KR20060030032A - 결합조직 생장 인자 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CTGF에 결합하는 항체에 관계한다. 이 항체는 특히 섬유증과 연관된 생물학적 활성이 관여한 CTGF의 부분에 결합한다. 본 발명은 또한 폐, 간, 심장, 피부, 신장을 포함하는 국소 및 전신 섬유증 질환을 포함하여 CTGF 연관된 질환을 치료하기 위해 이 항체를 이용하는 방법을 제공한다.

Description

결합조직 생장 인자 항체{CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR ANTIBODIES}

본 출원은 2003년 6월 4일자로 출원된 미국 예비 출원 No. 60/475,598의 잇점을 청구하며, 이 문헌은 참고문헌으로 첨부된다.

발명의 분야

본 발명은 결합 조직 생장 인자(CTGF)에 결합하는 항체에 관계한다. 이 항체는 특히 다양한 질환과 연관된 생물학적 활성에 관계하는 CTGF 부분에 관계한다.

결합 조직 생장 인자( CTGF )

CTGF는 사람 배꼽 정맥 내피 세포 배양 배지로부터 처음 분리된 36kD의 시스테인이 풍부한 헤파린 결합, 분비된 당단백질이다(See e. g. , Bradham et al. (1991) J Cell Biol 114: 1285-1294; Grotendorst and Bradham, U. S. Patent No. 5,408,040.) CTGF는 CCN(CTGF, Cyr61, Nov) 단백질(분비된 당단백질) 패밀리에 속하는데, 이는 혈청-유도된 초기발현단계(immediate early gene) 유전자산물 Cyr61, 가상 온코겐(putative oncogene) Nov, ECM-연합된 단백질 FISP-12, src-유도성 유전자 CEF-10, Wnt-유도성 분비 단백질 WISP-3, 항-증식성 단백질 HICP/rCOP을 포함한다(Brigstock (1999) Endocr Rev 20: 189-206; O'Brian et al. (1990) Mol Cell Biol 10: 3569-3577; Joliot et al. (1992) Mol Cell Biol 12: 10-21; Ryseck et al. (1990) Cell Growth and Diff 2: 225-233; Simmons et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 1178-1182 ; Pennica et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A, 95: 14717-14722 ; and Zhang et al. (1998) Mol Cell Biol 18: 6131- 6141). CCN 단백질은 전체 아미노산 함량의 10%이상으로 구성된 38개 시스테인 잔기가 보존되어 있고, N- 및 C-말단 모메인이 모듈 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. CTGF의 모듈(modular) 구조에는 N-말단 도메인에 인슐린-유사 생장 인자 결합 단백질(IGF-BP)와 von Willebrand's 인자(VWC)의 보존 모티프와 C-말단 도메인에 트롬보스포딘(TSPI) 및 시스테인-노트 모티프가 포함된다.

TGF-β-1, -2, -3를 포함하는 형질변환 생장 인자 베타(Transforming Growth Factor beta(TGFß)) 슈퍼패밀리, 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein (BMP))-2, 악티빈(activin) 뿐만아니라 덱사메타손, 트롬빈, 맥관내피생장인자(VEGF), 앙지오스테신 II을 포함하는 다양한 다른 조절 물질; 그리고 혈당과다증 및 고혈압에 의해 CTGF 발현이 유도된다(See, e. g., Franklin (1997) Int J Biochem Cell Biol 29: 79-89; Wunderlich (2000) Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 238 : 910-915; Denton and Abraham (2001) Curr Opin Rheumatol 13: 505-511; and Riewald (2001) Blood 97: 3109-3116; Riser et al. (2000) J Am Soc Nephrol 11: 25-38; and International Publication No. WO 00/13706). CTGF 발현의 TGFß 자극은 신속하고 장기적이나 지속적인 이용을 요구하지는 않는다(Igarashi et al. (1993) Mol Biol Cell 4: 637-645). TGFβ에 의해 강화된 CTGF의 발현은 CTGF 프로모터에 있는 DNA 조절 요소를 통하여 전사 활성에 관계한다 (Grotendorst et al. (1996) Cell Growth Differ 7: 469-480; Grotendorst and Bradham, U. S. Patent No. 6,069, 006; Holmes et al. (2001) J Biol Chem 276: 10594-10601).

CTGF는 α1(I) 콜라겐, α5 인테그린, 피르보넥틴 mRNA의 정상-상태(steady-state)를 증가시키고 뿐만아니라 배양물에서 다양한 세포형태의 증식 및 주화성(chemotaxis)를 포함하는 세포 프로세스를 촉진시키는 것으로 관찰되었다(See e. g. , Frazier et al. (1996) J Invest Dermatol 107: 406-411 ; Shi-wen et al. (2000) Exp Cell Res 259: 213-224; Klagsburn (1977) Exp Cell Res 105: 99-108; Gupta et al. (2000) Kidney Int 58: 1389-1399; Wahab et al. (2001) Biochem J 359 (Pt 1): 77-87 ; Uzel et al. (2001) J Periodontol 72: 921-931; and Riser and Cortes (2001) Ren Fail 23: 459-470). 신생 생쥐에 CTGF를 피하 주사하면 육아(granulation) 조직의 국소 침작이 된다. 유사하게, TGFβ를 피하 주사하면 육아조직 형성이 시작되고, 국소 섬유아세포에 CTGF mRNA를 높은 수준으로 유도한다. 또한, TGFβ 및 CTGF로 복합 또는 연속 처리하면 더 영속적인 육아종이 형성된다(Mori et al. (1999) J Cell Physiol 181: 153-159). 따라서, CTGF는 TGFβ에 의해 유도되는 부분적 효과, 특히 세포외 매트릭스(ECM)의 생산 및 침착을 중개하는 것으로 보인다. 또한, CTGF에 반응하는 능력 또는 CTGF 반응 정도는 세포가 “능력”을 가질 수 있게 하는 TGFβ에 의해 제공되는 프라이밍(priming) 자극에 의존할 수 있다(International Publication No. WO 96/08140.)

상호작용인자의 과다는 조직 조직화를 조절하는 것을 특징으로 하지만, 골 형성, 상처 치유, 세포외 매트릭스(ECM), 섬유형성, 종양형성, 맥관형성 조절에서 CTGF의 역할에 대한 의견이 분출하고 있다. 예를 들면, 간경변, 폐 섬유증, 염증성 장 질환, 경화성 피부 및 켈로이드(keloids), 결합직 섬유증생(desmoplasia), 동맥경화반(-죽상경화성플라그-atherosclerotic plaques)에서 CTGF 발현이 상승된 것을 관찰하였다(Abraham et al. (2000) J Biol Chem 275: 15220-15225; Dammeier et al. (1998) Int J Biochem Cell Biol 30: 909-922; diMola et al. (1999) Ann Surg 230 (1) : 63-71; Igarashi et al. (1996) J Invest Dermatol 106: 729-733; Ito et al. (1998) Kidney Int 53: 853-861; Williams et al. (2000) J Hepatol-32 : 754-761; Clarkson et al. (1999) Curr Opin Nephrol Hypertens 8 : 543-548; Hinton et al. (2002) Eye 16: 422-428; Gupta et al. (2000) Kidney Int 58: 1389-1399; Riser et al. (2000) J Am Soc Nephrol 11: 25-38).

또한 사구체신염(glomerulonephritis), IgA 신증, 초점성 분절성 사구체경화증(focal and segmental glomerulosclerosis), 당뇨병성신증에서도 CTGF가 상향 조절되었다(See, e. g. , Riser et al. (2000) J Am Soc Nephrol 11: 25-38). 만성 세뇨관 간질 손상 부위에서 CTGF를 발현하는 세포의 숫자가 증가되었으며, 손상의 정도에 따라 CTGF 수준이 달라졌다(Ito et al. (1998) Kidney Int 53: 853-861). 또한, 신장 실질 조직의 상처 및 경화와 연관된 다양한 신장 질환에서 사구체 및 tubulointerstium에서 CTGF 발현이 증가되었다. 간 섬유증, 심근경색 및 폐 섬유증도 CTGF의 수준 상승과 연관이 있었다. 예를 들면, 특발성 폐 섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis)(IPF) 환자에서, 생검 및 기관지폐포 세척 유체 세포에서 CTGF 가 상당히 상승되었다(Ujike et'al. (2000) Biochem Biophys Res Commun 277: 448-454; Abou-Shady et al. (2000) Liver 20: 296-304; Williams et al. (2000) J Hepatol 32: 754-761; Ohnishi et al. (1998) J Mol Cell Cardiol 30: 2411-22; Lasky et al. (1998) Am J PhysioT 275 : L365-371; Pan et al. (2001) Eur Respir J 17: 1220-1227; and Allen et al. (1999) Am J Respir Cell Mol Biol 21: 693-700). 따라서, CTGF는 상기에서 설명한 것과 같은 질환에서 유효한 치료요법적 표적이다.

이와 같은 다양한 질환과 CTGF의 연합에 대해서는 이미 설명된 바가 있고, CTGF 조절을 통한 질환 치료에 대해서도 설명된 바 있다(See, e. g., Grotendorst and Bradham, U. S. Patent No. 5, 783, 187; International Publication No. WO 00/13706; and International Publication No. WO 03/049773). 단클론항체를 이용하여 생장인자, 사이토킨 및 세포 표면 수용체의 조절이 가능하고, 몇 가지 치료요법적 단클론 항체가 승인되었거나 또는 개발중에 있다(See, e. g. , Infliximab (Remicade; Maini et al. (1998) Arthritis Rheum 41: 1552-1563 ; Targan et al. (1997) N Engl J Med 337: 1029-1035); Basiliximab (Simulect) and Daclizumab (Zenapax) (Bumgardner et al. (2001) Transplantation 72: 839-845 ; Kovarik et al. (1999) Transplantation 68: 1288-1294); and Trastuzumab (Herceptin; Baselga (2001) Ann Oncol 12 Suppl 1: S49-55.))

CTGF에 대한 항체가 생성되었고, 맥관형성을 저해하는 등의 in vivo 에서 효과가 증명되었다(See, e. g. , Grotendorst and Bradham, U. S. Patent No. 5,408, 040; International Publication No. WO 99/07407; and Shimo et al. (2001) Oncology 61: 315-322). 또한, CTGF의 모듈 성질은 특이적 생물학적 활성과 연관된 도메인과 구별되는 것으로 보인다. 예를 들면, CTGF의 N-말단 절반은 세포 분화를 자극하고, ECM 생산을 자극하는 것으로 보이나, C-말단 절반은 세포 증식을 촉진시킨다(See, e. g., International Publication Nos. WO 00/35936 and WO 00/35939; and Brigstock and Harding, U. S.Patent No. 5,876, 70.) 이는 CTGF의 상이한 부분에 해당되는 항체가 CTGF의 생물학적 활성을 조절하는데 있어서 상이한 효과를 발휘한다는 것을 설명한다(See, e. g., International Publication Nos. WO 00/35936 and WO 00/35939). 현재, 원하는 효과를 만드는 항-CTGF 항체와 다중 효과 또는 비-중화 효과를 만드는 항체와 분명하게 구별할 수는 없다(See, e.g., International Publication No. WO 99/33878.)

질환에서 CTGF의 활성을 효과적으로 중화시키는 물질이 이분야에서는 분명히 필요하다. 항체, 특히 단클론 항체가 치료요법제에 적절한 특이성 및 약리역학적 프로파일을 제공하고, CTGF의 특이적 활성을 표적으로 하는 중화항체가 이 분야에 필요하며, CTGF-연관된 질환, 가령, 특발성 폐 섬유증(IPF)와 같은 폐 질환; 당뇨병성 신증, 사구체경화증등과 같은 신장 질환; 망막증, 황반변성과 같은 안과 질환을 포함하는 질환의 치료에 이용될 수 있을 것이다.

발명의 요약

본 발명은 항체, 특히 CTGF 폴리펩티드의 N-말단 단편에 있는 부분에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체 또는 이의 일부분을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명의 항체는 사람 CTGF(SEQ ID NO : 2)의 일부분, 아미노산 103부터 아미노산 164(SEQ ID NO : 21)에서 제공되는 부분에 특이적으로 결합하는, 좀더 특이적으로는 아미노산 135부터 아미노산 157( (SEQ ID NO : 22)에 결합하는, 좀더 특이적으로는 아미노산 142부터 아미노산 154(SEQ ID NO : 25)에 결합하는 또는 다른 종에서 유도된 CTGF의 대응하는(orthologous) 부분에 결합한다. 특정 구체예에서, 항체는 ATCC 기탁 번호 PTA-6006(2004년 5월 19일에 기탁됨)에 의해 확인되는 세포주(Chinese Hamster Ovary Cells 132.14.2A5.3.3)에 의해 생성되는 항체와 같은 특이성을 가진다. 특정 구체예에서, 항체는 하기에서 설명하는 것과 같이 mAb1에 실질적으로 동일하다. 좀더 적절하게는 항체는 하기에서 설명하는 CLN1에 실질적으로 유사하다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 CTGF 폴리펩티드에 상기 언급된 항체와 경쟁적으로 결합한다.

한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 14로 구성된 이뮤노글로블린 중쇄 서열, SEQ ID NO: 14의 가변 부분으로 구성된 이뮤노글로블린 중쇄 서열, SEQ ID NO: 20으로 구성된 이뮤노글로블린 경쇄 서열, SEQ ID NO: 20의 가변 도메인으로 구성된 이뮤노글로블린 경쇄 서열 또는 이의 보존성 변이체로 구성된 군으로 이루어진 항체 또는 이의 일부분을 제공한다. 특정 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO : 14의 아미노산 1부터 아미노산 167까지의 이뮤노글로블린 중쇄 가변 도메인으로 구성된다. 또 다른 특정 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO : 20의 아미노산 1 내지 아미노산 136의 이뮤노글로블린 경쇄 가변 도메인으로 구성된다. 특정 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO : 14의 이뮤노글로블린 중쇄 서열 및 SEQ ID NO : 20의 이뮤노글로블린 경쇄 서열로 구성된다. 이 구체예내에서, 본 발명은 CLN1의 항체를 특별히 제공하거나 또는 최소한 CLN1의 항원 결합 부분 잔기로 구성된 이의 일부분을 제공한다.

한 특징에서, 본 발명의 항체는 다클론 항체이다. 다른 특징에서, 항체는 단클론 항체이다. 특정 구체예에서, 항체는 인간화 단클론 항체, 좀더 적절하게는 사람 단클론 항체이다. 상기 언급된 항체들중 임의 것에는 추가적으로 다양한 글리코실화를 포함하고, 이는 항체를 생산하는 세포에 의해 또는 제공되거나 합성에 의해 변형될 수도 있고, 또는 항체는 글리코실화되지 않을 수도 있다. 항체는 선택적으로 페길화(pegylated)되거나 또는 혈장 반감기를 연장시키기 위해 유사하게 변형될 수 있다. 다양한 구체예에서, 본 발명은 항체의 단편을 제공하는데, 특히, 단편은 Fab, F (ab)₂, 또는 Fv 단편이 될 수 있다.

특정 구체예에서, 항체 또는 이의 일부분은 클론된 세포주에 의해 만들어진다. 세포주는 단클론 항체 생산에 이용되는 임의 동물 모델에서 유도할 수 있는데, 생쥐, 염소, 닭등에서 유도할 수 있으나, 이에 국한시키지는 않는다. 특히, 세포주는 생쥐에서 유도될 수 있다. 생쥐는 항체 생산에 사용되는 표준 생쥐가 될 수 있는데, 예를 들면, BALB/C, 또는 특정 이소타입, 이디오타입 또는 종-특이적 단클론 항체를 생산하기 위해 최적화된 또는 개발된 유전자전이된 변형 생쥐 종족이 될 수 있다. 한 구체예에서, 세포주는 mAb1을 생산하고 분비하는 하이브리도마 세포주이다. 다른 구체예에서, 세포주는 mAb1에 실질적으로 등가의 성질을 가지는 항체 또는 이의 일부분을 생산하고 분비한다. 또 다른 구체예에서, 세포주는 CLN1에 실질적으로 등가의 성질을 가지는 항체 또는 이의 일부분을 생산하고 분비한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 ATCC 기탁 번호 PTA-6006(2004년 5월 19일에 기탁됨)에 의해 확인되는 Chinese Hamster Ovary Cells 132.14.2A5.3.3 세포주를 제공한다.

또 다른 특징에서, 항체 또는 이의 일부분은 사람이 아닌 유전자 전이 동물, 특히 사람 항체를 생산할 수 있는 사람이 아닌 유전자 전이 포유류에서 유도된다. 동물은 생쥐, 닭, 소, 염소 등을 포함하나 이에 국한되지 않는 임의 종이 될 수 있다. 사람의 CTGF 단편, 예를 들면, SEQ ID NO : 21, 또는 좀더 특이적으로 SEQ ID NO : 22 또는 사람이 아닌 종에서 유도한 CTGF의 대응 부분으로 사람이 아닌 유전자 전이 포유류를 면역주사하여 이와 같은 항체를 얻을 수 있을 것이다. 특정 구체예에서, 항체는 SEQ ID NOs : 23부터 26 또는 사람이 아닌 종에서 유도된 CTGF의 대응 부분으로 구성된 군에서 선택된 CTGF의 단편으로 사람이 아닌 유전자 전이된 동물을 면역주사하여 얻을 수 있을 것이다. 다른 구체예에서, 항체는 상기 언급한 CTGF 단편의 기능적 등가체를 이용하여 유전자 전이된 생쥐를 면역주사하여 얻었다.

"CTGF상의 부분에 특이적으로 결합하는"은 선형 아미노산 서열에 의해 정의되는 또는 CTGF의 폴리펩티드의 일부에 3차원 모양에 의해 정의되는 CTGF상의 특정 부분에 결합 특이성을 가진다는 것을 의미한다. 결합 특이성은 CTGF의 일부에 대한 항체 친화력이 다른 관련된 폴리펩티드에 대한 이들의 친화력보다 실질적으로 큰 것을 말한다. "실질적으로 큰 친화력“이란 다른 관련된 폴리펩티드의 친화력과 비교하였을 때 CTGF의 일부분에 대한 친화력이 상당히 증가된다는 것을 의미한다. 바람직하게는 다른 단백질에 비해 CTGF의 특정 부분에 대한 친화력이 적어도 1.5배, 2배, 5배, 10배, 100배, 103배, 104배, 105배, 106배 또는 그 이상이 되는 것을 말한다.

적절하게는, 친화성 크로마토그래피, 면역침번 또는 in vitro 결합 검사 예를 들면 방사능면역검사(RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검사(ELISA), 형광 활성화된 세포 소팅(FACS) 분석을 통하여 결합 친화력을 측정한다. 좀더 적적하게는 하기에서 설명하는 것과 같이, RIA 또는 친화성 크로마토그래피를 이용하여 결합 친화력을 얻을 수 있다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 항체는 하기에서 설명하는 것과 같이 mAb1과 동일한 또는 그이상의 친화력을 가지는데, 이는 Scatchard analysis of Munson and Pollard (1980, Anal Biochem 107: 220) 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 항체 친화력은 항체상에 있는 단일 항원-결합부위와 항원상에 있는 단일 에피토프사이에 전체 비-공유 상호작용 강도로 정의할 수 있다. 친화력은 다음과 같이 연합 상수(Ka)를 측정하여 계산한다.

이때, [Ab]는 항체상의 자유 항원 결합 부위의 농도이고; [Ag] 는 자유 항원의 농도이고;[Ab Ag]는 항체상에 항원이 차지하게 되는 항원 결합 부위의 농도이 고; Kd는 항체-항원 복합체의 해리 상수이다. 적절하게는 본 발명의 항체는 cCTGF에 대해 Kd=10^{- 8}이상, 적절하게는 10^{- 9}이상, 더욱 바람직하게는 치료요법적으로 이용하기 위해서는 10^{- 10}이상의 친화력을 가진다. 유익하게는 본 발명의 항체는 mAb1의 친화력(Kd≤10^-9)과 유사한 또는 그 이상의 친화력을 가진다. 그러나, mAb1과 에피토프 결합을 공유하나 mAb1보다 친화력이 낮은(예를 들면 더 높은 Kd) 항체도 본 발명에서 구체화되었고, 여기에서 설명하는 것과 같이 다양한 검사 및 진단에 유용하게 이용될 수도 있다. 이와 같은 항체는 특히 하기에서 설명하는 것과 같이 항원에 대한 요구가 강한 경우에 치료요법적으로 추가 이용할 수도 있다.

본 발명의 항체는 단가, 이가 또는 다가 항체가 될 수도 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 이가 또는 다가 항체이다. 본 발명의 임의 항체는 항체 요구성(avidity)을 개선시키기 위해 조작될 수 있는데, 예를 들면, 에피토프-결합 부위를 단일 항체 구조체에 복합시켜, 트리바디(tribody)로 만들수도 있다. 본 발명에 따른 항체는 단일 쇄 항체가 될 수도 있다.

본 발명의 항체는 다른 종에서 CTGF에 대한 적절한 친화력을 보여줄 수 있을때 유용한데 예를 들면, 이들 종에서 질병의 치료 및 예방에 유용할 수 있다. 예를 들면, 개과(canine) CTGF에 적절한 Kd를 가지는 본 발명의 항체는 개에서 CTGF-연관 질환을 치료하는데 이용할 수 있다. mAb1과 같은 종간(cross- species) 친화력을 가지는 본 발명의 항체는 다양한 동물 모델에서 CTGF 연관 질환을 연구하기 위한 연구 도구로써 유용하다. 다른 측면에서, 항체 및 이의 일부분은 사람에서 원래 유래된 유전 물질에 의해 인코드된다. 항체는 파아지 디스플레이 기술(phage display techniques)을 이용하여 배양물에서 세포에 의해 만들어질 수 있고 또는 사람에서 유도된 이뮤노글로블린 유전자를 포함하는 사람이 아닌 유전자전이 동물내에서 생산될 수도 있다.

또는, 본 발명은 상기에서 설명하는 것과 같은 본 발명의 항체의 임의 일부분과 다른 소스에서 유도된 단백질로 구성된 재조합 구조체를 제공한다. 특히, CTGF의 N-말단상에 부분에 특이적으로 결합하는 단클론 항체에서 유도된 가변 부분과 다른 소스로부터 유도된 항상 부분으로 구성된 키메라 항체를 포함하는 구체예도 고려할 수 있다. 가변 부분은 본 발명에서 정의하는 임의 항체에서 유도될 수 있는데, SEQ ID NO : 2의 아미노산 97내지 아미노산 180의, 더욱 특이적으로는 SEQ ID NO : 2의 아미노산 103 내지 아미노산 164 또는 SEQ ID NO : 2의 아미노산 134 내지 아미노산 158의, 좀더 특이적으로는 SEQ ID NO : 2의 아미노산 143 내지 아미노산 154의 또는 다른 종에서 유도된 CTGF의 상응 부분에 결합하는 사람 CTGF상의 부분에 결합하는 항체를 특이적으로 포함한다. 항상 부분은 다른 소스로부터 유도될 수도 있다. 일부 구체예에서, 항상 부분은 사람 이뮤노글로블린의 항상 부분에서 유도된다.

본 발명은 또한 상시에서 설명하는 항체의 임의의 것을 제공하는데, 이때 항체는 자체 또는 다른 물질과 함께 감지가능한 시그날을 제공할 수 있는 라벨링 물질을 추가로 포함한다. 이와 같은 라벨링 물질은 효소, 형광 물질, 화학적 발광 물질, 바이오틴, 아비딘, 방사능동위원소로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 국한시키지는 않는다. 본 발명은 또한 세포독성 물질 또는 효소가 추가 포함된 상기에서 설명하는 임의 항체를 제공한다.

다른 구체예에서, 상기에서 설명하는 항체에는 CTGF와 연관된 적어도 한가지 활성을 추가로 중화시킨다. CTGF와 연합된 이와 같은 활성에는 세포 이동 자극, 섬유아세포 또는 내피세포의 분화, 세포외 매트릭스 형성 및 리모델링에 관여하는 단백질 예를 들면 타입 I, II, III, IV등을 포함하나 이에 국한시키지 않은 단백질의 발현 유도, 피브로넥틴에서 선택된다.

한 구체예에서, 항체는 ex vivo 검사에서 세포 이동을 특이적으로 저해한다. 적절하게는 항체는 Boyden 쳄버 검사에서 평활근 세포의 CTGF-자극된 화학주성(chemotactic) 이동을 저해한다. 예를 들면, 상기에서 설명하는 세포 이동 검사에서, 본 발명의 항체는 반복적이고, 재생적으로 CTGF-유도된 이동을 저해한다. 다양한 구체예에서, 항체는 동물 모델에서 특이적으로 섬유증을 감소시킨다. 적절하게는 항체는 폐 및 신장 섬유증의 동물 모델에서 섬유증 발생을 저해한다. 예를 들면, 항체는 폐 하이드록시프롤린(콜라겐) 축적 및 조직의 조직학적 검사에 의해 결정한 바에 따르면 60-70%정도 쥐에서 블레오마이신-유도된 폐 섬유증을 감쇠시킨다. 또한, 항체는 하기에서 설명하는 것과 같이 일측상 수뇨관 폐쇄(UUO)후에 생쥐 및 들쥐의 잔류 신장 모델(5/6 신장적출)에서 콜라겐 축적을 감소시킨다.

다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 CTGF 폴리펩티드와 세포 수용체, 또는 CTGF 폴리펩티드 및 분비된 또는 막-연합된 공인자간에 상호작용을 조절하여, CTGF의 생물학적 활성을 중화시킨다. 공인자는 임의 단백질, 탄수화물, 지질이 될 수 있으며, 특정 구체예에서, 공인자는 생장인자의 TGF-ß 패밀리 구성요소 예를 들면, TGF-ß, BMP-4등이 될 수 있다.

다른 측면에서, 항체는 개체에서 섬유증을 감소시킨다. 다양한 구체예에서, 개체는 조직 또는 기관이 된다. 다른 구체예에서, 개체는 동물, 적절하게는 포유류, 가장 적절하게는 사람이 된다. 개체가 조직인 경우에, 본 발명은 내생 조직 및 ex vivo 조직 예를 들면 이식 조직, 배양물에서 생장된 조직을 모두 고려할 수 있다. 다양한 구체예에서, 조직은 상피, 내피, 결합조직으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 개체가 기관(organ)인 경우에, 본 발명에서는 신장, 폐, 간, 눈, 심장, 피부로 구성된 군에서 선택된 기관을 특히 고려할 수 있다. 적절한 구체예에서, 개체가 동물인 경우에, 특히 들쥐, 토끼, 소, 양, 돼지, 쥐과동물, 말, 영장류를 포함하는 포유류가 된다. 가장 적절한 구체예는 개체가 사람이다.

특정 구체예에서, CTGF-연관 질환을 가지는 또는 가질 위험이 있는 개체에서 CTGF-연관 질환을 치료 또는 예방하는데 항체가 이용된다. 이와 같은 질환에는 급성 임파성 백혈병, 피부섬유아종, 유방암, 유방암종, 신경교종, 신경교아세포종, 평활근 조직상 악성종양, 섬유종(fibrosarcoma), 결합조직형성(desmoplasia), 맥관지방종(angiolipoma), 혈관평활근종(angioleiomyoma), 결합조직형성암, 전립선, 난소, 결장, 췌장, 위장, 간암 및 다른 종양 생장 및 전이등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. CTGF- 연관 질환에는 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 신장섬유증, 사구체경화증, 안구섬유증, 골관절염, 피부경화증, 심장 및 간 경화증을 포함하나 이에 국한되지 않는 다양한 섬유증 질환이 포함된다. 섬 유증은 신장, 폐, 간, 심장, 피부에서 선택되나 이에 국한되지 않은 기관을 포함하는 기관 또는 상피, 내피, 결합 조직에서 선택된 조직에서 발생될 수 있다. 다른 구체예에서, CTGF-연관된 질환은 화학물질 또는 생물학적 물질, 염증 반응, 자가면역반응, 외상, 외과술등에 노출되는 것을 포함하나 이에 국한되지 않은 임의 개시 인자에 의해 발생될 수 있다.

CTGF-연관된 질환에는 혈당과다증 및 고혈압으로 인한 질환이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 이와 같은 질환은 당뇨 및 비만등으로 인하여 발생될 수 있는데, 신증, 망막증, 심장맥관 질환등이 포함된다.

따라서, 다양한 구체예에서, 본 발명은 개체에서 CTGF-연관된 질환 치료 또는 예방에 이용될 수 있는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 CTGF-연관된 질환 치료를 위해 약물 제조에 이와 같은 항체를 이용하는 것을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체와 CTGF 폴리펩티드를 접촉시키는 것으로 구성된 CTGF와 연관된 활성을 중화시키는 방법을 제공하여, 상기에서 설명하는 것과 같은 CTGF의 생물학적 활성을 중화시킨다. 생물학적 활성은 세포 이동 자극, 세포외 매트릭스의 생산을 포함하나 이에 국한시키지 않은 임의 CTGF 활성이 될 수 있다. 다양한 구체예에서, 중화는 in vitro에서 발생한다. 또 다른 구체예에서, 중화는 개체의 in vivo에서 일어난다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 치료를 요하는 환자에서 CTGF 연관된 질환을 치료하는데 상기에서 설명하는 항체를 이용하여 방법을 제공하는데, 이때 방법은 환자에게 항체 또는 이의 약학 조성물을 투여하고, 질환을 치료하는 것으로 구성된 다. 개체는 CTGF-연관 질환을 가지는 것으로 진단을 받은 또는 세포외 매트릭스를 과다하게 생산하는 질환과 같은 이 질환으로 의심가는 환자가 될 수 있다. 특정 측면에서, CTGF-연합된 질환은 암 또는 섬유증 질환에서 선택될 수 있다. 암에는 급성 임파성 백혈병, 피부섬유아종, 유방암, 유방암종, 신경교종, 신경교아세포종, 평활근 조직상 악성종양, 섬유종(fibrosarcoma), 결합조직형성(desmoplasia), 맥관지방종(angiolipoma), 혈관평활근종(angioleiomyoma), 결합조직형성암, 전립선, 난소, 결장, 췌장, 위장, 간암을 포함하나 이에 국한되지 않으며, 섬유증 질환은 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 신장섬유증, 사구체경화증, 안구섬유증, 황반변성, 골관절염, 피부경화증, 만성심부전 및 간 경화증, 심장 경화증등을 포함하나 이에 국한시키지 않는다. 다른 구체예에서, CTGF-관련 질환은 화학물질 또는 생물학적 물질, 염증 반응, 자가면역반응, 외상, 외과술등에 노출되는 것을 포함하나 이에 국한되지 않은 임의 개시 인자에 의해 발생될 수 있다. CTGF-연관된 질환에는 혈당과다증 및 고혈압으로 인한 질환이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 이와 같은 질환은 당뇨 및 비만등으로 인하여 발생될 수 있는데, 신증, 망막증, 심장맥관 질환등이 포함된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기에서 설명하는 항체와 적어도 한가지 다른 성분으로 구성된 조성물을 제공한다. 성분에는 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질등을 포함하는 임의 화합물, 분자, 물질이 포함된다. 추가적으로, 성분은 다양한 용매, 염, 다른 캐리어, 부형제가 포함될 수도 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 상기에서 설명하는 항체와 용매, 안정화제 또는 부형제에서 선택된 추가 성분으로 구성된 제약학적 조성물이 된다. 특정 구체예에서, 제약학적 조성물은 약학적으로 수용가능한 캐리어와 혼합된 항체로 구성된다. 약학 조성물에는 추가적으로 제2 치료제 예를 들면, 앙지오텐신 전환 효소(ACE) 저해물질, 개량된 글리케이션 최종물질 절단 또는 저해제등의 물질이 추가 포함된다. 본 발명은 추가적으로 CTGF-연관된 질환을 가지는 개체를 치료하기 위해 상기에서 정의한 바의 항체로 구성된 약물을 제공한다. 이와 같은 질환에는 다양한 암, 섬유증 질환, 심근경색, 관절염, 염증과 같은 상태로 인한 질환 및 신증, 망막증, 심장맥관 질환등이 포함되는 당뇨병, 비만등으로 인한 질환이 포함되나 이에 국한되지는 않는다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 14; SEQ ID NO : 14의 아미노산 1 내지 아미노산 167; SEQ ID NO : 20; SEQ ID NO : 20의 아미노산 1 내지 아미노산 136으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를 제공한다. 또한 본 발명은 이들 폴리펩티드의 다양한 보존성 변이체로 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 21부터 26 및 사람이 아닌 종에서 구한 해당 CTGF 단편으로 구성된 군에서 선택된 사람 CTGF의 특이적 단편을 제공한다.

상기에서 언급하는 폴리펩티드는 하기에서 정의하는 바의 “변경된” 폴리펩티드가 될 수도 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 인코드하는 폴리펩티드 서열을 제공한다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO : 14을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO : 14의 아미노산 1 내지 아미노산 167을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO : 13을 인코드하 는 폴리뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO : 13의 아미노산 1 내지 아미노산 167을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성된 군에서 선택된다. 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO : 20을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO : 19의 아미노산 1 내지 아미노산 136을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO : 19의 아미노산 1 내지 아미노산 408을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성된 군에서 선택된다.

상기에서 언급하는 폴리뉴클레오티드는 하기에서 정의하는 바의 “변경된” 폴리뉴클레오티드가 될 수도 있다.

본 발명은 복제 및 전사 조절 서열을 포함하는 벡터 서열에 작용가능하도록 연결된 상기에서 설명하는 임의 폴리뉴클레오티드로 구성된 재조합 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 한 측면에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO : 14 또는 이의 가변 도메인의 아미노산 서열을 인코드한다. 다른 한 측면에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO : 13으로 구성된다. 또 다른 한 측면에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO : 20 또는 이의 가변 도메인의 아미노산 서열을 인코드한다. 다른 측면에서 재조합 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO : 19로 구성된다.

본 발명은 또한 상기에서 설명하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나에 의해 감염된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포에는 임의 원핵세포 또는 진핵 숙주 세포 및 당업자에 공지된 배양 방법에 의해 유지되는 클론된 세포주도 포함된다. 숙주 세포에는 줄기 세포와 같은 형질변환된 세포에서 유도된 유전자전이된 식물 및 동물도 포함된다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 SEQ ID NO : 14를 인코드하는 폴리뉴클레오티드, SEQ ID NO : 20을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 공통-감염된 세포로 구성되는데, 이들 세포는 mAb1과 동일한 특징을 가진 기능 항체를 생산한다. 특정 구체예에서, 항체는 CLN1이다. 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 ATCC 기탁 번호 PTA-6006(2004년 5월 19일에 기탁됨)에 의해 확인되는 세포주(Chinese Hamster Ovary Cells 132.14.2A5.3.3로 확인된다.

본 발명의 이와 같은 구체예 및 다른 구체예는 여기에서 설명하는 것에 근거하여 당업자가 바로 인지할 수 있는 것이며, 모든 구체예를 특히 고려할 수 있다.

도 1A 및 1B에서는 결합조직 생장인자의 구조 및 서열보존을 보여준다. 도 1A에서는 CTGF의 모듈 도메인 구조를 보여주는데, N-말단 단편에 인슐린-유사 생장 인자 결합 단백질(IGF-BP) 및 Von Willebrand's 인자 (VWC)가 포함되고, C-말단 단편에서는 시스테인-노트 모티프(CT)를 포함한다. 도 1B에서는 사람(hCTGF), 소(bCTGF), 돼지(pCTGF), 쥐(rCTGF), 뮤린 (FISP12) CTGF 대응유전자(orthologs)간에 다중 서열 배열을 보여준다. 이와 같은 배열은 디폴트 변수를 이용한 CLUSTAL W 프로그램(v. 1.74 ; Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res 22: 4673-4680)으로 만들었다 도면에서, (*)는 제시된 종간에 아미노산이 완전하게 보존되었다는 것을 의미한다.

도 2A 및 2B에서는 항-CTGF 항체인, mAb2와 mAb1에 대해 각각 라벨된 그리고 라벨안된 사람 CTGF의 경쟁적 결합을 나타내는 Scatchard 플롯을 나타낸다. mAbl가 본 발명의 예시 항체이다.

도 3A는 상응하는 IgG 항체 mAb1의 파파인 절단후에 연속하여 단백질 A-Sepharose 친화력 크로마토그래피후에 수득된 Fab 항체 단편(Mr 45kD)을 나타낸다(SDS-PAGE)(라인 2). 도 3B에서는 무질서 유발제(chaotropic agent)(티오시아네이트)의 농도를 증가시키면서 CTGF에 Fab 및 이에 상응하는 IgG가 결합하는 것을 보여준다.

도 4A 및 4B에서는 라벨된 재조합 사람 CTGF와 라벨안된 쥐 CTGF가 항-CTGF항체 mAb2 및 mAb1 각각에 경쟁적 결합을 Scatchard 플롯으로 나타낸 것이다.

도 5A, 5B, 5C에서는 폐 간질성 섬유증 모델에서 본 발명의 항체의 치료요법적 잇점을 보여준다. 도 5A에서는 생쥐 폐의 하이드록시프롤린 함량에서 블레오마이신-유도된 증가에서 항체 치료 효과를 나타낸다. 각군의 동물의 숫자는 각 막대아래 괄호안에 나타내었고, 치료군은 x-축을 따라 표시하였다. SA: 염; BL: 블레오마이신; AbsJ: 본 발명의 3가지 단클론항체의 푸울; mAbl, 본 발명의 예시 항체. 값은 평균± SE으로 나타낸다. 도 5B 및 5C는 기관내로 블레오마이신을 주사하고 연속하여 염 또는 본 발명의 항체로 처리한 쥐의 폐 전단 선포(acini)의 헤마톡실린- 그리고 에오신- 착색된 파라핀 부분을 나타낸다. 도 5B에서, 얇은 폐포 격벽 소핵(interalveolar septa acinus)은 비정상 모양을 가지며, 염증 세포 및 섬유증이 존재한다. 도 5C에서 대상유조직(parenchyma)은 대개 정상이며 폐포 격벽내 약간 두꺼울 뿐이다.

도 6A, 6B, 6C에서는 신장의 세뇨관 간질성 경화증(tubulointerstitial) 모델에서 본 발명 항체의 치료요법적 잇점을 보여준다. 도 6A에서 본 발명의 항체 mAb1으로 치료후에 또는 CTGF의 C-말단에 대한 항체, mAb3으로 치료후에 일측상 요도관 폐쇄(unilateral ureter obstruction)(UUO)로 인한 섬유증의 감소가 나타났다. 섬유증의 정도는 대측성 비차단 신장(contralateral unobstructed kidney)의 것과 비교하여(평균 SE) 차단된 신장에서 프롤린에 대한 하이드록시프롤린의 비율로 나타낸다. 도 6B 및 6C에서는 염 또는 항체 치료를 받은 차단 신장의 트리콤-착색된 파라핀 단편을 보여준다.

도 7A 및 7B에서는 신장의 사구체 섬유증에 본 발명 항체의 치료요법적 잇점을 보여준다. 도 7A 및 7B에서는 염 또는 항체 요법을 제공받은 트리콤-착색된 잔여 신장 조직의 현미경 사진을 보여준다.

도 8A, 8B, 8C, 8D, 8E, 8F, 8G에서는 신생 쥐에서 국소화된 피하 육아종을 유도한 것을 보여준다. 좌측에서 도 8A 및 8B에서는 각각 TGFβ 단독 또는 TGFß 및 CTGF을 함께 피하 주사한 부위의 육사종 형성을 보여준다. 우측에서 도 8C부터 8G까지는 항체의 치료 효과를 평가하기 위해 이용된 숫자(0[정상]에서 4[섬유형성])을 나타내는 조직패널을 보여준다.

도 9에서는 항-CTGF 항체로 치료한 그리고 치료하지 않은 국소화된 피하 육아종에서 섬유증의 정도를 나타낸다. mAbl는 본 발명의 예시적인 항체이며, 반면에 mAb3는 C-말단 CTGF 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-CTGF 항체이다.

도 10A, 1OB, 1OC, 10D에서는 전신 경화증 모델을 이용한 기관 경화증에서 본 발명의 항체의 치료요법적 잇점을 보여준다. 각 패널에서는 염(기준), 항체요법과 수반하는 TGFß , CTGF, 및 TGFß 와 CTGF 치료후에 각 기관에 콜라겐 누적 변 화를 나타낸다.

도 11A 및 11B에서는 본 발명의 예시적인 항체 mAb1의 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로블린 사을의 클로닝을 도시한 것이다. 도 1lA에서는 mAb1 중쇄 코딩 서열(CDS)를 결정하기 위해 이용된 중쇄 PCR 단편을 배열한 것이다. 도 11B에서는 mAb1 경쇄 코딩 서열(CDS)을 결정하기 위해 이용된 경쇄 PCR 단편의 배열을 나타낸 것이다.

도 12A 및 12B에서는 CTGF 와 TGFß.간에 결합 연구를 나타낸 것이다. 도 12A에서는 항-CTGF 항체 유무하에 TGFß 와 엑손 3에 의해 인코드된 CTGF의 단편(Exon 3))간에 또는 엑손 5에 의해 인코드된 CTGF의 단편(Exon 5)간에 결합 정도를 나타낸 것이다. 도 12B에서는 항-CTGF 항체가 TGFβ 및 CTGF 상호작용 저해 정도를 나타낸 것이다. 도면에서, 항체에는 본 발명의 예시적 항체 mAbl 및 mAb4가 포함되며, C-말단 CTGF 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체인 mAb3도 포함된다.

발명의 설명

본 발명의 조성물과 방법을 설명하기 전에, 본 발명의 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 검사, 시약등에 제한을 두지 않으며, 이것들은 다양할 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다. 또한, 여기에서 사용된 용어들은 본 발명의 특정 구체예를 설명하기 위함이며, 본 발명의 범위를 이에 한정시키고자 함은 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위와 같다.

여기에서 설명하고, 첨부된 청구범위에서, 단수 부정관사("a,","an")는 특별한 다른 언급이 없는 한 복수의 개념이 포함된다. 따라서, “단편”은 이와 같은 복수개의 단편도 포함되며, "항체"도 한개 또는 그이상의 항체를 의미하고, 당분야에 공지된 이와 등가의 개념이 포함된다.

다른 언급이 없는 한, 여기에서 사용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이용할 수 있는 동일한 의미를 가진다.

여기에서 사용된 것과 같은 유사한 또는 등가의 임의 방법 및 재료를 본 발명의 실행, 테스트에 이용할 수 있지만, 적절한 방법, 장치, 또는 재료를 설명한다. 여기에서 언급하는 모든 공고는 공보에 보고하고 있는 방법, 시약, 도구 등을 설명하기 위해 전문을 참고문헌으로써 첨부하여, 본 발명과 연계하여 사용할 수도 있다. 이 발명이 선행 발명으로써 이와같은 공개들보다 엎선다고 해석되어서는 안된다.

다른 언급이 없는 한, 본 발명을 실행함에 있어서, 당분야에 기술 범위내에 화학, 생하학, 분자 생물학, 세포 생물학, 유전학, 면역학, 약리학을 이용한다. 이와 같은 기술은 문헌들에서 충분히 설명되어 있다. Gennaro, A. R. , ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc. ; Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds. , 1986, Blackwell Scientific Publications); Maniatis, T. et al. , eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. , eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, John Wiley &Sons; Ream et al. , eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton &Graham eds. , 1997, Springer Verlag).

정의

"결합 조직 생장 인자" 또는 "CTGF"는 임의 종, 특히 쥐, 토끼, 소, 양, 돼지, 쥐과 동물, 말, 사람과 동물을 포함하는 포유류 종, 적절하게는 사람에서 유도된, 그리고 천연, 합성, 반합성 또는 재조합이건 간에 임의 원료에서 유도된 실질적으로 정제된 CTGF의 아미노산 서열을 말한다.

CTGF의 "N-말단 단편"은 CTGF 폴리펩티드의 아미노-말단 부분에서 유도된 임의 폴리펩티드를 말하거나 또는 이의 변이체 또는 이의 단편을 말한다. N-말단 단편에는 도 1A 및 1B에서 볼 수 있는 것과 같이, 초기 메티오닌부터 시스테인-없는 “힌지”부분을 통한 CTGF의 모든, 또는 일부분이 포함될 수도 있고, 전혀 포함안될 수도 있다. 또한, N-말단 단편에는 도1B에서 볼 수 있는 것과 같이 인슐린 생장인자-결합 단백질 모티프의 전부 또는 일부분 또는 von Willebrand 타입 C 도메인(SEQ ID NO : 21)의 전부 또는 일부분을 포함하거나 전혀 포함안될 수도 있다. 또한, CTGF의 N-말단 단편은 상기에서 성의한 임이 선행하는 N-말단 단편내에 포함된 임의 15개 또는 그 이상의 인접하는 아미노산이 될 수도 있다.

한 측면에서, CTGF의 “N-말단 단편"은 사람 CTGF의 아미도 말단 부분에서 유도된 폴리펩티드 서열을 말한다. 이와 같은 단편은 SEQ ID NO : 2의 아미노산 잔 기 1부터 아미노산 잔기 198까지의 전체 부분을 포함할 수 있고, 또는 SEQ ID NO : 2의 아미노산 23부터 아미노산 198까지를 포함할 수도 있다. 힌지 부분내에 N-말단 단편의 경계는 선택적으로 SEQ ID NO : 2에서 정의된 몇 가지 프로테아제 절단 부부중 하나도 선택적으로 정의될 수 있는데, 예를 들면, 잔기 179과 180사이; 잔기 182과 183사이; 잔기 188과 189사이의 키모트립신 절단 부위; 잔기 183과 184사이, 잔기 196과 197사이의 플라스민 절단 부위, 잔기 169과 170사이의 뼈 형성 단백질-1 절단 부위가 된다. 추가로, 사람 CTGF의 N-말단 단편에는 SEQ ID NO : 2의 아미노산 27부터 아미노산 97; 또는 SEQ ID NO : 2의 아미노산 103부터 166까지; 또는 SEQ ID NO : 2의 167부터 198까지의 전부, 일부분이 포함되거나 전혀 포함되지 않을 수도 있다. 또한, 사람의 CTGF N-말단 부분은 상기에서 정의된 바와 같은 임의 선행 N-말단 단편내에 포함된 임의 15개 또는 그이상의 연속 아미노산이 될 수도 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 CTGF의 N-말단 단편은 사람 CTGF(SEQ ID NO : 2)의 다음 부분 그리고, 다른 종, 특히, 쥐, 토끼, 소, 양, 돼지, 쥐과 동물에서 유도된 이에 상응하는 단편; 아미노산 23 부터 아미노산 96 (엑손 2에 의해 인코드됨); 아미노산 27 부터 아미노산 97(IGF-BP 모티프) ; 아미노산 97 부터 아미노산 180(엑손 3에 의해 인코드됨); 아미노산 103 부터 아미노산 166(VWC 도메인); 아미노산 167 부터 아미노산 198 (시스테인이 없는 힌지); 아미노산 23 부터 아미노산 180 (엑손 2와 3에 의해 인코드됨); 아미노산 27 부터 아미노산 166(IGF-BP 및 VWC); 그리고 아미노산 23 부터 아미노산 198에서 선택된 서열로 구성된다.(도 1B.)

CTGF의 "C-말단 단편"은 CTGF 아미노산 폴리펩티드 서열의 카르복시 말단 부분에서 유도된 서열, 이의 변이체 또는 이의 단편으로 구성된 임의 폴리펩티드를 말한다. CTGF의 C-말단 단편에는 CTGF의 시스테인이 없는 힌지 부분(SEQ ID NO : 2의 아미노산 167부터 198까지)의 전부 또는 일부분을 포함하거나 포함되지 않을 수도 있다.

C-말단 단편에는 시스테인 없는 힌지 부분부터 단백질의 끝까지 CTGF의 전부 또는 일부분을 포함하거나 또는 전혀 포함되지 않을 수도 있다. 또한, C-말단 단편에는 트롬보스포딘 모티프 또는 시스테인-노트 모티프의 전부, 일부분이 포함되거나 전혀 포함되지 않을 수도 있다. 또한, CTGF의 C-말단 단편은 상기 정의한 임의 선행하는 C-말단 단편 내에 임의 15개 또는 그이상의 연속 아미노산이 될 수 있다.

일부 측면에서, C-말단 단편은 SEQ ID NO : 2의 아미노산 181부터 아미노산 349까지 전체 부분이 포함될 수 있다. 힌지 부분내에 C-말단 단편의 경계는 상기에서 정의된 키모트립신, 플라스민, 골 형성 단백질-1 절단 부분과 같은 SEQ ID NO :2의 몇가지 프로테아제 절단 부위 중에 하나로 선택적으로 특정될 수도 있다. 추가로, 본 발명의 CTGF의 C-말단 단편은 사람 CTGF(SEQ ID NO : 2)의 다음 부분 그리고, 다른 종, 특히, 쥐, 토끼, 소, 양, 돼지, 쥐과 동물에서 유도된 이에 상응하는 단편; 아미노산 201 부터 아미노산 242; 아미노산 247 부터 아미노산 349; 아미노산 248 부터 아미노산 349; 아미노산 249 부터 아미노산 346에서 선택된 서열로 구성된다. 또한, 사람 CTGF의 C-말단 단편은 상기 정의한 임의 선행하는 C-말단 단편 내에 임의 15개 또는 그이상의 연속 아미노산이 될 수 있다.

CTGF의 "시스테인 없는 부분" 또는 "힌지 부분"은 사람 CTGF(SEQ ID NO : 2)의 아미노산 167부터 아미노산 198까지에서 유도된 임의 폴리펩티드 또는 다른 종, 특히, 쥐, 토끼, 소, 양, 돼지, 쥐과 동물에서 유도된 이에 상응하는 단편을 말한다.

여기에서 사용된 "아미노산 서열" 또는 “폴리펩티드”또는 “폴리펩티드들”은 올리고펩티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 서열, 이의 단편, 자연 발생 또는 합성 분자를 말한다. 폴리펩티드 또는 아미노산 단편은 폴리펩티드의 적어도 한가지 구조적 또는 기능적 특징을 보유하는 폴리펩티드의 임의 부분이다. CTGF 단편에는 CTGF의 적어도 한가지 구조적 또는 기능적 특징을 보유하는 CTGF 폴리펩티드 서열의 임의 부분을 포함한다. “아미노산 서열”은 자연 발생 단백질 분자의 폴리펩티드 서열을 말하는 것이고, “아미노산 서열” 및 이와 유사한 용어는 아미노산 서열을 언급된 단백질 분자와 연관하여 완전한 고유 서열에 국한시키고자 함은 아니다.

“면역원성”은 신체내로 도입되었을 때 물질이 면역 반응을 자극시켜, 항체 생산하는 물질의 능력을 말한다. 면역원성을 발휘하는 물질은 면역원성이 있다라고 한다. 면역원성 물질에는 단백질, 리포프로페인, 폴리사카라이드, 핵산, 박테리아, 박테리아 성분, 바이러스, 바이러스 성분과 같은 다양한 거대분자가 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 면역원성 물질은 종종 분자량이 10kDa이상이 된다. 항원성 단편은 CTGF 폴리펩티드의 단편, 적절하게는 길이가 약 5 내지 15개 아미노산으로 된 CTGF 폴리펩티드 활성의 한 가지 생물학적 또는 면역학적 특징을 보유하는 단편을 말한다.

“항체”는 고유 분자 및 이의 단편 예를 들면, Fab, F(ab')₂, Fv 단편들로 에피토프 결정부위에 결합할 수 있는 단편도 포함하여, 단클론 및 다클론 항체도 포함된다. CTGF 또는 CTGF의 단편에 결합하는 항체는 고유 폴리펩티드를 이용하여 만들거나 또는 면역성 항원으로 소요의 작은 펩티드를 포함하는 단편을 이용하여 만들 수도 있다. 동물(예를 들면, 생쥐, 들쥐, 닭, 칠면조, 염소 등)을 면역주사하는데 이용되는 폴리펩티드 또는 올리고폴리펩티드는 RNA의 해독에서 유도하거나 화학적으로 합성할 수도 있고, 그리고 원하는 경우에 캐리어 단백질에 콘쥬게이트될 수도 있다. 펩티드에 화학적으로 결합된 흔히 이용되는 캐리어에는 소 혈청 알부민, 티모글로블린, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)등이 포함된다.

여기에서 사용된 바와 같은 “단클론 항체”는 항체의 실질적인 균질 집단, 가령, 이 집단으로 구성된 개별 항체는 소량으로 발생되는 자연 돌연변이를 제외하고는 특이성 및 친화성이 동일하다. 단클론 항체 조성에는 한가지 이상의 단클론 항체가 포함될 수 있다.

본 발명에 포함된 단클론 항체에는 기원 종 또는 이뮤노글로블린 클래스 또는 서브클래스에 무관하게 하이브리드 및 재조합 항체(가령, “인화” 항체) 및 상기에서 설명하는 특정 성질중 적어도 하나를 가지는 항체 단편(예를 들면, Fab, F (ab)₂, Fv)들이 포함된다. 적절한 구체예에서는 단클론 항체 mAb1에 의해 인지되는 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 mAb1의 친화력보다 큰 또는 동등한 에피토프에 대한 친화력을 가지는 항체도 포함된다.

“단클론”이란 실질적으로 균질한 항체 집단인 항체의 특징을 말하는 것으로 임의 특정 방법에 의해 항체 생산을 요구하는 것으로 해석해서는 안된다. 예를 들면, 본 발명의 단클론 항체는 Kohler and Milstein(1975, Nature 256: 495- 497)에 의해 처음으로 설명된 하이브리도마 방법을 이용하여 만들거나 재조합 DNA 방법을 이용하여 만들 수도 있다. 예를 들면, Celltech Therapeutics Ltd., European Patent No. EP-0 120 694; Cabilly et al. , U. S. Pat. No. 4,816, 567; or Mage and Lamoyi (1987 ; In: Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc. , New York, pp. 79-97)을 참고로 한다.

여기에서 언급한 것과 같은 "중화 항체"는 항체, CTGF의 생물학적 활성을 실질적으로 저해 또는 제거할 수 있는 바람직하게는 단클론 항체를 말하는 것이다. 일반적으로, 중화 항체는 표적 세포와 연합된 CTGF-특이적 수용체 또는 이의 또 다른 생물학적 표적, TGFβ와 같은 공인자에 CTGF의 결합을 저해할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 중화 항체는 CTGF의 생물학적 활성을 mAb1과 동등한 정도로 또는 그 이상으로 저해할 수 있다. 적절하게는 중화 항체는 CTGF의 생물학적 활성을 CLN1과 동등한 정도로 또는 그 이상으로 저해할 수 있다.

여기에서 언급하는 "CTGF-연관된 질환"은 CTGF의 비정상적 또는 변형 활성 또는 발현과 연관될 상태 또는 질환을 말한다. CTGF의 비정상적 발현은 내피 세포 증식, 세포 이동, 종양 유사 생장, 일반적인 조직 흉터와 같은 내피 세포 증식에 의한 질환과 같은 세포 증식성 질환, 그리고 세포외 매트릭스의 부적절한 침착을 특징으로 하는 다양한 질환등과 연관이 있다.

CTGF-연관된 질환에는

CTGF-연관 질환에는 맥관형성과 연관된 질환 및 증식성 망막병증과 같은 질환에서 주요한 역할을 하는 다른 과정과 연관될 질환이 포함되는데, 예를 들면, 급성 임파성 백혈병, 피부섬유아종, 유방암, 유방암종, 신경교종, 신경교아세포종, 평활근 조직상 악성종양, 섬유종, 결합조직형성, 맥관지방종, 혈관평활근종, 결합조직형성암, 전립선, 난소, 결장, 췌장, 위장, 간암 및 다른 종양 생장 및 전이등을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

CTGF-연관된 질환에는 섬유증 질환 및 관련 상태 예를 들면, 국소 또는 전신 섬유증으로 인한 과도한 반흔, 신장, 폐, 간, 눈, 심장 피부등과 같은 기관의 만성 또는 급성 섬유증; 내피, 상피 및 결합 조직에서 선택된 조직의 과도한 반흔 상태를 포함한다. 섬유증은 눈과 관절에서도 발생될 수 있다. 이와 같은 CTGF-관련 질환에는 심장 섬쥬증을 포함하는데, 예를 들면, 심근경색 또는 울혈성 심부전증이후에 심장 재형성(cardiac remodeling); 간질성 폐 섬유증을 포함하는 폐 질환; 복막 투석 예를 들면, 연속성 복막투석(CAPD)를 포함한 투석과 연관된 섬유증; 경막 섬유증; 신장 섬유증; 폐 섬유증; 간질 섬유증; 피부 섬유증; 외과술과 같은 급성 또는 반복성 외상, 화학요법, 방사능 치료, 자가면역성 간염, 만성 및 급성 이식 거부(예를 들면, 신장, 간 또는 다른 기관); 폐 이식 후의 폐쇄성세기관지기질화폐렴(bronchiolitis obliterans); 질병 또는 손상으로 인한 염증 및 감염등을 포함하나 이에 국한시키지 않는다.

추가적으로, CTGF-관련 질환에는 전신성 경화증, 공피증, 켈로이드, 비후성 흉터, 및 다른 피부 질환 및 상태등이 포함된 경화성 질환; 죽상 경화성 플라그 관련된 상태, 당뇨병, 복막 투석 연관된 죽상동맥경화: 류마티스 관절염, 골관절염 및 다른 관절 염증 상태를 포함하는 관절염; 간질 섬유증을 포함하는 간질 질환; 크론(Crohn) 질환; 염증성 장 질환; 증식성망막병증, 비-증식성 당뇨병 망막증, 증식성 당뇨병 망막증, 황반변성(노인성 및 청소년(Stargardt's) 질환 및 색소상피세포 탈락) 질환을 포함하는 망막증; 당뇨성 신증, IgA-연관된 신증, 독성으로 인한 신증 등을 포함하는 신증; 화학 독성 세관 파괴된 상태등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.

CTGF-연관된 질환에는 혈당과다증, 고혈압, advanced glycation 부산물(AGE) 형성으로 인한 질환이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 이와 같은 질환들은 당뇨병, 비만등으로 인하여 발생할 수도 있고, 이 질환에는 당뇨성 신증, 망막증, 심장맥관 질환이 포함된다. 또한, CTGF-관련 질환은 화학물질 또는 생물학적 물질, 염증 반응, 자가면역 반응, 외상, 외과적 과정등에 노출된 것을 포함하는 임의 개시 요인에 의해 발생될 수도 있으나, 이에 국한되지 않는 원인으로 발생될 수도 있다. 일부 구체예에서, 방법들은 심근경색, 국소 및 전신 염증을 포함하는 상태로 인한 CTGF-연관 질환에 걸린 환자를 치료하는데 이용되나, 상기 원인에 국한되지는 않는다.

"증식성" 과정 및 질환은 세포가 지속적으로 복제하여 조직내에 세포 집단의 과다 성장하는 것을 특징으로 하는 병리 상태가 포함된다. 세포 집단은 반드시 형질전환되거나 종양성 또는 악성 세포일 필요는 없고, 정상세포가 포함될 수도 있다. 예를 들면, CTGF는 동맥 벽의 내막층에 증식성 병소를 유도하여 죽상동맥 경화가 되거나 신맥관형성을 자극하는 질병과 관련될 수 있다.

"암"은 조직의 임의 자생 생장을 말하는 것으로, 세포의 통제불능의, 비정상적인 생장 또는 전이에 의해 전신으로 또는 침투에 의해 국소적으로 무제한적인 생장 잠재력을 가지는 임의 악성 종양을 말한다. 암은 또한 암의 의해 나타나는 비정상적인 상태를 말하기도 한다.

"섬유증"은 섬유성 조직 또는 유섬유종 또는 섬유성 퇴행의 비정상적인 과정을 말한다. 섬유증은 다양한 손상 및 질환으로 인하여 발생되며, 종종 다양한 기관의 이식과 연관된 만성 이식 거부로 인하여 발생될 수도 있다. 섬유증은 일반적으로 콜라겐, 피브로넥틴의 과다 생산 또는 침착을 포함하는 세포외 매트릭스 성분의 비정상적인 생산, 축적 또는 침착과 관계한다. 여기에서 언급하는 광의의 “섬유증”은 세포외 매트릭스 단백질의 임의 과다 생산 또는 침착을 말하는 것이다. 섬유증에는 심장의 펌프 능력이 손상되는 심장마비 후에 반흔 조직의 형성을 포함하는 다양한 예가 있다. 당뇨병은 흔히 신장의 손상/반흔의 원인이 되어, 신장 기능의 점진적인 상실을 유도하는데, 눈의 경우에는 시력 상실의 원인이 되기도 한다. 외과술 이후에 반흔 조직은 구축(근육 수축이 고정된 상태), 통증, 일부의 경우에는 불임의 원인이 되는 내부 기관사이에 반흔 조직을 형성하게 한다. 심장, 신장, 간, 눈, 피부와 같은 주요 기관이 다른 질환과 흔히 연관하여 만성 반흔이 되기 쉽 다. 비후성 반흔(Hypertrophic scars)(비종양성 거대 조직 bulk)이 화상 및 다른 외상에 의한 섬유증의 일반적인 형태이다. 또한, 전신성 경화증, 켈로이드, 죽상경화증을 포함하는 경화증식성 질환이 많은데, 이들은 각각 일반적인 조직 반흔, 피부에서의 종양과 유사한 생장 및 혈관의 지속적인 반흔으로 혈액의 운반 능력이 상실되는 등의 질환과 각각 연관이 있다.

"핵산" 또는 “폴리뉴클레오티드” 또는 “폴리뉴클레오티드들”은 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 임의 단편 및 단일 또는 이중 가닥의 그리고 센스 또는 안티센스 가닥이 되는 천연 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 펩티드 핵산(PNA), 또는 천연 또는 합성 기원의 임의 DNA 유사 또는 RNA 유사 물질을 말한다. 폴리뉴클레오티드 단편은 폴리뉴클레오티드의 적어도 한 가지 구조적 또는 기능적 특징을 보유하는 폴리뉴클레오티드 서열의 일부분이다. 폴리뉴클레오티드의 단편은 길이가 다양한데, 예를 들면, 60개 뉴클레오티드이상, 적어도 100개 뉴클레오티드이상, 적어도 1000개 뉴클레오티드이상, 또는 적어도 10,000개 뉴클레오티드 이상이 될 수도 있다.

"변경된" 폴리뉴클레오티드에는 상이한 뉴클레오티드의 결손, 삽입 또는 치환되어, 동일한 또는 기능적으로 등가의 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드가 된 것을 포함한다. 이 정의에는 본 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 정상적인 염색체 위치가 아닌 다른 위치에서 대립유전자와 부적절한 또는 기대하지 않은 하이브리드 반응의 결손을 통하여 또는 특정 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 바로 감지하거나 할 수 없는 다형성을 나타내는 서열도 포함된다.

"변경된" 폴리펩티드에는 아미노산의 결손, 삽입 또는 치환이 포함되어, 침묵 변화를 만들고, 기능적으로 등가의 폴리펩티드가 된다. 인코드된 폴리펩티드의 생물학적 또는 면역학적 활성이 유지되는 한 아미노산 잔기의 극성, 전하, 용해도, 친수성, 소수성 또는 양쪽성 성질의 유사성에 근거하여 대부분의 아미노산 치환이 이루어진다. 예를 들면, 음전하를 띈 아미노산에는 아스파르트산, 글루타민산이 포함되고; 양전하를 띈 아미노산 에는 리신 및 아르기닌이 포함되고; 유사한 친수성 값을 가지는 전하를 띄지 않는 아미노산 에는 루이신, 이소루이신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 티로신이 포함된다.

폴리펩티드 또는 아미노산 "변이체"는 특정 아미노산 서열로부터 한개 또는 그이상의 아미노산을 변경한 아미노산 서열이다. 폴리펩티드 변이체는 보존성 변화를 가질 수 있는데, 이때 치환된 아미노산은 대체된 아미노산에 유사한 구조적 또는 화학적 성질을 가지는데, 예를 들면 루이신이 이소루이신으로 치환되는 경우이다. 변이체는 또한 비-보존성 변화를 가질 수도 있는데, 이때 치환된 아미노산은 대체된 아미노산과는 상이한 물질적 성질을 가지며, 예를 들면, 글리신을 트립토판으로 대체하는 것이다. 유사 작은 변이에는 아미노산 결손, 삽입 또는 이두가지를 포함할 수도 있다. 적절하게는 아미노산 변이체에는 특정 폴리펩티드의 구조적 또는 기능적 특징이 포함된다. 어느 아미노산이 치환, 삽입 또는 결손되었는 지를 결정하는 방법은 당분야에 공지된 컴퓨터 프로그램 LASERGENE 소프트웨어(DNASTAR Inc., Madison, WI)를 이용하여 찾을 수도 있다.

폴리뉴클레오티드 변이체는 특정 폴리뉴클레오티드 서열에 적절하게는 적어도 약 80%, 좀더 적절하게는 적어도 약 90%, 좀더 적절하게는 적어도 약 95% 폴리뉴클레오티드 서열 유사성을 가지는 특정 폴리펩티드 서열의 변이체이다. 당업자는 유전자 코드의 축퇴(degeneracy) 결과로 특정 단백질을 인코드하는 변이체 폴리뉴클레오티드 서열이 다수 발생될 수 있으며, 일부는 임의 공지의 그리고 자연 발생 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열에 최소한의 유사성을 보유한다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명의 가능한 코돈 선택에 근거하여 조합을 선택하여 만들 수 있는 모든 가능한 폴리뉴클레오티드 서열을 고려한다. 이와 같은 조합은 표준 코돈 3문자 유전자 코드에 따라 만들 수 있으며, 모든 이와 같은 변이체는 특이적으로 기술된 것으로 간주된다.

"결손"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 변화로 인하여 한개 또는 그이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드가 없는 것을 말한다.

"삽입" 또는 "추가"는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 변화가 있어, 자연 발생 분자와 비교하였을 때 각각 한 개 이상의 아미노산 또는 뉴가 추가된 것을 말한다.

여기에서 언급하고 있는 것과 같이, "기능적 등가체"는 특정 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 적어도 한가지 기능적 또는 구조적 특징으로 보유하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 기능적 등가체는 특정 기능을 실행할 수 있는 변형을 포함할 수 있다. "기능적 등가체“는 분자의 단편, 돌연변이, 하이브리드, 변이체, 유사체 또는 화학적 유도체를 포함한다.

"마이크로어래이"는 기질상에서 핵산, 아미노산 , 항체의 배열을 말한다. 기질은 임의 적절한 서포트, 예를 들면, 비드, 유리, 종이, 니트로셀룰로오즈 또는 임의 적절한 막이 될 수 있다. 기질은 임의 고형의 또는 반고형의 서포트 예를 들면, 막, 필터, 와이퍼, 칩, 슬라이드, 화이버, 자성 또는 비자성 비드, 겔, 튜브, 플레이트, 폴리머, 미소입자, 모세관등이 있으나 이에 한정시키지는 않는다. 기질은 벽, 웰, 트렌치, 채널, 구멍등 핵산, 아미노산 등이 결합할 수 있는 다양한 표면을 가지고, 피복을 위한 표면을 제공할 수도 있다.

여기에서 “샘플”은 최대로 넓은 의미로 사용되었다. 샘플은 어떠한 소스로부터 유도될 수 있는데, 예를 들면, 체액, 분비물, 조직, 세포 및 타액, 혈액, 혈청, 플라스마, 유리체액, 활액, 뇌 척수액, 양수, 기관 조직(생검 조직)을 포함하는 배양물내 세포; 세포로부터 분리된 염색체, 기관 조직 또는 다른 막; 게놈 DNA, cDNA, RNA, mRNA 등; 처리된 세포 또는 조직으로부터 유도된 샘플 또는 이와 같은 세포 또는 조직으로부터의 블랏 또는 임프린트(imprint)에서 유도된 것을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 샘플은 사람 또는 사람이 아닌 포유류등의 소스로부터 유도할 수도 있다. 또한, 질병을 가진 임의 동물 모델로부터 샘플을 유도할 수도 있다. 샘플은 용액 또는 기질에 고정 또는 결합된 것일 수도 있다. 샘플은 CTGF 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 분자를 스크리닝하는데 적절한 또는 CTGF 또는 이의 단편이 존재하는 지를 테스트하는데 적절한 임의 물질이 될 수 있다. 이와 같은 샘플을 수득하는 방법은 당분야에 공지의 기술 수준이다.

"하이브리드반응"은 염기 페어링을 통하여 상보적인 서열에 핵산 서열을 결 합시키는 과정을 말한다. 하이브리드 반응 조건은 사전 하이브리드반응 및 하이브리드반응 용액의 염 또는 포름아니드 농도에 의해 정의되거나 하이브리드 반응 온도에 의해서도 정의되고, 이는 당분야에 공지된 것이다. 하이브리드 반응은 다양한 스트리젼트 조건하에서 일어날 수 있다.

특히, 스트리젼트는 포름아미드 농도를 증가시키거나 염의 농도를 감소시키거나 하이브리드 반응 온도를 상승시키면 증가될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 목적을 위해, 높은 스트리젼트 조건하에 하이브리드 반응은 약 50% 포름아미드와 약 37°C 내지 42°C에서 일어나며, 약 35% 내지 25% 포름아미드와 약 30°C 내지 35°C에서는 스트리젼트 조건이 감소된 상태에서 일어난다. 특히, 하이브리드 반응은 일반적으로, 42°C, 50% 포름아미드, 5X SSPE, 0.3% SDS, 200㎍/㎖ 전단 및 변성된 연어 정자 DNA에서 최대 스트린젼트 조건에서 일어난다.

특정 수준의 스트린젼트에 상응하는 온도 범위는 당분야에 공지된 방법에 의해 좁아질 수도 있는데 예를 들면, 소요의 핵산에 퓨린에 대한 피리미딘의 비율을 계산하고, 이에 따라 온도를 조절하는 것이다. 비-특이적 시그날을 제거하기 위해, 블랏은 0.1X SSC 및 0.5% SDS의 스트린젼트 조건을 증가시키면서 실온에서 또는 최고 60℃에서 연속하여 세척할 수 있다. 상이 범위 및 조건상의 변수들은 당분야에 공지되어 있다.

본 발명은 결합 조직 생장 인자(CTGF)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 항체는 단클론 또는 다클론항체, 적절하게는 단클론 항체이며, 좀더 바람직하게는 사람의 단클론항체이다. 항체는 도 1에서 나타낸 바와 같이 CTGF의 N-말단 단 편에 대응한다. 좀더 특별하게는 항체는 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 97 내지 180의 CTGF 단편에 다응한다. 좀더 특별하게는 항체는 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 97부터 아미노산 잔기 180까지의 CTGF 단편에 대응한다. 특정 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 103부터 잔기 164까지, 좀더 구체적으로는 아미노산 잔기 134부터 잔기 158까지의 CTGF 단편에 대응한다. 좀더 특이적으로는 항체는 SEQ ID NO:2의 잔기 143내지 잔기 154까지의 CTGF 단편에 대응한다.

특정 구체예에서, 항체는 CTGF의 생물학적 활성을 중화시킨다. CTGF의 생물학적 활성에는 세포 증식, 분화, 발현등이 포함된다. 특정 구체예에서, 생물학적 활성은 세포 분화, 가령 다양한 전구세포로부터 섬유아세포, 골수섬유아세포, 내피세포의 분화 또는 변환분화(transdifferentiation); 타입 I 콜라겐, 피브로넥틴을 포함하는 세포외 매트릭스 형성 및 재형성에 연관된 단백질의 발현 유도; TGF-β, IGF, VEGF, 앙지오텐신 II, 엔도테린 등을 포함하나 이에 국한되지 않은 다양한 인자들과 연관된 카스캐이드 시그날 공동 유도; 포도당의 증가(혈당과다증), 물리적인 스트레스 증가(고혈압)등을 포함하나 이에 국한되지 않은 다양한 환경에 대한 세포 반응 등이 포함된다.

본 발명은 CTGF의 활성을 중화시키는 기전에 제한하지는 않지만, 항체는 CTGF가 특정 세포 수용체에 결합하여 이와 상호작용하는 것을 방해한다. 수용체는 CTGF에 대한 높은 결합 친화력을 가질 수 있고, CTGF에 결합함으로써, 증식, 분화, 유전자의 발현 및 세포 형태 또는 기능에서 변화를 유도하는 세포내 시그날을 자극한다. CTGF에 대한 세포의 특정 생물학적 반응은 세포 및 주변 환경에 따라 달라진 다. 또는 수용체는 CTGF에 대해 낮은 결합 친화력을 가질 수 있고, CTGF에 결합함으로써 높은 친화성 수용체에 대해 CTGF를 위치시켜 CTGF에 인지 및 반응을 유도할 수 있다. 또는, 항체는 조직 또는 기관내에 CTGF와 결합할 수 있고, 신체로부터 CTGF를 제거하거나 적정할 수 있다.

또는 여기에서 설명하는 기전과 함께, 항체는 분비된 또는 막-결합된 공인자에 CTGF에 결합, CTGF가 이들 공인자와 상호작용하는 것을 방해할 수도 있다. 이와 같은 공인자는 특별히 TGF-β 슈퍼패밀리 구성요소, 예를 들면, TGFß-1,T GFß-2, TGFß--3; 악티빈-A, 악티빈-B, 악티빈-C, 악티빈-E; BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8a, BMP-8b, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-15; GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-9, GDF-10가 포함된다. 예를 들면, CTGF는 TGFβ-1 및 BMP-4에 결합하여 이들의 활성을 조절한다는 것을 알았다Abreu et al. (2002) Nat Cell Biol 4: 599-604.). 본 발명은 TGFβ에 결합하는 CTGF의 부분이 엑손 3에 의해 인코드되고(도 1B, SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 418부터 뉴클레오티드 669), 이 부분에 결합하는 항체가 CTGF 및 TGFβ 사이에 상호작용을 방해한다(실시예 12, 하기 참고). 또한, CTGF의 부분내에 결합하는 항체는 동물 모델에서 특이적 CTGF-연합된 과정을 중화시키는 것으로 나타났다. 예를 들면, CTGF의 부분내에 결합하는 항체는 ex vivo 검사에서 세포 이동을 특이적으로 저해하며, 동물 모델에서 섬유증을 감소시켰다. 본 발명의 예시적인 항체는 mAbl 및CLN1이고; 항체 CLN1는 ATCC에 2004년 5월 19일에 기탁된 ATCC 기탁 번호 PTA-6006에 의해 확인되는 세포주(Chinese Hamster Ovary Cells 132.14.2A5.3.3에 의해 생산된다.

작용 기전과는 무관하에, 본 발명은 CTGF와 연관된 다양한 질환 및 질병을 치료하는데 이 항체를 사용하는 방법을 제공한다. CTGF와 연관된 질환 및 질병에는 신증, 폐 섬유증, 망막증, 전신성 경화증, 간 섬유증, 심부전, 관절염, 죽상경화증이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 또한, CTGF와 연관된 질병은 혈당과다, 고혈압, 단요병, 비만등을 포함하나 이에 국한되지 않은 다양한 요인으로 인하여 발생되고, 질환에는 당뇨성 신증, 망막증, 심장 질환 등이 포함된다. CTGF가 상기 언급된 질환을 포함한 다양한 질환에서 과다발현하기 때문에, 본 발명은 CTGF-연관될 질환을 앓는 환자를 CTGF 항체로 치료하여 질병을 개선 또는 안정화시키거나, 기관의 기능을 회복 또는 유지시키거나, 삶의 질을 향상시키거나, 생존을 연장시키는 것을 포함한다.

예를 들면, 항체는 간질 폐 섬유증, 당뇨성 신증, 망막증, 황반변성 등을 포함한 다양한 질환의 섬유성 또는 비-섬유성 측면과 연관된 생물학적 활성에 연관된 CTGF의 부분에 특별히 대응한다. 본 발명은 또한 폐, 간, 심장, 피부, 신장등과 같은 국소 및 전신 섬유증 질환 및 외상, 외과술 등으로 인한 국소 반흔 형성을 포함하는 CTGF와 연관된 질환을 치료하기 위한 항체를 이용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 항체는 CTGF에 결합하는 것과 연관된 임의 방법을 이용할 수도 있다. 이와 같은 방법에는 CTGF 또는 이의 단편을 샘플에서 친화력 크로마토그래피를 이용한 정제; ELISA 또는 면역조직화학적 기술을 이용하여 샘플에서 CTGF 또는 CTGF의 단편 감지; 환자의 샘플에 있는 CTGF 수준을 측정하기 위한 CTGF를 감지하는 방법을 이용하여 CTGF 연관된 질환을 진단하고, 표준과 샘플내에 CTGF의 수준을 비교하는 것이 포함된다.

CTGF 에 대한 항체

단클론 항체를 이용하여 분비된 세포 인자들의 양과 활성을 조절하는 것을 설명하고 있으며, 몇 가지 치료요법적 항체가 승인되었거나 개발중에 있다(See, e. g., Abciximab (Reopro; Centocor, Inc., Malvern PA), Infliximab (Remicade; Maini et al. (1998) Arthritis Rheum 41: 1552-1563; Targan et al. (1997) N Engl J Med 337: 1029-1035); Basiliximab (Simulect) and Daclizumab (Zenapax) (Bumgardner et al. (2001) Transplantation 72: 839-845; Kovarik et al. (1999) Transplantation 68: 1288-1294); and Trastuzumab (Herceptin ; Baselga (2001) Ann Oncol 12 Suppl 1: S49-55.)). 동물, 식물, 곰팡이, 박테리아등에서 생산; 합성에 의한 작제; ex vivo 배양물 등을 포함하는 것을 포함하는 항체를 생산하는 다수 방법이 공지되어 있어, 당업자들이 이용할 수 있다.

본 발명의 항체는 항체 분자를 생산하기 위해 제공되는 임의 기술을 이용하여 준비할 수도 있다. 단클론 또는 다클론 항체의 in vitro 및 in vivo 생산 기술도 당분야에 잘 공지되어 있다(See, e. g., Pound (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ; Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2"d Edition, Academic Press; Schook (1987) Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc. ) 키메라 항체를 생산하는 것도 당분야에 공지되어 있고, 이 는 단일 쇄 항체 생산으로 공지되어 있다(See, e. g., Morrison et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81: 6851-6855; Neuberger et al. (1984) Nature 312: 604-608; Takeda et al. (1985) Nature 314: 452-454.) 관련된 특이성을 가지나 별개의 이디오타입 조성을 가지는 항체도 이용할 수 있는 다양한 수단을 사용하여 생산할 수 있는데, 예를 들면, 무작위 복합 이뮤노글로블린 라이브러리 사슬 셔플링을 사용할 수도 있다(See, e. g. , Burton (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 11120-11123.)

항체는 임파세포 군에서 in vivo 생산의 유도 또는 상당한 특이적 결합 시약의 패널 또는 이뮤노글로블린 라이브러리 스크리닝에 의해 생산될 수도 있다(See, e. g. , Orlandi et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 3833-3837; Winter and Milstein (1991) Nature 349: 293-299). 표적 폴리펩티드에 대한 특이적 결합 부위를 포함하는 항체 단편을 만들 수도 있다. 이와 같은 항체 단편에는 항체 분자를 펩신 처리하여 생성되는 F(ab')₂ 단편; F(ab')₂ 단편의 이황화결합 다리를 환원시키면 생성되는 Fab 단편들이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 또는, Fab 발현 라이브러리를 작제하여 원하는 특이성을 가지는 단클론 Fab 단편을 신속하고 용이하게 확인할 수 있다(See, e. g. , Huse et al. (1989) Science 254: 1275-1281.)

본 발명의 단클론 항체는 하이브리드 방법(see, e.g., Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497) 또는 재조합 DNA 방법(see, e.g., Celltech Therapeutics Ltd. , European Patent No. EP 0 120 694; Cabilly et al. , U. S. Patent No. 4,816, 567; and Mage and Lamoyi(1987))In: Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 79-97)을 이용하여 준비할 수 있다 .

하이브리도마 방법에서, 생쥐 또는 다른 적절한 숙주 동물을 피부, 복막 또는 근육 경로를 통하여 CTGF 또는 이의 단편으로 면역주사하여, 임파세포가 항체를 생산할 수 있도록 하는데, 이 항체는 면역주사에 이용된 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 또는, 숙주 동물은 사람 이뮤노글로블린 유전자를 인코드하는 트랜스유전자를 가지고, 비활성화된 내생 이뮤노글로블린 위치를 가지는 유전자 전이 동물이 될 수도 있다. 유전자전이 포유류는 사람 항체를 생산함으로써 면역원에 반응한다(See, e. g., Lonberg et al. , WO 93/12227 (1993), U. S. Patent No. 5,877, 397, and Nature 148: 1547-1553 (1994);and Kucherlapati et al.(1991) WO91/10741). 또는, 임파세포를 in vitro로 면역주사하여, 적절한 융합 물질, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜과 같은 물질을 이용하여 골수종 세포에 융합시켜, 하이브리도마 세포를 만든다(See, e.g., Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd Edition, Academic Press, pp.59-103). 또는, 항체를 생산할 수 있는 사람의 체세포, 특히 B 임파세포는 골수종 세포주와의 융합에 적절하다. 개체로부터 생검된 비장, 편도선, 임파구에서 취한 B 임파세포가 이용될 수도 있지만, 가장 용이하게 근접할 수 있는 말초 혈액 B 임파세포가 가장 적절하다. 또한, Epstein-Barr 바이러스를 이용하여 사람의 B 세포를 직접적으로 불사 화시킬 수도 있다(See, e.g., Cole et al.(1995) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96.)

하이브리도마를 생산하는 융합 과정에서 이용되는 적절한 골수종 세포주는 효과적으로 융합하여, 선택된 항체-생산 세포에 의해 항체를 안정적으로 높은 수준으로 발현하고, 원하는 하이브리도마 생산을 지원하는 특정 선택 배지에서 생장할 수 없도록 하는 효소 결핍을 가지며, 스스로는 항체를 생산할 수 없는 세포주이다. 본 발명에서 하이브리도마 생산에 이용할 수 있는 골수종 세포주의 예를 들면, P3X63Ag8, P3X63Ag8-653, NS1/l. Ag 4.1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7, S194/5XXO Bul, 생쥐에서 유도된 모든 것; R210. RCY3, Y3-Ag 1. 2. 3, IR983F, 4B210, 들쥐에서 유도된 모든 것; U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2, UC729-6, 사람에서 유도된 모든 것(See, e.g., Goding(1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd Edition, Academic Press, pp. 65-66; and Campbell (1984) In:Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13 (Burden and Von Knippenberg, eds.) Amsterdam, Elseview, pp. 75-83.)등이 포함된다.

하이브리도마 세포는 융합안된 모체 골수종 세포의 생장 또는 생존을 저해하는 한 가지 이상의 물질을 적절하게 포함하는 적절한 배양 배지에 접종하여 생장시킨다. 예를 들면, 모체 골수종 세포에 하이포산틴 구아닌 포스포리보실 트란스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT) 효소가 부족한 경우에, 하이브리도마의 배양 배지에는 일반적으로 HGPRT-결손 세포 생장을 방해하는 하이포산틴, 아미노프테린, 티미딘(HAT 배 지)과 같은 물질을 포함시킨다.

하이브리도마종 세포가 생장하는 배양 배지를 CTGF 또는 CTGF의 단편에 대한 단클론 항체가 생산되는 지에 대해 검사한다. 적절하게는 결합 특이성은 친화성 크로마토그래피, 면역침전 또는 방사능면역검사(RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검사(ELISA) 또는 형광-활성화된 세포 분류(FACS) 분석을 이용하여 결정할 수 있다. 본 발명의 단클론 항체는 CTGF에 결합하고, 추가적으로 하기에서 예시하는 바와 같이 CTGF의 생물학적 활성을 중화시키는 것들이다.

상기에서 설명하는 것과 같이 생산된 항체를 선택적으로 스크리닝하여 CTGF의 N-말단 단편에 실질적으로 결합하는 항체를 감지한다. 한 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기 24부터 180까지의 CTGF 단편에 대한 것이다. 또 다른 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기 96부터 180까지의 CTGF 단편에 대한 것이다. 특정 구체예에서, 하기에서 설명하는 종류의 경쟁적 검사를 이용하여 스크린으로 항체 mAb1에 의해 인지되는 것과 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 감지한다. 또 다른 특정 구체예에서, 스크린은 하기에서 설명하는 경쟁 검사를 이용하여 결정된 바와 같이 CLN1 항체에 의해 인지되는 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 감지한다. 명심할 것은 “동일한 에피토프”는 알라닌 스캔된 CTGF 변이체를 이용한 에피토프 매핑에서 결정된 바와 같이, 기준 항체가 결합하는 정확한 아미노산 또는 탄수화물을 말하는 것이 아니다. “동일한 에피토프”란 고유형의 기준 항체의 CTGF와 결합하여 차단된 CTGF 도메인을 말한다. 물론, “동일한 에피토프”에는 mAb1 또는 CLN1의 기준 상보성 결정 부분 (CDRs)와 구조적으로 상호작용하거나 결합하는 CTGF 도메인 잔기 또는 탄수화물이 포함된다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 단클론 항체는 Scatchard analysis of Munson and Pollard(1980, Anal Biochem 107: 220)에서 결정된 것과 같이 mAb1의 친화력과 동등하거나 더 큰 친화력을 가질 수 있다.

하이브리도마 세포가 원하는 특이성 및 친화력을 가지는 항체를 생산하는 것으로 확인된 후에, 클론은 일반적으로 제한된 희석과정을 통하여 서브클론시키고, 표준 방법을 이용하여 생장시킨다(Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd Edition, Academic Press, pp. 59-104). 이 목적을 위한 적절한 배양 배지에는 Dulbecco's Modified Eagle 배지 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물의 복수 종용과 같이 in vivo에서 생장시킬 수도 있다.

서브클론에 의해 분비되는 단클론 항체는 배양 배지, 복수 또는 혈청으로부터 통상의 이뮤노들로블린 정제 과정 예를 들면, 단백질 A-세파로즈, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화력 크로마토그래피를 이용하여 적절하게 분리하였다.

본 발명의 단클론 항체를 인코드하는 DNA를 통상의 과정 예를 들면 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코드하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 분리 및 서열화시킬 수 있다. 일단 분리하면, DNA를 발현 또는 클로닝 벡터에 결찰시키고, 그 다음, 이뮤노글로블린 단백질을 생산하지 않는 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄서터 오바리(CHO) 세포, 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 트랜스펙션시킨다. 형질변환된 세포는 재조합 숙주 세포 배양물에서 단클론 항체를 합성하는데 적합한 조건하에 배양하였다. 예시적인 세포주는 2004년 5월 19일자로 기탁된 ATCC 기탁 번호 PTA-6006(2004년 5월 19일에 기탁됨)에 의해 확인되는 세포주(Chinese Hamster Ovary Cells 132.14.2A5.3.3 것이다.

DNA를 선택적으로 변형시켜, 인코드된 이뮤노글로블린의 특징을 변화시켰다. 이뮤노글로블린 변이체는 많이 공지되어 있다. 예를 들면, 키메라 항체는 생쥐와 같은 한 종의 중쇄 및 경쇄 항상 도메인의 코딩 서열을 다른 종, 가령 사람에서 유도된 상동성 서열로 치환하여 만들었다(See, e. g., Boss et al. , International Publication No. WO 84/03712; Cabilly et al. , U. S. Patent No. 4,816, 567 ; or Morrison et al. (1984) Proc Nat Acad Sci 81: 6851.) 특정 구체예에서, 쥐과(murine) 항체의 인간화형은 상보적인 결정 부분(CDRs), 가령 생쥐 항체의 가변 도메인을 사람 항체의 구조 도메인, 가령 항상 부분으로 치환하여 만들 수 있다(See, e. g., International Publication No. WO 92/22653). 일부 구체예에 있어서, 선택된 뮤린 구조 잔기들을 사람의 수용체 이뮤노글로블린으로 치환시킬 수도 있다. 또한, 선택된 Fc 도메인은 IgA, IgD, IgE, IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4, IgM중 하나가 될 수 있다. Fc 도메인은 선택적으로 보체 결합과 같은 효과물질 기능을 할 수 있다.

본 발명의 항-CTGF 항체를 또한 감지 또는 세포독성 효과와 같은 추가 기능을 제공하는 모이어티에 융합시킬 수도 있다. 본 발명의 이뮤노글로빌린 및 세포독 성 모이어티의 융합은 세포독성 비-이뮤노글로블린 폴리펩티드의 코딩 서열 일부 또는 전부를 이뮤노글로블린 코딩 서열에 결찰시켜 만들었다. 이와 같은 비-이뮤노글로블린 폴리펩티드에는 리친, 디프테리아 독소 또는 슈도모나스 독소와 같은 폴리펩티드 독소가 포함된다. in vitro 방법을 이용하여 콘쥬게이트를 준비할 수도 있다. 예를 들면, 면역독소는 이황화물 교환 반응을 이용하여 만들거나 또는 이뮤노글로블린과 독소 폴리펩티드 사이에 티오에테르 결합을 형성시켜 만들 수 있다. 이 목적에 적절한 시약을 예로 들면, 이미노티오레이트 및 메틸-4-멀캅토부티미데이트를 포함한다. 일반적으로 이와 같은 비-이뮤노글로블린 융합 폴리펩티드는 본 발명 항체의 항상(constant) 도메인를 대신한다. 또는 본 발명 항체의 한개 항원-복합 부위의 가변 도메인를 대신한다.

비-CTGF 항원에 대한 특이성을 가지는 항체의 Fv 또는 CDRs를 대체하면 키메라 항체를 만들 수 있는데, 이 항체의 구성은 CTGF에 대한 특이성을 가지는 한개 항원-복합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 가지는 또 다른 항원-복합 부위로 구성된다. 이와 같은 구체예에서, 경쇄는 삭제되고, 중쇄의 Fv는 원하는 폴리펩티드로 대체된다. 이와 같은 항체들은 이용되는 Fc 도메인에 의해 소유되는 이뮤노글로블린 “팔(arm)"에 따라 이가(divalent) 또는 다가(polyvalent) 항체로 명명한다. 예를 들면, IgGs는 이가 항체가 되고, IgMs는 다가 항체가 될 것이다. 상기에서 언급하는 비-이뮤노글로블린과는 별도로 또한 항체에는 한개 이상의 특이성을 가지는 항체와의 재조합에 의해 다가(multivalent)가 부여될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서 항체는 상기에서 설명하는 CTGF에 결합할 수 있을 뿐 아니라 제2 생장 인자 가령, TGFß, VEGF, FGF, 및 다른 CCN 페밀리 구성원 예를 들면, CYR61, 또는 사이토킨에도 결합할 수 있다. 이들 인자들에 대한 항체의 예는 잘 공지되어 있다. 다중-특이성, 다가 항체는 이들 항체 모두의 중쇄 및 경쇄를 인코드하는 DNA를 세포에 공-형질감염시키고, 원하는 구조를 가지는 발현된 항체를 면역친화성 크로마토그래피 또는 유사한 방법을 이용하여 회수함으로써 만들 수 있다. 또는 이와 같은 항체는 통상적 방법으로 in vitro에서 재조합된 단가 항체로부터 만들었다.

통상적인 기술을 이용하여 단가 항체를 만들었다. 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현이 적절하다. 중쇄는 Fc 부분의 임의 지점에서 일반적으로 절단되어, 중쇄 교차연결을 방해한다. 또는 관련 시스테인을 다른 잔기로 치환시키거나 또는 제거하여 교차 연결을 막는다. In vitro 방법을 이용하여 단가 항체를 만들 수도 있는데, 예를 들면, Fab 단편은 고유 항체의 효소적 절단을 이용하여 만들 수 있다.

진단

본 발명의 항체는 샘플에서 CTGF를 정량적 그리고 정성적으로 감지하는데 이용된다. 샘플은 임의 소스로부터 구할 수 있는데, 예를 들면, 배양물에서 생장된 세포의 조건화 배지; 조직 샘플, 가령, 조직 생검 및 기관 이식물; 혈액, 뇨, 수포액, 뇌척수액, 유리체 액을 포함하는 체액등으로부터 구할 수 있다. 한 구체예에서, CTGF 감지를 이용하여 배양물에서 생장된 세포 상태 가령, 분화, 매트릭스 생산등의 상태를 진단할 수 있다. CTGF 는 배양된 세포상에서 다양한 오토크린 및 파라크린 효과를 가지고, 세포 층에 연합된 CTGF 수준 또는 조건화 배지에 있는 CTGF의 수준은 세포의 현재 상태를 암시 또는 세포의 미래 상태를 예견하는 지표가 될 수 있다 (See, e.g., International Publication No. WO 96/38168.) 다른 구체예에서, CTGF 감지를 이용하여 조직 또는 기관의 상태를 결정한다. 예를 들면 이식하게 되는 기관을 CTGF 수준을 측정하여 평가할 수도 있는데, 기관에 있는 세포에 의해 발현되는 CTGF의 수준은 기관의 상대적인 건강 및 이식의 적합성을 말해준다. 기관의 상태를 결정하기 위해 생검된 조직에서 CTGF 수준를 측정하거나 또는 암의 단계 및 전이 가능성을 파악하기 위해 CTGF 수준을 측정한다.

적절한 구체예에서, 항체를 이용하여 CTGF와 연관된 질환 또는 질병을 진단한다(See, e.g., International Publication No. WO03/024308). 한 측면에서 본 발명은 샘플을 수득하고, 샘플에 있는 CTGF를 감지하고 이의 수준을 측정하고, 샘플의 CTGF 수준과 표준 CTGF의 량을 비교하여 CTGF 연관된 질병을 진단하는 항체를 제공하는데, 이때 샘플에서 CTGF의 양이 증가 또는 감소되었다는 것은 CTGF 연관된 질병이 있음을 암시하는 것이다. CTGF의 수준이 비정상(증가 또는 감소)적인 질병에는 세포외 매트릭스-연합된 단백질의 이상 발현 및 침착과 연관된 질병이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 이와 같은 질환에는 유방암, 췌장암, 위장암과 같은 암; 죽상경화정, 관절염, 당뇨성 망막증과 같은 망막증; 당뇨성 신증과 같은 신증; 심장, 폐, 감의 섬유증; 만성 염증 또는 감염이 있는 질환등이 포함된다. CTGF-연합된 질병은 심근 경색, 당뇨병, 복막 투석, 만성 및 급성 이식 거부, 화학요법, 방사능요법, 외과술과 같은 상황과 연관이 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 CTGF-연관된 질환이 발생될 가능성이 있는 지를 확인하기 위한 항체를 제공한다. 개체에서 과다혈증, 고혈압 또는 비만 이 우선 이와 같은 성향이 있음을 나타낼 수도 있다. 또한, 심근경색, 외과술 또는 정형외과적 또는 마비성 부동(paralytic immobilization), 충혈성 심부전, 또는 임신 및 정맥류성 종창의 경우에 의심을 할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 CTGF 연관된 질환의 치료 효과를 모니터하거나 CTGF 연관된 질환의 진행을 모니터하기 위한 항체를 제공한다. 예를 들면, 이와 같은 항체를 이용하는 방법은 시간을 두고 개체로부터 샘플을 수득하고, 각 샘플에서 CTGF를 감지 및 이를 정량적으로 측정하고; 검사된 샘플의 CTGF 수준과 이전의 샘플에서 정량된 수준을 비교하는 것으로 구성된다. 시간에 따른 샘플에서의 CTGF 수준 변화는 CTGF 연관 질환의 진행 또는 CTGF 연관 질환의 치료 효과를 나타내는 것이다.

진단에 이용하기 위해, 본 발명의 항체는 일반적으로 감지가능한 모이어티로 라벨된다. 감지가능한 모이어티는 직간접적으로 감지 시그날을 생산할 수 있는 임의 모이어티가 된다. 예를 들면, 감지가능한 모이어티는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ^l25I와 같은 방사능동위원소; 플로레신 이소티오시아네이트, 로다민, 루시페린 등의 형광 또는 화학적 발광 화합물; 알칼리 포스포타제, 베타-갈락토시다제, 양고추냉이 과산화효소와 같은 효소가 될 수 있다.

감지가능한 모이어티에 항체를 별도 콘쥬게이트 하는 방법은 당분야에 공지된 것을 이용할 수 있다.(See, e. g. , Hunter et al. (1962) Nature 144: 945; David et al. (1974) Biochemistry 13: 1014; Pain et al. (1981) J Immunol Meth 40: 219; and Nygren (1982) J Histochem Cytochem 30: 407). 본 발명의 항체는 임의 공지의 검사 방법 예를 들면, 경쟁적 결합 검사, 직간접 샌드위치 검사, 면역침전 검사와 같은 것을 이용할 수 있다(Zola (1987) In : Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., pp. 147-158.)

경쟁적 결합 검사는 라벨된 표준(CTGF가 되거나 또는 이의 면역학적 반응 부위가 될 수 있음)이 테스트 샘플에 있는 분석 물질(CTGF)과 제한된 양의 항체에 결합하는 경쟁 능력에 따라 달라진다. 테스트 샘플에 있는 CTGF의 양은 항체에 결합하게 되는 표준 물질의 양과 역비례한다. 결합되는 표준 물질의 양을 결정하기 위해서 항체는 일반적으로 경쟁 전후에 고정시키고, 항체에 결합하게 되는 표준 및 분석물질은 통상적인 방법을 이용하여 결합안된 표준 및 분석물질로부터 분리할 수 있다.

샌드위치 검사는 두 가지 항체를 이용하는데, 각각은 감지대상 단백질의 상이한 면역원 부분 또는 에피토프에 결할할 수 있다. 샌드위치 검사에서 테스트 샘플 분석물질은 고형 서포트상에 고정된 제1항체에 결합되고, 제2 항체는 분석물질에 결합하여 불용성 세부분으로 구성된 복합체를 형성하게 된다(David and Greene, U.S. Patent No.4,376,110). 제2항체에는 감지가능한 모이어티가 라벨되거나(직접적인 샌드위치 검사) 또는 감기가능한 모이어티가 라벨된 항-이뮤노글로빌린 항체를 이용할 수 있다(간접 샌드위치 검사). 예를 들면, 샌드위치 검사의 한 가지 타입이 ELISA 검사인데, 이 경우에 감지가능한 모이어티는 효소가 된다. 본 발명의 항체를 이용할 수 있는 예시적인 방법은 International Publication No. WO03/024308에서 설명하고 있다.

본 발명의 항체는 in vivo 이미징에도 이용할 수 있는데, 방사능불투성 물질, 방사능동위원소, 그린 형광 단백질(GFP)와 같은 형광 모이어티 감지가능한 모이어티로 라벨된 항체를 숙주에게 적절하게는 혈류로 투여하고, 그리고 숙주내에 라벨된 항체의 존재 및 위치를 파악한다. 이와 같은 이미징 기술은 섬유증 질환완 같은 CTGF-연합된 질환의 단계 및 치료상태에 유용하다. 항체는 숙주에서 핵 자기 공명, 방사능 또는 당분야의 다른 임의 감지 수준을 이용한 임의 감지가능한 모이어티로 라벨될 수 있다.

치료요법

본 발명은 CTGF와 연관된 다양한 질환, 질병을 치료하기 위한 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 하기에서 예시하는 바와 같이 몇 가지 CTGF 생산 또는 활성의 유해한 효과를 감소시였다는 것이 확인된 상태이다. 또한, 항체는 CTGF와 연관된 질환을 치료하는 우수한 치료제를 만드는데 유익한 약리역동학을 보여주고 있다.

본 발명의 항-CTGF 항체는 동물 모델 예를 들면 폐 및 신장 섬유증의 동물 모델에서 섬유증의 발생을 저해한다. 특이, 항체는 폐 하이드록시프롤린(콜라겐) 축적 및 조직 준비물의 조직학적 검사를 통하여 측정한 결과, 생쥐에서 블레오마이신에 의해 유도된 폐 섬유증을 60-70% 감쇠시켰다. 또한, 항체는 잔존 신장(신장절제술에 의해 5/6을 절제)을 가진 생쥐 및 일측방 뇨도관 폐색(UUO)생쥐 에서 콜라겐 축적을 감소시킨다. 항체는 또한 신생 생쥐에서 CTGF 및 TGFβ를 복합하여 피하 또는 복막으로 주힙시켜 유도된 섬유증을 감소시킨다.

또한, 항체는 기관 기능부전과 연관된 합병증을 감소시키는데, 예를 들면, 다양한 만성 및 급성 신부전에서 신장 기능이 개선되었다. 동물에서 이들 항체로 인한 독성은 관찰되지 않았다. 제한형 및 방산 경피증, 골관절염, 당뇨성 신증 및 망막증을 포함하는 다양한 섬유증 질환에서 CTGF가 과다발현되기 때문에, 본 발명은 CTGF 항체를 이용하여 CTGF 연관된 질환을 앓고 있는 환차를 치료하여 병을 개선 또는 안정화시키고, 기관의 기능을 복구시키고, 삶의 질을 향상시키고, 생존을 연장시키는 것을 시도한다.

따라서, 본 발명의 항체는 개체에서 CTGF 연관 질환을 예방 또는 치료하기 위해 치료요법적 용도에 특이 유용하다. 이와 같은 질환에는 맥관형성 및 죽상경화증, 녹내장과 같은 상태에서 주요 역할을 하는 다른 과정; 급성림프성백혈병, 피부섬유종(dermatofibromas), 유방암, 유방암종, 신경교종, 신경교아종, 횡문근육종, 섬유육종, 결합조직형성, 지방종, 혈관평활근종, 결합조직형성 암, 전립선, 난소암, 결장암, 췌장암, 위암, 간암, 및 기타 종양 생장 및 전이등의 암을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.

또한, 본 발명의 항체는 섬유증과 연관된 CTGF-연관 질병의 치료 또는 예방을 위한 치료요법적 용도에 유용하다. 한 측면에서, 본 발명의 항체를 개체에 투여하여 CTGF-연관된 질병을 치료 또는 예방할 수 있는데, 관련 질환에는 세포외 매트릭스-연돤된 단백질의 발현 변화 또는 침착을 나타내는 질환, 예를 들면 섬유증 질환을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 다양한 측면에서 섬유증은 상피, 내피 또는 결합 조직과 같은 특정 조직; 신장, 폐, 간과 같은 기관에 국소화될 수 있다.

섬유증은 또한 눈 및 관절에서 발생될 수도 있다. 다른 측면에서 섬유증은 전신으로 나타날 수 있고 여러 기관 및 조직계가 연루될 수 있다. CTGF-연합된 질환에는 죽상경화증, 관절염, 당뇨성 망막증과 같은 망막증; 당뇨성 신증과 같은 신증; 심장, 폐, 간, 신장 섬유증, 만성 염증 또는 감염과 연관된 질병이 될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 이와 같은 질환이 발생될 소지가 있는 개체에서 CTGF 관련 질환을 예방하는 항체를 제공한다. 가능성 성향에는 개체에서 과다혈증, 고혈압 또는 비만이 포함된다. 이와 같은 질환은 당뇨병, 비만등에 의해 발생될 수 있는데, 당뇨성 신증, 망막증, 심장맥관 질환등이 포함된다. 또한, 심근경색, 외과술, 복막 투석, 만성 및 급성 이식거부, 화학요법, 방사능요법, 외상, 정형성 또는 마비성 부동(paralytic immobilization), 충혈성 심부전, 또는 임신 및 정맥류성 종창의 경우에 의심을 할 수 있다.

여기에서 예시하고 있는 바와 같이, 특정 구체예에서, 본 발명의 항체를 개체에 투여하여 폐 또는 신장에서의 섬유증을 치료한다. 항체는 다양한 폐 및 신장 섬유증의 모델에서 유익한 효과를 제공한다는 것이 밝혀졌다 (See, e.g., 실시예 7~9). 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체를 개체에 투여하여 전신 또는 국소 섬유증을 감소시켰다(See, e.g., 실시예 11 및 12 ). 추가 구체예에서, 항체를 개체에 투여하여, 증식성 망막병증, 당뇨성 망막증, 황반변성 등의 안구 질환 치료 및 예방한다. CTGF는 다양한 질병에 연루되어 있기 때문에, 본 발명은 질병 및 기관 기능을 개선시키거나 안정시키고, 삶의 질을 개선시키며, 생존을 연장시키기 위해 본 발명의 항체를 이용하여 CTGF 연합된 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 것도 포함한다.

치료에 이용하기 위해, 본 발명의 항체를 동물, 적절하게는 사람에 약리학적으로 수용가능한 약형을 이용하여 투여한다. 항체는 큰환약(bolus)으로 정맥을 통해 투여되거나 시간을 두고 연속 주입될 수 있으며, 근육, 피하, 동맥, 활액내, 척수강내, 초자체(intravitreal)내, 두개내(intracranial), 경구, 국소 또는 흡입 경로를 통하여 투여할 수 있다. 항체가 적절한 활성을 보유하는 경우에, 종양내, 종양간, 병소내, 병소간 투여 경로를 이용하여 국소 또는 전신 치료효과를 가질 수도 있다.

이와 같은 약형에는 원래 비독성 및 치료효과가 없는 약리학적으로 적절한 캐리어가 포함된다. 이와 같은 캐리어의 예를 들면, 이온교환물질, 알루미나 스테레이트, 레시틴; 사람 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질; 인산염 완충액 또는 글리신 완충액; 소르브산, 소르브산 칼륨염, 포화된 식물성 지방산의 부분적 글리세리트 혼합물, 물, 염 또는 황산 프라타민염과 같은 전해질, 금속염, 콜로이스성 실리카, 트리실리케이트 마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀롤로오즈 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜등이 있다. 국소 또는 겔형의 항체에 대한 캐리어에는 카르복시메틸셀룰로오즈 나트륨, 메틸셀룰로오즈와 같은 폴리사카라이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜, 나무 왁스 알코올등이 포함된다. 통상성인 데포우 형에는 마이크로캡슐, 나노-캡슐, 리 포좀, 플라스터, 설하(sublingual) 태블릿, 폴리락티드:폴리글리콜리드 공중합체와 같은 폴리머 매트릭스 등이 포함된다. 동결건도된 것보다는 수용성 약형에 존재하는 경우에 항체는 전형적으로 0.1mg/㎖ 내지 100mg/㎖의 농도로 존재하나 이 범위밖의 것도 허용된다.

질병의 예방 또는 치료를 위하여 항체의 적절한 약량은 전술한 바와 같은 치료될 질병의 타입, 질병의 중증도 및 과정, 예방 또는 치료 목적의 항체가 투여되었는지의 여부, 예전 치료 과정, 환자의 병력 및 항체에 대한 반응, 의사의 판단에 따라 달라질 수 있다. 항체는 환자에 1회 또는 여러차례 투여될 수 있다.

질병의 타입 및 중증도에 따라, 환자의 체중㎏ 당 0.015 내지 15mg을 환자에 초기 투여량으로 권장하고, 1회 또는 별도의 여러횟수로 또는 연속주입하여 투여될 수 있다. 몇일간 또는 그 이상의 시간동안 반복 투여를 위해서는 상태에 따라 질병의 원하는 억제 증상이 나타날 때 까지 치료를 반복한다. 그러나, 다른 약량 섭생을 이용할 수도 있고, 이는 본 발명에서 배제되지 않는다.

본 발명의 또 다른 특정 구체예에 따르면, 질병의 예방 또는 치료를 위한 항체의 효과는 항체를 연속으로 또는 동일한 임상적 목적에 효과가 있는 다른 물질과 복합하여 투여하면 개선될 수 있는데, 예를 들면, 주요 항체와는 다른 에피토프에 대응하는 또 다른 항체 또는 섬유증, 경화증, 종양 세포 생장 또는 전이 저해, 신맥관형성 저해 또는 염증 감소와 같은 과도한 세포외 매트릭스 생산과 연관된 질환의 치료 또는 예방을 위한 원하는 치료 징후를 위해 공지된 한개 또는 그 이상의 통상적인 치료제가 포함될 수 있다. 이와 같은 물질은 항-TGF-β 항체와 유사한 기전 또는 인터페론γ와 같은 상이한 기전을 통하여 증상을 감소시키거나 결과를 개선시킬 수 있다. 이와 같은 물질은 CTGF-연관 질환과 직간접적으로 증상을 추가로 개선시키거나 엥지오텐신-전환 효소(ACE) 저해물질, 엥지오텐신 수용체 차단물질(Arbs)등의 CTGF 연관된 질환 발생 성향을 개선시킨다.

예를 들면, 안정적인 프로스타사이클린 항진제 Iloprost를 제공받은 피부경화증 환자는 피부 두께가 개선되어, 이는 피부 경화증에 의해 반흔 조직 형성에 저해 효과와 일치한다고 보고된다. 프로스타노이드는 콜라겐 합성에 저해 효과가 있는 것으로 보고되었고, 몇 가지 증거를 통하여 Iloprost는 피부 경화증에서 CTGF 유도를 차단한다는 것이 밝혀졌다(Korn et al. (1980) J Clin Invest 65 : 543-554; Goldstein and Polger (1982) J Biol Chem 257: 8630-8633; and Stratton et al. (2001) J Clin Invest 108: 241-250). 건강한 대조군에 비하여 피부경화증 환자에서 수포액에 CTGF가 7배 많았다. 그러나, Iloprost를 정액으로 투여받은 환자에서는 수포액에서 CTGF가 상당히 감소되었다(Stratton et al. (2001) J Clin Invest 108 : 241-250). 이를 고려하면, 이와 같은 결과에서 피부경화증에 Iloprost의 일부 치료효과는 CTGF 수준 감소를 통하여 중개된 항-섬유증 효과에서 유도되었을 것이다. 피부경화증 환자에서 강력한 기관지확장 및 항-혈소판 프로스타사이클린 유사체의 만성적 전신 투여에 대한 우려가 있기 때문에, 항-CTGF 항체 단독으로 또는 Iloprost의 감소된 수준과 복합하여 피부경화증 치료에 안정적이고 효과적인 치료를 제공할 수 있다.

추가 용도

본 발명의 항체는 또한 친화력 정제 물질로 이용할 수 있다. 이와 같은 과정에서, CTGF에 대한 항체를 Sephadex 수지 또는 필터 페이퍼와 같은 적절한 서포트상에 당분야에 공지된 방법을 이용하여 고정시켰다. 고정된 항체는 정제될 CTGF를 포함하는 샘플과 접촉시키고, 서포트를 적절한 용매로 세척하여, 고정된 항체에 결합된 CTGF을 제외하고는 샘플내에 있는 모든 물질을 제거한다. 마지막으로 서포느는 글리신 완충액(pH5.0)와 같은 또 다른 적절한 용매를 이용하여 세척하여 항체로부터 CTGF를 유리할 수 있다.

본 발명은 다음의 실시예를 참고하면 더욱 이해를 잘 할 수 있으며, 다음의 실시예는 본 발명의 순수한 예를 설명하는 것이다. 이와 같은 실시예는 청구된 발명을 설명하기 위함이다. 본 발명은 실시예에 한정되지 않으며 본 발명의 단측면을 설명하기 위해 제공된 것이다. 기능적으로 등가의 임의 방법도 본 발명의 범위내에 있다. 여기에 설명된 것에 추가하여 전술한 명세서 및 첨부 도면으로부터 당업자는 본 발명을 다양하게 변형할 수 있을 것이다. 이와 같은 변형은 첨부된 청구범위 내에 속한다.

실시예 1. 재조합 사람 CTGF 의 생산

Segarini et al.,((2001)J Biol Chem 276:40659-40667)에서 설명하는 것과 같이 재조합 사람 CTGF 베큘로바이러스 구조체를 만들었다. 간단하게 설명하면 한 개의 오픈 리딩 프레임으로 구성된 CTGF cDNA를 이용하여 DB60R32(Bradham et al. (1991) J Cell Biol 114: 1285- 94)을 주형으로 하고, 프라이머로 5'- gctccgcccgcagtgggatccATGaccgccgcc-3' 및 5'-ggatccggatccTCAtgccatgtctccgta-3'를 사용하여 PCR하여 만들고, 증폭된 생성물의 단부에는 BamHI 제한효소 부위가 추가한다.

생성된 증폭된 DNA 단편은 BamHI으로 절단하고, 아가로즈 겔 상에서 전기영동하고, PFASTBAC1 발현 플라스미드(Invitrogen Corp., Carlsbad CA)의 BamHI 부위로 직접 서브클론시켰다. 발현 카세트의 서열 및 방향은 DNA 서열화를 이용하여 확인하였다. 생성된 CTGF 발현 카세트를 박테리아에 부위-특이적 재조합을 이용하여 bacmid DNA로 이동시켰다. 이 bacmid를 이용하여, 제조업자가 제공하는 프로토콜에 따라 스포도프테라 퓨루지페르다 (Spodoptera frugiperda)SF9에서 완전한 재조합 CTGF 베큘로바이러스를 만든다(BAC-TO-BAC 발현 시스템 메뉴얼; Invitrogen). Sf9 곤충 세포에서 재조합 베큘로바이러스 역가 연장은 당분야에 표준 과정을 이용하여 실행하였다.

분리된 세포의 각 계대에서 인리치먼트를 수반한 Hi5 곤충 세포를 진탕 플라스크 배양에서 세포의 연속 계대에 의한 현탁 생장에 알맞다. 현탁액 Hi5 세포를 110rpm의 교반 플랫포옴 상에 27°C에서 2.8L Fernbach 배양 플라스크(Corning Inc., Acton MA) 내에 20㎍/㎖ 젠타마이신(Mediatech, Inc. , Herndon VA) 및 1x 지방질(Invitrogen)이 보충된 1L의 SF900II SFM 배지에서(Invitrogen) 배양하였다. 세포의 밀도가 1.0-1.5x10⁶ 세포/㎖, 생존능이 95%에 도달하면, MOI가 10에서 재조합 베큘로바이러스로 감염시켰다. rhCTGF를 포함하는 조건화 배지를 수득하고, 얼 음상에서 냉동시키고, 5000xg로 원심분리시켰다. 상청액을 0.45㎜ 필터를 통하여 통과시켰다.

또는, 쥐 CTGF를 인코드하는 클론 2-4-7(Schmidt et al. , US Pat No 6,348, 329)을 pMK33 발현 벡터(Michael Koelle, Stanford University Ph. D. dissertation, 1992의 방법으로 만듬)로 삽입하여, 재조합 쥐 CTGF를 생산하였다. CELLFECTIN 시약(Invitrogen Corp., Carlsbad CA)을 이용하여, 쥐 CTGF 발현 구조체를 Schneider 2 세포(American Type Culture Collection, Manassas VA; Schneider (1972) J Embryol Exp Morphol 27: 353-365)로 이동시켰다. 세포들을 6주간 300㎍/㎖ 하이그로마이신 B를 포함하는 배지에서 생장시키고, 그 다음 3일간 선별없이 생장시켰다. 500μM CuSO₄ 및 100μM ZnSO₄를 첨가하여 CTGF 발현을 유도하고, 4시간 후에 배지를 수득하고 원심분리시키고, 상기에서 설명한 것과 같이 여과시켰다.

다음과 같이 상기에서 생성된 CTGF를 정제하였다. 조건화 배지 4ℓ를 5㎖ HI-TRAP 헤파린 컬럼(Amersham Biosciences Corp., Piscataway NJ)-50mM Tris(pH7.5), 150mM NaCl로 선-평형시켜둠-에 얹는다. 350mM NaCl, 50mM Tris(pH 7.5)로 된 용액 10배 컬럼 용적으로 컬럼을 세척하였다. CTGF는 NaCl 염 농도를 증가시키면서 컬럼으로부터 용출시키면 용출된다. 용출된 분취물은 SDS-PAGE에 의해 스크린되며, CTGF가 포함된 부분만 모았다.

발열성이 없는 이중 정제된 물을 이용하여 헤파린 정제된 CTGF를 최종 전도 성이 5.7mS가 되도록 희석시키고, pH는 8.0으로 조정하였다. 약 23㎖ 수지를 포함하는 Q-SEPHAROSE 강력한 음이온 교환 컬럼(Amersham Biosciences)과 나란히 연결되고, 7㎖ 수지가 포함된 카르복시메틸(CM) POROS 폴리스티렌 컬럼(Applied Biosystems)을 이용하여 내독소제거, 정제된 rhCTGF의 용출하였다. 샘플 로딩전에 직렬 컬럼은 0.5 M NaOH로 세척하고 이어서 0.1M NaOH으로 세척한 후 최종 균등 완충액으로 세척하였다. 적하된 샘플은 직렬 컬럼으로 이동되고, Q-Sepharose 컬럼을 떼어낸다음 CM POROS 컬럼(Applied Biosystems)으로부터 염화나트륨의 농도를 350mM에서 1200mM으로 증가시키면서 CTGF를 용출시켰다. CTGF를 포함하는 용출된 분취물의 순도는 SDS-PAGE 분석을 통하여 평가한 후 최종 샘플 푸울을 만든다.

실시예 2. CTGF 의 N-말단 및 C-말단 단편 생산

CTGF의 N 말단 단편 및 C 말단 단편은 다음과 같이 준비하였다. 상기에서 준비하고 정제한 재조합 사람 CTGF를 실온에서 6시간 동안 키모트립신 비드(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)을 사용하여 키모트립신 단위당 1.5㎎ CTGF가 되도록 처리하여 절단하였다. 혼합물을 원심분리시키고, 키모트립신 비드를 버린 후, 효소에 의해 절단된 rhCTGF를 포함하는 상청액을 50mM Tris, pH 7.5를 사용하여 1:5로 희석시켰다. 희석된 상청액을 Hi-Trap 헤파린 컬럼에 적하시켰다. CTGF의 N-말단 단편을 포함하는 부분을 모았다. 헤파린 컬럼은 350mM NaCl으로 세척시키고, 결합된 CTGF의 C-말단 단편을 상기에서 설명하는 것과 같이 염화나트륨 농도를 350mM에서 1200mM로 증가시키면서 용출시켰다. 분취물은 SDS-PAGE를 이용하여 분석하고, CTGF의 C-말단 단편을 포함하는 분취물을 수득하였다.

CTGF의 N-말단 단편을 포함하는 헤파린 컬럼 유동액은 0.5M 황산암모늄 염/50mM Tris, pH 7.5로 조절하고, 15㎖ 페닐 세파로즈 HP 컬럼 (Amersham-Pharmacia)에 얹고, 이때 이 컬럼은 미리 0.5M 황산암모늄염/50 mM 트리스, pH7.5로 평형을 맞춘다. 이 컬럼을 0.5M 황산암모늄/50mM Tris, pH7.5의 15배 컬럼 용적으로 세척하고, 결합되어 있는 CTGF의 N-말단 단편은 황산암모늄/50mM Tris, pH7.5에서 황산암모늄의 농도를 0.5M 내지 0M로 조정하면서(약 15배 컬럼 용적) 용출시켰다. 분취물은 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였고, CTGF의 N-말단을 포함하는 분취물을 모았다. 모아진 용액을 농축시키고, ULTRACEL AMICON YM10 한외여과 막(Millipore Corp., Bedford MA)을 이용하여 완충액을 50mM Tris, 400mM NaCl(pH 7.2)으로 교환하였다.

실시예 3. 사람의 항-CTGF 단클론 항체 생산

HUMAB 생쥐 균주 HCo7, HCol2, HCo7+HCol2(Medarex, Inc., Princeton NJ)을 이용하여 사람 CTGF에 대한 완전한 사람 단클론 항체를 준비하였다. 생쥐에 2-4주간에 걸쳐 컴플리트 Freund 어주번트에서 25-50mg의 사람 CTGF를 복막(IP) 또는 피하(SC)를 통하여 최고 10회 면역주사하였다. 안와후방 출형을 통하여 면역반응을 모니터하였다. ELISA(상기에서 설명한 것과 같은)를 이용하여 혈장을 스크린하고, 충분한 역가의 항-CTGF 이뮤노글로블린을 가진 생쥐를 주입에 이용하였다. 죽이기 3일 및 2일전에 생쥐에게 정맥을 통하여 항원으로 부스터하고, 죽인후에 비장을 제거하였다.

면역주사를 맞은 생쥐의 비장 임파세포의 단일 세포 현탁액을 50% PEG와 함 께 P3X63-Ag8.65 비분비성 생쥐 골수종 세포(merican Type Culture Collection (ATCC), Manassas VA) 수의 1/4로 주입하였다. 세포는 평판 바닥 미량적정 플레이트에서 웰당 1x10⁵세포로 도말시키고, 포도당이 많이 포함된 DMEM(Mediatech, Herndon VA)(L-글루타민 및 피루베이트 나트륨, 10% 태아 송아지 혈청, 10% P388D1(ATCC) 조건화 배지, 3-5% 오리겐(origen) (Igen International, Gaithersburg MD), 5mM HEPES, 0.055mM 2-멀캅토에탄올, 50mg/㎖ 젠타마이신, 1xHAT(Sigma)이 보충됨)에서 약 2주간 배양시켰다. 1-2주후에, 세포는 HAT가 HT로 대체된 배지에서 배양되었다. ELISA(상기에서 설명한 것과 같음)를 이용하여 개별 웰을 스크린하였다. 항체 분비 하이브리도마를 재도말시키고, 다시 스크린하였다. 항-CTGF 항체에 포지티브한 경우에는 제한 희헛을 이용하여 적어도 2회 서브클론시켰다. 안정적 서브클론을 in vitro에서 배양하여 특징조사를 위한 조직 배양 배지에서 소량의 항체를 만들었다. 모세포의 반응성을 보유하는 각 하이브리도마로부터 한개 클론을 이용하여 액체 질소에 서장된 5-10개 바이알 세포 뱅크를 만든다.

ELISA 검사는 Fishwild et al.,(1996, Nature Biotech 14: 845- 851)에서 설명한 것과 같이 실행하였다. 간단하게 설명하면, 미량적정 플레이트를 1-2pg/ml 정제된 재조합 CTGF/PBS으로 웰당 50㎕로 피복시키고, 4°C에서 하룻밤동안 배양시킨 후에, 웰당 200㎕ 5% 닭 혈청 PBS/Tween (0.05%)으로 차단시켰다. CTGF-면역주사를 맞은 생쥐로부터 얻은 혈장 또는 하이브리도마 배양 상청액을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1-2시간동안 배양시켰다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척하고, 양고 추냉이 과산화효소(HRP)가 콘쥬게이트된 염소-항-사람 IgG Fc 다클론항체로 1시간동안 실온에서 배양시켰다. 세척후에, 플레이트를 0.22mg/㎖ ABTS 기질(Sigma)로 디벨럽시키고, 415-495nm에서 분광스펙트럼을 통하여 분석하였다.

실시예 4 항체 특징화

사람 CTGF에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 실시예 3에서 설명하는 것과 같이 준비하였다. 클론된 하이브리도마 세포를 Dulbecco 변형된 Eagle 배지-고농도 포도당/RPMI 1640(50: 50)+ 8mM L-글루타민, 1/2 x 비-필수 아미노산, 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 배지에서 생장시켰다. 항체 생산을 위해 확장된 세포를 1.5% 낮은 IgG 태아 송아지 혈청이 보충된동일한 배지에 4-9일동안 37°C 및 6% CO₂에서 생장시켰다. 생성된 조건화 배지에는 세포가 없고, 접선 유동 필터링/농축 시스템을 이용하여 농축시켰다. 농축물을 단백질 A-컬럼상으로 통과시키고, 100mM glycine, pH3으로 용출된 단클론 항체에 결합된다. 용출물은 1M 트리스, pH 8.0로 중화시키고, PBS에 대해 투석시켰다.

4.1 에피토프 매핑

면역학 분야에서는 경쟁적 결합 실험에 의한 항체의 에피토프 매핑은 공지된 기술이다(See, e.g., Van Der Geld et al. (1999) Clinical and Experimental Immunology 118:487-96). 독특하게 클론된 하이브리도마 세포에서 증식된 세포로부터 분리된 각 항체 집단을 매핑하였고, 표준 결합 및 차단 실험(See, e.g., Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Harlow and Lane (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2nd ed., (1994) Chapter 10(Immunochemical Techniques), Saunders; and Clinical Chemistry:Theory Analysis. Correlation (1984) Chapter 10 (Immunochemical Techniques) and Chapter 11 (Competitive Binding Assays), C. V. Mosby, St. Louis.)을 통하여 사람 CTGF상에 특이적 결합 도메인을 할당하였다. 독립적 결합 도메인은 우선 항체 경쟁 실험으로 한정시키는데, 이때 두 가지 상이한 항체를 연속하여 CTGF 피복된 플레이트 상에서 배양시켰다. 제 1 항체의 공간적 방해가 CTGF에 제2항체의 결합을 막는 경우에, 두 항체는 동일한 도메인을 할당받은 것이 된다.

그러나, 두 항체가 별개의 에피토프를 가지나 서로가 충분히 가까운 거리에 있는 경우에, 동일한 결합 도메인을 가지는 것으로 지정될 수도 있다는 것을 인지해야 한다.

사람 CTGF의 4개 엑손 모두에 뻗어있는 결합 도메인을 확인하였다. 모든 결합 도메인을 구조적으로 확인하였고, 웨스턴 블랏 검사에서 비-환원 조건하에 항체는 CTGF에 결합하였다. 항체의 일부는 웨스턴 블랏 검사에서 환원 조건하에서도 CTGF에 결합하였다. 이는 각 항체가 CTGF 단백질상에 선형 에피토프에 결합된다는 것을 제시하는 것이다. 전체 CTGF에 대한 최고의 친화력을 가지는 각 군의 항체를 특징 및 분석에 이용하였다.

좀더 정제된 에피토프 매핑은 CTGF의 특이적 재조합에 의해 발현되는 단편을 이용하여 ELISA 분석으로 실행하였다. 예를 들면, CTGF의 N-말단 도메인상에 에피 토프를 인지하는 항체는 CTGF 유전자의 엑속 2 또는 3의 재조합 발현에 의해 수득된 고정된 단편에 대해 ELISA 분석으로 확인하였다. 동일한 방법으로, CTGF의 N-말단 도메인 또는 N-말단 단편을 특이적으로 인지하는 항체를 선택하고 추가 특징화하였다. CTGF의 C-말단 도메인 또는 C-말단 단편을 특이적으로 인지하는 항체도 선택하고, 특징화하였다.

mAb1으로 정의된 에피토프 군은 엑손 3에 의해 인코드된 CTGF의 N-말단 단편상의 선형 에피토프에 결합된다. 엑손 3의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 절두된 합성 펩티드 부분을 만들고, 이들 펩티드를 이용한 ELISA 테스트를 실시하여, mAb1의 에피토프를 추가 정의하였다. 그 결과는 표 1에 정리하였고, 이때 “+"는 펩티드와 mAb1사이에 결합이 있음을 나타내고, 반면에 "-"는 mAb1이 펩티드에 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 굵은 "C"자는 펩티드에서 mAb1 결합에 필수적인 시스테인 잔기를 나타내는 것이고, 밑줄친 "C"는 고유 CTGF의 서열 부분은 아니지만 끝 부분에 첨가된 시스테인 잔기를 나타낸다.

따라서, mAbl는 CTGF의 N-말단 부분에 결합하는 항체 종류중에 하나이다. mAb1의 결합에 필수적이고 충분한 CTGF의 선형 에피토프는 사람 CTGF의 아미노산 L143에서 V154(SEQ ID NO:2)에 의해 정의된다. 이 펩티드의 mAb1 결합 특이성에 대한 추가 확인은 RIA 및 친화력 크로마토그래피를 이용하여 얻었다.

이 에피토프의 전부 또는 일부를 공유하는 항체도 본 발명에 포함된다. 추가로, CTGF 또는 이의 단편에 결합하는 mAb1와 경쟁하는 항체도 본 발명에 속한다.

4.2 CTGF 에 대한 항체 친화력

항체 친화력은 항체상의 단일 항원-결합 부위와 항원상에 단일 에피토프 사이에 전체 비-공유 상호작용의 힘으로 정의된다. 친화력은 연합 상수(Ka)를 측정하여 계산하는데, 다음과 같다;

[ 수학식 1]

이때, [Ab]는 항체상의 자유 항원 결합 부위의 농도이고; [Ag] 는 자유 항원의 농도이고;[Ab Ag]는 항체상에 항원이 차지하게 되는 항원 결합 부위의 농도이고; Kd는 항체-항원 복합체의 해리 상수이다.

RIA를 이용하여 에피토프 매핑을 통하여 확인된 각 항체 집단의 친화력을 측정하는데, 이때 전체 rhCTGF를 방사능-요오드화하고, 다음과 같이 고정된 단클론 항체를 포함하는 웰에 첨가하였다. 재조합 사람 CTGF은 클로라민-T 방법(See, Greenwood et al. (1963) Biochem J 89: 114-123)을 이용하여 ¹²⁵I로 방사능라벨시켰다. 일반적으로, ¹²⁵I의 60%가 결합되고, 라벨된 CTGF의 특이항체는 적어도 1X10⁵cpm/ng이며, 특이 활성이 낮은 라벨된 CTGF도 방사능면역검사에 이용될 수 있다. Typically, at least

Ca2⁺ 및 Mg^{2 +} 없는 DPBS(Mediatech, Herndon VA)에서 염소 항-사람 IgG, γFc-특이적 캡쳐 항체(Jackson ImmunoResearch)를 MAXISORP BREAKAPART 미량적정 플레이트(Nalge Nunc International, Rochester NY)에 첨가하고, 결합할 수 있도록 4°C에서 하룻밤동안 방치하였다. 웰에 1% BSA Ca2⁺ 및 Mg^{2 +} 없는 DPBS를 이용하여 적어도 4시간동안 4°C에서 블럭시켰다. 차단 용액을 제거하고, 2-50ng의 Ca2⁺ 및 Mg^{2 +} 없는 DPBS에서 100㎕ 테스트 항체를 첨가하고, 결합할 수 있도록 4℃에서 하룻밤동안 방치하였다. [¹²⁵I]rhCTGF의 일정량에서 라벨안된 CTGF을 연속 희석한 혼합물을 웰에 첨가하고, 4-8시간동안 실온에서 배양시켰다. 웰을 0.1% Tween 20/Ca2⁺ 및 Mg^{2 +} 없는 DPBS(Mediatech)로 4회 세척하고, 미량적정 플레이트의 웰을 분리시키고, 감마 카운터를 이용하여 카운터하였다.

Scatchard(1948, Ann NY Acad Sci 51:660-72) 방법을 이용하여 친화력을 그래픽으로 평가하였다. 플레이트에 제공된 라벨된 CTGF의 전체 농도는 다음과 같이 계산하였다.

이때, cpm-applied는 기준 바이알로부터 얻은 카운트이고, 이는 미량적정 플레이트의 웰과 나란하게 CTGF 혼합물과 함께 로딩된다; cpm/ fmol은 [¹²⁵I]CTGF의 특이 활성을 나타낸다; [CTGF]_{cold_stock}은 각 웰에 첨가된 라벨안된 CTGF의 농도이고; dilution은 라벨안된 CTGF의 희석 인자이다.

항체에 결합된 CTGF 농도는 웰에 결합된 카운트 비율과 웰에 제공된 전체 CTGF의 농도에서 계산할 수 있다.

자유(미결합된) CTGF의 농도는 제공된 CTGF의 전체 농도와 결합된 CTGF의 농도 차이다.

도 2에서는 본 발명의 항체의 Scatchard 플롯에 의한 친화력 결정을 보여주고 있다. 도 2A에서는 라벨안된 rhCTGF의 농도를 증가시키면서 [¹²⁵I]CTGF에 본 발명의 항체 mAb2의 결합을 플롯한 것이다. 도 2B는 라벨안된 rhCTGF의 농도를 증가시키면서 [¹²⁵I]CTGF에 본 발명의 항체 mAb1의 결합을 플롯한 것이다. 결합된 CTGF와 결합안된 CTGF가 유사한 비율인 점에는 더 큰 가중치를 부여하는데, 그 이유는 이 점들은 실질적으로 과량의 블랭크(여기에서 잘 측정된 결합 카운트)에 결합 카운트를 가지기 때문이나, 적용된 전체 카운트(여기에서 잘 측정된 프리 카운트)보다는 실질적으로 작다. 최대 결합(Bmax) 및 Kd는 각각 x- 및 y-절편을 나타낸다.

CTGF에 대한 mAb1의 친화력(Kd)은 10^-9M이하이고, 시판되는 항체 요법에서 흔히 볼 수 있는 친화력이다(See, e.g., Maini et al.(1998) Arthritis Rheum 41: 1552-1563; Targan et al.,(1997) N Engl J Med 337: 1029-1035; Bumgardner et al.,(2001) Transplantation 72: 839-45; and Kovarik et al. (1999) Transplantation 68:1288-94). 따라서, mAb1은 치료목적에 적합한 추천물질이며, 상기에서 설명하는 것과 같이 mAb1과 에피토프 결합을 공유하고, mAb1과 유사한 또는 이보다 큰 CTGF 친화력을 가지는 항체(즉, Kd가 10^-9M이상)이 치료목적에 사용할 수 있는 적절한 후보물질이다. mAb1과 에피토프 결합을 공유하나 mAb1보다는 친화력이 낮은(Kd가 큰) 항체도 본 발명의 구체예에 포함되고, 이는 여기에서 설명하는 것과 같은 다양한 검사 및 진단 부분 응용에 유용하다. 이와 같은 항체들은 추가로 치료에 유용한데 특히 하기에서 설명하는 것과 같은 항원에 대한 높은 결합력(Avidity)을 가지는 경우에 유용하다.

4.3 항체 결합력

한개이상의 항원 결합 부위를 가지는 항체(다가)의 경우에 한개 결합 부위에서 친화력이 항상 항체-항원 상호작용의 강도를 반영하는 것은 아니다. 다가항체가 다중 반복 에피토프를 가지는 항원에 경합하면, 항체에서 한개 결합 부위에서의 한개 항원과의 상호작용은 추가 결합 부위에서의 항원 상호작용 기회를 증가시킨다. 결합력(Avidity)은 항원과 항체의 기능적 결합 강도를 측정하고, 이는 에피토프와 파라토프사이에 반응 친화력과 연관이 있으며, 항원과 항체의 밸런스(valencies)와도 관계가 있다. 따라서, 결합력은 항체가 해리되는 정확한 경향을 제공한다.

높은 결합력은 낮은 친화력을 보상할 수 있다. 예를 들면, IgM 항원 결합 부위는 일반적으로 IgG보다는 친화력이 낮지만, IgM의 다가성이 높은 결합력을 제공하여, 항원에 효과적으로 결합할 수 있도록 한다.

본 발명의 항체 결합력을 결정하기 위해, 상응하는 이뮤노글로블린의 통상적인 파파인 처리에 의해 Fab 단편을 우선 준비한다. 고정된 단백질 A를 이용하여 Fc 및 절단안된 항체로부터 Fab 단편을 분리하였다.

0.5㎖ 고정 겔, 250㎍ 파파인, 3.5 BAEE units를 포함하는 약 1㎖ 고정된 파파인 슬러리를 절단 완충액(Digestion Buffer)(DB; 20mM 인산나트륨염, 10mM EDTA, 20mM 시스테인, pH7.0)으로 3 x 1㎖ 및 1 x 10㎖ 세척한다. 슬러리를 0.3㎖ DB로 세척하고, 1.1㎖ 항체(약 5 mg, pH 7)으로 재현탁시키고, 37°C에서 하룻밤동안 교반시켰다. 항체 절단물을 수지로부터 분리시키고, Fab 단편을 Fc단편 및 절단안된 항체으로부터 단백질 A를 이용하여 친화력 크로마토그래피를 이용하여 분리시켰다. Fab 단편의 순도는 SDS-PAGE (도 3A)을 이용하여 모니터하였다.

티오시아네이트 농도를 다양하게 하면서 항원 결합된 항체를 용출시켜 이가(bivalent) 결합으로부터 단가(Monovalent) 결합을 구별하였다. 용액에서 혼돈유발이온(chaotropic ion)(티오시아네이트) 농도를 증가시켜, 친화력이 낮은 연합(가령, 항원에 Fab의 단가 결합)을 우선 파괴하고, 친화력이 높은 연합(리간드에 IgG의 이가 결합)은 방해를 받지않도록 해둔다. 따라서, 티오시아네이트 농도를 증가시킴으로써 두 가지 상이한 결합을 구별해낼 수 있다.

플레이트를 10㎍/㎖ CTGF 또는 CTGF 펩티드/50mM 중탄산염 완충액(pH8.5)로 4°C에서 하룻밤동안 코팅시키고, 차단물질 카제인/TBS을 이용하여 4°C에서 하룻밤동안 차단시키고, 100㎍/㎖ 항체 또는 이에 상응하는 Fab/차단물질/TBS로 실온에서 하룻밤동안 교반시키면서 배양시켰다. 플레이트를 티오시아네이트(0-7.6M)/100mM 인산완충액(pH 6.0)으로 15분간 희석시키고, 이어서 실온에서 45분간 알칼리 포스포타제-생쥐 항-사람 (Fab)₂ 콘쥬게이트(1:1000 희석)와 희석시켰다. 알칼리 포스포타제 기질(1mg/㎖; Sigma)/1M 디에탄올아민, 0.5mM MgCl₂(pH9.8)을 첨가하고, 플레이트는 실온에서 배양시키고, 405nm에서 흡수도를 2분, 10분, 20분, 60분에 측정하였다.

친화력 지수는 초기 흡수도의 50%가 감소된 혼돈유발물질(티오시아네이트)의 농도를 말한다. 본 발명의 예시적 항체, mAb1의 경우, CTGF으로부터 Fab 해리의 친화력 지수는 0.46M이며, 반면에 CTGF에서 고유 IgG의 해리에 대한 친화력 지수는 1.8M(도 3B)이다. 따라서, mAb1은 항원에 주로 이가(결합력)으로 결합하고, 항원으로부터는 단가에 의해 결합되는 항체보다 서서히 해리되었다. mAb1과 에피토프-결합 변수를 공유하는 본 발명의 추가 항체도 유사하게 이가 또는 단가 또는 다가일 수 있다. 본 발명의 임의 항체는 결합력이 개선되도록 조절될 수 있는데, 가령, 에피토프-결합 부위를 단일 항체 구조에 복합시켜, 트리바디(tribody)를 만들 수 있다(See, e. g, Schoonjans et al.(2000) J Immunol 165:7050-7057).

4.4. 교차 결합

상기에서 설명하는 방사능면역검사(실시예 4.2)를 이용하여 항체의 교차-반응성을 결정할 수 있는데, 단 라벨안된 thCTGF는 다른 라벨안된 경쟁물질, 정상적인 쥐 신장(NRK) 세포에서 유도된 쥐의 CTGF로 대체되었다. NRK 세포를 합류가 일어날 때까지 생장시키고, 그 다음 배양 배지를 2 ng/㎖ TGF-베타, 50㎍/㎖ 헤파린, 250㎍/㎖ BSA을 포함하는 무혈청 배지로 교환하였다. 조건화 배지를 배양 2일 후에 수득하고, 원심분리시켜 찌꺼기를 제거하고, 헤파린-세파로즈 비즈(1/100 v/v 비드 상청액:배지)로 2시간동안 4°C에서 교반시키면서 배양시켰다. 그 다음 혼합물을 원심분리시키고, 비드를 수거하여, PBS로 세척시키고, SDS 완충액에서 용해시켰다.

도 4A에서는 라벨안된 쥐 CTGF의 농도를 증가시키면서 [¹²⁵I]rhCTGF에 mAb2의 결합을 Scatchard 플랏으로 나타내었고; 도 4B에서는 라벨안된 쥐 CTGF의 농도를 증가시키면서 [¹²⁵I]rhCTGF에 mAb1의 결합을 Scatchard 플랏으로 나타내었다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이 mAb1은 사람 및 쥐의 CTGF에 모두 결합하였고, mAb2는 사람에는 결합하지만 쥐의 CTGF에는 결합하지 않았다.

mAb1의 경우에 쥐 CTGF와 경쟁을 하는 Scatchard 플롯(도 4B)은 rhCTGF와 경쟁하는 플롯(도 2B) 더 경사가 완만하였고, 표면 친화력이 낮았고, 더 높은 표면 Bmax를 가졌다. 따라서, 쥐 CTGF는 mAb1에 결합에 대해 사람 CTGF와 경쟁할 수 있을지만 항체는 재조합 쥐 CTGF보다는 재조합 사람 CTGF에 대해 더 높은 친화력을 가진다. mAb1은 또한 생쥐 및 원숭이 CTGF와 교차 반응하였다(데이타는 나타내지 않음). 다른 종의 CTGF에 대하 적절한 친화력을 나타내는 항체를 이들 종의 질병 치료 및 예방에 이용할 수 있다. 예를 들면, 개 CTGF에 적절한 Kd를 가지는 본 발명의 항체는 개에서 CTGF 관연 질환을 치료하는데 이용할 수 있다. mAb1과 같이 종간의 교차 특이성을 가지는 본 발명의 항체는 다양한 동물 모델에서 CTGF 연관 질환을 연구하기 위한 연구 도구로도 유용하다.

4.5 글리코실화반응

상기 방사능면역검사(실시예 4.2)를 이용하여 항원 결합 친화력에 항체 글리코실화 효과를 측정하였다. 항체 mAb1를 37°C에서 PBS, 0.5 M EDTA, pH8.0, 펩티드 N-글리코실화 효소 F(PNGase F)로 8일간 처리하하면, N-연결된 글리코단백질로부터 올리고사카라이드가 절단된다. 배양 후에, 반응 용액을 직접적으로 이용하거나 단백질 A-SEPHAROSE FASTFLOW컬럼(Amersham Bioscience, Piscataway NJ)에서 분취, 0.1M 글리신-HCl, pH 2.5으로 용출시켰다. 분취후에 항체 회수률은 약 87%이고, 내독소 수준은 0.30EU/mg이었다. 디글리코실화는 SDS-PAGE로 확인하였다. 디글리코실화된 항체의 사람 재조합 CTGF에 대한 결합 활성은 항체의 글리코실화형의 결합 활성에 대한 실험 오차범위에서 동일하였다

다양한 세포가 글리코실화 패턴이 상이하기 때문에, 재조합 단백질생산, 가령, 배양된 세포 또는 비-균질성 종에서 생산은 비-고유 글리코실화 패턴을 만들 수도 있다. 일부 단백질이 활성을 위해 특정 글리코실화를 요구하고, 변경된 글리코실화는 활성을 감소시키고, 항체의 경우에 항원의 친화력이 감소된다. 특정 시스템 예를 들면, 식물 및 계란에서 단백질 생산은 면역원성을 가지는 글리코실화 패턴을 만들고 이는 특정 용도에서 이용할 수 있는 능력이 감소된다. 본 발명의 항체는 글리코실화형이나 글리코실화되지 않은 형에서 동일한 활성을 나타내어, 본 발명은 글리코실화 특히 종-특이적 글리코실화에 제한을 받지 않는다는 것을 설명한다.

실시예 5. 세포 이동 검사

세포 이동은 정상적이고 중요한 세포내 사건으로, 발생 및 상처 치요등에서 중요하다. 세포 이동은 섬유성 병소 형성과 같은 질병의 인자이며, 섬유성 병소에서 분리된 세포는 이에 상응하는 정상 조직의 세포 보다 화학적 자극물질에 대해 더 반응성이 크다.

본 발명의 항체는 Boyden 챔버 검사를 이용하여 평활근 세포의 CTGF-자극된 화학주성 이동을 저해하는 능력에 대해 평가를 받았다. 0.1% 태아 송아지 혈청(FCS)을 포함하는 배지에 생쥐 동맥 평활근 세포(ASMCs)를 Boyden 챔버 상측 격실에 첨가하고, 300ng/㎖ rhCTGF, 10% FCS, 또는 0.1% FCS 만을 포함하는 배지를 아래 격실에 첨가하였다. 직경이 8㎛인 구멍이 있는 콜라겐-피복된 필터로 상하 격실이 구별된다. 세포는 필터를 통하여 2-3시간동안 흡착 및 이동할 수 있었다. 그 다음 필터를 제거하고, 필터상에 세포를 고정시키고, 착색시키고, 필터를 통하여 이동된 세포를 카운터하였다. 300ng/㎖ rhCTGF으로 배양시키면 0.1% FCS 기준에 비해 필터를 통하여 세포 이동수가 약 5배 증가되었다. CTGF에 자극을 받은 이동의 증가는 10% FCS(다중 화학주성 인자를 포함하고 있슴)에서 화학주성 효과의 약 27%에 해당된다.

본 발명의 항체는 상기에서 설명하는 검사를 이용하여 CTGF 중개된 세포 이동을 저해하는 능력에 대해서도 테스트 받았다. 단, 항-CTGF 항체(30mg/㎖ 및300mg/㎖) 또는 푸울 사람 IgG를 하측 챔버에 첨가하였다. 3개 별도 필터의 각각으로부터 세포의 4부분으로 이동을 각 검사에서 각 샘플에 대해 카운터하였다. 그 결과는 표 2에 나타내었다.

표 2에서 볼 수 있는 바와 같이 mAb1에 의해 특정되는 에피토프내에서 CTGF에 결합되는 항체는 약량-의존성 방식으로 CTGF 중개된 세포 이동을 저해한다. 이 에피토프 군의 항체가 반복적으로 그리고 재생적으로 CTGF-유도된 이동을 저해하는 유일한 항-CTGF 항체이었다.

맥관형성, 연골세포 분화 및 온코젠형성등과 같은 다양한 과정은 세포 흡착 및 이동에서 변형을 요구한다. CTGF는 세포 흡착 및 이동과 연관이 있으며, 한 활성은 다른 활성에 분별적으로 영향을 미치기 위해 CTGF에 대한 항체의 능력이 CTGF 연관된 상태 치료를 위한 치료제의 다양한 레파토리를 제공한다. 본 발명에 의해 제공되는 항체는 CTGF 활성 중화와 관련된 차별적 활성을 설명한다. 하기에서 예시화된 것과 같이, 이들의 능력은 항-CTGF 항체 종류에서 독특한 치료효과를 제공한다.

실시예 6. 폐 질환

생쥐에 블레오마이신을 기관내 주입(IT)하여 모델 시스템을 이용하여 폐 섬유증을 연구하고, 원하는 항-섬유증 물질을 선별한다. 다음에서 설명하는 것과 같이, Wang et al. (2000) Biochem Pharmacol 60: 1949-1958에서 설명하는 공정을 이용하여 in vivo에서 블레오마이신-유도된 폐 섬유증을 감소시키는 본 발명의 항체 능력을 테스트하였다.

수컷 C57BL/6 생쥐를 무작위로 두 개 군으로 나누었다. 생쥐를 이소플루오란으로 마취시키고, 단일 약량의 블레오마이신/0.9% 염 용액(한마리당 0.1unit/50㎕) 또는 0.9% 염만을 기관내 주입시켰다. 각 군을 나누고, 즉각 염 또는 복막(IP)으로 투여된 항체와 함께 총 7회 약량을 이틀에 한번씩 투여하였다. IT 주입후 14일에 마취한 후에 복부 동맥의 피를 빼내 쥐를 안락사시키고, 폐 조직을 수득하였다.

Palmerini et al.(1985; J Chromatogr 339: 285-292)의 방법을 이용하여, 하이드록시프롤린 및 프롤린의 수준을 측정함으로써 폐 콜라겐 함량을 분석하였는데, 단, 내부 기분으로 L-아제티딘 2-카르복실산(Aldrich)을 3,4-데하이드로프로린에 대체하여 사용하였다. 간략하게 설명하면, 조직 샘플을 6N HCl에서 22시간, 105°C에서 가수분해시키고, 샘플은 o-프탈알데히드로 그리고 그 다음 4-클로로-7-니트로벤조퓨란(Aldrich)선 컬럼 유도화하여, 프롤린 및 하이드록시프롤린의 형광 부가물을 만들었다. 형광 부가물은 역상 HPLC 및 형광 감지를 이용하여 분리하였다.

도 5에서는 본 발명의 예시적 항체인 mAb1, 염(SA), CTGF-특이적 항체(AbsJ)의 치료요법적 투여 결과를 블레오마이신 처리 후에 폐 섬유증을 억제하는 이들의 능력과 비교한 결과를 나타내었다. 도 5A에서 볼 수 있는 것과 같이, 블레오마이신 처리(BL+SA)하면, 대조군과 비교하여 폐의 하이드록시프롤린 함량이 상당히(168%) 증가하였다(SA+SA; 220 + 15㎍/lung). 그러나, 본 발명의 항체 푸울(BL+AbsJ)로 연속 처리하면 블레오마이신-처리된 것과 비교하여 폐의 하이드록시프롤린이 60% 감소되는 것으로 나타났다. 유사하게, mAbl(BL+ mAbl)으로 연속 처리하면 블레오마이신만으로 처리된 것과 비교하였을 때, 폐 하이드록시프롤린이 70% 감소된 것으로 나타났다.

생쥐 폐의 조직학적 검사에서 대조군에서는 정상적인 폐 실질조직이 나타났다(자료 없슴). 그러나, 블레오마이신 처리된 폐에서는 섬유증 부분이 증가된 것을 선명하게 확인할 수 있다(도 5B; 화살표). 블레오마이신 처리이 이어, 본 발명의 항체를 투여하면 섬유증 부분이 명백하게 감소되었다(도 5C). 일부 로브에서는 여전히 간질성 섬유증이 있었다. 따라서, 본 발명의 항체를 특발성 폐 섬유증(IPF)를 앓고 있는 또는 그런 위험에 처한 환자에 투여하면 치료요법적 효과를 제공할 수 있다.

실시예 7 신장 질환

7.1 신부전

신세뇨관증 섬유증은 신부전의 마지막 단계로 진행되는 몇가지 신장 질환의 주요 요소이다(Sharma et al. (1993) Kidney Int 44 : 774-788). 신장 기능의 감소 및 간질성 섬유증의 증가를 특징으로 하는 일측 수뇨관 폐쇄증(UUO)를 실험 모델로 이용하여, 신세뇨관증 손상 및 섬유증을 유도하였다(Fern et al. (1999) J Clin Invest 103: 39-46.)

생쥐는 이소플루오란으로 마취시키고, Moriyama et al.(1998; Kidney Int 54: 110-119)의 방법을 이용하여 좌측 수뇨관을 결찰시켰다. 생쥐는 외과술 즉시 처리하고, 염 또는 복막으로 항체 투여를 총7회 약량으로 이틀에 한번씩 처리하였다. UUO 발형 부 14일에 동물을 마취시키고, 복부 동맥의 피를 방혈시켜 안락사 시켰다. 좌우 신장을 별도로 떼내어 무게를 잰다. 각 신장의 절반을 10% 포르말린에 고정시켜 조직 검사(트리크롬 착색)를 하고, 나머지 절반의 무게도 측정하고, 하이드록시프롤린 측정을 위해 -70°C 에 보관하였다. 상기에서 설명한 것과 같이 하이드록시프롤린 및 프롤린을 측정하였다.

도 6A에서 볼 수 있는 것과 같이, 각 생쥐에서 폐쇄안된 우측 신장에 비교하여 폐쇄된 좌측 신장에서 플롤린에 대한 하이드록시프롤린의 비율을 측정한 결과 UUO는 신장 콜라겐 함량을 약 4배 증가시켰다. 본 발명의 항체, mAb1으로 치료하면 폐쇄된 신장의 섬유증이 약량 의존적인 방법으로 통계학적으로 상당히 감소되었다(도 6A). 그러나, CTGF의 C-말단 에피토프에 결합하는 항체인, mAb3는 유의성있는 효과를 나타내지 못하였다. UUO의 트리크롬 착색으로 콜라겐 축적이 증가된 부분을 확인하였다(도6B, 화살표), 반면에 본 발명의 항체로 처리하면 폐쇄된 신장에서 콜라겐 착색이 상당히 감소되었다는 것을 볼 수 있다(도 6C).

또는 신장 섬유증을 쥐의 잔유 신장의 진행성 신부전의 모델에서 연구할 수도 있다. 대측되는 신장을 완전히 제거한 신장제거(5/6 신장제거)와 복합하여 2/3 일측 신장제거된 모델은 남은 신장에서 만성 신부전과 연관된 실질조직의 퇴행성 변화를 유도하여, 동물은 요독증을 보이고, 상당한 단백뇨증, 사구체경화증, 간질성 섬유증, 세뇨관 위축을 보였다(See, e. g. , Frazier et al. (2000) Vet Pathol 37: 328-335; and Gandhi et al. (1998) Kidney Int 54: 1157-1165).

Frazier et al.(2000, Vet Pathol 37: 328-335)의 방법에 따라 5/6 신장 절제술을 실행하였다. 주령이 5주된 Sprague-Dawley 쥐(Harlan, Indianapolis IN), 체중 120g를 케타민 및 실라진으로 마취시키고, 좌측 신장의 앞부분(cranial) 1/3과 끝부분 1/3을 잘라내었다. 거즈 스폰지를 제공하여 지혈시키고, 복부는 염, 0.2㎖ 부토페놀로 씻어내고, 동물을 봉하였다. 처음 외과술 후 1주일 뒤에, 반대측 신장을 완전히 제거하였다.

쥐를 염 및 항체 처리군으로 나누고, 5/6 신장 절제후 2주에 치료를 개시하였다. 염 또는 5mg/kg의 약량의 항체를 IP주사(매회 0.5mL)를 통하여 15일간 매 3일마다 투여하였다(총 5회 주사). 혈액 및 뇨를 무작위로 신장절제된 쥐로부터 매주 취하여 신장 질환 발생 및 조직적 변화와 신장 기능이상의 상관관계를 파악하였다. 신장 섬유증 분석, 소변검사, 혈청 화학 검사의 결과를 처리후 18일과 28일에 하여 군간을 비교하였다.

신장 섬유증은 블라인드 방식으로 두 명의 병리학자들에 의해 별도로 평가되었다; 세 가지 별도 형태학적 착색(헤마토실린/에오신, Masson 트리크롬, 피크르산-시리우스 레드)을 이용하여 각 신장으로부터 세 가지 조직 부분을 검사하였다. 또한, 냉동 단편상에서 면역조직학적 검사를 실시하여 신장의 각 위치에 콜라겐 침착 형태를 평가하였다. 정량적인 콜라겐 평가(하이드록시프롤린/프롤린 비율)를 실행하고, 소변 검사 및 안락사시에 수득된 샘플의 혈청 화학검사를 이용하여 신장 기능을 평가하였다.

항체 처리안된 신장과 처리된 잔유 신장사이에 조직학적으로 섬유증에서 약간의 차이가 있었다(도 7). 처리 3일째에, 맹검(blinded) 개체 평가결과 염 처리군에서는 평균 섬유증 수치가 12.6이고, 항체 처리군에서는 10.7이었다(p<0.05). 항체 처리된 생쥐 및 염 처리된 생쥐사이에 조직학적 섬유증에서 통계학적 유의성 있는 차이는 처리후 14일에 유지되고, 염처리군에서 평균 섬유증 수치는 16.9이고, 항체 처리군에서 섬유증 수치는 14.4 (p<0.05)이었다. 콜라겐의 정량적 하이드록시프롤린 함량 분석에서 염-처리군에 비교하여 항체-처리군에서는 섬유증이 감소되는 경향이 있으나, 그 차이가 통계학적으로 유의성이 있지는 않았다.

처리군간에 정량적인 차이가 있었다. 항체 처리군에서 콜라겐 침착의 대부분은 피질수진(corticomedullary) 피질 간질에 제한되었고, 염 처리군에서 섬유증은 피질 및 수질에 산발적으로 분포되어 다중 초점을 이루었다. 가장 두드러진 조직병리학적 차이는 사구체 섬유증의 양이다. 염 처리된 군의 대부분은 캡슐주변 섬유증, 두꺼워진 Bowman 막, 유착, 사구체 감가(glomerular obsolescence)등을 수반한 약한 사구체경화증에서 심각한 사구체경화증까지 있다. 이와 같은 변화는 항체 처리된 쥐 신장을 포함하는 다른 군에서 미미한 수준부터 약한 정도까지 있었다. Masson 트리크롬 및 피크르산-시리우스 레드 착색으로 콜라겐 축적을 볼 수 있었다.

진행성 신부전의 두 가지 모델에서 본 발명의 항체는 조직 파괴를 감소시키고, 신장 기능을 개선시켰다. 따라서, 본 발명의 항체를 사구체 신증, IgA 신증, 사구체경화증과 같은 신장 질환 및 독성으로 인한 신부전 및 세뇨관 파괴를 앓고 있는 환자 또는 이런 위험에 처한 환자에게 투여하였을 때 치료 효과를 제공한다.

7.2. 당뇨성 신증

당뇨병은 신장, 심장, 눈을 포함하나 이에 국한되지 않은 여러 기관의 기능부전에 이르게 한다. 당뇨성 기관 기능부전의 주요 병라학적 진행 요인이 섬유증이다. 당뇨성 신증의 모델은 렙틴 수용체에 기능손실 돌연변이를 가지는 생쥐이다(Ob-R; db 유전자에 의해 인코드됨). db/db 생쥐 및 사람의 당뇨성 신증사이게 공통된 주요 특징은 신장 비재, 사구체 확대, 단백뇨증, 혈관간기질 팽창(mesangial matrix expansion)을 포함한다.

본 발명의 항체는 다음과 같이 당뇨성 신증의 db/db 모델을 이용하여 테스트하였다; 8주령의 db/db 생쥐(Harlan, Indianapolis IN)와 이들의 이형접합체 db/+ 한배새끼에게 본 발명의 항체(CLN1; 하기 참고) 또는 기준 사람 IgG(cIgG)를 복막 주입하여 처리하였다. 모든 동물에서, 항체 300㎍을 처음 주사한 후 30일간 매주 3회 100㎍을 투여하였다. 혈액 샘플 및 체중은 시작시 그리고 치료기간을 통하여 주기적으로 체크하고 수득하였다. 음식 소비 또한 기록하였다.

11주째에, 체중, 혈당 수분, 음식 소비에 있어서, 당뇨병 동물(db/db )과 비 당뇨병 동물(db/+)간에 명백한 차이가 있었다. 본 발명의 항체 또는 기준 항체로 치료하면 이들 변수에 심각한 영향을 주지는 않았다. 그러나, 신장 기능을 다양하게 측정하면 당뇨병 및 당뇨병이 없는 생쥐간에 명백한 차이를 설명하였다. 표 3에서 볼 수 있는 것과 같이, 당뇨병 생쥐는 비-당뇨병 쥐에 비교하여 신장 무게, 크리아티닌 제거, 알부민 방출 속도(AER)가 증가되었다. 그러나, 본 발명의 항체로 처리된 당뇨병 동물은 모든 변수에서 정상치를 나타내었다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 그룹당 생쥐 수(n)는 9 내지 15이다.

CTGF가 높은 포도당에 의해 유도되고, CTGF가 진행성 글리케이션 생성물(AGE)과 같은 손상 결과로 조직에서 ECM 생산을 포함하는 다양한 활성을 중재하기 때문에, 당뇨성 신증과 같은 당뇨병 연관된 질병을 본 발명의 항체를 이용하여 예방할 수 있을 것이다.

실시예 8. 안과 질환

CTGF 발현 증가는 증식성 망막병증(PVR), 황반변성, 당뇨성 망막증을 포함하는 다양한 안과질환과 연관되어 있다(See, e.g., Hinton et al. (2002) Eye 16: 422-428 ; He et al.(2003) Arch Ophthalmol 121: 1283-1288; and Tikellis et al. (2004) Endocrinology 145: 860-866). CTGF의 역할 및 항-CTGF 요법 이용을 제안하였다(International Publication No.WO03/049773). 본 발명의 항체는 이와 같은 안과 질환에 항-CTGF 치료요법적으로 독특한 효과를 제공한다. 안과 질환에서 합병증을 경감시키는 본 발명의 항체의 능력을 안과 질환 모델에서 다음과 같이 테스트하였다.

8.1. 당뇨성 망막증

상기 실시예 7.2에서 당뇨병을 가진 동물 모델 가령, 당뇨병 쥐(db/db)을 설명하였다. 이들 모델중 임의의 것을 이용하여 본 발명의 항체를 이용한 당뇨증 망막증 치료 효과를 설명할 수 있다. 당뇨성 망막증의 특정 모델은 하기와 같이 제공하고, 이때 동물에는 인슐인-분비 췌장 섬 세포의 공지 독소로 알려진 스트렙토조토신(STZ)을 주사하였다.

쥐(예를 들면, Long-Evans, Sprague-Dawley, 등)에서 복막으로 약 60 내지 85㎎/㎏의 STZ를 주사하여 당뇨병을 유도하였다. 생존을 개선시키기 위해, 쥐에 STZ 주사후에 하루에 24시간 동안 10% 설탕물을 제공하거나 또는 2 내지 4units 인슐린을 제공하였다. 체중, 뇨 알부민 방출 속도, 혈당, 글리케이트된(glycated hemoglobin), 혈압등의 다양한 인자를 4, 8, 12주후에 측정하였다. 완충액만을 주사한 기준 동물에도 동시에 한다. STZ-처리된 쥐와 기준 위의 절반을 본 발명의 항체로 처리한다(정맥, 복막 또는 안구로 주사). 연구에서 동물은 음식 및 물에 임의로 접근할 수 있다. 동물을 12주에 죽이고, 눈을 회수하여 조직학적 변화를 검사하였다.

비-처리된 대조군에 비하여 항체-처리된 동물에서 병리학적 변화 감소는 당뇨성 신증에서 치료효과가 있다는 것을 말한다.

CTGF가 높은 포도당에 의해 유도되고, CTGF가 진행성 글리케이션 생성물(AGE) 형성 및 축적과 같은 손상 결과로 조직에서 ECM 생산을 포함하는 다양한 활성을 중재하기 때문에, 당뇨성 망막증과 같은 당뇨병 연관된 질병을 항-CTGF 치료제를 이용하여 예방할 수 있을 것이다(See, e.g., International Publication No. WO03/049773). 본 발명의 항체는 당뇨성 망막증과 같은 안과 질환에 항-CTGF 치료제의 독특하고 치료요법적으로 효과적인 종류를 제공한다.

8.2. PVR

토끼 망악 색소 상피세포(RPE)를 성인 토끼 눈으로부터 분리하여 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 부합류 배양(일반적으로 계대 2-3)을 모든 주사에 사용하였다. 주사시에, 배양된 RPE 세포를 수득하고, PBS에 현탁하여 ㎖당 2.5x10⁶세포가 되도록 하였다. 약 0.2㎖ 수용성 체약을 각 수용 토끼로부터 25-가우지 바늘을 이용하여 빼내고, RPE 세포를 공막을 통하여 27-가우지 바늘을 이용하여 시신경의 아래위 주변 후부 3㎜지점에 주사하였다. RPE 세포 주사후에, 0.1㎖ PDGF BB(50-150ng), CTGF (200-400ng), PDGF, CTGF/PBS를 동일한 위치에 주사하였다. 각 동물에서 주사안된 눈을 대조군으로 이용한다. 선택적으로, CTGF를 처음 주사루 7일 또는 14일에 추가 주사할 수 있다. 동물의 절반을 본 발명의 항체로 처리하였다(정맥, 복막, 또는 안구로 주사). 주사 부위에 따라, 항체를 매일 또는 빈도를 덜 하게(7, 10, 14일) 주사할 수 있다.

간접적인 검안경 과정을 이용하여 동물을 검사하여 PVR의 발생 및 정도를 모니터하는데, 이는 Fastenberg(Fastenberg et al.(1982) Am J Ophthalmol 93: 565-572)에 따라 분류하였다. 그 다음 동물을 죽이고, 막 형성 정도 및 섬유증에 대해 조직 검사를 통하여 눈을 분석하였다. 추가로, 망막 및 섬유증 막을 수득하여 콜라겐 함량을 측정할 수 있다.

또는, Frenzel et al.(1998, Invest Ophthamol Vis Sci 39 : 2157-2164)의 과정 및 동물 모델을 이용하여 Dispase(디스파즈-제품명)를 망막아래 주사하여 PVR를 유도하였다. 50㎖(0.05U) Dispase(Sigma Chemical Co.)/PBS를 이용하여 망막아래에 수포를 형성시킨다. 동물의 절반은 본 발명의 항체를 주사(정맥, 복막, 안구내)하여 처리하였다. 외과술 후에 본 발명의 항체를 제공받지 않은 주사된 토끼의 약 75%에서 망막 분리가 유도되었고, 외과술 후 2주에 이들 동물의 100%에서 망막 분리가 있었다. 상피망막을 검사하여 섬유증 정도를 파악하였다.

처리안된 대조군에 비하여 항체-처리된 동물에서 병리학적 변화가 감소되었다는 것은 PVR에 치료효과가 있다는 것을 의미한다. CTGF가 PVR 모델에서 조직 손상과 연관이 있기 때문에, 항-CTGF 물질이 이와 같은 질환에 치료용도로 제안되었다(See, e.g., International Publication No.WO03/049773). 본 발명의 항체는 PVR과 같은 안구 질환에 항-CTGF 치료제의 독특하고 효과적인 종류를 제공한다.

실시예 9. 경화증

경화증은 일반적으로 확산성 섬유증, 퇴행성 변화, 그리고 피부, 관절, 내부 기관, 특히 식도, 위장관, 폐, 심장 및 신장에서 혈관 이상(전신성경화증)의 특징을 가진다.

9.1. 국소화된 육아종 유도

연속 7일간 사람에서 유도된 TGF-β2 및 CTGF를 피하로 복합투여하였을 때 신생 생쥐에서 영속적인 국소화된 섬유증이 생성된다(Mori et al. (1999) J Cell Physiol 181: 153-159; Shinozald et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun 237: 292- 297).

출생 후 1일에, 생쥐를 세 개 처리 군으로 분리하고, 40㎕ 1% 생쥐 혈청 알부민(MSA), 800ng TGF-β2, 400ng CTGF을 포함하는 PBS 또는 TGF-β2 및 CTGF를 모두 포함하는 PBS를 7일간 견갑하(subscapular) 부분으로 주사하였다. TGF-β2 및 CTGF 복합 그룹은 추가로 두개 군으로 나누며, 한 군에는 본 발명의 항체 mAb1 40㎍를 제공하였다. 11일 째에 동물을 죽이고, 주사된 부분을 처리하고, Mason 트리크롬으로 처리하여 조직학적으로 평가하였다. 세명의 과학자가 맹검 방식으로 슬라이드를 무작위로 하여 정량적으로 평가하였는데; 섬유증 및 결합 조직 팽창에 근거하여 0(변화없음)부터 4(섬유증 조직)까지 수치를 기록하였다(도 8 참고). 모든 개체 검열자에서 각 슬라이드의 누적 수치를 계산하고, ANOVA 테스트를 이용하여 군간에 평균 수치를 비교하였다.

비이클 대조군, TGF-β2, TGF-β2 및 CTGF 복합 경우에 군간 평균 수치는 각각 0.75, 6.83, 9.00이었다(표 4).

항체 처리의 경우 군 평균 수치는 6.17로써 TGF-β2와 CTGF 복합의 경우와 비교하였을 때(p<0.05), 통계학적으로 상당히 감소되었고, C-말단에 대한 비-중화 항-CTGF 항체인 mAb3으로 처리한 경우에는 섬유증을 감소시키지 않았다. 따라서, 본 발명의 항체는 조직에 대해 국소 경화증 손상을 감소시키는데 특히 효과가 있다.

9.2. 신생 전신 섬유증

신생 생쥐를 두 군으로 나누고, 21일간 연속하여 매일 300㎍/kg/day TGFβ, 300㎍/kg/day CTGF, 300㎍/kg/day TGFβ 및 CTGF를 복합 투여하거나 또는 TGFβ+CTGF 복합 주사후 본 발명의 항체 mAb1 5㎎/kg을 IP투여하고 생장인자 처리하였다. 치료과정동안 새끼는 어미와 같이 있었다. 21일째에 동물을 죽이고, 주요 기관을 떼내고, 상기에서 설명한 것과 같이 전체 프롤린 및 하이드록시프롤린을 측정하였다.

매일 TGFβ를 주사하면 사소한 전신 섬유증이 유도되나, CTGF 단독으로는 반응을 유도하지 않았다. TGFβ+CTGF 복합하면 몇 개 기관(간, 폐, 심장, 위장관, 횡경막, 신장포함)에서 상당한 콜라겐 침착; 상당한 장 흡착의 전신 섬유증을 유도하였고, 치사율이 25% 증가되었다. 생장 인자 치료와 함께 본 발명의 항체를 투여하면 기관 섬유증이 감소되었고(도 10), 장 흡착 및 치사율이 예방되었다. 따라서, 본 발명의 항체를 전신으로 투여하였을 때, 다양한 조직 및 기관에 경화성 손상을 감소시키는데 추가 효과가 있다. 실시예 10.1 및 10.2에서 제시한 결과에서 본 발명의 항체를 국소 또는 전신으로 투여하였을 때, 경화증 치료에 치료요법적 효과가 있었다.

9.3. 전신성 경화증

본 발명의 항체를 이용하여 전신성 경화증과 연관된 섬유증을 경감시켰다. 전신성 경화증에서 피부 질환 정도 및 중증도를 측정하는 방법은 당분야에 공지되어 있다(See, e.g., Rodnan et al.(1979) Arthritis Rheum 22: 130-40; Aghassi et al.(1995) Arch Dermatol 131: 1160-1166; Brennan et al.(1982) Br J Rheumatol 31: 457-460; Kahaleh et al.(1986) Clin Exp Rheumatol 4: 367-369; Falanga and Bucalo (1993) J Am Acad Derm 29: 47-51; Seyger et al.(1997) J Am Acad Derm 37: 793-796; Seyger et al. (1998) J Am Acad Dermatol 39: 220-225; Black (1969) Br J Dermatol 81: 661-666; Ballou et al. (1990) J Rheumatol 17: 790-794; and Enomoto et al.(1996) J Am Acad Dermatol 35: 381-387).

예를 들면, 수정 Rodnan 피부 수치는 Type 00 Rex DD-3 디지털 경도계(Rex Gauge Company, Buffalo Grove IL)를 이용하여 0.1 단위 해상도로 표준화된 경도계 단위에서 피부 경화를 측정한다. Rodnan 피부 수치에 의해 측정하였을 때 모든 피부 부위에서 경도계 측정을 실시하였다. 피부 수치 및 경도계 기록은 본 발명의 항체 투여전에 시작 스크리닝에서 그리고, 약량제공을 하는 동한 매 3개월마다 실시하였다. 매번 측정은 4회 반복하고, 변수의 구조적 분석 및 클래스내(intraclass) 상관 상수 계산을 이용하여 부위에 대한 반복 가변성과 환자의 가변성을 결정하였다(Fleiss(1971) Psychol Bull 76: 378-382). 상관관계 기술을 이용하여 주어진 시간대에 전체 수치 및 서브-그룹 수치에 대해서 피부 수치와 경도계 수치간에 조화를 평가하였다. 래그(lagged) 상관관계 분석(피부 수치 시작시에 경도계 수치에 대해, 항체 치료 t+3개월 또는 t+6개월)을 실행하였다. 콜라겐 합성 데이터(PIIINP 측정) 질환 활성 및 기능 상태 정도를 수집하였다. 상기에서 설명하는 임의 방법을 이용하여 측정하였을때, 증상 및 경화증의 감소는 본 발명의 항체가 치료요법적 효과가 있음을 말해주는 것이다.

실시예 10. 골관절염

골관절염에서 치료효과를 설명하기 위해 다음의 모델중 하나에서 본 발명의 항체를 테스트하였다. 다음의 실시예에서, 이용된 항체의 농도는 개체 체중 ㎏당 0.015 내지 15㎎, 체중 ㎏당 약 5㎎항체가 적절한 것으로 본다.

12주령의 수컷 C57BL/6 생쥐와 같은 동물을 표준 우리에 가두고 수돗물을 임의로 먹을 수 있게 하면서 표준 식이를 제공하였다.

10.1 뮤린 무릎 관절에서 AdCTGF 의 관절내 주사

ADEASY 시스템(Qbiogene, Carlsbad CA)을 이용하여 CTGF을 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터 구조(AdCTGF)를 제조업자가 제공하는 방법을 이용하여 준비하였다. 간략하게 설명하면, 전장의 사람 CTGF를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 표준 분자 클로닝 기술을 이용하여 PSHUTTLE-CMV 플라스미드(Qbiogene)에 합입하였다. pShuttle-CMV-CTGF 구조체를 결찰시키고, PADEASY-1 플라스미드(Qbiogene)와 함께 전기천공법을 이용하여 컴피턴트 대장균(E. coli) BJ-5183 세포로 공동 감염시켰다. Kim et al.(2001, J Biol Chem 276: 38781-38786)에서 설명하는 과정을 이용하여, AdCTGF를 증폭시키고, 정제하며, 빈 아데노바이러스 벡터를 대조군으로 이용하였다. AdCTGF 및 대조군 바이러스에서 플락 형성 단위(Plaque-forming units (범위 1.0-2.1 x 10¹⁰/㎖) 및 바이러스 입자(0.9-1.5 x 10¹²/㎖)는 유사하였다.

AdCTGF 또는 대조군 아데노바이러스(1 x 10⁷ plaque-forming units)를 동맥으로 주사하고; 본 발명의 항체를 관절, 정맥, 복막 또는 피하로 주사하였다. 동시에 항체를 아데노바이러스 투여로 주사할 수 있고, 치료는 AdCTGF 주사전에 또는 주사후에 시작할 수 있다. 대조군 아데노바이러스를 제공받은 동물에 유사하게 항-CTGF 항체 또는 기준 항체를 주사하였다. 무릎 관절에 주사를 맞지 않은 경우를 항체 효과에 대한 대조군으로 사용하였다.

AsCTGF 주사후 1, 3, 7, 14, 28일후에 무릎 관절을 분리하고, Stoop et al.(2001, Osteoarthritis Cartilage 9: 308-315)에서 설명하는 과정에 따라 14일간 EDTA/폴리비닐피롤리돈에서 칼슘을 제거하고, -20°C에서 보관하였다. 관절의 조직을 분석하여 활액의 두께 및 프로테오글리칸 소모를 측정하고; in situ 하이브리드 반응 및 면역조직화학검사를 실행하여 CTGF 발현을 확인하고 콜라겐(타입 I/III)을 포함하는 추가 인자들의 발현을 확인하였다. 활액을 수득하여 CTGF 수준, 메탈로프로테네이즈 등의 수준을 결정하였다. 항-CTGF 항체를 이용한 치료법의 효과는 AdCTGF을 주사하고, 대조군 항체로 처리된 동물에 비교하여 골관절염과 연관된 변수 감소로 확인하였다.

10.2 뮤린 무릎 관절에서 AdTGF β의 관절내 주사

Bakker et al.(2001, Osteoarthritis Cartilage 9: 128-136)에서 설명하는 동물 모델에서 항체를 테스트할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체 또는 대조군 항체를 1x10⁷pfu TGFβ-발현 아데노바이러스 구조체(AdTGFβ) 주사전에, 동시에 또는 연속하여 주사할 수 있다. 주사를 맞지 않은 무릎 관절을 항체 효과에 대해 대조군으로 사용한다. 각 군의 동물을 다양한 날짜, 가령, 3일, 7일, 14일등에 죽이고, 조직을 분리시켜 처리하였다. 관절의 조직을 분석하여 활액의 두께 및 프로테오글리칸 소모를 측정하고; in situ 하이브리드 반응 및 면역조직화학검사를 실행하여 CTGF 발현을 확인하고 콜라겐(타입 I/III)을 포함하는 추가 인자들의 발현을 확인하였다. 활액을 수득하여 TGFβ, CTGF 수준, 메탈로프로테네이즈 등의 수준을 결정하였다. 항-CTGF 항체를 이용한 치료법의 효과는 AdTGFβ을 주사하고, 대조군 항체로 처리된 동물에 비교하여 골관절염과 연관된 변수 감소로 확인하였다.

10.3 뮤린 무릎 관절에서 파파인의 관절내 주사

또는 van der Kraan et al.(1989, Am J Pathol 135: 1001-1014)에서 설명하는 과정에 따라 항체를 테스트할 수도 있다. 관절내 파파인을 주사하면 골증식체 형성, 섬유증, 관절연골로부터 프로테오글리칸 소실등을 유도한다. 파파인 용액(Sigma, St. Louis, MO) 1 unit를 생쥐의 우측 무릎 관절에 주사하여 파파인 모델이 개시된다. 각 동물의 좌측 무릎 관절은 내부 기준으로 사용하였다. 본 발명의 항체를 파파인(0.5%) 주사와 동시에 또는 미리, 연속하여 관절내, 정맥내, 복막내 또는 피하로 주사하였다. 각 군의 동물을 다양한 날짜, 가령 3일, 7일, 14일에 죽이고, 조직을 분리시켜 처리하였다. 관절의 조직을 분석하여, 활액의 두께 및 프로테오글리칸 소모를 측정하고; in situ 하이브리드 반응 및 면역조직화학검사를 실행하여 CTGF 발현을 확인하고 콜라겐(타입 I/III)을 포함하는 추가 인자들의 발현을 확인하였다. 활액을 수득하여 TGFβ, CTGF 수준, 메탈로프로테네이즈 등의 수준을 결정하였다. 항-CTGF 항체를 이용한 치료법의 효과는 파파인을 주사하고, 대조군 항체로 처리된 동물에 비교하여 골관절염과 연관된 변수 감소로 확인하였다.

실시예 11. 클로닝 및 발현

다음의 실시예는 본 발명의 특정 항체의 클로닝 및 발현을 설명하는 것이나, 이 방법을 여기에서 설명하고 청구하는 모든 항체에 적용시킬 수 있다.

본 발명의 예시적 항체, mAb1을 하이브리도마 세포주(8C12-F10; 실시예 3에서 설명한 것과 같이 준비함)에서 분비되는 복합 사람 항체의 일부분으로 첫번째로 확인되었다.

11.1 mAb1 중쇄의 클로닝 및 서열화

제조업자가 제공하는 프로토콜에 따라 MICRO-FAST TRACK 키트(Invitrogen)를 이용하여 8C12-F10 세포 배양물로부터 메신져 RNA를 분리시켰다. 제조업자가 제공하는 프로토콜에 따라 두 가지 cDNA 세포 사이클 키트(Invitrogen)를 이용하고 다음의 중쇄 안티센스 프라이머중 하나를 이용하여 두 가지 cDNA 푸울은 만들었다.

AB90 (TGCCAGGGGGAAGACCGATGG; SEQ ID NO : 3)

m19 H1504R (GCTGGGCGCCCGGGAAGTATGTA; SEQ ID NO : 4)

중쇄 가변 부위 서열을 AB90 프라이머와 V-부분 일련의 프라이머중 하나를 이용하여 AB90-프라임된 cDNA 푸울을 PCR 증폭시켜 클론하였다. 이때 프라이머에는 보존된 분비 시그날 서열에 상응하는 프라이머, 각 코딩 부분의 5‘말단을 인코드하는 프라이머, 성숙한 이뮤노글로블린을 인코드하는 프라이머가 포함된다. 추천받은 제조업자의 프로토콜에 따라 다음의 변수와 함께 Pfu DNA 폴리메라제(Stratagene)를 이용하였다; 반응은 일반적으로 1㎕ cDNA, 0.75μM 각각의 전방 및 역방 프라이머, 200μM 각 dNTP, 11㎕ Pfu 폴리메라제(㎕ 당 2.5 unit)을 포함하는 총 50㎕ 용적에서 실행한다. 카운트다운 열 사이클러 프로그램(countdown thermal cycler program)을 이용하는데, 효소 추가하기 전에 2분간 94°C에서 초기 배양하였다. 다음의 사이클 변수를 이용하였다; 94°C, 45초; 65°C, 45초; 72°C, 1분을 10회; 94°C, 45초; 55°C, 45초, 72°C, 1분을 30회; 72°C, 10분간 1회.

VH3 패밀리 중쇄 V 부분에 결합하는 한개 중쇄 시그날 프라이머 AB87 (ATGGAGTTTGGRCTGAGCTG; SEQ ID NO : 5)는 상당한 생성물을 생산하였다. 453개 뉴클레오티드 PCR 산물을 PCR BLUNT II-TOPO 벡터(Invitrogen)로 클론시키고, 정확한 삽입 크기에 맞는 클론을 선별하고, PCR 산물에 상응하는 세 개 클론을 서열화시켰다. 세 개 클론 모두에서 동일한 서열을 얻었다.

m19 H1504R-프라임된 cDNA 푸울(pool)의 PCR 증폭에 의해 중쇄 항상(constant)부분 및 UTR 부분을 클론하였다. 중쇄 단편의 5‘말단에 상응하는 601개 뉴클레오티드 PCR 단편을 센스 프라이머 VH3-33 29-51F(CGGCGGTGTTTCCATTCGGTGAT; SEQ ID NO:6) 및 안티센스 프라이머 m19 H553R(GGGCGCCTGAGTTCCACGACAC; SEQ ID NO:7)를 이용하여 증폭시켰다. 코토아이소메라제-중개된 클로닝을 이용하여, 제조업자의 지시에따라 PCR 생성물을 PCR-BLUNT II 벡터(Invitrogen)로 클로하였고, 삽입체를 서열화시켰다. 유사하게, 센스 프라이머 m19 H439F(GTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTC; SEQ ID NO:8) 및 안티센스 프라이머 m19 H943R(CCCGCGGCTTTGTCTTGGCATTAT; SEQ ID NO : 9)를 이용하여 505개 뉴클레오티드 PCR 단편을 증폭시키고, 센스 프라이머 m19 H1002F(CTGGCTGAATGGCAAGGAGTA; SEQ ID NO:10) 및 안티센스 프라이머 m19 H1504R을 이용하여 503개 뉴클레오티드 PCR 단편을 증폭시켰다. 이들 단편 둘은 별도로 PCR-BLUNT II 벡터(Invitrogen)내로 클론시키고, 상기에서 설명하는 것과 같이 서열화시켰다. 센스 프라이머 m19 H645F (GGGCACCCAGACCTACATC; SEQ ID NO:11) 및 안티센스 프라이머 m19 H1230R (CTCCGGCTGCCCATTGCTCTCC; SEQ ID NO:12)를 이용하여 4번째 중쇄 PCR 단편을 증폭시키고, 바로 서열화시켰다.

도 11A에서는 mAb1 중쇄(SEQ ID NO : 14)를 인코드하는 전장의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO : 13)을 제공하는 클론된 PCR 단편 배열을 나타낸 것이다. 중쇄 가변 부분의 아미노산 서열은 VH3 생식계열(germ line) 유전자 DP-44와 상당히 닮았다. 어느 D 단편이 이용되었다는 것을 말하는 것은 힘들지만, mAb1의 서열은 DH4 패밀리와 상당히 닮았다. JH 부분은 생식계열 JH4 및 JH5와 매우 일치한다. mAb1의 중쇄 항상(constant) 부분은 GenBank Accession No. BC016381와 매치되는데, 이는 G1m(3)의 알로타입(allotype)임을 나타내는 것이다.

11.2 mAb1 경쇄의 클로닝 및 서열화.

제조업자가 제공하는 프로토콜에 따라 MICRO-FAST TRACK 키트(Invitrogen)를 이용하여 8C12-F10 세포 배양물로부터 메신져 RNA를 분리시켰다. 제조업자가 제공하는 프로토콜에 따라 두 가지 cDNA 세포 사이클 키트(Invitrogen)를 이용하고 다음의 경쇄 안티센스 프라이머중 하나를 이용하여 제 2 가닥 합성에 의해 두 가지 cDNA 푸울은 만들었다.

AB16(CGGGAAGATGAAGACAGATG; SEQ ID NO:15)

Ck-760R(AAGGATGGGAGGGGGTCAGG; SEQ ID NO:16)

경쇄 가변 부위 서열을 AB16 프라이머와 V-부분 일련의 프라이머중 하나를 이용하여 AB16-프라임된 cDNA 푸울을 PCR 증폭시켜 클론하였다. 이때 프라이머에는 보존된 분비 시그날 서열에 상응하는 프라이머, 각 코딩 부분의 5‘말단을 인코드하는 프라이머, 성숙한 이뮤노글로블린을 인코드하는 프라이머가 포함된다. 추천받은 제조업자의 프로토콜에 따라 상기의 변수와 함께 Pfu DNA 폴리메라제(Stratagene)를 이용하였다;

VK1 패밀리 중쇄 V 부분에 결합하는 한개 경쇄 시그날 프라이머 AB123(CCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTG; SEQ ID NO:17)는 상당한 생성물을 생산하였다. 408개 뉴클레오티드 PCR 산물을 PCR BLUNT II-TOPO 벡터(Invitrogen)로 클론시키고, 정확한 삽입 크기에 맞는 클론을 선별하고, PCR 산물에 상응하는 세 개 클론을 서열화시켰다. 세 개 클론 모두에서 동일한 서열을 얻었다.

경쇄 항상 부분은 Ck-760R-프라임된 cDNA 푸울에 의해 클론되었다. 경쇄의 전체 코딩 서열 및 5‘UTR 부분을 경쇄 센스 프라이머 L15 22m (TCAGWCYCAGTCAGGACACAGC; SEQ ID NO:18) 및 Ck-760R을 이용하여 증폭시켰다. 788개 뉴클레오티드 단편을 PCR BLUNT II 벡터(Invitrogen)내에 클론시키고 서열화시켰다. 생성된 플라스미드를 41m6로 지정하였다.

도 11B에서는 mAb1 경쇄(SEQ ID NO:20)를 인코드하는 클론된 PCR 단편을 배열한 것이다. 경쇄 가변 부분의 아미노산 서열은 생식계열 VkL15 및 Jk2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드되는 부분과 상당히 매치된다. mAb1의 경쇄 항상 부분은 보고된 사람 생식계열 카파 경쇄 이뮤노글로블린 유전자 서열(Whitehurst et al. (1992) Nucleic Acids Res 20: 4929-4930)과 동일하였다.

11.3 mAb1 중쇄 및 경쇄 발현 구조체의 생산

전장의 mAb1 중쇄 cDNA는 2단계로 오버랩 PCR 연장에 의해 상기에서 설명하고 도 11A에서 나타낸 중쇄 PCR 생성물로부터 생성된다. PCR 오버랩 연장 반응에서 두개 5‘ PCR 생성물을 말단 프라이머 VH3-33 29-51F 및 m19 H943R을 복합시켜 991개 뉴클레오티드로된 단일 단편을 만들었다. 유사하게, PCR 오버랩 연장 반응에서 두개 3‘ PCR 생성물을 말단 프라이머 VH3-33 29-51F 및 m19 H943R을 복합시켜 860개 뉴클레오티드로된 단일 단편을 만들었다. 이들 두 가지 PCR연장 생성물을 겔-정제시키고, 말단 프라이머 VH3-33 29-51F 및 m19 H1504R를 이용하여 함께 증폭시키면, 1407개 뉴클레오티드 cDNA(SEQ ID NO:13의 잔기 441부터 1847까지) 전장의 mAb1 중쇄 코딩 서열을 만든다.

중쇄 cDNA를 PCR-BLUNT II TOPO 벡터(Invitrogen)에 클론시켜 플라스미드 43a4를 만들었다. mAb1 중쇄 코딩 부분은 플라스미드 43a4를 BamHI 및 XbaI 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 잘라낸 삽입체를 PCDNA5-FRT 발현 벡터(Invitrogen)(사전에 BamHI 및 Nhe 제한 엔도뉴클레아제로 처리해둠)에 결찰시켜 서브클론시켰다, 생성된 발현 플라스미드 삽입체 44a1를 서열화시킨 후, 다시 역방향으로 PBK-CMV 벡터(Clontech)에 유사하게 서브클론시켜 플라스미드 47a4를 만들었고, 그리고 pCEP-Pu벡터(E. Kohfeldt, Max-Planck-Institut fur Biochemie)(pCEP4 벡터에서 유도된 벡터(Invitrogen))에 삽입시켜, 플라스미드 49a1를 만들었다.

상기에서 설명하는 41m6 플라스미드에서 전장의 mAb1 경쇄를 인코드하는 708개 뉴클레오티드 cDNA(SEQ ID NO:19의 잔기 415에서 1122까지)를 HindIII 및 Xho I 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 잘라내고, PCDNA5-FRT 벡터(Invitrogen)(미리 HindIII 및 XhoI 제한 엔도뉴클레아제로 처리)에 결찰시켜, 포유류 발현 플라스미드 42b2를 만들었다.

생성된 발현 플라스미드 삽입체 42b2를 서열화시킨 후, 다시 역방향으로 PBK-CMV 벡터(Clontech)에 유사하게 서브클론시켜 플라스미드 47b3를 만들었고, 그리고 pCEP-Pu벡터(E. Kohfeldt, Max-Planck-Institut fur Biochemie)에 삽입시켜, 플라스미드 49b1를 만들었다.

11.4 항체 쇄 구조체의 형질감염 및 발현

표준 과정을 이용하여 별도 그리고 공동 감염에서 COS7 세포를 플라스미드 44a1(mAb1 중쇄) 및 42b2(mAb1 경쇄)로 트랜스펙션시켰다. 실시예 4에서 설명한 것과 같이 항체 존재에 대해 조건화 배양 배지를 검사하였다. 상기에서 설명하는 과정을 이용하여 ELISA에 의해 측정하였을 때, 44a1 및 42b2와 공동 트랜스펙션된 배지만 CTGF 결합 활성을 가지는 사람 항체를 발현시켰다. 공동 트랜스펙션된 COS7세포에 의해 생산된 여기에서 확인된 항체는 CLN1으로써 0.8nM의 친화력으로 CTGF의 N-말단 절반에 결합한다.

CLN1은 유전적으로 변형된 Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포에서 발현되었다. CLN1 항체를 발현시키는 CHO 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection (Manassas VA)에 2004년 5월 19일에 기탁되어 ATCC 기탁 번호 PTA-6006(2004년 5월 19일에 기탁됨)를 받았다. 세포주를 최적화시키고, 항체 발현은 다양한 공지 기술(Wigler et al. (1980; Proc Natl Acad Sci USA 77: 3567-3570)+ Ringold et al. (1981 ; J Mol Appl Genet 1: 165-175), Gasser et al. (1982; Proc Natl Acad Sci USA 79: 6522-6526), and Kaufman et al.(1985; Mol Cell Biol 5: 1750-1759)을 이용하여 유전자 증폭에 의해 강화시킬 수 있다.

실시예 12. CTGF 와 TGF β의 상호작용

본 발명의 항체는 엑손 3에 의해 인코드된 잔기로 확인된 CTGF에 특이적으로 결합한다(도 1B; SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 418에서 뉴클레오티드 669). 이 부분은 SEQ ID NO:2의 아미노산 97부터 아미노산 180을 포함하고, von Willebrand Type C 도메인(SEQ ID NO:2의 아미노산 103부터 아미노산 164); mAb1의 에피토프(SEQ ID NO:2의 아미노산 134부터 아미노산 158)을 포함한다. Abreu et al.(2002, Nat Cell Biol 4: 599-604)는 CTGF의 VWC 도메인에 상응하는 도메인이 CTGF와 TGFβ 또는 BMP-4사이에 상호작용에 중요하다고 보고하였다. 그리고 이와 같은 상호작용이 TGFβ 및 BMP-4의 활성을 조절한다고 보고하였다. 다음의 실시예에서는 엑손 3에 의해 인코드되는 부분이 TGFβ에 CTGF가 결합하는데 필수적이고 충분하며, 본 발명의 항체가 CTGF와 TGFβ사이에 상호작용을 차단할 수 있다는 것을 설명한다.

CTGF와 TGFβ의 상호작용은 다음의 과정에 의해 평가되었다. 96-웰 MAXISORP ELISA 플레이트(Nalge Nunc)를 4°C에서 10㎍/㎖의 CTGF(CTGF는 엑손 3에 의해 인코드됨) 또는 CTGF(엑손 5에 의해 인코드되는 단편)/PBS 또는 PBS만으로 하룻밤동안 피복시켰다. 모든 웰은 1% BSA/PBS로 차단시키고, 실온에서 1시간 동안 50㎕ 용액에서 배양하였다. 이때 용액에는 TGFβ가 0, 1, 3.3, 10, 33, 100, 333, 1000ng/㎖농도로, 그리고 MAB612 또는 MAB1835 생쥐 항-TGFβ 단클론항체(R&D Systems, Minneapolis MN)가 100, 300, 1000ng/㎖ PBS, 0.05% Tween-20을 포함하고 있다. MAB1835는 소, 생쥐 사람 TGF-β1, β2를 인지하고, TGFβ가 생쥐 흉선세포에 결합하는 것을 차단한다. MAB612는 TGFβ2를 인지하기는 하지만 TGFβ활성을 저해하지는 못한다. 웰은 PBS, 0.05% Tween-20으로 세척하고, 실온에서 1시간 동안 PBS로 희석시킨 알칼리 포스포타제 염소 항-생쥐 IgG 항체, 0.05% Tween-20을 포함하는 용액으로 배영시켰다. 플레이트를 다시 세척하고, p-니트로페닐 포스페이트(PNPP)/1M 에탄올아민, 1mM MgS0₄, pH9.8을 첨가하였다. 웰을 적절한 시간동안 배양하고, 반응은 NaOH를 첨가하여 중단시켰다. 405㎚에서 λ 흡수도는 분광광도계를 이용하여 측정하였다.

도 12에서는 엑손 3에 의해 인코드된 CTGF 및 이의 단편이 동등한 정도로 TGFβ와 상호작용하고, 엑손 5에 의해 인코드되는 CTGF 단편은 TGFβ에 결합 활성을 가지지 않는다. 흥미로운 것은 항-TGFβ 항체 MAB612가 약량 의존적 방식으로 CTGF-결합된 TGFβ를 감지할 수 있으나, 중화항체 MAB1835는 임의 테스트된 농도에서도 TGF-결합된 TGFβ를 감지하지 못하였다(데이타 없슴). 이는 CTGF가 TGFβ 결합에 대해 MAB1835와 경쟁한다는 것을 제시하는 것이다.

항-CTGF 항체를 CTGF 및 TGFβ사이에 결합 차단을 하는 능력에 대해 테스트하였다. 도 12에서 볼 수 있는 바와 같이 본 발명의 항체, 예시항체로 mAb4 및 mAb1는 엑손 3에 의해 인코드된 CTGF 및 CTGF 단편의 TGFβ 결합을 차단하였고 반면에, CTGF의 C-말단 단편에 대한 항-CTGF 항체가 결합을 차단하지는 않았다. 이 결과가 작용 기전을 뒷받침하고 본 발명의 항체는 CTGF와 TGFβ사이에 상호작용을 특이적으로 차단하였다.

여기에서 설명하는 것에 추가하여 본 발명의 다양한 구체예는 전술한 설명으로부터 당업자가 용이하게 인지할 수 있다. 이와 같은 변형은 첨부된 청구범위에 속한다.

여기에서 언급한 모든 참고문헌은 전문을 첨부하였다.

SEQUENCE LISTING <110> FIBROGEN, INC. LIN, Al Y. NEFF, Thomas B. OLIVER, Noelynn A. USINGER, William R. WANG, Qingjian YEOWELL, David A. <120> CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR ANTIBODIES <130> FP0814 PCT <150> US 60/475,598 <151> 2003-06-04 <160> 26 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 2075 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cccggccgac agccccgaga cgacagcccg gcgcgtcccg gtccccacct ccgaccaccg 60 ccagcgctcc aggccccgcg ctccccgctc gccgccaccg cgccctccgc tccgcccgca 120 gtgccaacca tgaccgccgc cagtatgggc cccgtccgcg tcgccttcgt ggtcctcctc 180 gccctctgca gccggccggc cgtcggccag aactgcagcg ggccgtgccg gtgcccggac 240 gagccggcgc cgcgctgccc ggcgggcgtg agcctcgtgc tggacggctg cggctgctgc 300 cgcgtctgcg ccaagcagct gggcgagctg tgcaccgagc gcgacccctg cgacccgcac 360 aagggcctct tctgtgactt cggctccccg gccaaccgca agatcggcgt gtgcaccgcc 420 aaagatggtg ctccctgcat cttcggtggt acggtgtacc gcagcggaga gtccttccag 480 agcagctgca agtaccagtg cacgtgcctg gacggggcgg tgggctgcat gcccctgtgc 540 agcatggacg ttcgtctgcc cagccctgac tgccccttcc cgaggagggt caagctgccc 600 gggaaatgct gcgaggagtg ggtgtgtgac gagcccaagg accaaaccgt ggttgggcct 660 gccctcgcgg cttaccgact ggaagacacg tttggcccag acccaactat gattagagcc 720 aactgcctgg tccagaccac agagtggagc gcctgttcca agacctgtgg gatgggcatc 780 tccacccggg ttaccaatga caacgcctcc tgcaggctag agaagcagag ccgcctgtgc 840 atggtcaggc cttgcgaagc tgacctggaa gagaacatta agaagggcaa aaagtgcatc 900 cgtactccca aaatctccaa gcctatcaag tttgagcttt ctggctgcac cagcatgaag 960 acataccgag ctaaattctg tggagtatgt accgacggcc gatgctgcac cccccacaga 1020 accaccaccc tgccggtgga gttcaagtgc cctgacggcg aggtcatgaa gaagaacatg 1080 atgttcatca agacctgtgc ctgccattac aactgtcccg gagacaatga catctttgaa 1140 tcgctgtact acaggaagat gtacggagac atggcatgaa gccagagagt gagagacatt 1200 aactcattag actggaactt gaactgattc acatctcatt tttccgtaaa aatgatttca 1260 gtagcacaag ttatttaaat ctgtttttct aactggggga aaagattccc acccaattca 1320 aaacattgtg ccatgtcaaa caaatagtct atcttcccca gacactggtt tgaagaatgt 1380 taagacttga cagtggaact acattagtac acagcaccag aatgtatatt aaggtgtggc 1440 tttaggagca gtgggagggt accggcccgg ttagtatcat cagatcgact cttatacgag 1500 taatatgcct gctatttgaa gtgtaattga gaaggaaaat tttagcgtgc tcactgacct 1560 gcctgtagcc ccagtgacag ctaggatgtg cattctccag ccatcaagag actgagtcaa 1620 gttgttcctt aagtcagaac agcagactca gctctgacat tctgattcga atgacactgt 1680 tcaggaatcg gaatcctgtc gattagactg gacagcttgt ggcaagtgaa tttgcctgta 1740 acaagccaga ttttttaaaa tttatattgt aaatattgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtata 1800 tatatatata tatgtacagt tatctaagtt aatttaaagt tgtttgtgcc tttttatttt 1860 tgtttttaat gctttgatat ttcaatgtta gcctcaattt ctgaacacca taggtagaat 1920 gtaaagcttg tctgatcgtt caaagcatga aatggatact tatatggaaa ttctgctcag 1980 atagaatgac agtccgtcaa aacagattgt ttgcaaaggg gaggcatcag tgtcttggca 2040 ggctgatttc taggtaggaa atgtggtagc tcacg 2075 <210> 2 <211> 349 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Val Arg Val Ala Phe Val Val Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Val Gly Gln Asn Cys Ser Gly Pro 20 25 30 Cys Arg Cys Pro Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser 35 40 45 Leu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu 50 55 60 Gly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu 65 70 75 80 Phe Cys Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val Cys Thr 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Ala Pro Cys Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr Arg Ser 100 105 110 Gly Glu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp 115 120 125 Gly Ala Val Gly Cys Met Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro 130 135 140 Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys 145 150 155 160 Cys Glu Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gln Thr Val Val Gly 165 170 175 Pro Ala Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro 180 185 190 Thr Met Ile Arg Ala Asn Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala 195 200 205 Cys Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp 210 215 220 Asn Ala Ser Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg 225 230 235 240 Pro Cys Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys Cys 245 250 255 Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu Ser Gly 260 265 270 Cys Thr Ser Met Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val Cys Thr 275 280 285 Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val Glu 290 295 300 Phe Lys Cys Pro Asp Gly Glu Val Met Lys Lys Asn Met Met Phe Ile 305 310 315 320 Lys Thr Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe 325 330 335 Glu Ser Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala 340 345 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ig Heavy chain primer <400> 3 tgccaggggg aagaccgatg g 21 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ig heavy chain primer <400> 4 gctgggcgcc cgggaagtat gta 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ig Heavy chain primer <400> 5 atggagtttg grctgagctg 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ig heavy chain primer <400> 6 cggcggtgtt tccattcggt gat 23 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ig heavy chain primer <400> 7 gggcgcctga gttccacgac ac 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ig heavy chain primer <400> 8 gtcttccccc tggcaccctc ctc 23 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ig heavy chain primer <400> 9 cccgcggctt tgtcttggca ttat 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ig heavy chain primer <400> 10 ctggctgaat ggcaaggagt a 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ig heavy chain primer <400> 11 gggcacccag acctacatc 19 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ig heavy chain primer <400> 12 ctccggctgc ccattgctct cc 22 <210> 13 <211> 2197 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ggtaccttct gaggcggaaa gaaccagctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag 60 tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 120 aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 180 tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt 240 tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 300 gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt 360 tgcaaaaagc ggccgcaagc taattcgccc ttcggcggtg tttccattcg gtgatcagga 420 ctgaacacac aggaatcacc atggagtttg tgctgagctg ggttttcctt gttgctatat 480 taaaaggtgt ccagtgtgag ggtcagctgg tgcaatctgg gggaggcttg gtacatcctg 540 gggggtccct gagactctcc tgtgcaggct ctggattcac cttcagtagc tatggtatgc 600 actgggttcg ccaggctcca ggaaaaggtc tggagtgggt atcaggtatt ggtactggtg 660 gtggcacata ctctacagac tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaatgcca 720 agaactcctt gtatcttcaa atgaacagcc tgagagccga ggacatggct gtgtattact 780 gtgcaagagg agattactat ggttcgggga gtttctttga ctgctggggc cagggaaccc 840 tggtcaccgt ctcctcagcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct 900 ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg 960 aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg 1020 ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca 1080 gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg 1140 acaagagagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac 1200 ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca 1260 tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg 1320 aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc 1380 gggaggagca gtacaacagc acgtaccggg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg 1440 actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca 1500 tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc 1560 ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct 1620 tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca 1680 agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg 1740 tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc 1800 tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga gtgcgacggc 1860 cggcaagccc cgctccccgg gctctcgcgg tcgcacgagg atgcttggca cgtaccccct 1920 gtacatactt cccgggcgcc cagcaagggc gaattgatcc agacatgata agatacattg 1980 atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt 2040 gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca 2100 attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt 2160 aaaacctcta caaatgtggt atggctgatt atgatca 2197 <210> 14 <211> 469 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Glu Phe Val Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Gly Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Thr Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Phe Phe Asp Cys 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ig Light chain primer <400> 15 cgggaagatg aagacagatg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ig light chain primer <400> 16 aaggatggga gggggtcagg 20 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ig Light chain primer <400> 17 cccgctcagc tcctggggct cctg 24 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Ig light chain primer <400> 18 tcagwcycag tcaggacaca gc 22 <210> 19 <211> 1433 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ggtaccttct gaggcggaaa gaaccagctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag 60 tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 120 aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 180 tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt 240 tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 300 gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt 360 tgcaaaaagc ggccgcaagc taattcgccc tttcagtctc agtcaggaca cagcatggac 420 atgagggtcc tcgctcagct cctggggctc ctgctgctct gtttcccagg tgccagatgt 480 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 540 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 600 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 660 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 720 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcccac ttttggccag 780 gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 840 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 900 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 960 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 1020 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 1080 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttagaggga gaagtgcccc 1140 cacctgctcc tcagttccag cctgaccccc tcccatcctt aagggcgaat tgatccagac 1200 atgataagat acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc 1260 tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa 1320 caagttaaca acaacaattg cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag 1380 gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggtatgg ctgattatga tca 1433 <210> 20 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 21 <211> 62 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 21 Cys Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr Arg Ser Gly Glu Ser Phe Gln Ser 1 5 10 15 Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp Gly Ala Val Gly Cys Met 20 25 30 Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro Ser Pro Asp Cys Pro Phe 35 40 45 Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys Cys Glu Glu Trp 50 55 60 <210> 22 <211> 23 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 22 Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro Ser Pro Asp Cys Pro Phe 1 5 10 15 Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro 20 <210> 23 <211> 18 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 23 Arg Leu Pro Ser Pro Asp Ser Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro 1 5 10 15 Gly Lys <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 24 Arg Leu Pro Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu 1 5 10 15 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 25 Arg Leu Pro Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val 1 5 10 <210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 26 Leu Pro Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu 1 5 10

Claims (90)

1. SEQ ID NO : 2의 아미노산 잔기 97 내지 180의 사람 CTGF 또는 다른 종으로부터 유도된 CTGF상의 대응 부분으로 구성된 CTGF 폴리펩티드의 일부분에 특이적으로 결합하여, CTGF의 생물학적 활성을 중화시키는 능력을 가진 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
2. 제 1 항에 있어서, CTGF 폴리펩티드의 N-말단 부분은 SEQ ID NO :2의 아미노산 103 내지 164까지의 아미노산 또는 다른 종에서 유도된 CTGF상의 대응 부분으로 구성된 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
3. 제 1 항에 있어서, CTGF 폴리펩티드의 N-말단 부분은 SEQ ID NO :2의 아미노산 134 내지 158까지의 아미노산 또는 다른 종에서 유도된 CTGF상의 대응 부분으로 구성된 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
4. 제 1 항에 있어서, CTGF 폴리펩티드의 N-말단 부분은 SEQ ID NO :2의 아미노산 143 내지 154까지의 아미노산 또는 다른 종에서 유도된 CTGF상의 대응 부분으로 구성된 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
5. 전술한 어느 한 항체 있어서, 생물학적 활성은 세포에 의해 세포외 매트릭스 를 생산하는 것으로 구성된 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
6. 제 5 항에 있어서, 세포외 매트릭스 생산은 in vivo상에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
7. 제 5 항에 있어서, 세포외 매트릭스 생산은 in vtro상에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
8. 전술한 어느 한 항에 있어서, 항체는 CTGF 폴리펩티드 및 분비된 또는 막-공인자와의 상호작용을 조절하여, CTGF의 생물학적 활성을 조절하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
9. 제 8 항에 있어서, 공인자는 TGF-β 패밀리인 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
10. 제 9 항에 있어서, 공인자는 TGFβ-1인 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
11. 제 9 항에 있어서, 공인자는 BMP-4인 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
12. 전술한 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성은 세포 이동이 되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
13. 전술한 어느 한 항에 있어서, 항체는 개체에서 섬유증을 감소시키는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
14. 제 13 항에 있어서, 섬유증은 내피, 상피 및 결합조직에서 선택된 조직에서 발생되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
15. 제 13 항에 있어서, 섬유증은 신장, 폐, 심장, 피부에서 선택된 기관에서 발생되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
16. 전술한 어느 한 항에 있어서, CTGF의 항체 친화력은 10^-9M이 되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
17. 전술한 어느 한 항에 있어서 단일 쇄 항체가 되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
18. 전술한 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
19. 전술한 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체가 되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
20. 전술한 어느 한 항에 있어서 다가 항체(multivalent antibody)가 되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
21. 전술한 어느 한 항에 있어서 항체는 글리코실화된 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
22. 전술한 어느 한 항에 있어서 항체는 비-글리코실화된 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
23. 전술한 어느 한 항에 있어서, 항체는 세포독성 물질 또는 효소에 콘쥬게이트된 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
24. 전술한 어느 한 항에 있어서, 항체는 감지가능한 라벨에 의해 라벨링된 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
25. 제 24 항에 있어서 감지가능한 라벨은 효소, 형광 모이어티, 화학적 발광 모이어티, 바이오틴, 아비딘, 방사능동위원소인 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
26. 전술한 어느 한 항에 있어서, 항체는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
27. 전술한 어느 한 항에 있어서, 항체는 2004년 5월 19일에 ATCC에 기탁된 기탁번호 ATCC 기탁 번호 PTA-6006에 의해 확인되는 세포주(Chinese Hamster Ovary Cells 132.14.2A5.3.3에 의해 생산된 항체와 동일한 특이성을 가지는 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
28. 전술한 어느 한 항에 있어서, 항체는 ATCC 기탁 번호 PTA-6006(2004년 5월 19일에 기탁됨)에 의해 확인되는 세포주(Chinese Hamster Ovary Cells 132.14.2A5.3.3에 의해 생산된 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
29. 전술한 어느 한 항에 있어서 생물학적 활성 단편은 Fab, F(ab)₂ 또는 Fv 단 편인 것을 특징으로 하는 분리된 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편.
30. 2004년 5월 19일에 ATCC에 기탁된 기탁번호 ATCC 기탁 번호 PTA-6006확인되는 세포주(Chinese Hamster Ovary Cells 132.14.2A5.3.3).
31. 다음에서 선택된 폴리펩티드로 구성된 분리된 항체.

    (a) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 가지는 이뮤노글로블린;

    (b) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 가지는 이뮤노글로블린:

    (c) (a) 또는 (b)의 가변도메인으로 구성된 이뮤노글로블린 단편; 그리고

    (d) (a), (b), (c)의 보존성 변이체.
32. 제 31 항에 있어서, 가변 도메인은 SEQ ID NO:14의 아미노산 1 내지 167의 이뮤노글로블린 중쇄 변이성 도메인으로 구성된 것을 특징으로 하는 항체.
33. 제 31 항에 있어서, 가변 도메인은 SEQ ID NO:20의 아미노산 1 내지 136의 이뮤노글로블린 중쇄 변이성 도메인으로 구성된 것을 특징으로 하는 항체.
34. 제 31 항에 있어서 항체는 CTGF의 생물학적 활성을 중화시키는 것을 특징으로 하는 항체.
35. 제 34 항에 있어서, 생물학적 활성은 세포에 의해 세포외 매트릭스를 생산하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 항체.
36. 제 34 항에 있어서, 생물학적 활성은 세포 이동을 자극하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 항체.
37. 제 35 항에 있어서, 세포외 매트릭스 생산은 in vivo상에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체.
38. 제 35 항에 있어서, 세포외 매트릭스 생산은 ex vivo상에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체.
39. 제 34 항에 있어서 항체는 CTGF 폴리펩티드 및 세포 수용체의 상호작용을 조절하여 생물학적 활성을 중화시키는 것을 특징으로 하는 항체.
40. 제 34 항에 있어서, 항체는 CTGF 폴리펩티드 및 분비된 또는 막-공인자와의 상호작용을 조절하여, CTGF의 생물학적 활성을 조절하는 것을 특징으로 하는 항체.
41. 제 40 항에 있어서, 공인자는 TGF-β 패밀리인 것을 특징으로 하는 항체.
42. 제 41 항에 있어서, 공인자는 TGFβ-1인 것을 특징으로 하는 항체.
43. 제 41 항에 있어서, 공인자는 BMP-4인 것을 특징으로 하는 항체.
44. 제 31 항에 있어서 항체는 글리코실화된 것을 특징으로 하는 항체.
45. 제 31 항에 있어서 항체는 비-글리코실화된 것을 특징으로 하는 항체.
46. 제 31 항에 있어서, 항체는 세포독성 물질 또는 효소에 콘쥬게이트된 것을 특징으로 하는 항체.
47. 제 31 항에 있어서, 항체는 감지가능한 라벨에 의해 라벨링된 것을 특징으로 하는 항체.
48. 제 47 항에 있어서 감지가능한 라벨은 효소, 형광 모이어티, 화학적 발광 모이어티, 바이오틴, 아비딘, 방사능동위원소인 것을 특징으로 하는 항체.
49. SEQ ID NO:14의 아미노산 서열로 된 이뮤노글로블린 중쇄와 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열로 된 이뮤노글로블린 경쇄로 구성된 분리된 항체.
50. 2004년 9월 19일 ATCC에 기탁된 기탁 번호 PTA-6006(에 의해 확인되는 세포주(Chinese Hamster Ovary Cells 132.14.2A5.3.3)에 의해 생산된 항체로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
51. 전술한 어느 한 항에 따른 항체의 효과량과 약학적으로 수용가능한 담체와 혼합된 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
52. 제 51 항에 있어서 제 2 치료제가 추가 포함된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
53. CTGF의 생물학적 활성을 중화시키는 방법에 있어서,

    항체 및 CTGF 폴리펩티드로 구성된 복합체 형성에 적합한 조건하에 샘플과 제1-50항중 어느 한항에 따른 항체를 접촉시켜, CTGF 폴리펩티드의 생물학적 활성을 중화시키는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
54. 제 53 항에 있어서, 생물학적 활성은 세포외 매트릭스를 생산하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
55. 제 53 항에 있어서 항체는 CTGF 폴리펩티드 및 세포 수용체의 상호작용을 조절하여 생물학적 활성을 중화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
56. 제 53 항에 있어서, 항체는 CTGF 폴리펩티드 및 분비된 또는 막-공인자와의 상호작용을 조절하여, CTGF의 생물학적 활성을 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
57. 제 56 항에 있어서, 공인자는 TGF-β 패밀리인 것을 특징으로 하는 방법.
58. 제 57 항에 있어서, 공인자는 TGFβ-1인 것을 특징으로 하는 방법.
59. 제 57 항에 있어서, 공인자는 BMP-4인 것을 특징으로 하는 방법.
60. 제 53 항에 있어서, 중화는 in vitro에서 일어하는 것을 특징으로 하는 방법.
61. 제 53 항에 있어서, 중화는 개체의 in vivo에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
62. 제 61 항에 있어서, 개체는 고혈압, 혈당과다증, 당뇨병, 심근경색, 관절염, 국소 또는 전신 염증으로 진단을 받은 환자 또는 이들 질병에 걸릴 성향이 환자가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
63. 제 61 항에 있어서, 개체는 세포 증식성 질환으로 진단을 받은 환자 또는 이들 질병에 걸릴 성향이 있는 환자가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
64. 제 63 항에 있어서, 세포 증식성 질환은 맥관형성, 죽상경화증, 녹내장 또는 암인 것을 특징으로 하는 방법.
65. 제 64 항에 있어서, 암은 급성림프성백혈병, 피부섬유종(dermatofibromas), 유방암, 유방암종, 신경교종, 신경교아종, 횡문근육종, 섬유육종, 결합조직형성, 지방종, 혈관평활근종, 결합조직형성 암, 전립선, 난소암, 결장암, 췌장암, 위암, 간암이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
66. 제 61 항에 있어서, 개체는 섬유증 질환으로 진단을 받은 환자 또는 이에 걸릴 성향이 있는 환자가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
67. 제 66 항에 있어서, 섬유성 질환은 특발성 폐 섬유증, 당뇨성 신증, 당뇨성 망막증, 골관절염, 전신성 경화증, 만성심부전 또는 간경화증인 것을 특징으로 하는 방법.
68. 개체에서 CTGF-연관 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 개체에 제1-50항에 따른 항체를 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
69. 제 68 항에 있어서, 질환은 고혈압, 혈당과다증, 당뇨병, 심근경색, 관절염, 국소 또는 전신 염증이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
70. 제 68 항에 있어서 질환은 세포 증식성 질환이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
71. 제 63 항에 있어서, 세포 증식성 질환은 맥관형성, 죽상경화증, 녹내장 또는 암인 것을 특징으로 하는 방법.
72. 제 71 항에 있어서, 암은 급성림프성백혈병, 피부섬유종(dermatofibromas), 유방암, 유방암종, 신경교종, 신경교아종, 횡문근육종, 섬유육종, 결합조직형성, 지방종, 혈관평활근종, 결합조직형성 암, 전립선, 난소암, 결장암, 췌장암, 위암, 간암이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
73. 제 68 항에 있어서, 개체는 섬유증 질환으로 진단을 받은 환자 또는 이에 걸릴 성향이 있는 환자가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
74. 제 73 항에 있어서, 섬유성 질환은 특발성 폐 섬유증, 당뇨성 신증, 당뇨성 망막증, 골관절염, 전신성 경화증, 만성심부전 또는 간경화증인 것을 특징으로 하 는 방법.
75. 제 1 항 내지 제50항중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 일부분은 사람에서 유도된 유전자 물질에 의해 인코드되는 것을 특징으로 하는 항체.
76. 제1-50항중 어느 한 항에 따른 항체의 가변 부분에서 유도된 가변 부분과 또 다른 소스에서 유도된 항상 부분(constant region)으로 구성된 키메라 항체.
77. 제 76 항에 있어서, 항상 부분은 사람의 이뮤노글로블린 항상 부분에서 유도된 것을 특징으로 하는 키메라 항체.
78. 특발성 폐 섬유증, 당뇨성 신증, 당뇨성 망막증, 골관절염, 전신성 경화증, 만성심부전 또는 간경화에서 선택된 질환을 가지는 개체를 치료하기 위해 제1-50항중 어느 한 항에 따른 항체로 구성된 약물.
79. 고혈압, 혈당과다증, 당뇨병, 심근경색, 관절염, 국소 또는 전신 염증에서 선택된 질환을 가지는 개체를 치료하기 위해 제1-50항중 어느 한 항에 따른 항체로 구성된 약물.
80. (a) SEQ ID NO:14의 폴리뉴클레오티드 서열

    (b) SEQ ID NO:14의 아미노산 1 내지 167의 아미노산을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열

    (c) SEQ ID NO:13;

    (d) SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드 1 내지 501의 폴리뉴클레오티드 서열에서 선택된 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 서열.
81. 제 81 항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열이 복제 및 전사 제어 서열을 포함하는 벡터 서열에 연결된 구성을 가지는 재조합 폴리뉴클레오티드.
82. 제 81 항에 있어서 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 인코드하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
83. 제 82 항에 있어서 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 인코드하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
84. 제81항에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 감염된 숙주 세포.
85. (a) SEQ ID NO:20의 폴리뉴클레오티드 서열

    (b) SEQ ID NO:14의 아미노산 1 내지 136의 아미노산을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열

    (c) SEQ ID NO:19;

    (d) SEQ ID NO:19의 뉴클레오티드 1 내지 408의 폴리뉴클레오티드 서열에서 선택된 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 서열.
86. 제 85 항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열이 복제 및 전사 제어 서열을 포함하는 벡터 서열에 연결된 구성을 가지는 재조합 폴리뉴클레오티드.
87. 제 86 항에 있어서 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 인코드하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
88. 제 87 항에 있어서 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 인코드하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
89. 제86항에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 감염된 숙주 세포.
90. SEQ ID NO : 14를 인코드하는 폴리뉴클레오티드 및 SEQ ID NO :20을 인코드하는 폴리뉴클레오티드에 의해 공동 전이감염되고, 2004년 5월 19일자 ATCC에 기탁된 기탁번호 의 세포주에 의해 생산된 항체와 실질적으로 동일한 특징을 가지는 기능 항체를 생산하는 숙주 세포.

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