NO326968B1

NO326968B1 - PAF-AH-polypeptidfragment, isolert polynukleotid, DNA-vektor, vertscelle, fremgangsmate for fremstilling av et PAF-AH-polypeptidfragment, en variant eller et variant-fragment av plasma-PAF-AH, PAF-AH-polypeptidfragment, variant eller variantfragment, farmasoytisk preparat, anvendelse av PAF-AH-fragmentet, varianten eller variantfragmentet for fremstilling av et medikament for behandling av et pattedyr.

Info

Publication number: NO326968B1
Application number: NO19991717A
Authority: NO
Inventors: Lawrence S Cousens; Christine D Eberhardt; Patrick Gray; Hai Le Trong; Larry W Tjoelker; Cheryl L Wilder
Original assignee: Icos Corp
Priority date: 1997-08-13
Filing date: 1999-04-12
Publication date: 2009-03-23
Also published as: NO991717D0; CA2267994A1; CZ124199A3; SK286518B6; IL129262A; JP2001502163A; CZ297603B6; PL190532B1; IL173867A0; PL332833A1; SK47399A3; BR9711882A; IL129262A0; EP0948605A1; AU751594B2; WO1999009147A1; NO991717L; CA2267994C; HUP9903959A2; HUP9903959A3

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår PAF-AH-polypeptidfragment, isolert polynukleotid, DNA-vektor, vertscelle, fremgangsmåte for fremstilling av et PAF-AH-polypeptidfragment, en variant eller et variantfragment av plasma-PAF-AH, PAF-AH-polypeptidfragment, variant eller variantfragment, farmasøytisk preparat, anvendelse av PAF-AH-fragmentet, varianten eller variantfragmentet for fremstilling av et medikament for behandling av et pattedyr.

Bakgrunn

Blodplateaktiverende faktor (PAF) er et biologisk aktivt fosfolipid som syntetiseres av forskjellige celletyper. In vivo og ved normale konsentrasjoner på IO"<10> til 10" <9> M aktiverer PAF målceller, slik som blodplater og nøytro-filer, ved binding til spesifikke G-proteinkoplede celleoverflatereseptorer [Venable et al., J. Lipid Res., 34:691-701 (1993)]. PAF har strukturen 1-0-alkyl-2-acetyl-sn-glysero-3-fosfokolin. For optimal biologisk aktivitet må sn-1-posisjonen i PAF-glyserolryggraden foreligge i en eter-binding med en fettalkohol, og sn-3-posisjonen må ha en fosfokolinhodegruppe.

PAF funksjonerer i normale fysiologiske prosesser (f.eks. inflammasjon, hemostase og fødsel) og er implisert i patologiske, inflammatoriske responser (f.eks. astma, anafylakse, septisk sjokk og artritt) [Venable et al., supra, og Lindsberg et al., Ann. Neurol., 30:117-129

(1991)]. Sannsynligheten for PAF-involvering i patologiske responser har tilskyndet forsøk på å modulere aktiviteten av PAF, og hovedfokus for disse forsøk har vært utvikling av antagonister av PAF-aktivitet som forstyrrer binding av PAF til celleoverflatereseptorer. Se f.eks. Heuer et al., Clin. Exp. Allergy, 22:980-983 (1992).

Syntese og sekresjon av PAF, så vel som dens nedbrytning og utskilling, synes å være strengt kontrollert. I den grad patologiske, inflammatoriske virkninger av PAF resulterer fra en svikt i PAF-regulatoriske mekanismer som medfører for høy produksjon, utilstrekkelig produksjon eller mangel på nedbrytning, ville en alternativ metode for å modulere aktiviteten av PAF involvere etterligning eller forsterkning av den naturlige prosess for resolusjon av inflammasjon. Makrofager [Stafforini et al., J. Biol. Chem., 255(17):9682-9687 (1990)], hepatocytter og den humane hepatomcellelinje HepG2 [Satoh et al., J. Clin. Invest., 87:476-481 (1991), og Tarbet et al., J. Biol. Chem., 266( 25) : 16667-16673 (1991)] er blitt rapportert å frigjøre en enzymatisk aktivitet, PAF-acetylhydrolase (PAF-AH), som inaktiverer PAF. I tillegg til å inaktivere PAF, inaktiverer PAF-AH også oksidativt fragmenterte fosfolipider, slik som produkter fra arakidonsyrekaskaden som formidler inflammasjon. Se Stremler et al., J. Biol. Chem., 266(17):11095-11103 (1991). Inaktiveringen av PAF med PAF-AH foregår primært ved hydrolyse av PAF-sn-2-acetylgruppen, og PAF-AH metaboliserer oksidativt fragmenterte fosfolipider ved å fjerne sn-2-acylgrupper. To typer av PAF-AH er blitt identifisert: cytoplasmatiske former funnet i mange forskjellige celletyper og vev, slik som endotelceller og erytrocytter, og en ekstracellulær form funnet i plasma og serum. Plasma-PAF-AH hydrolyserer ikke intakte fosfolipider, med unntak av PAF, og denne substratspesifisitet tillater enzymet å sirkulere in vivo i en fullstendig aktiv tilstand uten ugunstige effekter. Plasma-PAF-AH synes å svare for all PAF-nedbrytning i humant blod ex vivo [Stafforini et al., J. Biol. Chem., 262(9):4223-4230 (1987)].

Selv om de cytoplasmatiske og plasmaformer av PAF-AH synes å ha identisk substratspesifisitet, har plasma-PAF-AH biokjemiske karakteristika som skjelner den fra cytoplasmatisk PAF-AH og fra andre karakteriserte lipaser. Nærmere bestemt er plasma-PAF-AH assosiert med lipoprotein-partikler, inhiberes av diisopropylfluorfosfat, påvirkes ikke av kalsiumioner, er relativt ufølsom for proteolyse og har en tilsynelatende molekylvekt på 43 000 dalton. Se Stafforini et al., (1987), supra. Den samme artikkel av Stafforini et al. beskriver en prosedyre for delvis rensing av PAF-AH fra humant plasma, og aminosyresammensetningen av plasmamaterialet oppnådd ved anvendelse av prosedyren. Cytoplasmatisk PAF-AH er blitt renset fra erytrocytter, som rapportert av Stafforini et al., J. Biol. Chem., 268(6):3857-3865 (1993), og 10 aminoterminale rester av cytoplasmatisk PAF-AH er også beskrevet i artikkelen. Hattori et al., J. Biol. Chem., 268(25):18748-18753 (1993) beskriver rensing av cytoplasmatisk PAF-AH fra bovin hjerne. Etter innsendelse av stamsøknaden til foreliggende patent-søknad ble nukleotidsekvensen av bovin hjerne-cytoplasmatisk PAF-AH publisert av Hattori et al., J. Biol. Chem., 259(237):23150-23155 (1994). 5. januar 1995, 3 måneder etter innsendelsesdatoen for stamsøknaden til foreliggende patent-søknad, ble en nukleotidsekvens for en lipoproteinassosiert fosfolipase A2 (Lp-PLA2) publisert i Smithkline Beecham PLC Patent Cooperation Treaty (PCT), internasjonal publikasjon nr. WO 95/00649. Nukleotidsekvensen av Lp-PLA2 er forskjellig i én posisjon sammenlignet med nukleotidsekvensen av PAF-AH ifølge foreliggende oppfinnelse. NUkleotidforskjellen (tilsvarende posisjon 1297 i SEKV.ID. NR. 7) resulterer i en aminosyreforskjell mellom enzymene som kodes for av polynukleotidene. Aminosyren i posisjon 379 i SEKV.ID. NR. 8 er valin, mens aminosyren i den tilsvarende posisjon i Lp-PLA2 er alanin. Nukleotidsekvensen av PAF-AH ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer dessuten 124 baser ved 5'-enden og 20 baser ved 3'-enden som ikke er til stede i Lp-PLA2-sekvensen. 3 måneder senere, 10. april 1995, ble det deponert en Lp-PLA2-sekvens i GenBank under aksesjonsnr. U24577 som er forskjellig i 11 posisjoner sammenlignet med nukleotidsekvensen av PAF-AH ifølge foreliggende oppfinnelse. Nukleotidforskjellene (tilsvarende posisjon 79, 81, 84, 85, 86, 121, 122, 904, 905, 911, 983 og 1327 i SEKV.ID. NR. 7) resulterer i fire aminosyreforskjeller mellom enzymene kodet for av polynukleotidene. Aminosyrene i posisjonene 249, 250, 274 og 389 i SEKV.ID. NR. 8 er henholdsvis lysin, asparaginsyre, fenylalanin og leucin, mens de respektive aminosyrer i de tilsvarende posisjoner i GenBank-sekvensen er isoleucin, arginin, leucin og serin.

Den rekombinante produksjon av PAF-AH ville mulig-gjøre anvendelse av eksogent PAF-AH for å etterligne eller forsterke normale prosesser for resolusjon av inflammasjon in vivo. Administrering av PAF-AH ville tilveiebringe en fysiologisk fordel i forhold til administrering av PAF-reseptorantagonister, fordi PAF-AH er et produkt som vanligvis finnes i plasma. Fordi PAF-reseptorantagonister som er strukturelt beslektet med PAF inhiberer nativ PAF-AH-aktivitet, blir dessuten den ønskelige metabolisme av PAF og av oksidativt fragmenterte fosfolipider forhindret. Inhibering av PAF-AH-aktivitet med PAF-reseptorantagonister motvirker således den kompetitive blokkering av PAF-reseptoren med antagonistene. Se Stremler et al. supra. På steder med f.eks. akutt inflammasjon resulterer dessuten frigivelse av oksidanter i inaktivering av det native PAF-AH-enzym, hvilket i sin tur resulterer i forhøyede lokale nivåer av PAF og PAF-lignende forbindelser som ville konkurrere med enhver eksogent administrert PAF-reseptor-antagonist for binding til PAF-reseptoren. I motsetning til dette ville behandling med rekombinant PAF-AH forsterke endogen PAF-AH-aktivitet og kompensere for eventuelt inaktivert endogent enzym.

WO 95 09921 omfatter PAF-AH. WO 95 00649 vedrører lipoprotein assosiert fosfolipase A2, LP-PLA2 i renset form, og et isolert nukleinsyremolekyl som koder for dette enzymet.

Det foreligger således et behov i teknikken for å identifisere og isolere polynukleotidsekvenser som koder for humant plasma-PAF-AH, og utvikle materialer og metoder anvendelige for rekombinant produksjon av PAF-AH, og frem-stille reagenser for påvisning av PAF-AH i plasma.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse beskriver nye rensede og isolerte polynukleotider (det vil si DNA og RNA, både sense-og antisensetråder) som koder for humant plasma-PAF-AH eller enzymatisk aktive fragmenter derav. Foretrukne DNA-sekvenser inkluderer genomiske og cDNA-sekvenser, så vel som helt eller delvis kjemisk syntetiserte DNA-sekvenser. DNA-sekvensene som koder for PAF-AH, som er vist i SEKV.ID. NR. 7, og DNA-sekvenser som hybridiserer til den ikke-kodende tråd derav under standard stringente betingelser, eller som ville hybridisere hvis det ikke var for overfledigheten av den genetiske kode, er omfattet av foreliggende oppfinnelse. Også omfattet er biologiske kopier (det vil si kopier av isolerte DNA-sekvenser dannet in vivo eller in vitro) av DNA-sekvenser. Autonomt replikerende, rekombinante konstruksjoner, slik som plasmid- og virus-DNA-vektorer som inkorpo-rerer PAF-AH-sekvenser, og spesielt vektorer hvori DNA som koder for PAF-AH er operativt bundet til en endogen eller eksogen ekspresjonskontroll-DNA-sekvens og en transkrip-sjons terminator, tilveiebringes også.

Det beskrives videre at prokaryote eller eukaryote vertsceller blir stabilt transformert med DNA-sekvenser som beskrevet heri på en måte som tillater at den ønskede PAF-AH blir uttrykt deri. Vertsceller som uttrykker PAF-AH-produkter, kan tjene til mange forskjellige nyttige formål. Slike celler utgjør en verdifull kilde for immunogener for utvikling av antistoffer som er spe'sifikt immunreaktive med PAF-AH. Vertsceller ifølge oppfinnelsen er påfallende nyttige ved fremgangsmåter for produksjon i stor skala av PAF-AH, hvori cellene dyrkes i et passende kulturmedium og de ønskede polypeptidprodukter isoleres fra cellene eller fra mediet som cellene dyrkes i, f.eks. ved immunaffinitets-rensing.

En ikke-immunologisk fremgangsmåte som beskrives heri for rensing av PAF-AH fra plasma, inkluderer de følgende trinn: (a) isolering av lavdensitetslipoprotein-partikler; (b) oppløsning av lavdensitetslipoproteinpartik-lene i en buffer som omfatter 10 mM CHAPS for å danne en første PAF-AH-enzymløsning; (c) applisering av denne første PAF-AH-enzymløsning på en DEAE-anionebytterkolonne; (d) vask av DEAE-anionebytterkolonnen ved anvendelse av en passende pH 7,5-buffer som omfatter 1 mM CHAPS; (e) eluering av PAF-AH-enzym fra DEAE-anionebytterkolonnen i fraksjoner ved anvendelse av ca. pH 7,5-buffere som omfatter en gradient fra 0 til 0,5 M NaCl; (f) sammenslåing av fraksjoner eluert fra DEAE-anionebytterkolonnen med PAF-AH-enzymatisk aktivitet; (g) justering av de sammenslåtte, aktive fraksjoner fra DEAE-anionebytterkolonnen til 10 mM CHAPS for å danne en andre PAF-AH-enzymløsning; (h) applisering av den andre PAF-AH-enzymløsning på en blåfargeligandaffinitetskolonne; (i) eluering av PAF-AH-enzym fra blåfargeligandaffinitetskolonnen ved anvendelse av en buffer omfattende 10 mM CHAPS og et kaotropt salt; (j) applisering av eluatet fra blåfargeligandaffinitetskolonnen på en Cu-ligandaffinitetskolonne; (k) eluering av PAF-AH-enzym fra Cu-ligand-af f initetskolonnen ved anvendelse av en buffer omfattende 10 mM CHAPS og imidazol; (1) utførelse av SDS-PAGE på eluatet fra Cu-ligandaffinitetskolonnen; og (m) isolering av det ca. 44 kDa PAF-AH-enzym fra SDS-polyakrylamidgelen. Bufferen i trinn (b) er fortrinnsvis 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, pH 7,5; bufferen i trinn (d) er 25 mM Tris-HCl, 1 mM CHAPS; kolonnen i trinn (h) er en blå Sepharose Fast Flow-kolonne; bufferen i trinn (i) er 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M KSCN, pH 7,5; kolonnen i trinn (j) er en Cu-chelaterende Sepharose-kolonne; og bufferen i trinn (k) er 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M NaCl, 50 mM imidazol, ved en pH i området 7,5-8,0.

En fremgangsmåte for rensing av enzymatisk aktiv PAF-AH fra E. coli som produserer PAF-AH, inkluderer trinnene: (a) preparering av en sentrifugeringssupernatant fra lysert E. coli som produserer PAF-AH-enzym; (b) applisering av sentrifugeringssupernatanten på en blåfargeligandaffinitetskolonne; (c) eluering av PAF-AH-enzym fra blåfargeligandaffinitetskolonnen ved anvendelse av en buffer som omfatter 10 mM CHAPS og et kaotropt salt; (d) applisering av eluatet fra blåfargeligandaffinitetskolonnen på en Cu-ligandaffinitetskolonne; og (e) eluering av PAF-AH-enzym fra Cu-ligandaffinitetskolonnen ved anvendelse av en buffer som omfatter 10 mM CHAPS og imidazol. Kolonnen i trinn (b) er fortrinnsvis en blå Sepharose Fast Flow-kolonne; bufferen i trinn (c) er 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M KSCN, pH 7,5; kolonnen i trinn (d) er en Cu-chelaterende Sepharose-kolonne; og bufferen i trinn (e) er 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M NaCl, 100 mM imidazol, pH 7,5.

En annen fremgangsmåte for rensing av enzymatisk aktiv PAF-AH fra E. coli som produserer PAF-AH, inkluderer trinnene: (a) preparering av en sentrifugeringssupernatant fra lysert E. coli som produserer PAF-AH-enzym; (b) fortynning av sentrifugeringssupernatanten i en buffer med lav pH, som omfatter 10 mM CHAPS; (c) applisering av den fortynnede sentrifugeringssupernatant på en kationebytterkolonne ekvilibrert til ca. pH 7,5; (d) eluering av PAF-AH-enzym fra kationebytterkolonnen ved anvendelse av 1 M salt; (e) for-høyelse av pH i eluatet fra kationebytterkolonnen og justering av saltkonsentrasjonen i eluatet til ca. 0,5 M salt; (f) applisering av det justerte eluat fra kationebytterkolonnen på en blåfargeligandaffinitetskolonne; (g) eluering av PAF-AH-enzym fra blåfargeligandaffinitetskolonnen ved anvendelse av en buffer som omfatter ca. 2 M til 3 M salt; og (h) dialysering av eluatet fra blåfarge-ligandaf f initetskolonnen ved anvendelse av en buffer som omfatter ca. 0,1 % Tween. Bufferen i trinn (b) er fortrinnsvis 25 mM MES, 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA, pH 4,9; kolonnen i trinn (c) er en S-Sepharose-kolonne ekvilibrert i 25 mM MES, 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH 5,5; PAF-AH elueres i trinn (d) ved anvendelse av 1 mM NaCl; pH i eluatet i trinn (e) justeres til pH 7,5 ved anvendelse av 2 M Tris-base; kolonnen i trinn (f) er en Sepharose-kolonne; bufferen i trinn (g) er 25 mM Tris, 10 mM CHAPS, 3 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5; og bufferen i trinn (h) er 25 mM Tris, 0,5 mM NaCl, 0,1 % Tween 80, pH 7,5.

Ytterligere en annen fremgangsmåte for rensing av enzymatisk aktiv PAF-AH fra E. coli inkluderer trinnene: (a) preparering av en E. coli-ekstrakt som gir oppløst PAF-AH-supernatant etter lyse i en buffer inneholdende CHAPS; (b) fortynning av supernatanten og applisering på en anionebytterkolonne ekvilibrert ved ca. pH 8,0; (c) eluering av PAF-AH-enzym fra anionebytterkolonnen; (d) applisering det justerte eluat fra anionebytterkolonnen på en blåfarge-ligandaf f initetskolonne; (e) eluering av blåfargeligand-af f initetskolonnen ved anvendelse av en buffer som omfatter 3,0 M salt; (f) fortynning av blåfargeeluatet i en egnet buffer for utførelse av hydroksylapatittkromatografi; (g) utførelse av hydroksylapatittkromatografi der vask og eluering utføres ved anvendelse av buffere (med eller uten CHAPS; (h) fortynning av hydroksylapatitteluatet til en egnet saltkonsentrasjon for kationebytterkromatografi; (i) applisering av det fortynnede hydroksylapatitteluat på en kationebytterkolonne ved en pH som varierer mellom ca. 6,0 og 7,0; (j) eluering av PAF-AH fra kationebytterkolonnen med en egnet formuleringsbuffer; (k) utførelse av katione-bytterkromatograf i ved lav temperatur; og (1) formulering av PAF-AH i flytende eller frossen form i fravær av CHAPS.

I trinn (a) ovenfor er lysebufferen fortrinnsvis 25 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM CHAPS, pH 8,0; i trinn (b) er fortynningen av supernatanten for anionebytter-kromatografi 3-4 ganger i 25 mM Tris, 1 mM EDTA, 10 mM CHAPS, pH 8,0, og kolonnen er en Q-Sepharose-kolonne ekvilibrert med 25 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8,0; i trinn (c) elueres anionebytterkolonnen ved anvendelse av 25 mM Tris, 1 mM EDTA, 350 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8,0; i trinn (d) appliseres eluatet fra trinn (c) direkte på en blåfargeaffinitetskolonne; i trinn (e) elueres kolonnen med 3 M NaCl, 10 mM CHAPS, 25 mM Tris, pH 8,0-buffer; i trinn (f) utføres fortynning av blåfargeeluatet for hydroksylapatittkromatografi ved fortynning i 10 mM natriumfosfat, 100 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 6,2; i trinn (g) utføres hydroksylapatittkromatografi ved anvendelse av en hydroksylapatittkolonne ekvilibrert med 10 mM natriumfosfat, 100 mM NaCl, 10 mM CHAPS, og elueringen utføres ved anvendelse av 50 mM natriumfosfat, 100 mM NaCl (med eller uten 10 mM CHAPS), pH 7,5; i trinn (h) utføres fortynning av hydroksylapatitteluatet for kationebytterkromatografi ved fortynning i en buffer ved en pH som varierer fra ca. 6,0 til 7,0, og som omfatter natriumfosfat (med eller uten CHAPS); i trinn (i) ekvilibreres en S-Sepharose-kolonne med 50 mM natriumfosfat (med eller uten 10 mM CHAPS), pH 6,8; i trinn (j) utføres eluering med en passende formulerings-buf f er, slik som kaliumfosfat, 50 mM, 12,5 mM asparaginsyre, 125 mM NaCl, pH 7,5, inneholdende 0,01 % Tween 80; og i trinn (k) utføres kationebytterkromatografi ved 2-8 °C. Eksempler på egnede formuleringsbuffere for anvendelse i trinn (1) som stabiliserer PAF-AH, inkluderer 50 mM kaliumfosfat, 12,5 mM asparaginsyre, 125 mM NaCl, pH 7,4

(med og uten tilsetning av Tween 80 og/eller Pluronic F68)

eller 25 mM kaliumfosfatbuffer inneholdende (minst) 125 mM NaCl, 25 mM arginin og 0,1 % Tween 80 (med eller uten Pluronic F68 ved .ca. 0,1 og 0,5 %) .

En ytterligere fremgangsmåte for rensing av enzymatisk aktive rPAF-AH-produkter fra E. coli inkluderer trinnene: (a) preparering av en E. coli-ekstrakt som gir oppløst rPAF-AH-produktsupernatant etter lyse i en buffer inneholdende Triton X-100; (b) fortynning av supernatanten og applisering på en immobilisert metallaffinitetsutbytterkolonne ekvilibrert ved ca. pH 8,0; (c) eluering av rPAF-AH-produkt fra den immobiliserte metallaffinitetsutbytterkolonne med en buffer omfattende imidazol; (d) justering av saltkonsentrasjonen og applisering av eluatet fra den immobiliserte metallaffinitetsutbytterkolonne på en hydrofob interaksjonskolonne (HIC nr. 1); (e) eluering av HIC nr. 1 ved reduksjon av saltkonsentrasjonen og/eller økning av detergentkonsentrasjonen; (f) titrering av HIC nr. 1-eluatet til en pH på ca. 6,4; (g) applisering av det justerte HIC nr. 1-eluat på en kationebytterkolonne (CEX nr. 1) ekvilibrert ved ca. pH 6,4; (h) eluering av CEX nr. 1 med konsentrert natriumklorid; (i) justering av CEX nr. 1-eluatet med natriumklorid til en konsentrasjon på ca. 2,0 M; (j) applisering av det justerte CEX nr. 1-eluat på en hydrofob interaksjonskolonne (HIC nr. 2) ekvilibrert ved ca. pH 8,0 og ca. 2,0 M natriumklorid; (k) eluering av HIC nr. 2 ved reduksjon av saltkonsentrasjonen og/eller økning av detergentkonsentrasjonen; (1) fortynning av HIC nr. 2-eluatet og justering til en pH på ca. 6,0; (m) applisering av det justerte HIC nr. 2-eluat på en kationebytterkolonne (CEX nr. 2) ekvilibrert ved ca. pH 6,0; (n) eluering av rPAF-AH-produktet fra CEX nr. 2 med en egnet formuleringsbuffer.

I trinn (a) ovenfor er lysebufferen fortrinnsvis 90 mM Tris, 0,125 % Triton X-100, 0,6 M NaCl, pH 8,0, og lysen utføres i en høytrykkshomogenisator; i trinn (b) fortynnes supernatanten i ekvilibreringsbuffer (20 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0), en sinkchelat-kolonne (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia, Uppsala, Sverige) lades, ekvilibreres med ekvilibreringsbuffer, den fortynnede supernatant appliseres, og kolonnen vaskes med 20 mM Tris, 0,5 M NaCl, 4 M urea, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0, etterfulgt av vask med 20 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,02 % Triton X-100, pH 8,0; i trinn (c) utføres eluering med 20 mM Tris, 50 mM imidazol, 0,02 % Triton X-100, pH 8,0; i trinn (d) justeres eluatet til 1 mM EDTA og 2 M NaCl, en fenyl-Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia) ekvilibreres med ekvilibreringsbuffer (2,0 M NaCl, 25 mM Tris, 0,02 % Triton X-100, pH 8,0), det justerte eluat fra trinn (c) appliseres ved romtemperatur, kolonnen vaskes med ekvilibreringsbuffer og vaskes med 25 mM NaP04, 0,02 % Triton X-100, pH 6,5, ved en gjennomstrømningshastighet på 30 cm/t; i trinn (e) utføres eluering med 25 mM NaP04, 3 % Triton X-100, pH 6,5; i trinn (g) ekvilibreres en Macro-Prep High S-kolonne (Bio-Rad Labs, Richmond, CA) med ekvilibreringsbuffer (20 mM NaP04, 0,02 % Triton X-100, pH 6,4), det justerte eluat fra trinn (f) appliseres, kolonnen vaskes med ekvilibreringsbuffer og vaskes med 25 mM Tris, 0,02 % Triton X-100, pH 8,0; i trinn (h) utføres eluering med 25 mM Tris, 0,02 % Triton X-100, 1,3 M NaCl, pH 8,0; i trinn (j) ekvilibreres en Bakerbond Wide Pore Hi-Propyl C3 (Baker, Phillipsburg, NJ) med ekvilibreringsbuffer (2,0 M NaCl, 25 mM Tris, 0,02 % Triton X-100, pH 8,0), det justerte eluat fra trinn (i) appliseres ved romtemperatur, kolonnen vaskes med ekvilibreringsbuffer og vaskes med 25 mM Tris, 0,02 % Triton X-100, pH 8,0, ved 30 cm/t; i trinn (k) utføres eluering med 10 mM Tris, 3,0 % Triton X-100, pH 8,0; i trinn (1) utføres fortynningen i ekvilibreringsbuffer (20 mM suksinat, 0,1 % Pluronic F68, pH 6,0); i trinn (m) ekvilibreres en SP Sepharose Fast Flow-kolonne (Pharmacia) med ekvilibreringsbufferen fra trinn (1), eluatet fra trinn (1) appliseres, kolonnen vaskes med ekvilibreringsbuffer; og i trinn (n) utføres eluering med 50 mM NaP04, 0,7 M NaCl, 0,1 % Pluronic F68, 0,02 % Tween 80, pH 7,5.

PAF-AH-produkter kan oppnås som isolater fra naturlige cellekilder, eller de kan syntetiseres kjemisk, men de fremstilles fortrinnsvis ved hjelp av rekombinante prosedyrer som involverer prokaryote eller eukaryote vertsceller ifølge oppfinnelsen. PAF-AH-produkter der en del av eller hele aminosyresekvensen er vist i SEKV.ID. NR. 8, er inkludert. Oppfinnelsen angår spesielt fragmenter som mangler opptil de første 12 N-terminale aminosyrer av den modne, humane PAF-AH-aminosyresekvens vist i SEKV.ID. NR. 8, spesielt de som har Met46, Ala47 eller Ala48 i SEKV.ID. NR. 8 som den innledende N-terminale aminosyre. Fragmenter som mangler opptil 30 C-terminale aminosyrer av aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 8, er også inkludert, spesielt de som har Ile429 og Leu431 som den C-terminale rest. Også inkludert er varianter av PAF-AH som har en aminosyre-erstatning i sekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 8 utvalgt fra gruppen bestående av S 108 A, S 273 A, D 286 A, D 286 N, D 296 A, D 304 A, D 338 A, H 351 A, H 395 A, H 399 A, C 67 S, C 229 S, C 291 S, C 334 S, C 407 S, D 286 A, D 286 N og D 304 A. Som anført ovenfor, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse polynukleotider (inkludert DNA) som koder for slike fragmenter eller variantfragmenter, så vel som fremgangsmåter for rekombinant produksjon av slike fragmenter eller varianter, ved dyrkning av vertsceller omfattende et slikt DNA. Foretrukne PAF-AH-produkter inkluderer de prokaryote polypeptidekspresjonsprodukter fra DNA som koder for aminosyrerester Met46-Asn441 i SEKV.ID. NR. 8, betegnet rPH.2, og de prokaryote polypeptidekspresjonsprodukter fra DNA som koder for aminosyrerester Met46-Ile429 i SEKV.ID. NR. 8, betegnet rPH.9. Både rPH.2- og rPH.9-produktene oppviser mindre aminoterminal heterogenitet enn f.eks. de tilsvarende prokaryote ekspresjonsprodukter fra DNA som koder for den fullstendige modne sekvens av PAF-AH med et foranliggende translasjonsstartkodon. rPH.9-produktet oppviser dessuten høyere karboksyterminal homogenitet (konsistens). Anvendel-sen av pattedyrvertsceller forventes å tilveiebringe slike posttranslasjonelle modifikasjoner (f.eks. myristolering, glykosylering, trunkering, lipidering og tyrosin-, serin-eller treoninfosforylering) som kan være nødvendig for å gi rekombinante ekspresjonsprodukter ifølge oppfinnelsen optimal biologisk aktivitet. PAF-AH-produkter ifølge oppfinnelsen kan være uforkortede polypeptider, fragmenter eller varianter. Varianter kan omfatte PAF-AH-analoger hvori én eller flere av de spesifiserte (det vil si kodede) aminosyrer er delert eller erstattet, eller hvori én eller flere ikke-spesifiserte aminosyrer er tilføyd: (1) uten tap av én eller flere av de enzymatiske aktiviteter eller immunologiske karakteristika som er spesifikke for PAF-AH; eller (2) med spesifikt tap av en spesiell biologisk aktivitet av PAF-AH. Proteiner eller andre molekyler som bindes til PAF-AH, kan anvendes for å modulere dens aktivitet.

Det beskrives også antistoffer (f.eks. monoklonale og polyklonale antistoffer, enkeltkjedede antistoffer, kimære antistoffer, CDR-podede antistoffer og lignende) og andre bindingsproteiner som er spesifikke for PAF-AH. Spesielt illustrerende bindingsproteiner er de monoklonale antistoffer produsert av hybridomene 90G11D og 90F2D, som ble deponert hos American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, 30. september

1994, og som ble gitt henholdsvis aksesjonsnumre HB 11724 og HB 11725. Illustrerende bindingsproteiner er også det monoklonale antistoff produsert av hybridom 143A, som ble deponert hos ATCC 1. juni 1995 og gitt aksesjonsnr. HB 11900. Proteiner eller andre molekyler (f.eks. lipider eller små molekyler) som spesifikt bindes til PAF-AH, kan identifiseres ved anvendelse av PAF-AH isolert fra plasma, rekombinant PAF-AH, PAF-AH-varianter eller celler som uttrykker slike produkter. Bindingsproteiner er i sin tur anvendelige i preparater for immunisering, så vel som for rensing av PAF-AH, og er nyttige for påvisning eller kvantifisering av PAF-AH i væskeprøver og vevsprøver ved hjelp av kjente immunologiske prosedyrer. Antiidiotypiske antistoffer som er spesifikke for PAF-AH-spesifikke antistoffer, er også inkludert.

Den vitenskapelige verdi av informasjonen som gis ved beskrivelsene av DNA og aminosyresekvenser er inn-lysende. Som én serie av eksempler muliggjør kunnskap om sekvensen av et cDNA for PAF-AH isolering ved hjelp av DNA/DNA-hybridisering av genomiske DNA-sekvenser som koder for PAF-AH, og spesifisering av PAF-AH-ekspresjonskontroll-regulatoriske sekvenser, slik som promotorer, operatorer og lignende. DNA/DNA-hybridiseringsprosedyrer utført med DNA-17 (1994)], ulcerativ kolitt (Denizot et al., supra], iskemisk slag [Satoh et al., Stroke, 23:1090-1092 (1992)], iskemisk hjerneskade [Lindsberg et al., Stroke, 21:1452-1457

(1990), og Lindsberg et al. (1991), supra], systemisk lupus erythematosus [Matsuzaki et al., Clinica Chimica Acta, 210:139-144 (1992)], akutt pankreatitt [Kald et al., Pancreas, 8(4):440-442 (1993)], septikemi (Kald et al., supra), akutt glomerulonefritt etter streptokokkinfeksjon [Mezzano et al., J. Am. Soc. Nephrol., 4:235-242 (1993)], lungeødem etter IL-2-terapi [Rabinovici et al., J. Clin. Invest., 89:1669-1673 (1992)], allergisk inflammasjon [Watanabe et al., Br. J. Pharmacol., 111:123-130 (1994)], iskemisk nyresvikt [Grino et al., Annals of Internal Medicine, 121(5):345-347 (1994); for tidlige veer [Hoffman et al.. Am. J. Obstet. Gynecol., 162(2):525-528 (1990), og Maki et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 85:728-732

(1988)]; åndenødssyndrom hos voksne [Rabinovici et al., J. Appl. Physiol., 74(4):1791-1802 (1993); Matsumoto et al., Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 19:509-515 (1992); og Rodriguez-Roisin et al., J. Clin. Invest., 93:188-194

(1994)]. Foreliggende oppfinnelse angår også anvendelse av PAF-AH-preparater for behandling av humant immunsviktvirus(HIV)-infeksjon av sentralnervesystemet. "Behandling" som anvendt heri, inkluderer både profylaktisk og terapeutisk behandling.

Dyremodeller for mange av de foregående patologiske tilstander er beskrevet i teknikken. En musemodell for astma og rhinitt er f.eks. beskrevet i eksempel 16 heri; en kaninmodell for artritt er beskrevet av Zarco et al., supra; rottemodeller for iskemisk tarmnekrose/nekrotiserende enterokolitt er beskrevet av Furukawa et al., Ped. Res., 34(2):237-241 (1993), og Caplan et al., supra; en kaninmodell for slagtilfeller er beskrevet av Lindsberg et al.

(1990), supra; en musemodell for lupus er beskrevet av Matsuzaki et al., supra; en rottemodell for akutt pankreatitt er beskrevet av Kald et al., supra; en rottemodell for lungeødem etter IL-2-terapi er beskrevet av Rabinovici et al., supra; en rottemodell for allergisk inflammasjon er beskrevet av Watanabe et al., supra; en hundemodell for nyreallotransplantasjon er beskrevet av Watson et al., Transplantation, 56(4):1047-1049 (1993); og rotte- og marsvinmodeller for åndenødssyndrom hos voksne er henholdsvis beskrevet av Rabinovici et al., supra, og Lellouch-Tubiana, Am. Rev. Respir. Dis., 137:948-954 (1988).

Det beskrives spesielt PAF-AH-preparater for anvendelse ved fremgangsmåter for behandling av et pattedyr som er mottakelig for eller lider av PAF-formidlede patologiske tilstander, omfattende at det til pattedyret administreres PAF-AH i en mengde som er tilstrekkelig til å supplere endogen PAF-AH-aktivitet og inaktivere patologiske mengder av PAF i pattedyret.

Terapeutiske/farmasøytiske preparater som beskrevet heri inkluderer PAF-AH-produkter og et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel eller en bærer, og kan også inkludere andre midler med antiinflammatoriske effekter. Angitte doseringsmengder vil være tilstrekkelig til å supplere endogen PAF-AH-aktivitet og inaktivere patologiske mengder av PAF. For generelle doseringsvurderinger, se Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utgave, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Doser vil variere mellom ca. 0,1 og 1000 p,g PAF-AH/kg kroppsvekt. Terapeutiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres på forskjellige måter, avhengig av den patologiske tilstand som skal behandles. Administreringen kan f.eks. utføres intra-venøst, subkutant, oralt, ved hjelp av suppositorier og/eller pulmonalt.

For patologiske tilstander i lungene er pulmonal administrering av PAF-AH spesielt indikert. Ved pulmonal administrering kan det anvendes mange forskjellige utlever-ingsanordninger, inkludert f.eks. forstøvningsapparater, doseringsinhalatorer og pulverinhalatorer, som er standard i teknikken. Utlevering av forskjellige proteiner til lungene og sirkulasjonssystemet ved inhalering av aerosolformuler-inger er beskrevet av Adjei et al., Pharm. Res., 7(6):565-569 (1990) (leuprolidacetat); Braquet et al., J. Cardio. Pharm., 13 (supp. 5): s. 143-146 (1989) (endotelin-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine, IJI(3), 206-212

(1989) (al-antitrypsin); Smith et al., J. Clin. Invest., 84:1145-1146 (1989) (al-proteinaseinhibitor); Debs et al., J. Immunol., 140:3482-3488 (1933) (rekombinant gamma-inter-feron og tumornekrosefaktor alfa); PCT patentsøknad nr.

WO 94/20069, publisert 15. september 1994 (rekombinant pegylert granulocyttkolonistimulerende faktor).

Kort beskrivelse av figurene

Et stort antall andre aspekter og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå ved betraktning av den følgende detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen under refe-ranse til figurene, hvori: FIGUR 1 er et fotografi av en PVDF-membran inneholdende PAF-AH renset fra humant plasma; FIGUR 2 er et diagram som viser den enzymatiske aktivitet av rekombinant, humant plasma-PAF-AH; FIGUR 3 er en skjematisk tegning som avbilder rekombinante PAF-AH-fragmenter og deres katalytiske aktivitet; FIGUR 4 viser massespektroskopiresultater for et rekombinant PAF-AH-produkt, rPH.2; FIGUR 5 viser massespektroskopiresultater for et rekombinant PAF-AH-produkt, rPH.9; FIGUR 6 er et stolpediagram som illustrerer blokkering av PAF-indusert rottefotødem ved hjelp av lokalt administrert rekombinant PAF-AH ifølge oppfinnelsen; FIGUR 7 er et stolpediagram som illustrerer blokkering av PAF-indusert rottefotødem ved hjelp av intra-venøst administrert PAF-AH; FIGUR 8 er et stolpediagram som viser at PAF-AH blokkerer PAF-indusert ødem, men ikke zymosan A-indusert ødem; FIGURENE 9A og 9B viser doseresponsresultater for PAF-AH-antiinflammatorisk aktivitet ved rottefotødem; FIGURENE 10A og 10B viser resultater som angir effektiviteten in vivo av en enkelt dose PAF-AH over tid. FIGUR 11 er et linjediagram som viser farmako-kinetikken for PAF-AH i rottesirkulasjon; og FIGUR 12 er et stolpediagram som viser de antiinflammatoriske effekter av PAF-AH sammenlignet med de mindre effekter av PAF-antagonister ved rottefotødem; FIGUR 13 viser resultater som angir at PAF-AH nøytraliserer de apoptotiske effekter av kondisjonert medium fra HIV-1-infiserte og aktiverte monocytter.

Detaljert beskrivelse

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. Eksempel viser en ny metode for rensing av PAF-AH fra humant plasma. Eksempel 2 beskriver aminosyremikrosekvensering av den rensede humane plasma-PAF-AH. Kloningen av et uforkortet cDNA som koder for humant plasma-PAF-AH, er beskrevet i eksempel 3. Identifikasjon av en antatt spleisingsvariant av det humane plasma-PAF-AH-gen er beskrevet i eksempel 4. Kloningen av genomiske sekvenser som koder for humant plasma-PAF-AH, er beskrevet i eksempel 5. Eksempel 6 beskriver kloning av hunde-, muse-, bovin-, kylling-, gnager- og makak-cDNA som er homologe med det humane plasma-PAF-AH-cDNA. Eksempel 7 viser resultatene fra en analyse som bevis på den enzymatiske aktivitet av rekombinant PAF-AH som er forbigående uttrykt i COS 7-celler. Eksempel 8 beskriver ekspresjon av uforkortede, trunkerte og kimære humane PAF-AH-DNA i E. coli, S. cerevisiae og pattedyrceller. Eksempel 9 viser protokoller for rensing av rekombinant PAF-AH fra E. coli og analyser som bekrefter dens enzymatiske aktivitet. Eksempel 10 beskriver forskjellige rekombinante PAF-AH-produkter, inkludert aminosyresubstitusjonsanaloger og amino- og karboksytrunkerte produkter, og beskriver eksperimenter som viser at nativ PAF-AH isolert fra plasma er glykosylert. Resultater fra en Northern blot-analyse for ekspresjon av humant plasma-PAF-AH-RNA i forskjellige vev og cellelinjer er vist i eksempel 11, mens resultater av in situ-hybridisering er vist i eksempel 12. Eksempel 13 beskriver utvikling av monoklonale og polyklonale antistoffer som er spesifikke for humant plasma-PAF-AH. Eksempler 14, 15, 16, 17, 18 og 19 viser den terapeutiske effekt in vivo av administrering av rekombinante PAF-AH-produkter ifølge oppfinnelsen på henholdsvis akutt inflammasjon, pleurisi, astma, nekrotiserende enterokolitt, åndenødssyn-drom hos voksne og pankreatitt i dyremodeller. Eksempel 2 0 beskriver effekten in vitro av rekombinant PAF-AH-produkt på nevrotoksisitet forbundet med HIV-infeksjon. Eksempel 21 viser resultatene fra immunanalyser av serum fra humane pasienter som oppviser en svikt i PAF-AH-aktivitet, og beskriver identifikasjonen av en genetisk lesjon hos pasien-tene som tydeligvis er ansvarlig for svikten.

Eksempel 1

PAF-AH ble renset fra humant plasma for å tilveiebringe materiale for aminosyresekvensering.

A. Optimalisering av rensingsbetingelser

Lavdensitetslipoprotein(LDL)partikler ble først utfelt fra plasma med fosfowolframat og oppløst i 0,1 % Tween 20 og underkastet kromatografi på en DEAE-kolonne (Pharmacia, Uppsala, Sverige) i overensstemmelse med metoden ifølge Stafforini et al. (1987), supra, men uoverensstem-mende eluering av PAF-AH-aktivitet fra DEAE-kolonnen fordret reevaluering av oppløsningsbetingelsene og de etterfølgende rensingsbetingelser.

Tween 20, CHAPS (Pierce Chemical Co., Rockford,

IL) og oktylglukosid ble evaluert ved sentrifugering og gelfiltreringskromatografi med hensyn til deres evne til å opp-løse LDL-partikler. CHAPS ga 25 % høyere gjenvinning av opp-løst aktivitet enn Tween 20 og 300 % høyere gjenvinning enn oktylglukosid. LDL-bunnfall oppløst med 10 mM CHAPS ble deretter fraksjonert på en DEAE-Sepharose Fast Flow-kolonne (en anionebytterkolonne; Pharmacia) med buffer inneholdende 1 mM CHAPS, for å tilveiebringe en stor porsjon delvis renset PAF-AH ("DEAE-porsjonen") for evaluering av ytterligere kolonner.

DEAE-porsjonen ble anvendt som startmateriale for å teste forskjellige kromatografikolonner for anvendelighet ved videre rensing av PAF-AH-aktiviteten. De testede kolonner inkluderte: Blue Sepharose Fast Flow (Pharmacia), en fargeligandaffinitetskolonne; S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), en kationebytterkolonne; Cu-chelaterende Sepharose (Pharmacia), en metall-ligandaffinitetskolonne; Fractogel S (EM Separations, Gibbstown, NJ), en kationebytterkolonne; og. Sephacryl-200 (Pharmacia), en gelfil-treringskolonne. Disse kromatografiske prosedyrer ga alle lave, utilfredsstillende rensingsnivåer når de ble utført i 1 mM CHAPS. Etterfølgende gelfiltreringskromatografi på Sephacryl S-200 i 1 mM CHAPS ga en enzymatisk aktiv fraksjon som eluerte i et bredt størrelsesområde istedenfor den forventede størrelse på ca. 44 kDa. Samlet indikerte disse resultater at LDL-proteinene aggregerte i oppløsning.

Forskjellige LDL-prøver ble derfor evaluert ved hjelp av analytisk gelfiltreringskromatografi for aggre-gering av PAF-AH-aktiviteten. Prøver fra DEAE-porsjonen og av nyoppløst LDL-bunnfall ble analysert på Superose 12 (Pharmacia) ekvilibrert i buffer med 1 mM CHAPS. Begge prøvene eluerte i et meget bredt molekylvektområde, idet mesteparten av aktiviteten eluerte over 150 kDa. Når prøvene deretter ble analysert på Superose 12 ekvilibrert med 10 mM CHAPS, eluerte hovedmengden av aktiviteten nær 44 kDa, som forventet, for PAF-AH-aktivitet. Prøvene inneholdt imidlertid noe PAF-AH-aktivitet i det høymolekylære området som tilsvarer aggregater.

Andre prøver eluerte PAF-AH-aktivitet utelukkende i det ca. 44 kDa-området når de senere ble testet ved gel-filtrering. Disse prøver var et LDL-bunnfall oppløst i 10 mM CHAPS i nærvær av 0,5 M NaCl, og en nypreparert DEAE-porsjon som ble justert til 10 mM CHAPS etter eluering fra DEAE-kolonnen. Disse data indikerer at minst 10 mM CHAPS fordres for å opprettholde ikke-aggregert PAF-AH. Økning av CHAPS-konsentrasjonen fra 1 mM til 10 mM etter kromatografi på DEAE, men før etterfølgende kromatografiske trinn, resulterte i dramatiske rensingsforskjeller. Graden av PAF-AH-rensing på S-Sepharose Fast Flow ble f.eks. økt fra 2 ganger til 10 ganger. PAF-AH-aktivitet ble bundet irreversibelt til Blue Sepharose Fast Flow-kolonnen i 1 mM CHAPS, men kolonnen ga det'høyeste rensingsnivå i 10 mM CHAPS. DEAE-kromato-grafien ble ikke forbedret med tidligere tilsetning av 10 mM

CHAPS.

Kromatografi på Cu-chelaterende Sepharose etter Blue Sepharose Fast Flow-kolonnen konsentrerte PAF-AH-aktiviteten 15 ganger. Det ble også bestemt at PAF-AH-aktivitet kunne gjenvinnes fra en redusert SDS-polyakrylamidgel, så lenge som prøvene ikke ble kokt. Aktiviteten av materialet som eluerte fra den Cu-chelaterende Sepharose-kolonne når det ble underkastet SDS-polyakrylamidgelelektroforese, falt sammen med et hovedproteinbånd når gelen ble sølvfarget.

B. PAF- AH- rens ingsprotokol1

Den nye protokoll anvendt for å rense PAF-AH for aminosyresekvensering omfattet derfor de følgende trinn, som ble utført ved 4 °C. Humant plasma ble delt i 900 ml ali-quoter ill Nalgene-flasker og justert til pH 8,6. LDL-partikler ble deretter utfelt ved tilsetning av 90 ml 3,85 % natriumfosfowolframat, etterfulgt av 23 ml 2 M MgCl2. Plasma ble deretter sentrifugert i 15 minutter ved 3600 g. Pelleter ble resuspendert i 800 ml 0,2 % natriumsitrat. LDL ble utfelt på nytt ved tilsetning av 10 g NaCl og 24 ml 2 M MgCl2. LDL-partikler ble pelletert ved sentrifugering i 15 minutter ved 3600 g. Dette ble gjentatt to ganger. Pelletene ble deretter nedfrosset ved -20 °C. LDL-partikler fra 5 1 plasma ble resuspendert i 5 1 buffer A (25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, pH 7,5) og omrørt over natten. Oppløste LDL-partikler ble sentrifugert ved 3600 g i 1,5 time. Supernatanter ble kombinert og filtrert med Whatman 113-filterpapir for å fjerne eventuelle resterende faste materialer. Oppløst LDL-supernatant ble applisert på en DEAE-Sepharose Fast Flow-kolonne (11 cm x 10 cm; 1 1 resinvolum; 80 ml/minutt) ekvilibrert i buffer B (25 mM Tris-HCl, 1 mM CHAPS, pH 7,5). Kolonnen ble vasket med buffer B inntil absorbansen gikk tilbake til basislinjen. Protein ble eluert med en 8 1, 0-0,5 M NaCl-gradient, og 480 ml fraksjoner ble oppsamlet. Dette trinn var nødvendig for å oppnå binding til den nedenfor angitte Blue Sepharose Fast Flow-kolonne. Fraksjoner ble analysert for acetylhydrolaseaktivitet, vesentlig ved hjelp av metoden beskrevet i eksempel 4.

Aktive fraksjoner ble sammenslått, og tilstrekkelig CHAPS ble tilsatt til å gi en konsentrasjon på ca. 10 mM

CHAPS. DEAE-porsjonen ble applisert over natten ved en hastighet på 4 ml/minutt på en Blue Sepharose Fast Flow-kolonne (5 cm x 10 cm; 200 ml materialvolum) ekvilibrert i buffer A inneholdende 0,5 M NaCl. Kolonnen ble vasket med ekvilibreringsbufferen ved en hastighet på 16 ml/minutt inntil absorbansen gikk tilbake til basislinjen. PAF-AH-aktivitet ble eluert trinnvis med buffer A inneholdende 0,5 M KSCN (et kaotropt salt) ved en hastighet på 16 ml/minutt, og oppsamlet i 50 ml fraksjoner. Dette trinn ga en rensing høyere enn 1000 ganger. Aktive fraksjoner ble sammenslått, og porsjonen ble justert til pH 8,0 med 1 M Tris-HCl, pH 8,0. Den aktive porsjon fra Blue Sepharose Fast Flow-kromatografi ble applisert på en Cu-chelaterende Sepharose-kolonne (2,5 cm x 2 cm; 10 ml materialvolum; 4 ml/minutt) ekvilibrert i buffer C [25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M NaCl, pH 8,0 (pH 7,5 fungerte også)], og kolonnen ble vasket med 50 ml buffer C. PAF-AH-aktivitet ble eluert med 100 ml 50 mM imidazol i buffer C, og oppsamlet i 10 ml fraksjoner. Fraksjoner inneholdende PAF-AH-aktivitet ble sammenslått og dialysert mot buffer A. I tillegg til å gi en 15 gangers konsentrasjon av PAF-AH-aktivitet, ga den Cu-chelaterende Sepharose-kolonne en liten rensing. Den Cu-chelaterende Sepharose-porsjon ble redusert i 50 mM DTT i 15 minutter ved 37 °C og applisert på en 0,75 mm, 7,5 % polyakrylamidgel. Gelbiter ble utskåret for hver 0,5 cm og plassert i engangsmikrosentrifugerør inneholdende 200 ^il 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 150 mM NaCl. Bitene ble oppmalt og inkubert over natten ved 4 °C. Supernatanten fra hver gelbit ble deretter analysert for PAF-AH-aktivitet for å bestemme hvilket proteinbånd på SDS-PAGE som inneholdt PAF-AH-aktivitet. PAF-AH-aktivitet ble funnet i båndet på ca. 44 kDa. Protein fra en duplikatgel ble elektrooverført til en PVDF-membran (Immobilon-P, Millipore) og farget med Coomassie Blue. Et fotografi av PVDF-membranen er vist i figur 1.

Som vist i tabell 1 nedenfor, ble ca. 200 (ig PAF-AH renset 2 x IO<6> ganger fra 5 1 humant plasma. Sammenligning med dette er en 3 x 10<*> gangers rensing av PAF-AH-aktivitet, beskrevet av Stafforini et al., (1987), supra. ;Som oppsummering var de følgende trinn unike og kritiske for vellykket rensing av plasma-PAF-AH for mikro-sekvensering: (1) oppløsning og kromatografi i 10 mM CHAPS, (2) kromatografi på en blue-ligandaffinitetskolonne, slik som Blue Sepharose Fast Flow, (3) kromatografi på en Cu-ligandaf f initetskolonne, slik som Cu-chelaterende Sepharose, og (4) eluering av PAF-AH fra SDS-PAGE. ;Eksempel 2 ;For aminosyresekvensering ble det tilnærmet 44 kDa-proteinbånd fra den PAF-AH-inneholdende PVDF-membran beskrevet i eksempel 1 utskåret og sekvensert ved anvendelse av et Applied Biosystems 473A-proteinsekvenseringsapparat. N-terminal sekvensanalyse av det tilnærmet 44 kDa-proteinbånd som tilsvarte PAF-AH-aktiviteten, indikerte at båndet inneholdt to hovedsekvenser og to mindre sekvenser. Forholdet mellom de to hovedsekvenser var 1:1, og det var derfor vanskelig å fortolke sekvensdataene. ;For å skjelne sekvensene av de to hovedproteiner som var blitt atskilt på SDS-gelen, ble en duplikat-PVDF-membran som inneholdt det tilnærmet 44 kDa-bånd delt på midten, slik at det ble utført separat sekvensering av den øvre del og den nedre del av membranen. ;Den N-terminale sekvens oppnådd for den lavere del av membranen, var: ;Et søk i proteindatabaser avslørte at denne sekvens var et fragment av humant serumalbumin. Den øvre del av den samme PVDF-membran ble også sekvensert, og den N-terminale aminosyresekvens var: ;Denne sekvens tilsvarte ikke noe protein i de søkte databaser og var forskjellig fra den N-terminale aminosyresekvens: ;som var rapportert for erytrocyttcytoplasmatisk PAF-AH av Stafforini et al. (1993), supra. Den nye sekvens (SEKV.ID. NR. 2) ble benyttet for cDNA-kloning av humant plasma-PAF-AH, som beskrevet nedenfor i eksempel 3. ;Eksempel 3 ;En uforkortet klon som koder for humant plasma-PAF-AH, ble isolert fra et makrofag-cDNA-bibliotek. ;A. Konstruksjon av et makrofag- cDNA- bibliotek ;Poly A<+>RNA ble innhøstet fra monocyttavledede makrofager fra perifert blod. Dobbelttrådet, buttendet cDNA ble dannet ved anvendelse av Invitrogen Copy Kit (San Diego, CA), og BstXI-adaptere ble ligert til cDNA før innføyelse i pattedyrekspresjonsvektoren pRc/CMV (Invitrogen). De resulterende plasmider ble innført i E. coli, stamme XL-1 Blue ved elektroporering. Transformerte bakterier ble utspredt ved en densitet på ca. 3000 kolonier pr. agaroseplate, på totalt 978 plater. Plasmid-DNA fremstilt separat fra hver plate ble oppbevart i individuelle porsjoner og ble også kombinert til større porsjoner som hver representerte 300 000 kloner. ;B. Biblioteksscreening ved hjelp av PCR ;Makrofagbiblioteket ble screenet ved hjelp av polymerasekjedereaksjonen ved anvendelse av en degenerert antisenseoligonukleotid-PCR-primer basert på den nye N-terminale aminosyresekvens beskrevet i eksempel 2. Sekvensen av primeren er vist nedenfor i IUPAC-nomenklatur, og hvor "I" er et inosin. ;Kodonutvelgelsestabellene ifølge Wada et al., Nuc. Acids Res., 19S:1981-1986 (1991), ble anvendt for å utvelge nukleotider i den tredje posisjon på hvert kodon i primeren. Primeren ble anvendt i kombinasjon med en primer som var spesifikk for enten SP6- eller T7-promotorsekvensene, hvilke begge flankerer kloningssetet for pRc/CMV, for å screene makrofagbiblioteksporsjonene fra 300 000 kloner. Alle PCR-reaksjoner inneholdt 100 ng templat-cDNA, 1 \ ig av hver primer, 0,125 mM av hvert dNTP, 10 mM Tris-HCl, pH 8,4, 50 mM MgCl2 og 2,5 enheter Taq-polymerase. Et første denaturer-ingstrinn ved 94 °C i 4 minutter ble etterfulgt av 30 ampi i-fikasjonssykluser på 1 minutt ved 94 °C, 1 minutt ved 60 °C og 2 minutter ved 72 °C. Det resulterende PCR-produkt ble klonet i pBluescript SK" (Stratagene, La Jolla, CA) , og dets nukleotidsekvens ble bestemt ved hjelp av dideoksykjede-termineringsmetoden. PCR-produktet inneholdt sekvensen forutsagt av den nye peptidsekvens og tilsvarer nukleotider 1-331 av SEKV.ID. NR. 7. ;PCR-primerne vist nedenfor, som er spesifikke for det klonede PCR-fragment beskrevet ovenfor, ble deretter utformet for identifikasjon av en uforkortet klon. ;PCR-reaksjoner ved anvendelse av primerne ble utført som beskrevet ovenfor for først å screene cDNA-porsjonene på 300 000 kloner, og deretter det passende undersett av de mindre porsjoner på 3 000 kloner. Tre porsjoner på ;3000 kloner som produserte et PCR-produkt med den forventede størrelse, ble deretter anvendt for å transformere bakterier. ;C. Biblioteksscreening ved hjelp av hybridisering ;DNA fra de transformerte bakterier ble deretter screenet ved hybridisering ved anvendelse av det opprinnelige klonede PCR-fragment som en probe. Kolonier ble blottet på nitrocellulose og prehybridisert og hybridisert i 50 % formamid, 0,75 M natriumklorid, 0,075 M natriumsitrat, 0,05 M natriumfosfat, pH 6,5, 1 % polyvinylpyrrolidin, 1 % Ficoll, 1 % bovint serumalbumin og 50 ng/ml sonikert laksesperma-DNA. Hybridiseringsproben ble merket ved vilkårlig heksamerpriming. Etter hybridisering over natten ved 42 °C ble blots vasket omfattende.i 0,03 M natriumklorid, 3 mM natriumsitrat, 0,1 % SDS, ved 42 °C. Nukleotidsekvensen av 10 hybridiseringskloner ble bestemt. Én av klonene, klon sAH 406-3, inneholdt sekvensen forutsagt av den opprinnelige peptidsekvens for PAF-AH-aktiviteten renset fra humant plasma. DNA- og de utledede aminosyresekvenser av humant plasma-PAF-AH er vist i henholdsvis SEKV.ID. NR. 7 og 8. ;Klon sAH 406-3 inneholder- en 1,52 kb innføyelse med en åpen leseramme som koder for et forutsagt protein med 441 aminosyrer. Ved aminoterminalen ligger et relativt hydrofobt segment med 41 rester foran den N-terminale aminosyre (isoleucin i posisjon 42 i SEKV.ID. NR. 8) identifisert ved hjelp av proteinmikrosekvensering. Det kodede protein kan således enten ha en lang signalsekvens eller en signalsekvens pluss et ytterligere peptid som avspaltes for å gi det modne funksjonelle enzym. Tilstedeværelsen av en signalsekvens er en karakteristisk egenskap hos utskilte proteiner. Proteinet kodet for av klon sAH 406-3 inkluderer dessuten konsensus GxSxG-motivet (aminosyrer 271-275 i SEKV.ID. NR. 8), som antas å inneholde aktivt sete-serinet for alle kjente pattedyrlipaser, mikrobielle lipaser og serinproteaser. Se Chapus et al., Biochimie, 70:1223-1224 (1988), og Brenner, Nature, 334:528-530 (1988). ;Tabell 2 nedenfor er en sammenligning mellom aminosyresammensetningen av den humane plasma-PAF-AH ifølge foreliggende oppfinnelse, som forutsagt fra SEKV.ID. NR. 8, og aminosyresammensetningen av det påstått rensede materialet beskrevet av Stafforini et al. (1987), supra. Aminosyresammensetningen av den modne form av den humane plasma-PAF-AH ifølge foreliggende oppfinnelse og aminosyresammensetningen av det tidligere rensede materialet som ble påstått å være den humane plasma-PAF-AH, er klart forskjellig fra hverandre. ;Når nukleotidet ifølge Hattori et al., supra, og de utledede aminosyresekvenser av bovin hjerne-cytoplasmatisk PAF-AH ble forsøkt sammenlignet med aminosyresekvensene av den humane plasma-PAF-AH ifølge foreliggende oppfinnelse, ble det ikke observert noen signifikant strukturell likhet i sekvensene. ;Eksempel 4 ;En antatt spleisingsvariant av det humane PAF-AH-gen ble påvist når PCR ble utført på makrofag- og stimulert ;PBMC-cDNA ved anvendelse av primere som hybridiserte til det 5'-utranslaterte området (nukleotider 31-52 i SEKV.ID. NR. 7) og området som omspenner translasjonstermineringskodonet ved 3<1->enden av PAF-AH-cDNA (nukleotider 1456-1487 i SEKV.ID. NR. 7). PCR-reaksjonene ga to bånd på en gel, ett bånd som tilsvarte den forventede størrelse av PAF-AH-cDNA ifølge eksempel 3, og det andre som var ca. 100 bp kortere. Sekvensering av begge bånd avslørte at det større bånd var PAF-AH-cDNA ifølge eksempel 3, mens det kortere bånd manglet exon 2 (eksempel 5 nedenfor) av PAF-AH-sekvensen som koder for de antatte signal- og propeptidsekvenser av plasma-PAF-AH. Den forutsagte katalytiske triade og alle cysteiner var til stede i den kortere klon, og derfor tilsvarer sannsynligvis den biokjemiske aktivitet av proteinet som kodes for av klonen aktiviteten av plasmaenzymet. ;For å begynne å vurdere den biologiske relevans av PAF-AH-spleisingsvarianten som er forutsagt å kode for et cytoplasmatisk aktivt enzym, ble den relative hyppighet av ;de to former i blodmonocyttavledede makrofager analysert ved hjelp av RNase-beskyttelse. Ingen av de to budskaper var til stede i nyisolerte monocytter, men begge ble funnet på dag 2 av in vitro-differensiering av monocyttene til makrofager, ;og vedvarte under 6 dagers dyrkning. Mengden av de to budskaper var tilnærmet ekvivalente gjennom differen-sieringsperioden. I motsetning til dette avslørte lignende analyser av nervevev at kun uforkortet budskap forutsagt å kode for den uforkortede ekstracellulære form av PAF-AH, blir uttrykt. ;Eksempel 5 ;Genomiske, humane plasma-PAF-AH-sekvenser ble også isolert. Strukturen av PAF-AH-genet ble bestemt ved å isolere lambda- og Pl-fagkloner inneholdende humant, genomisk DNA ved hjelp av DNA-hybridisering under betingelser for høy stringens. Fragmenter av fagklonene ble subklonet og sekvensert ved anvendelse av primere utformet til å anneale med regelmessige mellomrom gjennom cDNA-klonen sAH 406-3. Nye sekvenseringsprimere utformet til å anneale til intron-områdene som flankerer exonene ble dessuten anvendt for å sekvensere tilbake gjennom exon-introngrensene, for å be-krefte sekvensene. Exon-/introngrenser ble definert som de punkter hvor de genomiske sekvenser og cDNA-sekvenser diver-gerte. Disse analysert avslørte at det humane PAF-AH-gen består av 12 exoner. ;Exoner 1, 2, 3, 4, 5, 6 og en del av 7 ble isolert fra mannlig fosterplacentabibliotek konstruert i lambda FIX (Stratagene). Fagplakker ble blottet på nitrocellulose og prehybridisert og hybridisert i 50 % formamid, 0,75 M natriumklorid, 75 mM natriumsitrat, 50 mM natriumfosfat ;(pH 6,5), 1 % polyvinylpyrrolidin, 1 % Ficoll, 1 % bovint serumalbumin og 50 ng/ml sonikert laksesperma-DNA. Den anvendte hybridiseringsprobe for å identifisere en fagklon inneholdende exoner 2-6 og en del av 7 bestod av hele cDNA-klonen sAH-406-3. En klon inneholdende exon 1 ble identifisert ved anvendelse av et fragment avledet fra 5'-enden av cDNA-klonen (nukleotider 1-312 av SEKV.ID. NR. 7). Begge prober ble merket med <32>P ved hjelp av vilkårlig heksamerpriming. Etter hybridisering over natten ved 42 °C ble blots vasket omfattende i 30 mM natriumklorid, 3 mM natriumsitrat, 0,1 % SDS, ved 42 °C. DNA-sekvensene av exoner 1, 2, 3, 4, 5 og 6, sammen med delvis omgivende intronsekvenser, er vist i henholdsvis SEKV.ID. NR. 9, 10, 11, 12, 13 og 14. ;Resten av exon 7, så vel som exoner 8, 9, 10, 11 og 12, ble subklonet fra en Pl-klon isolert fra humant Pl-genomisk bibliotek. Pl-fagplakker ble blottet på nitrocellulose og prehybridisert og hybridisert i 0,75 M natriumklorid, 50 mM natriumfosfat (pH 7,4), 5 mM EDTA, 1 % polyvinylpyrrolidin, 1 % Ficoll, 1 % bovint serumalbumin, 0,5 % SDS og 0,1 mg/ml totalt humant DNA. Hybridiseringsproben, merket med <32>P ved hjelp av vilkårlig heksamerpriming, bestod av et 2,6 kb EcoRI-fragment av genomisk DNA avledet fra 3'-enden av en lambda-klon isolert ovenfor. Dette fragment inneholdt exon 6 og den delen av exon 7 som var til stede på fagklonen. Etter hybridisering over natten ved 65 °C ble blottene vasket som beskrevet ovenfor. DNA-sekvensene av exoner 7, 8, 9, 10, 11 og 12, sammen med delvis omgivende intronsekvenser, er vist i henholdsvis SEKV.ID. NR. 15, 16, 17, 18, 19 og 20. ;Eksempel 6 ;Uforkortede plasma-PAF-AH-cDNA-kloner ble isolert fra musemilt-, hundemilt-, bovin milt- og kyllingmilt-cDNA-biblioteker, og en partiell gnagerklon ble isolert fra et rottethymus-cDNA-bibliotek. Klonene ble identifisert ved hjelp av lavstringenshybridisering til det humane cDNA (hybridiseringsbetingelser var de samme som beskrevet for exoner 1-6 i eksempel 5 ovenfor, med unntak av at 20 % formamid ble anvendt istedenfor 50 % formamid). Et 1 kb Hindlll-fragment av den humane PAF-AH-sAH 406-3-cDNA-klon (nukleotider 309-1322 av SEKV.ID. NR. 7) ble anvendt som en probe. En partiell apeklon ble dessuten isolert fra makakhjerne-cDNA ved hjelp av PCR ved anvendelse av primere basert på nukleotider 285-303 og 851-867 av SEKV.ID. NR. 7. Nukleo-tidsekvensene og de utledede aminosyresekvenser av muse-, hunde-, bovin-, kylling-, rotte- og makak-cDNA-kloner er vist i henholdsvis SEKV.ID. NR. 21," 22, 23, 24, 25 og 26. ;En sammenligning mellom de utledede aminosyresekvenser av cDNA-klonene og den humane cDNA-klon resulterer i identitetsverdiene for aminosyreprosent vist i tabell 3 nedenfor. ;Ca. 38 % av restene er fullstendig konservert i alle sekvensene. De mest avvikende områder er ved den aminoterminale ende (inneholdende signalsekvensen) og den karboksylterminale ende som er vist i eksempel 10 som ikke-kritisk for enzymatisk aktivitet. Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly-motivet (SEKV.ID. NR. 27) funnet i nøytrale lipaser og andre esteraser var konservert i bovin-, hunde-, muse-, rotte- og kylling-PAF-AH. Det sentrale serin i dette motiv tjener som den aktivt sete-nukleofil for disse enzymer. De forutsagte aspartat- og histidinkomponenter i det aktive setet (eksempel 10A) var også konservert. Den humane plasma-PAF-AH ifølge foreliggende oppfinnelse synes derfor å benytte en katalytisk triade og kan anta a/p-hydrolasekonformasjonen til de nøytrale lipaser, selv om den ikke oppviser noen annen sekvenshomologi med lipasene. ;Humant plasma-PAF-AH er dessuten forventet å inneholde et område som formidler dens spesifikke interaksjon med de lavdensitets- og høydensitetslipoproteinpartikler i plasma. Interaksjon med disse partikler kan formidles av den N-terminale halvpart av molekylet som inneholder store strekninger med aminosyrer som er ytterst konservert blant arter, men inneholder ikke enzymets katalytiske triade. ;Eksempel 7 ;For å bestemme hvorvidt humant plasma-PAF-AH-cDNA-klon sAH 406-3 (eksempel 3) koder for et protein med PAF-AH-aktivitet, ble pRc/CMV-ekspresjonskonstruksjonen kortvarig uttrykt i COS 7-celler. Tre dager etter transfeksjon ved hjelp av en DEAE-dekstranmetode ble COS-cellemedium analysert for PAF-AH-aktivitet. ;Celler ble utsådd ved en tetthet på 300 000 celler pr. 60 mm vevskulturskål. Den påfølgende dag ble cellene inkubert i 2 timer i DMEM inneholdende 0,5 mg/ml DEAE-dekstran, 0,1 mM klorokin og 5-10 ^g plasmid-DNA. Cellene ble deretter behandlet med 10 % DMSO i fosfatbufret saltvann i 1 minutt, vasket med medium og inkubert i DMEM inneholdende 10 % kalvefosterserum som tidligere var behandlet med diisopropylfluorfosfat (DFP) for å inaktivere endogen, bovin serum-PAF-AH. Etter 3 dagers inkubasjon ble media fra transfekterte celler analysert for PAF-AH-aktivitet. Analyser ble utført i nærvær og fravær av enten 10 mM EDTA eller 1 mM DFP for å bestemme hvorvidt det rekombinante enzym var kalsiumuavhengig, og ble inhibert av serine-steraseinhibitoren DFP, som tidligere beskrevet for plasma-PAF-AH av Stafforini et al. (1987), supra. Negative kontroller inkluderte celler transfektert med pRc/CMV som enten manglet en innføyelse eller som inneholdt sAH 406-3-innføyelsen i motsatt orientering. ;PAF-AH-aktivitet i transfektante supernatanter ble bestemt ved hjelp av metoden ifølge Stafforini et al. ;(1990), supra, med de følgende modifikasjoner. Kort beskrevet ble PAF-AH-aktivitet bestemt ved å måle hydrolysen av 3H-acetat fra [acetyl-3H] PAF (New England Nuclear, Boston, MA) . Det vandige, frie <3>H-acetat ble separert fra merket substrat ved hjelp av reversfase-kolonnekromatografi over oktadecylkiselgelpatroner (Baker Research Products, Phillipsburg, PA). Analyser ble utført ved anvendelse av ;10 ul transfektantsupernatant i 0,1 M HEPES-buffer, pH 7,2, ;i et reaksjonsvolum på 50 |il. Totalt 50 pmol substrat ble anvendt pr. reaksjon med et forhold på 1:5 mellom merket og umerket PAF. Reaksjonsblandingene ble inkubert i 30 minutter ved 37 °C, og reaksjonene ble stanset ved tilsetning av 40 \ il 10 M eddiksyre. Løsningen ble deretter vasket gjennom okta-decylkiselgelpatronene, som deretter ble skylt med 0,1 M natriumacetat. Det vandige eluat fra hver prøve ble oppsamlet og tellet i en væskescintillasjonsteller i 1 minutt. Enzymaktivitet ble uttrykt i tellinger pr. minutt. ;Som vist i figur 2, inneholdt media fra celler transfektert med sAH 406-3 PAF-AH-aktivitet på nivåer som var fire ganger høyere enn bakgrunnen. Denne aktivitet var upåvirket av tilstedeværelse av EDTA, men ble utslettet med 1 mM DFP. Disse observasjoner viser at klon sAH 406-3 koder for en aktivitet som er overensstemmende med det humane plasmaenzym PAF-AH. ;Eksempel 8 ;Uforkortede og forskjellige trunkerte, humane plasma-PAF-AH-DNA og et kimært mus-humant PAF-AH-DNA ble uttrykt i E. coli og gjær, og stabilt uttrykt i pattedyrceller ved hjelp av rekombinante metoder. ;A. Ekspresjon i E . coli ;PCR ble anvendt for å danne et proteinkodings-fragment av humant p1asma-PAF-AH-cDNA fra klon sAH 406-3 som lett kunne subklones i en E. coli-ekspresjonsvektor. Det subklonede segment startet ved 5<1->enden av det humane gen med kodonet som koder for Ile42 (SEKV.ID. NR. 8), den N-terminale rest av enzymet renset fra humant plasma. Resten av genet, gjennom det native termineringskodon, ble inkludert i konstruksjonen. Den anvendte 5'-sense-PCR-primer var: og inneholdt et Xbal-kloningssete, så vel som et transla-sjonsinitieringskodon (understreket). Den anvendte 3'-anti-senseprimer var: ;og omfattet termineringskodonet for sAH 406-3, og inneholdt et EcoRV-kloningssete. PCR-reaksjoner ble utført vesentlig som beskrevet i eksempel 3. Det resulterende PCR-produkt ble spaltet med Xbal og EcoRV og subklonet i en pBR322-vektor inneholdende Trp-promotoren [deBoer et al., PNAS, 80:21-25 ;(1983)] umiddelbart oppstrøms for kloningssetet. E. coli-stamme XL-1 Blue ble transformert med ekspresjonskonstruksjonen og dyrket i L-næringsløsning inneholdende 100 g/ml karbenicillin. Transformanter fra kulturer dyrket over natten ble pelletert og resuspendert i lysebuffer inneholdende 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA, 100 ^g/ml lysozym og 0,05 trypsin-inhiberende enheter (TIU)/ml aprotinin. Etter inkubasjon i 1 time på is og sonikering i 2 minutter ble lysatene analysert for PAF-AH-aktivitet ved hjelp av metoden beskrevet i eksempel 4. E. coli transformert med ekspresjonskonstruksjonen (betegnet trp AH) dannet et produkt med PAF-AH-aktivitet. Se tabell 6 i eksempel 9. ;Konstruksjoner som inkluderte tre ytterligere promotorer, tacJJ-promotoren (deBoer, supra), arabinose (ara)B-promotoren fra Salmonella typhimurium [Horwitz et al., Gene, 14:309-319 (1981)] og bakteriofag-T7-promotoren, ble også anvendt for å drive ekspresjon av humane PAF-AH-sekvenser i E. coli. Konstruksjoner som omfattet Trp-promotoren (pUC trp AH), tacIJ-promotoren (pUC tac AH) og araB-promotoren (pUC ara AH), ble samlet i plasmid pUC19 (New England Biolabs, MA), mens konstruksjonen som omfattet T7-promotoren (pET AH), ble samlet i plasmid pET15B (Novagen, Madison, WI). En konstruksjon inneholdende en hybridpromotor, pHAB/PH bestående av araB-promotoren fusjonert til ribosombindings-setene av T7-promotorområdet, ble også samlet i pET15B. Alle E. coli-konstruksjoner ga PAF-AH-aktivitet innen et område fra 20 til 50 U/ml/OD600 . Denne aktivitet tilsvarte en total rekombinant proteinmasse på > 1 % av den totale mengde celleprotein. ;Det ble også evaluert flere E. coli-ekspresjons-konstruksjoner som produserer PAF-AH med forlengede amino-terminaler. N-terminalen av naturlig plasma-PAF-AH ble identifisert som Ile42 ved hjelp av aminosyresekvensering (eksempel 2). Sekvensen umiddelbart oppstrøms for Ile42 er imidlertid ikke overensstemmende med aminosyrer funnet ved signalsekvensspaltingsseter [det vil si at "-3-1-regelen" ikke er fulgt fordi lysin ikke finnes i posisjon -1; se von Heijne, Nuc. Acids Res., 14:4683-4690 (1986)]. Antakelig blir en mer klassisk signalsekvens (M^A^ eller M^P^) gjenkjent av det cellulære sekresjonssystem, etterfulgt av endo-proteolytisk spalting. Hele kodingssekvensen for PAF-AH, som starter ved det innledende metionin (nukleotider 162-1487 av SEKV.ID. NR. 7), ble utformet for ekspresjon i E. coli ved anvendelse av trp-promotoren. Som vist i tabell 4, dannet denne konstruksjon aktiv PAF-AH, men ekspresjonen var ca. en femtiendedel av nivået av den opprinnelige konstruksjon, som starter ved Ile42. En annen ekspresjonskonstruksjon, som starter ved Val18 (nukleotider 213-1487 av SEKV.ID. NR. 7), produserte aktiv PAF-AH ved ca. en tredjedel av nivået av den opprinnelige konstruksjon. Disse resultater antyder at aminoterminale endeforlengelser ikke er kritiske eller nødvendige for aktivitet av rekombinant PAF-AH produsert i E. coli. ;;Trunkerte, rekombinante, humane PAF-AH-produkter ble også produsert i E. coli ved anvendelse av et plasmid med lavt kopiantall og en promotor som kan induseres ved tilsetning av arabinose til kulturen. Et slikt N-terminalt, trunkert PAF-AH-produkt er det rekombinante ekspresjonsprodukt fra DNA som koder for aminosyrerester Met46-Asn441 av polypeptidet som kodes for av uforkortet PAF-AH-cDNA (SEKV.ID. NR. 8), og er betegnet rpH.2. Plasmidet anvendt for produksjon av rpH.2 i bakterieceller var pBAR2/PH.2, et pBR322-basert plasmid som inneholder (1) nukleotider 297-1487 av SEKV.ID. NR. 7 som koder for human PAF-AH med start med metioninkodonet i posisjon 46, (2) araB-C-promotorene og araC-genet fra arabinoseoperonet i Salmonella typhimurium, (3) en transkripsjonstermineringssekvens fra bakteriofagen T7, og (4) et replikasjonsstartområde fra bakteriofag fl. ;pBAR2/PH.2 inkluderte spesielt de følgende segmenter av DNA: (1) fra det ødelagte Aatll-setet i posisjon 1994 til EcoRI-setet ved nukleotid 6274, vektorsekvens inneholdende et replikasjonsstartområde og gener som koder for resistens mot enten ampicillin eller tetrasyklin avledet fra det bakterielle plasmid pBR322; (2) fra EcoRI-setet i posisjon 6274 til Xbal-setet i posisjon 131, DNA fra Salmonella typhimurium-arabinoseoperonet (Genbank-aksesjonsnumre M11045, M11046, M11047, J01797); (3) fra Xbal-setet i posisjon 131 til Ncol-setet i posisjon 170, DNA inneholdende et ribosombindingssete fra pET-21b (Novagen, Madison, WI); ;(4) fra Ncol-setet i posisjon 170 til Xhol-setet i posisjon 1363, human PAF-AH-cDNA-sekvens; og (5) fra Xhol-setet i posisjon 1363 til det ødelagte Aatll-setet i posisjon 1993, et DNA-fragment fra pET-21B (Novagen) som inneholder en transkripsjonstermineringssekvens fra bakteriofag T7 og et replikasjonsstartområde fra bakteriofag fl. Et annet PAF-AH-produkt, betegnet rPH.9, er det rekombinante ekspresjonsprodukt fra DNA som koder for aminosyrerester Met46-Ile429 av polypeptidet som kodes for av uforkortet PAF-AH-cDNA (SEKV.ID. NR. 8). DNA som koder for rpH.9, ble innføyd i den samme vektor anvendt for produksjon av rPH.2 i bakterieceller. Dette plasmid ble betegnet pBAR2/PH.9 og inkluderte spesifikt de følgende segmenter av DNA: (1) fra det ødelagte Aatll-setet i posisjon 1958 til EcoRI-setet ved nukleotid 623 9 av vektorsekvensen inneholdende et replikasjonsstartområde og gener som koder for resistens mot enten ampicillin eller tetrasyklin avledet fra bakterieplasmidet pBR322; (2) fra EcoRI-setet i posisjon 6239 til Xbal-setet i posisjon 131, DNA fra Salmonella typhimurium-arabinoseoperonet (Genbank-aksesj onsnumre M11045, M11046, M11047, J01797); (3) fra Xbal-setet i posisjon 131 til Ncol-setet i posisjon 170, DNA inneholdende et ribosombindingssete fra pET-21b (Novagen, Madison, WI); (4) fra Ncol-setet i posisjon 170 til Xhol-setet i posisjon 1328, human PAF-AH-cDNA-sekvens; (5) fra Xhol-setet i posisjon 1328 til det ødelagte Aatll-setet i posisjon 1958, et DNA-fragment fra pET-21B (Novagen, Madison, WI) som inneholder en transkripsjonstermineringssekvens fra bakteriofag T7 og et replikasjonsstartområde fra bakteriofag fl. ;Ekspresjon av PAF-AH-produkter i pBAR2/PH.2 og pBAR2/PH.9 er under kontroll av araB-promotoren, som er sterkt hemmet i nærvær av glukose og i fravær av arabinose, men virker som en sterk promotor når L-arabinose tilsettes til kulturer uten glukose. Seleksjon for celler inneholdende plasmider kan oppnås ved tilsetning av enten ampicillin (eller beslektede antibiotika) eller tetrasyklin til kultur-mediet. Mange forskjellige E. coli-stammer kan anvendes som en vert for rekombinant ekspresjon av PAF-AH-produkter, inkludert, men ikke begrenset til, stammer som er proteo-trofe for arabinosemetabolisme, slik som W3110, DH5 , BL21, C600, JM101 og deres derivater, stammer inneholdende mutasjoner som reduserer proteolyse, slik som CAG62 9, KY1429, og stammer som er defekte i deres evne til å nedbryte arabinose, slik som SB7219 og MC1061. Fordelen ved å anvende en stamme som ikke kan nedbryte arabinose, er at induseren (arabinose) for produksjon av PAF-AH ikke oppbrukes i mediet under induksjonsperioden, hvilket resulterer i høyere nivåer av PAF-AH sammenlignet med det som oppnås med stammer som er i stand til å metabolisere arabinose. Ethvert egnet medium og dyrkningsbetingelser kan anvendes for å uttrykke aktive PAF-AH-produkter i forskjellige E. coli-stammer. For eksempel tillater enten rikt medium-formuleringer, slik som LB, EDM2 95 (et M9-basert minimumsmedium supplert med gjærekstrakt og syrehydrolysert kasein), eller "definert" medium, slik som A675, et A-basert minimalt medium innstilt til pH 6,75 med glyserol som karbonkilde og supplert med sporelementer og vitaminer, betydelig produksjon av rPAF-AH-pro<*>dukter. Tetrasyklin inkluderes i mediet for å opprettholde seleksjon av plasmidet.

Plasmidet pBAR2/PH.2 ble transformert i E. coli-stamme MC1061 (ATCC 53338) som inneholder en delesjon av arabinoseoperonet, og derved ikke kan metabolisere arabinose. MC1061 er også en leucinauxotrof og ble dyrket ved hjelp av en satsprosess ved anvendelse av et definert medium inneholdende kasaminosyrer som komplementerer 1euc inmutasj onen.

E. coli MC1061-celler transformert med pBAR2/PH.2 ble dyrket ved 30 °C i satsmedium inneholdende 2 g/l glukose. Glukose har to formål, idet den er en karbonkilde for celle-vekst og en repressor av arabinosepromotoren. Når de satsvise glukosenivåer var uttømt (< 50 mg/l), ble en tilførsel av næringsmiddel (inneholdende 300 g/l glukose) innledet. Næringstilførselen ble økt lineært i 16 timer i en grad som begrenset dannelse av syrebiprodukt. Ved dette punkt ble næringstilførselen endret til medium inneholdende glyserol istedenfor glukose. Samtidig ble 500 g/l L-arabinose tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 5 g/l. Glyseroltilførselen ble holdt ved en konstant tilførsels-hastighet i 22 timer. Cellene ble innhøstet ved anvendelse av hulfiberfiltrering for å konsentrere suspensjonen ca. 10 ganger. Cellepasta ble lagret ved -70 °C. Det ble oppnådd en endelig cellemasse på ca. 80 g/l (OD600 = 50 - 60) med en PAF-AH-aktivitet på 65-70 U/OD/ml, hvilket representerer ca. 10

% av det totale celleprotein. Det endelige dyrkningsvolum på ca. 75 1 inneholdt 50-60 g PAF-AH.

Høynivåproduksjon av rPAF-AH-produkter kan oppnås når pBAR2/PH.2 eller -PH.9 uttrykkes av stamme SB7219 eller MC1061. Andre stammer med svikt i arabinosenedbrytning er egnet for produksjon av celler med høy tetthet. Fortrinnsvis dyrkes cellene under de følgende betingelser. Eksponentielt voksende SB7219;pBAR2/PH.2- og SB7219;pBAR2/PH.9-stammer tilsås i fermentorer inneholdende satsmedium inneholdende 2 g/l glukose. Når glukosen er forbrukt, tilføres tankene en glyserolløsning inneholdende sporelementer, vitaminer, magnesium og ammoniumsalt for å opprettholde sunn ekspo-nentiell vekst. Tankene opprettholdes ved 30 °C, forsynes med luft for å tilføre oksygen og omrøres for å opprettholde nivået av oppløst oksygen høyere enn ca. 15 % metning. Når celletettheten i kulturen er høyere enn 110 g/l (våtcelle-masse) innføres konstant f6ringshastighet, og en bolus-tilsetning av L-arabinose tilføres til kulturen (ca. 0,5 % sluttmengde). Produktdannelse observeres i 16-22 timer. Fra kulturene oppnås typisk 40-50 g/l (tørrcellevekt). Cellene innhøstes ved sentrifugering, lagres ved -70 °C og rPAF-AH-produkt renses for analyse. Det oppnås rutinemessig spesifikke produkt iviteter høyere enn 150 enheter/ml/OD600 .

B. Ekspresjon i gjærceller

Rekombinant, human PAF-AH ble også uttrykt i Saccharomyces cerevisiae. Gjær-ADH2-promotoren ble anvendt for å drive rPAF-AH-ekspresjon og produserte 7 U/ml/OD600 (tabell 5 nedenfor).

C. Ekspresjon av PAF- AH i pattedyrceller

1. Ekspresjon av humane PAF- AH- cDNA- konstruksjoner

Plasmider konstruert for ekspresjon av PAF-AH, med unntak av pSFN/PAFAH.1, benytter en sterk viruspromotor fra cytomegalovirus, et polyadenyleringssete fra det bovine veksthormongen og SV40-repliaksjonsstartområdet for å tillate replikasjon med høyt kopiantall av plasmidet i COS-celler. Plasmider ble elektroporert i celler.

Et første sett av plasmider ble konstruert hvori den 5'-flankerende sekvens (pDCl/PAFAH.1) eller både de 5'-og 3<1->flankerende sekvenser (pDCl/PAFAH.2) av det humane PAF-AH-cDNA var erstattet med flankerende sekvenser fra andre gener kjent for å bli uttrykt i høye nivåer i pattedyrceller. Transfeksjon av disse plasmider i COS-, CHO-eller 293-celler førte til produksjon av PAF-AH på cirka det samme nivå (0,01 enheter/ml eller 2-4 ganger høyere enn bakgrunnen) som nivået anført for klon sAH 406-3 i eksempel 7 etter kortvarig transfeksjon av COS-celler. Et annet plasmid ble konstruert som inkluderte en Friend-milt-fokus-dannende viruspromotor istedenfor cytomegaloviruspromotoren. Det humane PAF-AH-cDNA ble innføyd i plasmid pmH-neo [Hahn et al., Gene, 127:267 (1993)] under kontroll av den Friend-milt-fokusdannende viruspromotor. Transfeksjon av myelom-cellelinjen NSO med plasmidet som ble betegnet pSFN/PAFAH.l og screening av flere hundre kloner resulterte i isolering av to transfektanter (4B11 og 1C11) som utgjorde 0,15-0,5 enheter/ml PAF-AH-aktivitet. Dersom det antas en spesifikk aktivitet på 5000 enheter/mg, tilsvarer produktiviteten av disse to NSO-transfektanter ca. 0,1 mg/l.

2. Ekspresjon av mus- humane, kimære PAF- AH- gen-konstruksj oner

En konstruksjon (pRc/MS9) inneholdende den cDNA-kodende muse-PAF-AH i pattedyrekspresjonsvektoren pRc/CMV resulterte i produksjon av utskilt PAF-AH på nivået 5-10 enheter/ml (1000 ganger høyere enn bakgrunnen) etter transfeksjon i COS-celler. Antas det at den spesifikke aktivitet av muse-PAF-AH er cirka den samme som aktiviteten av det humane enzym, blir derfor muse-cDNA uttrykt ved et 500-1000 ganger høyere nivå enn det humane PAF-AH-cDNA.

For å undersøke forskjellen mellom ekspresjons-nivåene av human og muse-PAF-AH i COS-celler ble to mus-humane, kimære gener konstruert og testet for ekspresjon i COS-celler. Den første av disse konstruksjoner, pRc/PH.MHCl, inneholder kodingssekvensen for de N-terminale 97 aminosyrer i muse-PAF-AH-polypeptidet (SEKV.ID. NR. 21) fusjonert med de C-terminale 343 aminosyre i human PAF-AH i ekspresjons-vektoren pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA). Det andre kimære gen, i plasmid pRc/PH.MHC2, inneholder kodingssekvensen for de N-terminale 40 aminosyrer i muse-PAF-AH-polypeptidet fusjonert med de C-terminale 400 rester i human PAF-AH i pRc/CMV. Transfeksjon av COS-celler med pRc/PH.MHCl førte til akkumulering av 1-2 enheter/ml PAF-AH-aktivitet i mediet. Kondisjonert medium avledet fra celler transfektert med pRc/PH.MHC2 ble funnet å inneholde kun 0,01 enheter/ml PAF-AH-aktivitet. Fra disse eksperimenter synes det som om forskjellen i ekspresjonsnivå mellom muse- og humane PAF-AH-gener i det minste delvis skyldes polypeptidsegmentet mellom restene 40 og 97, eller det tilsvarende RNA- eller DNA-segment som koder for dette området av PAF-AH-proteinet.

3. Rekoding av de første 290 bp av PAF- AH-kodingssekvensen

En hypotese for det lave nivået av human PAF-AH syntetisert i transfekterte pattedyrceller er at de anvendte kodoner av det naturlige gen er suboptimale for effektiv ekspresjon. Det er imidlertid ikke sannsynlig at kodon-anvendelse kan forklare 500-1000 gangers forskjell i ekspresjonsnivåer mellom musegener og humane gener, fordi optimalisering av kodoner generelt høyst har kun en 10 gangers effekt på ekspresjon. En andre hypotese for å forklare forskjellen mellom muse- og humane PAF-AH-ekspresjonsnivåer er at det humane PAF-AH-mRNA i 5'-kodingsområdet danner en sekundær struktur som enten fører til forholdsvis hurtig nedbrytning av mRNA eller forårsaker ineffektiv transla-sjonsinitiering eller forlengelse.

For å teste disse hypoteser ble det konstruert et syntetisk fragment som koder for det autentiske humane PAF-AH-protein fra aminoterminalen til rest 96, men hvori de fleste av kodonene er blitt erstattet ("rekodet") med et kodon med en forskjellig sekvens, men som koder for den samme aminosyre. Endring av det andre kodon fra GTG til GTA resulterte i dannelse av et Asp718-sete som var i én ende av det syntetiske fragment, og som er til stede i muse-cDNA. Den andre enden av fragmentet inneholdt BamHI-setet, som vanligvis finnes på kodon 97 i det humane gen. Det ca. 290 bp Asp718/BamHI-fragment var avledet fra et PCR-fragment som ble dannet ved anvendelse av den dobbelt asymmetriske PCR-metode for konstruksjon av syntetiske gener, beskrevet av Sandhu et al., Biotechniques, 12:14-16 (1992). Det syntetiske Asp718/BamHI-fragment ble ligert med DNA-fragmenter som koder for resten av det humane PAF-AH-molekyl med start med nukleotid 453 i SEKV.ID. NR. 7, slik at en sekvens som koder for autentisk humant PAF-AH-enzym ble innføyd i pattedyrekspresjonsvektoren pRc/CMV (Invitrogen, San Diego) for å danne plasmid pRc/HPH.4. Den komplette sekvens av det rekodede gen er vist i SEKV.ID. NR. 30. Den 5'-flankerende sekvens som er tilgrensende den humane PAF-AH-kodende sekvens i pRc/HPH.4, er fra sekvensen av et muse-cDNA som koder for PAF-AH i pRc/MS9 (nukleotider 1-116 i SEKV.ID. NR. 21).

For å teste ekspresjon av human PAF-AH fra pRc/HPH.4 ble COS-celler kortvarig transfektert med pRc/HPH.4 (rekodet humant gen), pRc/MS9 (muse-PAF-AH) eller pRc/PH.MHCl (mus-human hybrid 1). Det kondisjonerte medium fra de transfekterte celler ble testet for PAF-AH-aktivitet og funnet å inneholde 5,7 enheter/ml (musegen), 0,9 enheter/ml (mus-human hybrid 1) eller 2,6 enheter/ml (rekodet humant gen). Strategien for rekoding av de første 290 bp av kodingssekvensen for human PAF-AH var således vellykket for å øke ekspresjonsnivåer av human PAF-AH fra noen få nanogram/ml til ca. 0,5 mikrogram/ml i en kortvarig COS-celletransfeksjon. Det rekodede PAF-AH-gen fra pRc/HPH.4 vil bli innføyd i en pattedyrekspresjonsvektor inneholdende dihydrofolatreduktase(DHFR)genet, og DHFR-negative ovarie-celler fra kinesisk hamster vil bli transfektert med vektoren. De transfekterte celler vil underkastes meto-trexatseleksjon for å oppnå kloner som danner høye nivåer av human PAF-AH på grunn av genamplifikasjon.

Eksempel 9

Rekombinant, humant plasma-PAF-AH (start ved Ile42) uttrykt i E. coli ble renset til ett enkelt Coomassie-farget SDS-PAGE-bånd ved hjelp av forskjellige metoder og analysert for aktiviteter oppvist av det native PAF-AH-enzym.

A. Rensing av rekombinant PAF- AH

Den første anvendte rensingsprosedyre er lignende den beskrevet i eksempel 1 for nativ PAF-AH. De følgende trinn ble utført ved 4 °C. Pelleter fra 50 ml PAF-AH-produ-serende E. coli (transformert med ekspresjonskonstruksjon trp AH) ble lysert som beskrevet i eksempel 8. Faste materialer ble fjernet ved sentrifugering ved 10 000 g i 20 minutter. Supernatanten ble applisert ved 0,8 ml/minutt på en Blue Sepharose Fast Flow-kolonne (2,5 cm x 4 cm; 20 ml materialvolum) ekvilibrert i buffer D (25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M NaCl, pH 7,5). Kolonnen ble vasket med 100 ml buffer D og eluert med 100 ml buffer A inneholdende 0,5 M KSCN ved 3,2 ml/minutt. En 15 ml aktiv fraksjon ble applisert på en 1 ml Cu-chelaterende Sepharose-kolonne ekvilibrert i buffer D. Kolonnen ble vasket med 5 ml buffer D, etterfulgt av eluering med 5 ml buffer D inneholdende 100 mM imidazol, med gravitasjonsstrømning. Fraksjoner inneholdende PAF-AH-aktivitet ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE.

Resultatene fra rensingen er vist i tabell 6, hvori én enhet tilsvarer mol PAF-hydrolyse pr. time. Det oppnådde rensingsprodukt ved 4 °C fremkom på SDS-PAGE som ett enkelt intenst bånd under 43 kDa-markøren, med noe diffus farging direkte over og under båndet. Det rekombinante materialet er betydelig mer rent og oppviser høyere spesifikk aktivitet sammenlignet med PAF-AH-preparater fra plasma, som beskrevet i eksempel 1.

Når den samme rensingsprotokoll ble utført ved omgivelsestemperatur, ble det i tillegg til båndet under 43 kDa-markøren observert en gruppe bånd under 29 kDa-markøren som korrelerte med PAF-AH-aktivitet i analyserte gelbiter. Disse bånd med lavere molekylvekt kan være proteo-lytiske fragmenter av PAF-AH som bibeholder enzymatisk aktivitet.

En forskjellig rensingsprosedyre ble også utført ved omgivelsestemperatur. Pelleter (100 g) av PAF-AH-produ-serende E. coli (transformert med ekspresjonskonstruksjonen pUC trp AH) ble resuspendert i 200 ml lysebuffer, 25 mM Tris, 20 mM CHAPS, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 g/ml benz-amidin, pH 7,5) og lysert ved passering tre ganger gjennom et mikrofluidiseringsapparat ved 1054,5 kg/cm<2>. Faste materialer ble fjernet ved sentrifugering ved 14 300 x g i 1 time. Supernatanten ble fortynnet 10 ganger i fortynningsbuffer [25 mM MES (2-[N-morfolino]etansulfonsyre), 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA, pH 4,9] og applisert ved 25 ml/minutt på en S-Sepharose Fast Flow-kolonne (200 ml) (en kationebytterkolonne) ekvilibrert i buffer E (25 mM MES 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH 5,5). Kolonnen ble vasket med 1 1 buffer E, eluert med 1 M NaCl, og eluatet ble oppsamlet i 50 ml fraksjoner og justert til pH 7,5 med 0,5 ml 2 M Tris-base. Fraksjoner inneholdende PAF-AH-aktivitet ble sammenslått og justert til 0,5 M NaCl. S-porsjonen ble applisert ved 1 ml/minutt på en Blue Sepharose Fast Flow-kolonne (2,5 cm x 4 cm; 20 ml) ekvilibrert i buffer F (25 mM Tris, 10 mM CHAPS, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5). Kolonnen ble vasket med 100 ml buffer F og eluert med 100 ml buffer F inneholdende 3 M NaCl ved 4 ml/minutt. Blue Sepharose Fast Flow-kromatografitrinnet ble deretter gjentatt for å redusere endotoksinnivåer i prøven. Fraksjoner inneholdende PAF-AH-aktivitet ble sammenslått og dialysert mot buffer G (25 mM Tris, pH 7,5, 0,5 M NaCl, 0,1 % Tween 80, 1 mM EDTA).

Resultatene av rensingen er vist i tabell 7, hvori én enhet er lik mol PAF-hydrolyse pr. time.

Det oppnådde rensingsprodukt viste seg ved SDS-PAGE som ett enkelt intenst bånd under 43 kDa-markøren, med noe diffus farging direkte over og under båndet. Det rekombinante materialet er betydelig mer rent og oppviser høyere spesifikk aktivitet sammenlignet med PAF-AH-preparater fra plasma, som beskrevet i eksempel 1.

En ytterligere rensingsprosedyre ifølge oppfinnelsen involverer cellelyse, klaring og første kolonnetrinn. Celler fortynnes 1:1 i lysebuffer (25 mM Tris, pH 7,5,

150 mM NaCl, 1 % Tween 80, 2 mM EDTA). Lysis utføres i et avkjølt mikrofluidiseringsapparat ved 1054,5-1406 kg/cm<2> med tre passeringer av materialet for å gi > 99 % cellenedbryt-ning. Lysatet fortynnes 1:20 i fortynningsbuffer (25 mM Tris, pH 8,5, 1 mM EDTA) og appliseres på en kolonne pakket med Q-Sepharose Big Bead-kromatografimedium (Pharmacia) og ekvilibreres i 25 mM Tris, pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,015 % Tween 80. Eluatet fortynnes 1:10 i 25 mM 'MES, pH 5,5, 1,2 M ammoniumsulfat, 1 mM EDTA, og appliseres på butyl-Sepharose-kromatografimedium (Pharmacia) ekvilibrert i den samme buffer. PAF-AH-aktivitet elueres i 25 mM MES, pH 5,5, 0,1 % Tween 80, 1 mM EDTA.

En ytterligere metode ifølge oppfinnelsen for rensing av enzymatisk aktiv PAF-AH fra E. coli inkluderer trinnene: (a) preparering av en E. coli-ekstrakt som gir oppløst PAF-AH-supernatant etter lyse i en buffer inneholdende CHAPS; (b) fortynning av supernatanten og applisering på en anionebytterkolonne ekvilibrert ved ca. pH 8,0; (c) eluering av PAF-AH-enzym fra anionebytterkolonnen;

(d) applisering det justerte eluat fra anionebytterkolonnen på en blåfargeligandaffinitetskolonne; (e) eluering av blåfargeligandaffinitetskolonnen ved anvendelse av en buffer som omfatter 3,0 M salt; (f) fortynning av blåfargeeluatet i en egnet buffer for utførelse av hydroksylapatittkromato-graf i; (g) utførelse av hydroksylapatittkromatografi der vask og eluering utføres ved anvendelse av buffere (med eller uten CHAPS; (h) fortynning av hydroksylapatitteluatet til en egnet saltkonsentrasjon for kationebytterkromato-graf i; (i) applisering av det fortynnede hydroksylapatitteluat på en kationebytterkolonne ved en pH som varierer

mellom ca. 6,0 og 7,0; (j) eluering av PAF-AH fra kationebytterkolonnen med en egnet formuleringsbuffer; (k) utførelse av kationebytterkromatografi i kald tilstand; og (1) formulering av PAF-AH i flytende eller frossen form i fravær av CHAPS.

I trinn (a) ovenfor er lysebufferen fortrinnsvis 25 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM CHAPS, pH 8,0; i trinn (b) er fortynningen av supernatanten for anionebytter-kromatografi 3-4 ganger i 25 mM Tris, 1 mM EDTA, 10 mM CHAPS, pH 8,0, og kolonnen er en Q-Sepharose-kolonne ekvilibrert med 25 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8,0; i trinn (c) elueres anionebytterkolonnen ved anvendelse av 25 mM Tris, 1 mM EDTA, 350 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8,0; i trinn (d) appliseres eluatet fra trinn (c) direkte på en blåfargeaffinitetskolonne; i trinn (e) elueres kolonnen med 3 M NaCl, 10 mM CHAPS, 25 mM Tris, pH 8,0-buffer; i trinn (f) utføres fortynning av blåfargeeluatet for hydroksylapatittkromatografi ved fortynning i 10 mM natriumfosfat, 100 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 6,2; i trinn (g) utføres hydroksylapatittkromatografi ved anvendelse av en hydroksylapatittkolonne ekvilibrert med 10 mM natriumfosfat, 100 mM NaCl, 10 mM CHAPS, og elueringen utføres ved anvendelse av 50 mM natriumfosfat, 100 mM NaCl (med eller uten 10 mM CHAPS), pH 7,5; i trinn (h) utføres fortynning av hydroksylapatitteluatet for kationebytterkromatografi ved fortynning i en buffer ved en pH som varierer fra ca. 6,0 til 7,0, og som omfatter natriumfosfat (med eller uten CHAPS); i trinn (i) ekvilibreres en S-Sepharose-kolonne med 50 mM natriumfosfat (med eller uten 10 mM CHAPS), pH 6,8; i trinn (j) utføres eluering med en passende formulerings-buf f er, slik som kaliumfosfat, 50 mM, 12,5 mM asparaginsyre, 125 mM NaCl, pH 7,5, inneholdende 0,01 % Tween 80; og i trinn (k) utføres kationebytterkromatografi ved 2-8 °C. Eksempler på egnede formuleringsbuffere for anvendelse i trinn (1) som stabiliserer PAF-AH, inkluderer 50 mM kaliumfosfat, 12,5 mM asparaginsyre, 125 mM NaCl, pH 7,4 (tilnærmet, med og uten tilsetning av Tween 80 og/eller Pluronic F68) eller 25 mM kaliumfosfatbuffer inneholdende

(minst) 125 mM NaCl, 25 mM arginin og 0,1 % Tween 80 (med eller uten Pluronic F68 ved ca. 0,1 og 0,5 %).

B. Aktivitet av rekombinant PAF- AH

Den mest bemerkelsesverdige egenskap hos PAF-acetylhydrolase er dens markerte spesifisitet for substrater med en kort rest i sn-2-posisjonen i substratet. Denne strenge spesifisitet skiller PAF-acetylhydrolase fra andre former for PLA2. For således å bestemme hvorvidt rekombinant PAF-AH nedbryter fosfolipider med langkjedede fettsyrer i sn-2-posisjonen ble hydrolyse av l-palmitoyl-2-arakidonyl-sn-glysero-3-fosfokolin (arakidonoylPC) undersøkt, fordi dette er det foretrukne substrat for en velkarakterisert form for PLA2. Som forutsagt fra tidligere undersøkelser med nativ PAF-AH, ble dette fosfolipid ikke hydrolysert når det ble inkubert med rekombinant PAF-AH. I ytterligere eksperimenter ble arakidonoylPC inkludert i en standard PAF-hydrolyseanalyse i konsentrasjoner fra 0 til 125 M for å bestemme hvorvidt det inhiberte hydrolysen av PAF ved hjelp av rekombinant PAF-AH. Det var ingen inhibering av PAF-hydrolyse, selv i den høyeste konsentrasjon av PAF-AH, som var 5 ganger høyere enn konsentrasjonen av PAF. Rekombinant PAF-AH oppviser således den samme substratselektivitet som det native enzym; langkjedede substrater blir ikke gjenkjent. Rekombinant PAF-AH-enzym ga dessuten hurtig nedbrytning av et oksidert fosfolipid (glutaroylPC) som hadde gjennomgått oksidativ spalting av sn-2-fettsyren. Nativ plasma-PAF-AH har flere andre egenskaper som skiller den fra andre fosfolipaser, inkludert kalsiumuavhengighet og resistens mot forbindelser som modifiserer sulfhydrylgrupper eller nedbryter disulfider.

Både de native og rekombinante plasma-PAF-AH-enzymer er sensitive overfor DFP, hvilket indikerer at et

serin utgjør en del av deres aktive seter. Et uvanlig trekk ved den native plasma-PAF-acetylhydrolase er at den er tett forbundet med lipoproteiner i sirkulasjon, og dens katalytiske effektivitet påvirkes av lipoproteinmiljøet. Når rekombinant PAF-AH ifølge oppfinnelsen ble inkubert med humant plasma (på forhånd behandlet med DFP for å oppheve den endogene enzymaktivitet), assosierte den med lav- og høydensi-

tetslipoproteiner på samme måte som den native aktivitet. Dette resultat er signifikant fordi det foreligger vesentlige bevis for at modifikasjon av lavdensitetslipo-proteiner er essensiell for kolesteroldeponeringen observert i ateromer, og at oksidasjon av lipider er en initierende faktor i denne prosess. PAF-AH beskytter lavdensitetslipo-proteiner mot modifikasjon under oksiderende betingelser in vitro, og kan ha en slik rolle in vivo. Administrering av PAF-AH blir således indikert for undertrykkelse av oksida-sjonen av lipoproteiner i aterosklerotiske plakker, så vel som å fjerne inflammasjon.

Alle disse resultater bekrefter at cDNA-klonen sAH 406-3 koder for et protein med de samme aktiviteter som den humane plasma PAF-acetylhydrolase.

Eksempel 10

Forskjellige andre rekombinante PAF-AH-produkter ble uttrykt i E. coli. Produktene inkluderte PAF-AH-analoger med enkle aminosyremutasjoner, og PAF-AH-fragmenter.

A. PAF- AH- aminosyresubstitusjonsprodukter

PAF-AH er en lipase fordi den hydrolyserer fosfo-lipidet PAF. Selv om det ikke eksisterer noen åpenbar total likhet mellom PAF-AH og andre karakteriserte lipaser, er det funnet konserverte rester ved sammenligninger mellom strukturelt karakteriserte lipaser. Et serin er blitt identifisert som et medlem av det aktive setet. Serinet, sammen med en aspartatrest og en histidinrest, danner en katalytisk triade som representerer lipasens aktive sete. De tre rester er ikke tilgrensende i den primære proteinsekvens, men strukturelle undersøkelser har vist at de tre rester er tilgrensende i det tredimensjonale rom. Sammenligninger mellom strukturer av pattedyrlipaser antyder at aspartat-resten generelt er beliggende 24 aminosyrer C-terminalt for det aktive seteserin. I tillegg til dette ligger histidinet vanligvis 109-111 aminosyrer C-terminalt for det aktive seteserin.

Ved setedirigert mutagenese og PCR ble individuelle kodoner i den humane PAF-AH-kodingssekvens modifisert for å kode for alaninrester og ble uttrykt i E. coli. Som vist i tabell 8, hvor f.eks. forkortelsen "S108A" indikerer at serinresten i posisjon 108 ble endret til alanin, øde-legger punktmutasjoner av Ser273 , A<sp>296 eller His351 fullstendig PAF-AH-aktivitet. Distansene mellom aktivt sete-rester er lignende for PAF-AH (Ser til Asp, 23 aminosyrer;

Ser til His, 78 aminosyrer) og andre lipaser. Disse eksperimenter viser at Ser273 , As<p>296 og His351 er kritiske rester for aktivitet, og er derfor sannsynligvis kandidater for katalytiske triaderester. Cysteiner er ofte kritiske for den funksjonelle integritet av proteiner på grunn av deres kapasitet til å danne disulfidbindinger. Plasma-PAF-AH-enzymet inneholder fem cysteiner. For å bestemme hvorvidt noen av de fem er kritiske for enzymaktivitet ble hvert cystein mutert individuelt til serin, og de resulterende mutanter ble uttrykt i E. coli. Preliminære aktivitets-resultater ved anvendelse av delvis rensede preparater av disse rekombinant produserte mutanter er vist nedenfor i den andre kolonnen i tabell 8, mens resultater ved anvendelse av mer rensede preparater er vist nedenfor i den tredje kolonnen i tabell 8. Dataene viser at alle cysteinmutantene hadde hovedsakelig ekvivalent aktivitet, slik at ingen av cysteinene synes å være nødvendige for PAF-AH-aktivitet. Andre punktmutasjoner hadde også liten eller ingen effekt på PAF-AH-katalytisk aktivitet. I tabell 8 representerer "++++" vi 11 type-PAF-AH-aktivi tet på ca. 40-60 U/ml/OD600 , "+++" representerer ca. 20-40 U/ml/OD600 aktivitet, "++" representerer ca. 10-20 U/ml/OD600 aktivitet, " + " representerer 1-10 U/ml/OD600 aktivitet, og "-" representerer < 1 U/ml/OD600 aktivitet.

B. PAF- AH- f ragmentprodukter

C-terminale delesjoner ble preparert ved spalting av 3'-enden av PAF-AH-kodingssekvensen med exonnuklease III i forskjellig tid, og deretter ligering av den forkortede kodingssekvens til plasmid-DNA-kodingsstoppkodoner i alle tre leserammer. Ti forskjellige delesjonskonstruksjoner ble karakterisert ved hjelp av DNA-sekvensanalyse, proteinekspresjon og PAF-AH-aktivitet. Fjerning av 21-30 C-terminale aminosyrer reduserte katalytisk aktivitet i høy grad, og fjerning av 52 rester utslettet fullstendig aktiviteten. Se figur 3.

Lignende delesjoner ble utført ved den aminoterminale ende av PAF-AH. Fusjoner av PAF-AH med E. coli-tio-redoksin ved N-terminalen ble preparert for å lette konse-kvent høynivåekspresjon av PAF-AH-aktivitet [LaVallie et al., Bio/technology, 11:187-193 (1993)]. Fjerning av 19 aminosyrer fra den naturlig bearbeidede N-terminal (Ile42) reduserte aktiviteten med 99 %, mens fjerning av 26 aminosyrer destruerte fullstendig enzymatisk aktivitet i fusjons-proteinet. Se figur 3. Delesjon av 12 aminosyrer synes å forhøye enzymaktivitet ca. fire ganger.

Ved etterfølgende rensinger av PAF-AH fra friskt, humant plasma ved en metode lignende den beskrevet i eksempel 1 (Microcon 30-filter fra Amicon ble anvendt for å konsentrere Blue Sepharose-eluat istedenfor en Cu-kolonne), ble det identifisert to N-terminaler i tillegg til Ile42, Ser35 og Lys55. Heterogeniteten kan være den naturlige tilstand av enzymet i plasma, eller den kan fremkomme under rensing.

Det rensede materialet beskrevet ovenfor ble også analysert for glykosylering. Renset nativ PAF-AH ble inkubert i nærvær eller fravær av N-glykanase, et enzym som fjerner N-bundne karbohydrater fra glykoproteiner. De behandlede PAF-AH-prøver ble underkastet elektroforese gjennom en 12 % SDS-polyakrylamidgel og deretter visualisert ved Western-blotting ved anvendelse av kanin-polyklonale antisera. Protein som ikke var behandlet med N-glykanase, migrerte som et diffust bånd på 45-50 kDa, mens proteinet behandlet med glykanasen migrerte som et tett bånd på ca. 44 kDa, hvilket viser at nativ PAF-AH er glykosylert.

N-terminal heterogenitet ble også observert i rensede preparater av rekombinant PAF-AH (Ile42-N-terminal). Disse preparater var en blanding av polypeptider med N-terminaler med start ved Ala47, Ile42 eller det kunstige initieringssetet Met.x tilgrensende Ile42.

1. Innledende sammenligning av PAF- AH- fragmenter

med PAF- AH

I betraktning av den observerte heterogenitet av rekombinant produsert PAF-AH ble andre rekombinante produkter fremstilt og testet for homogenitet etter rekombinant ekspresjon og rensing. Preparatet av de rekombinante ekspresjonsprodukter av pBAR2/PH.2 og pBAR2/PH.9 i E. coli-stamme MC1061 ble analysert på forskjellige tidspunkter under produksjonsfasen av cellefermentering. Delvis rensede prøver av de rekombinante PH.2 og PH.9 fra celler oppsamlet ved tidspunkter som varierte mellom 5 og 22 timer etter induksjon av proteinekspresjon, ble analysert ved hjelp av matriksassistert laserdesorpsjonsioniserings-massespektro-metri (MALDI-MS).

Når PH.2-ekspresjonsvektoren ble benyttet, ble det observert to topper i spekteret for det delvis rensede protein ved en masseverdi forventet for rPAF-AH-protein. To topper ble observert ved alle tidspunkter, og høyere heterogenitet ble observert ved tidspunkter når fermentering er stresset, som indikert ved en akkumulering av acetat og/eller en uttømming av oksygen i mediet. Nøyaktigheten av MALDI-MS-teknikken i dette masseområdet var ca. ± 0,3 %, hvilket er tilnærmet massen av én aminosyre. Den høyere massetopp som ble observert, var overensstemmende med tilstedeværelse av det forventede uforkortede translasjonsprodukt for PH.2-vektoren, minus det translasjonsinitierende metionin som er forventet å bli fjernet etter translasjon. Den lavere massetopp var ca. 1200 atommasser mindre.

Når PH.9-ekspresjonsvektoren ble benyttet, domi-nerte en enkelt topp i spekteret for det delvis rensede protein ved en masseverdi som var forventet for rPAF-AH-protein. Denne enkle topp ble observert ved alle tidspunkter, og ingen økning i heterogenitet ble observert ved forskjellige tidspunkter. Den observerte masse av dette protein var overensstemmende med tilstedeværelse av det forventede uforkortede translasjonsprodukt for PH.9-vektoren minus det innledende metionin.

2. Rensing av PAF- AH- fragmenter Rekombinant uttrykte rPH.2-preparater (ekspresj onsprodukt et av DNA som koder for Met46-Asn441) og rPH9-preparater (ekspresjonsproduktet av DNA som koder for Met46-Ile429) ble renset for ytterligere sammenligning med renset r PAF-AH (ekspresj onsprodukt av DNA som koder for Ile42-Asn441) . rPH.9 ble produsert ved hjelp av E. coli-stamme SB7219 og generelt renset i overensstemmelse med sinkchelat-rensingsprosedyren beskrevet ovenfor, mens rPH.2 ble produsert av E. coli-stamme MC1061 og renset som beskrevet som nedenfor. De transformerte celler ble lysert ved fortynning av cellepastaen med lysebuffer (100 mM suksinat, 100 mM NaCl, 20 mM CHAPS., pH 6,0) . Oppslemmingen ble blandet og lysert ved hjelp av høytrykksnedbrytning. De lyserte celler ble sentrifugert, og supernatanten inneholdende rPH.2 ble beholdt. Den klarede supernatant ble fortynnet fem ganger i 25 mM natriumfosfatbuffer inneholdende 1 mM EDTA, 10 mM CHAPS, pH 7,0. Den fortynnede supernatant ble deretter applisert på Q-Sepharose-kolonnen. Kolonnen ble først vasket med 3 kolonnevolumer 25 mM natriumfosfatbuffer inneholdende 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 7,0 (vask 1), deretter vasket med 10 kolonnevolumer 25 mM Tris-buffer inneholdende 1 mM EDTA, 10 mM CHAPS, pH 8,0 (vask 2), og med 10 kolonnevolumer 25 mM Tris-buffer inneholdende 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8,0 (vask 3). Elueringen ble

utført med 25 mM Tris-buffer inneholdende 1 mM EDTA, 350 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8,0. Q-Sephar'ose-eluatet ble fortynnet tre ganger i 25 mM Tris, 1 mM EDTA, 10 mM CHAPS, pH 8,0, og deretter applisert på en Blue Sepharose-kolonne. Kolonnen ble først vasket med 10 kolonnevolumer 25 mM Tris, 1 mM EDTA, 10 mM CHAPS, pH 8,0. Kolonnen ble deretter vasket med 3 kolonnevolumer 25 mM Tris, 0,5 M NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8,0. Elueringen ble utført med 25 mM Tris, 3,0 M NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8,0. Blue Sepharose-eluatet ble fortynnet fem ganger i 10 mM natriumfosfat, 10 mM CHAPS, pH 6,2, og deretter applisert på kromatografikolonnen. Kolonnen ble vasket med 10 kolonnevolumer 10 mM natriumfosfat, 100 mM NaCl, 0,1 % Pluronic F68, pH 6,2. rPH.2 ble eluert med 120 mM natriumfosfat, 100 mM NaCl, 0,1 % Pluronic F68, pH 7,5. Hydroksyapatitteluatet ble fortynnet seks ganger med 10 mM natriumfosfat, 0,1 % Pluronic F68, pH 6,8. Det fortynnede hydroksyapatitteluat ble justert til pH 6,8 ved anvendelse av 0,5 N ravsyre og deretter applisert på en SP-Sepharose-kolonne. SP-Sepharose-kolonnen ble vasket med 10 kolonnevolumer 50 mM natriumfosfat, 0,1 % Pluronic F68, pH 6,8, og eluert med 50 mM natriumfosfat, 125 mM NaCl, 0,1 % Pluronic F68, pH 7,5. Det eluerte rPH.2 ble formulert med fortynning til en sluttkonsentrasjon på 4 mg/ml i 50 mM natriumfosfat, 125 mM NaCl, 0,15 % Pluronic F68, pH 7,5, og Tween 80 ble

tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,02 % Tween 80. Det formulerte produkt ble deretter filtrert gjennom en 0,2 membran og lagret før anvendelse.

3. Sammenligning av PAF- AH- fragmenter med PAF- AH

ved sekvensering

De rensede rPH.2- og rPH.9-preparater ble sammenlignet med rensede rPAF-AH-preparater ved hjelp av N-terminal sekvensering ved anvendelse av et Applied Biosystems modell 473A-proteinsekvenseringsapparat (Applied Biosystems, Foster City, CA) og ved hjelp av C-terminal sekvensering ved anvendelse av et Hewlett-Packard modell G1009A C-terminal-proteinsekvenseringsapparat. rPH2.preparatet hadde mindre N-terminal heterogenitet sammenlignet med rPAF-AH. Den N-terminale analyse av rPH.9-preparatet var lignende analysen av rPH.2, men mindre C-terminal heterogenitet ble observert for rPH.9-preparatet i forhold til rPH.2.

Det rensede rPH.2-preparat inneholdt en hovedsekvens der N-terminalen var Ala47 (ca. 86-89 %) og en mindre viktig sekvens der N-terminalen var Ala48 (ca. 11-14 %), idet forholdet mellom de to N-terminaler var ganske konstant under forskjellige fermenteringsbetingelser. Det rensede rPH.9-preparat inneholdt også en hovedsekvens der N-terminalen var Ala47 (ca. 83-90 %) og en mindre viktig sekvens der N-terminalen var Ala4B (10-17 %). I motsetning til dette resulterte forsøk i bakterier på å produsere polypeptidet som startet med Ile42 (rPAF-AH) i en varierende blanding av polypeptider med N-terminaler som startet med Ala47 (20-53 %) , Ile42 (8-10 %) eller med det kunstige innledende Met^-metionin (37-72 %) tilgrensende Ile42. For rPH.2 og rPH.9 blir det innledende metionin effektivt fjernet av en aminoterminal peptidase etter bakteriell syntese av polypeptidet og etterlater alaninet i posisjon 47 (eller alaninet i posisjon 48) som den N-terminale rest.

C-terminal sekvensering ble utført på ett parti av rPH.2, som ble observert å ha en hovedsekvens der C-terminalen var HOOC-Asn-Tyr (ca. 80 %), hvilket var overensstemmende med den forutsagte H00C-Asn441-Tyr440-C-terminal av translasjonsproduktet, mens ca. 20 % var HOOC-Leu. Etter at rPH.2-preparatet var blitt fraksjonert ved hjelp av SDS-PAGE, ga ytterligere sekvensering av de primære og sekundære bånd en C-terminal sekvens på HOOC-Leu-Met fra et lavere sekundært bånd (AHL, beskrevet nedenfor i avsnitt B.5), hvilket er overensstemmende med et produkt som er 10 aminosyrer kortere enn det uforkortede translasjonsprodukt, så vel som lave nivåer av HOOC-His. Ytterligere peptidkart-legging har vist at ytterligere C-terminaler er til stede i noen partier av PH.2-protein. C-terminalen av rPH.9 var primært HOOC-Ile-His (ca. 78-91 %, avhengig av partiet) ved direkte sekvensering, hvilket er overensstemmende med den forutsagte HOOC-Ile429-His428-C-terminal av translasjonsproduktet. Det synes å forekomme noe bakgrunn ("støy") i denne teknikk, så lave nivåer av andre sekvenser kan ikke utelukkes.

4. Sammenligning av PAF- AH- fragmenter med PAF- AH

ved hjelp av MALDI- MS

MALDI-MS ble utført på rensede rPH.2- og rPH.9-preparater. rPH.2-spekteret oppviste to topper i spekteret ved en masseverdi forventet for rPAF-AH-produktet (se figur 4) lignende mønsteret observert med det delvis rensede protein i avsnitt B.l ovenfor. Den sekundære topp med lavere molekylvekt var typisk til stede ved ca. 20-30 % av den totale mengde. rPH.9-spekteret viste en dominerende topp ved en masse overensstemmende med den forventede for det uforkortede translasjonsprodukt for rPH.9-vektoren, minus det translasjonsinitierende metionin (se figur 5). En skulder-topp med litt lavere molekylvekt ble også observert for rPH.9, som representerte ca. 5 % av totalen.

5. Sammenligning av PAF- AH- fragmenter med PAF- AH

ved hjelp av SDS- PAGE

Natriumdodecylsulfat-polyakrylamidelektroforese (SDS-PAGE) ble utført på rensede rPAF-AH-, rPH.2- og rPH.9-preparater. Et komplisert mønster av bånd ble observert for rPH.2 rundt det elektroforetiske migrasjonsområdet forventet for rPAF-AH-produktet, basert på proteinmolekylvektstandar-der. I én eller i noen geler ble det observert to dominerende bånd med lett observerbare sekundære bånd over og under det primære bånd. Disse øvre sekundære, midtre primære og lavere sekundære bånd ble henholdsvis betegnet AHUf AHM og AHL. Alle disse bånd reagerte med et anti-rPAF-AH-monoklonalt antistoff på Western blot, og er således blitt identifisert som rPAF-AH-beslektede produkter. Det øvre sekundære bånd, AH,,, økte i intensitet over tiden med lagring av proteinet, og representerer antakeligvis en modifisert form av rPAF-AH-produktet. SDS-PAGE av rPAF-AH-preparatet er lignende det for rPH.2. Det er to hovedbånd som vandrer nær den forventede molekylvekt for rPAF-AH, så vel som et mindre bånd over og en skygge under hovedbåndene. I motsetning til dette fremviste rPH.9 ett enkelt dominerende bånd på SDS-PAGE uten noen synlig splitting. Svake bånd med en litt lavere molekyl vekt og i en forventet dimerposisjon ble også observert. Ingen AH„-lignende bånd ble observert.

Sammensetningen av de rensede rPH.2- og rPH.9-preparater ble også analysert på 2D-geler (isoelektrisk fokusering (IEF) i urea, etterfulgt av SDS-PAGE i den andre dimensjon). For rPH9 viste 2D-gelene 5 hovedflekker separert i IEF-retningen. Ladningsheterogeniteten syntes å være konstant mellom partier av rpH9. I motsetning til dette var 2D-gelmønsteret av rPH.2 mer komplisert fordi det inneholdt ca. 15 flekker separert i IEF- og SDS-PAGE-dimensjonene.

6. Sammenligning av aktivitet av PAF-AH-fragmenter med PAF- AH

Renset rPH.2 og rPH.9 har enzymatisk aktivitet som ikke kan skjelnes fra aktiviteten av endogen PAF-AH renset fra serum, og rPH.2 og rPH.9 bindes til lipoprotein på en lignende måte som renset endogen PAF-AH.

Eksempel 11

En foreløpig analyse av ekspresjonsmønsteret av humant plasma-PAF-AH-mRNA i humane vev ble utført ved hjelp av Northern blot-hybridisering.

RNA ble fremstilt fra human cerebral korteks, hjerte, nyre, placenta, thymus og tonsill ved anvendelse av RNA Stat 60 (Tel-Test "B", Friendswood, TX). RNA ble dessuten fremstilt fra den humane hematopoietiske forløper-lignende cellelinje THP-1 (ATCC TIB 202), som også ble indusert til å differensiere til en makrofaglignende fenotype ved anvendelse av forbolesteren forbolmyristyl-acetat (PMA). Vevs-RNA og RNA fremstilt fra den premyelo-cytiske THP-l-cellelinje før og 1-3 dager etter induksjon ble underkastet elektroforese gjennom en 1,2 % agarose-formaldehydgel og deretter overført til en nitrocellulose-membran. Det uforkortede humane plasma-PAF-AH-cDNA, sAH 406-3, ble merket ved vilkårlig priming og hybridisert til membranen under betingelser identiske med dem beskrevet i eksempel 3 for biblioteksscrening. Innledende resultater indikerer at PAF-AH-proben hybridiserte til et 1,8 kb-bånd i thymus, tonsill og i en mindre grad placenta-RNA.

PAF syntetiseres i hjernen under normale fysiologiske og patofysiologiske betingelser. Gitt molekylets kjente proinflammatoriske og potensielle nevrotoksiske egenskaper vil en mekanisme for lokalisering av PAF-syntese eller for dens hurtige katabolisme forventes å være kritisk for nervevevets helse. Tilstedeværelsen av PAF-acetylhydrolase i nervevev er overensstemmende med at det spiller en slik beskyttende rolle. Det er interessant at både en bovin heterotrimer, intracellulær PAF-AH [kloningen av denne er beskrevet av Hattori et al., J. Biol. Chem., 269(37):23150-23155 (1994)] og PAF-AH ifølge oppfinnelsen er blitt identifisert i hjernen. For å bestemme hvorvidt de to enzymer blir uttrykt i lignende eller forskjellige områder av hjernen ble den humane homolog av det bovine hjerne-intracellulære PAF-AH-cDNA klonet, og dets mRNA-ekspresjonsmønster i hjernen ble sammenlignet ved hjelp av Northern blotting med mRNA-ekspresjonsmønsteret for PAF-AH ifølge oppfinnelsen, ved anvendelse av vesentlig de samme metoder som beskrevet i det foregående avsnitt. Områdene i hjernen som ble undersøkt ved hjelp av Northern blotting, var cerebellum, medulla, ryggmargen, putamen, amygdala, caudate nucleus, thalamus og den oksipitale, frontale og temporale lobe i den cerebrale korteks. Indikasjon på begge enzymer ble påvist i alle disse vev, selv om den heterotrimere intracellulære form forekom mer tallrik enn den utskilte form. Northern blot-analyse av ytterligere vev avslørte videre at den heterotrimere, intracellulære form uttrykkes i mange forskjellige vev og celler, inkludert thymus, prostata, testikkel, ovarie, tynntarm, tykktarm, perifere blodleukocytter, makrofager, hjerne, lever, skjelettmuskel, nyre, pankreas og binyre. Denne ubikvitære ekspresjon antyder at den heterotrimere, intracellulære PAF-AH har en generell husholdningsfunksjon i celler.

Ekspresjonen av PAF-AH-RNA i monocytter isolert fra humant blod og under deres spontane differensiering til makrofager i kultur ble også undersøkt. Lite eller intet RNA ble påvist i friske monocytter, men ekspresjon ble indusert og opprettholdt under differensiering til makrofager. Det var en samtidig akkumulering av PAF-AH-aktivitet i kultur-mediet for de differensierende celler. Ekspresjon av den humane plasma-PAF-AH-transkripsjon ble også observert i THP-1-celle-RNA i 1 dag, men ikke 3 dager, etter induksjon. THP-1-celler uttrykte ikke mRNA for PAF-AH i grunntilstanden.

Eksempel 12

PAF-AH-ekspresjon i menneske- og musevev ble undersøkt ved hybridisering in situ.

Humane vev ble anskaffet fra National Disease Research Interchange og the Cooperative Human Tissue Network. Normal musehjerne og ryggmarg og EAE-trinn-3-museryggmarger ble uttatt fra S/JLJ-mus. Normale S/JLJ-museembryoer ble uttatt fra 11 til 18 dager etter befruktning.

Vevssnittene ble plassert i Tissue Tek II kryo-former (Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL) med en liten mengde OCT-forbindelse (Miles, Inc., Elkhart, IN). De ble sentrert i kryoformen, kryoformen ble fylt med OCT-forbindelse og deretter plassert i en beholder med 2-metyl-butan [C2H5CH (CH3) 2, Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI], og beholderen ble plassert i flytende nitrogen. Når vevet og OCT-forbindelsen i kryoformen var frosset, ble blottene lagret ved -80 °C til de ble snittet. Vevs-blokkene ble snittet med en tykkelse på 6 (im og festet til Vectabond (Veetor Laboratories, Inc., Burlingame, CA) belagte objektglass og lagret ved -70 °C og plassert ved 50 °C i ca. 5 minutter for oppvarming og fjerning av konden-sasjon, og ble deretter fiksert i 4 % paraformaldehyd i 20 minutter ved 4 °C, dehydrert (70 %, 95 %, 100 % etanol) i 1 minutt ved 4 °C i hvert trinn og deretter lufttørket i 30 minutter ved romtemperatur. Snittene ble denaturert i 2 minutter ved 70 °C i 70 % formamid/2 x SSC, skylt to ganger i 2 x SSC, dehydrert og deretter lufttørket i 30 minutter. Vevene ble hybridisert in situ med radiomerket, enkelttrådet mRNA dannet fra DNA avledet fra et internt 1 kb HindiII-fragment av PAF-AH-genet (nukleotider 308-1323 av SEKV.ID. NR. 7) ved in vitro-RNA-transkripsjonsinkorporering av 35S-UTP (Amersham) eller fra DNA avledet fra det heterotrimere, intracellulære PAF-AH-cDNA identifisert av Hattori et al. Probene ble anvendt i forskjellige lengder fra 2 50 til 500 bp. Hybridisering ble utført over natten (12-16 timer) ved 50 °C; de <35>S-merkede riboprober (6 x IO<5> cpm/snitt) , tRNA (0,5 (ig/snitt) og dietylpyrokarbonat (depc)behandlet vann ble tilsatt til hybridiseringsbufferen for å bringe den til en sluttkonsentrasjon på 50 % formamid, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 10 % dekstransulfat, 1 x Denhardts løsning, 100 mM ditiotreitol (DTT) og 5 mM EDTA. Etter hybridisering ble snittene vasket i 1 time ved romtemperatur i 4 x SSC/10 mM DTT, deretter i 40 minutter ved 60 °C i 50 % formamid/1 x SSC/10 mM DTT, i 30 minutter ved romtemperatur i 2 x SSC og i 30 minutter ved romtemperatur i 0,1 x SSC. Snittene ble dehydrert, lufttørket i 2 timer, belagt med Kodak NTB2 fotografisk emulsjon, lufttørket i 2 timer, fremkalt (etter lagring ved 4 °C i fullstendig mørke) og kontrafarget med hematoksylin/eosin.

A. Hj erne

Cerebellum. I både musehjerner og menneskehjerner ble det observert et sterkt signal i Purkinje-cellelaget i cerebellum, i kurvceller og individuelle nevronale cellelegemer i nucleus dentate (én av de fire dype kjerner i cerebellum). Budskap for den heterotrimere, intracellulære PAF-AH ble også observert i disse celletyper. Plasma-PAF-AH-signal ble dessuten observert på individuelle celler i de granulære og molekylære lag av den grå substans.

Hippocampua. I de humane hippocampussnitt viste individuelle celler gjennom hele snittet, som syntes å være nevronale cellelegemer, et sterkt signal. Disse ble identifisert som polymorfe cellelegemer og granulceller. Budskap for den heterotrimere, intracellulære PAF-AH ble også observert i hippocampus.

Hjernestamme. I snitt fra både human og muse-hjernestamme var det et sterkt signal på individuelle celler i den grå substans.

Korteks. I humane kortekssnitt tatt fra de cerebrale, oksipitale og temporale kortekser og i snitt fra hele musehjerner viste individuelle celler gjennom hele korteks et sterkt signal. Disse celler ble identifisert som pyramidale, stjerneformede og polymorfe cellelegemer. Det synes ikke å være differensiering i- ekspresj onsmønsteret i de forskjellige lag av korteks. Disse in situ-hybridi-seringsresultater er forskjellige fra resultatene for cerebral korteks oppnådd ved Northern blotting. Forskjellen resulterer sannsynligvis fra den høyere sensitivitet av in situ-hybridisering sammenlignet med Northern blotting. Som i cerebellum og hippocampus ble det observert et lignende mønster for ekspresjon av den heterotrimere, intracellulære

PAF-AH.

Hypofyse. Et noe svakt signal ble observert på spredte individuelle celler i pars distalis på det humane vevssnitt.

B. Human tykktarm

Både normale tykktarmer og tykktarmer med Crohns sykdom oppviste signal i de lymfatiske aggregater til stede i slimhinnen i snittene, idet signalnivået er litt høyere i snittet fra pasienten med Crohns sykdom. Tykktarmen med Crohns sykdom hadde også et sterkt signal i lamina propria. Et høyt signalnivå ble likeledes observert i et sykdoms-rammet appendikssnitt, mens den normale appendiks oppviste et lavere, men fremdeles påvisbart, signal. Snittene fra pasienten med ulcerativ kolitt viste intet tydelig signal i verken de lymfatiske aggregater eller i lamina propria.

C. Human tonsill og thymus

Et sterkt signal ble observert på spredte grupper av individuelle celler i kimsentrene i tonsillen og i thymus.

D. Human lymfeknute

Sterkt signal ble observert på lymfeknutesnittet tatt fra en normal donor, mens et noe svakt signal ble observert i lymfenodulene på snittet fra en donor med septisk sjokk.

E. Human tynntarm

Både normal tynntarm og tynntarm med Crohns sykdom hadde svakt signal i Peyers flekker og lamina propria i snittene, idet signalet på det sykdomsrammede vev var litt høyere.

F. Human milt og lunge

Det ble ikke observert noe signal på noen av milt-vevene (normalsnitt og snitt med miltabscess) eller lungevev (normalsnitt og snitt med emfysem).

G. Mus e ryggmarg

I både de normale og EAE-trinn-3-ryggmargene var det et sterkt signal i ryggmargens grå substans, idet ekspresjonen er litt høyere i EAE-trinn-3-ryggmargen. I EAE-trinn-3-ryggmargen viste celler i den hvite substans og de perivaskulære mansjetter antakeligvis infiltrerende makrofager og/eller leukocytter, et signal som var fraværende i den normale ryggmarg.

F. Museembryoer

I 11 dager gamle embryoer var det tydelig signal i sentralnervesystemet i den fjerde ventrikkel som forble konstant gjennom embryotidsforløpet etter hvert som det utviklet seg inn i cerebellum og hjernestammen. Etter hvert som embryoene modnet, ble signal tydelig i sentralnervesystemet i ryggmargen (dag 12), primær korteks og ganglion Gasseri (dag 14) og hypofysen (dag 16). Signal ble observert i det perifere nervesystem (med start på dag 14 eller 15) på nerver som går ut fra ryggmargen, og på dag 17 fremkom et sterkt signal rundt embryoets værhår. Ekspresjon ble også observert i leveren og lungen på dag 14, tarmen (med start på dag 15) og i den bakre del av munnen/svelget (med start på dag 16). På dag 18 hadde ekspresjonsmønsteret differen-siert til signal i korteks, bakre hjerne (cerebellum og hjernestamme), nerver som går ut fra lumbalområdet til ryggmargen, den bakre del av munn/svelg, leveren, nyren og muligens et svakt signal i lunge og tarm.

G. Oppsummering

PAF-AH-mRNA-ekspresjon i tonsill, thymus, lymfeknute, Peyers flekker, appendiks og colonlymfatiske aggregater er overensstemmende med konklusjonene at den antakelig dominerende in vivo-kilde for PAF-AH er makrofager, fordi disse vev alle er befolket med vevsmakrofager som tjener som fagocytiske og antigenprosesseringsceller.

Ekspresjon av PAF-AH i inflammerte vev ville være overensstemmende med hypotesen at en av rollene til monocyttavledede makrofager er å redusere inflammasjon. PAF-AH ville forventes å inaktivere PAF og de proinflammatoriske fosfolipider og således nedregulere den inflammatoriske kaskade av hendelser innledet av disse formidlere.

PAF er blitt påvist i hjernevev og utskilles av rottecerebellumgranulceller i kultur. Eksperimenter in vi tro og in vivo har vist at PAF binder en spesifikk reseptor i nervevev og induserer funksjonelle og fenotypiske endringer, slik som kalsiummobilisering, oppregulering av transkrip-sjonsaktiverende gener og differensiering av den neurale forløpercellelinje PC12. Disse observasjoner antydet en fysiologisk rolle for PAF i hjernen, og i overensstemmelse med dette har nylige eksperimenter ved anvendelse av kulturer av hippocampusvevssnitt og PAF-analoger og -antagonister implisert PAF som en viktig retrograd budbringer ved langtidspotensiering av hippocampus. I tillegg til dens patologiske effekt ved inflammasjon synes derfor PAF å delta i rutinemessige nevronale signaleringsprosesser. Ekspresjon av den ekstracellulære PAF-AH i hjernen kan tjene til å regulere varigheten og størrelsen av PAF-formidlet signalering.

Eksempel 13

Monoklonale antistoffer spesifikke for rekombinant, humant plasma-PAF-AH ble dannet ved anvendelse av E. coli-produsert PAF-AH som et immunogen.

Mus nr. 1342 ble injisert på dag 0, dag 19 og dag 40 med rekombinant PAF-AH. Musen ble først injisert med immunogenet i PBS, 4 dager senere ble musen avlivet, og milten ble fjernet sterilt og plassert i 10 ml serumfritt RPMI 1640. En enkeltcellesuspensjon ble dannet ved å gni milten mellom de mattslepne ender av to mikroskopobjektglass neddyppet i serumfritt RPMI 1640, supplert med 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 enheter/ml penicillin og 100 p.g/ml streptomycin (RPMI) (Gibco, Canada) . Cellesuspen-sjonen ble filtrert gjennom 70 mesh Nitex-cellefilter (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) og vasket to ganger ved sentrifugering ved 200 g i 5 minutter og resus-pendering av pelleten i 20 ml serumfritt RPMI. Thymocytter tatt fra tre vanlige Balb/c-mus ble preparert på lignende måte. NS-l-myelomceller, holdt i logfase i RPMI med 10 % bovint fosterserum (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) i 3 dager før fusjon, ble sentrifugert ved 200 g i 5 minutter, og pelleten ble vasket to ganger som beskrevet i det foregående avsnitt.

1 x 10<8> miltceller ble kombinert med 2,0 x 10<7> NS-1-celler, sentrifugert, og supernatanten ble avsugd. Celle-pelleten ble fjernet ved tapping av røret, og 1 ml 37 °C PEG 1500 (50 % i 75 mM Hepes, pH 8,0) (Boehringer Mannheim) ble tilsatt under omrøring i løpet av 1 minutt, etterfulgt av tilsetning av 7 ml serumfritt RPMI i løpet av 7 minutter. Ytterligere 8 ml RPMI ble tilsatt, og cellene ble sentrifugert ved 200 g i 10 minutter. Etter at supernatanten var kastet, ble pelleten resuspendert i 200 ml RPMI inneholdende 15 % FBS, 10 (IM natriumhypoksantin, 0,4 uM aminopterin, 16

\ iM thymidin (HAT) (Gibco) , 25 enheter/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) og 1,5 x IO<6> thymocytter/ml, og utspredt på 10 Corning 96-brønners vevskulturplater med flat bunn (Corning, Corning New York).

På dagene 2, 4 og 6 etter fusjonen ble 100 [ il medium fjernet fra brønnene i fusjonsplatene og erstattet med friskt medium. På dag 8 ble fusjonen screenet ved hjelp av ELISA ved testing for tilstedeværelse av muse-IgG-binding til rekombinant PAF-AH. Immulon 4-plater (Dynatech, Cambridge, MA) ble belagt i 2 timer ved 37 °C med 100 ng/brønn rekombinant PAF-AH fortynnet i 25 mM Tris, pH 7,5. Den overlagte løsning ble avsugd, og 200 ^l/brønn blok-keringsløsning [0,5 % fiskehudgelatin (Sigma) fortynnet i CMF-PBS] ble tilsatt og inkubert i 30 minutter ved 37 °C. Platene ble vasket tre ganger med PBS med 0,05 % Tween 20 (PBST) , og 50 (il kultursupernatant ble tilsatt. Etter inkubasjon ved 37 °C i 30 minutter og vask som angitt ovenfor, ble 50 ji.1 pepperrotperoksidasekonjugert geit-antimus-IgG(fc)

(Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) fortynnet 1:3500 i PBST tilsatt. Platene ble inkubert som angitt ovenfor, vasket fire ganger med PBST, og 100 jil substrat bestående av 1 mg/ml o-fenylendiamin (Sigma) og 0,1 (il/ml 30 % H20 i 100 mM sitrat, pH 4,5, ble tilsatt. Fargereaksjonen ble stanset etter 5 minutter ved tilsetning av 50 \ ll 15 % H2S04. A490 ble avlest på en plateavleser (Dynatech).

Utvalgte fusjonsbrønner ble klonet to ganger ved fortynning i 96-brønners plater og visuell opptelling av antall kolonier/brønn etter 5 dager. Klonede hybridomer var 90D1E, 90E3A, 90E6C, 90G11D (ATCC HB 11724) og 90F2D (ATCC HB 11725).

De monoklonale antistoffer produsert av hybridomer ble isotypebestemt ved anvendelse av Isostrip-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Resultatene viste at de monoklonale antistoffer produsert av hybridomer fra fusjon 90 alle var IgG^

Alle de monoklonale antistoffer produsert av hybridomer fra fusjon 90 funksjonerte godt i ELISA-analyser, men var ikke i stand til å binde PAF-AH på Western blots. For å danne antistoffer som kunne gjenkjenne PAF-AH ved hjelp av Western ble mus nr. 1958 immunisert med rekombinant enzym. Hybridomer ble dannet som beskrevet for fusjon 90, men ble screenet ved hjelp av Western blotting istedenfor ELISA for å identifisere Western-kompetente kloner.

For Western-analyser ble rekombinant PAF-AH blandet med et like stort volum prøvebuffer inneholdende 125 mM Tris, pH 6,8, 4 % SDS, 100 mM ditiotreitol og 0,05 % bromfenolblått, og kokt i 5 minutter før applisering på en 12 % SDS-polyakrylamidgel (Novex). Etter elektroforese ved 40 mAmp ble proteiner elektrooverført på en polyvinyliden-fluoridmembran (Pierce) i 1 time ved 125 V i 192 mM glysin, 25 mM Tris-base, 20 % metanol og 0,01 % SDS. Membranen ble inkubert i 20 mM Tris, 100 mM NaCl (TBS) inneholdende 5 % bovint serumalbumin (BSA, Sigma) over natten ved 4 °C. Blottet ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med kanin-polyklonale antisera fortynnet 1:8000 i TBS inneholdende 5 % BSA, og deretter vasket med TBS og inkubert med alkalisk fosfatasekonjugert geit-antimus-IgG i TBS inneholdende 5 % BSA i 1 time ved romtemperatur. Blottet ble på nytt vasket med TBS og deretter inkubert med 0,02 % 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat og 0,03 % nitroblåtetrazolium i 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl og 5 mM MgCl2. Reaksjonen ble stanset ved gjentatte skyllinger med vann.

Utvalgte fusjonsbrønner, i hvilke supernatantene var positive i Western-analyser, ble bearbeidet som beskrevet ovenfor. Hybridom 143A reagerte med PAF-AH i Western blots og ble klonet (ATCC HBZ 11900).

Polyklonale antisera spesifikke for humant plasma-PAF-AH ble produsert i kaniner ved hjelp av tre månedlige immuniseringer med 100 |ig renset rekombinant enzym i Freunds adj uvans.

Eksempel 14

Eksperimentelle undersøkelser ble utført for å evaluere de terapeutiske effekter in vivo av rekombinant PAF-AH ifølge foreliggende oppfinnelse på akutt inflammasjon, ved anvendelse av en rottefotødemmodell [Henriques et al., Br. J. Pharmacol., 106:579-582 (1992)]. Resultatene fra disse undersøkelser viste at rPAF-AH blokkerer PAF-AH-indusert ødem. Parallelle undersøkelser ble utført for å sammenligne effektiviteten av PAF-AH med to kommersielt tilgjengelige PAF-antagonister.

A. Fremstilling av PAF- AH

E. coli transformert med PAF-AH-ekspresjons-vektoren puc trp AH ble lysert i et mikrofluidiseringsapparat, faste materialer ble sentrifugert fra, og celle-supernatantene ble applisert på en S-Sepharose-kolonne (Pharmacia). Kolonnen ble vasket grundig med buffer bestående av 50 mM NaCl, 10 mM CHAPS, 25 mM MES og 1 mM EDTA, pH 5,5. PAF-AH ble eluert ved å øke NaCl-konsentrasjonen i bufferen til 1 M. Affinitetskromatografi ved anvendelse av en Blue Sepharose-kolonne (Pharmacia) ble deretter anvendt som et ytterligere rensingstrinn. Før applisering av PAF-AH-preparater på Blue Sepharose-kolonnen ble prøven fortynnet 1:2 for å redusere NaCl-konsentrasjonen til 0,5 M, og pH ble justert til 7,5. Etter grundig vask av Blue Sepharose-kolonnen med buffer bestående av 0,5 M NaCl, 25 mM Tris, 10 mM CHAPS og 1 mM EDTA, pH 7,5, ble PAF-AH eluert ved å øke NaCl-konsentrasjonen til 3,0 M.

Renheten av PAF-AH isolert på denne måten var generelt 95 %, som bestemt ved SDS-PAGE, med aktivitet i området 5000-10 000 U/ml. Ytterligere kvalitetskontroller utført på hvert PAF-AH-preparat inkluderte bestemmelse av endotoksinnivåer og hemolyseaktivitet i nypreparerte rotte-erytrocytter. En buffer inneholdende 25 mM Tris, 10 mM CHAPS, 0,5 M NaCl, pH 7,5, funksjonerte både som et lagringsmedium for enzymet og som bærer ved administreringen. Anvendte doser i eksperimentene var basert på enzymaktivitetsanalyser utført umiddelbart før eksperimentene .

B. Induksjon av ødem

6-8 uker gamle Long Evans-hunnrotter (Charles River Wilmington, MA) med vekt på 180-200 g ble anvendt i alle eksperimenter. Før eksperimentelle manipulasjoner ble dyrene anestetisert med en blanding av det anestetiske

middel Ketaset (Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA), Rompun (Miles, Shawnee Mission, KS) og Ace Promazin (Aveco, Fort Dodge, IA), administrert subkutant i en mengde på ca. 2,5 mg Ketaset, 1,6 mg Rompun, 0,2 mg Ace Promazin pr. dyr pr. dose. Ødem ble indusert i foten ved administrering av enten PAF eller zymosan som følger. PAF (Sigma nr. P-1402) ble nypreparert for hvert eksperiment fra en 19,1 mM stamløsning lagret i kloroform/metanol (9:1) ved -20 °C. De nødvendige volumer ble tørket under N2, fortynnet 1:1000 i en buffer inneholdende 150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, og 0,25 % BSA, og sonikert i 5 minutter. Dyrene mottok 50 (il PAF (endelig dose 0,96 nmol) subkutant mellom bakfotputene, og ødem ble vurdert etter 1 time, og på nytt etter 2 timer i noen eksperimenter. Zymosan A (Sigma nr. A-8800) ble nypreparert for hvert eksperiment som en suspensjon av 10 mg/ml i PBS. Dyrene mottok 50 1 zymosan (endelig dose 500 ug) subkutant mellom bakfotputene, og ødem ble vurdert etter 2 timer.

Ødem ble kvantifisert ved å måle fotvolumet umiddelbart før administrering av PAF eller zymosan, og ved et angitt tidspunkt etter administrering av PAF eller zymosan. Ødem er uttrykt som økningen i fotvolum i ml. Volumendrings-målinger ble utført på anestetiserte dyr ved anvendelse av et pletysmometer (UGO Basile, modell nr. 7150) som måler det endrede båndvolum av den nedsenkede fot. For å sikre at fot-nedsenkingen var sammenlignbar fra et tidspunkt til det neste ble bakfoten merket med vannfast blekk der hvor hårlinjen møter hælen. Gjentatte målinger av den samme fot ved anvendelse av denne teknikk viste at nøyaktigheten var innenfor 5 %.

C. Administreringsmåter og doseringer for PAF- AH

PAF-AH ble injisert lokalt mellom fotputene eller systemisk ved IV-injeksjon i halevenen. For lokal administrering mottok rottene 100 1 PAF-AH (4000-6000 U/ml) subkutant mellom de høyre bakfotputer. Den venstre fot tjente som kontroll ved administrering av 100 (il bærer (bufret saltløsning). For systemisk administrering av PAF-AH mottok rottene de angitte enheter av PAF-AH i 300 ul bærer IV i halevenen. Kontrolldyr mottok det tilsvarende volum bærer intravenøst i halevenen.

D. Lokal administrering av PAF- AH

Rotter (N = 4) ble injisert med 100 1 PAF-AH (4000-6000 U/ml) subkutant mellom de høyre fotputer. Den venstre ble injisert med 100 1 bærer (bufret saltløsning). Fire andre rotter ble kun injisert med bærer. Alle rotter ble umiddelbart gitt PAF via subkutan fotinjeksjon, og fotvolumer ble vurdert 1 time etter injeksjon. Figur 6, hvori ødem er uttrykt som gjennomsnittlig økning av fotvolum (ml) ± SEM for hver behandlingsgruppe, illustrerer at PAF-indusert fotødem blokkeres ved lokal administrering av PAF-AH. Gruppen som mottok lokal PAF-AH-behandling før administrering av PAF, viste redusert inflammasjon sammenlignet med kontrollgruppen. En økning i fotvolum på 0,08 ml ± 0,08 (SEM) ble observert i PAF-AH-gruppen sammenlignet med 0,63 0,14 (SEM) for de bærerbehandlede kontrollrotter. Økningen i fotvolum var et direkte resultat av PAF-injeksjon fordi dyrene som kun ble injisert med bærer i foten, ikke oppviste noen økning i fotvolum.

E. Intravenøs administrering av PAF- AH

Rotter (N = 4 pr. gruppe) ble forhåndsbehandlet IV med enten PAF-AH (2000 U i 300 1 bærer) eller bærer alene 15 minutter før administrering av PAF. Ødem ble vurdert 1 og 2 timer etter administrering av PAF. Figur 7, hvori ødem er uttrykt som gjennomsnittlig økning i volum (ml) ± SEM for hver behandlingsgruppe, illustrerer at IV-administrering av PAF-AH blokkerte PAF-indusert fotødem 1 og 2 timer etter administrering. Gruppen som mottok 2000 U PAF-AH gitt IV, viste en reduksjon i inflammasjon i løpet av 2 timer. Gjennomsnittlig volumøkning for den PAF-AH-behandlede gruppe etter 2 timer var 0,10 ml ± 0,08 (SEM) sammenlignet med 0,56 ±0,11 bærerbehandlede kontroller.

F. Sammenligning av PAF- AH- beskyttelse ved ødem indusert av PAF eller zymosan

Rotter (N = 4 pr. gruppe) ble forhåndsbehandlet IV med enten PAF-AH (2000 U i 300 ul bærer) eller bærer alene. 15 minutter etter forhåndsbehandlingen mottok gruppene enten PAF eller zymosan A, og fotvolum ble vurdert etter henholdsvis 1 og 2 timer. Som vist i figur 8, hvori ødem er uttrykt som gjennomsnittlig økning i volum (ml) ± SEM for hver behandlingsgruppe, var systemisk administrering av PAF-AH (2000 U) effektiv for å redusere PAF-indusert fotødem, men blokkerte ikke zymosan-indusert ødem. En gjennomsnittlig økning i volum på 0,08 ± 0,02 ble observert hos den PAF-AH-behandlede gruppe i forhold til 0,49 ± 0,03 for kontrollgruppen .

G. Titrering av effektiv dose for PAF- AH- beskyttelse

I to separate eksperimenter ble grupper av rotter (N = 3-4 pr. gruppe) forhåndsbehandlet IV med enten serie-fortynninger av PAF-AH eller bærerkontroll i et volum på 300 ul 15 minutter før PAF-administrering. Begge føttene ble administrert med PAF (som beskrevet ovenfor), og ødem ble vurdert etter 1 time. Figur 9, hvori ødem er uttrykt som gjennomsnittlig økning i volum (ml) ± SEM for hver behandlingsgruppe, illustrerer økningen i beskyttelse mot PAF-indusert ødem i rotter injisert med økende doser av PAF-AH. I eksperimentene ble ID50 for PAF-AH gitt IV funnet å være mellom 40 og 80 U pr. rotte.

H. Effektivitet in vitro av PAF- AH som en funksjon av tid etter administrering

I to separate eksperimenter ble grupper av rotter (N = 3-4 pr. gruppe) forhåndsbehandlet IV med enten PAF-AH (2000 U i 300 ul bærer) eller bærer alene. Etter administrering mottok gruppene PAF ved tidspunkter som varierte fra 15 minutter til 47 timer etter administrering av PAF-AH. Ødem ble deretter vurdert 1 time etter PAF-administrering. Som vist i figur 10, hvori ødem er uttrykt som gjennomsnittlig økning i volum (ml) ± SEM for hver behandlingsgruppe, beskyttet administrering av 2000 U PAF-AH rottene mot PAF-indusert ødem i minst 24 timer.

I. Farmakokinetikk for PAF- AH

Fire rotter mottok 2000 U PAF-AH ved intravenøs injeksjon i et volum på 300 ul. Plasma ble oppsamlet ved forskjellige tidspunkter og lagret ved 4 °C, og plasmakonsen-trasjoner av PAF-AH ble bestemt ved hjelp av ELISA ved anvendelse av en dobbelt mAb-innfangelsesanalyse. Kort beskrevet ble monoklonalt antistoff 90G11D (eksempel 13) fortynnet i 50 mM karbonatbuffer, pH 9,6, ved 100 ng/ml og immobilisert på Immulon 4 ELISA-plater over natten ved 4 °C. Etter omfattende vask med PBS inneholdende 0,05 % Tween 20 ble platene blokkert i 1 time ved romtemperatur med 0,5 % fiskehudgelatin (Sigma) fortynnet i PBS. To like serumprøver fortynnet i PBS med 15 mM CHAPS ble tilsatt til den vaskede ELISA-plate og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Etter vask ble et biotinkonjugat av monoklonalt antistoff 90F2D (eksempel 13) tilsatt til brønnene i en konsentrasjon på 5 ug/ml fortynnet i PBS og inkubert r 1 time ved romtemperatur. Etter vask ble 50 ul av en 1:1000 fortynning av ExtraAvidin (Sigma) tilsatt til brønnene og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Etter vask ble brønnene fremkalt ved anvendelse av OPD som substrat og kvantifisert. Enzymaktivitet ble deretter beregnet fra en standardkurve. Figur 11, hvori datapunkter representerer gjennomsnitt ± SEM, viser at plasmaenzymnivåer etter 1 time nærmet seg den forutsagte konsentrasjon basert på et 5-6 ml plasmavolum på 180-200 g rotter, middelverdi = 374 U/ml ± 58,2. Etter 1 time sank plasmanivåene jevnt og nådde en gjennomsnittlig plasmakonsentrasjon på 19,3 U/ml ±3,4 etter 24 timer, hvilket fremdeles er betydelig høyere enn endogene rotte-PAF-AH-nivåer, som er blitt funnet å være ca. 4 U/ml ved hjelp av enzymatiske analyser.

J. Effektivitet av PAF- AH i forhold til PAF-antagonister

Grupper av rotter (N = 4 pr. gruppe) ble forhåndsbehandlet med ett av tre potensielle antiinflammatoriske midler: PAF-antagonisten CV3988 (Biomol nr. L-103) administrert IP (2 mg i 200 ul EtOH), PAF-antagonisten Alprazolam (Sigma nr. A-8800) administrert IP (2 mg i 200 ul EtOH) eller PAF-AH (2000 U) administrert IV. Kontrollrotter ble injisert IV med 300 ul bærer. PAF-antagonistene ble administrert IP fordi de var oppløst i etanol. Rotter injisert med enten CV3988 eller Alprazolam ble gitt PAF 30 minutter etter administrering av PAF-antagonisten for å tillate PAF-antagonisten å komme inn i sirkulasjonen, mens rotter behandlet med PAF-AH og bærer ble injisert 15 minutter etter enzymadministrering. Rotter injisert med PAF-AH oppviste en reduksjon av PAF-indusert ødem ut over det som ble oppnådd med de etablerte PAF-antagonister CV3 988 og Alprazolam. Se figur 12, hvori ødem er uttrykt som gjennomsnittlig økning i volum (ml) ± SEM for hver behandlingsgruppe .

Som oppsummering gir rPAF-AH effektiv blokkering av ødem formidlet av PAF in vivo. Administrering av PAF-AH-produkter kan enten være lokal eller systemisk ved intra-venøs injeksjon. I doseringsundersøkelser ble IV-injeksjoner i området 160-2000 U/rotte funnet å dramatisk redusere PAF-formidlet inflammasjon, mens ID50-dosen synes å være i området 40-80 U/rotte. Beregninger basert på plasmavolumet for rotter på 180-200 g forutsier at en plasmakonsentrasjon i området 25-40 U/ml burde blokkere PAF-utløst ødem. Disse forutsigelser er understøttet av preliminære farmako-kinetiske undersøkelser. En dose på 2000 U PAF-AH ble funnet å gi effektiv blokkering av PAF-formidlet ødem i minst 24 timer. 24 timer etter administrering av PAF-AH ble plasma-konsentrasjoner av enzymet funnet å være ca. 25 U/ml. PAF-AH ble funnet å blokkere PAF-indusert ødem mer effektivt enn de to kjente PAF-antagonister som ble testet.

Samlet viser disse resultater at PAF-AH effektivt blokkerer PAF-indusert inflammasjon, og kan være av terapeutisk verdi ved sykdommer hvor PAF er den primære formidler.

Eksempel 15

Rekombinant PAF-AH ifølge foreliggende oppfinnelse ble testet i en andre in vivo-modell, PAF-indusert pleuritt. PAF er tidligere vist å indusere vaskulær lekkasje når den innføres i lungesekken [Henriques et al., supra]. Hunnrotter

(Charles River, 180-200 g) ble injisert i halevenen med 200 ul 1 % Evans blue-fargestoff i 0,9 % saltvann med 300 ul rekombinant PAF-AH (1500 umol/ml/t, preparert som beskrevet i eksempel 14) eller med et ekvivalent volum kontrollbuffer. 15 minutter senere mottok rottene en injeksjon på 100 ul PAF (2,0 nmol) i lungesekken. 1 time etter PAF-administreringen ble rottene avlivet, og pleuravæsken ble oppsamlet ved å skylle lungesekken med 3 ml heparinbehandlet, fosfatbufret saltvann. Graden av vaskulær lekkasje ble bestemt ved hjelp av mengden av Evans blue-fargestoff i lungesekken, som ble kvantifisert ved hjelp av absorbans ved 620 nm. Rotter forhåndsbehandlet med PAF-AH ble funnet å ha mye mindre vaskulær lekkasje enn kontrolldyr (representerer mer enn 80 % reduksjon av inflammasjon).

De foregående resultater støtter behandlingen av individer som lider av pleuritt med rekombinant PAF-AH-enzym ifølge foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 16

Rekombinant PAF-AH-enzym ifølge foreliggende oppfinnelse ble også testet for effektivitet i en modell av antigenindusert eosinofilrekruttering. Akkumulering av eosinofiler i luftveiene er et karakteristisk trekk ved sen-faseimmunresponser som forekommer ved astma, rhinitt og eksem. Balb/c-mus (Charles River) ble sensitivisert ved hjelp av to intraperitoneale injeksjoner bestående av 1 ug ovalbumin (OVA) i 4 mg aluminiumhydroksid (Imject alum, Pierce Laboratories, Rockford, IL) gitt med 2 ukers mellomrom. 14 dager etter den andre immunisering ble de sensibiliserte mus enten utfordret med OVA i form av en aerosol eller saltvann som en kontroll.

Før utfordringen ble musene vilkårlig plassert i fire grupper med fire mus/gruppe. Musene i gruppene 1 og 3

ble forhåndsbehandlet med 140 ul kontrollbuffer bestående av 25 mM Tris, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA og 0,1 % Tween 80 gitt ved intravenøs injeksjon. Musene i gruppene 2 og 4 ble forhåndsbehandlet med 750 enheter PAF-AH (aktivitet 5500 enheter/ml gitt i 140 ul PAF-AH-buffer). 30 minutter etter administrering av PAF-AH eller buffer ble musene i gruppene 1 og 2

eksponert for PBS i aerosolform, som beskrevet nedenfor, mens musene i gruppene 3 og 4 ble eksponert for OVA i aerosolform. 24 timer senere ble musene behandlet en andre gang med enten 140 ul buffer (gruppene 1 og 3) eller 750 enheter PAF-AH i 140 ul buffer (gruppene 2 og 4) gitt ved intravenøs injeksjon.

Eosinofilinfiltrering i luftrøret ble indusert i de sensibiliserte mus ved å utsette dyrene for OVA i aerosolform. Sensibiliserte mus ble plassert i 50 ml koniske sentrifugerør (Corning) og tvunget til å innånde OVA i aerosolform (50 mg/ml) oppløst i 0,9 % saltvann i 20 minutter ved anvendelse av et forstøvningsapparat (modell 646, DeVilbiss Corp., Somerset, PA). Kontrollmus ble behandlet på lignende måte, med unntak av at 0,9 % saltvann ble anvendt i forstøvningsapparatet. 48 timer etter utsettelse for OVA eller saltvann i aerosolform ble musene avlivet, og luftrørene ble utskåret. Luftrøret fra hver gruppe ble innstøpt i OCT og lagret ved

-70 °C inntil snitt ble kuttet.

For å evaluere eosinofilinfiltrasjon i luftrøret

ble vevssnitt fra de fire grupper mus farget med enten Luna-løsning og hematoksylin-eosinløsning eller peroksidase. Tolv 6 um tykke snitt ble kuttet fra hver gruppe mus og nummerert deretter. Snitt nummerert med oddetall ble farget med Luna-fargestoff som følger. Snittene ble fiksert i formal-alkohol i 5 minutter ved romtemperatur, skylt tre ganger i kranvann i 2 minutter ved romtemperatur og deretter skylt to ganger i dH20 i 1 minutt ved romtemperatur. Vevssnitt ble farget med Luna-fargestoff i 5 minutter ved romtemperatur (Luna-fargestoff består av 90 ml Weigerts jernhematoksylin og 10 ml 1 % Biebrich Scarlet). Fargede snitt ble dyppet i 1 % sur

alkohol seks ganger, skylt i kranvann i 1 minutt ved romtemperatur, dyppet i 0,5 % litiumkarbonatløsning fem ganger og skylt under rennende kranvann i 2 minutter ved romtemperatur. Snittene ble dehydrert med 70 %-95 %-100 % etanol, 1 minutt hver gang, ved romtemperatur, deretter klaret med xylen i 1 minutt, to ganger, ved romtemperatur og montert i Cytoseal 60.

For peroksidasefargingen ble snitt nummerert med like tall fiksert i aceton ved 4 °C i 10 minutter og tillatt å lufttørke. 200 1 DAB-løsning ble tilsatt til hvert snitt og hensatt i 5 minutter ved romtemperatur. Snittene ble skylt i kranvann i 5 minutter ved romtemperatur, og 2 dråper 1 % osmiumsyre ble applisert på hvert snitt i 3-5 sekunder. Snittene ble skylt i kranvann i 5 minutter ved romtemperatur og farget med Mayers hematoksylin ved 25 °C ved romtemperatur. Snittene ble deretter skylt i kranvann i 5 minutter og dehydrert i 1 minutt med 70 %-95 %-100 % etanol ved romtemperatur. Snittene ble klaret to ganger med xylen i 1 minutt ved romtemperatur og montert i Cytoseal 60.

Antall eosinofiler i luftrørets submukosale vev ble evaluert. Luftrør fra mus fra gruppene 1 og 2 ble funnet å ha meget få eosinofiler utspredt gjennom det submukosale vev. Som forventet ble luftrør fra mus i gruppe 3, som var forhåndsbehandlet med buffer og eksponert for forstøvet OVA, funnet å ha et stort antall eosinofiler gjennom det submukosale vev. I motsetning til dette ble luftrørene fra mus i gruppe 4, som var forhåndsbehandlet med PAF-AH og eksponert for forstøvet OVA, funnet å ha meget få eosinofiler i det submukosale vev sammenlignet med det som ble observert i de to kontrollgrupper, gruppene 1 og 2.

Terapeutisk behandling med PAF-AH av individer som oppviser en senfaseimmunrespons som involverer akkumulering av eosinofiler i luftveiene, slik som forekommer ved astma og rhinitt, er således vist.

Eksempel 17

Et PAF-AH-produkt ifølge foreliggende oppfinnelse ble også testet i to forskjellige rottemodeller for behandling av nekrotiserende enterokolitt (NEC), en akutt blødende tarmnekrose som forekommer hos spedbarn med lav fødselsvekt og forårsaker en betydelig sykelighet og dødelighet. Tidligere eksperimenter har vist at behandling med glukokortikoider reduserer forekomsten av NEC hos dyr og for tidlig fødte barn, og aktiviteten av glukokortikoider er blitt foreslått å foregå via en økning av aktiviteten av plasma-PAF-AH.

A. Aktivitet i rotter med NEC indusert ved utfordring med PAF

1. Forebyggelse av NEC

Et rekombinant PAF-AH-produkt, rPH.2 (25 500 enheter i 0,3 ml, gruppene 2 og 4), eller vehikkel/buffer alene (25 mM Tris, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA og 0,1 % Tween 80)

(gruppene 1 og 3) ble administrert i halevenene hos Vistar-hunnrotter (n = 3) med vekt 180-220 g. Enten BSA(0,25 %)-saltvann (gruppene 1 og 2) eller PAF (0,2 ug/100 g) suspen-dert i BSA-saltvann (gruppene 3 og 4) ble injisert i den abdominale aorta på høyde med den øvre mesenteriumarterie 15 minutter etter injeksjon av rPH.2 eller vehikkel, som tidligere beskrevet av Furukawa et al. [J. Pediatr. Res., 34:237-241 (1993)]. Etter 2 timer ble tynntarmen fjernet fra det Treitzke ligament til blindtarmen, grundig vasket med kaldt saltvann og overfladisk undersøkt. Fra mikroskopisk undersøkelse ble prøver uttatt fra de øvre, midtre og lavere deler av tynntarmen. Vevene ble fiksert i bufret formalin, og prøvene ble bearbeidet for mikroskopisk undersøkelse ved farging med hematoksylin og eosin. Eksperimentet ble gjentatt tre ganger.

Overfladiske funn indikerte en normalt utseende tarm i grupper behandlet med vehikkelen av BSA-saltvann. rPH.2 injisert i fravær av PAF hadde likeledes ingen effekt på de overfladiske funn. I motsetning til dette resulterte injeksjon av PAF i den nedstigende aorta i hurtig, alvorlig misfarging og blødning i overflaten av tarmens serøse hinne. En lignende blødning ble observert når et snitt av tynntarmen ble undersøkt på slimhinnesiden, og tarmen syntes å være ganske nekrotisk. Når rpH.2 ble injisert via halevenen 15 minutter før administreringen av PAF i aorta, syntes tarmen å være normal.

Ved mikroskopisk undersøkelse viste tarmen fra gruppene 1, 2 og 4 en normal tarmtottarkitektur og en normal populasjon av celler i lamina propria. I motsetning til dette viste gruppen behandlet med PAF alene en nekrose med full tykkelse og en blødning gjennom hele slimhinnen.

Plasma-PAF-AH-aktivitetene ble også bestemt i rottene anvendt i eksperimentet beskrevet ovenfor. PAF-AH-aktivitet ble bestemt som følger. Før injeksjon i halevenen ble blodprøver uttatt. Blodprøver ble deretter uttatt fra vena cava like før injeksjonen av PAF og ved avlivningstidspunktet. Cirka 50 ml blod ble oppsamlet i heparinbehand-lede kapillarrør. Plasma ble isolert etter sentrifugering (980 x g i 5 minutter). Enzymet ble analysert som tidligere beskrevet av Yasuda og Johnston, Endocrinology, 130:708-716

(1992) .

Den gjennomsnittlige plasma-PAF-AH-aktivitet hos alle rotter før injeksjon ble funnet å være 75,5 ±2,5 enheter (1 enhet er lik 1 nmol x min"<1> x ml"<1> plasma) . De gjennomsnittlige plasma-PAF-AH-aktiviteter 15 minutter etter injeksjon av vehikkelen var 75,2 ± 2,6 enheter for gruppe 1 og 76,7 ± 3,5 enheter for gruppe 3. Etter 15 minutter var plasma-PAF-AH-aktiviteten hos dyrene injisert med 25 500 enheter rPH.2 2249 ± 341 enheter for gruppe 2 og 2 494 ±

623 enheter for gruppe 4. Aktiviteten hos gruppene 2 og 4 forble forhøyet (1855 ± 257 enheter) inntil avlivningstidspunktet (2 1/4 time etter injeksjon av rPH.2) (gruppe 2 = 1771 ± 308; gruppe 4 = 1939 ± 478). Disse resultater indikerer at plasma-PAF-AH-aktivitet hos rottene som ble injisert med vehikkel alene (gruppene 1 og 3), ikke endret seg under eksperimentforløpet. Alle dyr som mottok PAF-injeksjonen alene, utviklet NEC, mens alle rotter som ble injisert med rPH.2 etterfulgt av PAF-injeksjon, var fullstendig beskyttet.

2. Doseavhengighet for forebyggelse av NEC

For å bestemme hvorvidt beskyttelsen mot NEC i rotter var doseavhengig ble dyrene behandlet med økende doser av rPH.2 15 minutter før PAF-administrering. Først ble rPH.2, varierende fra 25,5 til 25 500 enheter, injisert i rottenes halevener. PAF (0,4 ug i 0,2 ml BSA-saltvann) ble deretter inj isert i den abdominale aorta 15 minutter etter administreringen av rPH.2. Tynntarmen ble fjernet og undersøkt for NEC-utvikling 2 timer etter PAF-administrering. Plasma-PAF-AH-aktivitet ble bestemt før den eksogene administrering av enzymet og 15 minutter og 2 1/4 time etter rPH.2-administrering. Resultatene er middelverdien av 2-5 dyr i hver gruppe.

Overfladiske funn indikerte at alle rotter som mottok mindre enn 2000 enheter av enzymet, utviklet NEC. Plasma-PAF-AH-aktivitet i dyr som mottok den laveste beskyttende mengde enzym (2040 enheter), var 363 enheter pr. ml plasma etter 15 minutter, hvilket representerer en 5 gangers økning i forhold til basisnivåene. Når rPH.2 ble administrert i en mengde mindre enn 1020 totale enheter, var den resulterende plasmaenzymaktivitet gjennomsnittlig ca. 160 eller lavere, og alle dyr utviklet NEC.

3. Varighet av beskyttelse mot NEC

For å bestemme hvor lang tid det eksogene PAF-AH-produkt ga beskyttelse mot utvikling av NEC ble rotter injisert én gang med en fast mengde av enzymet via halevenen og deretter utfordret med PAF ved forskjellige tidspunkter. rPH.2 (8 500 enheter i 0,3 ml) eller vehikkel alene ble administrert i rottenes halevener, og PAF (0,36 ug i 0,2 ml BSA-saltvann) ble injisert i den abdominale aorta på forskjellige tidspunkter etter enzymadministreringen. Tynn-tarmene ble fjernet 2 timer etter PAF-injeksjon for overfladiske og histologiske undersøkelser for å evaluere med hensyn til NEC-utvikling. Plasma-PAF-AH-aktiviteter ble bestemt på forskjellige tidspunkter etter enzymadministrering og 2 timer etter PAF-administrering. Middelverdien ± standardfeil for enzymaktivitet ble bestemt for hver gruppe.

Resultatene indikerte at ingen av rottene utviklet NEC innen de første 8 timer etter injeksjon av rPH.2, men 100 % av dyrene utfordret med PAF 24 og 48 timer etter injeksjon av enzymet utviklet NEC.

4. Reversering av NEC

For å bestemme hvorvidt administrering av PAF-AH-produkt var i stand til å reversere utvikling av NEC indusert ved PAF-injeksjon ble 25 500 enheter enzym administrert via injeksjon i vena cava 2 minutter etter PAF-administrering (0,4 g). Ingen av dyrene utviklet NEC. Når rPH.2 ble administrert på denne måten 15 minutter etter PAF-injeksjonen, utviklet imidlertid alle dyr NEC, hvilket er overensstemmende med det hurtige tidsforløp for NEC-utvikling, som indusert ved administrering av PAF, tidligere rapportert av Furukawa [ supra] .

Summen av disse observasjoner indikerer at en relativt liten (5 ganger) økning i plasma-PAF-AH-aktivitet er i stand til å forhindre NEC. Disse observasjoner, kombinert med tidligere rapporter om at plasma-PAF-AH-aktivitet i kaninfostre [Maki et al., Proe. Nati. Acad. Sei.

(USA), 85:728-732 (1988)] og for tidlig fødte individer [Caplan et al., J. Pediatr. 116:908-964 (1990)] er blitt vist å være forholdsvis lav, antyder at profylaktisk administrering av humane, rekombinante PAF-AH-produkter til nyfødte med lav fødselsvekt kan være anvendelig for behandling av NEC.

B. Aktivitet i en neonatal modell av NEC

Effektiviteten av et PAF-AH-produkt, rPH.2, ble evaluert som følger i en NEC-modell hvori nyfødte rotter blir stresset ved reseptforing og asfyksi, to vanlige risikofaktorer for sykdommen hos mennesker. I denne modell utvikler ca. 70-80 % av dyrene overfladisk og mikroskopisk tarmskade som er lignende neonatal NEC på den 3. dag etter fødselen. Nyfødte rotter ble anskaffet fra drektige Sprague-Dawley-rotter (Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN) som var anestetisert med C02 og forløst via keisersnitt. Nyfødte dyr ble oppsamlet, tørket og oppbevart i en neonatalinkubator under hele eksperimentet.

Separate grupper av dyr ble først anvendt for å bestemme doseringen og absorpsjonskarakteristika for rPH.2. Normale nyfødte rotteunger ble gitt én av tre forskjellige enterale eller intraperitoneale doser av rPH.2 (3 X,, 15 X eller 75 X) ved tid 0, og blod ble oppsamlet 1 time, 6 timer eller 24 timer senere for bestemmelse av plasma-PAF-AH-aktivitet. PAF-AH-aktivitet ble målt ved anvendelse av en substratinkubasjonsanalyse [Gray et al., Nature, 374:549

(1995) ] og en ELISA ved anvendelse av et antihumant rPAF-AH-monoklonalt antistoff for hver prøve (90F2D og 90G11D, beskrevet i eksempel 13). For utvalgte prøver ble immun-histokjemisk analyse utført ved anvendelse av to forskjellige monoklonale antistoffer utviklet mot human rPAF-AH (90F2D og 90G11D, beskrevet i eksempel 13). Immunhistokjemi ble utført med standardteknikker ved anvendelse av en 1:100-fortynning av antistoffet og inkubasjoner over natten.

Etter enteral dosering av rPH.2 til normale nyfødte rotter var det ingen målbar plasma-PAF-AH-aktivitet på noe tidspunkt, verken ved anvendelse av substratin-kubasjonsanalysen eller ELISA-teknikken. Med intraperitoneal administrering av rPH.2 var betydelig sirkulerende PAF-AH-aktivitet målbar ved anvendelse av begge metoder 1 time etter dosering, og denne aktivitet hadde en topp ved 6 timer. Høyere doser av rPH.2 (fra 3 til 75 X, 10-250 U) resulterte i høyere plasma-PAF-AH-aktivitet. Immunhisto-kj emisk analyse avslørte tilstedeværelse av rPAF-AH-produkt i epitelcellene i tarmslimhinnen etter enteral administrering. Reaktiviteten samlet seg for det meste i tarmtottene, og minimal farging var til stede i krypt-cellene. Det var mer farging i ileum enn jejunum, og noe rPAF-AH-produkt ble immunkjemisk identifisert i deler av tykktarmen. Det var ingen påvisbar farging i noen kontroll-prøver eller i prøver fra dyr dosert intraperitonealt. Enteral administrering av rPAF-AH-produkt resulterte således i lokal akkumulering av enzymet i slimhinneepitelet uten noen målbar systemisk absorpsjon, mens i motsetning til dette resulterte intraperitoneal administrering av rPAF-AH-produkt i høye nivåer av sirkulerende enzym, men ingen lokal akkumulering i slimhinner.

I NEC-modellen ble NEC indusert i nyfødte rotter i overensstemmelse med Caplan et al., Pediatr. Pathol., 14:1017-1028 (1994). Kort beskrevet ble dyr f6ret med for for nyfødte unger rekonstituert fra pulver (Esbiliac, Borden Inc.) hver 3. time via et foringsrør. Foringsvolumet startet først ved 0,1 ml/porsjon og økte, alt etter det som ble tålt, til 0,4 ml/porsjon på den 4. dag. I alle dyr ble det fremkalt asfyksi to ganger daglig ved innånding av 100 % nitrogen i 50 sekunder i et lukket plastkammer, etterfulgt av utsettelse for kulde (4 °C) i 10 minutter. Funksjon av tarm og blære ble stimulert ved forsiktig manipulering etter hver foring. Dyrene ble oppbevart i 96 timer, eller inntil de viste tegn på lidelse. Syke dyr hadde oppsvulmet buk, blødende avføring, åndenød, cyanose og letargi og ble avlivet ved dekapitasjon. Etter avlivningen ble tarmen fra hver rotte undersøkt overfladisk for tegn på nekrose og deretter fiksert med formalin for senere histologisk analyse. Prøvene ble innstøpt i parafin, snittet med en mikrotom, farget med hematoksylin og eosin og undersøkt av to observatører. Tarmskade ble poengbedømt som 1+ for hevelse eller separasjon av epitelceller, 2+ for løsning av epitelceller til midtre tarmtottnivå, 3+ for nekrose av hele tarmtotter og 4+ for transmural nekrose.

For å vurdere effektiviteten av rPH.2 ble tre forskjellige grupper av rotter behandlet med forbindelsen via enteral administrering, intraperitoneal administrering eller begge. rPH.2-preparatet inneholdt 0,8 mg/ml protein og med en PAF-AH-aktivitet på ca. 4000 enheter/mg, med et endo-toksin-/proteinforhold < 0,5 EU/mg. Enteralt doserte dyr ble gitt 25 X (80 U) rPH.2 tilsatt ved hver foring (hver 3. time) via munn-magesonden. Intraperitonealt doserte dyr ble gitt 75 X ved intraperitoneal injeksjon to ganger daglig. Kontrolldyr mottok passende volumer buffer (20 mM NaP04, pH 7,4) uten rPH.2 og ble undersøkt samtidig med hver eksperi-mentgruppe. Dødelighet og tegn på NEC ble evaluert for hver behandlingsgruppe, og forskjeller ble analysert statistisk ved anvendelse av Fischers eksakte test. En p-verdi

< 0,05 ble betraktet som signifikant. Resultatene er vist i tabell 9 nedenfor.

Dataene representerer kumulative resultater fra fire forskjellige eksperimenter for intraperitoneal dosering, fire eksperimenter for enteral dosering og tre eksperimenter for intraperitoneal + enteral dosering.

Enteral dosering av rPH.2 reduserte betydelig forekomsten av både NEC og død sammenlignet med kontrolldyr. Resultater fra fire forskjellige eksperimenter med enteral dosering viste at forhåndsbehandling med rPH.2 reduserte NEC fra 19/26 (kontroll) til 6/26 (p < 0,001). Tarmskade var variabel blant behandlede og kontrolldyr, men var i de fleste tilfeller kjennetegnet ved midtre tarmtottnekrose i noen segmenter, total tarmtottnekrose i andre områder, tilfeldige områder med transmural nekrose og resterende deler med normal tarmhistologi. Den verste grad av NEC hos behandlede dyr og kontrolldyr med tarmskade var omtrent den samme (midlere poengtall 2,8 for kontrolldyr i forhold til 2,4 for rPH.2-behandlede rotter, p > 0,05).

Intraperitoneal dosering med rPH.2 hadde ingen vesentlig virkning på NEC eller død i denne modell. Inntreden av symptomer var lignende for denne gruppen og kontrollgruppen (40 ± 5 timer for kontrollrotter i forhold til 36 ± 7 timer for rPH.2-behandlede rotter), og graden av NEC i begge grupper var lignende (midlere poengtall 2,6 for kontrolldyr i forhold til 2,5 for rPH.2-behandlede rotter).

Ytterligere eksperimenter ble utført hvori rotter ble dosert både enteralt og intraperitonealt med rPH.2 i de samme doser som gruppene med en enkelt behandling (25 X av rPH.2 ved hver foring hver 3. time pluss 75 X ved intraperitoneal injeksjon to ganger daglig. Resultatene er vist ovenfor i tabell 9. Selv om det ikke var noen signifikante forskjeller mellom behandlingsgrupper og kontrollgrupper med hensyn til dødsfall, ga rPH.2-behandling betydelig reduksjon av forekomsten av NEC (10/17 for kontrolldyr i forhold til 3/14 for rPH.2-behandlede rotter, p = 0,04). Det skal be-merkes at 6 av de 7 dyrene som døde i den rPH.2-behandlede gruppe, hadde positive blodkulturer for E. coli, bestemt like før døden.

Disse resultater gir videre understøttelse for at PAF-AH-produkter har en beskyttende rolle i en neonatal modell av non-PAF-indusert NEC. Enteral behandling med rPAF-AH-produkt forhindrer NEC, mens intraperitoneal behandling med disse doser ikke hadde noen påvisbar effekt. Disse funn antyder at supplering med PAF-AH-produkt for kunstig f6rede, for tidlig nyfødte med risiko for NEC kan redusere forekomsten av denne sykdom.

Eksempel 18

Effektiviteten av PAF-AH-produkt i en marsvin-modell for akutt åndenødssyndrom (ARDS) ble undersøkt.

Blodplateaktiverende faktor (PAF) injisert intra-venøst i marsvin produserer en dyp lungeinflammasjon som minner om tidlig ARDS hos mennesker. Innen minutter etter intravenøs administrering av PAF blir lungeparenkymet over-fylt med blod med innsnevrede bronkier og bronkioler [Lellouch-Tubiana et al., supra]. Blodplater og polymorfo-nukleære nøytrofiler begynner å vandre utover, og cellulære aggregater kan lett identifiseres langs lungearteriolene [Lellouch-Tubiana, Br. J. Exp. Path., 6"6:345-355 (1985)]. PAF-infusjon skader også bronkiale epitelceller som diss-osierer fra veggene i luftveiene og akkumulerer i hulrommene i luftveiene. Denne skade på epitelcellene i luftveiene er overensstemmende med dannelse av hyalinmembran som forekommer hos mennesker under utvikling av ARDS. Nøytrofilenes og blodplatenes vandring utover etterfølges hurtig av diapedese av disse celler inn i de alveolare septa og alveolarhulrommene i lungen. Cellulære infiltrater utløst av PAF medfølges av betydelig vaskulær lekkasje som fører til luftveisødem [Kirsch, Exp. Lung. Res., 18:447-459 (1992)]. Bevis for ødem er ytterligere understøttet ved undersøkelser in vi tro, hvor PAF induserer en doseavhengig (10-1000 ng/ml) uttredelse av 125I-merket fibrinogen i perfuserte marsvin-lunger [Basran, Br. J. Pharmacol., 77:437 (1982)].

Basert på de ovenfor angitte observasjoner ble det utviklet en ARDS-modell i marsvin. En kanyle plasseres i

halsvenen hos anestetiserte Hartly-hannmarsvin (ca 350-

400 g), og PAF fortynnet i 500 ul fosfatbufret saltvann med 0,25 % bovint serumalbumin som en bærer (PBS-BSA) infuseres i løpet av 15 minutter i en total dose som varierer fra 100 til 400 ng/kg. Med forskjellig mellomrom etter PAF-infusjon avlives dyrene, og lungevev oppsamles. I marsvin infusert med PAF er doseavhengig lungeskade og inflammasjon klart synlig etter 15 minutter og fortsetter å være til stede i 60 minutter. Nøytrofiler og røde blodceller er til stede i alveolarhulrommene hos PAF-behandlede marsvin, men fraværende i kontrolldyr eller simulert infuserte dyr. Bevis for skade på epitelceller er også tydelig og ligner hyalin-membrandannelse i humane ARDS-pasienter. Proteinbestemmelser utført i bronkoalveolarutskyllingsprøver (BAL) tatt fra marsvin infusert med PAF, viser en dramatisk akkumulering av protein i den inflammerte lunge, hvilket er et klart bevis på vaskulær lekkasje.

rPH.2 ble funnet å fullstendig beskytte mot PAF-formidlet lungeskade i marsvinmodellen for ARDS. Grupper av marsvin ble forhåndsbehandlet med enten rPH.2 (2000 enheter i 500 ul) eller kun 500 ul av PAF-AH-bufferen. 15 minutter senere ble disse marsvin infusert med 400 ng/kg PAF i et volum på 500 ul, infusert i løpet av 15 minutter. En simuleringsgruppe av marsvin ble dessuten infusert med 500 ul PBS-BSA. Ved fullførelse av PAF-infusjonen ble dyrene avlivet, og BAL-fluid ble oppsamlet ved utskylling av lungene 2 x med 10 ml saltvann inneholdende 2 ug/ml heparin for å forhindre koagulering. For å bestemme proteinkonsentrasjon i BAL ble prøvene fortynnet 1:10 i saltvann, og OD

280 ble bestemt. BAL-fluid fra simuleringsgruppen av marsvin ble funnet å ha en proteinkonsentrasjon på 2,10 ± 1,3 mg/ml. I skarp motsetning til dette ble BAL-fluid fra dyr infusert med PAF funnet å ha en proteinkonsentrasjon på 12,55 ± 1,65 mg/ml. I marsvin forhåndsbehandlet med rPH.2 ble BAL-fluid funnet å ha en proteinkonsentrasjon på 1,13 ± 0,25 mg/ml, hvilket er sammenlignbart med simuleringskontroilene og viser at PAF-AH-produkt fullstendig blokkerer lungeødem som respons på PAF.

Eksempel 19

Effektiviteten av et PAF-AH-produkt, rPH.2, ble evaluert i to forskjellige modeller av akutt pankreatitt.

A. Aktivitet i en rottepankreatittmodell

Wistar-hannrotter (200-250 g) ble innkjøpt fra Charles River Laboratories (Wilmington, MA). De ble oppbevart i et klimakontrollert rom ved 23 ±2 °C med en 12 timers syklus mellom lys og mørke og f6ret med standard laboratoriet6r med vann ad libitum. Dyrene ble vilkårlig plassert i enten kontrollgrupper eller eksperimentgrupper. Rottene ble anestetisert med 50 mg/kg pentobarbitalnatrium intraperitonealt, og et polyvinylkateter (størrelse V3, Biolab Products, Lake Havasu, AZ) ble plassert i halsvenen. Kateteret ble ledet under huden og ut i det dorsale hal-sområdet, og dyrene ble tillatt å komme seg etter aneste-sien. Rottene ble gitt fri adgang til vann, men ble fastet over natten. Eksperimentet ble utført den neste dag på bevisste dyr. I mellomtiden ble kateteret holdt åpent ved konstant infusjon av saltvann (0,2 ml/t). På eksperiment-dagen ble dyrene injisert intravenøst med rPH.2 eller vehikkelkontroll, etterfulgt av en infusjon av enten (1) 5 (lg/kg pr. time caerulein i 3,5 timer, eller (2) 10 ug/kg pr. time caerulein i 5 timer (Research Plus, Bayonne, NJ). Umiddelbart etter fullførelse av infusjonen ble dyrene anestetisert med pentobarbital-natrium, bukene ble åpnet, og 5 ml blod ble tappet fra vena cava inferior for etterfølgende analyser. Dyrene ble deretter avlivet ved bloduttapping. Serumamylase, serumlipase og serumbilirubin ble målt, og pankreas ble fjernet. Biter av pankreas ble enten fiksert i en 4 % fosfatbufret formaldehydløsning for histologisk undersøkelse eller umiddelbart dypfrosset ved - 80 °C for målinger av myeloperoksidaseaktivitet. Ytterligere biter av pankreas ble undersøkt for innhold av vann og amylase og trypsin, som beskrevet nedenfor. Myeloperoksidaseaktivitet, et mål på nøytrofil sekvestrering, ble bestemt i pankreas og lunge som beskrevet nedenfor. Pulmonal, vaskulær permeabilitet ble også bestemt som beskrevet nedenfor. Statistisk analyse av dataene ble oppnådd ved anvendelse av.uparet Student<1>s t-test. De rapporterte data representerer middelverdier + SEM for minst tre forskjellige eksperimenter. Forskjeller i resultatene ble betraktet som signifikante når p < 0,05.

1. Vanninnhold i pankreas

Pankreasbiter ble avtørket og veid (våtvekt) og ble deretter tørket i 34 timer ved 120 °C og veid på nytt (tørrvekt). Vanninnhold i pankreas ble beregnet som forskjellen mellom våtvekt og tørrvekt og uttrykt som en prosent av pankreasvåtvekten. En økning i vanninnhold i pankreas ble betraktet å indikere utvikling av ødem.

2. Serum- og pankreasamylase

Amylaseaktivitet i serum ble målt ved anvendelse av 4, 6-et<y>liden(G7) -p-nitrofen<y>l (GJ -a^-maltoplasid (ET-G7PNP) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) som substrat ifølge Pierre et al., Clin. Chem., 22:1219 (1976). Amylaseaktivitet i pankreasvev homogenisert i 10 mM fosfatbuffer, pH 7,4, ble målt ved anvendelse av den samme metode.

3. Trypsinaktivitet i pankreas

Trypsinaktivitet ble målt fluorimetrisk ved anvendelse av Boc-Gin-Ala-Arg-MCA som substrat. Kort beskrevet ble 200 ul av prøven og 2,7 ml 50 mM Tris-buffer (pH 8,0) inneholdende 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2 og 0,1 % bovint serumalbumin blandet i en kyvette. 100 ul substrat ble tilsatt til prøven etter preinkubasjon i 20 sekunder for å starte reaksjonen. Fluorescensavlesningen ble utført (eksitasjon 380 nm, emisjon 440 nm) og uttrykt som en skråkurve. For å tillate sammenslåing av data fra forskjellige eksperimenter ble trypsinaktivitet i fraksjonene uttrykt som prosent av total trypsinaktivitet.

4. Histologi og morfometri

For lysmikroskopi ble komplette, vilkårlige tverr-snitt av hode, kropp og hale til pankreas fiksert i 10 % nøytralt fosfatbufret formalin. Parafininnstøpte 5 um snitt ble farget med hematoksylin-eosin (H&E) og undersøkt blindt av en erfaren morfologiker. Acinuscelleskade/nekrose ble definert som enten (a) tilstedeværelse av tomme acinusceller eller (b) vakuolisering og svelling av acinusceller og destruksjon av histoarkitekturen av hele eller deler av acinuscellene, hvilke begge måtte være assosiert med en inflammatorisk reaksjon. Omfanget av acinuscelleskade/nekrose og det totale areal okkupert av acinusvev ble kvantifisert morfometrisk ved anvendelse av en datorisert planimetrisk avbildningsanalysevideoenhet (modell CCD-72, Dage-MTl, Michigan city, IN) med NIH-1200 avbildnings-analysesoftware. Ti vilkårlig valgte mikroskopiske områder (125 x) ble undersøkt for hver vevsprøve. Graden av acinuscelleskade/nekrose ble uttrykt som prosent av totalt acinusvev som var okkupert av områder som tilfredsstilte kriteriene for skade/nekrose.

5. Måling av aktivitet av pankreas- og lunge-myeloperoksidase ( MPO)

Nøytrofil sekvestrering i pankreas og lunge ble evaluert ved måling av vevsmyeloperoksidaseaktivitet. Vevs-prøver uttatt på avlivningstidspunktet ble lagret ved -70 °C inntil analysetidspunktet. Prøver (50 mg) ble tint og homogenisert i 1 ml 20 mM fosfatbuffer (pH 7,4) og sentrifugert (10 000 x g, 10 minutter, 4 °C) . Den resulterende pellet ble resuspendert i 50 mM fosfatbuffer (pH 6,0) inneholdende 0,5 % heksadecyltrimetylammoniumbromid (Sigma, St. Louis, MO) og underkastet fire sykluser med frysing-tining. Suspensjonen ble deretter ytterligere desintegrert ved sonikering i 40 sekunder og sentrifugert (10 000 x g, 5 minutter, 4 °C) . En reaksjonsblanding bestående av det ekstraherte enzym,

1,6 mM tetrametylbenzidin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 80 mM natriumfosfatbuffer (pH 5,4) og 0,3 mM hydrogen-peroksid ble inkubert ved 37 °C i 110 sekunder, og absorbansen ble målt ved 655 nm i et CobasBio-autoanalyserings-apparat. Denne absorbans ble deretter korrigert for tørr-vekten av vevsprøvefraksjonen. 6. Måling av lungeblodårepermeabilitet

Obstruksjon av den felles galle-pankreaskanal resulterer også typisk i alvorlig pankreatittassosiert lungeskade som kan kvantifiseres ved hjelp av lungeblodkarpermeabilitet og histologisk undersøkelse. 2 timer før dyrene ble avlivet, ble de gitt en intravenøs bolusinjeksjon av 5 mg/kg fluoresceinisotio-cyanat-albumin (FITC-albumin, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Mikrovaskulær lungepermeabilitet ble evaluert ved kvantifisering av lekkasjen av FITC-albumin fra det vasku-lære rom og inn i det bronkoalveolare området. Kort beskrevet, like etter avlivning, ble den høyre bronkie blokkert ved anvendelse av en klemme, og luftrøret ble blottlagt. Den høyre lunge ble deretter utskylt ved anvendelse av en kanyle innsatt i luftrøret. Tre vaskinger med saltvann (60 ml utskyllingsvæske) ble sammenslått, og FITC-fluorescensen i serum og utskyllingsvæsken ble målt ved eksitasjon 494 nm og emisjon 520 nm. Fluorescensforholdet mellom utskyllingsvæske og blod ble beregnet og tatt som et mål på mikrovaskulær permeabilitet i lungen. Lungen ble også farget med H&E og undersøkt histologisk. 7. Effekt av administrering av caerulein og rPH. 2

Infusjon av caerulein alene i en mengde på

5 ug/kg/t i 3,5 timer resulterte i en typisk mild sekresjonsmiddelindusert pankreatitt i rottene, som var kjennetegnet ved hyperamylasemi, pankreasødem som målt ved pankreasvanninnhold og histologiske endringer, inkludert markert acinuscellevakuolisering og pankreasødem. Infusjon av saltvann i kontrolldyr ga ingen av disse biokjemiske eller histologiske endringer. Administrering av rPH.2

intravenøst i doser på 5, 10 eller 20 mg/kg 30 minutter før starten av caeruleininfusjonen ga ingen signifikant endring av størrelsen av endringene i pankreasødem (vanninnhold) og histologi som ble indusert av infusjon av caerulein alene. Administrering av rPH.2 hadde heller ingen effekt på caeruleinindusert aktivering av pankreastrypsinogen eller andre amylaseinnhold.

Infusjon av en høyere dose av caerulein,

10 ug/kg/t i 5 timer til rotter resulterte i en mer alvorlig pankreatitt, kjennetegnet, i forhold til kontrollene, ved en mer uttalt økning av serumamylaseaktivitet og pankreasødem, en markert økning av pankreas-MPO-aktivitet og en betydelig økning av trypsinogenaktivering og amylaseaktivitet i pankreas. Pankreashistologi indikerte ikke kun pankreasødem og acinuscellevakuolisering, men også noe spredt nekrose og noen få infiltrerende celler.

Administrering av rPH.2 (5 eller 10 mg/kg intra-venøst) 30 minutter før starten av caeruleininfusjon

(10 ug/kg/t) minsket omfanget av mange av pankreasendringene indusert ved infusjon av caerulein alene. Resultatene er vist i tabell 10 nedenfor. rPH.2-behandling ved en dose på 5 mg/kg resulterte i reduksjon av serumamylaseaktivitet (fra 10 984 ± 1412 til 6763 ± 1256). Den høyere dose på 10 mg/kg av rPH.2 ga ingen ytterligere forbedring av hyperamylasemi. Behandling med enten 5 eller 10 mg/kg rPH.2 ga også noe reduksjon av caeruleinindusert utvikling av pankreasødem, som målt ved vanninnhold (90,61 ± 0,27 for caerulein alene, vs. 88,21 ± 0,61 for caerulein + 5 mg/kg rPH.2. Dosen på 5 mg/kg av rPH.2 ga en betydelig reduksjon av pankreas-MPO-aktivitet (2,92 + 0,32 gangers økning i forhold til kontroller for caerulein alene vs. 1,19 + 0,21 for caerulein med rPH.2, p < 0,05). Høyere doser av rPH.2 ga ingen ytterligere forbedring av MPO-aktivitet. Ingen av dosene av rPH.2 ga noen betydelig endring av graden av trypsinogenaktivering eller amylaseinnhold i pankreas. Pankreashistologi indikerte noe forbedring av mikroskopisk nekrose og infiltrering etter forhåndsbehandling med rPH.2.

Pankreasassosiert lungeskade er blitt observert både klinisk og i flere modeller av pankreatitt. Infusjon av caerulein ved 5 ug/kg/t i 3,5 timer, som ga en mild form for pankreatitt, ga ingen betydelig skade på lungene. Infusjon av caerulein ved 10 ug/kg/time i 5 timer, som resulterte i mer alvorlig pankreatitt, ga imidlertid også lungeskade kvantifisert ved økt lungeblodårepermeabilitet (0,31 ± 0,04 til 0,79 ± 0,09), lunge-MPO-aktivitet (som indikerer nøytrofil sekvestrering) og nøytrofil infiltrering ved histologisk undersøkelse.

Administrering av rPH.2 i en dose på 5 mg/kg

30 minutter før infusjon av caerulein reduserte betydelig økningen av lunge-MPO-aktivitet indusert ved infusjon av caerulein alene (3,55 ± 0,93 for caerulein alene vs. 1,51 0,26 for caerulein med rPH.2). rPH.2-behandling reduserte betydelig alvorligheten av mikroskopiske endringer observert i lungevev etter caeruleininfusjon. Den caeruleininduserte økning av lungeblodårepermeabilitet ble redusert ved behandling med rPH.2, selv om det ikke er statistisk signifikant. Den høyere dose på 10 mg/kg av rPH.2 var ikke mer effektiv enn den lavere dose med hensyn til reduksjon av alvorligheten av caeruleinindusert lungeskade.

B. Aktivitet i en modell av pankreatitt hos opossum

Friske, vilkårlig fangede amerikanske opossumer ( Didelphis virginiana) av begge kjønn (2,0 kg til 4,0 kg) ble anskaffet fra Scott-Haas og oppbevart i klima-kontrollerte rom ved 23 ± 2 °C med en syklus mellom lys og mørke på 12 timer, og fdret med en standard laboratorie-foring med vann ad libitum. Etter faste over natten ble dyrene anestetisert med 50 mg/kg natriumpentobarbital i.p.

(Veterinary Laboratories Inc., Lenexa, KS). En cøliotomi ble utført gjennom et midtlinjesnitt under sterile betingelser, og den felles galle-pankreaskanal ble ligert i alle dyr for å indusere akutt nekrotiserende pankreatitt. Galleblære-gangen ble dessuten ligert for å forhindre galleblæren fra å tjene som et gallereservoar. Dyrene ble vilkårlig plassert i enten kontrollgrupper eller eksperimentgrupper. Med start 2 dager etter ligering av pankreaskanalen mottok eksperiment-gruppen 5 mg/kg kroppsvekt pr. dag av rPH.2 (i en 4 mg/ml oppløsning) intravenøst via halevenen, mens kontrollgruppen kun mottok en intravenøs injeksjon av det samme volum placebovehikkel. Etter 1 og 2 dagers behandling (på dagene 3 og 4 etter ligering av pankreaskanalen) ble dyrene avlivet med en overdose av natriumpentobarbital. Blodprøver ble tatt fra hjertet for målinger av serumamylase, serumlipase og serumbilirubin, og pankreas ble uttatt. Biter av pankreas ble enten fiksert i en 4 % fosfatbufret formaldehydløsning for histologisk undersøkelse, eller umiddelbart dypfrosset ved -80 °C for målinger av myeloperoksidaseaktivitet. Ytterligere biter av pankreas ble undersøkt for vanninnhold og pankreasamylase, som beskrevet ovenfor i avsnitt A i dette eksempel. Myeloperoksidaseaktivitet, et mål på nøytrofil sekvestrering, ble bestemt i pankreas som beskrevet ovenfor. Lungeblodårepermeabilitet ble også bestemt som beskrevet ovenfor.

De rapporterte resultater representerer middelverdier ± standardfeil (SEM) fra mange bestemmelser i tre eller flere separate eksperimenter. Endringenes signifikans ble evaluert ved anvendelse av Student's t-test når dataene kun besto av to grupper, eller ved variansanalyse (ANOVA) ved sammenligning av tre eller flere grupper. Dersom ANOVA indikerte en signifikant forskjell, ble dataene analysert ved anvendelse av Tukeys metode som en post hoc-test for forskjellen mellom grupper. En p-verdi < 0,05 ble betraktet som å angi en signifikant forskjell.

Resultatene er vist i tabell 11. Obstruksjon av den felles galle-pankreaskanal resulterte i alvorlig

nekrotiserende pankreatitt, kjennetegnet ved hyperamylasemi, hyperlipasemi og omfattende nekrose av pankreas. Obstruksjon av den felles galle-pankreaskanal var dessuten forbundet med en markert økning av bilirubinnivåer i serum. Intravenøs administrering av rPH.2 (5 mg/kg/dag) med start på dag 2 etter ligering av pankreaskanalen reduserte størrelsen av mange av pankreasendringene indusert ved kanalobstruksjon og placebobehandling alene. Én dag med rPH.2-behandling reduserte serumamylasenivåer sammenlignet med placebobehandlede dyr, selv om forskjellen ikke var statistisk signifikant, og 2 dager med rPH.2-behandling (på dag 4 etter ligering av pankreaskanalen) reduserte signifikant serumamylasenivåer sammenlignet med placebo. Én eller 2 dager med rPH.2-behandling reduserte serumlipasenivåer i forhold til kontroller, selv om forskjellen ikke var statistisk signifikant. To dager med rPH.2-behandling reduserte pankreas-amylaseinnholdet i forhold til kontroller, selv om 1 dag med behandling resulterte i en økning av pankreasamylase. Behandling med rPH.2 ble ikke observert å påvirke bilirubin-nivået i serum, myeloperoksidaseaktivitet i pankreas eller vanninnhold i pankreas.

De viktigste karakteristiske histologiske endringer indusert ved obstruksjon av galle-pankreaskanalen inkluderte markert nekrose, infiltrering av inflammatoriske celler, acinuscellevakuolisering og markert distensjon av acinushulrommene. Morfometrisk undersøkelse av pankreas for acinuscelleskade viste at rPH.2 hadde en omfattende beskyttende effekt på pankreas etter 1 og 2 dagers behandling med rPH.2. Etter 1 dags behandling med rPH.2 var acinuscelleskaden redusert til ca. 23 % av totalt acinuscellevev sammenlignet med 48 % skade for de placebobehandlede dyr. Denne reduksjon av acinuscelleskade var enda mer uttalt etter 2 dagers behandling, ved hvilket tidspunkt rPH.2-behandlingen resulterte i ca. 35 % skade av det totale acinuscellevev sammenlignet med ca. 60 % skade for de placebobehandlede dyr.

Lungeblodkarpermeabilitet, kvantifisert ved FITC-injeksjon, viste en ytterst signifikant forskjell etter behandling 1 og 2 dager med rPH.2 sammenlignet med placebo-gruppen. Histologisk undersøkelse av lungen viste alvorlig lungeskade hos alle placebobehandlede dyr. Lungeskade var kjennetegnet ved en omfattende inflammatorisk respons med interstitiell og intraalveolar infiltrasjon av hovedsakelig makrofager, lymfocytter og nøytrofiler, og ved et spredt, men markert, interstitielt ødem og fortykning av alveolar-membranene. Administrering av rPH.2 resulterte i en markert reduksjon av infiltrasjon av inflammatoriske celler og en reduksjon av interstitielt ødem ved alle tidspunkter.

Som oppsummering viser disse resultater at administrering av rPH.2 intravenøst i en dose på 5 mg/kg/dag, med start 48 timer etter ligering av pankreaskanalen, resulterte i signifikant reduksjon av økningen i blodnivåer av amylase og lipase og acinuscelleskade, som kvantifisert ved morfometrisk analyse av H&E-fargede snitt, og en signifikant reduksjon av alvorligheten av pankreatittindusert lungeskade. Administrering av rPAF-AH-produkt i denne klinisk relevante modell for pankreatitt viste fordelaktige effekter i form av reduksjon av alvorligheten av pankreatitt.

Eksempel 20

En undersøkelse ble utført for å evaluere effekten av et PAF-AH-produkt, rpH.2, på nevrotoksisitet forbundet med HIV-infeksjon. Humant immunsviktvirus, type l(HIV-l)-infeksjon av sentralnervesystemet resulterer i nevronalt tap ved apoptose. HIV-l-infiserte monocytter aktivert med mange forskjellige antigene stimuli, inkludert kontakt med nerve-celler, utskiller høye nivåer av nevrotoksiske, proinflammatoriske cytokiner, inkludert PAF. Effekten av rPH.2 på nevrotoksisiteten av kondisjonerte medier fra HIV-infiserte og aktiverte monocytter ble bestemt.

Monocytter ble infisert med HIV og aktivert som følger. Monocytter ble tatt fra perifere benmargsceller (PBMC) fra HIV- og hepatitt B-serumnegative donorer etter leukoferese og renset (> 98 %) ved motstrøms sentrifugal-utvasking, som beskrevet av Genis et al., J. Exp. Med., 176:1703-1718 (1992). Celler ble dyrket som adherente monolag (1 x 10<4> celler/ml i T-75-kulturflasker) i DMEM (Sigma, St. Louis, MO) med rekombinant, human makrofag-kolonistimulerende faktor (MSCF) (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA). Under disse betingelser differensierte monocytter til makrofager. Etter dyrkning i 7-10 dager ble makrofagene utsatt for HIV-lmA (aksesjonsnr. M60472) ved en infeksjonsmultiplisitet (MOI) på 0,01 infeksiøse virus-partikler/målcelle. Under disse betingelser ble 20-50 % av monocyttene infisert 7 dager etter HIV-1-inokulering, som bestemt ved immunfluorescensteknikker og in situ-hybridi-seringsteknikker [Kalter et al., J. Immunol., 146:298-306

(1991)]. Alle kulturer ble tilført friskt medium hver 2. til 3. dag. 5-7 dager etter HIV-l-infeksjon, og under toppen for reverstranskriptaseaktivitet (IO<7> cpm/ml), bestemt i overensstemmelse med Kalter et al., supra, ble kulturer av HIV-1-infiserte monocytter og parallelle kulturer av uinfiserte monocytter stimulert med LPS (10 ng/ml) eller vehikkel i 30 minutter ved 37 °C, og ble deretter hurtig nedfrosset til -80 °C inntil de ble anvendt i nevrotoksisitetsanalysen.

Kulturer av humane hjernebarknevronceller ble etablert som følger. Humant fosterhjernevev ble anskaffet fra telencefalon fra andre trimester (13-16 ukers svanger-skap) humant fosterhjernevev, i overensstemmelse med en modifisert prosedyre ifølge Banker og Cowan, Brain Res., 126:397-425 (1977). Kort beskrevet ble hjernevev oppsamlet, vasket i 30 ml kald Hanks BSS (inneholdende Ca<2+> og Mg<2+> + 25 mM HEPES og 5 x gentamicin), separert fra adherente hjerne-hinner og blod, og kuttet i 2 mm<3> biter. Vevet ble presset gjennom en 230 uM Nitex-pose og forsiktig triturert gjennom en flammepolert Pasteur-pipette 10-15 ganger. Vevet ble sentrifugert ved 550 rpm i 5 minutter ved 4 °C, og pelleten ble resuspendert i 5-10 ml MEM-hipp (D-glukose, 5 g/l; L-glutamin, 2 mM; HEPES, 10 mM; Na-pyruvat, 1 mM; KC1, 20 mM) inneholdende NI-komponenter (insulin, 5 mg/l; transferrin,

5 mg/l; selenitt, 5 ug/l, progesteron, 20 nM; putreskin,

10 UM), så vel som 10 % kalvefosterserum (FCS), PSN-anti-biotikablanding (penicillin, 50 mg/l; streptomycin, 50 mg/l; neomycin, 100 mg/l) og fungizon (2,5 mg/l). Antallet og levedyktigheten av celler ble bestemt ved fortynning med Hanks BSS med 0,4 % trypanblått (1:1, volum/volum) og telling med et hemocytometer. Cellene ble forsiktig triturert fem ganger med en 10 ml pipette og utspredt med en tetthet på 10s celler/12 mm objektglass forhåndsbelagt med poly-L-lysin (70K-150K MW, Sigma, St. Louis, MO), plassert i 24-brønners dyrkningsskåler. 1 ml medium ble pipettert ned i hver dyrkningsbrønn. Celler ble dyrket i 10-28 dager ved 37 °C i en fuktig atmosfære med 5 % C02/95 % luft, og med utskifting av medium hver 3. dag. Under disse betingelser var kulturer > 60-70 % homogene med hensyn til nøytroner, med 20-30 % astrocytter, < 1 % mikroglia og ca. 10 % makrofag- og mikrogliafarging. Etter dyrkning i 14-28 dager uttrykker nevronkulturer tilstrekkelige nivåer av N-metyl-D-aspartat (NMDA) eller non-NMDA-reseptorer til å dø etter toksiske doser av NMDA eller alfa-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoksazol-propionsyre (AMPA).

Nevrotoksisitetsanalysen ble utført som følger. Testprøvene som var (a) kondisjonert medium fra LPS-stimulerte HIV-1-infiserte monocytter, (b) kontroiImedium, (c) kondisjonert medium med tilsatt rPH.2 til 51 ug/ml eller (d) kondisjonert medium med tilsatt vehikkel for rPH.2, ble tilført til nevroncellekulturene i en konsentrasjon på 1:10 volum/volum i 24 timer. Nevrotoksisitet ble målt ved identifikasjon av apoptotiske kjerner in situ på nevrondekkglass fiksert i 4 % paraformaldehyd under benyttelse av et kommersielt sett (Apop Tag; ONCOR, Gaithersburg, MD) som benytter terminal deoksynukleotidyltransferase (TdT) til å binde digoksigenin-dUPT til frie 3'-OH-ender av nylig spaltet DNA (TUNEL-farging). Digitaliserte avbildninger av TUNEL-fargede nevroner i > 15 vilkårlig utvalgte mikroskopiske områder ble analysert for antall TUNEL-fargede kjerner/antall totale nevroner pr. 50 x område, ved anvendelse av datorisert morfometri (MCID, Imaging Research, St. Catherine, Ontario, Canada). Dataene ble uttrykt som % nevronkjerner positive for TUNEL-farging ± SEM, og er vist i figur 13. Tester på statistisk signifikans mellom kontroller og eksperiment-behandlinger ble bestemt ved hjelp av ANOVA eller parede t-tester, med signifikans p < 0,05. Kvantifisering av disse kulturer bekreftet at kondisjonerte medier fra HIV-infiserte og aktiverte monocytter induserte nervecelledød i nesten 25 % av den totale populasjon av hjernebarknevroner, og rPH.2 var i stand til å redusere denne toksisitet til mindre enn 5 % av de totale nevroner. rPH.2 var i seg selv ikke nevrotoksisk, fordi 50 ug/ml rPH.2 ikke hadde noen effekt på nervecelledød i forhold til kulturer behandlet med kontroll-medium. Disse resultater viser tydelig at en hovedkomponent av den induserte nevrotoksisitet ved applisering av kondisjonert medium fra aktiverte HIV-1-infiserte monocytter må skyldes PAF, fordi nevrotoksisitet nesten fullstendig kan motvirkes ved samtidig inkubasjon med PAF-AH-produkt, enzymet som er ansvarlig for metabolisme av PAF i sentralnervesystemet. Disse funn antyder potensielle terapeutiske intervensjoner ved behandling av den CNS-nevrologiske sykdom assosiert med HIV-1-infeksjon.

Eksempel 21

Nesten 4 % av den japanske populasjon har lave eller upåvisbare nivåer av PAF-AH-aktivitet i deres plasma. Denne mangel er blitt korrelert med alvorlige respiratoriske symptomer hos astmatiske barn [Miwa et al., J. Clin. Invest., 82:1983-1991 (1988)] som synes å ha arvet mangelen på en autosomal recessiv måte.

For å bestemme hvorvidt mangelen oppstår fra et inaktivt men tilstedeværende enzym, eller fra en manglende evne til å syntetisere PAF-AH, ble plasma fra mange pasienter med mangelfull PAF-AH-aktivitet analysert for både PAF-AH-aktivitet (ved hjelp av metoden beskrevet i eksempel 10 for transfektanter) og for tilstedeværelse av PAF-AH ved anvendelse av de monoklonale antistoffer 90G11D og 90F2D

(eksempel 13) i en sandwich-ELISA som følger. Immulon 4 flatbunnede plater (Dynatech, Chantilly, VA) ble belagt med 100 ng/brønn av monoklonalt antistoff 90G11D og lagret over natten. Platene ble blokkert i 1 time ved romtemperatur med 0,5 % fiskehudgelatin (Sigma), fortynnet i CMF-PBS, og deretter vasket tre ganger. Pasientplasma ble fortynnet i PBS inneholdende 15 mM CHAPS og tilsatt til hver brønn på platene (50 ul/brønn). Platene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur og vasket fire ganger. 50 ul 5 ug/ml monoklonalt antistoff 90F2D, som var biotinylert ved hjelp av standardmetoder og fortynnet i PBST, ble tilsatt til hver brønn, og platene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur og deretter vasket tre ganger. 50 ul ExtraAvidin (Sigma) fortynnet 1/1000 i CMF-PBST ble deretter tilsatt til hver brønn, og platene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur før de ble fremkalt.

En direkte korrelasjon mellom PAF-AH-aktivitet og enzymnivåer ble observert. Et fravær av aktivitet i en pasients serum ble avspeilet av et fravær av påvisbart enzym. Plasmaprøver med halvparten av den normale aktivitet inneholdt likeledes halvparten av de normale nivåer av PAF-AH. Disse observasjoner antydet at mangelen på PAF-AH-aktivitet var forårsaket av en manglende evne til å syntetisere enzymet, eller var forårsaket av et inaktivt enzym som ikke ble gjenkjent av de monoklonale antistoffer.

Ytterligere eksperimenter avslørte at mangelen var forårsaket av en genetisk lesjon i det humane plasma-PAF-AH-gen. Genomisk DNA fra PAF-AH-manglende individer ble isolert og anvendt som templat for PCR-reaksjoner med PAF-AH-gen-spesifikke primere. Hvert av kodingssekvensexonene ble først amplifisert og sekvensert fra ett individ. En enkelt nukleo-tidendring innen exon 9 ble observert (en G til T i posisjon 996 av SEKV.ID. NR. 7). Nukleotidendringen resulterer i en aminosyresubstitusjon av valin med fenylalanin i posisjon 279 av PAF-AH-sekvensen (V279F). Exon 9 ble amplifisert fra genomisk DNA fra ytterligere 11 PAF-AH-manglende individer som ble funnet å ha den samme punktmutasjon.

For å teste hvorvidt denne mutasjon ødela enzymet ble det fremstilt en E. coli-ekspresjonskonstruksjon inneholdende mutasjonen ved hjelp av metoder lignende den beskrevet i eksempel 10. Når den ble innført i E. coli, ga ekspresjonskonstruksjonen ingen PAF-AH-aktivitet, mens en kontroiIkonstruksjon som manglet mutasjonen, var fullt ut aktiv. Denne aminosyresubstitusjon resulterer antakeligvis i en strukturell modifikasjon som forårsaker den observerte mangel på aktivitet og mangel på immunreaktivitet med PAF-AH-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse.

PAF-AH-spesifikke antistoffer ifølge oppfinnelsen kan således anvendes i diagnostiske metoder for å påvise unormale nivåer av PAF-AH i serum (normale nivåer er ca. 1-5 U/ml), og for å følge progresjonen av behandling av patologiske tilstander med PAF-AH. Identifikasjon av en genetisk lesjon i PAF-AH-genet tillater dessuten genetisk screening for PAF-AH-mangelen som oppvises av de japanske pasienter. Mutasjonen forårsaker tilkomst av et restriksjonsendo-nukleasesete (Maell) og tillater således den enkle metode restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme(RFLP)-analyse for å differensiere mellom aktive og mutante alleler. Se Lewin,

s. 136-141 i Genes V, Oxford University Press, New York, New York (1994) .

Screening av genomisk DNA fra 12 PAF-AH-manglende pasienter ble utført ved spalting av DNA med Maell, Southern blotting og hybridisering med en exon 9-probe (nukleotider 1-3 96 av SEKV.ID. NR. 17). Alle pasienter ble funnet å ha RFLP overensstemmende med det mutante allel.

Selv om foreliggende oppfinnelse er beskrevet i form av spesifikke utførelsesformer, er det underforstått at variasjoner og modifikasjoner vil fremgå for fagfolk. Foreliggende oppfinnelse er således kun begrenset av de med-følgende krav.

Claims

1. PAF-AH-polypeptidfragment, karakterisert ved at det er utvalgt fra gruppen bestående av polypeptider som har Met46 i SEKV.ID. NR. 8 som den innledende N-terminale aminosyre.

2. PAF-AH-polypeptidfragment ifølge krav 1, karakterisert ved at det mangler inntil 30 C-terminale aminosyrer av aminosyresekvensen med SEKV.ID. NR. 8.

3. PAF-AH-polypeptidfragment ifølge krav 1, karakterisert ved at dets C-terminale rest er en rest i SEKV.ID. NR. 8 utvalgt fra gruppen bestående av: (a) Ile429 , (b) Leu431, og (c) Asn441.

4. Variant av PAF-AH-polypeptidfragmentet ifølge krav 1, karakterisert ved at den har en aminosyre-erstatning i sekvensen med SEKV.ID. NR. 8 utvalgt fra gruppen bestående av: (a) S 108 A, (b) S 273 A, (c) D 286 A, (d) D 286 N, (e) D 296 A, (f) D 304 A, (g) D 338 A, (h) H 351 A, (i) H 395 A, (j) H 399 A, (k) C 67 S, (1) C 229 S, (m) C 291 S, (n) C 334 S, og (o) C 407 S.

5. Isolert polynukleotid, karakterisert ved at det koder for ethvert PAF-AH-polypeptidfragment ifølge kravene 1-3, ethvert variantfragment ifølge krav 4.

6. Isolert polynukleotid, karakterisert ved at det koder for et humant PAF-AH-fragment eller et variantfragment som har Met46 i SEKV.ID. NR. 8 som den N-terminale rest og Ile429 eller Asn441 som den C-terminale rest.

7. Polynukleotid ifølge ethvert av kravene 5 eller 6, karakterisert ved at det er et DNA.

8. DNA-vektor, karakterisert ved at den omfatter et DNA ifølge krav 7.

9. Vertscelle, karakterisert ved at den er stabilt transformert eller transfektert med et DNA ifølge krav 8 på en måte som tillater ekspresjon i vertscellen av et PAF-AH-polypeptidf ragment , en variant eller et variantfragment.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av et PAF-AH-polypeptidf ragment , en variant eller et variantfragment av plasma-PAF-AH, karakterisert ved dyrkning av en vertscelle ifølge krav 9 i et egnet næringspreparat og isolering av PAF-AH-fragmentet, varianten eller variantfragmentet fra cellen eller vekstmediet.

11. PAF-AH-polypeptidfragment, variant eller variantfragment, karakterisert ved at det er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 10.

12. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter PAF-AH-fragmentet, varianten eller variantfragmentet ifølge ethvert av kravene 1 eller 11, og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel, en adjuvans eller en bærer.

13. Anvendelse av PAF-AH-fragment, variant eller variantfragment ifølge ethvert av kravene leller 11 for fremstilling av et medikament til behandling av et pattedyr som er mottakelig for eller lider av en PAF-formidlet patologisk tilstand, der medikamentet administreres i en mengde tilstrekkelig til å supplere PAF-AH-aktiviteten og inaktivere patologiske effekter av PAF i pattedyret.

14. Anvendelse ifølge krav 13 der den patologiske tilstand er pleurisi, astma, rhinitt, nekrotiserende enterokolitt, akutt åndenøds syndrom," akutt pankreatitt eller nevrologisk sykdom forbundet med HIV-infeksjon.