NO331741B1 - Peptidbaserte forbindelser som har affinitet for integrinreseptorer, farmasoytiske sammensetninger omfattende slike og bruk av disse for fremstilling av et kontrastmiddel og et medikament. - Google Patents

Abstract

Oppfinnelsen dreier seg om nye peptidbaserte forbindelser til bruk som bildediagnostiske midler eller som terapeutika hvor midlene inneholder en målstyrt vektor som bindes til reseptorer som er forbundet med integrinreseptorer.

Description

Denne oppfinnelsen dreier seg om nye peptidbaserte forbindelser, farmasøytiske sammensetninger omfattende slike og bruk av disse for fremstilling av et medikament og et kontrastmiddel for bruk i bildediagnostikk. Nærmere bestemt dreier oppfinnelsen seg om bruk av slike peptidbaserte forbindelser i form av målstyrte vektorer som binder seg til reseptorer forbundet med angiogenese, spesielt integrinreseptorer, f.eks. avP3-integrinreseptoren. Kontrastmiddelet kan således brukes til diagnose av for eksempel maligne sykdommmer, hjertesykdom, inflammatoriske sykdommer, revmatoid artritt og Kaposis sarkom, og medikamentetkan brukes i terapi av slike sykdommer.

Nye blodkar kan dannes ved to forskjellige mekanismer: vaskulogenese og angiogenese. Angiogenese er dannelse av nye blodkar ved forgrening fra eksisterende kar. Den primære stimulus for denne prosessen kan være utilstrekkelig tilførsel av næringsstoffer og oksygen (hypoksi) til cellene i et vev. Cellene kan reagere ved å utskille angiogenesefaktorer, som det er mange av. Et eksempel som ofte nevnes er vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF). Disse faktorene starter utskilling av proteolytiske enzymer som bryter ned proteinene i basalmembranen, sammen med hemmere som begrenser virkningen av disse potensielt skadelige enzymene. Den andre fremtredende virkningen av angiogenesefaktorene er å få endotelceller til å vandre og dele seg. Endotelceller som er festet til basalmembranen, som danner et kontinuerlig skikt rundt blodkar på kontralumenalsiden, har ikke mitose. Den kombinerte effekten av tapet av dette festet og signaler fra reseptorene for angiogenesefaktorene er at endotelcellene beveger seg, formerer seg og omorganiserer seg, og lager til slutt en basalmembran rundt de nye karene.

Angiogenese er fremtredende ved vekst og remodellering av vev, blant annet ved sårheling og betennelsesprosesser. Tumorer må sette i gang angiogenese når de kommer opp i millimeterstørrelse for å holde veksthastigheten ved like. Angiogenese er forbundet med karakteristiske forandringer i endotelcellene og miljøet rundt dem. Overflaten til disse cellene er remodellert for å forberede dem for vandringen, og kryptiske strukturer er eksponert der hvor basalmembranen er nedbrutt, ved siden av de forskjellige proteinene som er involvert i å utføre og kontrollere proteolysen. Når det gjelder tumorer er det resulterende nettverket av blodårer vanligvis uorganisert, med skarpe svinger og også arteriovenøse anastomoser. Hemming av angiogenese betraktes også som en lovende strategi for antitumorterapi. Transformasjonene som følger med angiogenese er også meget lovende for diagnose, hvor et opplagt eksempel er kreft, men konseptet gir også gode utsikter for behandling av betennelser og en rekke forskjellige betennelsesrelaterte sykdommer, blant annet aterosklerose, siden makrofagene i tidlige aterosklerotiske lesjoner er potensielle kilder for angiogenesefaktorer. Disse faktorene er også innblandet i revaskularisering av infarktrammede deler av myokard, som skjer hvis en stenose løsner etter kort tid.

Andre eksempler på uønskede tilstander som er forbundet med neovaskularisering eller angiogenese, utvikling eller utbredelse av nye blodkar er omtalt nedenfor. Det henvises også her til WO 98/47541.

Sykdommer og indikasjoner som er forbundet med angiogenese er f.eks. forskjellige former for kreft og metastase, f.eks. brystkreft, hudkreft, prostatakreft, lungekreft, eggstokkreft, kolorektal kreft og kreft i bukspyttkjertelen.

Andre sykdommer og indikasjoner er betennelse (f.eks. kronisk), aterosklerose, revmatoid artritt og gingivitt.

Andre sykdommer og indikasjoner som er forbundet med angiogenese er arteriovenøse misdannelser, astrocytomer, koriokarsinomer, glioblastomer, gliomer, hemangiomer (barne-, kapillær-), hepatomer, hyperplastisk endometrium, ischemisk myokardium, Kaposis sarkom, maculadegenerasjon, melanom, nevroblastomer, okkluderende perifer arteriesykdom, osteoartritt, psoriasis, retinopati (diabetisk, proliferativ), skleroderma, seminomer og ulcerøs kolitt.

Angiogenese involverer reseptorer som er unike for endotelceller og vevet i omgivelsene. Disse markørene er blant annet vekstfaktorreseptorer som VEGF og integrinreseptorfamilien. Immunohistokjemiske undersøkelser har vist at en rekke forskjellige integriner, kanskje med civ-klassen som den viktigste, uttrykkes på innsiden av blodkar [Conforti, G., et al. (1992) Blood 80: 37-446] og er tilgjengelige for målstyring med sirkulerende ligander [Pasqualini, R., et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 542-546]. Et annet viktig integrin er a5pi, som stimulerer til oppbygging av fibronektinmatriks og setter i gang prosessen med å feste celler til fibronektinet. Det spiller også en avgjørende rolle for cellevandring [Bauer, J. S., (1992) J. Cell Biol. 116: 477-487] samt tumorinvasjon og metastase [Gehlsen, K. R., (1988) J. Cell Biol. 106: 925-930].

Integrin avP3 er en av reseptorene som er kjent for å være forbundet med angiogenese. Stimulerte endotelceller ser ut til å være avhengige av denne reseptoren for å overleve under en kritisk periode av angiogeneseprosessen, siden antagonister for interaksjonen mellom avP3-reseptor og ligand fører til apoptose og hemmer vekst av blodkarene.

Integriner er heterodimere molekyler hvor a- og P-underenhetene trenger igjennom det doble lipidlaget i cellemembranen. På den ekstracellulære kjeden av a-enheten er det fire Ca<2+->bindende domener, mens p-enheten har et antall ekstracellulære cysteinrike domener.

Mange ligander (f.eks. fibronektin) som er involvert i celleadhesjon inneholder tripeptidsekvensen arginin-glycin-asparaginsyre (RGD). RGD-sekvensen ser ut til å fungere som et primært gjenkjennelsespunkt mellom ligander som presenterer denne sekvensen og reseptorer på celleoverflaten. Generelt tror man at sekundære interaksjoner mellom liganden og reseptoren gjør interaksjonen mer spesifikk. Det kan hende at disse sekundære interaksjonene finner sted mellom grupper i liganden og reseptoren som ligger like ved RGD-sekvensen eller på steder som er et stykke fra RGD-sekvensen.

Det er kjent at RGD-peptider binder seg til en rekke integrinreseptorer og har muligheter for å regulere en rekke cellebegivenheter som er av vesentlig betydning for kliniske formål.

(Ruoslahti, J. Clin. Invest. 87: 1-5 (1991)). Kanskje den mest undersøkte effekten av RGD-peptider og etterlikninger av disse dreier seg om bruk av dem som antitrombotiske midler som styres til blodplateintegrinet GpIIbllla.

Hemming av angiogenese i vev ved tilførsel av enten en avP3- eller en avP3-antagonist er beskrevet for eksempel i WO 97/06791 og WO 95/25543 ved å bruke enten antistoffer eller RGD-holdige peptider. EP 578083 beskriver en serie monosykliske RGD-holdige peptider og WO 90/14103 inneholder patentkrav for RGD-antistoffer. Haubner et al. i J. Nucl. Med

(1999), 40: 1061-1071 beskriver en ny klasse sporingsstoffer for målstyring til tumorer basert på monosykliske RGD-holdige peptider. Biodistribusjonsstudier med autoradiografisk avbildning av hele kroppen viste imidlertid at de<I25>I-merkede peptidene hadde svært lav halveringstid i blodet og ble skilt ut overveiende hepatobiliært, noe som førte til høye bakgrunnsverdier. Sykliske RGD-peptider med flere broer er også beskrevet i WO 98/54347 og WO 95/14714. Peptider som stammer fra in vivo biopanning (WO 97/10507) er brukt til diverse målstyringsformål. Sekvensen CDCRGDCFC (RGD-4C), med uidentifiserte broposisjoner er brukt til å styre slike medikamenter som doxirubicin (WO 98/10795), nukleinsyrer og adenovirus til bestemte celler (se WO 99/40214, WO 99/39734, WO 98/54347, WO 98/54346, US 5846782). Peptider som inneholder mange cysteiner har imidlertid den ulempen at det kan oppstå mange disulfidisomerer. Et peptid med 4 cysteiner som RGD-4C kan danne 3 forskjellige disulfidfoldede former. Isomerene vil ha varierende affinitet for integrinreseptoren ettersom RGD-farmakoforen tvinges inn i 3 forskjellige konformasjoner.

Effektiv målstyring og avbildning med integrinreseptorer som er forbundet med angiogenese in vivo krever derfor en selektiv RGD-basert vektor som er kjemisk robust og stabil. Dessuten er utskillelsesmåten en viktig faktor når de bildediagnostiske midlene skal utformes for å redusere bakgrunnsproblemene. Disse strenge betingelsene tilfredsstilles ved de bisykliske strukturene som er beskrevet i den foreliggende oppfinnelsen.

Ett aspekt av oppfinnelsen er å tilveiebringe nye peptidbaserte forbindelser som definert i formel I. Disse forbindelsene kan brukes som vektorer med affinitet for integrinreseptorer, f.eks. for integrin avP3.

Forbindelsene av formel I har minst to broer, hvor en bro danner en disulfidbinding og den andre har en tioeter- (sulfid-)binding og hvor broene folder vektorgruppen i en 'nestet' konfigurasjon.

Forbindelsene i henhold til den foreliggende oppfinnelsen har dermed maksimalt en disulfidbro for hver vektorgruppe. Forbindelser i henhold til den foreliggende oppfinnelsen er overraskende stabile in vivo og under betingelser som brukes ved merking, f.eks. med technetium.

Disse nye forbindelsene kan brukes både til fremstilling av medikamenter for effektiv terapeutisk eller profylaktisk behandling og for avbildningsformål.

Avhengig av definisjonene av Ri og X].g inkluderer formel I forbindelser som inneholder gruppene (V)keventuelt sammen med gruppene L og/eller R, hvor

V er den bisykliske vektoren, L er en linker, R er en detekterbar gruppe (reporter), f.eks. detekterbar i en avbildningsprosedyre, brukt f.eks. som kontrastmiddel i form av en (V)kLR-konstruksjon ved avbildning av menneskekroppen eller en vaskularisert ikke-menneskelig dyrekropp (f.eks. pattedyr, fugler eller krypdyr) in vivo, eller brukt som terapeutiskmiddel.

De nye peptidbaserte forbindelsene i henhold til den foreliggende oppfinnelsen er definert ved formel I:

hvor

G er glycin og

D er asparaginsyre og

Ri er -(CH2)n- eller -(CH2)n-C6H4-, fortrinnsvis er Ri -(CH2)-, og

n er et positivt heltall 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 og

h er et positivt heltall 1 eller 2 og

Xi er en binding eller 1,2, 3,4 eller 5 aminosyrer, fortrinnsvis 1 eller 2 aminosyrer, hvor hver aminosyre uavhengig av hverandre eventuelt er derivatisert med en funksjonell sidegruppe, f.eks. en karbohydratgruppe, som egner seg for å modifisere farmakokinetikken eller halveringstiden i blodet for de nevnte midlene, og den nevnte sidegruppen fortrinnsvis innbefatter Ci-22-alkyl- eller Ci-22-perfluoralkylkjeder, polyetylenglykolpolymerer og/eller hydrofobe grupper med affinitet for serumalbumin og

hver aminosyre uavhengig av hverandre eventuelt binder en reportergruppe (R) som egner seg for in vivo avbildning ved hjelp av i) en linker (L) eller ii) en chelatdanner eller iii) en linker (L) bundet til en chelatdanner,

og X2fortrinnsvis er asparaginsyre, tyrosin, tyrosin-asparaginsyre, lysin, glutaminsyre, acetyllysin, asparagin, serin, treonin eller glutamin eller derivater av disse og

X2og X4uavhengig av hverandre er en aminosyre som kan danne en disulfidbinding, fortrinnsvis cystein eller homocystein og

X3er arginin, N-metylarginin eller en argininetterlikning, fortrinnsvis arginin eller N-metylarginin og

X5er en hydrofob aminosyre eller et derivat derav, fortrinnsvis tyrosin, fenylalanin, 3-jodtyrosin eller naftylalanin, og helst fenylalanin eller 3-jodtyrosin, og

X6er en tiolholdig aminosyre, fortrinnsvis cystein eller homocystein og

k er et positivt heltall 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10, fortrinnsvis det positive heltallet 1,2,3 eller 4 og helst er k det positive heltallet 1, og

X7er en linker (L) eller 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 aminosyrer, eventuelt som del av en linker (L), fortrinnsvis er X7én aminosyre, og

hver aminosyre uavhengig av hverandre eventuelt er derivatisert med en funksjonell sidegruppe, f.eks. en karbohydratgruppe, egnet for modifisering av farmakokinetikken eller halveringstiden i blodet for de nevnte midlene, hvor den nevnte sidegruppen fortrinnsvis innbefatter Ci-22-alkyl- eller Ci-22-perfluoralkylkjeder, polyetylenglykolpolymerer og/eller hydrofobe grupper med affinitet for serumalbumin, og

hvor hver aminosyre uavhengig av hverandre eventuelt binder en reportergruppe (R) egnet for avbildning in vivo ved hjelp av i) en linker (L) eller ii) en chelatdanner eller iii) en linker (L) festet til en chelatdanner, eller

X7fraværende, og

minst en individuell linker (L) fortrinnsvis inneholder en eller flere etylenglykolenheter, og/eller X7fortrinnsvis inneholder gly ein og et foretrukket alternativ er at X7er fraværende, og

Xg er en reportergruppe (R) eller er -NH2eller mangler, og

eventuelle farmasøytisk akseptable salter av disse.

Spesielt foretrukne definisjoner av chelatdannere er formel a, b, c og d, se nedenfor. Imidlertid kan forbindelsene i henhold til formel I også inkludere chelatdannere i henhold til tabell I.

Foretrukne eksempler på chelatdannere og linkere er vist som formel e og f.

I noen aspekter av oppfinnelsen er chelatet en funksjonell gruppe som binder eller kan binde en radionuklide. Foretrukne definisjoner for chelatdannere til kompleksering av nuklider, fortrinnsvis """technetium, er ført opp i tabell I nedenfor. I noen aspekter av oppfinnelsen er chelatet en funksjonell gruppe som binder eller kan binde en 1 RF-isotop eller en isotop av Cu, enten ved nukleofil substitusjon, elektrofil addisjonsreaksjon eller ved å bruke en chelatdanner. Den resulterende forbindelsen kan dermed brukes ved avbildningsmetoden positronemisjonstomografi (PET - Positron Emission Tomography).

Vektorkomponentene av vektorkonjugatene som beskrives i dette dokumentet har fortrinnsvis ingen frie amino- eller karboksyterminale ender. Dette gjør disse forbindelsene vesentlig mer motstandsdyktige mot enzymatisk nedbrytning og dermed mer stabile in vivo sammenliknet med kjente frie peptider.

Reporteren, R, kan festes til V (via L) ved hjelp av X]og/eller X7. Fortrinnsvis velges festepunktet slik at den biologiske aktiviteten til V eller bindingsaffiniteten til V for målet ikke reduseres betydelig eller vesentlig (sammenliknet med den biologiske aktiviteten for V eller bindingsaffiniteten til V uten R). Det foretrekkes mest at R er festet til V.

I dette dokumentet brukes betegnelsen 'aminosyre' i sin mest vidtfavnende betydning som proteogene L-aminosyrer, D-aminosyrer, kjemisk modifiserte aminosyrer, N-metyletterlikninger, Ca-metyletterlikninger og etterlikninger av aminosyresidegrupper og unaturlige aminosyrer som naftylalanin. Det som foretrekkes er hvilke som helst naturlig forekommende aminosyrer eller etterlikninger av slike naturlig forekommende aminosyrer.

Noen foretrukne utførelsesformer av forbindelsene med formel I illustreres av forbindelse II-IX nedenfor:

Forbindelse II

Forbindelse III Forbindelse IV

Forbindelse V

Forbindelse VI Forbindelse VII

Forbindelse VIII Forbindelse IX

hvor forbindelse V og forbindelse VI er egnet for technetiummerking, forbindelse II kan merkes med en radioisotop av jod og forbindelse III har tyrosin i en posisjon som egner seg for merking med en radioisotop av jod. Forbindelse VII inneholder et vektor-chelatkonjugat hvor arginin og fenylalanin er erstattet med henholdsvis N-metylarginin og naftylalanin, noe som øker den enzymatiske stabiliteten av vektorkomponenten. Forbindelse IV inneholder tyrosin i stedet for fenylalanin for radioaktiv merking med jod, hvor det C-terminale glycinet er fjernet og syrefunksjonen erstattet med en amidbinding for å redusere karboksypeptidasenes nedbrytning av vektoren.

Formel I som definert innbefatter en eller flere vektorer (V)

hvor X]er en binding eller 1,2, 3,4 eller 5 aminosyrer hvor hver aminosyre uavhengig av hverandre eventuelt er derivatisert med en funksjonell sidegruppe som egner seg for å modifisere farmakokinetikken eller halveringstiden i blodet for de nevnte midlene, og Xi .6 er som definert ved formel I, og

X7er 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 aminosyrer eller mangler,

og Xg mangler.

I de fleste tilfellene foretrekkes det at aminosyrene i vektoren V er av L-formen. Men i noen utførelsesformer av oppfinnelsen er fortrinnsvis en, to, tre eller flere av aminosyrene i vektoren V i D-formen. Slike D-aminosyrer kan ha en vesentlig effekt på serumstabiliteten av vektoren. Her vises det spesielt til vektorer som har D-tyrosin i posisjon Xi.

I henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan hvilke som helst av aminosyrene som defineres ved formel I fortrinnsvis være en aminosyre som forekommer i naturen og uavhengig av hverandre foreligge i hvilken som helst av D- eller L-konformasjonene.

Forbindelse II-VII har fortrinnsvis de stereospesifikke konformasjonene som er vist nedenfor:

Forbindelse Ila

Forbindelse Illa

Forbindelse IVa Forbindelse Va

Molekylvekt= 1569,856

Eksakt masse = 1569,690

Molekylformel = C64H104N20O20S3

Forbindelse Via

Forbindelse Vila

Noen av forbindelsene i henhold til oppfinnelsen er høy-affinitets RGD-baserte vektorer. I dette dokumentet betegner uttrykket' høy-affinitets RGD-basert vektor' forbindelser med Ki på mindre enn < 100 nM, fortrinnsvis < 10 nM og helst < 5 nM, i et kompetitivt bindingsforsøk for avP3-integrin og hvor Ki-verdien ble bestemt ved å la den konkurrere med echistatin, en ligand med kjent høy affinitet. Metoder for å utføre slike konkurransetester er velkjente.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en farmasøytisk sammensetning som inneholder en effektiv mengde (f.eks. en mengde som er effektiv for å forbedre bildekontrasten ved avbildning in vivo) av en forbindelse av den generelle formel I eller et salt av denne, sammen med et eller flere farmasøytisk aksepterbare hjelpestoffer, bærere eller fortynningsmidler.

Oppfinnelsen tilveiebringer også bruk av en forbindelse ifølge oppfinnelsen til fremstilling av et kontrastmiddel for bruk i en diagnosemetode som innebærer å gi det nevnte kontrastmidlet til et levende subjekt og danne et bilde av minst en del av det nevnte subjektet.

Oppfinnelsen tilveiebringer også bruk av en forbindelse ifølge oppfinnelsen til å fremstille et medikament for terapeutisk eller profylaktisk behandling av kreft eller en beslektet sykdom hos et menneskelig eller ikke-menneskelig subjekt.

Som nevnt ovenfor kan forbindelsene av formel I innbefatte vektor-, linker- og reportergrupper. En linker kan tjene til å binde en vektor til en reporter, men alternativt kan den binde mer enn en vektor og/eller mer enn en reporter. Likeledes kan en reporter eller en vektor bindes til mer enn en linker. Slikt bruk av flere reportere (f.eks. flere linker-reportergrupper bundet til en vektor eller flere reportere bundet til en linker som selv er bundet til en vektor) kan gjøre det mulig å øke registrerbarheten for kontrastmidlet (f.eks. ved å øke radioopasiteten, ekkogenisiteten eller relaksiviteten) eller kan gjøre det mulig å registrere det i mer enn én avbildningsmetode. Slikt bruk av flere vektorer kan f.eks. øke målstyringseffektiviteten for et kontrastmiddel eller kan gjøre det mulig å styre kontrastmidlet/terapimidlet til mer enn ett sted, f.eks. forskjellige reseptorer hvis midlet er reseptorheterogent.

Det kan brukes et stort utvalg av linkere, blant annet slike som er biologisk nedbrytbare eller biopolymerer.

Linkerkomponenten av kontrastmidlet er på sitt enkleste en binding mellom vektor- og reportergruppene. Mer generelt sett vil linkeren imidlertid være et mono- eller multimolekylært skjelett som kovalent eller ikke-kovalent binder en eller flere vektorer til en eller flere reportere, f.eks. et lineært, syklisk, enkelt forgrenet eller nettverksforgrenet molekylskjelett, eller et molekylært aggregat, med innebygde eller påhengte grupper som bindes kovalent eller ikke-kovalent, f.eks. koordinativt, til vektor- og reportergruppene eller som innkapsler, innestenger eller forankrer slike grupper. En foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringer forbindelser av formel I hvor en eller flere aminosyrer inngår i hvilken som helst av de individuelle linkerkomponentene.

Altså kan sammenkobling av en reportergruppe med en ønsket vektor oppnås ved kovalente eller ikke-kovalente midler, vanligvis ved interaksjon med en eller flere funksjonelle grupper på reporteren og/eller vektoren. Eksempler på kjemisk reaktive funksjonelle grupper som kan brukes til dette formålet er amino, hydroksyl, sulfhydryl, karboksyl og karbonyl, samt karbohydratgrupper, vicinale dioler, tioetere, 2-aminoalkoholer, 2-aminotioler, guanidyl, imidazolyl og fenolgrupper.

Kovalent binding av reporter og vektor kan derfor utføres med linkere som inneholder reaktive grupper som kan reagere med slike funksjonelle grupper.

Det vil være klart at funksjonelle grupper i reporter og/eller vektor hvis ønskelig kan konverteres til andre funksjonelle grupper før reaksjonen, f.eks. for å øke reaktiviteten eller selektiviteten.

Det kan også være nyttig å bruke en vektor som er bundet til linker i form av et peptid, et lipo-oligosakkarid eller et lipopeptid som inneholder et element som kan bidra til å føre den inn i membranen.

Såkalte null-lengde-linkere, som medfører direkte kovalent sammenbinding av to reaktive kjemiske grupper uten å innføre noe linkermateriale (som f.eks. hvis det lages amidbindinger ved innvirkning av karbodiimider eller enzymer) kan brukes i henhold til oppfinnelsen hvis man ønsker det, og også slike midler som biotin-/avidinsystemer som gir ikke-kovalent sammenbinding av reporter og vektor, samt slike midler som induserer elektrostatiske interaksjoner.

Imidlertid er det mest vanlig at linkeren inneholder to eller flere reaktive grupper, f.eks. som beskrevet ovenfor, bundet sammen med et inert mellomledd. Et slikt mellomledd gjør det mulig for bifunksjonelle linkere å reagere med spesifikke funksjonelle grupper inne i et molekyl eller mellom to forskjellige molekyler, noe som fører til binding mellom disse to komponentene og fører inn linkermateriale utenfra til reporter-vektor-konjugatet. De reaktive gruppene i en linker kan være de samme (homobifunksjonelle midler) eller forskjellige (heterobifunksjonelle midler eller, hvis det inneholder flere ulike reaktive grupper, heteromultifunksjonelle midler), noe som tilveiebringer et rikt utvalg av potensielle reagenser som kan innføre kovalent binding mellom hvilke kjemiske stoffer som helst, enten intramolekylært eller intermolekylært.

Karakteren av materialet som innføres utenfra ved hjelp av linkeren kan ha en kritisk betydning for målstyringsevnen og den generelle stabiliteten for sluttproduktet. Altså kan det være ønskelig å innføre labile sammenkoblinger, f.eks. med mellomledd som er biologisk nedbrytbare eller kjemisk sensitive eller har enzymspaltningspunkter. Alternativt kan mellomleddet inneholde polymerkomponenter som f.eks. kan fungere som surfaktanter og øke stabiliteten av midlet. Mellomleddet kan også inneholde reaktive grupper, f.eks. som beskrevet ovenfor, for å lage flere tverrforbindelser i overflaten. Mellomleddelementer kan også inneholde makromolekylære strukturer som dekstran og fortrinnsvis poly(etylenglykoler), som vanligvis betegnes PEG. Foruten linkerelementene kan PEG også brukes til å modifisere egenskapene in vivo for vektorene.

Andre representative mellomleddelementer er strukturtypepolysakkarider, lagringstypepolysakkarider, polyaminosyrer og metyl- og etylestere av disse, og polypeptider, oligosakkarider og oligonukleotider, enten med eller uten enzymspaltningspunkter.

Foretrukne linkegrupper er avledet fra vektorreaktive grupper som velges blant, men ikke er begrenset tik-

en gruppe som vil reagere direkte med karboksyl, aldehyd, amin (NHR), alkohol, sulfhydryl, aktiverte metylener og liknende på vektoren, for eksempel aktive halogenholdige grupper,

en gruppe som lett kan reagere med modifiserte vektormolekyler som inneholder en vektorreaktiv gruppe, d.v.s. vektorer med en reaktiv gruppe som er modifisert slik at den innholder reaktive grupper, for eksempel ved oksidasjon av vektoren til et aldehyd eller en karboksylsyre, og

en gruppe som kan bindes til vektoren som inneholder en reaktiv gruppe, eller til en modifisert vektor som ovenfor ved å bruke et kryssbindingsmiddel.

Foretrukne anvendbare linkergrupper er avledet fra forskjellige heterobifunksjonelle kryssbindingssreagenser som for eksempel de som er oppført i Pierce Chemical Company Immunotechnology Catalog - Protein Modification Section, (1995 og 1996).

I tillegg til den foregående beskrivelsen kan linkergruppene i sin helhet eller delvis innbefatte og være avledet fra komplementære sekvenser av nukleotider og rester av nukleotider, både slike som forekommer i naturen og modifiserte, fortrinnsvis ikke selv-assosierende oligonukleotidsekvenser.

Linkere som brukes i henhold til oppfinnelsen vil generelt binde sammen vektor og reporter eller reporter og reporter med noen grad av spesifisitet, og kan også brukes til å binde et eller flere terapeutisk aktive midler.

Andre eksempler på linkere som kan brukes i den foreliggende søknadens gyldighetsområde er nevnt på side 32-54 av W098/47541 og det som fremlegges på disse sidene inkorporeres herved i sin helhet i dette dokumentet ved referanse.

Det understrekes herved at alle linkerne eller deler av disse som fremlegges på de forannevnte sidene skal anses for å inngå i beskrivelsen av oppfinnelsen som er fremlagt i denne søknaden.

Reportergruppene i kontrastmidlene i henhold til oppfinnelsen kan være en hvilken som helst gruppe som kan registreres enten direkte eller indirekte i en bildediagnostisk prosedyre in vivo. Fortrinnsvis innbefatter kontrastmidlet én reporter. Foretrukne grupper er grupper som sender ut eller kan bringes til å sende ut registrerbar stråling (f.eks. ved radioaktiv nedbrytning, fluorescenseksitasjon, spinnresonanseksitasjon etc), grupper som innvirker på lokale elektromagnetiske felt (f.eks. paramagnetiske, superparamagnetiske, ferrimagnetiske eller ferromagnetiske substanser), grupper som absorberer eller sprer strålingsenergi (f.eks. kromoforer og fluoroforer), partikler (deriblant væskeholdige vesikler), tunge grunnstoffer og forbindelser av disse, og grupper som danner en registrerbar substans, etc.

Et svært bredt utvalg av materialer som kan detekteres ved diagnostiske avbildningsmetoder er kjent og reporteren vil velges i samsvar med avbildningsmetoden som brukes. For eksempel vil man for ultralydavbildning normalt velge et ekkogent materiale eller et materale som kan danne et ekkogent materiale. Vektorene kan bindes ved hjelp av en linker til en passende lipidreporter/-bærer for å inkorporeres i en gassfylt mikroboble. Slike mikrobobler kan brukes til målstyrt ultralydavbildning. For røntgen vil reporteren generelt være eller inneholde et tungt atom (f.eks. med atomvekt 38 eller mer), for MR-avbildning vil reporteren enten være en isotop med kjernespinn forskjellig fra null (som 19F) eller et materiale som har uparede elektronspinn og dermed paramagnetiske, superparamagnetiske, ferrimagnetiske eller ferromagnetiske egenskaper, for lysavbildning vil reporteren være et materiale som sprer lyset (f.eks. en farget eller ufarget partikkel), absorberer lyset eller avgir lys, for magnetometrisk avbildning vil reporteren ha registrerbare magnetiske egenskaper, for elektroimpedansavbildning vil reporteren innvirke på den elektriske impedansen og for scintigrafi, SPECT, PET etc. vil reporteren være en radionuklide.

Eksempler på egnede reportere er godt kjent fra litteraturen om bildediagnostikk, f.eks. magnetiske jernoksidpartikler, vesikler som inneholder røntgenkontrastmidler, chelater av paramagnetiske metaller (som Gd, Dy, Mn, Fe etc).

Generelt uttrykt kan reporteren være (1) et chelaterbart metall som kan danne chelater eller et fleratomig metallholdig ion (d.v.s. TcO etc), hvor metallet har høyt atomnummer (f.eks. atomnummer over 37), en paramagnetisk substans (f.eks. et overgangsmetall eller en lantanide), eller en radioaktiv isotop, (2) en kovalent bundet ikkemetallisk substans hvor det er et uparet elektron et sted (f.eks. et oksygen eller karbon i et stabilt fritt radikal), et ikke-metall med høyt atomnummer eller en radioisotop, (3) et aggregat eller en krystall av mange atomer som inneholder atomer med høyt atomnummer og har kooperativ magnetisk oppførsel (f.eks. superparamagnetisme, ferrimagnetisme eller ferromagnetisme) eller inneholder radionuklider, (4) en kromofor (hvori inngår substanser med fluorescens eller fosforescens), f.eks. en uorganisk eller organisk struktur, spesielt et kompleksert metallion eller en organisk gruppe som har et ekstensivt delokalisert elektronsystem, eller (5) en struktur eller gruppe hvor det er mulig å variere den elektriske impedansen, f.eks. på grunn av et ekstensivt delokalisert elektronsystem.

Eksempler på spesielle foretrukne reportergrupper er beskrevet i mer detalj nedenfor.

Chelaterte metallreportere velges fortrinnsvis fra gruppen av metall radionuklider, paramagnetiske metallioner, fluorescerende metallioner, tunge metallioner og aggregationer.

Foretrukne metalliske radionuklider inkluderer blant annet 90Y, 99mTc, Inln,<47>Sc,<67>Ga,<5I>Cr, 117mSn, 67Cu,167Tm,9<7>Ru,186Re,177Lu,199Au,203Pb og141Ce.

Foretrukne paramagnetiske metallioner er blant annet ioner av overgangs- og lantanidemetaller (f.eks. metaller med atomnummer fra 6 til 9, 21-29, 42, 43, 44 eller 57-71), spesielt ioner av Cr, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb og Lu, mer spesielt Mn, Cr, Fe, Gd og Dy, mest spesielt Gd.

Chelater av metallionene dannes fortrinnsvis av chelatdannere på linkergruppen eller på eller i en partikkel (f.eks. en vesikkel eller et porøst eller ikke-porøst uorganisk eller organisk fast stoff), spesielt lineære og makrosykliske chelatdannere og terpyridinchelatdannere og N2S2-chelatdannere, som for eksempel DTPA, DTPA-BMA, EDTA, D03A og TMT. Andre eksempler på egnede chelatdannere er fremlagt i US-A-4647447, WO89/00557, US-A-5367080, US-A-5364613 etc.

Linkergruppen eller partikkelen kan inneholde en eller flere slike chelatdannere, hvis ønskelig metallert med mer enn ett metallslag (f.eks. for å danne reportere som kan registreres med forskj ellige avbildningsmetoder).

Metoder for å metallere enhver chelatdanner eer kjent av fagmannen. Metaller kan inkorporeres i en chelatdanner ved en av tre generelle metoder: direkte inkorporering, mal-syntese og/eller transmetallering. Direkte inkorporering foretrekkes.

Altså er det ønskelig at metallionet lett kan komplekseres til chelatdanneren, for eksempel ved å bare eksponere eller blande en vannløsning av den chelatdannerholdige gruppen med et metallsalt i en vannløsning som fortrinnsvis har pH i området mellom omtrent 4 til omtrent 11. Saltet kan være et hvilket som helst salt, med fortrinnsvis er saltet et vannløselig salt av metallet, for eksempel et halogensalt, og helst velges slike salter slik at de ikke interfererer med bindingen av metallionet til chelatdanneren. Den chelatdannerholdige gruppen er fortrinnsvis i vannløsning ved pH mellom omtrent 5 og omtrent 9, mens en pH mellom omtrent 6 og omtrent 8 foretrekkes mer. Den chelatdannerholdige gruppen kan blandes med buffersalter som citrat, acetat, fosfat og borat for optimal pH. Fortrinnsvis velges buffersaltene slik at de ikke interfererer med den påfølgende bindingen av metallionet til chelatdanneren.

Ved bildediagnostikk har vektor-linker-reporter-konstruksjonen (V)kLR fortrinnsvis et forhold mellom metallisk radionuklideion og chelatdanner som er effektivt for slike bildediagnostiske formål. I foretrukne utførelsesformer er molforholdet mellom metallioner og chelatdanner fra omtrent 1:1000 til omtrent 1:1.

Til strålebehandling har (V)kLR fortrinnsvis et forhold mellom metallisk radionuklideion og chelatdanner som er effektivt for slike terapeutiske formål. I foretrukne utførelsesformer er molforholdet mellom metallion og chelatdanner fra omtrent 1:100 til omtrent 1:1. Radionukliden kan for eksempel være radionuklider av Sc, Fe, Pb, Ga, Y, Bi, Mn, Cu, Cr, Zn, Ge, Mo, Ru, Sn, Sr, Sm, Lu, Sb, W, Re, Po, Ta og Tl. Foretrukne radionuklider er blant annet<44>Sc, ^Cu,<67>Cu,<2I2>Pb,<68>Ga,<90>Y,<I5>3Sm, 2I2Bi, I86Re og<I88>Re. Av disse foretrekkes spesielt<90>Y. Disse radioisotopene kan være atomære eller fortrinnsvis ioniske.

De følgende isotopene eller isotopparene kan brukes både for avbildning og terapi uten at merkemetodologien eller chelatdanneren må endres:<47>Sc2i,<I4I>Ces8,<188>Re75, mLu7i,<I99>Au79, 47c~ I3IT 67^,, 131T . 123T 188T>a 99111^ 90v . 87v 47c„ . 44c„ 90v SC21,<I>53, CU29, I53Og I53, Re?5 Og TC43, Y39Og Y39, SC21Og SC21, Y39 . 123T 146c, 153c_ . 90v .111T„

og I53, Sm62og<S>m62, og Y39 og I1149.

Chelatdannerdelene kan festes ved funksjonalisering av hovedkjeden til chelatdanneren eller ved å utnytte en eller flere av de metallkoordinerende gruppene til chelatdanneren eller ved å danne amid- eller esterbinding mellom sure chelatdannere og en hovedkjeden av en linker med amin eller hydroksyl, som f.eks. i polylysin-polyDTPA, polylysin-polyDOTA og i de såkalte 'forstørrende' polychelatdannerne fra PCTYEP96/00565. Slike grupper kan konjugeres til en eller flere vektorgrupper enten direkte (f.eks. ved å bruke amin-, syre- eller hydroksylgrupper i polychelatdanner-linkeren) eller ved hjelp av en bifunksjonell linker som diskutert ovenfor for monochelatdanner-linkere.

Hvis chelatet er festet på en partikulær linker (eller et molekylært aggregat, f.eks. vesikler) kan det for eksempel være et ubundet mono- eller polychelat (som for eksempel Gd DTPA-BMA eller Gd HP-D03 A) innesluttet i partikkelen eller det kan være et mono- eller polychelat konjugert til partikkelen enten ved kovalent binding eller ved interaksjon med en annen gruppe (f.eks. en lipofil gruppe) på mono-/polychelatet med membranen av en vesikkel (se for eksempel PCT/GB95/02378).

Foretrukne ikke-metalliske atomære reportere er blant annet slike radioisotoper somI23I,<I3I>I og<I8>F, samt atomer med kjernespinn forskjellig fira null, som<I9>F, og tunge atomer som for eksempel I.

Slike reportere, fortrinnsvis mange av dem, f.eks. 2 til 200, kan bindes kovalent til hovedkjeden av en linker, enten direkte med konvensjonell kjemisk synteseteknikk eller med en hjelpegruppe, f.eks. en trijodfenylgruppe.

I en utførelsesform av denne oppfinnelsen betraktes spesielt bruk av radioisotoper av jod eller fluor. Hvis for eksempel vektoren eller linkeren består av substituenter som kan substitueres kjemisk med jod eller fluor i en reaksjon hvor det dannes en kovalent binding, som for eksempel substituenter som inneholder hydroksyfenyl- eller p-nitrobenzoylfunksjonalitet, kan slike substituenter merkes med en radioisotop av henholdsvis jod eller fluor med metoder som er godt kjent. Disse substansene kan brukes til terapi eller bildediagnostikk. Og samtidig kan et metall bundet til en chelatdanner på den samme vektoren-linkeren brukes enten til terapi eller bildediagnostikk.

Som med de metallchelatdannerne som diskuteres ovenfor kan slike metallatomære reportere bindes til linkeren eller befinne seg i eller på en partikulær linker, f.eks. i en vesikkel (se WO95/26205 og GB 9624918.0).

Linkere av typen som beskrives ovenfor i forbindelse med metallreporterne kan brukes til ikke-metalliske atomære reportere hvor den ikke-metalliske atomære reporteren eller grupper som har slike reportere erstatter noen av eller alle chelatdannergruppene.

Fortrinnsvis vil (V)kLR-midlene i henhold til oppfinnelsen ha reseptormålstyringsvektorene bundet direkte eller indirekte til en reporter, f.eks. med kovalent bundne radioisotoper av jod, med metallchelater bundet direkte eller ved hjelp av en organisk linkergruppe eller bundet til en partikkelformet reporter eller linker-reporter, f.eks. superparamagnetiske krystaller (eventuelt overtrukne, f.eks. som i PCT/GB97/00067) eller en vesikkel, f.eks. et jodert kontrastmiddel som inneholder miceller eller liposomer.

En foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen dreier seg om et radiomerket middel av generell formel (I), spesielt for bruk i tumoravbildning.

De diagnostiske midlene i henhold til oppfinnelsen kan gis til pasienter for avbildning i mengder som er tilstrekkelige for å gi den ønskede kontrasten med den angjeldende avbildningsteknikken. Hvis reporteren er et metall, er generelt doser på fra 0,001 til 5,0 mmol chelatert avbildningsmetallion pr. kilogram av pasientens kroppsvekt effektive for å oppnå tilstrekkelig kontrastforbedring. Hvis reporteren er en radionuklide vil doser på 0,01 til 100 mCi, fortrinnsvis 0,1 til 50 mCi normalt være tilstrekkelig pr. 70 kg kroppsvekt.

Doseringen av forbindelsene i henhold til oppfinnelsen for terapeutisk bruk vil være avhengig av tilstanden som skal behandles, men generelt vil den ligge mellom 1 pmol til 1 mmol pr. kg kroppsvekt.

Forbindelsene i henhold til oppfinnelsen kan derfor med velkjente metoder formuleres med fysiologisk aksepterbare bærere eller hjelpestoffer for å gis til pasienter. For eksempel kan forbindelsene, eventuelt med tilsetning av farmasøytisk aksepterbare hjelpestoffer, suspenderes eller løses i vannmedium, og den resulterende løsningen eller suspensjonen deretter steriliseres.

Forbindelsene av formel I kan være terapeutisk effektive ved behandling av sykdomstilstander så vel som registrerbare ved avbildning in vivo. For eksempel kan vektor-eller reportergruppene ha terapeutisk effekt f.eks. på grunn av den radioterapeutiske effekten av en radionuklidereporter, effektiviteten til en kromoforreporter (eller fluoroforreporter) i fotodynamisk terapi eller den kjemoterapeutiske effekten av vektorgruppen.

Bruk av forbindelsene av formel I til fremstilling av terapeutiske sammensetninger (medikamenter) og i metoder for terapeutisk eller profylaktisk behandling, fortrinnsvis behandling av kreft, i menneskekroppen eller i ikke-menneskelige dyrekropper, betraktes dermed som andre aspekter av oppfinnelsen.

Ytterligere eksempler på reportere som kan brukes i sammenheng med den foreliggende søknaden er gitt på side 63-66 og 70-86 av W098/47541, og det som fremlegges på disse sidene inkorporeres herved i sin helhet i dette dokumentet ved referanse. Det understrekes herved at alle de reporterne eller deler av slike som fremlegges på de nevnte sidene betraktes som del av beskrivelsen av oppfinnelsen som omhandles i denne søknaden.

Et annet aspekt av oppfinnelsen er bruk av en forbindelse av formel I til fremstilling av et kontrastmiddel for bruk i en diagnosemetode som innebærer at det nevnte kontrastmidlet gis til et levende subjekt og at det dannes et bilde av minst en del av det nevnte subjektet.

Et videre aspekt av oppfinnelsen er en metode for å danne et bilde av et levende menneskelig eller ikke-menneskelig (fortrinnsvis pattedyr eller fugl) animalsk subjekt som innebærer at det gis et kontrastmiddel til det nevnte subjektet, f.eks. i blodkarsystemet, og at det dannes et bilde av minst en del av det nevnte subjektet som det nevnte kontrastmidlet er fordelt i, f.eks. ved slike metoder som røntgen, MR, ultralyd, scintigrafi, PET, SPECT, elektoimpedans-, lys-eller magnetometriavbildning, hvor det brukes et middel av formel I som det nevnte kontrastmidlet.

Et videre aspekt av oppfinnelsen er en metode for å danne forbedrede bilder av et menneskelig eller ikke-menneskelig animalsk subjekt som fra før er gitt en kontrastmiddelsammensetning som inneholder en forbindelse i samsvar med formel I, hvor metoden innbefatter å danne et bilde av minst en del av det nevnte subjektet.

Et vider aspekt av oppfinnelsen er en metode for å overvåke virkningen av behandlingen av et menneskelig eller ikke-menneskelig animalsk subjekt med et medikament mot tilstand som er forbundet med kreft, fortrinnsvis angiogenese, f.eks. et cytostatikum, hvor den nevnte metoden innebærer å gi det nevnte subjektet et middel av formel I og registrere opptaket av det nevnte midlet av cellereseptorer, fortrinnsvis endotelcellereseptorer og spesielt avP3-reseptorer, hvor den nevnte medikamenteringen og deteksjonen eventuelt men fortrinnsvis gjentas flere ganger, f.eks. før, under og etter behandlingen med det nevnte medikamentet.

Et videre aspekt av oppfinnelsen er en prosess for fremstilling av et middel av formel I, hvor den nevnte prosessen innbefatter å konjugere en vektor V til en forbindelse som kan registreres i en bildediagnostisk prosedyre eller en chelatdanner og hvis nødvendig metallerende chelatdannergrupper i det resulterende konjugatet med et metallion som kan registreres i en bildediagnostikksprosedyre.

Forbindelsene i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan fremstilles med alle de kjente metodene for kjemisk syntese, men spesielt nyttig er fastfasemetodologien til Merrifield hvor det brukes en automatisk peptidsyntesemaskin (J. Am. Chem. Soc, 85: 2149 (1964)). Vektorer som inneholder flere broer fremstilles med forskjellige cysteinbeskyttende grupper slik at det ikke eksisterer noen muligheter for å gjøre feil med den endelige foldede formen for vektoren. Peptidene og peptidchelatene kan renses med høyeffektiv væskekromatografi (HPLC) og karakteriseres med massespektometri og analytisk HPLC før de testes ved screening in vitro.

Den foreliggende oppfinnelsen illustreres videre nedenfor ved hjelp av ikke-begrensende eksempler.

Eksempel 1: Fremstilling av forbindelse Via.

1 a) Fremstilling av ClCH?COHN- Asp- CvsrMBzl)- Arg- Glv- Asp- Cvs( MBzn- Phe- Cvs-Gly- NH-( CH2CH2Q) 2CH?CH?NH2

Eksakt masse: 1388 Molekylformel C60H85C1N14O16S3

Peptidet ble fremstilt på en ABI433A automatisk peptidsyntesemaskin med O-Bis-(aminoetyl)etylenglykoltritylresin som utgangspunkt på 0,25 mmolskala med 1 mmol aminosyre- og kloreddiksyrepatroner. Aminosyrene og kloreddiksyren ble preaktivert med HBTU før bindingen. Samtidig fjerning av peptid- og sidegruppebeskyttende grupper (bortsett fra MBzl) fra resinet ble utført i TF A med innhold av TIS (5 %) og fenol (2,5 %) i to timer og tyve minutter.

Etter opparbeiding var utbyttet 250 mg råprodukt (analytisk HPLC: gradient, 5-50 % B i 20 min hvor A = H2O/0,l % TF A og B = CH3CN/0,1 % TFA, kolonne, VYDAC Cl 8 218TP54, deteksjon, UV 214 nm, produktretensjonstid 20,55 min). Ytterligere produktkarakterisering ble gjort med MALDI massespektrometri: ventet M+H ved 1389, funnet ved 1392). 1 b) Fremstilling av svklor- CH?CONH- Asp- Cvs( MBzl)- Arg- Glv- Asp- Cvs( MBzl)- Phe-Cvsl- Glv- NH-( CH2CH2Q) ?CH?CH?NH?

Eksakt masse 1352 Molekylformel C50H84N14O16S3

250mgClCH2CONH-Asp-Cys(MBzl)-Arg-Gly-Asp-Cys(MBzl)-Phe-Cys-Gly-NH-(CH2CH20)2CH2CH2NH2ble løst i vann/acetonitril. Blandingen ble justert til pH 8 med ammoniakkløsning og omrørt i 20 timer.

Etter lyofilisering var utbyttet 240 mg råpeptid (analytisk HPLC: gradient, 5-50 % B i 20 min hvor A = H2O/0,l % TF A og B = CH3CN/0,1 % TFA, kolonne, VYDAC Cl 8 218TP54, deteksjon, UV 214 nm, produktretensjonstid 19,45 min). Ytterligere produktkarakterisering ble gjort med MALDI massespektrometri: ventet M+H ved 1353, funnet ved 1358).

1 c) Fremstilling av fCvs2 61 svklor- CH, CONH- Asp- Cvs- Arg- Glv- Asp- Cvs- Phe- Cvsl-Glv- NH-( CH2CH2Q) 2CH?CH?NH2

Molekylvekt= 1143,29

Eksakt masse = 1142

Molekylformel = C44H66N14016S3

100 mg syklo[-CH2CONH-Asp-Cys(MBzl)-Arg-Gly-Asp-Cys(MBzl)-Phe-Cys]-Gly-NH-(CH2CH20)2CH2CH2NH2ble løst i TFA (10 ml) og så tilsatt til en løsning av anisol (200^1), DMSO (5 ml) og TFA (90 ml) som var varmet opp på forhånd. Blandingen ble omrørt ved 60 °C i 60 min og deretter ble TFA fjernet i vakuum og peptidet ble felt ut ved tilsetning av dietyleter.

Rensing av råmaterialet ved preparativ HPLC (Vydac C18 218TP1022-kolonne) ble utført med 0-30 % B, hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, i 40 min med strømningshastighet 9 ml/min. Etter lyofilisering var utbyttet 26 mg rent materiale (analytisk HPLC: gradient, 0-35 % B hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, kolonne, VYDAC Cl8 218TP54, deteksjon, UV 214 nm, produktretensjonstid 14,33 min). Ytterligere produktkarakterisering ble utført med MALDI massespektrometri: ventet M+H ved 1143, funnet ved 1148).

1 d) Koniiigering av fCvs 2- 6l svklof- CIkCONH- Asp- Cvs- Arg- Glv- Asp- Cvs- Phe- Cvsl-Gly- NH-( CH2CH2Q) 2CH?CH?NH2 med N3S- adipatchelat - forbindelse Via;

Molekylvekt 1546,75

Eksakt masse 15465

Molekylformel = C60H91N17O23S4

6,5 mg aktiv ester av N3S-adipatchelatdanner løst i acetonitril (5 ml) ble tilsatt til 5,1 mg [Cys<2>-<6>]syklo[-CH2CONH-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-Gly-NH-(CH2CH20)2CH2CH2NH2 løst i DPBS (5 ml, pH 7,4). Blandingen ble omrørt i 3 dager. Reaksjonsblandingen ble renset ved preparativ HPLC (Vydac C18 218TP1022-kolonne) med 0-30 % B, hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, i 40 min med strømningshastighet 9 ml/min. Etter lyofilisering var utbyttet 4,3 mg rent materiale (analytisk HPLC: gradient, 5-50 % B i 10 min hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, kolonne, Phenomenex Luna 3^ C18 (2) 50 x 4,6 mm, deteksjon, UV 214 nm, produktretensjonstid 6,55 min). Ytterligere produktkarakterisering ble utført med MALDI massespektrometri: ventet M+H ved 1150, funnet ved 1546).

1 e) Technetiummerking av forbindelse Via.

Et nitrogenfylt glass ble tilsatt forbindelse Via (50^g) løst i vann (50^1), 150^1 natriumglukonatløsning (25 mg i 6 ml H2O), 100^1 ammoniumacetat (pH 4,0, 50 mM), 1 ml Tc04-løsning (500 MBq) og 50^1 SnCl2-løsning (20 mg i 100 ml H20). Blandingen ble oppvarmet til 75 °C i 20 minutter før analyse ved ITLC og HPLC.

Eksempel 2; Koniiigering av fCvs<2><6>1 svklor- CH?CONH- Asp- Cvs- Arg- Glv- Asp- Cvs-Phe- Cvsl- Glv- NH-( CH2CH2Q) 2CH2CH2NH2 med Pn216- chelat ( forbindelse Va)

2 a) Fremstillin<g>av Pn216- chelat

Klor- nitroso- mellomstadium ( 3- klor- 3- metyl- 2- nitrosobiitan)

En blanding av 2-metylbut-2-en (18,5 ml) og isoamylnitrat (19,5 ml) ble omrørt, nedkjølt til

-10 °C og tilsatt konsentrert saltsyre (17,5 ml) forsiktig for å holde temperaturen under 0 °C. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved denne temperaturen i 30 minutter. Bunnfallet som dannet seg ble filtrert fra, vasket med 4 x 5 ml etanol (-20 °C) og tørket i vakuum til et hvitt, fast stoff som besto av 3-klor-3-metyl-2-nitrosobutan. 2 b) Pn216 - ( 3, 3Jl, ll- tetrametvl- 7- aminoetvl- 4, 7, 10- triazatridekan- 2, 12- diondioksim) En løsning av tris-(2-aminoetyl)amin i acetonitril (20 ml) ble tilsatt natriumbikarbonat (2,2 g, 26 mmol). En løsning av 3-klor-3-metyl-2-nitrosobutan (1,8 g, 13 mmol) i tørr acetonitril ble tilsatt sakte ved 0 °C. Reaksjonsblandingen ble satt til omrøring ved romtemperatur i 4 timer og så filtrert. Filtranten ble vasket med acetonitril og filtratet inndampet. Råproduktet ble løst 1 acetonitril og renset ved HPLC med 0,88 g (19 %) Pn216 som utbytte.

2 c) Fremstilling av Pn216- ravsyremellomstadium:

Ravsyreanhydrid (100)

Pn216(358)

Tetrafluortiofenol (182)

DCCI (206)

Pn216 (0,5 g, 1,4 mmol) ble løst i DMF (5 ml) og tilsatt ravsyreanhydrid (0,015 g, 1,5 mmol i DMF (10 ml) porsjonsvis med omrøring. Reaksjonsblandingen ble satt til omrøring i 16 timer for å oppnå fullstendig omdanning til ønsket produkt. HPLC-kromatografi ga et godt utbytte av den rene syren.

2 d) Fremstilling av tetrafluortiofenolesterderivatet av Pn216- ravsyre

Pn216-syre (10 mg, 0,022 mmol) i DMF (1,0 ml) ble tilsatt HATU (8,3 mg, 0,022 mmol) og DMM (0,007 ml, 0,066 mmol). Blandingen ble omrørt i 5 minutter og deretter tilsatt TFTP (0,022 mmol, 4 mg). Løsningen ble omrørt i 30 minutter og deretter ble reaksjonsblandingen fortynnet med 20 % acetonitril/H^O (3 ml) og produktet renset ved kromatografi i omvendt fase med 6 mg av det ønskede produktet som resultat etter frysetørking.

2 e) ; For peptidsyntese se eksempel 1 a) til c)

2 f) Konjiigering av peptid og Pn216- chelat

Molekylvekt= 1569,856

Eksakt masse = 1569,690

Molekylformel = C64H104N20O20S3

5 mg aktiv ester av Pn216-chelat, 2^1 N-metylmorfolin og 6 mg [Cys<2>"<6>] syklo[-CH2CONH-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-Gly-NH-(CH2CH20)2CH2CH2NH2ble løst i N,N-dimetylformamid (0,5 ml). Blandingen ble omrørt i 24 timer.

Reaksjonsblandingen ble renset ved preparativ HPLC (Phenomenex Luna 5^Cl8 (2) 250 x 21,20 mm-kolonne) med 5-50% B, hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, i 40 min med strømningshastighet 10 ml/min. Etter lyofilisering var utbyttet 3,5 mg rent materiale (analytisk HPLC: gradient, 5-50 % B i 10 min hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, kolonne, Phenomenex Luna 3^ C18 (2) 50 x 4,6 mm, deteksjon, UV 214 nm, produktretensjonstid 4,47 min). Ytterligere produktkarakterisering ble utført med MALDI massespektrometri: ventet M+H ved 1569,7, funnet ved 1569,7). 2 g) Forbindelsen kan merkes med technetium (" mTc) på en måte som tilsvarer den som er beskrevet i eksempel 1 e) ovenfor.

Eksempel 3: Fettsyremodifiserte vektorer med Pn216- chelat

3 a) Sammensetting av Dde- Lys- Cys( tBn)- Argæmc)- Gly- Asp( OtBii)- Cys( tBii)- Phe-Cys( Trt)- Gly-( Q- bis-( aminoetyl) etylenglykoltrityl)- resin ( i)

Det beskyttede peptidet ble satt sammen på en ABI433A automatisk peptidsyntesemaskin med 0-bis-(aminoetyl)etylenglykol-trityl-resin som utgangspunkt på 0,3 mmol-skala med 1 mmol aminosyrepatroner. Aminosyrene ble preaktivert med HBTU før binding.

3 b) Fremstilling av ClCH?CO- Lvs( heksanovl)- Cvs( tBii)- Arg- Glv- Asp- Cvs( tBii)- Phe-Cys( tBn)- Glv- NH-( CH, CH, 0), CH, CH, NH, qi)

0,1 mmol av resin (i) ble behandlet med en løsning av heksansyreanhydrid i DMF i 17 timer. Fjerning av Dde-beskyttelsen fra resinet ble gjort med 2 % hydrazinmonohydrat i DMF i fire ganger tre minutter. Resinet ble deretter behandlet med en løsning av kloredikksyreanhydrid i DMF i 60 minutter.

Samtidig fjerning av peptid- og sidegrenbeskyttende grupper (bortsett fra tBu) fra resinet ble gjort i TFA med innhold av TIS (5 %), H20 (5 %) og fenol (2,5 %) i to timer.

Etter opparbeiding var utbyttet 100 mg råpeptid (analytisk HPLC: gradient, 5-50 % B i 10 min hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, kolonne, Phenomenex Luna 3^ Cl8 (2) 50 x 4,6 mm, strømning, 2 ml/min, deteksjon, UV 214 nm, produktretensjonstid 7,81 min). Ytterligere produktkarakterisering ble gjort med MALDI massespektrometri: ventet M+H ved 1404,7, funnet ved 1404,6).

3 c) Fremstilling av syklofCH2CO- Lys( heksanoyl)- Cys( tBtt)- Arg- Gly- Asp- Cys( tBtt)- Phe-Cvsl- Glv- NH-( CH2CH20) ?CH?CH?NH?( iin

Molekylvekt= 1368,757

Eksakt masse = 1367,676

Molekylformel = C60H101N15O15S3

100 mg av forbindelse (ii) ble løst i vann/acetonitril. Blandingen ble justert til pH 8 med ammoniakkløsning og omrørt i 20 timer.

Etter opparbeiding var utbyttet 104 mg råpeptid (analytisk HPLC: gradient, 5-50 % B i 10 min hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, kolonne, Phenomenex Luna 3^ Cl8 (2) 50 x 4,6 mm, strømning, 2 ml/min, deteksjon, UV 214 nm, produktretensjonstid 7,67 min). Ytterligere produktkarakterisering ble gjort med MALDI massespektrometri: ventet M+H ved 1368,7, funnet ved 1368,7). 3 d) Fremstilling av fCvs2 61 svklorCH2CO- Lvs( heksanovl)- Cvs- Arg- Glv- Asp- Cvs- Phe-Cvsl- Glv- NH-( CH2CH20) ?CH?CH?NH?( iv) 50 mg av forbindelse (iii) ble behandlet med en løsning av anisol (100^1), DMSO (1 ml) og TFA (50 ml) ved romtemperatur i 30 minutter. Deretter ble TFA fjernet i vakuum og peptidet utfelt ved tilsetning av dietyleter.

Råmaterialet ble renset ved preparativ HPLC (Phenomenex Luna 5^Cl 8 (2) 250 x 21,20 mm-kolonne) med 5-50% B, hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, i 40 min med strømningshastighet 10 ml/min. Etter lyofilisering var utbyttet 9 mg rent materiale (analytisk HPLC: gradient, 5-50 % B i 10 min hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, kolonne, Phenomenex Luna 3^Cl8 (2) 50 x 4,6 mm, strømning, 2 ml/min, deteksjon, UV 214 nm, produktretensjonstid 5,38 min). Ytterligere produktkarakterisering ble utført med MALDI massespektrometri: ventet M+H ved 1254,5, funnet ved 1254,6).

3 e) Fremstilling av fCvs2 61 syklo rCHiCO- Lvsfheksanovn- Cvs- Arg- Glv- Asp- Cvs- Phe-Cvsl- Glv- NH-( CH2CH2Q) ?CH?CH?NH- Pn216( v)

Molekylvekt= 1681,088

Eksakt masse = 1679,831

Molekylformel = C72H121N21019S3

9 mg av forbindelse (iv), 11 mg Pn216-chelat aktiv ester og 8^1 N-metylmorfolin ble løst i DMF (1 ml). Blandingen ble omrørt i 3,5 timer.

Reaksjonsblandingen ble renset ved preparativ HPLC (Phenomenex Luna 5^Cl8 (2) 250 x 21,20 mm-kolonne) med 5-50% B, hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, i 40 min med strømningshastighet 10 ml/min. Etter lyofilisering var utbyttet 5,2 mg rent materiale (analytisk HPLC: gradient, 5-50 % B i 10 min hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, kolonne, Phenomenex Luna 3^Cl8 (2) 50 x 4,6 mm, strømning, 2 ml/min, deteksjon, UV 214 nm, produktretensjonstid 5,83 min). Ytterligere produktkarakterisering ble utført med MALDI massespektrometri: ventet M+H ved 1680,8, funnet ved 1680,7).

Eksempel 4; PEG- modifiserte vektorer med Pn- 216- chelat

4 a) Fremstilling av ClCH, CO- LvsffEG2000)- Cvs( tBn)- Arg- Glv- Asp- Cvs( tBn)- Phe-Cvs- Glv- NH-( CH2CH2Q) ?CH?CH?NH2( vi)

0,1 mmol av resin (i) ble behandlet med CH20-PEG-NHCOCH2CH2COOH (preaktivert med HATU) i 16 timer. Dde-beskyttelsen ble fjernet fra resinet med 2 % hydrazinmonohydrat i DMF i fire ganger tre minutter. Resinet ble så behandlet med en løsning av kloreddiksyreanhydrid i DMF i 60 minutter.

Peptid- og sidegruppebeskyttelsen (bortsett fra tBu) ble fjernet fra resinet i TFA med innhold av TIS (5 %), H20 (5 %) og fenol (2,5 %) i to timer.

Etter opparbeiding var utbyttet 110 mg råpeptid (analytisk HPLC: gradient, 5-50 % B i 10 min hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, kolonne, Phenomenex Luna 3^ C18 (2) 50 x 4,6 mm, strømning, 2 ml/min, deteksjon, UV 214 nm, produktretensjonstid flere topper fra 5 til 9 min). Ytterligere produktkarakterisering ble utført med MALDI massespektrometri: ventet M+H ved 3313, funnet ved 2785).

4 b) Fremstilling av svklor- CH2CO- Lvs( PEG2000)- Cvs( tBn)- Arg- Glv- Asp- Cvs( tBii)-Phe- Cvsl- Glv- NH-( CH?CH2Q) 2CH?CH?NH2( vii)

Molekylvekt = 3276,032

Eksakt masse = 3275,778

Molekylformel = C145H270N16O59S3

110 mg av forbindelse (vi) ble løst i vann/acetonitril. Blandingen ble justert til pH 8 med ammoniakkløsning og omrørt i 20 timer.

Etter opparbeiding var utbyttet 90 mg råpeptid (analytisk HPLC: gradient, 5-50 % B i 10 min hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, kolonne, Phenomenex Luna 3^Cl8 (2) 50 x 4,6 mm, strømning, 2 ml/min, deteksjon, UV 214 nm, produktretensjonstid flere topper fra 5 til 9 min). Ytterligere produktkarakterisering ble utført med MALDI massespektrometri: ventet M+H ved 3277, funnet ved 2627). 4 c) Fremstilling av fcvs2 61 syklo- rCH2CO- Lvs( PEG2000)- Cvs- Arg- Glv- Asp- Cvs- Phe-Cvsl- Glv- NH-( CH2CH20) 2CH2CH2NH2( viii) 60 mg av forbindelse (vii) ble behandlet med en løsning av anisol (200^1), DMSO (2 ml) og TFA (100 ml) ved romtemperatur i 30 minutter. Deretter ble TFA fjernet i vakuum og peptidet utfelt ved tilsetning av dietyleter.

Råmaterialet ble renset ved preparativ HPLC (Phenomenex Luna 5^Cl 8 (2) 250 x 21,20 mm-kolonne) med 5-50% B, hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, i 40 min med strømningshastighet 10 ml/min. Etter lyofilisering var utbyttet 30 mg rent materiale (analytisk HPLC: gradient, 5-50 % B i 10 min hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, kolonne, Phenomenex Luna 3^Cl8 (2) 50 x 4,6 mm, strømning, 2 ml/min, deteksjon, UV 214 nm, produktretensjonstid, bred topp ved 5 min).

4 d) Konjugasjon av fcvs2 61 syklo- rCH2CO- Lvs( PEG2000)- Cvs- Arg- Glv- Asp- Cvs- Phe-Cvsl- Glv- NH-( CH, CH, Q), CH, CH, NH, med Pn216- chelat ( ix)

Molekylvekt = 3590,363

Eksakt masse = 3587,933

Molekylformel = C167H290N22O63S3

20 mg av forbindelse (viii), 11 mg Pn216-chelat aktiv ester og 8^1NMM ble løst i DMF (1 ml). Blandingen ble omrørt i 24 timer.

Reaksjonsblandingen ble renset ved preparativ HPLC (Phenomenex Luna 5^Cl8 (2) 250 x 21,20 mm-kolonne) med 5-50% B, hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, i 40 min med strømningshastighet 10 ml/min. Etter lyofilisering var utbyttet 10,7 mg rent materiale (analytisk HPLC: gradient, 5-50 % B i 10 min hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, kolonne, Phenomenex Luna 3^Cl8 (2) 50 x 4,6 mm, strømning, 2 ml/min, deteksjon, UV 214 nm, produktretensjonstid bred topp fra 5 til 8 min). Ytterligere karakterisering av produktet ble gjort med massespektrometri: ventet M+H ved 3589, funnet ved 3270).

Eksempel 5: Vektorer med Pn44- chelat

5 a) Fremstilling av l, l, l,- tri( fenylsnlfonyloksymetyl) etan

1,1,1-tristrihydroksymetyl (120g, 1,0 mol) ble løst i diklormetan (1000 ml) og pyridin (237 g, 1 mol) og behandlet porsjonsvis med fenylsulfonylklorid (528 g, 3 mol) ved -5 °C på is/metanol-bad med slik hastighet at temperaturen ikke steg over 10 °C. Reaksjonsblandingen ble så satt til side i romtemperatur over natten. Deretter ble den ristet med 5N saltsyre og den organiske fasen separert fra. Vannfasen ble reekstrahert med diklormetan og de organiske ekstraktene ble slått sammen. Diklormetanløsningen ble tørket over natriumsulfat og konsentrert i vakuum til l,l,l-tri(fenylsulfonyloksymetyl)etan (540 g, 1 mol) i form av en gummiaktig masse.

5 b) Fremstilling av U, l- tri( azidometyl) etan

l,l,l-tri(fenylsulfonyloksymetyl)etan (25 g, 70 mmol) i dimetylformamid (300 ml) ble behandlet med natriumazid (41 g, 630 mmol, 9 ekv) i en 500 ml RB-kolbe og blandingen ble oppvarmet til 120 °C med omrøring i 7 timer. Reaksjonsblandingen ble så hensatt for å avkjøles til romtemperatur og deretter tilsatt 50 % mettet saltvann (250 ml) og tørket over Na2SC«4 og konsentrert til en gul, seig væske av l,l,l-tri(azidometyi)etan (5,51 g, 28,2 mmol, 40 % utbytte).

NMR H<1>(CDC13), 1,0 (3H, s, CH3), 3,3 (6H, s, CH3)

5 c) Fremstilling av l, l, l- tri( aminometyl) etan

l,l,l-tri(azidometyl)etan (5,51 g, 28,2 mmol) i etanol (140 ml) ble behandlet med 10 % palladium på trekull (2 g) og hydrogenert ved atmosfæretrykk i 15 timer under hydrogenstrøm for å fjerne det frigjorte nitrogenet. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom en Celite-pad for å fjerne katalysatoren og konsentrert i vakuum til en gul væske av 1,1,1-tri(aminometyl)etan (2,53 g, 21,6 mmol, 76 % utbytte).

NMR H<1>(CDCI3), 0,8 (3H, s, CH3), 1,18 (6H, s, 3xNH2), 2,6 (6H, s, 3xCH3).

NMR C<13>(CDC13), 20,1 CH3, 31,7 C, 48,8 CH2.

5 d) Fremstilling av Pn44

En suspensjon av 3-klor-3-metyl-2-nitrosobutan (23,14 g, 1706 mmol, 2 ekv) i tørr metanol (50 ml) under nitrogen ved 0 °C ble sakte tilsatt en løsning av l,l,l-tri(aminometyl)etan (10 g, 85,3 mmol) i tørr metanol (10 ml). Blandingen ble omrørt ved 0 °C i 40 minutter, oppvarmet til romtemperatur og så oppvarmet ved 60 °C i 3 timer. Reaksjonsblandingen ble så hensatt for å avkjøles til romtemperatur og ble omrørt i 5 dager. Til slutt ble blandingen oppvarmet til reflukstemperatur i 3 timer og deretter ble løsningsmidlet fjernet i vakuum. Inndampingsresten ble løst i 2M HC1 (150 ml) og ekstrahert med eter (3x100 ml). Vannskiktet ble så justert til pH 10 med 6M NaOH og ekstrahert med diklormetan (3x100 ml). De kombinerte organiske skiktene ble hensatt i romtemperatur og det ble felt ut et hvitt, fast stoff. Dette ble filtrert fra og viste seg etter NMR å være trippeladdisjonsforbindelsen. Filtratet ble konsentrert til ~ 1/3 og hensatt i kjøleskap. Et annet hvitt fast stoff ble felt ut fra løsningen. Dette ble isolert ved filtrering og viste seg å være Pn44 etter 'H-NMR. Filtratet ble igjen konsentrert og en ny porsjon Pn44 krystalliserte fra løsningen. (Totalt utbytte 6,981 g, 26 %).

NMR H<1>(CDC13), 0,9 (3H, s, CH3), 1,25 (6H, d, 4xCH3), 1,8 (6H, s, 2xCH3), 2,4 (2H, d, 2xCH), 2,54 (2H, d, 2xCH), 2,95 (2H, s, CH2), 4,95 (6H, s, OH).

MS C15H33N502 M+H=316 funnet 316

5 e) Fremstilling av Pn44- ravsyre

Som for eksempel 2c.

5 f) Fremstilling av tetrafliiortiofenolesterderivat av Pn44- ravsyre Som for eksempel 2d. 5 g) Fremstilling av fCvs2 61 svklorCH?CONH- Asp- Cvs- Arg- Glv- Asp- Cvs- Phe- Cvsl- Glv-NH( CH2CH2Q) 2CH2CH?NH2

Se eksempel la-lc.

5 h) Fremstilling av fCvs2 61 svklorCH?CONH- Asp- Cvs- Arg- Glv- Asp- Cvs- Phe- Cvsl- Glv-NH( CH2CH2Q) 2CH2CH?NH2- Pn44

Molekylvekt= 1540,815

Eksakt masse = 1539,663

Molekylformel = C63H101N19O20S3

7 mg Pn44-chelat aktiv ester, 5^1NMM og 10 mg [Cys<2>"<6>] syklo[CH2CONH-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-Gly-NH(CH2CH20)2CH2CH2NH2ble løst i NMP (1 ml). Blandingen ble omrørt i 3 timer.

Reaksjonsblandingen ble renset ved preparativ HPLC (Phenomenex Luna 5^Cl8 (2) 250 x 21,20 mm-kolonne) med 5-50% B, hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, i 40 min med strømningshastighet 10 ml/min. Etter lyofilisering var utbyttet 9,8 mg rent materiale (analytisk HPLC: gradient, 5-50 % B i 10 min hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, kolonne, Phenomenex Luna 3^Cl8 (2) 50 x 4,6 mm, strømning, 2 ml/min, deteksjon, UV 214 nm, produktretensjonstid 4,38 min). Ytterligere karakterisering av produktet ble gjort med massespektrometri: ventet M+H ved 1540,7, funnet ved 1540,6).

Eksempel 6 ; Fremstilling av bis- fCvs2 6U svklof- CH?CONH- Asp- Cvs2- Arg- Glv- Asp-Cvs6- Phe- Cvsl- Ahx- Lvs( svklor- CH?CONH- Asp- Cvs2- Arg- Glv- Asp- Cvs6- Plie- Cvsl- Alix)-NH( CH2CH2Q) 2CH2CH?NH2- Pn216

Dimerpeptidet ble satt sammen på en ABI433A automatisk peptidsyntesemaskin med O-bis(aminoetyl)etylenglykol-tritylresin på 0,1 mmolskalamed 1 mmol aminosyrepatroner. Aminosyrene ble preaktivert med HBTU før binding i rekkefølgen Pmoc-Lys(Fmoc)-OH, Pmoc-Ahx-OH (Ahx = aminoheksansyre), Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(tBu)-OH, Fmoc-Asp(0-tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Cys(tBu)-OH, Fmoc-Asp(0-tBu)-OH, kloreddiksyreanhydrid. Det halvbeskyttede peptidet ble så spaltet av fra det faste underlaget i TFA med innhold av 5 % TIS, 5 % fenol og 5 % vann. Klorpeptidråproduktet ble så gjort syklisk i 20 % acetonitril/vann (pH 8) og ga det monosykliske t-butyl-beskyttede mellomproduktet (se nedenfor) etter HPLC-rensing på Vydac C18-kolonne.

Det rene mellomproduktet ble tilsatt en løsning av 10 % DMSO/TFA som inneholdt 0,1 ml anisol. Peptidblandingen ble omrørt i 1 time og overskudd av TFA dampet av før utfelling av produktet (se nedenfor) ved tilsetning av dietyleter.

Dette produktet (5 mg) ble så løst i 1 ml DMF som var tilsatt 2 % NMM og 5 mg av den aktive esteren av Pn216 fra eksempel 1. Konjugeringsreaksjonen ble etterfulgt av HPLC og funnet å være fullstendig etter 16 timer. Peptidløsningen ble så fortynnet med vann til totalt 8 ml og påfylt en Phenomenex Luna 5^C18 (2) 250 x 21,20 mm-kolonne) med 5-50% B-gradient, hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, i 30 min med strømningshastighet 5 ml/min. Etter lyofilisering var utbyttet 2 mg av det ønskede sluttproduktet (analytisk HPLC: gradient, 5-50 % B i 10 min hvor A = H2O/0,l % TFA og B = CH3CN/0,1 % TFA, kolonne, Phenomenex Luna 3^Cl8 (2) 50 x 4,6 mm, strømning, 2 ml/min, deteksjon, UV 214 nm, produktretensjonstid 9,8 min). Ytterligere karakterisering av produktet ble gjort med ES-MS: ventet M+H ved 1805, funnet ved 1805).

Claims (20)

1. Patentkrav 1. En forbindelse av generell formel (I) som har affinitet for integrinreseptorer,

   hvor

   G er glycin og

   D er asparaginsyre og

   Ri er -(CH2)n- eller -(CH2)n-C6H4- og

   n er et positivt heltall 1 til 10 og

   h er et positivt heltall 1 eller 2 og Xi er en binding eller 1 til 5 aminosyrer, hvor hver aminosyre uavhengig av hverandre eventuelt er derivatisert med en funksjonell sidegruppe egnet for å modifisere farmakokinetikken eller halveringstiden i blodet for de nevnte midlene, og hvor den nevnte sidegruppen eventuelt uavhengig binder en reportergruppe (R) egne for avbildning in vivo ved hjelp av i) en linker (L) eller ii) en chelatdanner eller iii) en linker (L) bundet til en chelatdanner, og

   X2og X4uavhengig av hverandre er en aminosyre som kan danne en disulfidbinding, X3er arginin, N-metylarginin eller en argininetterlikning,

   X5er en hydrofob aminosyre eller derivat av en hydrofob aminosyre, og X6er en tiolholdig aminosyre, og

   k er et positivt heltall 1 til 10, og

   X7 er en linker (L) eller 1 til 10 aminosyrer, eventuelt som del av en linker (L), og hvor hver aminosyre uavhengig av hverandre eventuelt er derivatisert med en funksjonell sidegruppe for å modifisere farmakokinetikken eller halveringstiden i blodet for de nevnte midlene, og hvor hver aminosyre eventuelt binder en reporter (R) som egner seg for avbildning in vivo ved hjelp av i) en linker (L) eller ii) en chelatdanner eller iii) en linker (L) festet til en chelatdanner, eller

   X7 mangler, og

   Xg er en reportergruppe (R) eller er -NH2 eller mangler, og

   farmasøytisk aksepterbare salter av disse.
2. 2. En forbindelse i henhold til krav 1 hvor Ri er -(CH2)-.
3. 3. En forbindelse i henhold til ett eller flere av de foregående kravene hvor X]er 1 eller 2 aminosyrer.
4. 4. En forbindelse i henhold til ett eller flere av krav 1 til 3 hvor Xi er asparaginsyre, tyrosin, tyrosin-asparaginsyre, lysin, glutaminsyre, acetyllysin, asparagin, serin, treonin eller glutamin eller derivater av disse.
5. 5. En forbindelse i henhold til ett eller flere av de foregående kravene hvor X2 og X4uavhengig av hverandre er cystein eller homocystein.
6. 6. En forbindelse i henhold til ett eller flere av de foregående kravene hvor X3 er arginin eller N-metylarginin.
7. 7. En forbindelse i henhold til ett eller flere av de foregående kravene hvor X5er tyrosin, fenylalanin, 3-jodtyrosin eller naftylalanin.
8. 8. En forbindelse i henhold til ett eller flere av de foregående kravene hvor X6er cystein eller homocystein.
9. 9. En forbindelse i henhold til ett eller flere av de foregående kravene hvor X7er én aminosyre.
10. 10. En forbindelse i henhold til ett eller flere av de foregående kravene hvor X7er gly ein eller er fraværende.
11. 11. En forbindelse i henhold til ett eller flere av de foregående kravene hvor X7inkluderer en linker (L) som eventuelt inneholder en eller flere etylenglykolenheter.
12. 12. En forbindelse i henhold til ett eller flere av de foregående kravene hvor k er et positivt heltall fira 1 til 4.
13. 13. En forbindelse i henhold til ett eller flere av de foregående kravene som innbefatter en eller flere av chelatdannerne a-d
14. 14. En forbindelse i henhold til ett eller flere av de foregående kravene hvor chelatdanneren kan binde en radionuklide. 15. En forbindelse i henhold til krav 14 som kan binde technetium, en radioisotop av jod eller Cu eller en<I8>F-isotop. 16. En forbindelse i henhold til krav 1 og krav 13 definert ved de følgende formlene: Forbindelse V
15. Forbindelse VIII
16. Forbindelse IX
17. 17. En forbindelse av formel I i henhold til krav 1 som representerer en vektor (V) hvor Xi er en binding eller 1 til 5 aminosyrer hvor hver aminosyre uavhengig av hverandre eventuelt kan derivatiseres med en funksjonell sidegruppe som egner seg for å modifisere farmakokinetikken eller halveringstiden i blodet for de nevnte midlene, og X2-4er som definert i krav 1, og X7er 1 til 10 aminosyrer eller er fraværende, og X8er fraværende.
18. 18. En farmasøytisk sammensetning som innbefatter en effektiv mengde av en forbindelse av generell formel (I) eller et salt av denne, sammen med et eller flere farmasøytisk aksepterbare hjelpestoffer, bærere eller fortynningsmidler til bruk for å forbedre bildekontrast ved avbildning in vivo eller for behandling av en sykdom.
19. 19. Bruk av en forbindelse i henhold til ett eller flere av kravene 1 til 17 til fremstilling av et kontrastmiddel for bruk i en diagnosemetode som innebærer å gi det nevnte kontrastmidlet til et levende subjekt og danne et bilde av minst en del av det nevnte subjektet.
20. 20. Bruk av en forbindelse i henhold til ett eller flere av kravene 1 til 17 til å fremstille et medikament for terapeutisk eller profylaktisk behandling av kreft eller en beslektet sykdom hos et menneskelig eller ikke-menneskelig subjekt.