NO329321B1 - Anvendelse av gaba-analoger slik som gabapentin i fremstillingen av et medikament for behandling av betennelsessykdommer - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Denne oppfinnelse vedrører anvendelse av gamma-aminosmørsyre (GABA) for fremstilling av farmasøytiske preparater for å behandle betennelsessykdommer.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Betennelsessykdommer karakteriseres ved en kompleks serie med histolog-iske endringer, som inkluderer utvidelse av arterioler, kapillærer og venyler, med øket permeabilitet og blodgjennomstrømning, utstrømning av væsker, deriblant plasmaproteiner og bevegelse av hvite blodlegemer inn i betennelsesfokus. Mange former av betennelse er lokaliserte beskyttelsesresponser fremkalt av skade eller vevsødeleggelse, som fører til å ødelegge, fortynne eller avgrense både skademid-delet og det skadede vev. Betennelsesresponsen er også selv ansvarlig for pato-logisk skade av vev. Leddgikt er en spesielt destruktiv betennelsessykdom, som vanligvis affiserer eldre, og som karakteriseres av at betennelseslesjonene i hoved-sak er begrenset til spesielle ledd. Sykdommen karakteriseres av smerte, varme, rødhet, oppsvulming, samt vevsødeleggelse. Kronisk leddgikt er en kronisk system-sykdom i leddene, karakterisert ved betennelsesendringer i synovialvev og i ledd-strukturer og ved atrofi og bensvinn. Denne form av betennelsessykdom vil vanligvis progrediere til deformiteter og leddstivhet.

En rekke betennelsesdempende behandlinger er kjent og brukes ofte. De vanligste er ikke-steroid betennelsesdempende midler slik som naproksen, diflunisal, mefenamsyre, samt ketorolaktrometamin. Disse midler blir vanligvis benyttet for å behandle korttids mild betennelse og smerte. Mer alvorlige betennelsessykdommer, slik som leddgikt, blir behandlet med steroidhormoner og glukokortikoider, for eksempel prednisolon, hydrokortisonacetat, samt betametasonnatriumfosfat.

Siden mange av de betennelsesdempende midler bare virker over kort tid, og ofte gir alvorlige bivirkninger er det fortsatt behov for nye behandlinger. Vi har nå oppdaget at forbindelser som er analoger av gamma-aminosmørsyre (GABA) er hensiktsmessige for å behandle betennelsessykdommer. Alt som kreves for å hindre eller behandle betennelsessykdommen ifølge denne oppfinnelse er å tilføre en betennelsesdempende mengde av en GABA-analog til en pasient som har behov for behandling.

En rekke GABA-analoger er kjent. Gabapentin, som er en syklisk GABA-analog, er kommersielt tilgjengelig og i utstrakt bruk for behandling av epilepsi og neuro-patisk smerte. Slike forbindelser er beskrevet i US-patent 4.024.175. En annen serie med GABA-analoger er beskrevet i US-patent 5.563.175.

JP60036413A omtaler bruk av gamma-aminobutansyre (GABA) og dens salter for behandling av betennelsessykdommer.

Sammenfatning av oppfinnelsen

Denne oppfinnelse frembringer anvendelse av en effektiv mengde av en GABA-analog for fremstilling av farmasøytiske preparater for å behandle og forebygge betennelsessykdommer som omfatter tilførsel til en pasient som lider av en slik sykdom eller som er i faresonen for å utvikle slik sykdom og har behov for behandling. En foretrukket utførelsesform benytter en syklisk aminosyre-forbindelse med formel I

hvori Ri er hydrogen og n er et heltall fra 4 til 6, eller med formel II

hvori Ri er et lineært eller forgrenet alkyl med fra 1 til 6 karbonatomer, fenyl eller sykloalkyl med fra 3 til 6 karbonatomer;

R2 er hydrogen eller metyl; og

R3 er hydrogen, metyl eller karboksyl, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å forhindre og behandle betennelsessykdommer.

En spesielt foretrukket utførelsesform benytter en forbindelse med formel I der Ri er hydrogen og n er 5, denne forbindelse er 1-(aminometyl)-sykloheksan-eddiksyre, som er kjent generisk som gabapentin. Andre foretrukne GABA-analoger har formel I der den sykliske ring er substituert, for eksempel med alkyl slik som metyl eller etyl. Typiske slike forbindelser inkluderer (1-aminometyl-3-metylsykloheksyl) eddiksyre, (1-aminometyl-3-metylsyklopentyl) eddiksyre og (1-aminometyl-3,4-dimetylsyklopentyl) eddiksyre.

Diastereomerer og enantiomerer av forbindelsene med formel II kan bli benyttet i oppfinnelsen.

En spesielt foretrukket anvendelse ifølge oppfinnelsen benytter en oppfinnelse der R2 og R3 begge er hydrogen, og Ri er -(CH2)o-2- i C4H9 som en (R), (S), eller (R,S) isomer.

En mer foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen benytter 3-aminometyl-5-metylheksansyre, og spesielt (S)-3-(aminometyl)-5-metylheksansyre, nå generisk kjent som pregabalin. Pregabalin er også kjent som "CI-1008" og "S-(+)-3-IBG". En annen foretrukket forbindelse med formel II er 3-(1-aminoetyl)-5-metylhepansyre.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Som beskrevet ovenfor, benytter denne oppfinnelses fremgangsmåte enhver GABA-analog. En GABA-analog er enhver forbindelse som er avledet fra eller basert på gamma-aminosmørsyre, og fremkaller en betennelsesdempende effekt i overens-stemmelse med denne oppfinnelse. Forbindelsene er lett tilgjengelige, enten kommersielt eller ved syntetiske metoder som er velkjent for de som er øvet i organisk kjemi. De foretrukne GABA-analoger som skal benyttes i denne oppfinnelse er syklisk aminosyre med formel I. Disse er beskrevet i US-patent 4.024.175. En annen foretrukket utførelse benytter GABA-analoger med formel II, og disse er beskrevet i US-patent 5.563.175.

Alt som kreves for å praktisere den betennelsesdempende anvendelse ifølge denne oppfinnelse er å tilføre en GABA-analog med formel I eller II i en mengde som er effektiv i å forebygge eller behandle betennelsestilstanden. Slike betennelsesdempende mengder vil vanligvis være fra omtrent 1 til omtrent 300 mg/kg av pasientens kroppsvekt. Typiske doser vil være fra omtrent 10 til omtrent 5000 mg/dag for en voksen pasient med normal vekt.

Farmasøytiske blandinger med en GABA-analog med formel I eller II eller dets salter blir produsert ved å formulere den aktive forbindelse i en doseenhetsform med en farmasøytisk bærer. Noen eksempler på doseenhetsformer er tabletter, kapsler, piller, pulvere, vandige eller ikke-vandige orale løsninger og suspensjoner, og parenterale løsninger pakket i beholdere som inneholder én eller et større antall doseenheter og kan bli oppdelt i individuelle doser. Noen eksempler på passende farmasøytiske bærere, deriblant farmasøytiske fortynnere, er gelatinkapsler, sukkere slik som laktose og sukrose, stivelser slik som potet- og maisstivelse, cellulosederivater slik som natriumkarboksymetylcellulose, etylcellulose, metylcellulose og celluloseacetatftalat, gelatin, talk, stearinsyre, magnesiumstearat, vegetabilske oljer slik som peanøttolje, bomullsfrøolje, sesamolje, olivenolje, maisolje, samt olje fra teobrom, propylenglykol, glyserin, sorbitol, polyetylenglykol, vann, agar, alginsyre, isotont saltvann og fosfat-bufferløsninger samt andre kompatible forbindelser som vanligvis benyttes i farmasøytiske formuleringer. Blandingene som skal benyttes i oppfinnelsen kan også inneholde andre komponenter slik som fargemidler, smakstilsetninger og/eller konserveringsmidler. Disse materialene blir vanligvis, dersom de er til stede, benyttet i relativt små mengder. Blandingene kan, dersom det ønskes, også inneholde andre terapeutiske midler som vanligvis benyttes for å behandle betennelse, for eksempel aspirin, naprosyn og lignende anit-inflammatoriske midler.

Prosentandelen av de aktive ingredienser i de beskrevne blandinger kan vari-eres innenfor vide grenser, men for praktiske hensyn er det fordelaktig å ha dem tilstede i en konsentrasjon på minst 10% i en fast blanding og minst 2% i en primært flytende blanding. De mest hensiktsmessige blandingene er de der en mye høyere del av den aktive ingrediens er til stede, for eksempel opptil omtrent 95%.

Tilførselsveier for GABA-analogen eller dens salter er orale eller parenterale. For eksempel er en hensiktsmessig intravenøs dose mellom 5 og 50 mg, og en hensiktsmessig oral dose er mellom 20 og 800 mg. Dosenivået er innenfor det område som benyttes for behandling av betennelsessykdommer slik som leddgikt, eller slik det ville blitt bestemt av pasientens behov som beskrevet av legen.

En enhetsdoseform av GABA-analogen som skal benyttes i denne oppfinnelse kan også inneholde andre forbindelser som er hensiktsmessige i behandling av betennelsessykdommer.

Fordelene ved å bruke forbindelsene fra formel I og II, spesielt gabapentin og pregabalin i den foreliggende oppfinnelse inkluderer at disse forbindelser er relativt ikke-toksiske, de er lette å fremstille, det faktum at forbindelsene blir godt tolerert, og at de lett kan tilføres IV og per oralt. Videre er medikamentene ikke utsatt for meta-bolisme i kroppen.

Pasientene som benyttes er pattedyr, deriblant mennesker.

Evnen som GABA-analoger har til å behandle betennelsessykdommer ifølge denne oppfinnelse har blitt etablert i en rekke dyremodeller for betennelse og leddgikt.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 viser effekter av pregabalin (beskrevet som S-(+)-3-IBG), den tilsvaren-de R-optiske enantiomer R-(-)-3-isobutyl GABA (beskrevet som R-(-)-3-IBG) og en aCSF (kunstig cerebrospinalvæske) på varmeindusert PWL (latenstid før tilbaketrekking av pote), videre på omkrets av kneledd, og på smertegrad hos dyr før utvikling av akutt leddgikt. Fig. 2 viser effekten av 0,9 og 10 mg/ml doser med pregabalin, R-(-)-3-IBG og aCSF på varmeindusert latenstid for tilbaketrekking av pote tilført etter utvikling av akutt leddbetennelse. Fig. 3 viser effektene av 0,9 og 10 mg/ml pregabalin, R-(-)-3-IBG og aCSF på opphovning av ledd, tilført etter utvikling av akutt leddbetennelse. Fig. 4 viser effekten av 0,9 og 10 mg/ml pregabalin, R-(-)-3-IBG og aCSF på smerterelatert adferd, ved tilføring etter utvikling av akutt leddbetennelse.

De følgende detaljerte eksempler illustrerer den spesifikke betennelsesdempende aktivitet til GABA-analogen.

Eksempel 1

Gabapentin ble evaluert i en streptokokk cellevegg (SCW)-indusert pote-ødem-modell. Lewis hunnrotter ble sensitisert mot SCW (6 ^g/rotte) i det høyre tibi-otalus-ledd på dag 0. Bærer (0,5% hydroksypropylmetylcellulose/0,2% Tween 80) eller medikament (100 mg/kg, BID) ble tilført oralt (10 mg/kg) fra 1 time før injisering av den forsinkede type hypersensitivitetsreaksjonen fremkalt av systemisk SCW (100 ^g/rotte) på dag 21, og gitt til og med dag 24. Vurdering av ødem i baklabb ble bestemt på dag 22 til 25 ved kvikksølvpletysmometri.

Gabapentin ble funnet å signifikant hemme opphovning på dagene 22, 23, 24 og 25 (henholdsvis 58%, 77%, 83% og 81%).

Eksempel 2

Pregabalin ble evaluert i en lignende analyse og viste dramatisk betennelsesdempende aktivitet. Testen er en analyse av leddbetennelse fremkalt av en streptokokk cellevegg (SCW)-indusert reaktivering. Lewis hunnrotter ble injisert i leddet med 10 ^l av 100 p fraksjon peptidoglykan-polysakkarid (PG-PS) suspendert i fosfat-bufret saltvann (PBS). Leddene på andre side av kroppen ble injisert med PBS som kontroll. Systemisk tilførsel av 100 ^g PG-PS ble gitt via halevenen 21 dager etter den initielle inokkulering. Dyrene fikk doser per oralt tre ganger om dagen med pregabalin (3,10 og 30 mg/kg) på en 12-timers syklus i 72 timer. Den første dose ble gitt 1 time før den systemiske tilførselen.

Systemisk tilførsel på dag 21 av de tidligere sensitiserte dyr med SCW førte til akutt opphovning i den sensitiserte ankelen. Ankelvolumene økte med omtrent 0,5 ml i løpet av 72 timer. Pregabalin tilført i 10 og 30 mg/kg svekket på en doseav-hengig måte økning i ødem med opptil 40% i løpet av den 72 timer lange observa-sjonsperiode. Resultatene er presentert i tabell 1.

Den beskrevne undersøkelse etablerer at GABA-analoger slik som gabapentin og pregabalin er effektive betennelsesreduserende midler, og fører til reduksjon i opphovning av typen som man møter hos pasienter som lider av leddgikt.

Eksempel 3

Pregabalin (som er en S-isomer, og også er kjent som CI-1008, og som S-(+)-3-IBG) ble også evaluert i den følgende betennelsesdempende test, sammen med den korresponderende R-isomer, (R)-3-(aminometyl)-5-metyl-heksansyre (også beskrevet som R-(-)-3-IBG). Akutt eksperimentell leddgikt ble indusert i rotter ved å indusere kaolin og karragenan i kneleddet. Det betennelsesproduserende middel, karragenan, fører til utstrømning av blodplasma og ødem etter at neuropeptider og andre inflammatoriske mediatorer ble frigjort i leddhulen. Samtidig med skaden til leddvevet oppstår både perifer og sentral sensitisering, som manifesteres hos den våkne rotte som hyperalgesi, noe som lett kan måles ved å måle reduksjonen i latenstid for tilbaketrekning av pote overfor en varmestrålingskilde. Både pregabalin og dets R-stereoisomer (R-(-)-3-IBG) ble tilført før betennelse ble indusert og etter at betennelsen hadde utviklet seg. 36 Sprague-Dawley hannrotter (235-380 g) ble anestisert med natriumpentobarbital (Nembutal; 50 mg/kg"<1> i.p.). En mikrodialysefiber (200 ^m ytre diameter, 45.000 MW Cut-off, Hospal AN69) ble belagt med epoksyresin, med unntak av en 2 mm lang del. Et lite midtlinjesnitt ble gjort i ryggen på nivå med det siste ribben. Mus-kelen ble fjernet fra rundt virvel nr. T12, og et hull ble drillet i begge sider. Mikrodialysefiberet ble deretter plassert på tvers gjennom ryggmargens dorsalhorn mellom lumbarsegmentene L4-L6, slik at de permeable 2 mm av fiberet lå i dorsalhornet. Mikrodialysefiberet ble knyttet til PE2o-slanger (Becton og Dickson) som deretter ble ført under huden til nakken. Fiberet ble festet med dental sement. Kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) ble pumpet gjennom slangene med en hastighet på 5 ul/min i 1 time før PE20 ble gjenstengt og dyrene fikk våkne opp.

Dyrene ble testet med henblikk på tilbaketrekking av poten fremkalt av strålevarme som et mål på termal hyperalgesi. På dagen etter plassering av fiberet ble dyrene plassert i små lusittavlukker på en opphøyd glassplate. Strålevarme ble på-ført undersiden av hælen av bakpoten til rotten løftet opp poten. Tidspunktet da dette forekom ble definert som tilbaketrekkingslatens av pote (PWL). Begge poter ble testet uavhenging med intervaller på 5 minutter, totalt fem forsøk. Et gjennomsnitt av disse fem avlesninger ble benyttet som PWL. I rotter før behandling ble PWL målt før tilførsel av noen GABA-analoger (basislinje) og etter at GABA-analogen hadde blitt infundert i 1,5 timer, da kaolin og karragenan ble injisert i kneleddet. PWL ble målt siste gang 4 timer etter induksjon av leddbetennelse. I etter-behandlingsgruppen ble dyrene testet før induksjon av leddbetennelse i kneleddet (kontroll), 4-timers etter-induksjon og 1,5 timer etter infusjon av medikament, det vil si 5,5 timer etter induksjon av leddbetennelse. En nedgang i PWL fremkalt av strålevarme hos et dyr med kneleddsbetennelse induserer sekundær hyperalgesi.

Omkretsen av kneleddet ble også målt før injeksjon av kaolin og karragenan (kontroll) ved hjelp av et fleksibelt målebånd. Grad av beskyttelse av bakbenet ble også observert etter at leddbetennelse var indusert. For å kvantifisere disse endringer ble dyrene gradert med en subjektiv smertegraderingsskala (0-5), der 0 er normal, 1 er krølling av tærne, 2 er eversjon av poten, 3 er delvis vektbelastning, 4 er ikke-vektbelastning og beskyttelse og 5 er unngåelse av enhver kontakt med bakbenet.

Induksjon av leddbetennelse

Rotter ble kortvarig anestisert med natriummetoheksital (Brevital; 60 mg/kg"<1 >i.p.) etter kontrolladferdstesten (etter-behandlingsgruppe) eller etter infusjon av medikamentet (for-behandlingsgruppe). Kneleddet ble deretter injisert med 3% kaolin og 3% karragenan suspendert i sterilt saltvann (0,1 ml, pH 7,4). Kneleddet ble deretter maksimalt bøyet til rotten våknet opp (omtrent 5 minutter).

Tilførsel av GABA- analoger

Alle GABA-analoger ble løst opp i kunstig cerebrospinalvæske (aCSF)

(pH 7,4, justert ved å boble med 95% C02/5% O2) og infundert gjennom ryggmargen ved en hastighet på 5 ^l/min"<1>. Dyrene mottok enten pregabalin, R-(-)-3-IBG, eller aCSF. I etter-behandlingsgruppen ble GABA-analogene tilført ved konsentrasjoner på 0,1, 0,9 og 10 mg/ml. I motsetning til dette fikk for-behandlingsgruppen en enkel dose på 10 mg/ml.

Statistisk analyse

Data viste normal distribusjon. Statistiske analyser ble utført ved å bruke upa-rede t-tester for å sammenligne forskjeller mellom behandlingsgrupper på det samme tidspunkt. Parede t-tester ble benyttet for å sammenligne før- og etter-behandling i den samme gruppen. En P-verdi på mindre enn 0,05 ble benyttet for å indikere sig-nifikans. Data blir uttrykket som gjennomsnitt + standard feil. Tester ble utført ved å bruke Statistica (Jandel Corporation).

RESULTATER

Effekt av pregabalin og dets R- isomer infundert inn i ryggmargen før utvikling av akutt leddbetennelse

Infusjon av 10 mg/ml pregabalin, dets R-isomer, eller aCSF inn i dorsalhornet i ryggmargen førte alene ikke til endringer i PWL i varmehyperalgesitest, sammenlignet med basalnivåer. PWL hos rottene behandlet med aCSF før induksjon av betennelse var signifikant redusert 4 timer etter injeksjon av kaolin og karragenan (P<0,01, paret t-test), sammenlignet med verdien notert umiddelbart før injeksjonen. Det var også en signifikant forskjell (P<0,05, uparet t-test) mellom det injiserte ben og det ikke-injiserte ben ved dette tidspunkt.

Imidlertid ble det ikke observert noen sekundær termal hyperalgesi 4 timer etter injeksjon hos rotter infundert med en konsentrasjon på 10 mg/ml pregabalin eller dets R-isomer gjennom ryggmargen 1,5 timer før kaolin og karragenan i kneleddet (fig. 1, toppanel). Ingen signifikant forskjell ble observert når PWL-verdien notert 4 timer etter betennelse ble sammenlignet med den som ble observert før injeksjon av kaolin og karragenan, eller mellom det betente ben og det ikke-betente ben 4 timer etter injeksjon kaolin og karragenan.

Infusjon av pregabalin eller dets R-isomer inn i ryggmargen i 1,5 timer før induksjon av leddbetennelse ga også signifikant reduksjon (P<0,05, uparet t-test) av opphovningsmengde som var typisk etter injeksjon av kaolin og karragenan inn i kneleddet, med omtrent 30%, sammenlignet med rotter aCSF ble infundert (fig. 1, midtpanel). Videre forhindret forbehandling med pregabalin eller dets R-isomer utvikling av unormal posisjon av poten som indikerte spontan smerte (fig. 1, bunn-panel).

Effekt av pregabalin og dets R- isomer fundert inn i ryggmargen etter utvikling av akutt leddbetennelse

Fire timer etter induksjon av akutt betennelse av kneleddet var det en nedgang i PWL fremkalt av strålevarme mot den ipsilaterale fotpute, sammenlignet med kontrollverdi hos alle dyr som ble testet (n=30), noe som indikerte tilstedeværelse av sekundær hyperalgesi (fig. 2). Denne nedgang var signifikant (paret t-test, PO,01). Fire timer etter betennelse av kneleddet var det en signifikant økning i omkrets av kneleddet sammenlignet med målingen som ble gjort like før injeksjon av kaolin og karragenan (PO,05, paret t-test, fig. 3). Etter betennelse var det også en endring i rottens posisjon (nedsatt vektbelastning på det hovne ben og krølling av tærne), noe som ble reflektert av den økte spontane smertegraderingsscore som ble gitt til rottene (fig. 4, åpne søyler).

Infusjon av 0,9 mg/ml pregabalin eller dets R-isomer inn i dorsalhornet i ryggmargen reduserte termale hyperalgesi ved 5,5 timer (fig. 2, øvre panel). Selv om PWL notert etter infusjon av begge medikamenter var signifikant forskjellig fra den som ble observert 4 timer etter betennelsesinduksjon, var den fremdeles signifikant mindre enn kontrollverdien. Pregabalin var mer effektiv i å indusere termal hyperalgesi enn dets R-isomer. Infusjon av en høyere dose, 10 mg/ml, med pregabalin eller dets R-isomer, etter betennelse i kneleddet, førte til en reversering av PWL til kontrollverdien (fig. 2, nedre panel). I motsetning til dette, ga infusjon av aCSF i dorsalhornet ingen reduksjon av den termale hyperalgesi, PWL ved 4 timer etter betennelse var ikke signifikant forskjellig fra den etter aCSF-infusjonen.

Den spontane smerte ble også redusert av infusjon av begge doser av pregabalin og dets R-isomer. Etter infusjon av begge medikamentisomerer var potens posisjon nesten normal, mens krølling av tær og eversjon av poten ble observert etter infusjon av aCSF.

Resultatene fra disse studier viser at injeksjon av kaolin og karragenan i kneleddet hos en rotte fører til en akutt leddbetennelse som karakteriseres av sekundær termal hyperalgesi, opphovning av kneleddet og spontan smerte. Infusjon av pregabalin og R-(-)-3-IBG inn i ryggmargens dorsalhorn i 1,5 timer før injeksjon av kaolin og karragenan førte til reduksjon av opphovninger, og blokkerte den sekundære hyperalgesi og den spontane smerte. GABA-analogene er således hensiktsmessige for å behandle inflammatoriske sykdommer, spesielt leddbetennelse.

Eksempel 4

Gabapentin, en annen GABA-analog, ble evaluert i en lignende analyse og ble vist å være effektiv i både å forebygge og reversere effektene av kaolin/karragenan kneleddsbetennelse, sekundær varmehyperalgesi og spontane smerterelaterte adferdsmønstre.

Fremgangsmåter

30 dyr i to eksperimentelle grupper ble behandlet (1) før og (2) etter induksjon av eksperimentell leddbetennelse. Betennelsen ble indusert i kneleddet ved induksjon av kaolin/karragenan. Gabapentin eller aCSF ble tilført gjennom et mikrodialysefiber som var plassert i dorsalhornet i ryggmargen, eller subkutant i nakken for systemisk tilførsel. Alle eksperimenter ble utført blindt av en observatør som ikke kjente til medikamentell behandling.

Plassering av mikrodialysefiber

Sprague-Dawley-rotter (220-270 g) ble anestisert med natriumpentobarbital (nembutal, 50 mg/kg, i.p.). Et mikrodialysefiber (200 ^m ytre diameter, 45.000 MW Cut-off, Hospal AN69) ble dekket med epoksyresin, med unntak av et 2 mm område. Mikrodialysefiberet ble plassert i dorsalhornet hos 24 dyr. Et lite snitt i midtlinjen ble gjort i huden over virvel L1. L1 -virvelen ble renset for muskel og et hull ble drillet på begge sider av virvelbuen. Mikrodialysefiberen ble deretter ført gjennom hullet i virvelen og på tvers gjennom dorsalhornet i ryggmargen. Mikrodialysefiberen lå mellom segementene L4-L6, med de permeable 2 mm av fiberet i dorsalhornet. Mikrodialysefiberet ble koblet til PE2o-slanger (Becton Dickinson) som ble ført under huden til nakken. Forbindelse mellom mikrodialysefiberet og PE2o-slangen ble stabilisert med tannsement. aCSF ble pumpet gjennom slangen med en hastighet på 5 jai/min i 1 time før PE2o-slangen ble stengt og dyret ble tillatt å komme seg i 24 timer. Så fort rottene våknet ble de undersøkt med henblikk på motoriske sviktsymptomer, alle rotter som hadde motorsvikt ble ekskludert fra studien. Som en systemisk kontroll for tilførsel av medikament ble mikrodialysefiberet implantert subkutant i nakken hos seks andre rotter.

Adferdstesting og vurdering av leddbetennelse

Latenstid for tilbaketrekking av pote (PWL) fremkalt av skadelig varmestråling ble testet som et mål på termal hyperalgesi. En nedgang i PWL hos dyr med betennelse i kneleddet ble tolket som indikasjon på sekundær hyperalgesi. Siden strål-ingsvarmestimulus ble rettet mot fotsålen av bakbenet i en betydelig avstand fra det betente kneledd representerer dette mål sekundær varmehyperalgesi.

På dagen etter plassering av fiber ble dyrene puttet i små lusitt-avlukker på en forhøyet glassplate. Strålevarme ble påført mot fotsålen av bakbenet til rotten løftet opp poten. Tidspunktet da dette forekom ble definert som PWL. Begge poter ble testet uavhengig med 5 minutters intervaller totalt fem ganger. Gjennomsnittet av disse fem avlesninger ble benyttet som PWL ved hvert tidspunkt. Hos rotter før behandling (n=12) ble PWL målt før tilførsel av hvert medikament (basislinje), etter at medikamentet var blitt infundert i 1,5 timer (etter-medikament) og 4 timer etter leddbetennelse. I etter-behandlingsgruppen (n=18) ble dyrene testet før induksjon av betennelse i kneleddet (basislinje) 4 timer etter induksjon av leddbetennelse og 1,5 timer etter infusjon av medikament, det vil si 5,5 timer etter induksjon av leddbetennelse.

Den smerterelaterte adferd, grad av beskyttelse av bakben i leddbetennelses-benet, ble vurdert av to uavhengige observatører. For å kvanitfisere disse endringer ble dyrene gradert med en subjektiv smertegraderingsskala (0-5) der 0 er normal, 1 er krølling av tærne, 2 er eversjon av poten, 3 er inkomplett vektbæring, 4 er ingen vektbæring og beskyttelse, og 5 er unngåelse av enhver kontakt med bakpoten.

Omkretsen av kneleddet ble også målt ved å bruke et fleksibelt måkebånd før induksjon av leddbetennelse (basislinje), 4 timer etter induksjon av leddbetennelse (for-behandlings- og etter-behandlingsgruppe) og 1,5 timer etter infusjon av medikament i etter-behandlingsgruppen (5,5 timer etter induksjon av leddbetennelse).

Induksjon av leddbetennelse

Rottene ble kortvarig anestisert med metoheksitalnatrium (Brevital natrium, 60 mg/kg i.p.) etter basislinje adferdstest (etter-behandlingsgruppe) eller etter infusjon av medikamenter (før-behandlingsgruppe). Kneleddet ble deretter injisert med 0,1 ml 3% kaolin og 3% karragenan suspendert i sterilt saltvann, og ble bøyet manu-elt til rotten våknet opp (omtrent 5-10 min).

Tilførsel av medikament

Dyret mottok enten gabapentin eller aCSF som kontroll. Gabapentin var opp-løst i aCSF. Både gabapentin og aCSF ble infundert gjennom mikrodialysefiberet med en hastighet på 5 ^l/minutt. pH av gabapentin-løsningen og aCSF ble justert ved å boble med 95% C02/5% 02 (omtrent 7,4) før bruk.

Enkeltdosen på 10 ^g/ml gabapentin ble benyttet i denne studie.

Statistisk analyse

Resultatene i hver gruppe ble uttrykt som gjennomsnittlig prosent endring fra basislinje + standard feil av gjennomsnittet (s.e.m.). Parede t-tester ble benyttet for å sammenligne hvert dyrs testresponser med dets egne basalverdier (P<0,01).

RESULTATER

Basallinje- verdier

Basalverdiene av PWL, spontan adferd og kneleddsomkrets på alle rotter som ble brukt i disse studier ble målt før infusjon av medikament eller bæremiddel gjennom ryggmargen eller subkutant (tabell 2). Gjennomsnittlig PWL og omkrets av kneledd var henholdsvis 10,52 + 0,39 sekunder og 5,26 + 0,03 cm. Ingen spontan smerterelatert adferd ble observert, og en gradering på 0 ble gitt.

Følgende endringer med leddbetennelse

I tabell 2 blir resultatene for alle variabler observert i dyr med leddbetennelse presentert. Data inkluderer de sammenslåtte mål for aCSF leddbetennelse kontroll-dyr fra begge behandlingsgrupper. I aCSF-behandlede leddbetennelses kontrollrotter (n=12) sank PWL overfor skadelig strålingsvarme til 76% av kontrollverdi 4 timer etter injeksjon av kaolin og karragenan. Denne nedgang var signifikant (paret t-test, P<0,01) og indikerte at sekundær hyperalgesi var tilstede.

I dyr med leddbetennelse var det signifikant endring i plassering av bakpote hos rotten, som indikerte spontan smerterelatert adferd. Disse endringer i posisjon, som representerte spontan smerterelatert adferd, ble representert med en gradering på 1,25 ± 0,13 (P<0,01). En signifikant 14% økning i omkrets av kneledd ble notert sammenlignet med basislinjen (paret t-test, P<0,01).

Effekt av gabapentin- infusjoner direkte i ryggmarg før betennelse i kneledd

Gabapentin forhindret på en effektiv måte utvikling av sekundære hyperalgesi-responser overfor den tilførte strålingsvarme. Gabapentin eller aCSF ble infundert gjennom mikrodialysefiberet inn i ryggmargen før kneleddet ble injisert med kaolin og karragenan. Etter 1,5 times infusjon i ryggmarg var det ingen signifikante endringer i PWL fremkalt av strålingsvarme sammenlignet med basislinje-nivåer (tabell 3). 4 timer etter injeksjon av kneleddet med kaolin og karragenan var PWL-responsen overfor strålingsvarme og plassering av bakpote med leddbetennelse ikke signifikant endret fra de basale verdier observert uten leddbetennelse. I motsetning til dette hadde dyr behandlet med aCSF en signifikant i deres PWL-respons, og de viste signifikant spontan smerterelatert adferd. Omkrets av det betente ledd var signifikant øket 4 timer etter leddbetennelse, på samme måte som aCSF leddbetennelse kontrollrotter. Således var gabapentin effektivt i å forebygge utvikling av sekundær varmehyperalgesi og mål på spontane smerterelaterte adferder.

Effekt av gabapentin- infusion i ryggmargen eller subkutant etter betennelse i kneledd

Etter-behandling av dyr med leddbetennelse med gabapentin reverserte den sekundære varmehyperalgesi og de spontane smerterelaterte adferdsmønstre når medikamentet ble tilført i ryggmargen. To grupper med dyr mottok gabapentin i etter-behandlingsstudiet (tabell 4). En gruppe med rotter ble infundert med medikamentet gjennom et mikrodialysefiber implantert rett inn i ryggmargen, den andre gruppen mottok gabapentin systemisk gjennom et mikrodialysefiber implantert subkutant i nakken.

Fire timer etter injeksjon av kaolin og karragenan fremviste alle dyr reduserte PWL-responser og spontane smerterelaterte adferdsmønstre. I gruppen som var blitt infundert med gabapentin i ryggmargen falt PWL signifikant til omtrent 81% av kon-trollmålinger (paret t-test, p<0,01). 1,5 timer etter ryggmargsinfusjon av gabapentin var PWL-målingene kommet tilbake til basalnivå, og tærne var nesten flate.

I gruppen som fikk gabapentin infundert subkutant sank PWL, fremkalt av skadelig strålingsvarme, signifikant med 15% fra basislinje-verdier 4 timer etter injeksjon av ledd, og etter 1,5 timers infusjon av medikament fortsatte PWL å synke til 82% av basislinje-verdi, lik aCSF kontrollrotter med leddbetennelse. Både gradering av smerterelatert adferd og omkrets av det betente ledd økte signifikant etter fire timers leddbetennelse og 1,5 timers infusjon av medikament (5,5 timer etter) i alle grupper.

Den foregående studie etablerer at GABA-analoger slik som gabapentin har effekt både i å forhindre og å reversere effekter av kaolin/karragenan kneleddsbetennelse på sekundær varmehyperalgesi og spontane smerterelaterte adferder. I begge behandlingsgrupper var den signifikante observasjon evnen som gabapentin hadde i å bevare (eller å returnere) PWL latensgraderingeer til basalnivå. Gabapen-tins effektivitet i å redusere hyperalgesien og smerterelatert adferd etter at ledd-betennelsen blir fullt utviklet i denne modell viser at gabapentin og lignende GABA-analoger vil ha klinisk hensiktsmessige virkninger i kliniske betennelsestilstander.

Claims (9)

1. Anvendelse av en GABA-analog med formel I hvori Ri er hydrogen og n er et heltall fra 4 til 6, eller med formel II hvori Ri er et lineært eller forgrenet alkyl med fra 1 til 6 karbonatomer, fenyl eller sykloalkyl med fra 3 til 6 karbonatomer; R2 er hydrogen eller metyl; og R3 er hydrogen, metyl eller karboksyl, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å forhindre og behandle betennelsessykdommer.

2. Anvendelse ifølge krav 1, idet den benytter gabapentin.

3. Anvendelse ifølge krav 1, idet den benytter en forbindelse med formel I der den sykliske ring er substituert med en eller to grupper utvalgt fra metyl og etyl.

4. Anvendelse ifølge krav 3, idet den benytter (1-aminometyl-3-metylsykloheksyl) eddiksyre.

5. Anvendelse ifølge krav 3, idet den benytter (1-aminometyl-3-metylsyklopentyl) eddiksyre.

6. Anvendelse ifølge krav 3, idet den benytter (1-aminometyl-3,4-dimetylsyklopentyl) eddiksyre.

7. Anvendelse ifølge krav 1, idet den benytter pregabalin.

8. Anvendelse ifølge krav 1, idet den benytter R-(3)-(aminometyl)-5-metyl-heksansyre.

9. Anvendelse ifølge krav 1, den benytter 3-(1-aminometyl)-5-metyl-heksansyre.