количества CTGF, где увеличенное или уменьшенное количество CTGF в образце указывает на присутствие связанного с CTGF расстройства. Расстройства, связанные с аберрантными (например, повышенными или сниженными) уровнями CTGF, включают, но не ограничиваются этим, расстройства, связанные с измененной экспрессией белков, связанных с внеклеточного матрикса. Такие расстройства включают, например, различные виды рака, такие как рак молочной железы, поджелудочной железы и желудочно-кишечного тракта; атеросклероз, артрит, ретинопатии, такие как диабетическая ретинопатия; нефропатии, такие как диабетическая нефропатия; фиброз сердца, легкого, печени и почки, и заболевания, связанные с хроническим воспалением и/или инфекцией. Расстройства, связанные с CTGF, также связаны с такими состояниями, как инфаркт миокарда, сахарный диабет, перитонеальный диализ, хроническое и острое отторжение трансплантата, химиотерапия, лучевая терапия и хирургическая операция.
В другом аспекте изобретение относится к антителам для идентификации того, имеет или нет индивидуум предрасположенность к развитию расстройства, связанного с CTGF. На предрасположенность может первоначально указывать гипергликемия, гипертония или ожирение у субъекта. Кроме того, предрасположенность может быть заподозрена вследствие эпизода, например, инфаркта миокарда, хирургической операции, ортопедической или паралитической иммобилизации, застойной сердечной недостаточности, беременности или варикозного расширения вен у субъекта.
В другом аспекте изобретение относится к антителам для мониторинга прогрессирования связанного с CTGF расстройства или мониторинга терапевтической эффективности лечения связанного с CTGF расстройства. Например, способ использования антител может включать получение образцов у субъекта в течение времени; выявление и количественное определение уровня CTGF в таком образце; и сравнение уровня CTGF в последующих образцах с уровнями CTGF в более ранних или предыдущих образцах. Изменение уровня CTGF между образцами в течение времени указывает на прогрессирование расстройства, связанного с CTGF, или терапевтическую эффективность лечения расстройства, связанного с CTGF.
В случае применения для диагностики видов применения антитела по изобретению обычно метят выявляемой составной частью. Выявляемая составная часть может представлять собой любую часть, способную продуцировать, прямо или косвенно, выявляемый сигнал. Например, выявляемая часть может представлять собой радиоизотоп, такой как 3Н, 14С, 32Р, 35S или 125I, флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как изоцианат флюоресцеина, родамин или люцифирин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или пероксидаза хрена.
Можно использовать любой способ, известный в данной области, для отдельного конъюгирования антитела с выявляемой составной частью (см. например, Hunter et al. (1962) Nature, 144: 945; David et al. (1974) Biochemistry, 13: 1014; Pain et al. (1981) J. Immunol. Meth., 40: 219 и Nygren (1982) J. Histochem. Cytochem., 30: 407). Антитела по настоящему изобретению можно использовать в любом известном способе анализа, таком как анализы конкурентного связывания, прямой и непрямой сэндвич-анализы и анализы иммунопреципитации (Zola (1987) In: Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., pp.147-158).
Анализы конкурентного связывания основаны на способности меченого стандарта (который может представлять собой CTGF или его иммунологически реактивную часть) конкурировать с анализируемым веществом тестируемого образца (CTGF) за связывания с ограниченным количеством антитела. Количество CTGF в тестируемом образце обратно пропорционально количеству стандарта, которое оказывается связанным с антителами. Чтобы облегчить определение количества стандарта, который связывается, антитела в целом становятся нерастворимыми перед или после конкуренции, так что стандарт и анализируемое вещество, которые связаны с антителами, могут быть удобно отделены от стандарта и анализируемого вещества, которые остаются несвязанными.
Сэндвич-анализы включают использование двух антител, каждое из которых способно связываться с другой иммуногенной частью или эпитопом подлежащего выявлению белка. В сэндвич-анализе анализируемое вещество в тестируемом образце связывается с первым антителом, которое иммобилизовано на твердой подложке, и затем второе антитело связывается с анализируемым веществом, формируя, таким образом, нерастворимый комплекс, состоящий из трех частей (David and Greene, патент США № 4376110). Второе антитело само может быть меченным выявляемой составной частью (прямые сэндвич-анализы) или может быть измерено с использованием антитела против иммуноглобулина, которое мечено выявляемой частью (непрямой сэндвич-анализ). Например, один тип сэндвич-анализа представляет собой анализ ELISA, и в этом случае выявляемая часть представляет собой фермент. Иллюстративный анализ, в котором можно использовать антитела по изобретению, например, описан в международной публикации WO 03/024308.
Антитела по изобретению можно также использовать для визуализации in vivo, при которой антитело, меченное выявляемой частью, такой как рентгеноконтрастное вещество, радиоизотоп или флуоресцентная часть, такая как зеленый флуоресцентный белок (GFP), вводится хозяину предпочтительно в поток крови и анализируется присутствие и локализация меченого антитела у хозяина. Эту методику визуализации можно использовать при определении стадии и лечении связанных с CTGF расстройств, таких как фибротические расстройства. Антитело может быть меченным любой частью, которую можно выявить у хозяина, или ядерным магнитным резонансом, рентгенологическим или другими средствами выявления, известными в данной области.
Терапевтические средства
Настоящее изобретение относится к антителам для лечения различных болезней и расстройств, связанных с CTGF. Было обнаружено, что антитела по изобретению уменьшают вредные эффекты продукции или активности CTGF при нескольких расстройствах, как проиллюстрировано ниже. Кроме того, антитела проявляют благоприятную фармакокинетику, что делает их превосходными терапевтическими средствами для лечения расстройств, связанных с CTGF.
Антитела против CTGF настоящего изобретения ингибируют развитие фиброза в случае моделей на животных, например, пневмосклероза и фиброза почек. В частности, антитела ослабляют вызванный блеомицином пневмосклероз у мышей на 60-70%, что определяется по ингибированию легочного накопления гидроксипролина (коллагена) и путем гистологического исследования препаратов ткани. Кроме того, антитела снижают накопление коллагена в модели остатка почки крыс (т.е. после нефрэктомии 5/6) и у мышей после односторонней обструкции мочеточника (UUO). Антитела также уменьшают фиброз, вызванный комбинированным подкожным или внутрибрюшинным вливанием CTGF и TGFβ у новорожденных мышей. Кроме того, антитела уменьшают осложнения, связанные с недостаточностью органа, например улучшают почечную функцию в случае различных моделей хронической и острой почечной недостаточности. При использовании этих антител у животных не наблюдали токсичности. Поскольку CTGF избыточно экспрессируется при широком разнообразии фибротических заболеваний, включая диффузную и ограниченную склеродермию, остеоартрит, диабетическую нефропатию и ретинопатию и т.д., изобретение предусматривает лечение пациентов, имеющих расстройство, связанное с CTGF, антителом против CTGF для улучшения или стабилизации течения патологии, восстановления функции органов, улучшения качества жизни и продления выживаемости.
Поэтому антитела по изобретению особенно полезны в случае терапевтического применения для предотвращения или лечения расстройств, связанных с CTGF, у субъекта. Такие расстройства включают, но не ограничиваются этим, ангиогенез и другие процессы, которые играют центральную роль при таких состояниях, как атеросклероз, глаукома и т.д.; и при раке, включая острый лимфобластический лейкоз, дерматофибромы, рак молочной железы, карциному молочной железы, глиому и глиобластому, рабдомиосаркому и фибросаркому, десмоплазию, ангиолипому, ангиолейомиому, десмопластические формы рака и рак предстательной железы, яичников, толстой и прямой кишки, поджелудочной железы, желудочно-кишечного тракта и печени и другой опухолевой рост и метастазы.
Кроме того, антитела по изобретению можно использовать для терапевтического применения для предотвращения или лечения связанных с CTGF расстройств, включающих фиброз. В одном из аспектов антитела по изобретению вводятся субъекту для предотвращения или лечения связанного с CTGF расстройства, включая, но не ограничиваясь этим, расстройства, проявляющие измененную экспрессию и отложение белков, связанных с внеклеточного матрикса, например фибротические расстройства. В различных аспектах фиброз может быть локализован в определенной ткани, такой как эпителиальная, эндотелиальная или соединительная ткань; или в органе, таком как почка, легкое или печень. Фиброз может также возникнуть в глазу и суставах. В других аспектах фиброз может быть системным и вовлекать множественные органные и тканевые системы. Связанные с CTGF расстройства включают, например, атеросклероз, артрит, ретинопатии, такие как диабетическая ретинопатия, нефропатии, такие как диабетическая нефропатия; сердечный, легочный, печеночный и почечный фиброз, и заболевания, связанные с хроническим воспалением и/или инфекцией.
В другом аспекте изобретение относится к антителам для предотвращения связанного с CTGF расстройства у субъекта, имеющего предрасположенность к развитию такого расстройства. Предрасположенность может включать, например, гипергликемию, гипертонию или ожирение у субъекта. Такие расстройства могут возникать, например, вследствие сахарного диабета, ожирения и т.д. и включают диабетическую нефропатию, ретинопатию и сердечно-сосудистые заболевания. Кроме того, предрасположенность может быть заподозрена вследствие явления, например, инфаркта миокарда, хирургической операции, перитонеального диализа, хронического или острого отторжения трансплантата, химиотерапии, лучевой терапии, травмы, ортопедической или паралитической иммобилизации, застойной сердечной недостаточности, беременности или варикозного расширения вен у субъекта.
В конкретных вариантах осуществления, как проиллюстрировано в настоящем описании, антитела по настоящему изобретению вводятся субъекту для лечения фиброза органа, например легкого или почки. В настоящем описании показано, что антитела приводят к благоприятному действию в случае различных моделей пневмосклероза и почечного фиброза (см. например, примеры 7-9). В другом конкретном варианте осуществления антитела по настоящему изобретению вводятся субъекту для уменьшения локального или системного склероза (см. например, примеры 11 и 12). В дополнительных вариантах осуществления антитела вводятся субъекту для лечения или профилактики глазных расстройств, таких как пролиферативная витреоретинопатия, диабетическая ретинопатия, дегенерация желтого пятна и т.д. Поскольку CTGF вовлечен в широкий спектр расстройств, изобретение, кроме того, предусматривает лечение пациентов, имеющих связанное с CTGF расстройство, с использованием антитела по изобретению для улучшения или стабилизации патологического процесса и функции органа, улучшения качества жизни и продления выживаемости.
При терапевтическом применении антитела по изобретению вводятся млекопитающему, предпочтительно человеку, в фармацевтически приемлемой лекарственной форме. Антитела можно вводить внутривенно в виде болюса или путем непрерывного вливания в течение периода времени и/или внутримышечным, подкожным, внутрисуставным, внутрисиновиальным, подоболочечным, интравитреальным (в стекловидное тело), внутричерепным, пероральным, местным или ингаляционным путями. Когда антитело обладает подходящей активностью, можно также использовать пути введения в опухоль, вокруг опухоли, внутрь поражения или около поражения для оказания местного, а также системного терапевтических эффектов.
Такие лекарственные формы включают фармацевтически приемлемые носители, которые являются по существу нетоксичными и нетерапевтическими. Примеры таких носителей включают ионообменные вещества, окись алюминия, стеарат алюминия, лецитин; сывороточные белки, такие как альбумин сыворотки человека; буферы, такие как фосфат или глицин; сорбиновую кислоту, сорбат калия, частичные глицеридовые смеси насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли; или электролиты, такие как протаминсульфат, хлорид натрия, соли металлов, коллоидный оксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, целлюлозные полимеры и полиэтиленгликоль. Носители для местных или основанных на геле форм антитела включают полисахариды, такие как карбоксиметилцеллюлоза или метилцеллюлоза натрия, поливинилпирролидон, полиакрилаты, блок-сополимеры полиоксиэтилена-полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и спирты воска дерева. Обычные депо-формы включают, например, микрокапсулы, нано-капсулы, липосомы, пластыри, сублингвальные таблетки и полимерные матрицы, такие как сополимеры полилактида:полигликолида. В случае присутствия в водной лекарственной форме, а не в лиофилизированном виде, антитело обычно содержится в композиции в концентрации примерно от 0,1 мг/мл до 100 мг/мл, хотя допускается колебание далеко за пределы этих границ.
Для предотвращения или лечения заболевания соответствующая дозировка антитела будет зависеть от типа подлежащего лечению заболевания, как определено выше, тяжести и течения заболевания, от того, вводится ли антитело в профилактических или лечебных целях, от курса предыдущей терапии, клинического анамнеза пациента и реакции на антитело и от суждения лечащего врача. Антитело можно вводить пациенту один раз или в ходе серии лечебных циклов.
В зависимости от типа и тяжести заболевания примерно от 0,015-15 мг антитела/кг массы пациента является начальной возможной дозировкой для введения пациенту, например, путем одного или нескольких отдельных введений или непрерывного вливания. При повторных введениях в течение нескольких дней или более в зависимости от состояния лечение повторяют до тех пор, пока не произойдет желательное подавление симптомов заболевания. Однако можно использовать другие схемы дозировки, и они не исключены из настоящего изобретения.
В соответствии с другим вариантом осуществления эффективность антитела при предотвращении или лечении заболевания может быть повышена введением антитела серийно или в комбинации с другим средством, которое эффективно для той же клинической цели, таким как другое антитело, направленное против эпитопа, отличного от эпитопа, против которого направлено основное антитело, или с одним или несколькими обычными терапевтическими средствами, которые, как известно, применяются по предполагаемому показанию, например для предотвращения или лечения состояний, связанных с избыточной продукцией внеклеточного матрикса, таких как фиброз или склероз, ингибирования роста или метастазирования опухолевых клеток, ингибирования неоваскуляризации или уменьшения воспаления. Такие средства могут облегчить симптомы или улучшить исход посредством аналогичного механизма действия, например антитела против TGFβ, или другого механизма, например интерферон-γ. Такие средства могут дополнительно облегчить симптомы, прямо или косвенно связанные с расстройством, связанным с CTGF, или предрасположенностью к развитию расстройства, связанного с CTGF, например, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ) и блокаторы ангиотензиновых рецепторов (Arbs).
Например, больные склеродермией, получающие вливания устойчивого агониста простациклина илопроста, часто отмечают уменьшение уплотнения кожи, что согласуется с ингибирующим эффектом на формирование рубцовой ткани фибробластами кожи. Было показано, что простаноиды оказывают ингибирующий эффект на синтез коллагена, и ряд доказательств демонстрирует, что илопрост блокирует индукцию CTGF при склеродермии (Korn et al (1980) J. Clin. Invest., 65: 543-554; Goldstein and Polger (1982) J. Biol. Chem., 257: 8630-8633 и Stratton et al. (2001) J. Clin. Invest., 108: 241-250). Уровень CTGF возрастает в 7 раз в жидкости пузырьковых высыпаний у пациентов со склеродермией по сравнению со здоровыми контрольными лицами, однако у пациентов, получающих внутривенное введение илопроста, проявляется выраженное снижение уровня CTGF в жидкости пузырьковых высыпаний (Stratton et al. (2001) J. Clin. Invest., 108:241-250). Взятые вместе, эти результаты свидетельствуют о том, что некоторые из положительных эффектов терапии илопростом при склеродермии могут быть получены в результате антифибротических эффектов, опосредованных через снижение уровней CTGF. Поскольку имеются опасения относительно применения активного сосудорасширяющего и антитромбоцитарного аналога простациклина при хроническом системном введении пациентам со склеродермией, лечение с использованием одного антитела против CTGF или в сочетании со сниженными уровнями илопроста может обеспечить безопасное и эффективное лечение в случае склеродермии.
Дополнительные способы применения
Антитела по изобретению можно также использовать в качестве средств аффинной очистки. При этом способе антитела против CTGF иммобилизуются на подходящей подложке, такой как смола Sephadex или фильтровальная бумага, с использованием способов, хорошо известных в данной области. Затем иммобилизованное антитело контактирует с образцом, содержащим подлежащий очистке CTGF, а затем подложка промывается подходящим растворителем, который удаляет по существу весь материал в образце, кроме CTGF, который связан с иммобилизованным антителом. Наконец, подложка промывается другим подходящим растворителем, таким как глициновый буфер (рН 5,0), который освобождает CTGF от антитела.
ПРИМЕРЫ
Изобретение будет далее разъяснено при ссылке на следующие примеры, которые предназначены лишь для иллюстрации изобретения. Эти примеры представлены только для иллюстрации заявленного изобретения. Объем настоящего изобретения не ограничивается проиллюстрированными вариантами его осуществления, которые предназначены только для иллюстраций одиночных аспектов. Любые способы, которые являются функционально эквивалентными, находятся в пределах объема изобретения. Различные модификации изобретения в дополнение к модификациям, описанным в настоящем описании, станут очевидными для специалистов в данной области из предшествующего описания и сопровождающих чертежей. Такие модификации предназначены для включения в объем прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1. Продукция рекомбинантного человеческого CTGF
Бакуловирусный конструкт рекомбинантного человеческого CTGF продуцировали, как описано в публикации Segarini et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:40659-40667). Вкратце, кДНК CTGF, содержащую только открытую рамку считывания, генерировали PCR с использованием DB60R32 (Bradham et al. (1991) J. Cell Biol., 114:1285-94) в качестве матрицы и затравок 5'-gctccgcccgcagtgggatccATGaccgccgcc-3' и 5'-ggatccggatccTCAtgccatgtctccgta-3', которые добавляли сайты рестрикционного фермента BamHI к концам амплифицированного продукта. Нативные инициирующие и терминирующие кодоны указаны заглавными буквами.
Полученный амплифицированный фрагмент ДНК расщепляли BamHI, выделяли электрофорезом на агарозном геле и субклонировали непосредственно в сайт BamHI экспрессионной плазмиды PFASTBAC1 бакуловируса (Invitrogen Corp., Carlsbad CA). Последовательность и ориентацию экспрессионной кассеты подтверждали секвенированием ДНК. Затем полученную экспрессионную кассету CTGF переносили в бакмидную ДНК путем сайт-специфической рекомбинацией у бактерий. Затем эту бакмиду использовали для генерирования полностью рекомбинантного бакуловируса CTGF в клетках SF9 насекомого Spodoptera frugiperda в соответствии с протоколами, поставляемыми изготовителем (руководство по Экспрессионной системе BAC-TO-BAC, Invitrogen). Экспансию титров рекомбинантного бакуловируса в клетках Sf9 насекомых выполняли с использованием стандартной процедуры, известной в данной области.
Клетки Hi5 насекомых адаптировали для роста в суспензии путем нескольких пассажей клеток в культуре во стряхиваемой колбе, сопровождаемых обогащением при каждом пассаже для отделенных клеток. Суспензию клеток Hi5 культивировали в 1л среды SF900II SFM (Invitrogen) с добавлением 20 мкг/мл гентамицина (Mediatech, Inc., Herndon VA) и 1х липида (Invitrogen) в одноразовых культуральных колбах Fernbach емкостью 2,8 л (Corning Inc., Acton MA) на платформе шейкера при 110 об/мин при 27°С. Когда клетки достигали плотности 1,0-1,5×106 клеток/мл при жизнеспособности >95%, их инфицировали рекомбинантным бакуловирусом при множественности заражения (MOI) 10. Затем культуры инкубировали при 27°С в течение еще 40-44 ч. Кондиционированную среду, которая содержит rhCTGF, собирали, охлаждали на льду и центрифугировали при 5000 g. Затем супернатант пропускали через фильтр с размером пор 0,45 мм.
Альтернативно рекомбинантный крысиный CTGF продуцировали инсерцией клона 2-4-7, который кодирует крысиный CTGF (Schmidt et al., патент США № 6348329), в экспрессионный вектор pMK33 (сконструированный Michael Koelle, Stanford University Ph.D. dissertation, 1992). Экспрессионный конструкт крысиного CTGF трансфецировали в клетки Schneider 2 (Американская коллекция типовых культур, Manassas VA; Schneider (1972) J Embryol Exp Morphol 27:353-365) с использованием реагента CELLFECTIN (Invitrogen Corp., Carlsbad CA). Клетки выращивали в среде, содержащей 300 мкг/мл гидромицина В, в течение 6 недель, и затем выращивали без отбора в течение 3-х дней. Экспрессию CTGF индуцировали добавлением 500 мкМ CuSO4 и 100 мкМ ZnSO4 и через 4 дня среду собирали и просветляли центрифугированием и фильтрацией, как указано выше.
CTGF, продуцированный любым способом, описанным выше, очищали следующим образом. 4 л кондиционированной среды загружали на гепариновую колонку емкостью 5 мл HI-TRAP (Amersham Biosciences Corp., Piscataway NJ), предварительно уравновешенную 50 мМ Tris (рН 7,5), 150 мМ NaCl. Колонку промывали 10 объемам колонки 350 мМ NaCl, 50 мМ Tris (рН 7,5). CTGF элюировали из колонки с увеличением градиента соли NaCl. Проводили скрининг элюированных фракций с помощью SDS-PAGE и объединяли фракции, содержащие CTGF.
Очищенный гепарином CTGF разбавляли до конечной проводимости 5,7 мС апирогенной дважды дистиллированной водой и рН доводили до 8,0. Сильную анионообменную колонку Q-SEPHAROSE (Amersham Biosciences), содержащую приблизительно 23 мл смолы, соединенную тандемом с карбометиловой полистироловой колонкой (CM) POROS (Applied Biosystems), содержащей приблизительно 7 мл смолы, использовали для удаления эндотоксина и захвата и элюирования очищенного rhCTGF. Перед загрузкой образца тандемную колонку промывали 0,5 М NaOH с последующим промыванием 0,1 М NaOH и, наконец, уравновешивающим буфером. Загруженный образец пропускали через тандемную колонку, колонку Q-Sepharose удаляли, и CTGF элюировали из колонки CM POROS (Applied Biosystems) с увеличением градиента от 350 мМ до 1200 мМ NaCl. Чистоту элюированных фракций, содержащих CTGF, оценивали с помощью анализа SDS-PAGE перед формированием конечного пула образца.
Пример 2. Продукция N-концевого и С-концевого фрагмента CTGF
N-концевые и С-концевые фрагменты CTGF получали следующим образом. Рекомбинантный человеческий CTGF, полученный и очищенный, как описано выше, расщепляли при комнатной температуре в течение 6 ч путем обработки шариками химотрипсина (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO) при 1,5 мг CTGF на единицу химотрипсина. Смесь центрифугировали, шарики химотрипсина удаляли и супернатант, содержащий ферментативно расщепленный CTGF, разводили 1:5 50 мМ Tris, pH 7,5. Разбавленный супернатант наносили на гепариновую колонку Hi-Trap. Собирали элюирующиеся содержащие N-концевые фрагменты CTGF. Гепариновую колонку промывали 350 мМ NaCl и связанные С-концевые фрагменты CTGF элюировали с линейным градиентом от 350 мМ до 1200 мМ NaCl, как описано выше. Фракции анализировали SDS-Page, и объединяли фракции, содержащие С-концевые фрагменты CTGF.
Элюент с гепариновой колонки, который содержал N-концевые фрагменты CTGF, доводили до 0,5 М сульфата аммония/50 мМ Tris при рН 7,5 и затем загружали на колонку фенилсефарозы НР на 15 мл (Amersham-Pharmacia), которая была предварительно уравновешена 0,5 М сульфата аммония/50 мМ Tris при рН 7,5. Колонку промывали 15 колоночными объемами 0,5 М сульфата аммония/50 мМ Tris при рН 7,5, и связанные N-концевые фрагменты CTGF элюировали с линейным градиентом от 0,5 до 0 М сульфата аммония/50 мМ Tris при рН 7,5 приблизительно 15 объемами колонки. Фракции анализировали SDS-PAGE и объединяли фракции, содержащие N-концевые фрагменты CTGF. Объединенный раствор концентрировали и буфер обменивали с 50 мМ Tris, 400 мМ NaCl (рН 7,2), используя ультрафильтрационную мембрану ULTRACEL AMICON YM10 (Millipore Corp., Bedford MA).
Пример 3. Продукция человеческих моноклональных антител против CTGF
Полностью человеческие моноклональные антитела к человеческому CTGF получали, используя линии HCo7, HCo12 и HCo7+HCo12 мышей HUMAB (Medarex, Inc., Princeton NJ). Мышей иммунизировали вплоть до 10 внутрибрюшинными (IP) или подкожными (Sc) инъекциями 25-50 мг рекомбинантного человеческого CTGF в полном адъюванте Фрейнда в течение периода 2-4 недель. Иммунный ответ контролировали позадиглазничными кровоизлияниями. Скрининг плазмы проводили с помощью ELISA (как описано ниже), и мышей с достаточными титрами иммуноглобулина против CTGF использовали для гибридизаций. Мышам внутривенно повторно проводили иммунизацию антигеном за 3 и 2 дня до умерщвления и удаления селезенки.
Суспензии одиночных клеток селезеночных лимфоцитов от иммунизированных мышей подвергали гибридизации с одной четвертой количества не секретирующих клеток миеломы мышей P3X63-Ag8.653 (Американская коллекция типовых культур (АТСС), Manassas VA) в 50% PEG (Sigma, St.Louis MO). Клетки высевали в концентрации приблизительно 1 × 105 клеток/лунку в титровочный микропланшет с плоским дном и инкубировали в течение примерно 2 недель в среде DMEM (модифицированной Дульбекко среде Игла) с высоким содержанием глюкозы (Mediatech, Hemdon VA), содержащей L-глутамин и пируват натрия, 10% фетальную телячью сыворотку, 10% кондиционированную среду P388D1 (ATCC), 3-5% ориген (Igen International, Gaithersburg MD), 5 мМ HEPES, 0,055 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мг/мл гентамицина и 1х НАТ (Sigma). Через 1-2 недель клетки культивировали в среде, в которой НАТ был замещен НТ. Затем проводили скрининг отдельных ячеек ELISA (описанный ниже). Секретирующие антитела гибридомы повторно высевали на планшеты, снова проводили скрининг и, если они еще были положительными по антитела против CTGF, субклонировали по меньшей мере дважды при ограничивающем разведении. Затем устойчивые субклоны культивировали in vitro для генерирования небольших количеств антитела в среде для культуры ткани, чтобы охарактеризовать. Один клон от каждой гибридомы, которая сохраняла реактивность материнских клеток, использовали для генерирования банков клеток в 5-10 флакончиках, хранившихся в жидком азоте.
Анализы ELISA выполняли, как описано Fishwild et al. (1996, Nature Biotech., 14:845-851). Вкратце, титровочные микропланшеты покрывали 1-2 мкг/мл очищенного рекомбинантного CTGF в PBS (сыворотке с фосфатным буфером) в концентрации 50 мкл/лунку, инкубировали при 4°С в течение ночи, затем блокировали 200 мкл/лунку 5% куриной сывороткой в PBS/Tween (0,05%). Разведения плазмы от мышей, иммунизированных CTGF, или супернатанты культуры гибридомы добавляли в каждую лунку и инкубировали 1-2 ч при окружающей температуре. Планшеты промывали PBS/Tween и затем инкубировали с козьим поликлональным антителом Fc против человеческого IgG, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания планшеты проявляли 0,22 мг/мл субстрата ABTS (Sigma) и анализировали с помощью спектрофотометра при 415-495 нм.
Пример 4: Характеристика антитела
Гибридомы, которые продуцировали антитела к человеческому CTGF, получали, как описано в примере 3. Клонированные клетки гибридомы выращивали в модифицированной Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы/RPMI 1640 (50:50) с 8 мМ L-глутамина, 1/2x не незаменимых аминокислот и 10% фетальной телячьей сывороткой. Клетки, размноженные для получения антитела, выращивали в той же среде с 1,5% фетальной телячьей сывороткой с низким содержанием IgG в течение 4-9 дней при 37°С и 6% СО2. Полученную кондиционированную среду очищали от клеток и концентрировали, используя устройство фильтрации в тангенциальном потоке/концентрирования. Концентрат пропускали через колонку с белком А и связанные моноклональные антитела элюировали 100 мМ глицина, рН 3. Элюат нейтрализовали 1 М Tris, pH 8,0 и проводили диализ против PBS.
4.1 Картирование эпитопов
Картирование эпитопов антител с помощью экспериментов конкурентного связывания хорошо известно специалистам в области иммунологии (см. например, Van Der Geld et al. (1999) Clinical and Experimantal Immunology, 118:487-96). Каждую популяцию антител, выделенную из клеток, размножившихся из уникальной клетки клонированной гибридомы, картировали и относили к специфическому домену связывания человеческого CTGF, используя стандартные эксперименты связывания и блокирования (см. например, Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Harlow and Lane (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2nd ed., (1994) Chapter 10 (Immunochemical Techniques), Saunders и Clinical Chemistry: Theory, Analysis, Correlation (1984) Chapter 10 (Immunochemical Techniques) и Chapter 11 (Competitive Binding Assays), C.V. Mosby, St. Louis). Независимые домены связывания первоначально определяли с помощью экспериментов конкуренции антител, в которых 2 различных антитела инкубировали в последовательном порядке на планшетах, покрытых CTGF. Если стерическое препятствие от первого антитела мешало связыванию второго антитела с CTGF, то эти 2 антитела относили к одному и тому же домену связывания. Однако следует понимать, что эти 2 антитела могут иметь различные эпитопы, но все же настолько близкие по отношению друг к другу, чтобы обозначаться как члены одного и того же домена связывания.
Были идентифицированы домены связывания, охватывающие все 4 экзона человеческого CTGF. Все домены связывания конформационно определены, так что антитела связываются с CTGF в невосстанавливающих условиях в анализах вестерн-блоттинга. Некоторые антитела также связываются с CTGF в восстанавливающих условиях в анализах вестерн-блоттинга, это предполагает, что каждое из этих антител связывается с линейным эпитопом белка CTGF. Также антитела, представляющие поднабор доменов связывания, проявляют перекрестную реактивность на мышиный CTGF в анализах вестерн-блоттинга. Антитело из каждой группы, имеющее самую высокую аффинность ко всему CTGF, использовали для дальнейшей характеристики и анализа.
Более точное картирование эпитопов выполняли с помощью анализа ELISA, используя специфические рекомбинантно экспрессированные фрагменты CTGF. Например, антитела, которые распознают эпитопы N-концевого домена CTGF, идентифицировали анализом ELISA против иммобилизованных фрагментов, полученных в результате рекомбинантной экспрессии экзона 2 и/или экзона 3 гена CTGF. Таким образом, отбирали и проводили дальнейшую характеристику антител, которые специфически распознают N-концевые домены или N-концевые фрагменты CTGF. Также отбирали и проводили дальнейшую характеристику антител, которые специфически распознают С-концевые домены или С-концевые фрагменты CTGF.
Группа эпитопов, определенная mAb1, связывается с линейным эпитопом N-концевого фрагмента CTGF, кодируемого экзоном 3. Была генерирована серия усеченных синтетических пептидов, перекрывающих области, кодируемые полинуклеотидом экзона 3, и были проведены тесты ELISA с использованием этих пептидов для дальнейшего определения эпитопа mAb1. Результаты суммированы в табл.1; "+" указывает на связывание между пептидом и mAb1, тогда как "-" указывает на то, что mAb1 не связывается с пептидом. Представленная жирным шрифтом курсивом " С " указывает на остаток цистеина в пептиде, который является существенным для связывания mAb1. Подчеркнутая "С" указывает на остаток цистеина, добавленный на конце и не являющийся частью последовательности нативного CTGF.
Таблица 1 Связывание mAb1 с серией усеченных пептидов, кодированных экзоном 3 |
|||
Петид | Последовательность | Связывание mAb1 | SEQ ID NO: |
N-CTGF | + | ||
Экзон 3 | + | ||
Pep135 | CPLCSMDVRLPSPDCPFPRRVKLP | + | |
PC5444 | PLSSMDVRLPSPDS | - | |
PC5445 | RLPSPDSPFPRRVKLPGK | + | |
PEP5 | RLPSPDCPFPRRVKL | + | |
P40340 | RLPSPD C PFPRRV | + | |
P40341 | RLPSPDSPFPRRV | - | |
P40342 | LPSPD C PFPRRVKL | + | |
10MER | SPDSPFPRRV | - | |
10MER2 | SPDCPFPRRV | - | |
9MER | PDSPFPRRV | - | |
9MER2 | CPFPRRVKL | - | |
8MER | DSPFPRRV | - | |
8MER2 | CPFPRRVKL | - | |
7MER | CPRRVKL | - | |
6MER | CRRVKL | - | |
5MER | CRVKL | - |
Поэтому mAb1 является членом класса антител, которые связываются с N-концевой областью CTGF. Линейный эпитоп CTGF, необходимый и достаточный для связывания mAb1, определяется аминокислотными остатками L143-V154 человеческого CTGF (SEQ ID NO:2). Дополнительное подтверждение специфичности связывания mAb1 с этим пептидом было получено с помощью RIA и аффинной хроматографии. Антитела, которые разделяют этот эпитоп частично или полностью, особо включены в настоящее изобретение. Кроме того, антитела, которые конкурируют с mAb1 за связывание с CTGF или его фрагментом, также особо включены в настоящее изобретение.
4.2 Аффинность антител к CTGF
Аффинность антител определяется как сила всех нековалентных взаимодействий между одним антигенсвязывающим сайтом антитела, и одним эпитопом антигена. Аффинность рассчитывается с помощью измерения константы ассоциации (Ка), так что
где [Ab] представляет собой концентрацию свободного антигенсвязывающего сайта антитела, [Ag] представляет собой концентрацию свободного антигена, [Ab·Ag] представляет собой концентрацию антигенсвязывающего сайта антитела, занятого антигеном, и Kd представляет собой константу диссоциации комплекса антитело-антиген.
Аффинность каждой популяции антител, идентифицированной картированием эпитопов, измеряли, используя RIA, где весь rhCTGF связывали с радиоактивным йодом и добавляли в лунки, содержащие иммобилизованное моноклональное антитело, следующим образом. Рекомбинантный человеческий CTGF метили радиоактивным изотопом 125I, используя способ хлорамин-Т (см. Greenwood et al. (1963) Biochem. J., 89:114-123). Обычно включалось по меньшей мере 60% 125I и удельная активность меченого CTGF составляла по меньшей мере 1×105 импульсов/мин/нг, хотя можно использовать при радиоиммуноанализе меченый CTGF более низкой удельной активности. Козье антитело против человеческого IgG, γFc-специфическое антитело захвата (Jackson ImmunoResearch) в DPBS, лишенной Ca2+ и Mg2+ (Mediatech, Herndon VA), добавляли в лунки титровочного микропланшета MAXISORP BREAKAPART (Nalge Nunc International, Rochester NY) и давали возможность связываться в течение ночи при 4°С. Затем лунки блокировали 1% BSA (бычьим сывороточным альбумином) в DPBS, лишенной Ca2+ и Mg2+, в течение по меньшей мере 4 ч при 4°С. Блокирующий раствор удаляли, добавляли 100 мкл тестируемого антитела при 2-50 нг/мл в DPBS, лишенной Ca2+ И Mg2+, и давали возможность связываться в течение ночи при 4°С. Смеси серийных разведений немеченого CTGF при постоянном количестве [125I]rhCTGF добавляли в лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение 4-8 ч. Затем лунки промывали 4 раза 0,1% Tween 20 в PBS, лишенной Ca2+ И Mg2+ (Mediatech), и лунки титровочного микропланшета отделяли и проводили подсчет в гамма-счетчике.
Аффинность оценивали графически с помощью способа Скэтчарда (1948, Ann. NY Acad. Sci., 51:660-72). Общую концентрацию меченого CTGF, нанесенного на планшет, рассчитывали как
где "cpm_applied" представляют собой импульсы, полученные из контрольных флакончиков, которые заполнены смесями CTGF, параллельно с лунками титровочного микропланшета; "cpm/fmol" представляет собой удельную активность [125I]CTGF, "[CTGF]охл. исх. раствор" представляет собой концентрацию немеченого CTGF, добавленного в каждую лунку, и "разведение" представляет собой фактор разведения для немеченого CTGF.
Концентрацию CTGF, связанного с антителом, рассчитывали по пропорции импульсов, связанных с лунками, и общей концентрации CTGF, внесенного в лунки.
Концентрация свободного (несвязанного) CTGF представляет собой разность между общей концентрацией нанесенного CTGF и концентрацией связанного CTGF.
Графики Скэтчарда определения аффинности для антител по изобретению показаны на фиг.2. На фиг.2А показан график связывания антитела по изобретению, mAb2, с [125I]rhCTGF в присутствии увеличивающихся концентраций немеченого rhCTGF. На фиг.2В показан график связывания иллюстративного антитела по изобретению, mAb1, с [125I]rhCTGF в присутствии увеличивающихся концентраций немеченого rhCTGF. Большей массе соответствуют точки с одинаковым соотношением связанного и несвязанного CTGF, потому что эти точки имеют количество импульсов связанного CTGF, превышающее контроли (следовательно, определенные в лунке импульсы связанного фактора), но все же существенно меньше, чем общее количество импульсов нанесенного CTGF (следовательно, определенные в лунке импульсы свободного фактора). Максимальное связывание (Bmax) и Kd представлены в виде отрезков, отсекаемых на оси х и оси у соответственно.
Аффинность (Kd) mAb1 к CTGF составляет менее чем 10-9 М, обычно обнаруживаемая аффинность у коммерчески успешных терапевтических средств антител (см. например, Maini et al. (1998) Arthritis Rheum., 41: 1552-1563; Targan et al (1997) N. Engl. J. Med., 337: 1029-1035; Bumgardner et al. (2001) Transplantation, 72: 839-45 и Kovarik et al. (1999) Transplantation, 68: 1288-94). Таким образом, mAb1 является подходящим кандидатом для терапевтического применения, и антитела, которые разделяют связывание эпитопов с mAb1, как описано выше, и имеют аффинность к CTGF, которая аналогична или больше аффинности mAb1 (то есть Kd=10-9), аналогичным образом являются подходящими кандидатами для терапевтического применения. Антитела, разделяющие связывание эпитопов с mAb1, но имеющие более низкую аффинность (т.е. более высокое значение Kd), чем mAb1, также осуществлены в рамках настоящего изобретения и потенциально могут использоваться в различных анализах и диагностическе, как описано в настоящем описании. Такие антитела, кроме того, подходят для терапевтического применения, особенно если они имеют высокую авидность к антигену, как описано ниже.
4.3 Авидность антител
Для антител с более чем одним антигенсвязывающим сайтом (мультивалентность) аффинность одного связывающего сайта не всегда отражает истинную силу взаимодействия антитело-антиген. Когда мультивалентное антитело связывается с антигеном, имеющим множественные повторяющиеся эпитопы, взаимодействие одного антигена, взаимодействующего у одного связывающего сайта антителе, увеличивает возможность взаимодействия антигена с дополнительными связывающими сайтами. Авидность отражает силу функционального объединения антитела с антигеном, которая связана как с аффинностью взаимодействия между эпитопами и паратопами, так и валентностью антитела и антигена. Таким образом, авидность обеспечивает более точную меру тенденции антитела к диссоциации.
Высокая авидность может компенсировать низкую аффинность. Например, сайты связывания антигена IgM обычно имеют более низкую аффинность, чем IgG, но мультивалентность IgM дает ему высокую авидность, позволяя, таким образом, эффективно связывать антиген.
Для определения авидности антител по изобретению фрагмента сначала Fab были получены обычным расщеплением папаином соответствующего иммуноглобулина. Затем иммобилизованный белок А использовали для отделения фрагментов Fab от Fc и непереваренного антитела.
Приблизительно 1 мл суспензии иммобилизованного папаина, содержащей 0,5 мл затвердевшего геля, 250 мкг папаина и 3,5 единиц ВАЕЕ, промывали 3 × 1 мл и 1 × 10 мл буфера расщепления (DB; 20 мМ фосфата натрия, 10 мМ EDTA (этилендиамин-тетрауксусной кислоты), 20 мМ цистеина, рН 7,0). Затем суспензию ресуспендировали в 0,3 мл DB, смешивали с 1,1 мл антитела (приблизительно 5 мг, рН 7) и перемешивали в течение ночи при 37°С. Затем продукт расщепления антитела отделяли от смолы и фрагменты Fab отделяли от фрагментов Fc и непереваренного антитела с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А. Чистоту фрагмента Fab контролировали с помощью SDS-PAGE (фиг.3А).
Моновалентное связывание отличали от бивалентного связывания путем элюирования связанных с антигеном антител тиоцианатом с меняющейся концентрацией. При увеличении концентрации хаотропного иона (тиоцианата) в растворе сначала разрушаются ассоциации с более низкой аффинностью (например, моновалентное связывание Fab с антигеном), тогда как ассоциации с более высокой аффинностью (например, бивалентное связывание IgG с лигандом) остаются нетронутыми. Таким образом, с помощью увеличения концентрации тиоцианина можно различить 2 различных связывания.
Планшеты покрывали 10 мкг/мл CTGF или пептидов CTGF в 50 мМ бикарбонатном буфере (рН 8,5) при 4°С в течение ночи, блокировали блокатором казеином/TBS при 4°С в течение ночи и затем инкубировали со 100 мкг/мл антитела или соответствующего Fab в блокаторе казеине/TBS при комнатной температуре в течение ночи при перемешивании. Затем планшеты инкубировали с разведениями (1:1) тиоцианата (0-7,6 М) в 100 мМ фосфатном буфере (рН 6,0) в течение 15 мин при комнатной температуре и перемешивании с последующей инкубацией с конъюгатом щелочной фосфатазы-мышиного антитела против человеческого антигена (Fab')2 (разведение 1:1000) при комнатной температуре в течение 45 мин. Добавляли субстрат щелочной фосфатазы (1 мг/мл; Sigma) в 1 М диэтаноламине, 0,5 мМ MgCl2 (рН 9,8), планшеты инкубировали при комнатной температуре и определяли поглощение при 405 нм через 2, 10, 20 и 60 мин.
Показатель аффинности является концентрацией хаотропного вещества (тиоцианата), которая приводит к снижению первоначального поглощения на 50%. Для иллюстративного антитела по изобретению mAb1, показатель аффинности для диссоциации Fab от CTGF, составил 0,46 М, тогда как показатель аффинности для диссоциации интактного IgG от CTGF составил 1,8 М (фиг.3В). Таким образом, mAb1 связывается с антигеном преимущественно бивалентно (авидность) и диссоциируется от антигена гораздо медленнее, чем антитело, которое связывается моновалентно. Дополнительные антитела по изобретению, которые разделяют показатели связывания эпитопов с mAb1, могут быть аналогичным образом бивалентными, или они могут быть моно- или мультивалентными. Любым из антител по изобретению можно манипулировать для улучшения авидности, например комбинированием сайтов связывания эпитопов в один конструкт антитела, например тритело и т.д. (см. например, Schoonjans et al. (2000) J. Immunol., 165:7050-7057).
4.4 Перекрестная реактивность
Описанный выше радиоиммуноанализ (пример 4.2) использовали для определения перекрестной реактивности антител за исключением того, что немеченый rhCTGF был заменен другим немеченым конкурентом, крысиным CTGF, полученным из клеток почки нормальной крысы (NRK). Клетки NRK выращивали до их слияния и затем культуральную среду меняли на бессывороточную среду, содержащую 2 нг/мл TGF-β2, 50 мкг/мл гепарина и 250 мкг/мл BSA. Кондиционированную среду собирали через 2 дня культивирования, центрифугировали для удаления клеточных фрагментов и инкубировали с гранулами гепарина-сефарозы (1/100 об/об суспензии гранул:среды) в течение 2 ч при 4°С при перемешивании. Затем смесь центрифугировали; гранулы собирали и промывали PBS и затем лизировали в буфере SDS (додецилсульфата натрия).
График Скэтчарда связывания mAb2 с [125I]rhCTGF в присутствии увеличивающихся концентраций немеченого крысиного CTGF показан на фиг.4А; а график Скэтчарда связывания mAb1 с [125I]rhCTGF в присутствии увеличивающихся концентраций немеченого крысиного CTGF показан на фиг.4В. Как видно из фигуры, mAb1 связывается как с человеческим, так и с крысиным CTGF, тогда как mAb2 связывается с человеческим, но не связывается с крысиным CTGF.
Для mAb1 графики Скэтчарда в случае конкуренции с крысиным CTGF (фиг.4В) имеют меньший наклон, более низкую видимую аффинность и более высокую видимую величину Bmax, чем графики в случае конкуренции с rhCTGF (фиг.2В). Таким образом, хотя крысиный CTGF способен конкурировать с человеческим CTGF за связывание с mAb1, антитело имеет более высокую аффинность к рекомбинантному человеческому CTGF, чем к рекомбинантному крысиному CTGF. mAb1 также перекрестно взаимодействует с мышиным и обезьяним CTGF (данные не показаны). Антитела, проявляющие подходящую аффинность к CTGF от других видов, можно использовать при лечении и предотвращении расстройств у этих видов. Например, антитело по изобретению, которое проявляет подходящий Kd к собачьему CTGF, можно использовать для лечения расстройства, связанного с CTGF, у собак. Антитела по изобретению, которые проявляют перекрестновидовую аффинность, такие как mAb1, можно также использовать в качестве инструментов исследования для изучения расстройств, связанных с CTGF, на различных моделях на животных.
4.5 Гликозилирование
Описанный выше радиоиммуноанализ (пример 4.2) использовали для определения эффекта гликозилирования антител на аффинность связывания антигенов. Антитело mAb1 обрабатывали в течение 8 дней при 37°С в PBS, 0,5 M EDTA, pH 8,0, пептидом N-гликозидазой F (PNGаза F), который отщепляет олигосахариды от N-связанных гликопротеидов. После инкубации реакционный раствор или использовали непосредственно, или фракционировали на колонке с белком А-SEPHAROSE FASTFLOW (Amersham Bioscience, Piscataway NJ) и элюировали 0,1 М глицином-HCl, рН 2,5. Извлечение антитела после фракционирования составило приблизительно 87%, и уровень эндотоксина составил 0,30 единиц энтропии/мг. Дегликозилирование подтверждали SDS-PAGE. Активность связывания дегликозилированного антитела с человеческим рекомбинантным CTGF была идентична в пределах экспериментальной ошибки активности связывания гликозилированной формы антитела.
Поскольку различные клетки продуцируют различные типы гликозилирования, продукция рекомбинантных белков, например антител, в культивированных клетках или негомологичных видах, может генерировать ненативное гликозилирование.
Для активности некоторых белков требуется специфическое гликозилирование, и измененное гликозилирование снижает активность; например в случае антител снижается аффинность к антигену. Продукция белка в определенных системах, например растениях и куриных яйцах, может также продуцировать типы гликозилирования, которые являются иммуногенными, таким образом, снижая возможность использования белков при определенных видах применения. Способность настоящих антител проявлять одинаковую активность в гликозилированной и негликозилированной форме демонстрирует то, что изобретение не ограничивается присутствием гликозилирования, в частности, видоспецифического гликозилирования.
Пример 5. Анализ клеточной миграции
Миграция клеток представляет собой нормальное и важное клеточное явление, например, во время развития и заживления ран. Миграция клеток также является фактором в патологии расстройств, таких как формирование фибротических поражений, и клетки, выделенные из фибротических поражений, больше реагируют на хемотаксические раздражители, чем клетки из соответствующей нормальной ткани.
Антитела по настоящему изобретению анализировали на их способность ингибировать стимулированную CTGF хемотаксическую миграцию гладкомышечных клеток с использованием анализа в камере Бойдена следующим образом. Артериальные гладкомышечные клетки крыс (ASMC) в среде, содержащей 0,1% фетальную телячью сыворотку (FCS), добавляли в верхний отсек камеры Бойдена, а среду, содержащую или 300 нг/мл rhCTGF, 10% FCS, или только 0,1% FCS, добавляли в нижний отсек. Покрытый коллагеном фильтр, имеющий поры диаметром 8 мкм, отделял верхнюю камеру от нижней камеры. Клеткам давали возможность в течение 2-3 ч сцепиться с фильтром и мигрировать через него. Затем фильтр удаляли, клетки на фильтре фиксировали и окрашивали и подсчитывали клетки, которые мигрировали через фильтр. Инкубация с 300 нг/мл rhCTGF увеличивала количество клеток, мигрирующих через фильтр, приблизительно в 5 раз относительно контролей 0,1% FCS. Увеличение миграции, стимулированной CTGF, составило приблизительно 27% хемотаксического эффекта, наблюдавшегося в случае 10% FCS, которая содержит множественные хемотаксические факторы.
Антитела по изобретению испытывали на их способность ингибировать опосредованную CTGF клеточную миграцию, используя описанный выше анализ, за исключением того, что или антитела против CTGF (в концентрации 30 и 300 мг/мл), или объединенный человеческий IgG также добавляли в нижнюю камеру. Подсчитывали 4 поля клеток каждого из 3 отдельных фильтров для каждого образца в каждом анализе. Результаты показаны в табл.2.
Таблица 2 Ингибирование опосредованной CTGF клеточной миграции |
||
Антитело | Клеточная миграция (%) | |
Средняя величина | Стандартное отклонение | |
hIgG | 100 | 10 |
7(30 мкг/мл) | 77 | 13 |
19(30 мкг/мл) | 71 | 14 |
19(300 мкг/мл) | 43 | 12 |
Как видно в табл.2, антитела, которые связываются с CTGF, в пределах эпитопа, определенного mAb1, ингибируют опосредованную CTGF клеточную миграцию зависимым от дозы образом. Антитела группы этого эпитопа представляли собой единственные испытанные антитела против CTGF, которые повторно и воспроизводимо ингибировали вызванную CTGF миграцию.
Различные процессы, такие как ангиогенез, хондрогенез и онкогенез, требуют изменения адгезии и миграции клеток. CTGF связан как с адгезией, так и с миграцией клеток, и способность антител, направленных против CTGF, дифференциально воздействовать на одну активность в сравнении с другой предоставляет разнообразный репертуар лекарственных средств для лечения состояний, связанных с CTGF. Антитела, полученные в настоящем изобретении, ясно демонстрируют дифференциальную активность, относящуюся к нейтрализации активностей CTGF. Как проиллюстрировано ниже, эти способности предоставляют уникальный терапевтический потенциал в этом классе антитела против CTGF.
Пример 6. Легочные расстройства
Внутритрахеальная (IT) инстилляция блеомицина у мышей представляет собой модельную систему, широко используемую для изучения пневмосклероза и для скрининга потенциально желательных антифибротических средств. Антитела по изобретению испытывали на их способность уменьшать вызванный блеомицином пневмосклероз in vivo с использованием процедуры, описанной Wang et al. (2000) Biochem. Pharmacol., 60:1949-1958, следующим образом.
Самцов мышей C57BL/6 методом случайной выборки делили на 2 группы. Мышей наркотизировали изофлюраном и затем интратрахеально инъецировали или одну дозу блеомицина в 0,9% солевом растворе в дозе 0,1 единицы/50 мкл/мышь, или один 0,9% солевой раствор. Каждую группу делили и лечили сразу и затем 1 раз через день, чтобы всего количество вводимых внутрибрюшинно (в/б) доз или солевого раствора, или антитела было равно 7. Через 14 дней после внутритрахеальной инстилляции мышей подвергали эвтаназии кровопусканием из нисходящей брюшной аорты под наркозом и брали легочную ткань.
Содержание коллагена в легких анализировали, измеряя уровень гидроксипролина и пролина, используя способ Palmerini et al. (1985; J. Chromatogr., 339:285-292), за исключением того, что L-азетидин-2-карбоновая кислота (Aldrich) была заменена на 3,4-дигидропролин в качестве внутреннего стандарта. Вкратце, образцы ткани гидролизировали в 6н. HCl в течение 22 ч при 105°С. Образцы подвергали предколоночной дериватизации о-фталальдегидом и затем 4-хлор-7-нитробензофураном (Aldrich) для образования флуоресцентных аддуктов пролина и гидроксипролина. Флюоресцентные аддукты отделяли ВЭЖХ на обращенной фазе с последующим флуорометрическим выявлением.
На фиг.5 показано сравнение результата терапевтического введения солевого раствора (SA), иллюстративного антитела по изобретению, mAb1, и пула антител, специфичных для CTGF (AbsJ) в случае их способности подавлять пневмосклероз после обработки блеомицином. Как видно на фиг.5А, обработка блеомицином (BL+SA) значительно увеличивала содержание гидроксипролина на 168% по сравнению с контрольной группой (SA+SA; 220 ± 15 мкг/легкое). Однако последующее лечение объединенными антителами по изобретению (BL+ AbsJ) показало снижение на 60% содержания гидроксипролина в легких по сравнению с обработкой одним блеомицином. Аналогичным образом последующее лечение mAb1 (BL+mAb1) показало снижение содержания гидроксипролина в легких на 70% по сравнению с одним блеомицином.
Гистологическое исследование легких мышей выявило нормальную легочную паренхиматозную ткань в контрольной группе (не показана). Однако в легких, обработанных блеомицином, отчетливо наблюдалось увеличение областей фиброза (фиг.5В; стрелки). Терапевтическое введение антитела по изобретению после обработки блеомицином показало отчетливое уменьшение фиброза (фиг.5С), хотя в некоторых долях еще проявлялась легкая степень интерстициального фиброза. Таким образом, антитела по изобретению являются терапевтически выгодными при введении пациентам с риском развития легочного расстройства, такого как идиопатический пневмосклероз (IPF).
Пример 7. Почечные расстройства
7.1. Почечная недостаточность
Канальцево-интерстициальный фиброз представляет собой основной компонент нескольких почечных заболеваний, связанных с прогрессированием конечной стадии почечной недостаточности (Sharma et al. (1993) Kidney Int., 44:774-788). Односторонняя обструкция мочеточника (UUO), характеризуемая сниженной почечной функцией и увеличенным интерстициальным фиброзом, использовалась в качестве экспериментальной модели для индукции канальцево-интерстициального повреждения и фиброза (Fern et al.(1999) J. Clin. Invest., 103:39-46).
Мышей наркотизировали изофлюраном и затем выполняли перевязку левого мочеточника в соответствии со способом, описанным Moriyama et al.(1998; Kidney Int., 54:110-119). Мышей лечили сразу после операции и затем 1 раз через день для обеспечения всего семи доз или солевого раствора, или антитела, вводимого внутрибрюшинно (в/б). Через 14 дней после UUO животных наркотизировали и умерщвляли кровопусканием из нисходящей брюшной аорты. И правую, и левую почки отдельно декапсулировали и взвешивали. Половину каждой почки фиксировали в 10% формалине для гистологического исследования (окрашивание трихромом), а другую половину взвешивали и хранили при -70°С для определения содержания гидроксипролина. Содержание гидроксипролина и пролина определяли, как описано выше.
Как видно на фиг.6А, у каждой мыши в результате UUO увеличивалось содержание коллагена в почке приблизительно в 4 раза по данным измерения соотношения между гидроксипролином и пролином в левой почке, подвергнутой обструкции, относительно не подвергнутой обструкции правой почки. Лечение антителом по изобретению, mAb1, привело к статистически значимому зависимому от дозы снижению фиброза подвергнутой обструкции почки (фиг.6А). Однако антитело, которое связывается с С-концевым эпитопом на CTGF, mAb3, не проявило значимого эффекта. Окрашивание трихромом почки после UUO выявляет области увеличенного накопления коллагена (фиг.6В, стрелки), тогда как лечение антителом по изобретению показывает значительное уменьшение окрашивания коллагена в почке, подвергнутой обструкции (фиг.6С).
Альтернативно фиброз почек можно изучать на модели прогрессирующей почечной недостаточности - остаточной почки крысы. Модель, которая включает одностороннюю нефрэктомию на 2/3 в сочетании с субтотальной резекцией второй почки (нефрэктомия на 5/6), вызывает дегенеративные паренхиматозные изменения с хронической почечной недостаточностью в остатке почки, и у животных развивается уремия и проявляется выраженная альбуминурия, гломерулосклероз, интерстициальный фиброз и атрофия канальцев (см. например, Frazer et al. (2000) Vet. Pathol., 37:328-335; и Gandhi et al. (1998) Kidney Int., 54:1157-1165).
Нефрэктомию на 5/6 выполняли по методу Frazier et al. (2000, Vet Pathol 37:328-335). Пятинедельных самцов крыс Sprague-Dawley (Harlan, Indianapolis IN) со средней массой тела 120 г наркотизировали кетамином и ксилазином и проводили разрез краниальной 1/3 и каудальной 1/3 левой почки. Накладывали марлевый тампон кратковременно для обеспечения гемостаза, брюшную полость промывали солевым раствором, 0,2 мл буторфенола и операционную рану зашивали. Через 1 неделю после первоначальной операции вторую почку полностью удаляли.
Крыс делили на группы лечения солевым раствором и антителом, причем лечение начинали через 2 недели после нефрэктомии на 5/6. Солевой раствор или антитело в дозировке 5 мг/кг вводили в/б инъекцией (0,5 мл каждая) 1 раз/3 дня в течение 15 дней (всего 5 инъекций). Образцы крови и мочи брали еженедельно у рандомизированных крыс, подвергнутых нефрэктомии, для слежения за развитием почечного заболевания и для корреляции функциональных почечных нарушений с гистологическими изменениями. Результаты анализа почечного фиброза, анализа мочи и анализов химического состава сыворотки сравнивали у групп через 18 и 28 дней после начала лечения.
Почечный фиброз оценивался независимо двумя патологоанатомами слепым методом; 3 гистологических среза из каждой почки исследовали, используя 3 различных морфологических красителя: гематоксилин/эозин, трихром Masson и пикриновая кислота-сириус красный. Кроме того, выполняли иммуногистохимическое исследование на замороженных срезах для оценки типа отложения коллагена в каждом участке в почке. Выполняли количественную оценку коллагена (соотношение гидроксипролин/пролин), и почечную функцию оценивали, используя и анализ мочи, и химический анализ сыворотки образцов, взятых во время эвтаназии.
Гистологически были отмечены умеренные различия фиброза в остатках почек без лечения и после лечения антителом (фиг.7). Через 3 дня после лечения осуществляли слепую субъективную оценку, имеющую своим результатом величину средней балльной оценки фиброза 12,6 в группе лечения солевым раствором, в сравнении с 10,7 в группе лечения антителом (p<0,05). Статистически значимые различия гистологической степени фиброза у крыс, получавших лечение солевым раствором и антителом, сохранялись через 14 дней после лечения при средней балльной оценке фиброза, равной 16,9 в группе лечения солевым раствором, в сравнении с 14,4 в группе лечения антителом (p<0,05). Количественный анализ содержания гидроксипролина коллагена также продемонстрировал тенденцию к сниженному фиброзу в группе лечения антителом относительно группы лечения солевым раствором, но различие не было статистически значимым.
Между группами лечения были также отмечены качественные различия. Хотя большая часть отложения коллагена в группах лечения антителом ограничивалась кортикомедуллярным и медуллярным интерстицием, фиброз у крыс, получавших лечение солевым раствором, был многоочаговым с диффузным распределением по коре и мозговому слою. Наиболее выраженное патогистологическое различие наблюдалось в случае в количества клубочкового фиброза. У многих крыс из группы лечения солевым раствором имелся гломерулосклероз от умеренной до тяжелой степени с перикапсулярным фиброзом, утолщением мембраны Боумэна, спайками и запустеванием клубочков. В других группах эти изменения были от минимальных до легких, включая получавшие лечение антителом почки крыс. Накопление коллагена визуализировали окрашиванием трихромом Masson и пикриновой кислотой-сириусом красным.
В обеих моделях прогрессирующей почечной недостаточности антитело по изобретению уменьшало разрушение ткани и улучшало почечную функцию. Таким образом, антитела по изобретению обеспечивают терапевтическую выгоду при введении пациентам с риском развития почечного расстройства, такого как гломерулонефрит, нефропатия, вызванная IgA, гломерулосклероз; почечной недостаточности и разрушения канальцев, вызванного токсинами, и т.д.
7.2. Диабетическая нефропатия
Сахарный диабет ведет к недостаточности множества органов, включая, но не ограничиваясь этим, почки, сердце и глаза. Основным компонентом патоморфологического прогрессирования диабетической недостаточности органа является фиброз. Признанной моделью диабетической нефропатии является мышь, несущая мутацию потери функции рецептора лептина (Ob-R, кодируемого геном db). Ключевые признаки, общие между мышью db/db и диабетической нефропатией человека, включают почечную гипертрофию, увеличение клубочков, альбуминурию и расширение мезангиального матрикса.
Антитела по изобретению испытывали, используя следующую модель на мышах db/db диабетической нефропатии. Восьминедельных мышей db/db (Harlan, Indianapolis IN) и их гетерозиготных особей db/+ того же помета лечили внутрибрюшинной инъекцией либо антитела по изобретению (CLN1; см. ниже), либо контрольного человеческого IgG (cIgG). У всех животных за первоначальной инъекцией 300 мкг антитела следовали дозы 100 мкг, вводимые 3 раза в неделю в течение 60 дней. Брали образцы крови и измеряли массу тела в начале и периодически в течение всего периода лечения. Регистрировали также потребление пищи.
К 11-ой неделе существовало четкое различие между животными с диабетом (db/db) и животными без диабета (db/+) в отношении массы тела, уровней глюкозы в крови и потребления пищи. Лечение или антителом по изобретению, или контрольным антителом не оказывало значимого воздействия ни на один из этих показателей. Однако различные способы определения почечной функции показали отчетливое различие между мышами, пораженными и не пораженными сахарным диабетом. Как видно из табл.3, у мышей с диабетом было выявлено увеличение массы почек, клиренса креатинина и скорости выделения альбумина (AER) относительно мышей без диабета. Однако у животных с диабетом, получавших лечение антителом по изобретению, выявлены нормализованные величины всех показателей. Все данные выражены в виде средней величины ± стандартная ошибка средней. Количество мышей в группе (n) находилось в диапазоне от 9 до 15.
Таблица 3. Почечная функция у мышей db/db и db/+ |
||||
Группа животных | Лечение | Масса почки (мг) | Креатинин (мл/ч) | AER (мкг/24 ч) |
db/+ | cIgG | 133,8±5,1 | 2,17±0,29 | 0,30±0,02 |
db/+ | mAb1 | 141,0±4,3 | 2,37±0,19 | 0,23±0,04 |
db/db | cIgG | 207,8±3,9** | 5,39±0,36** | 2,52±0,20** |
db/db | mAb1 | 177,4±4,5* | 2,76±0,31Δ | 0,98±0,09 |
** P<0,01, в сравнении с мышами db/+. * P<0,01, в сравнении с мышами db/+ и P<0,05 с получавшими clgG мышами db/db. |
||||
Δ P<0,01, в сравнении с получавшими clgG мышами db/db. | ||||
P<0,01, в сравнении с мышами db/+ и с получавшими clgG мышами db/db. |
Поскольку CTGF индуцируется при высоком уровне глюкозы и опосредует различные виды активности, включая продукцию ЕСМ в тканях в результате повреждения, например вследствие образования и накопления конечных продуктов гликирования (AGE), и т.д, патологические состояния, связанные с сахарным диабетом, такие как диабетическая нефропатия, можно предотвратить, используя антитела по изобретению.
Пример 8. Глазные расстройства
Увеличенная экспрессия CTGF связана с различными глазными расстройствами, включая пролиферативную витреоретинопатию (PVR), дегенерацию желтого пятна и диабетическую ретинопатию (см. например, (Hinton et al (2002) Eye, 16: 422-428; He et al. (2003) Arch Ophthalmol., 121: 1283-1288 и Tikellis et al. (2004) Endocrinology, 145: 860-866). Была предположена роль CTGF и применение лекарственных средств против CTGF (см. международную публикацию WO 03/049773). Антитела по настоящему изобретению являются представителями класса уникальных терапевтически эффективных лекарственных средств против CTGF для применения в случае глазных расстройствах. Способность антител по настоящему изобретению облегчать осложнения при глазных расстройствах испытывается на моделях глазных заболеваний следующим образом.
8.1. Диабетическая ретинопатия
Модели на животных сахарного диабета, например мыши db/db, описаны в примере 7.2 выше. Любую из этих моделей можно использовать для демонстрации эффективности лечения диабетической ретинопатии с использованием антител по изобретению. Конкретная модель диабетической ретинопатии представлена ниже, при которой животным инъецируют стрептозотоцин (STZ), известный токсин секретирующих инсулин панкреатических β-островковых клеток.
Сахарный диабет вызывается у крыс (например, Long-Evans, Sprague-Dawley и т.д.) инъекцией, например, внутрибрюшинно, стрептозотоцина (STZ), например, в дозе примерно 60-85 мг/кг массы тела. Для улучшения выживаемости крысам можно давать 10% сахарную воду в течение 24 ч и/или 2-4 единицы инсулина в день после инъекции STZ. Различные факторы, включая, например, массу тела, скорость выделения альбумина с мочой, уровень глюкозы в крови, гликированный гемоглобин, артериальное давление и т.д., измеряют, например, через 4, 8 и 12 недель. Одновременно наблюдаются контрольные животные, которым инъецировали один буфер. Одну половину получавших STZ и контрольных крыс дополнительно лечат антителом по изобретению, инъецируемым, например, внутривенно, внутрибрюшинно или интраокулярно. В течение исследования животные имеют неограниченный доступ к пище и воде. Животных умерщвляют через 12 недель и глаза извлекают и исследуют для выявления гистологических изменений.
Уменьшение патоморфологических изменений у животных, получавших лечение антителом, относительно не получавших лечение контролей указывает на терапевтическую эффективность при диабетической ретинопатии. Поскольку CTGF индуцируется высоким уровнем глюкозы и опосредует различные виды активности, включая продукцию ЕСМ в тканях в результате повреждения, например, вследствие образования и накопления конечных продуктов гликирования (AGE), и т.д, то патологические состояния, связанные с сахарным диабетом, такие как диабетическая ретинопатия, можно предотвратить, используя лекарственные препараты против CTGF (см. например, международную публикацию № WO 03/049773). Антитела по настоящему изобретению являются представителями уникального класса терапевтически эффективных лекарственных средств против CTGF для применения при глазных расстройствах, например диабетической ретинопатии.
8.2. PVR (пролиферативная витреоретинопатия)
Клетки пигментного эпителия сетчатки (RPE) кроликов выделяют из глаз взрослых кроликов и культивируют в среде DMEM с добавкой 10% фетальной телячьей сыворотки. Почти слившиеся культуры (обычно при 2-3 пассаже) используют для всех последующих инъекций. Во время инъекции культивированные клетки RPE собирают и суспендируют в PBS приблизительно до концентрации 2,5 × 106 клеток/мл. Приблизительно 0,2 мл водянистой влаги удаляют из каждого глаза кролика-реципиента, используя иглу 25G, и затем клетки RPE инъецируют через склеру в точку на 3 мм позади от лимба непосредственно над зрительным диском и выше него, используя иглу 27G. После инъекции клеток RPE или 0,1 мл PDGF BB (50-150 нг), CTGF (200-400 нг), или PDGF и CTGF в PBS инъецируется через тот же участок входа. Глаз каждого животного без инъекции служит в качестве контроля. Необязательно, CTGF можно дополнительно инъецировать на 7-ой день и/или 14-й день после первой инъекции. Одну половину животных дополнительно лечат антителом по изобретению, инъецируемым, например, внутривенно, внутрибрюшинно или интраокулярно. В зависимости от участка введения антитело может вводиться ежедневно или водиться менее часто, например на 7-й, 10-й, 14-й день и т.д.
Животных исследуют, используя непрямые офтальмоскопические процедуры, для контроля развития и степени PVR, которая классифицируется в соответствии с параметрами, описанными Fastenberg (Fastenberg et al. (1982) Am. J. Ophthalmol., 93:565-572). Затем животных умерщвляют и глаза анализируют с помощью гистологического исследования для выявления и степени формирования мембраны и фиброза. Кроме того, сетчатку и фибротическую мембрану можно взять для измерения содержания коллагена.
Альтернативно PVR вызывают в глазах кролика, используя подсетчаточную инъекцию диспазы, используя адаптированные модель и процедуру, из публикации Frenzel et al. (1998, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 39: 2157-2164). Подсетчаточный пузырь формируется с использованием 50 мл (0,05 Ед) диспазы (Sigma Chemical Co.) в PBS. Одну половину животных дополнительно лечат антителом по изобретению, инъецированным, например, внутривенно, внутрибрюшинно или интраокулярно. Отслоение сетчатки вызывают приблизительно у 75% кроликов, которым проводили инъекцию, не получающих антитело по изобретению через 1 неделю после операции и приблизительно у 100% этих животных через 2 недели после операции. Эпиретинальные мембраны исследуют для определения степени фиброза.
Уменьшение патоморфологических изменений у животных, получавших лечение антителом, относительно не получавших лечение контролей указывает на терапевтическую эффективность при PVR. Поскольку CTGF связан с повреждением ткани в случае моделей PVR, средства против CTGF предложены в качестве лекарственных средств для использования при таких расстройствах (см. например, международную публикацию WO 03/049773). Антитела по настоящему изобретению являются представителями уникального класса терапевтически эффективных лекарственных средств против CTGF для применения при глазных расстройствах, например PVR.
Пример 9. Склероз
Склероз в целом характеризуется диффузным фиброзом, дегенеративными изменениями и сосудистыми аномалиями в коже (склеродермия), суставах и внутренних органах, в частности пищеводе, желудочно-кишечном тракте, легких, сердце и почках.
9.1. Индукция локализованной гранулемы
У новорожденных мышей развивается стойкий локализованный фиброз при введении комбинации полученного у человека TGF-β2 и CTGF подкожной инъекцией в течение 7 последовательных дней (Mori et al. (1999) J. Cell Physiol., 181: 153-159; Shinozaki et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun., 237: 292-297).
Через 1 день после рождения мышей делили на 3 группы лечения и вводили 40 мкл 1% мышиного сывороточного альбумина (MSA), PBS, содержащий или 800 нг TGF-β2, 400 нг CTGF, или оба TGF-β2 и CTGF, подкожной инъекцией в подлопаточную область в течение 7 последовательных дней. Группу комбинации TGF-β2 и CTGF дополнительно делили на 2 группы, где одна группа дополнительно получала 40 мкг антитела по изобретению, mAb1. На 11-й день животных умерщвляли и срезы участков инъекции обрабатывали и окрашивали трихромом Mason для гистологической оценки. Покровные стекла рандомизировались и качественно оценивались в слепом методе тремя учеными; балльная оценка изменялась в диапазоне от 0 (отсутствие изменений) до 4 (фибротическая ткань) на основании степени фиброза или распространения соединительной ткани (см. фиг.8). Затем рассчитывали кумулятивные балльные оценки по каждому покровному стеклу от всех отдельных исследователей и средние величины сравнивали между группами с использованием теста ANOVA (вариационного анализа).
Групповые средние балльные оценки для контроля - носителя, TGF-β2 и комбинации TGF-β2 и CTGF - составили соответственно 0,75, 6,83 и 9,00 (табл.4).
Таблица 4 Гистологическая балльная оценка гранулемы у новорожденных мышей |
|||
Лечение | Средняя балльная оценка | Стандартная ошибка | Размер группы |
Носитель | 0,75 | 0,48 | 4 |
TGF-β2 | 6,83 | 0,65 | 6 |
TGF-β2+rhCTGF | 9,00 | 0,72 | 7 |
TGF-β2+CTGF+mAb1 | 6,17 | 1,40 | 6 |
TGF-β2+CTGF+FG-3025 | 7,50 | 1,50 | 4 |
1 Групповая балльная оценка покровных стекол от 3 разных исследователей. |
Групповая средняя балльная оценка в случае лечения антителом составила 6,17, что является статистически значимым уменьшением по сравнению с соответствующей комбинацией TGF-β2 и CTGF (p<0,05), тогда как лечение направленным на С-конец ненейтрализующим антителом против CTGF, mAb3, не уменьшало фиброз. Таким образом, антитела по настоящему изобретению, в частности, эффективны при уменьшении локального склеротического поражения тканей.
9.2. Системный фиброз новорожденных
Новорожденных мышей делили на группы и ежедневно в течение 21 дня вводили внутрибрюшинные инъекции 300 мкг/кг/день TGF-β, 300 мкг/кг/день CTGF, комбинацию TGF-β и CTGF по 300 мкг/кг/день каждого, или комбинацию TGF-β и CTGF с предшествующим в/б введением 5 мг/кг антитела по изобретению, mAb1, за 30 мин перед лечением фактором роста. Мышата оставались со своими матерями во время курса лечения. На 21-й день животных умерщвляли, основные органы удаляли и определяли общее содержание пролина и гидроксипролина, как описано выше.
Ежедневные инъекции TGFβ вызывали небольшой системный фиброз, в то время как один CTGF не вызывал реакции. Комбинация TGFβ и CTGF вызывала системный фиброз с обширным отложением коллагена в нескольких органах (фиг.10), включая печень, легкие, сердце, желудочно-кишечный тракт, диафрагму и почки; обширные кишечные спайки и увеличение смертности на 25%. Введение антитела по изобретению в сочетании с лечением фактором роста предотвращало фиброз органов (фиг.10) и кишечные спайки и предотвращало смертность. Таким образом, антитела по настоящему изобретению дополнительно эффективны при системном введении в уменьшении склеротического повреждения различных тканей и органов. Результаты, представленные в примерах 10.1 и 10.2, ясно демонстрируют, что антитела по изобретению при местном или системном введении терапевтически эффективны для лечения склеротических состояний.
9.3. Склеродермия
Антитела согласно изобретению можно использовать для уменьшения фиброза, связанного со склеродермией. Способы, которые измеряют степень и тяжесть поражения кожи при склеродермии, известны в данной области (см. например, Rodhan et al. (1979) Arthritis Rheum, 22:130-40; Aghassi et al. (1995) Arch Dermatol., 131: 1160-1166; Brennan et al. (1982) Br. J. Rheumatol., 31: 457-460; Kahaleh et al. (1986) Clin. Exp. Rheumatol., 4: 367-369; Falanga and Bucalo (1993) J. Am. Acad. Derm., 29: 47-51; Seyger et al. (1997) J. Am. Acad. Derm., 37: 793-796; Seyger et al. (1998) J. Am. Acad. Dermatol., 39: 220-225; Black (1969) Br. J. Dermatol., 81: 661-666; Ballou et al. (1990) J. Reumatol., 17: 790-794 и Enomoto et al. (1996) J. Am. Acad. Dermatol., 35: 381-387).
Например, с помощью модифицированной балльной оценки Rodnan кожи измеряется твердость кожи с использованием цифрового твердомера типа OO Rex DD-3 (Rex Gauge Company, Buffalo Grove IL) в стандартизированных блоках твердомера с 0,1 единицы разрешением. Измерения твердомером выполняются во всех одинаковых участках кожи по данным измерения балльной оценкой Rodnan кожи. Выполнение балльной оценки кожи и получение показаний твердомера осуществляют при исходном скрининге, перед введением антитела по изобретению и 1 раз в 3 месяца в течение периодов введения и наблюдения. Каждое измерение повторяется 4 раза, и структурированный анализ дисперсии и расчет коэффициентов корреляции между классами используется для определения вариабельности между повторениями в связи с вариабельностью участков и пациентов (Fleiss (1971) Physiol. Bull., 76:378-382). Методики корреляции также используются для оценки согласованности между балльными оценками кожи и балльными оценками твердомера. И для общих балльных оценок, и для подгрупповых балльных оценок в данную точку времени. Выполняются также корреляционные анализы со сдвигом фаз (например, отношение балльных оценок твердомера в начале исследования к балльным оценкам кожи во время t+3 месяца или t+6 месяца лечения антителом). Может также быть собрана информация об активности заболевания и функциональном состоянии, включая данные о синтезе коллагена (измерения PIIINP). Уменьшение симптомов и/или осложнений склеродермии по данным измерения с использованием любых описанных выше способов демонстрирует терапевтическую эффективность антител настоящего изобретения.
Пример 10. Остеоартрит
Антитела по настоящему изобретению испытывают на одной из следующих моделей для демонстрации терапевтической эффективности при остеоартрите. Для следующих примеров концентрация используемого антитела находится в диапазоне примерно от 0,015 до 15 мг антитела на 1 кг массы тела индивидуума; например считается целесообразной дозировка примерно 5 мг антитела на 1 кг массы тела.
Животных, например, 12-недельных самцов мышей C57BL/6, содержат в стандартных клетках и без ограничения кормят стандартным рационом с водопроводной водой.
10.1 Внутрисуставная инъекция AdCTGF в коленные суставы мышей
Конструкт вектора экспрессии аденовируса, содержащий CTGF (AdCTGF), получают, используя систему ADEASY (Qbiogene, Carlsbad CA), в соответствии с процедурами, поставляемыми изготовителем. Вкратце, инсерцию в плазмиду PSHUTTLE-CMV (Obiogene) полинуклеотида, кодирующего человеческий CTGF полной длины, производят, используя стандартные методики молекулярного клонирования. Затем конструкт pShuttle-CMV-CTGF линеаризуют и совместно трансфецируют плазмидой PADEASY-1 (Qbiogene) в компетентные клетки E.coli BJ-5183 электропорацией. AdCTGF амплифицируется и очищается с использованием процедур, описанных Kim et al. (2001, J. Biol. Chem., 276:38781-38786); пустой аденовирусный вектор используется в качестве контроля. Бляшкообразующие единицы (диапазон 1,0-2,1 × 1010/мл) и вирусные частицы (диапазон 0,9-1,5 × 1012/мл) одинаковы для AdCTGF и контрольного вируса.
Производится внутрисуставная инъекция AdCTGF или контрольного вируса (1 × 107 бляшкообразующих единиц) и вводятся антитела согласно изобретению путем внутрисуставной, внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции. Антитело может инъецироваться в то же самое время, что и введение аденовируса, или, альтернативно, терапия может начинаться перед или после инъекции AdCTGF. Животным, получающим контрольный аденовирус, аналогичным образом инъецируют или антитело против CTGF, или контрольное антитело. Коленные суставы, в которые не производилась инъекция, служат в качестве контролей для воздействий антитела.
Коленные суставы выделяют в различные дни, например через 1, 3, 7, 14 и/или 28 дней после инъекции AdCTGF, декальцифицируют в течение 14 дней в EDTA/поливинилпирролидоне и хранят при -20°С, используя процедуру, описанную в публикации Stoop et al. (2001, Osteoarthritis Cartilage, 9:308-315). Исследуют гистологию суставов, чтобы измерить синовиальную толщину и истощение запасов протеогликана; гибридизацию in situ и иммуногистохимическое исследование выполняют для идентификации экспрессии CTGF, а также экспрессии дополнительных факторов, включая коллаген (типа I и/или III) и т.д. Синовиальную жидкость собирают для определения уровней CTGF, металлопротеиназ и т.д. Эффективность терапии с использованием антител против CTGF подтверждается уменьшением параметров, связанных с остеоартритом, при сравнении с животными, которым инъецировали AdCTGF, получавшими лечение контрольным антителом.
10.2 Внутрисуставная инъекция AdTGFβ в мышиные коленные суставы
Альтернативно антитела можно испытать на модели на животных остеоартрита, описанной Bakker et al. (2001, Osteoarthritis Cartilage, 9:128-136). Например, антитело по изобретению или контрольное антитело можно инъецировать в то же время, после или перед внутрисуставной инъекцией 1 × 107 бляшкообразующих единиц экспрессирующего TGFβ аденовирусного конструкта (AdTGFβ). Коленные суставы, в которые не производилась инъекция, служат в качестве контроля эффектов антитела. В различные дни, например 3, 7, 14 день и т.д., животных из каждой группы умерщвляют и ткани выделяют и обрабатывают. Гистологию суставов анализируют для измерения синовиальной толщины, истощения запасов протеогликана и формирование остеофитов; гибридизацию in situ и иммуногистохимическое исследование выполняют для идентификации экспрессии CTGF, а также экспрессии дополнительных факторов, включая коллаген (типа I и/или III) и т.д. Синовиальную жидкость собирают для определения уровней TGFβ, CTGF, металлопротеиназ и т.д. Эффективность терапии с использованием антител по изобретению подтверждается уменьшением параметров, связанных с остеоартритом, при сравнении с животными, которым инъецировали ACTGF, получавшими лечение контрольным антителом.
10.3 Внутрисуставная инъекция папаина в мышиные коленные суставы
Альтернативно антитела можно испытывать, используя процедуру, описанную van der Kraan et al. (1989, Am. J. Pathol., 135:1001-1014). Внутрисуставная инъекция папаина вызывает формирование остеофитов, фиброз и истощение запасов протеогликана в суставном хряще. Папаиновая модель инициируется инъекцией 1 единицы раствора папаина (Sigma, St.Louis, MO) в правый коленный сустав мышей. Левый коленный сустав каждого животного служит в качестве внутреннего контроля. Антитела по изобретению вводят внутрисуставной, внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной инъекцией в то же самое время, после или перед внутрисуставной инъекции папаина (0,5%/коленный сустав). В различные дни, например 3, 7, 14 день и т.д., животных из каждой группы умерщвляют и ткани выделяют и обрабатывают. Гистологию суставов анализируют для измерения синовиальной толщины, истощения запасов протеогликана и формирование остеофитов; гибридизацию in situ и иммуногистохимическое исследование выполняют для идентификации экспрессии CTGF, а также экспрессии дополнительных факторов, включая коллаген (типа I и/или III) и т.д. Синовиальную жидкость собирают для определения уровней TGFβ, CTGF, металлопротеиназ и т.д. Эффективность терапии с использованием антител против CTGF подтверждается уменьшением параметров, связанных с остеоартритом, при сравнении с животнымих, которым инъецировали папаин и получавшими лечение контрольным антителом.
Пример 11. Клонирование и экспрессия
Хотя следующие примеры иллюстрируют клонирование и экспрессию одного конкретного антитела по изобретению, способы в целом применимы для всех антител, описанных и заявленных в настоящем описании.
Иллюстративное антитело по изобретению, mAb1, было сначала идентифицировано как часть сложного человеческого антитела, секретируемого линией клеток гибридомы (8C12-F10; полученной, как описано в примере 3).
11.1 Клонирование и секвенирование тяжелой цепи mAb1
Матричную РНК изолировали из культуры клеток 8C12-F10, используя набор MICRO-FAST TRACK (Invitrogen), следуя протоколу, предоставленному изготовителем. Затем получали 2 пула кДНК синтезом второй нити, используя набор клеточного цикла кДНК (Invitrogen), следуя протоколу, предоставленному изготовителем, и одну из следующих антисмысловых затравок тяжелой цепи:
AB90 | (TGCCAGGGGGAAGACCGATGG; SEQ ID NO:3) |
m19 H1504R | (GCTGGGCGCCCGGGAAGTATGTA; SEQ ID NO:4) |
Последовательности вариабельной области тяжелой цепи клонировали PCR амплификацией примированного АВ90 пула кДНК, используя затравку АВ90 и одну из серии затравок области V, включая затравки, соответствующие сохраненным секреторным сигнальным последовательностям, которые кодируют 5'-конец соответствующих кодирующих областей, и последовательности каркасной области 1, которые кодируют начало зрелых иммуноглобулинов. Бляшкообразующую единицу ДНК-полимеразы (Stratagene) использовали в соответствии с рекомендуемыми протоколами изготовителя со следующими изменениями: Реакции обычно проводили в общем объеме 50 мкл, содержащем 1 мкл кДНК, по 0,75 мкМ каждой прямой и обратной затравки, по 200 мкМ каждой dNTP и 1 мкл бляшкообразующей единицы ДНК-полимеразы (2,5 единиц на 1 мкл). Использовали программу обратного отсчета термического датчика циклов при первоначальной инкубации при 94°С в течение 2 мин перед добавлением фермента. Затем использовали следующие параметры циклов: 10 циклов при 94°С в течение 45 сек, при 65°С в течение 45 сек и при 72°С в течение 1 мин; 30 циклов при 94°С в течение 45 сек, при 55°С в течение 45 сек и при 72°С в течение 1 мин; и затем 1 цикл при 72°С в течение 10 мин.
Только одна затравка сигнальной последовательности тяжелой цепи, AB87 (ATGGAGTTTGGRCTGAGCTG; SEQ ID NO:5), которая связывается с областями V тяжелой цепи семейства VH3, давала значительный продукт. Продукт PCR нуклеотида 453 клонировали в вектор PCR BLUNT II-TOPO (Invitrogen), проводили скрининг клонов для определения правильного размера вставки и проводили секвенирование трех клонов, соответствующих продуктам PCR. Идентичные последовательности получали для всех трех клонов.
Последовательности константной области тяжелой цепи и области UTR клонировали PCR амплификацией пула кДНК, примированного m19 H1504R. Нуклеотид 601 фрагмента PCR, соответствующий 5'-концу сегмента тяжелой цепи, амплифицировали, используя смысловую затравку VH3-33 29-51F (CGGCGGTGTTTCCATTCGGTGAT; SEQ ID NO:6) и антисмысловую затравку константной области тяжелой цепи m19 H553R (GGGCGCCTGAGTTCCACGACAC; SEQ ID NO:7). Опосредованное топоизомеразой клонирование использовали для клонирования продуктов PCR в вектор PCR-BLUNT II (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя, и затем проводили секвенирование вставки. Аналогичным образом амплифицировали фрагмент PCR нуклеотида 505, используя смысловую затравку m19 H439F (GTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTC; SEQ ID NO:8) и антисмысловую затравку m19 H943R (CCCGCGGCTTTGTCTTGGCATTAT; SEQ ID NO:9), и фрагмент PCR нуклеотида 503, используя смысловую затравку m19 H1002F (CTGGCTGAATGGCAAGGAGTA; SEQ ID NO:10) и антисмысловую затравку m19 H1504R. Оба фрагмента отдельно клонировали в вектор PCR-BLUNT II (Invitrogen) и секвенировали, как описано выше. Четвертый фрагмент PCR тяжелой цепи нуклеотидов 586 амплифицировали, используя смысловую затравку m19 H645F (GGGCACCCAGACCTACATC; SEQ ID NO:11) и антисмысловую затравку m19 H1230R (CTCCGGCTGCCCATTGCTCTCC; SEQ ID NO:12) и проводили прямое секвенирование.
На фиг.11А показана схема упорядочения клонированных фрагментов, которые обеспечили нуклеотидную последовательность полной длины (SEQ ID NO:13), которая кодирует тяжелую цепь mAb1 (SEQ ID NO:14). Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи ближе всего напоминает ген DR-44 зародышевой линии VH3. Хотя было невозможно сказать, какой сегмент D использовался, последовательность mAb1 ближе всего напоминает семейство DH4. Область JH ближе всего соответствует зародышевой линии JH4 и JH5. Константная область тяжелой цепи mAb1 соответствует обозначенной номером доступа ВС016381 в Генном банке, указывая аллотип G1m(3).
11.2 Клонирование и секвенирование легкой цепи mAb1
Матричную РНК выделяли из культуры клеток 8C12-F10, используя набор MICRO-FAST TRACK (Invitrogen), следуя последовательности операций, предоставленной изготовителем. Затем пулы кДНК получали при синтезе второй нити, используя набор клеточного цикла кДНК (Invitrogen), следуя протоколам, предоставленным изготовителем, и одну из следующих затравок антисмысловой кДНК легкой цепи:
AB16 | (CGGGAAGATGAAGACAGATG; SEQ ID NO:15) |
Ck-760R | (AAGGATGGGAGGGGGTCAGG; SEQ ID NO:16) |
Последовательности вариабельной области легкой цепи клонировали амплификацией PCR примированного АВ16 пула кДНК, используя затравку АВ16 и одну из серии затравок области V, включая затравки, соответствующие сохраненным секреторным сигнальным последовательностям, которые кодируют 5'-конец соответствующих колирующих областей, и последовательности каркасной области 1, которые кодируют начало рекомендуемого иммуноглобулина. Бляшкообразующую единицу ДНК-полимеразы (Stratagene) использовали в соответствии с последовательностями операций, рекомендуемыми изготовителем, с описанными выше изменениями и параметрами циклов.
В случае только одной затравки сигнальной последовательности легкой цепи, АВ123 (CCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTG; SEQ ID NO:17), которая связывается с областями V тяжелой цепи семейства VK1, продуцировалось значительное количество продукта. Продукт PCR нуклеотида 408 клонировали в вектор PCR BLUNT II-TOPO (Invitrogen), проводили скрининг клонов для выявления правильного размера вставки и проводили секвенирование трех клонов, соответствующих продуктам PCR. Идентичные последовательности были получены для всех трех клонов.
Последовательности константной области легкой цепи клонировали амплификацией PCR пула кДНК, примированного Ck-760R. Всю кодирующую последовательность и 5'UTR-область легкой цепи амплифицировали, используя смысловую затравку легкой цепи L15 22m (TCAGWCYCAGTCAGGACACAGC; SEQ ID NO:18) и Ck-760R. Нуклеотидный фрагмент 788 клонировали в вектор PCR BLUNT II (Invitrogen) и секвенировали. Полученную плазмиду обозначили 41m6.
На фиг.11В представлена схема упорядочения клонированных фрагментов PCR, которое обеспечило нуклеотидную последовательность полной длины (SEQ ID NO:19), которая кодирует легкую цепь mAb1 (SEQ ID NO:20). Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи ближе всего соответствует областям, кодированным нуклеотидными последовательностями L15 и Jk2 зародышевой линией Vk. Константная область легкой цепи mAb1 идентична известной генной последовательности иммуноглобулина каппа легкой цепи человеческой зародышевой линии (Whitehurst et al. (1992) Nucleic Acids Res 20:4929-4930).
11.3 Продукция конструктов экспрессии тяжелой и легкой цепи
кДНК тяжелой цепи mAb1 полной длины генерировали перекрывающим распространением PCR в два этапа из описанных выше и показанных на фиг.11А продуктов PCR тяжелой цепи. Два 5'-продукта PCR комбинировали с дистальными затравками VH3-33 29-51F и m19 H943R в реакции перекрывающего распространения PCR для получения одного фрагмента из 991 нуклеотида. Аналогичным образом два 3'-продукта PCR комбинировали с дистальными затравками VH3-33 29-51F и m19 H943R в реакции перекрывающего распространения PCR для получения фрагмента из 860 нуклеотидов. Эти продукты реакции распространения PCR были очищены на геле и амплифицированы вместе с использованием дистальных затравок VH3-33 29-51F и m19 H1504R для генерирования кодирующей последовательности кДНК нуклеотида 1407 (остатки 441-1847 SEQ ID NO:13) тяжелой цепи mAb1 полной длины.
кДНК тяжелой цепи затем клонировали в вектор PCR-BLUNT II TOPO (Invitrogen) для получения плазмиды 43а4. Кодирующую область тяжелой цепи mAb1 затем субклонировали расщеплением плазмиды 43а4 рестрикционными эндонуклеазами BamH1 и Xbal с последующим лигированием иссеченной вставки в вектор экспрессии PCDNA5-FRT (Invitrogen), который был предварительно переварен рестрикционными эндонуклеазами BamH1 и Nhe. Последовательность вставки полученной плазмиды экспрессии, 44а1, верифицировали перед осуществлением аналогичного субклонирования в обратной ориентации в вектор PBK-CMV (Clontech) для получения плазмиды 47а4, и в вектор pCEP-Pu (E.Kohfeldt, Max-Planck-Institut fur Biochemie), вектор, полученный из вектора рСЕР4 (Invitrogen), для получения плазмиды 49а1.
кДНК нуклеотида 708 (остатки 415-1122 SEQ ID NO:19), кодирующего легкую цепь mAb1 полной длины, иссекали из плазмиды 41m6, описанной выше, используя рестрикционные эндонуклеазы HindIII и Xho I, и лигировали в вектор PCDNA5-FRT (Invitrogen), который был предварительно расщеплен рестрикционными эндонуклеазами HindIII и Xho I, для получения экспрессионной плазмиды млекопитающих 42b2. Перед осуществлением аналогичного субклонирования в обратной ориентации в вектор PBK-CMV (Clontech) для получения плазмиды 47b3 и в вектор pCEP-Pu (E.Kohfeldt, Max-Planck-Institut fur Biochemie) для получения плазмиды 49b1 верифицировали последовательность вставки плазмиды 42b2.
11.4 Трансфекция и экспрессия конструктов цепи антитела
Клетки COS7 трансфецировали плазмидами 44а1 (тяжелая цепь mAb1) и 42b2 (легкая цепь mAb1) как путем отдельной, так и совместной трансфекции, используя стандартные процедуры. Кондиционированные культуральные среды анализировали для выявления присутствия антитела, как описано в примере 4 (выше). Только в среде клеток, совместно трансфецированных как 44а1, так и 42b2, экспрессировалось человеческое антитело, обладающее активностью связывания CTGF, что было измерено ELISA с использованием описанных выше процедур. Антитело, идентифицируемое в настоящем описании как CLN1, продуцируемое совместно трансфецированными клетками COS7, связывается с N-концевой половиной CTGF с аффинностью 0,8 нМ.
CLN1 также экспрессировалось у генетически модифицированных клеток яичников китайских хомячков (СНО). Линия клеток СНО, экспрессирующих антитело CLN1, депонирована в Американскую коллекцию типовых культур (Manassas VA) 20 мая 2004 г. и обозначена номером доступа PTA-6006. Линии клеток можно оптимизировать и экспрессию антитела можно усилить, используя различные методики, известные в данной области, например, путем генной амплификацией, как описано Wigler et al. (1980; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:3567-3570), с модификациями, как описано у Ringold et al. (1981; J. Mol. Appl. Genet., 1: 165-175), Gasser et al (1982; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 6522-6526) и Kaufman et al. (1985; Mol. Cell Biol., 5:1750-1759).
Пример 12: Взаимодействие CTGF с TGFβ
Антитела по изобретению специфически связываются с областями CTGF, определяемыми остатками, кодируемыми экзоном 3 (фиг.1В; нуклеотиды 418-669 SEQ ID NO:1). Эта область охватывает аминокислоты 97-180 SEQ ID NO:2 и включает домен фон Виллебранда типа С (аминокислоты 103-164 SEQ ID NO:2) и эпитоп mAb1 (аминокислоты 134-158 SEQ ID NO:2). Abreu et al. (2002, Nat. Cell Biol., 4:599-604) сообщают о том, что домен, соответствующий домену VWC CTGF, важен для взаимодействия между CTGF и TGFβ или BMP-4 и что указанное взаимодействие модулирует активность TGFβ или BMP-4. Следующие эксперименты демонстрируют, что области, кодируемые экзоном 3, необходимы и достаточны для связывания CTGF с TGFβ, и что антитела по изобретению могут блокировать взаимодействие между CTGF и TGFβ.
Взаимодействие между CTGF и TGFβ анализировали с использованием следующей процедуры. Ячейки 96-луночного планшета MAXISORP ELISA (Nalge Nunc) покрывали на ночь при 4°С 10 мкг/мл либо CTGF, фрагментом CTGF, кодируемым экзоном 3, либо фрагментом CTGF, кодируемым экзоном 5, в PBS; или только PBS. Все лунки затем блокировали 1% BSA в PBS с последующей инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре в 50 мкл раствора, содержащего TGFβ в концентрации 0, 1, 3,3, 10, 33, 100, 333 или 1000 нг/мл, и мышиное моноклональное антитело MAB612 или MAB1835 (R&D Systems, Minneapolis MN) в концентрации 100, 300 или 1000 нг/мл в PBS, 0,05% Tween-20. MAB1835 распознает бычий, мышиный и человеческий TGF-β1 и -β2 и блокирует связывание TGFβ с мышиными тимоцитами. МАВ612 распознает TGF-β2, но не ингибирует активность TGFβ. Лунки промывали PBS, 0,05% Tween-20 и затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в растворе, содержащем конъюгированное щелочной фосфатазой козье антитело против мышиного IgG, разведенное в PBS, 0,05% Tween-20. Планшеты снова промывали и добавляли п-нитрофенилфосфат (PNPP) в 1 М этаноламине, 1 мМ MgSO4, pH 9,8, лунки инкубировали в течение подходящего времени для проявления, и реакцию затем прекращали добавлением NaOH. Измеряли поглощение при λ, равной 405 нм, используя спектрофотометр.
На фиг.12 показано, что CTGF и фрагмент CTGF, кодируемый экзоном 3, способны в эквивалентной степени взаимодействовать с TGFβ, в то время как фрагмент CTGF, кодируемый экзоном 5, не проявлял какой-либо связывающей активности в отношении TGFβ. Интересно, что антитело против TGFβ МАВ612 было также способно выявлять связанный с CTGF TGFβ зависимым от дозы образом, но нейтрализующее антитело, МАВ1835, не позволяло выявлять связанный с CTGF TGFβ в любой испытанной концентрации (данные не показаны). Это свидетельствует о том, что CTGF конкурирует с МАВ1835 за связывание с TGFβ.
Антитела против CTGF были испытаны для выявления их способности блокировать связывание между CTGF и TGFβ. Как показано на фиг.12, антитела согласно изобретению, проиллюстрированные mAb4 и mAb1, блокировали связывание TGFβ как с CTGF, так и с фрагментом CTGF, кодируемым экзоном 3, в то время как антитело против CTGF, направленное на С-концевой фрагмент CTGF, не блокировало связывания. Эти результаты подтверждают механизм действия, при котором антитела согласно изобретению специфически блокируют взаимодействие между CTGF и TGFβ и потенциально между CTGF и другими членами суперсемейства TGFβ.
Различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые представлены и описаны в настоящем описании, станут очевидными для специалистов в данной области из предшествующего описания. Такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
Все ссылки, приведенные здесь, включены в полном объеме в качестве ссылки.
Claims (83)
1. Выделенное антитело или его биологически активный фрагмент, который специфически связывается по меньшей мере с частью области CTGF человека, соответствующей аминокислотам 103-164 SEQ ID NO: 2, или с ортологичной областью CTGF, полученного от других видов, и которое способно нейтрализовать биологическую активность CTGF.
2. Антитело по п.1, где антитело связывается по меньшей мере с частью области CTGF человека, соответствующей аминокислотам 134-158 SEQ ID NO: 2, или с ортологичной областью CTGF, полученного от других видов.
3. Антитело по п.1, где антитело связывается по меньшей мере с частью области CTGF человека, соответствующей аминокислотам 143-154 SEQ ID NO: 2, или с ортологичной областью CTGF, полученного от других видов.
4. Антитело по п.1, где биологическая активность представляет собой способность клетки продуцировать внеклеточный матрикс.
5. Антитело по п.4, где продукция внеклеточного матрикса происходит in vivo.
6. Антитело по п.4, где продукция внеклеточного матрикса происходит ех vivo.
7. Антитело по п.1, где антитело модулирует взаимодействие полипептида CTGF и секретируемого или мембранного кофактора, что приводит к нейтрализации биологической активности.
8. Антитело по п.7, где кофактором является член семейства TGF-β.
9. Антитело по п.8, где кофактором является TGFβ-1.
10. Антитело по п.8, где кофактором является ВМР-4.
11. Антитело по п.1, где биологическая активность представляет собой клеточную миграцию.
12. Антитело по п.1, где антитело уменьшает фиброз у индивидуума.
13. Антитело по п.12, где фиброз возникает в ткани, выбранной из группы, состоящей из эпителиальной, эндотелиальной и соединительной ткани.
14. Антитело по п.12, где фиброз возникает в органе, выбранном из группы, состоящей из почки, легкого, печени, сердца и кожи.
15. Антитело по п.1, где аффинность антитела к CTGF составляет примерно 10-9 М.
16. Антитело по п.1, которое представляет собой одноцепочечное антитело.
17. Антитело по п.1, которое представляет собой гуманизированное антитело.
18. Антитело по п.1, которое представляет собой химерное антитело.
19. Антитело по п.1, которое представляет собой мультивалентное антитело.
20. Антитело по п.1, где антитело является гликозилированным.
21. Антитело по п.1, где антитело является негликозилированным.
22. Антитело по п.1, где антитело конъюгировано с цитотоксическим агентом или ферментом.
23. Антитело по п.1, где антитело является меченым и может быть выявлено.
24. Антитело по п.23, где выявляемая метка представляет собой фермент, флуоресцентную группу, хемилюминесцентную группу, биотин, авидин или радиоизотоп.
25. Антитело по п.1, где антитело представляет собой моноклональное антитело.
26. Антитело по п.1, где антитело продуцируется клеточной линией, депонированной в коллекции АТСС под номером РТА-6006.
27. Антитело по п.1, где биологически активные фрагменты представляют собой фрагменты Fab, F(ab)2 или Fv.
28. Выделенное антитело, которое способно нейтрализовать биологическую активность CTGF, включающее полипептиды, выбранные из группы, состоящей из
(a) иммуноглобулина с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14;
(b) иммуноглобулина с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 20;
(c) фрагмента иммуноглобулина, содержащего вариабельный домен (а) или (b); и
(d) консервативных вариантов (а), (b) или (с).
29. Антитело по п.28, где вариабельный домен включает вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, соответствующий аминокислотам 1-167 SEQ ID NO: 14.
30. Антитело по п.28, где вариабельный домен включает вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, соответствующий аминокислотам 1-136 SEQ ID NO:20.
31. Антитело по п.28, где биологическая активность представляет собой способность клетки продуцировать внеклеточный матрикс.
32. Антитело по п.28, где биологическая активность включает стимуляцию клеточной миграции.
33. Антитело по п.31, где продукция внеклеточного матрикса происходит in vivo.
34. Антитело по п.31, где продукция внеклеточного матрикса происходит ex vivo.
35. Антитело по п.31, где антитело модулирует взаимодействие полипептида CTGF и клеточного рецептора, что приводит к нейтрализации биологической активности.
36. Антитело по п.31, где антитело модулирует взаимодействие полипептида CTGF и секретируемого или мембранного кофактора, что приводит к нейтрализации биологической активности.
37. Антитело по п.36, где кофактором является член семейства TGF-β.
38. Антитело по п.37, где кофактором является TGFβ-1.
39. Антитело по п.37, где кофактором является ВМР-4.
40. Антитело по п.28, где антитело гликозилировано.
41. Антитело по п.28, где антитело не гликозилировано.
42. Антитело по п.28, где антитело конъюгировано с цитотоксическим агентом или ферментом.
43. Антитело по п.28, где антитело является меченым и может быть выявлено.
44. Антитело по п.43, где выявляемая метка представляет собой фермент, флуоресцентную группу, хемилюминесцентную группу, биотин, авидин или радиоизотоп.
45. Антитело по п.28, содержащее тяжелую цепь иммуноглобулина с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14, и легкую цепь иммуноглобулина с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 20.
46. Антитело по любому из пп.1-45, где антитело или его фрагмент кодируются генетическим материалом, первоначально полученным у человека.
47. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики связанного с CTGF расстройства, содержащая эффективное количество антитела по любому из предыдущих пунктов в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.
48. Фармацевтическая композиция по п.47, дополнительно содержащая второе лекарственное средство.
49. Способ нейтрализации биологической активности CTGF, предусматривающий приведение в контакт антитела по любому из пп.1-46 и образца в условиях, подходящих для образования комплекса, содержащего антитело и полипептид CTGF.
50. Способ по п.49, где биологическая активность представляет собой способность клетки продуцировать внеклеточный матрикс.
51. Способ по п.49, где антитело модулирует взаимодействие полипептида CTGF и клеточного рецептора.
52. Способ по п.49, где антитело модулирует взаимодействие полипептида CTGF и секретируемого или мембранного кофактора.
53. Способ по п.52, где кофактором является член семейства TGF-β.
54. Способ по п.53, где кофактором является TGFβ-1.
55. Способ по п.53, где кофактором является ВМР-4.
56. Способ по п.49, где нейтрализация происходит in vitro.
57. Способ по п.49, где нейтрализация происходит у индивидуума in vivo.
58. Способ по п.57, где индивидуум предрасположен к развитию или у которого диагностирована гипертония, гипергликемия, сахарный диабет, инфаркт миокарда, артрит и локальное или системное воспаление.
59. Способ по п.57, где индивидуум предрасположен к развитию или у которого диагностировано клеточное пролиферативное расстройство.
60. Способ по п.59, где клеточное пролиферативное расстройство представляет собой ангиогенез, атеросклероз, глаукому или рак.
61. Способ по п.60, где указанный рак представляет собой острый лимфобластический лейкоз, дерматофиброму, рак молочной железы, десмоплазию карциномы молочной железы, ангиолипому, ангиолейомиому, десмопластический рак, рак предстательной железы, рак яичников, рак толстой и прямой кишки, рак поджелудочной железы, рак желудочно-кишечного тракта или рак печени.
62. Способ по п.57, где индивидуум предрасположен к развитию или у которого диагностировано фибротическое расстройство.
63. Способ по п.62, где фибротическое расстройство представляет собой идиопатический пневмосклероз, диабетическую нефропатию, диабетическую ретинопатию, остеоартрит, склеродермию, хроническую сердечную недостаточность или цирроз печени.
64. Способ лечения или профилактики связанного с CTGF расстройства у индивидуума, страдающего таким расстройством, или имеющего риск его развития, предусматривающий введение индивидууму антитела по любому из пп.1-46.
65. Способ по п.64, где расстройство представляет собой гипертонию, гипергликемию, сахарный диабет, инфаркт миокарда, артрит и локальное или системное воспаление.
66. Способ по п.64, где расстройство представляет собой клеточное пролиферативное расстройство.
67. Способ по п.66, где клеточное пролиферативное расстройство представляет собой ангиогенез, атеросклероз, глаукому или рак.
68. Способ по п.67, где указанный рак включает острый лимфобластический лейкоз, дерматофиброму, рак молочной железы, десмоплазию карциномы молочной железы, ангиолипому, ангиолейомиому, десмопластический рак, рак предстательной железы, рак яичников, рак толстой и прямой кишки, рак поджелудочной железы, рак желудочно-кишечного тракта или рак печени.
69. Способ по п.64, где индивидуум предрасположен к развитию или у которого диагностировано фибротическое расстройство.
70. Способ по п.69, где фибротическое расстройство представляет собой идиопатический пневмосклероз, диабетическую нефропатию, диабетическую ретинопатию, остеоартрит, склеродермию, хроническую сердечную недостаточность или цирроз печени.
71. Химерное антитело, которое способно нейтрализовать биологическую активность CTGF, содержащее вариабельную область, полученную из вариабельной области антитела по любому из пп.1-46, и константную область, полученную из другого источника.
72. Химерное антитело по п.71, где константная область получена из константной области иммуноглобулина человека.
73. Лекарственное средство, содержащее антитело по любому из пп.1-46 для лечения индивидуума с расстройством, выбранным из группы, состоящей из идиопатического пневмосклероза, диабетической нефропатии, хронической сердечной недостаточности и цирроза печени.
74. Лекарственное средство, содержащее антитело по любому из пп.1-46 для лечения индивидуума, предрасположенного к расстройству вследствие состояния, выбранного из группы, состоящей из гипертонии, сахарного диабета, инфаркта миокарда, артрита и локального или системного воспаления.
75. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая антитело по п.1, содержащая последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(a) полинуклеотидной последовательности, кодирующей последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO: 14;
(b) полинуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, соответствующей аминокислотам 1-167 SEQ ID NO: 14;
(c) последовательности SEQ ID NO: 13, кодирующей тяжелую цепь иммуноглобулина; и
(d) нуклеотидной последовательности 1-501 SEQ ID NO: 13, кодирующей вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина; или полинуклеотидной последовательности, содержащей последовательность, выбранную из группы, состоящей из
(а) полинуклеотидной последовательности, кодирующей последовательность легкой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO: 20;
(b) полинуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, соответствующей аминокислотам 1-136 SEQ ID NO: 20;
(c) последовательности SEQ ID NO: 19; кодирующей легкую цепь иммуноглобулина; и
(d) нуклеотидной последовательности 1-408 SEQ ID NO: 19, кодирующей вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина.
76. Рекомбинантный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность по п.75, функционально связанную с векторной последовательностью, которая содержит репликационную и транскрипционную контрольные последовательности.
77. Рекомбинантный полинуклеотид по п.76, где полинуклеотид кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 20.
78. Рекомбинантный полинуклеотид по п.77, где полинуклеотид содержит SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 19.
79. Клетка-хозяин, продуцирующая антитело по п.1, трансфецированная рекомбинантным полинуклеотидом по п.75.
80. Клетка-хозяин, продуцирующая антитело по п.1, включающая клетку, совместно трансфецированную полинуклеотидом, кодирующим последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO: 14, и полинуклеотидом, кодирующим последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 20, и которая продуцирует функциональное антитело с характеристиками, по существу, такими же как у антитела, продуцируемого клеточной линией с номером доступа РТА-6006 в АТСС.
81. Клеточная линия, продуцирующая антитело по п.1, с номером доступа РТА-6006 в АТСС.
Приоритет по пунктам:
04.06.2003 по пп.1-19, 22-25, 28-40, 43-46, 48-80.
01.06.2004 по пп.20-21, 22-27, 41-42, 47, 81.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US47559803P | 2003-06-04 | 2003-06-04 | |
US60/475,598 | 2003-06-04 | ||
US10/858,186 US7405274B2 (en) | 2003-06-04 | 2004-06-01 | Connective tissue growth factor antibodies |
US10/858,186 | 2004-06-01 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2005141492A RU2005141492A (ru) | 2007-07-20 |
RU2330861C2 true RU2330861C2 (ru) | 2008-08-10 |
Family
ID=33493433
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2005141492/13A RU2330861C2 (ru) | 2003-06-04 | 2004-06-02 | Антитела к ростовому фактору соединительной ткани |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (9) | US7405274B2 (ru) |
EP (3) | EP2338914A1 (ru) |
JP (2) | JP5624707B2 (ru) |
KR (1) | KR101244113B1 (ru) |
CN (2) | CN103539858A (ru) |
AT (1) | ATE538136T1 (ru) |
AU (1) | AU2004245514B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0410963B8 (ru) |
CA (1) | CA2526509C (ru) |
DK (1) | DK1631591T3 (ru) |
ES (1) | ES2379662T3 (ru) |
HK (1) | HK1094336A1 (ru) |
IL (1) | IL172328A (ru) |
NO (1) | NO336451B1 (ru) |
NZ (1) | NZ543522A (ru) |
RU (1) | RU2330861C2 (ru) |
WO (1) | WO2004108764A2 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2764919C2 (ru) * | 2016-06-13 | 2022-01-24 | Дзе Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл | Оптимизированные гены и экспрессионные кассеты cln1, и их применение |
RU2794975C2 (ru) * | 2017-12-15 | 2023-04-26 | Медицинише Хохшуле Ганновер | Усовершенствованное соединение для лечения сердечной недостаточности |
Families Citing this family (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000035939A2 (en) * | 1998-12-14 | 2000-06-22 | University Of Miami | Connective tissue growth factor fragments and methods and uses thereof |
US7115390B1 (en) * | 1998-12-14 | 2006-10-03 | Fibrogen, Inc. | Connective tissue growth factor fragments and methods and uses thereof |
NZ549784A (en) | 2004-02-11 | 2008-06-30 | Fibrogen Inc | Inhibitors of CTGF the manufacture of a medicament for the treatment of diabetic nephropathy |
AU2005244154C1 (en) | 2004-04-28 | 2010-07-01 | Fibrogen, Inc. | Treatments for pancreatic cancer |
WO2006122046A2 (en) * | 2005-05-05 | 2006-11-16 | Fibrogen, Inc. | Vascular disease therapies |
DE602006021600D1 (de) * | 2005-09-29 | 2011-06-09 | Fibrogen Inc | Verfahren zur senkung des blutdrucks |
JP2008295328A (ja) | 2007-05-30 | 2008-12-11 | Fujifilm Corp | 卵巣癌の検出方法、及び抑制方法 |
EP2949752B1 (en) | 2008-09-22 | 2017-12-20 | RXi Pharmaceuticals Corporation | Reduced size self-delivering rnai compounds |
WO2010042201A1 (en) * | 2008-10-07 | 2010-04-15 | Fibrogen, Inc. | Methods for treatment of focal segmental glomerulosclerosis |
WO2010042202A1 (en) * | 2008-10-07 | 2010-04-15 | Fibrogen, Inc. | Methods for treatment of podocyte injury |
EP2221387A1 (en) * | 2009-02-19 | 2010-08-25 | Université de la Méditerranée | Fibrosis susceptibility gene and uses thereof |
US20110110953A1 (en) * | 2009-06-29 | 2011-05-12 | Dennis Keith Bishop | Compound and method for treatment of chronic transplant rejection |
US8771692B2 (en) * | 2009-07-02 | 2014-07-08 | Fibrogen, Inc. | Methods for treatment of muscular dystrophy |
US20120244169A1 (en) * | 2009-11-06 | 2012-09-27 | Fibrogen, Inc. | Treatment for Radiation-Induced Disorders |
EP3578183B1 (en) | 2010-03-24 | 2021-09-08 | Phio Pharmaceuticals Corp. | Rna interference in ocular indications |
WO2011119887A1 (en) | 2010-03-24 | 2011-09-29 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Rna interference in dermal and fibrotic indications |
US20140134181A1 (en) * | 2010-11-05 | 2014-05-15 | Kenneth E. Lipson | Treatment Method For Lung Remodeling Diseases |
WO2012100262A1 (en) | 2011-01-21 | 2012-07-26 | Fibrogen, Inc. | Therapeutic method using anti - ctgf antibody |
US20140065162A1 (en) * | 2011-11-08 | 2014-03-06 | Fibrogen, Inc. | Compositions and Methods for Treating Brain Tumors |
MX345019B (es) * | 2011-12-22 | 2017-01-11 | Astellas Pharma Inc | Nuevo anticuerpo ctgf antihumano. |
WO2013108869A1 (ja) * | 2012-01-20 | 2013-07-25 | 国立大学法人岡山大学 | がんの治療又は予防剤 |
WO2013148159A1 (en) * | 2012-03-30 | 2013-10-03 | Fibrogen Inc | Therapeutic methods for peritoneal carcinomatosis |
EP2844291B1 (en) | 2012-05-03 | 2019-02-13 | Fibrogen, Inc. | Methods for treating idiopathic pulmonary fibrosis |
BR112016006426A2 (pt) * | 2013-09-26 | 2017-08-01 | Galderma Sa | método de tratamento de cicatrizes cutâneas atróficas |
US9631013B2 (en) | 2014-01-28 | 2017-04-25 | Fibrogen, Inc. | Therapeutic method for pancreatic cancer |
US10900039B2 (en) | 2014-09-05 | 2021-01-26 | Phio Pharmaceuticals Corp. | Methods for treating aging and skin disorders using nucleic acids targeting Tyr or MMP1 |
CN104740628B (zh) * | 2015-02-12 | 2017-09-26 | 西安交通大学医学院第一附属医院 | 用于治疗肝纤维化的结缔组织生长因子嵌合疫苗及其应用 |
CA2986926A1 (en) * | 2015-06-15 | 2016-12-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for diagnosing and treating affective disorders |
ES2844899T3 (es) * | 2015-12-10 | 2021-07-23 | Fibrogen Inc | Métodos para el tratamiento de enfermedades de las neuronas motoras |
CN112118857A (zh) * | 2018-05-17 | 2020-12-22 | 株式会社橄榄生物科技 | 用于预防或治疗视网膜疾病的包含ccn5作为活性成分的药物组合物 |
WO2020009248A1 (ja) * | 2018-07-04 | 2020-01-09 | 京都府公立大学法人 | 眼組織の線維化抑制用組成物 |
CN109402127B (zh) * | 2018-09-29 | 2021-12-10 | 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 | 一组与结缔组织生长因子特异性结合的高亲和力核酸适配体及其应用 |
CN109824777A (zh) * | 2019-03-15 | 2019-05-31 | 辽宁何氏医学院 | 一种具有抑制玻璃体视网膜纤维化病变作用的单克隆抗体及其制备方法和应用 |
US20200369759A1 (en) | 2019-05-23 | 2020-11-26 | Fibrogen, Inc. | Methods of treatment of muscular dystrophies |
CA3142092A1 (en) * | 2019-06-04 | 2020-12-10 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | Anti-connective tissue growth factor antibody and application thereof |
EP3821946A1 (en) * | 2019-11-12 | 2021-05-19 | Université de Strasbourg | Anti-claudin-1 monoclonal antibodies for the prevention and treatment of fibrotic diseases |
CN115286713A (zh) * | 2020-10-27 | 2022-11-04 | 温州医科大学 | 一种以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体及其应用 |
MX2023006383A (es) * | 2020-12-03 | 2023-06-14 | Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd | Composicion farmaceutica que contiene anticuerpo anti-factor de crecimiento de tejido conjuntivo. |
CN115645525B (zh) * | 2022-12-14 | 2023-04-14 | 北京大学第三医院(北京大学第三临床医学院) | Ctgf中和抗体在制备防治绝经后骨关节炎的药物中的应用 |
Family Cites Families (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US587670A (en) | 1897-08-03 | Combined high-pressure throttle and reducing valve | ||
US4376110A (en) | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
AU633698B2 (en) | 1990-01-12 | 1993-02-04 | Amgen Fremont Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
US5877397A (en) | 1990-08-29 | 1999-03-02 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
EP1400536A1 (en) | 1991-06-14 | 2004-03-24 | Genentech Inc. | Method for making humanized antibodies |
US5408040A (en) * | 1991-08-30 | 1995-04-18 | University Of South Florida | Connective tissue growth factor(CTGF) |
US5770209A (en) | 1991-08-30 | 1998-06-23 | University Of South Florida | Acceleration of wound healing using connective tissue growth factor |
US5837258A (en) * | 1991-08-30 | 1998-11-17 | University Of South Florida | Induction of tissue, bone or cartilage formation using connective tissue growth factor |
EP0746609A4 (en) | 1991-12-17 | 1997-12-17 | Genpharm Int | NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES |
EP0783243B1 (en) | 1994-09-15 | 2001-02-21 | Fred Nordberg | Electric fence device |
US5876730A (en) | 1997-08-07 | 1999-03-02 | Childrens Hospital Research Foundation | Heparin-binding growth factor (HBGF) polypeptides |
JPH11180895A (ja) | 1997-09-12 | 1999-07-06 | Masaharu Takigawa | 血管新生阻害剤 |
US6562618B1 (en) * | 1997-12-25 | 2003-05-13 | Japan Tobacco, Inc. | Monoclonal antibody against connective tissue growth factor and medicinal uses thereof |
JP4537507B2 (ja) * | 1997-12-25 | 2010-09-01 | アムジェン インコーポレイテッド | 結合組織増殖因子に対するモノクローナル抗体及びその医薬用途 |
CN1326361A (zh) | 1998-09-08 | 2001-12-12 | 亨利福特保健系统公司 | 通过修饰、调节及抑制结缔组织生长因子来检查、预防和治疗肾脏疾病的方法 |
US6348329B1 (en) | 1998-11-06 | 2002-02-19 | Fibrogen, Inc. | Nucleic acids encoding rat connective tissue growth factor (CTGF) and methods of use |
WO2000035939A2 (en) * | 1998-12-14 | 2000-06-22 | University Of Miami | Connective tissue growth factor fragments and methods and uses thereof |
US20040142325A1 (en) * | 2001-09-14 | 2004-07-22 | Liat Mintz | Methods and systems for annotating biomolecular sequences |
US20030113816A1 (en) * | 2001-09-18 | 2003-06-19 | Weitz Stephen L. | Methods of assaying connective tissue growth factor |
EP1463531B1 (en) | 2001-12-11 | 2011-09-28 | Fibrogen, Inc. | Methods for inhibiting ocular processes |
US20190127456A1 (en) * | 2017-10-31 | 2019-05-02 | Fibrogen, Inc. | Methods of treating idiopathic pulmonary fibrosis |
-
2004
- 2004-06-01 US US10/858,186 patent/US7405274B2/en active Active
- 2004-06-02 BR BRPI0410963A patent/BRPI0410963B8/pt active IP Right Grant
- 2004-06-02 CA CA2526509A patent/CA2526509C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-06-02 CN CN201310140880.8A patent/CN103539858A/zh active Pending
- 2004-06-02 AU AU2004245514A patent/AU2004245514B2/en not_active Expired
- 2004-06-02 DK DK04753822.8T patent/DK1631591T3/da active
- 2004-06-02 KR KR1020057022909A patent/KR101244113B1/ko active IP Right Grant
- 2004-06-02 EP EP10184854A patent/EP2338914A1/en not_active Withdrawn
- 2004-06-02 CN CN2004800221456A patent/CN1829740B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2004-06-02 JP JP2006515028A patent/JP5624707B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2004-06-02 WO PCT/US2004/017080 patent/WO2004108764A2/en active Search and Examination
- 2004-06-02 RU RU2005141492/13A patent/RU2330861C2/ru active
- 2004-06-02 NZ NZ543522A patent/NZ543522A/en unknown
- 2004-06-02 EP EP04753822A patent/EP1631591B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-06-02 AT AT04753822T patent/ATE538136T1/de active
- 2004-06-02 ES ES04753822T patent/ES2379662T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-06-02 EP EP10184591A patent/EP2322549A1/en not_active Withdrawn
-
2005
- 2005-12-01 IL IL172328A patent/IL172328A/en active IP Right Grant
-
2006
- 2006-01-03 NO NO20060027A patent/NO336451B1/no unknown
-
2007
- 2007-02-07 HK HK07101399.8A patent/HK1094336A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-06-09 US US12/157,262 patent/US7871617B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-11-10 US US12/927,243 patent/US20110091468A1/en not_active Abandoned
-
2012
- 2012-03-08 JP JP2012051770A patent/JP5753506B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2012-11-30 US US13/691,356 patent/US9034643B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2015
- 2015-04-20 US US14/690,727 patent/US20160024198A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-05-25 US US15/164,615 patent/US20160257740A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-10-10 US US16/156,873 patent/US20190023778A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-09-08 US US17/014,852 patent/US20210230259A1/en not_active Abandoned
-
2022
- 2022-12-20 US US18/068,977 patent/US20240076364A1/en active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
РОЙТ А. и др. ИММУНОЛОГИЯ. -М.: Мир, 2000, с.153-155. * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2764919C2 (ru) * | 2016-06-13 | 2022-01-24 | Дзе Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл | Оптимизированные гены и экспрессионные кассеты cln1, и их применение |
US11504435B2 (en) | 2016-06-13 | 2022-11-22 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Optimized CLN1 genes and expression cassettes and their use |
RU2794975C2 (ru) * | 2017-12-15 | 2023-04-26 | Медицинише Хохшуле Ганновер | Усовершенствованное соединение для лечения сердечной недостаточности |
RU2819228C2 (ru) * | 2019-06-04 | 2024-05-15 | Цзянсу Хэнжуй Медицин Ко., Лтд. | Антитело против фактора роста соединительной ткани и его применение |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20240076364A1 (en) | Connective tissue growth factor antibodies | |
WO2004108764A9 (en) | Connective tissue growth factor antibodies | |
CA2355976C (en) | Vascular endothelial cell growth factor antagonists and uses thereof | |
KR101314014B1 (ko) | 신규한 항-plgf 항체 | |
KR101482483B1 (ko) | 인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타(hptp베타)에 결합하는 항체 및 그의 용도 | |
CN117582494A (zh) | 抑制有需要的受试者的血管发生的方法 | |
JP2002525094A (ja) | Tie2アンタゴニスト抗体 | |
JP2019507137A (ja) | 抗−c−MET抗体及びその用途 | |
ZA200509233B (en) | Connective tissue growth factor antibodies | |
MXPA05012947A (en) | Connective tissue growth factor antibodies |