CZ124199A3 - Zkrácená PAF acetylhydrolasa (acetylhydrolasa destičky-aktivujícího faktoru) - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká obecně PAF acetylhydrolasy (AH) (hydrolasy hydrolysující faktor aktivující destičky)a specifičtěji nově purifikovaných a izolovaných polynukleotidů kódujících lidskou plasmovou PAF acetylhydrolasu a produktu PAF-AH kódovaných polynukleotidy. Dále materiálu a metod produkce produktů rekombinantí PAF-AH a protilátek proti PAF-AH.

Dosavadní stav techniky

PAF je biologicky aktivní fosfolipid syntetizovaný různými typy buněk. In vivo a při normálních koncentracích 1O'¹⁰ až ΙΟ⁹ M PAF aktivuje cílové buňky (jako například krevní destičky a neutrofily) vazbou na specifické povrchové receptory spojené s G proteiny (Venable et al., J.Lipid Res., 34: 691-701 (1993)). PAF má strukturu l-0-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-fosfocholin. K optimální biologické aktivitě musí být na sn-1 pozici glycerolové páteře PAF navázán éterovou vazbou mastný alkohol a na sn-3 pozici musí být fosfocholinová vedoucí skupina.

PAF pracuje za normálních fyziologických procesů (např. zánětech, zástavě krvácení a porodu) a jeho role je předpokládána u patologických zánětlivých procesů (např. astma, anafylaxe, septický šok a arthitida)(Venable et al., viz předchozí citace, Lindsberg et al., Ann. Neurol., 30: 117-129 (1991). Pravděpodobnost role PAF v patologických odpovědích vedla k pokusům modulovat aktivitu PAF. Nejvíce těchto pokusů bylo zaměřeno na vývoj antagonistů aktivity PAF, které by interferovaly s vazbou PAF na buněčné povrchové receptorů. Viz např. Heuer et al., Clin. Exp. Allergy, 22: 980-983 (1992) .

Syntéza a sekrece PAF, jeho degradace a vyčištění je zřejmě vysoce kontrolováno a to do té míry, že patologické působení PAF může být výsledkem zhroucení regulačních mechanismů PAF. To vede k jeho nadměrné produkci, nepatřičné produkci nebo neschopnosti degradace. Alternativní zdroj modulace aktivity PAF by zahrnovalo napodobování nebo zvětšování přírodních procesů, kterými dochází i

• · k rozlišení zánětu. Makrofágy (Stafforini et al., J.Biol. Chem., 265 (17): 9682-9687 (1990), hepatocyty a lidské hepatomové buněčné linie HepG2 (Saton et al., J.Clin.Invest., 87:476-481 (1991) a Tarbet et al., J. Biol. Chem., 266(25):16667-16673 (1991) popsali uvolňování enzymatické aktivity, PAF acetylhydrolasy (PAF-AH), která inaktivuje PAF. Kromě toho, že inaktivuje PAF, PAF-AH také inaktivuje oxidativně fragmentované fosfolipidy jako jsou např. produkty arachidonové kaskády, které přenášejí zánět (viz Stremler et al.,

J.Biol.Chem., 266(17): 11095-11103 (1991). Inaktivace PAF PAF-AH je způsobeno především hydrolýzou PAF na sn-2 acetylované skupině a PAF-AH metabolizuje oxidativně fragmentované fosfolipidy tak, že odnímá sn-2 acyl skupinu. Dva typy PAF-AH byly identifikovány: cytoplasmatická forma nalezená v různých typech buněk a tkání jako jsou endoteliální a erytrocyty a extracelulární forma nalezená v plasmě a séru. Plasmová PAF-AH nehydrolyzuje intaktní fosfolipidy s výjimkou PAF a tato substrátová specificita dovoluje enzymu cirkulovat in vivo v plně aktivním stavu bez nepříznivých vlivů. Plasmová PAF-AH se zdá být zodpovědná za všechny degradace PAF v lidské krvi ex vivo (Stafforini et al., J.Biol. Chem., 162(9): 4223-4230 (1987))

Zdá se že zatímco cytoplasmická a plasmová forma PAF-AH mají identickou substrátovou specificitu, má plasmová PAF-AH biochemické vlastnosti, které jí odlišují od cytoplasmatické PAF-AH a od jiných lipas. Konkrétně je plasmová PAF-AH asociována s lipoproteinovými částicemi, je inhibována disopropyl fluorofosfátem, není ovlivněna vápenatými ionty, je relativně insenzitivní vůči proteolýze a má molekulovou váhu 43000 Da (viz Stafforini et al., (1987), viz výše). Stejný Stafforiniho článek popisuje postup částečné purifikace PAFAH z lidské plasmy a dále aminokyselinové složení materiálu získaného s použitím tohoto postupu. Cytoplasmatická PAF-AH byla purifikována z erytrocytů (Stafforini et al., J.Biol. Chem., 268(6): 3857-3865(1993) a deset aminokyselinových zbytků z amino-konce cytoplasmatické PAF-AH bylo v článku také popsáno. Hattori et al., J.Biol.Chem, 268(25): 18748-18753 popsal purifikaci cytoplasmatického PAF-AH z hovězího mozku. Poté, co byl k tomuto dokumentu podán patentový návrh, byla publikována nukleotidová sekvence cytoplasmatického PAF-AH z hovězího mozku v článku Hattori • · · • · · · · · φ • · · · · · · • · ··· ·· φ et. al., J.Biol.Chem., 269(237): 23150-23155 (1994). 5.ledna 1995, tři měsíce po podání patentového návrhu k tomuto dokumentu byla publikována nukleotidová sekvence lipoprotein asociované fosfolipasy A₂ (Lp-PLA₂) v Smithkline Beecham PLC Patent Cooperation Treaty (PTC) International Publication No. WO95/00649. Nukleotidová sekvence Lp-PLA₂ se liší v jedné pozici v porovnání s' nukleotidovou sekvencí PAF-AH předcházejícího vynálezu. Rozdíl v nukleotidu (odpovídající pozici 1297 SEQ ID NO:7) vedl k rozdílu v aminokyselině mezi enzymy, které byly těmito polynukleotidy kódovány. Aminokyselina v pozici 379 SEQ ID NO:8 je valin, zatímco aminokyselina na odpovídající pozici Lp-PLA₂ je alanin. Kromě toho zahrnuje nukleotidová sekvence PAF-AH předkládaného vynálezu 124 bází na 5' konci a 20 bází na 3' konci není přítomno v sekvenci LpPLA₂. Po třech měsících 10. Dubna 1995 byla do GenBank pod Accession No. U24577 uložena sekvence Lp-PLA₂, která se liší na 11 pozicích v porovnání s nukleotidovou sekvencí PAF-AH předkládaného vynálezu. Rozdíly v nukleotidech (odpovídající pozicím 79, 81, 84, 85, 86,

121, 122, 904, 905, 911, 983 a 1327 SEQ ID NO:7) vedly k rozdílům ve čtyřech aminokyselinách u enzymů kódovaných těmito polynukleotidy. Aminokyseliny na pozicích 249, 250, 274 a 389 SEQ ID NO:8 jsou lysin, kyselina asparagová, fenylalanin a leucin, zatímco příslušné aminokyseliny na odpovídajících pozicích v genové bance (GenBank) jsou izoleucin, arginin, leucin a serin.

Rekombinantní produkce PAF-AH by umožnila použití exogenního PAF-AH k napodobení či rozšíření normálních procesů rozeznání zánětu in vivo. Podávání PAF-AH by poskytlo fyziologickou výhodu před podáváním antagonistů receptoru PAF, protože PAF-AH je látka normálně se vyskytující v plasmě. Antagonisté receptoru PAF, které jsou strukturně příbuzné k PAF také inhibují nativní aktivitu PAFAH. Podávání PAF-AH by tak chránilo žádoucí metabolismus PAF a metabolismus oxidativně fragmentovaných fosfolipidů. Inhibice aktivity PAF-AH pomocí antagonistů receptoru PAF tak vlastně maří kompetitivní blokádu receptoru PAF antagonisty (viz Stremler et al., viz výše). Kromě toho v místě akutního zánětu se například uvolňují oxidanty, které vedou k inaktivaci nativního enzymu PAF-AH a to ústí následně do zvýšené lokální hladiny PAF a látek příbuzných PAF (PAFlike). Tyto látky mohou dále soutěžit s kterýmkoliv exogenně podaným antagonistou PAF receptorů o vazbu na PAF receptor. Naproti tomu by ošetření rekombinantním PAF-AH zvýšilo endogenní aktivitu PAF-AH, čímž by se kompenzovala jakákoliv inaktivace endogenního enzymu. Existuje tedy v tomto oboru potřeba identifikace a izolace polynukleotidové sekvence kódující lidský plasmový PAF-AH a dále potřeba vyvinout materiál a metody použitelné k rekombinantní produkci PAF-AH a k výrobě látek pro detekci PAF-AH v plasmě.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje nově purifikované a izolované polynukleotidy (např. DNA a RNA - obě vlákna) kódující lidskou plasmovou PAF-AH nebo její enzymaticky aktivní fragmenty.

Preferované sekvence DNA vynálezu zahrnují genomické a cDNA sekvence a také částečně nebo celkově chemicky syntetizované sekvence DNA. Ve vynálezu jsou uvažovány sekvence DNA kódující PAF-AH, které jsou popsané v SEQ ID NO:7 a sekvence DNA, které hybridizují za stringentních podmínek s nekódujícím vláknem této sekvence nebo, které by pro redundanci genetického kódu hybridizovaly. Ve vynálezu jsou také uvažovány biologické repliky (např. kopie izolovaných sekvencí DNA vytvořených in vivo nebo in vitro) sekvencí DNA vynálezu. Zajištěny jsou také autonomně se replikující rekombinantní konstrukty jako jsou plasmidové a virální vektory s inkorporovanými sekvencemi PAF-AH a zvláště poté vektory kde je DNA kódující PAF-AH operativně svázána s endogenními nebo exogenními expresními kontrolními DNA sekvencemi a transkripčními terminátory.

Podle další stránky vynálezu jsou prokaryotické a eukaryotické hostitelské buňky stabilně transformovány sekvencemi DNA vynálezu způsobem dovolujícím požadovanou expresi PAF-AH uvnitř těchto buněk. Hostitelské buňky exprimující PAF-AH produkty mohou sloužit k rozličným užitečným úkolům. Takovéto buňky vytvářejí hodnotný zdroj imunogenů pro vývoj protilátkových substancí specificky imunoreagující s PAF-AH. Hostitelské buňky dle vynálezu jsou jasně použitelné při metodách produkce PAF-AH ve velkých objemech, při kterých jsou buňky pěstovány ve vhodných kultivačních mediích a požadované polypeptidové produkty jsou izolovány z těchto buněk nebo

z média, ve kterém byly buňky pěstovány například imunoafinitní purifikací.

Neimunologické metody uvažované vynálezem purifikace PAF-AH z plasmy zahrnují následující kroky: a)izolaci nízkohustotních lipoproteinových částic; b)solubilizaci výše uvedených nízkohustotních lipoproteinových částic v pufru obsahujícím lOmM CHAPS. Takto je vytvořen první roztok PAF-AH enzymu; c)nanesení výše uvedeného prvního roztoku enzymu PAF-AH na DEAE anion-iontoměničovou kolonu; d)promytí výše uvedené DEAE anion-iontoměničové kolony pufrem o pH přibližně 7,5 obsahujícím lmM CHAPS e)elucí enzymu PAFAH z výše uvedené DEAE anion-iontoměničové kolony do frakcí pufrem o pH přibližně 7,5 obsahujícím gradient NaCl 0 až 0,5M; f)spojení frakcí majících enzymatickou aktivitu PAF-AH eluovaných z výše uvedené DEAE anion-iontoměničové kolony; g)převedení výše uvedených spojených aktivních frakcí z výše uvedené DEAE anion-iontoměničové kolony do lOmM CHAPS. Tak byl vytvořen druhý roztok PAF-AH enzymu; h)nanesení výše uvedeného druhého roztoku enzymu na afinitní kolonu s blue dye ligandem i)eluce enzymu PAF-AH z výše uvedené afinitní kolony s blue dye ligandem pufrem obsahujícím lOmM CHAPS a chaotropické soli; j)nanesení eluátu z výše uvedené afinitní kolony s blue dye ligandem na afinitní kolonu s Cu ligandem; k)eluce enzymu PAF-AH z výše uvedené afinitní kolony s Cu ligandem pufrem obsahujícím lOmM CHAPS a imidazol; 1)nanesení eluátu z výše uvedené afinitní kolony s Cu ligandem na SDS-PAGE a m)izolace přibližně 44kDa enzymu PAF-AH z SDS polyakrylamidového gelu. Přednostně je pufr v kroku b) 25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, pH 7,5; pufr v kroku d) je 25mM Tris-HCL, lmM CHAPS; kolona kroku h) je kolona s Blue Sepharose Fast Flow; pufr kroku i) je 25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS,

0,5M KSCN, pH 7,5; kolona v kroku j) je Cu Chelating Sepharose kolona a pufr kroku k) je 25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, 0,5M NaCl, 50mM imidazol při pH v rozmezí okolo 7,5-8,0.

Metoda uvažovaná ve vynálezu pro purifikaci enzymaticky aktivního PAF-AH z E.coli produkující PAF-AH zahrnuje tyto kroky b) nanesení výše uvedeného centrifugačního supernatantu na afinitní kolonu s blue dye ligandem; c) eluce enzymu PAF-AH z výše uvedené afinitní kolony s blue dye ligandem pufrem obsahujícím lOmM CHAPS a chaotropické soli; d) nanesení eluátu z výše uvedené afinitní kolony • · s blue dye ligandem na afinitní kolonu s Cu ligandem; e)eluce enzymu PAF-AH z výše uvedené afinitní kolony s Cu ligandem pufrem obsahujícím lOmM CHAPS a imidazol. Přednostně je kolona kroku b) kolona s Blue Sepharose Fast Flow; pufr kroku c) je 25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, 0,5M KSCN, pH 7,5; kolona v kroku d) je Cu Chelating Sepharose kolona a pufr kroku e) je 25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, 0,5M NaCl, 50mM imidazol, pH 7,5.

Ještě jiná metoda pro purifikaci enzymaticky aktivního PAF-AH z E.coli produkující PAF-AH je uvažována ve vynálezu. Tato metoda zahrnuje následující kroky: a)příprava centrifugačního supernatantu z lyžovaných E.coli produkující enzym PAF-AH; b)zředění výše uvedeného centrifugačního supernatantu v pufru o nízkém pH obsahujícím lOmM CHAPS; c)nanesení výše uvedeného zředěného centrifugačního supernatantu na kation-iontoměničovou kolonu ekvilibrovanou na pH okolo 7,5; d)eluce enzymu PAF-AH z výše uvedené kation-iontoměničové kolony IM solí ; e)zvýšení pH výše uvedeného eluátu z výše uvedené kation-iontoměničové kolony a upravení koncentrace solí výše uvedeného eluátu na koncentraci solí okolo 0,5M; f)nanesení výše uvedeného eluátu z výše uvedené kationiontoměničové kolony na afinitní kolonu s blue dye ligandem; g)eluce enzymu PAF-AH z výše uvedené afinitní kolony s blue dye ligandem pufrem obsahujícím soli o koncentraci okolo 2M až 3M; h)dialýza výše uvedeného eluátu z výše uvedené afinitní kolony s blue dye ligandem s použitím pufru obsahujícím asi 0,1% Tween. Přednostně je pufr v kroku b) 25mM MES, lOmM CHAPS, lmM EDTA, pH 4,9; kolona v kroku c) je S Sepharose kolona ekvilibrovaná v 25mM MES, lOmM CHAPS, lmM EDTA, 5 0mM NaCl, pH 5,5; PAF-AH je v kroku d) eluován lmM NaCl; pH eluátu v kroku e) je upravena na pH 7,5 s použitím 2M Tris-báze; kolona v kroku f) je kolona sepharosy; pufr v kroku g) je 25mM Tris, lOmM CHAPS, 3M NaCl, lmM EDTA, pH 7,5 a pufr v kroku h) je 25mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,1% Tween 80, pH 7,5.

Ještě jedna metoda purifikace enzymaticky aktivního PAF-AH z E.coli je uvažována ve vynálezu. Tato metoda zahrnuje následující kroky: a) příprava extraktu E. coli, která vede po lyži v pufru obsahujícím CHAPS k supernatantu obsahujícímu solubilizovaný PAF-AH; b) ředění výše zmíněného supernatantu a jeho aplikace na anioniontoměničovou kolonu ekvilibrovanou na pH okolo 8,0; c) eluce • · · · • ·

enzymu PAF-AH z výše uvedené anion-iontoměničové kolony; d) nanesení výše uvedeného adjustovaného eluátu z výše uvedené anioniontoměničové kolony na afinitní kolonu obsahující „blue day ligand; e)eluce výše uvedené kolony obsahující „blue day ligand pufrem obsahujícím 3,0M sůl; f) zředění eluátu z kolony obsahující „blue day ligand do pufru vhodného pro provedení hydroxylapatitové chromatografie g) provedení hydroxylapatitové chromatografie kde je promytí a eluce uskutečněna s pomocí pufrů (s obsahem či bez obsahu CHAPS); h) naředění výše uvedeného hydroxylapatitového eluátu na koncentraci solí vhodnou pro kation-iontoměničovou; i) nanesení výše uvedeného naředěného hydroxylapatitového eluátu na kationiontoměničovou kolonu při pH pohybující se v rozmezí přibližně 6,0 až 7,0; j) eluce PAF-AH z výše uvedené kation-iontoměničové kolony vhodným pufrem vhodného složení; k) provedení kation-iontoměničové chromatografie za chladu a 1) složení kapalné nebo zmražené formy PAF-AH v nepřítomnosti CHAPSu.

Nejlépe je ve výše uvedeném kroku použít a) lyzovací pufr má složení: 25mM Tris, ÍOOmM NaCl, lmM EDTA, 20mM CHAPS, pH 8,0; v kroku b) ředění supernatantu pro anion-iontoměničovou chromatografii je 3-4 krát do 25mM Tris, lmM EDTA, lOmM CHAPS, pH 8,0 a kolona je Q-Sepharosová kolona ekvilibrovaná 25mM Tris, lmM EDTA, 50mM NaCl, lOmM CHAPS, pH 8,0; v kroku c) je anioniontoměničová kolona vymývána s použitím 25mM Tris, lmM EDTA, 350mM NaCl, lOmM CHAPS, pH 8,0; v kroku d) je eluát z kroku c) aplikován přímo na afinitní kolonu s „blue dye ligandem; v kroku e) je kolona eluována pufrem obsahujícím 3M NaCl, lOmM CHAPS, 25mM Tris, pH 8,0; v kroku f) je eluát z Blue dye zředěn pro hydroxylapatitovou chromatografii. Eluát je zředěn lOmM fosforečnanem sodným, ÍOOmM NaCl, lOmM CHAPS, pH 6,2; v kroku g) je hydroxylapatitové chromatografie doprovázena použitím hydroxylapatitové kolony ekvilibrované lOmM fosforečnanem sodným, ÍOOmM NaCl, lOmM CHAPS. Eluce je prováděna s použitím 50mM fosforečnanu sodného, ÍOOmM NaCl (s či bez lOmM CHAPS), pH 7,5; v kroku h) je provedeno naředění výše uvedeného hydroxylapatitového eluátu pro kation-iontoměničovou chromatografii pomocí pufru o pH v rozmezí přibližně 6,0 až 7,0 a obsahujícím fosforečnan sodný (s či bez CHAPS); v kroku i) je kolona s S-Sepharosou ekvilibrována 50mM fosforečnanem sodným (s či bez • · · · lOmM CHAPS), pH 6,8; v kroku j) je eluce provedena pufrem vhodného složení jako například 50mM fosforečnan draselný, 12,5mM kys. aspartová, 125mM NaCl, pH 7,5 a obsahujícího 0,01% Tween 80; v kroku k) je provedena kation-iontoměničová chromatografie při 2-8°C. Příkladem pro vhodné složení pufru použitelného v kroku 1) , který stabilizuje PAF-AH je 50mM fosforečnan draselný, 12,5mM kys. aspartová, 125mM NaCl, pH přibližně 7,4(s či bez přídavku Tween 80 a/nebo Plurinicu F68) nebo 25mM fosfátový (Kl) pufr obsahující (přinejmenším) 125mM NaCl, 25mM arginin a 0,01% Tween-80 (s či bez Pluronicku F68 v koncentraci přibližně 0,1 a 0,5%).

Ještě jedna metoda purifikace enzymaticky aktivního rPAF—AH produktu E.coli je uvažována ve vynálezu. Tato metoda zahrnuje následující kroky: a)příprava extraktu E.coli, která po lyži v pufru obsahujícím Triton X-100 vede k solubilizovanému supernatantu produktu rPAF-AH; b)naředění výše uvedeného supernatantu a jeho nanesení na afinitní „exchange kolonu s imobilizovaným kovem ekvilibrovanou na pH okolo 8,0; c)eluce produktu rPAF-AH z výše uvedené afinitní „exchange kolony s imobilizovaným kovem pufrem obsahujícím imidazol; d)úprava koncentrace solí a nanesení výše uvedeného eluátu z afinitní „exchange kolony s imobilizovaným kovem na hydrofobní kolonu (hydrophobic interaction column (HIC#1); e)eluce výše uvedené HIC#1 snížením koncentrace solí a/nebo zvýšením koncentrace detergentu; f) titrace výše uvedeného eluátu z HIC#1 na pH okolo 6,4; g) nanesení výše uvedeného upraveného eluátu z HIC#1 na kation-iontoměniěovou kolonu (CEX#1) ekvilibrovanou na pH cca 6,4; h)eluce výše uvedené CEX#1 s použitím koncentrace chloridu sodného; i) úprava výše uvedeného eluátu z CEX#1 pomocí chloridu sodného na koncentraci okolo 2,0 M; j) nanesení výše uvedeného eluátu z CEX#1 na hydrofobní kolonu (hydrophobic interaction column (HIC#2) ekvilibrovanou na pH okolo 8,0 a koncentraci chloridu sodného okolo 2,0 M; k) eluce výše uvedené HIC#2 snížením koncentrace solí a/nebo zvýšením koncentrace detergentu; 1) naředění výše uvedeného eluátu z HIC#2 a úprava pH na hodnotu okolo 6,0; m)nanesení výše uvedeného upraveného eluátu z HIC#2 na kationiontoměniěovou kolonu (CEX#2) ekvilibrovanou na pH okolo 6,0; n) eluce produktu rPAF-AH z výše uvedené CEX#2 pufrem o vhodném složení.

• · · · • · · · ·

Nejlépe je použít ve výše uvedeném kroku a) lyzovací pufr 90mM TRIS, 0,125% Triton X-100, 0,6M NaCl, pH 8,0. Lyže je provedena ve vysokotlakém homogenizátoru; v kroku b) je supernatant naředěn ekvilibračním pufrem (20mM TRIS, 0,5 M NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 8,0), zinková chelátová kolona (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia, Uppsala, Švédsko) je nabitá a ekvilibrovaná ekvilibračním pufrem. Na kolonu je nanesen naředěný supernatant a kolona je promyta pufrem o složení 20mM TRIS, 0,5M NaCl, 4M močovina, 0,1% Triton X-100, pH 8,0 a dále promyta 20mM TRIS, 0,5M NaCl, 0,02% Triton X-100, pH 8,0; v kroku c) je eluce dokonalá pomocí roztoku o složení 20mM Tris, 50mM imidazol, 0,02% TritonX-100, pH 8,0; v kroku d) je eluát upraven na lmM EDTA a 2M NaCl, kolona Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia) je ekvilibrována ekvilibračním pufrem (2,0M NaCl, 25mM Tris, 0,02% Triton X-100, pH 8,0) a je na ní nanesen eluát z kroku c) při pokojové teplotě. Kolona je promyta ekvilibračním pufrem a dále promyta roztokem o složení 25mM NaPO₄, 0,02% Triton X-100, pH 6,5 rychlostí 30cm/hod.; v kroku e) je eluce dokonalá pomocí roztoku 25mM NaPO₄, 3% Triton X-100, pH 6,5; v kroku g) je kolona Macro-prep High S Column (Bio-Rad Labs, Richmond, CA, USA) ekvilibrována ekvilibračním pufrem (20mM NaPO₄, 0,02% Triton X100, pH 6,4). Upravený eluát z kroku f) je nanesen na kolonu, promyt ekvilibračním pufrem a dále promyt pufrem o složení 25mM NaPO₄, 0,02% Triton X-100, pH 8,0; v kroku h) je eluce dokonalá pomocí roztoku o složení 25mM NaPO₄, 0,02% Triton X-100, 1,3M NaCl, pH 8,0; v kroku j) je Bakerbond Wide Póre Hi-Propyl C₃ (Baker, Phillipsburg, NJ) ekvilibrována ekvilibračním pufrem (0,02% Triton X-100, 2M NaCl, 25mM Tris, pH 8,0). Upravený eluát z kroku i) je nanesen při pokojové teplotě na tuto kolonu, kolona je promyta ekvilibračním pufrem a dále promyta roztokem o složení 0,02% Triton X-100, 25mM Tris, pH 8,0 rychlostí 30cm/hod.; v kroku k) je eluce dokonalá za použití roztoku o složení lOmM Tris, 3,0% Triton X-100, pH 8,0; v kroku 1) je naředění do ekvilibračního pufru (20mM skcinát, 0,1% PLURONIC F68m pH 6,0); v kroku m) je kolona SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia) ekvilibrována ekvilibračním pufrem kroku 1) a na ni dále nanesen eluát z kroku 1) a kolona je promyta ekvilibračním pufrem; a v kroku n) je eluce dokonalá s pomocí roztoku o složení 50mM NaPO₄, 0,7M NaCl, 0,1% PLURONIC F68, 0,02% TWEEN 80, pH 7,5.

• ·

I « • · • · · · • · · ·

PAF-AH produkty mohou být získány jako izoláty z přírodních buněčných zdrojů nebo mohou být chemicky syntetizovány. Přednostně jsou ale produkovány rekombinantnimi postupy zahrnujicimi hostitelské eukaryotické a prokaryotické buňky tohoto vynálezu. PAFAH produkty, které mají část nebo celou aminokyselinovou sekvenci popsanou v SEQ ID NO: 8 jsou uvažovány v tomto vynálezu. Zvláště jsou uvažovány fragmenty postrádající až prvních dvanáct N-koncových aminokyselin lidské aminokyselinové sekvence PAF-AH popsané v SEQ ID NO:8. Zvláště ty, které mají jako iniciační N-koncovou aminokyselinu Met₄₆, Ala₄₇ nebo Ala₄₈ SEQ ID NO: 8. Uvažovány jsou také fragmenty tohoto postrádající až třicet C-koncových aminokyselin aminokyselinové sekvence SEQ ID NO:8, zvláště pak ty, které mají Ile₄₂9 a Leu₄₃i jako C-koncový zbytek. Uvažovány jsou dále obměny PAFAH nebo PAF-AH nebo ty, které mají v sekvenci SEQ ID NO:8 nahrazenu aminoskupinu a které jsou vybrány ze skupiny skládající se z S 108 A, S 273 A, D 286 A, D 286 N, D 296 A, D 304 A, D 338 A, H 351 A, H 395 A, H 399 A, C 67 S, C 229 S, C 291 S, C 334 S, C 407 S, D 286 A, D 286 N a D 304 A. Jak.je poznamenáno výše, jsou polynukleotidy (včetně DNA) kódující takovéto fragmenty nebo obměny fragmentů zajištěny vynálezem. Vynálezem jsou zajištěny také způsoby rekombinantní produkce těchto fragmentů nebo obměn pěstováním hostitelských buněk obsahujících takovéto DNA. Současně upřednostňované PAF-AH produkty zahrnují prokaryotické polypeptidové expresní produkty DNA kódující aminokyselinové zbytky Met_4e až Asn_44i SEQ ID NO:8 označované jako rPH.2 a prokaryotické polypeptidové expresní produkty DNA kódující aminokyselinové zbytky Met_4S až Ile₄₂₉ SEQ ID NO:8 označované jako rPH.9. Oba produkty (rPH.2 a rPH.9) vykazují nižší aminokoncovou heterogennost než, například, odpovídající prokaryotické polypeptidové expresní produkty DNA kódující celou sekvenci PAF-AH s předcházejícím translačním iniciačním kodonem. Kromě toho rPH.9 vykazuje vyšší karboxy koncovou homogenitu (konzistenci). Použití savčích hostitelských buněk je předpokládáno k zajištění takovýchto posttranslačních modifikací (např. myristolace, glykosilace, zkrácení, lipidace a tyrosin, serin a treonin fosforylace), které mohou být potřebné k udělení optimální biologické aktivity rekombinantních expresních produktů vynálezu. PAF-AH produkty popsané ve vynálezu mohou mít plnou délku, mohou to

být fragmenty nebo obměny. Obměny mohou obsahovat PAF-AH analoga, kde je jedna nebo více specifikovaných (např. přirozeně kódovaných) aminokyselin vyjmuto nebo nahrazeno nebo kde je jedna nebo více nespecifikovaných aminokyselin přidáno 1) bez ztráty jedné nebo více enzymatických aktivit nebo imunologických charakteristik specifických pro PAF-AH nebo 2)se specifickou neschopností konkrétní biologické aktivity PAF-AH. Proteiny nebo další molekuly, které se váží na PAF-AH mohou být použity k modulaci její aktivity.

V předkládaném vynálezu jsou také uvažovány „protilátkové substance (např. monoklonální a polyklonální protilátky, jednořetězcové protilátky, chimérické protilátky, CDR roubované protilátky apod.) a další vazebné proteiny specifické pro PAF-AH. Konkrétně demonstrativní vazebný proteiny vynálezu jsou monoklonální protilátky produkované hybridomy 90G11D a 90F2D, které byly uloženy v American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 30 září 1994 a byly jim přiděleny Accession Nos. HB 11724 a HB 11725. Další demonstrativní vazebný protein vynálezu je monoklonální protilátky produkovaná hybridomem 143Á, který byl uložen v ATCC 1 června 1995 a jemu přidělené Accession No. Je HB 11900. Proteiny nebo jiné molekuly (např. lipidy nebo malé molekuly), které se specificky váží na PAF-AH mohou být identifikovány s použitím PAF-AH izolované z plazmy, rekombinantního PAF-AH, obměn PAF-AH nebo buněk exprimujícich takovéto produkty. Vazebné proteiny jsou použitelné následovně ve směsích pro imunizaci a také pro purifikaci PAF-AH. Jsou také použitelné k detekci nebo kvantifikaci PAF-AH v tekutinách a tkáňových vzorcích pomocí známých imunologických postupů. Uvažovány jsou také antiidiotypické protilátky specifické pro PAF-AH specifické protilátkové substance.

Vědecká hodnota informací poskytnutých skrze odhalení DNA a aminokyselinové sekvence předkládaným vynálezem je zřejmá. Jedna ze série příkladů: znalost sekvence cDNA pro PAF-AH umožňuje za použití hybridizací DNA/DNA izolaci genomických DNA sekvencí kódujících PAFAH a specifikaci PAF-AH expresních kontrolních regulačních sekvencí jako jsou promotory, operátory apod. Postupy DNA/DNA hybridizací prováděných se sekvencemi DNA vynálezu při standardních podmínkách stringence taktéž zřejmě dovolí izolaci DNA kódujících alelické varianty PAF-AH, dalších strukturně příbuzných proteinů sdílejících • · • · · · · · • ·

jednu nebo více biochemických a/nebo imunologických vlastností PAFAH a také proteinových homologů PAF-AH z jiných (než lidských) zdrojů. DNA sekvenční informace poskytované předkládaným vynálezem dovolují také pomocí homologních rekombinací nebo „knockout stratedií (viz např. Kapecchi, Science, 244: 1288-1292 (1989)), vývoj hlodavců, kteří neumí exprimovat funkční enzym'PAF-AH nebo exprimovat obměnu PAF-AH enzymu. Vhodně označené polynukleotidy popsané ve vynálezu jsou použitelné při hybridizačních testech k detekci kapacity buněk syntetizovat PAF-AH. Polynukleotidy popsané ve vynálezu mohou být také základem diagnostických metod užitečných k identifikaci a genetickým úpravám v PAF-AH centru, které vyzdvihuje stav nebo stavy nemoci. Dostupné dělá vynález také antisence polynukleotidy, významné při regulaci exprese PAF-AH těmi buňkami, které zpravidla exprimují to samé.

Je uvažováno podávání preparátů PAF-AH vynálezu savčím subjektům, zvláště lidem s cílem ameliorace patologických zánětlivých stavů. Na základě důkazů o zapojení PAF v patologických zánětlivých stavech je podávání PAF-AH indikováno např. při ošetření astma (Miwa et al., J.Clin.Invest., 82: 1983-1991 (1988); Hsieh et al., J.Allergy Clin. Immunol., 91: 650-657 (1993); a Yamashida et al., Allergy, 49: 60-63 (1994)), anafylaxe (Venable et al., viz výše), šoku (Venable et al., viz výše), reperfůzní poranění a ischemie centrálního nervového systému (Lindsberg et al. (1991), viz výše), antigeny vyvolané artritidy (Zarco et al., Clin. Exp. Immunol., 88: 318-323 (1992)), aterogenese (Handley et al., Drug Dev. Res., 7: 361-375 (1986)) Crohnovy nemoci (Ďenizot et al., Digestive Diseases and Sciences, 37(3): 432-437 (1992)), ischemické nekrózy střeva/ nekrotizující enterokolitidy (Ďenizot et al., viz výše a Caplan et al., Acta Paediatr., Suppl. 396, 11-17 (1994)), ulcerózní kolitidy (Ďenizot et al., viz výše), ischemické mozkové příhody (Saton et al., Stroke 23: 1090-1092 (1992)), ischemického poranění mozku (Lindsberg et al., Stroke , 21: 1452-1457 (1990), a Lindsberg et al., (1991), viz výše), systémové lupus erythematotus (Matsizaki et al., Clinica Chimica Acta, 210: 139-144 (1992)), akutní pankreatitidy (Kald et al., Pancreas, 8(4): 440-442 (1993)), otravy krve (Kald et al., viz výše), akutní poststreptokokové glomerulonefritidy (Mezzano et al., J.Am.Soc. Nephrol., 4: 235-242 • fl · * · · ·· (1993), plicního otoku jako reakce na léčení IL-2 (Rabinovici et al., J.Clin.Invest., 89: 1669-1673 (1992)), alergického zánětu (Watanabe et al., Br.J.Pharmacol., 111: 123-130 (1994)), ischemického selhání ledvin (Grino et al., Annals of Internal Medicine, 121(5): 345-347 (1994)); předčasného porodu (Hoffman et al., Am.J.Obstet. Gynecol., 162(2):525-528 (1990) a Maki et al.,

Proč.Nati.Acad.Sci. USA, 85: 728-732 (1988)); syndromu respirační nedostatečnosti dospělých (Rabinovici et al., J.Appl. Physiol., 74(4): 1791-1802 (1993); Matsumoto et al., Clin.Exp.

Pharmacol.Physiol., 19 509-515 (1992) a Rodriguez-Roisin et al., J.Clin. Invest., 93: 188-194 (1994)). Použití PAF-AH přípravků k ošetření HIV infekce centrálního nervového systému je také ve vynálezu uvažováno. „Ošetření”, jak je zde používáno, zahrnuje jak profylaktické tak i terapeutické ošetření.

Pro mnoho z dříve zmíněných patologických stavů byl popsán pokusný zvířecí model. Například myšší model pro astma a rinitidu je popsán v příkladu 16 tohoto dokumentu; králičí model pro artritidu je popsán v Zarco et al., viz výše; krysí modely pro ischemickou nekrozu střev/ nekrotizující enterokolitidu jsou popsány v Furukawa et al., Ped.Res., 34(2): 237-241 (1993) a Caplan et al., viz výše; králičí model pro mrtvici je popsán u Lindsberga et al., (1990), viz výše; myšší model pro lupus je popsán v Matsuzaki et al., viz výše; krysí model pro akutní pankreatitidu je popsán u Kald et al., viz výše; krysí model pro otok plic jako výsledek terapie IL-2 je popsán u Rabinovici et al., viz výše; krysí model alergického zánětu je popsán u Watanabe et al., viz výše; psí model pro ledvinový aloimplantát je popsán u Watson et al., Transplantation, 56(4): 1047-1049 (1993) a krysí a morčecí modely syndromu respirační nedostatečnosti dospělých jsou samostatně popsány v Rabinovici et al., viz výše a Lellouch-Tubiana, Am.Rev.Respir.Dis., 137:948-954 (1988) .

Zvláště uvažované jsou ve vynálezu směsi PAF-AH použitelné při metodě ošetření savců snadno podléhajících nebo trpících patologickými stavy způsobenými PAF. Takovéto ošetření zahrnuje podávání PAF-AH savcům v množstvích dostatečných k doplnění endogenní aktivity PAF-AH a k inaktivaci patologických množství PAF u těchto savců.

·

9 • · · • 44 • · • · * • 4 44 · ·

Terapeuticko-farmakologická směs uvažovaná ve vynálezu zahrnuje PAF-AH produkty a fyziologicky akceptovatelné ředidla nebo nosiče. Může také zahrnovat další látky mající protizánětlivé účinky. Indikované množství dávky by bylo dostatečné k doplnění endogenní aktivity PAF-AH a k inaktivaci patologických množství PAF. Pro obecnou úvahu o dávkách viz Remmington's Pharmaceutioal Sciences, 18^th Edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Dávky se budou pohybovat mezi 0,1 až asi lOOOpg PAF-AH/kg tělesné hmotnosti. Terapeutické směsi vynálezu mohou být podávány různými cestami v závislosti na patologických stavech, které mají být léčeny. Podávání může být například intravenózní, subkutánní, orální, ve formě čípku a/nebo plicními cestami.

U patologických stavů plic je podávání PAF-AH plicními cestami zvláště indikováno. Pro použití při pulmonárním podávání je zvažováno široké spektrum „doručovacích zařízení běžné pro tyto účely, např. nebulizéry, inhalátory s měřením a práškové inhalátory. „Doručení různých proteinů do plic a oběhového systému inhalací aerosolových směsí bylo popsáno v Adjei et al., Pharm. Res., 7(6): 565-569 (1990)(leuprolide acetat); Braquet et al., J.Cardio. Pharm., 13(Supp.5): s. 143-146 (1989)(endothelin-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine, III(3), 206-212 (1989) (al-antitrypsin) ; Smith et al., J.Clin.Invest., 84: 1145-1146 (1989)(α-1-proteinase inhibitor); Debs et al., J.Immunol.,140: 3482-3488 (1933)(rekombinantní gamma interferon a tumorový nekrotický faktor alfa); Patent Cooperation Treaty (PCT) International Publication No. WO 94/20069 publikovaný 15 září 1994 (rekombinant pegylated granulocyte colony stimulating factor).

Popis obrázků na výkresech

Množství dalších stránek a výhod předkládaného vynálezu bude zřejmé po zvážení následujících detailních vysvětleních, ve kterých bude odkazováno na obrázky kde je:

Obr.l: Fotografie PVDF membrány obsahující PAF-AH purifikovaný z lidské plasmy.

Obr.2: Graf ukazující enzymatickou aktivitu rekombinantní lidské plasmové PAF-AH.

Obr.3: Schématický nákres znázorňující rekombinantní fragmenty PAFAH a jejich katalytické aktivity.

Obr.4: Hmotová spektroskopie rPH.2 - rekombinantního produktu PAFAH.

Obr.5: Hmotová spektroskopie rPH.9 - rekombinantního produktu PAFAH.

Obr.6: Sloupcový graf ilustrující blokádu edému nohy krys vyvolaného PAF lokálně podaným rekombinantním PAF-AH tohoto vynálezu.

Obr.7: Sloupcový graf ilustrující blokádu edému nohy krys vyvolaného PAF intravenózně podaným rekombinantním PAF-AH.

Obr.8: Sloupcový graf znázorňující, že PAF-AH blokuje edém vyvolaný PAF, ale ne edém vyvolaný zymosanem A.

0br.9A a 9B: Antizánětlivá aktivita PAF-AH u edému nohy krys závislost na velikosti dávky.

Obr.lOA a 10B: Časová závislost in vivo účinnosti jedné dávky PAFAH.

Obr.11: Čárový graf znázorňující farmakokinetiky PAF-AH v krevním oběhu krysy.

Obr.12: Sloupcový graf znázorňující protizánětlivé účinky PAF-AH v porovnání s nižším účinkem antagonistú PAF u edému nohy krys.

Obr.13: Znázornění výsledků indikujících, že PAF-AH neutralizuje apoptické účinky média z HIV-1 infikovaných a aktivovaných monocytů.

Příklady provedení vynálezu

Následující uvedené příklady slouží k ilustraci vynálezu. Příklad 1 uvádí novou metodu purifikace PAF-AH z lidské plazmy. Příklad 2 popisuje mikrosekvenování aminokyselinových zbytků PAF-AH purifikovaného z lidské plazmy. V Příkladu 3 je popsáno klonování cDNA celého genu (full lenth cDNA) kódujícího lidský plazmatický PAF-AH. V Příkladu 4 jsou popsány různé varianty složení genu kódujícího lidský plazmatický PAF-AH. Klonování genových sekvencí kódujících lidský plazmatický PAF-AH je popsáno v Příkladu 5. Příklad 6 popisuje klonování homologů cDNA pro lidský plazmatický • · · · • · » · · · » · · • · » ·

PAF-AH pro psí, myší, hovězí, kuřecí, hlodavčí cDNA a cDNA z makaka. V Příkladu 7 jsou popsány výsledky testu prokazujícího enzymatickou aktivitu rekombinantního PAF-AH transientně exprimovaného v buňkách COS 7. Příklad 8 popisuje expresi DNA reprezentující klon o plné délce DNA, zkrácenou DNA a chimérické DNA pro lidský PAF-AH v E.coli, S. cerevisiae a savčích buňkách. Příklad 9 uvádí protokol pro purifikaci rekombinantního PAF-AH z E.coli a testy potvrzující jeho enzymatickou aktivitu. Příklad 10 popisuje různé rekombinantní produkty pro PAF-AH včetně analogů vzniklých substitucí aminokyselinových zbytků a produktů vzniklých zkrácením na amino a karboxy koncích . Dále je zde popsán pokus dokazující, že nativní PAF-AH izolovaný z plazmy je glykosylovaný.Výsledky analýz provedených pomocí Northern blotu pro důkaz exprese lidské plazmatické PAF-AH RNA v různých tkáních a buněčných liniích jsou prezentovány v Příkladu 11, zatímco výsledky hybridizace in sítu jsou uvedeny v Příkladu 12. Příklad 13 popisuje vývoj monoklonálních a polyklonálních protilátek specifických pro lidský plazmatický PAF-AH. Příklady 14, 15, 16, 17, 18 a 19 popisují na zvířecích modelech in vivo terapeutické vlivy podávání rekombinantních produktů PAF-AH dle vynálezu na akutní záněty; zánět pohrudnice, astma, nekrotizující enterokolitidu (střevní katar), syndrom dechové nedostatečnosti dospělých a pankreatitidu. Příklad 20 popisuje in vitro vliv rekombinantního produktu PAF-AH na neurotoxicitu spojenou s infekcí HIV. Příklad 21 ukazuje výsledky imunologického vyšetření séra lidských pacientů vykazujících deficienci v aktivitě PAF-AH a popisuje identifikaci genetických poruch u pacientů, které jsou zjevně zodpovědné za tuto nedostatečnost.

Příklad 1

Za účelem získání materiálu pro aminokyselinovou sekvenaci lidského plazmatického PAF-AH byla provedena jeho purifikace .

A. Optimalizace purifikačních podmínek • · · » • ·· · to <· • · · · • · · ···· · >

• to • ·· • ·

Nejprve se z plazmy odstranily lipoproteinové částice o nízké hustotě (low density lipoprotein- LDL), a to pomocí precipitace fosowolframanem z plazmy a následnou solubilizací v 0.1% Tween 20. Dále následovala chromatografie na sloupci DEAE (Pharmacia, Uppsala, Sweden) postupem popsaným Stafforinim a dalšími (1987), viz výše, ale nekonsistentní eluce aktivity PAF-AH ze sloupce DEAE si vyžádala přehodnocení solubilizace a následných podmínek purifikace.

Tween 20, CHAPS (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) a oktylglukosid byly hodnoceny v použitých centrifugačních metodách a gelové filtrační chromatografií na svou schopnost solubilizovat částice LDL. CHAPS vykázal o 25 % větší návratnost aktivity v rozpustné frakci než Tween 20 a o 300 % větší výtěžek aktivity než oktylglukosid. Precipitát LDL solubilizovaný 10 mM CHAPS se potom dělil na sloupci DEAE

Sepharosy Fast Flow ( je to sloupec aniontového měniče; Pharmacia) pomocí pufru obsahujícího 1 mM CHAPS. Tak bylo získáno velké množství částečně načistěného PAF-AH („DEAE pool''), které sloužilo k hodnocení dalších sloupců.

DEAE pool byl použit jako startovní materiál k testování dalších různých chromatografických sloupců, které byly použity pro další čistění aktivity PAF-AH. Mezi testovanými sloupci byly : Blue Sepharose Fast Flow (Pharmacia), sloupec pro afinitní chromatografií s barevným ligandem; S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), kationtový měnič; Cu Chelating Sepharose (Pharmacia), sloupec pro afinitní chromatografií využívající kovových ligandů; Fractogel S (EM Separations, Gibbstown, NJ), kationtový měnič a Sephacryl -200 (Pharmacia), sloupec pro gelovou filtraci.Všechny tyto chromatografické postupy však přinesly pouze nízký stupeň načistění, jestliže se použil 1 mM CHAPS. Následná gelová chromatografie na Sephacrylu S-200 v 1 mM CHAPS poskytla enzymaticky aktivní frakci, která se však vymývala ze sloupce ve větším rozsahu velikostí, než byla předpokládaná velikost odpovídající přibližně 44 kDa. Z tohoto zjištění vyplývá závěr, že LDL proteiny jsou v roztoku agregovány.

Různé vzorky LDL se proto hodnotily pomocí analytické gelové filtrace, kdy se hodnotil stupeň agregace a jeho vliv na aktivitu PAF-AH. Vzorky z DEAE poolu a čerstvě rozpuštěné LDL precipitáty se analyzovaly na sloupci Superose 12 (Pharmacia) ekvilibrovaném pufrem s 1 mM CHAPS. Oba vzorky se eluovaly ze sloupce v širokém rozmezí molekulových hmotností, nejvyšší aktivita byla nalezena ve frakci o molekulové hmotnosti vyšší než 150 kDa. Jestliže se vzorky analyzovaly na sloupci Superose 12 ekvilibrovaném 10 mM CHAPS, největší množství aktivity se nacházelo ve frakci o molekulové hmotnosti přibližně 44 kDa, což je oblast kde byla aktivita předpokládána. Vzorky, které obsahovaly aktivitu ve frakcích o vyšší molekulové hmotnosti, odpovídaly agregátům.

Aktivita ostatních vzorků se po následujícím testování pomocí gelové filtrace nalézala výhradně v rozsahu molekulové hmotnost odpovídající 44 kDa. Tyto vzorky byly precipitáty LDL rozpuštěné v 10 mM CHAPS za přítomnosti 0.5 M NaCl a dále vzorky z DEAE poolu, které byly upraveny po elucí ze sloupce pomocí 10 mM CHAPS. Získané výsledky potvrzují, že k zamezení agregace vzorků PAF-AH je nutné použít minimálně 10 mM CHAPS. Zvýšení koncentrace CHAPS z 1 mM na 10 mM po chromatografií na sloupci DEAE celulózy, ale před dalšími kroky purifikačního postupu, navodilo dramatické změny v purifikačním postupu. Například, stupeň načistění PAF-AH na sloupci S-Sepharosy Fast Flow se zvýšilo z dvojnásobku na desetinásobek. Aktivita PAF-AH se váže v 1 mM CHAPS na sloupec Blue Sepharosy Fast Flow ireversibilně, ale použije-li se 10 mM CHAPS, vymyje se ze sloupce velmi vysoká hladina aktivity. Chromatografie na sloupci DEAE se však přidánímlO mM CHAPS oproti předcházejícím chromatografiím nezlepšilo.

Chromatografie na sloupci Cu Chelating Sepharosy, která následovala po chromatografií na Blue Sepharose Fast Flow, zvýšilo aktivitu PAF-AH patnáctkrát.. Také se zjistilo, že aktivita PAF-AH se může obnovit po elektroforéze na redukujícím SDSpolyakrylamidovém gelu, vzorek se však před elektroforézou nesmí vařit. Aktivita materiálu získaného elucí ze sloupce Cu Chelating Sepharose, se po elektroforéze na SDS polyakrylamidovém gelu a následném barvení stříbrem , vyskytovala v hlavním proužku proteinu.

B. Protokol pro purifikaci PAF-AH • · · · • · * · ( · * * · · • · · «

Nový protokol pro purifikaci PAF-AH pro účely aminokyselinového sekvenování obsahuje následující kroky, které jsou prováděny při 4° C.Lidská plazma se rozdělila po

900 ml alikvotech do 1 litrových lahví firmy Nalgene a upravila se hodnota pH na 8.6. LDL částice se potom precipitovaly přidáním 90 ml 3.85% fosfowolframanu sodného a potom následným přidáním 2M MgCl₂. Plasma se poté centrifugovala 15 minut při 3600 g. Pelet byl resuspendován v 800 ml 0.2% citrátu sodného.

LDL částice se znovu vysrážely pomocí přidání 10 g NaCl a 24 ml 2M MgCl₂. LDL částice získané z 5 1 lidské plazmy se rozpustily v 5 1 pufru A (25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, pH 7.5) a nechaly se míchat přes noc. Rozpuštěné LDL částice se centrifugovaly při 3600 g po dobu 1.5 hodiny. Supernatant se schraňoval, po té se přefiltroval přes filtrační papír Whatman 113, čímž se odstranily zbylé pevné částice. Solubilizované LDL částice se nasadily na sloupec DEAE Sepharosy Fast Flow (11 x 10 cm; objem pryskyřice 1 1 ; 80 ml/min), který byl ekvilibrován pufrem B (25 mM Tris-HCl, lmM CHAPS, pH 7.5).Sloupec se promýval 8 1 gradientu 0-0.5 M NaCl a jímaly se 480 ml frakce. Tento krok byl nezbytný pro navázání látky na sloupec Blue Sepharosy Fast Flow, tak jak je popsáno dále.Frakce byly testovány na aktivitu acetylhydrolasy, a to metodou, která je popsaná v Příkladu 4.

Frakce vykazující aktivitu se slily a přidalo se takové množství CHAPS, aby v celém objemu frakcí jeho koncentrace dosáhla 10 mM. Všechny frakce získané po chromatografií na DEAE se nanášely přes noc rychlostí 4ml /minutu na sloupec Blue Sepharosy Fast Flow (5cm x 10 cm, mrtvý objem 200 ml) ekvilibrovaný pufrem obsahujícím 0.5 M NaCl. Sloupec se promýval ekvilibračním pufrem rychlostí 16ml/minutu, a to až do té doby, než se absorbance vrátila na hodnotu pro absorbance naměřené před aplikací vzorku. Aktivita PAF-AH se vymývala ze sloupce pomocí krokové eluce pufrem A obsahujícím 0.5 M KSCN (chaotropní sůl), a to rychlostí 16ml/min. Sbíraly se 50 ml frakce. Tento krok vedl k více než tisícinásobnému načištění enzymového preparátu. Sbíraly se aktivní frakce , po té se v celém jejich nasbíraném objemu upravilo pH na hodnotu 8.0, a to pomocí 1M Tris-HCl, pH 8.0.Aktivní frakce získaná po chromatografií na sloupci Blue

Sepharosy Fast Flow se nanesla na sloupec Cu Chelating Sepharosy (2.5 x 2 cm, mrtvý objem 10 ml; průtoková rychlost 4ml/min), který byl ekvilibrovaný pufrem C (25 mM Tris-Hcl, 10 mM CHAPS,

0.5 M NaCl, pH 8.0, lze použít i pufr s pH 7.5). Sloupec byl vymýván objemem 50 ml pufru C. Aktivita PAF-AH se vymývala ze sloupce 100 ml 50mM imidazolu v pufru C a sbíraly se 10 ml frakce. Eluent s aktivním PAF-AH se shromáždil a nechal se dialyzovat proti pufru A. Kromě toho, že se tímto krokem 15 krát zvýšila aktivita daného enzymového preparátu PAF-AH, chromatografie na sloupci Cu Chelating Sepharose dala jen velmi malé načištění. Aktivní eluent ze sloupce Cu Chelating Sepharose byl redukován v 50 mM DTT po dobu 15 minut při 37° C a po té byl nanesen na 0.75 mm 7.5% polyakrylamidový gel. Gelové plotny byly nakrájeny na proužky o šířce 0.5 cm a vloženy do centrifugační mikrokyvety na jedno použití obsahující 20 μΐ 25 mM Tris-DCl, 10 mM CHAPS, 150 mM NaCl. Proužky byly po té rozetřeny a ponechány inkubovat v kyvetě přes noc při 4° C. Supernatant vzniklý centrifugací těchto rozdrcených gelových proužku se po té testoval na aktivitu PAF-AH, tím se určilo, který proužek na gelu SDS-PAGE obsahuje PAF-AH. Aktivita PAF-AH byla nalezena v proužku odpovídající molekulové hmotnosti přibližně 44 kDa. Proteiny z duplicitního gelu bylo přeneseny elektricky na PVDF membránu (Immobilon-P, Millipore) a obarveny Comassie Blue. Fotografie PVDF membrány je na obrázku 1.

Tak, jak je ukázáno v Tabulce č.l dále v textu, z 5 1 lidské plazmy se získalo přibližně 200 μg PAF-AH načištěného 2 x 10⁶.

Pro srovnání, Stafforini a další (1987), viz výše, popsal ve svém postupu načištění aktivity 3 x 10⁴ .

·

Tabulka 1

Vzorek	Obj em (ml)	Aktivita (cpmxlO6)	Celková aktivita (cpmxlO6)	Konc. proteinů (mg/ml)	Specifická aktivita (cpmxlO6)	% návratnosti
aktivity	Násobek načištění
(cpm	xlO6)
						krok	celk.	krok	celk
plazma	5000	23	116	62	0,37	100	100 ·	1	1
LDL	4500	22	97	1,76	12	84	84	33	33
DEAE	4200	49	207	1,08	46	212	178	3,7	124
Blue	165	881	14	0,02	54200	70	126	1190	1,5xl05
Cu	12	12700	152	0,15	82200	104	131	1,5	2,2xl05
SDS-PAGE	-	-	-	-	-	-	-	~10	2,2xl05

Souhrnně můžeme konstatovat, že pro úspěšnou purifikaci PAF-AH z plazmy za účelem mikrosekvenování jsou unikátní a kritické následující kroky: (1) rozpuštění a chromatografie na v 10 mM CHAPS, (2) afinitní chromatografie na sloupci s modrým ligandem jako je Blue Sepharose Fast Flow, (3) chromatografie na Cu ligandovém afinitním nosiči, jako je Cu Chelating Sepharose a za (4) eluce PAF-AH z gelu po SDS-PAGE.

Příklad 2

Proužek s proteiny o velikosti asi 44 kDa byl vystřižen z PVDF membrány obsahující PAF-AH (popsáno v Příkladě 1), sekvence přítomných bílkovin byla stanovena pomocí proteinového sekvenátoru Applied Biosystems 473A. Analýza sekvencí N-koncové oblasti proteinů migrujících v oblasti asi 44 kDa, která vykazuje PAF-AH aktivitu, naznačila přítomnost dvou majoritních a dvou minoritních sekvencí. Poměr obou majoritních sekvencí byl 1:1, proto bylo obtížné interpretovat sekvenční data.

Aby bylo možno odlišit sekvence obou majoritních proteinů rozdělených na SDS gelu, byl duplikát PVDF membrány s proužkem kolem 44 kDa rozpůlen a horní i dolní část byla sekvenována odděleně.

Sekvence N-konce získaná z dolní poloviny membrány je následuj ící:

SEQ ID NO: 1

FKDLGEEAFKALVLIAF • *

• ft

Po prohledání databazí proteinů byla tato sekvence ztotožněna s fragmentem lidského serumalbuminu. N-koncová sekvence stanovená u materiálu z horní poloviny téže PVDF membrány je následující:

SEQ ID NO: 2

IQVLMAAASFGQTKIP

Tato sekvence neměla protějšek v žádném proteinu ze zkoumaných databazí a lišila se od N-koncové sekvence aminokyselin:

SEQ ID NO: 3 MKPLVVFVLGG popsané u erytrocytového cytoplazmatického PAF-AH ve Stafforini et al. (1993), viz výše. Nová sekvence (SEQ ID NO: 2) byla využita při klonování cDNA lidské plazmatické PAF-AH, jak je popsáno dále v Příkladu 3.

Příklad 3

Klon kódující úplnou lidskou plazmatickou PAF-AH byl izolován z makrofágové cDNA knihovny.

A. Konstrukce makrofágové cDNA knihovny.

Z makrofágů periferní krve odvozených od monocytů byla izolována póly A+ RNA. Dvouřetězcová, tupě zakončená cDNA byla získána pomocí soupravy Invitrogen Copy Kit (San Diego, CA), k ní byly ligací připojeny adaptory BstXI a pak byla vložena do savčího expresního vektoru pRc/CMV (Invitrogen). Vzniklý plazmid byl vnesen elektroporací do E. coli XL-1 Blue. Transformované bakterie byly vysety na 978 ploten v hustotě asi 3000 kolonií na plotnu. Plazmidová DNA připravená odděleně z každé plotny byla uložena v jednotlivých souborech, byla též spojena do větších souborů, reprezentujících 300 000 klonů.

B. Testování knihovny pomocí PCR

Makrofágová knihovna byla testována pomocí polymerázové řetězové reakce s využitím degenerovaných „antisense primerů navržených na základě nové N-koncové aminokyselinové sekvence popsané v Příkladu 2. Sekvence primeru je uvedena v souladu s nomenklaturou IUPAC, „I znamená inozin.

SEQ ID NO: 4

5' ACATGAATTCGGIATCYTTIGTYTGICCRAA 3'

Tabulka výběru kodonů (Wada et al. Nuc. Acids Res., 19S: 19811986 (1991)) byla užita k určení nukleotidu na třetí pozici každého kodonu tohoto primeru. K testování souborů makrofágové knihovny o 300 000 klonech byl užit tento primer v kombinaci s primerem specifickým pro buď SP6, anebo T7 promotorovou sekvenci, nalézající se po obou stranách klonovacího místa vektoru pRc/CMV. Každá PCR reakční směs se skládala ze 100 ng templátové cDNA, lgg každého ze dvou primerů, 0,125 mM každého ze čtyř dNTP, 10 mM Tris-Hcl pH 8,4, 50 mM MgCl₂ a 2,5 jednotky Taq polymerázy. Počáteční denaturační krok trvající 4 minuty při 94° C byl následován 30 cykly amplifikace skládajícími se z 1 minuty při 94° C, I minuty při 60° C c a 2 minut při 72°C. Výsledný PCR produkt byl nakloňován do vektoru pBluescript SK- (Stratagene, La Jolla, CA) a jeho nukleotidová sekvence stanovena pomocí dideoxy metody. Tento PCR produkt obsahoval sekvenci odvoditelnou od nové peptidové sekvence a odpovídající nukleotidům 1 až 331 (SEQ ID NO:7).

Dále jsou uvedeny PCR primery, specifické pro výše popsaný klonovaný PCR fragment a určené k nalezení klonu o úplné délce.

„Sense primer (SEQ ID NO: 5)

5' TATTTCTAGAAGTGTGGTGGAACTCGCTGG 3' „Antisense” primer (SEQ ID NO:6)

5' CGATGAATTCAGCTTGCAGCAGCCATCAGTAC 3'

PCR reakce s využitím těchto primerů byly provedeny jak bylo popsáno výše a posloužily k prvnímu testování souborů cDNA o 300 000 klonech a poté k testování příslušných menších souborů o 3000 klonech. Tři soubory o 3000 klonech, které dávaly PCR produkt očekávané velikosti byly použity k transformaci bakterií.

• 4

C. Testování knihovny pomocí hybridizace

DNA z těchto bakterií byla testována pomocí hybridizace s využitím původního nakloňovaného PCR fragmentu jako sondy. Kolonie byly přeneseny na nitrocelulózu, prehybridizovány a hybridizovány v 50% formamidu, 0,75M chloridu sodném, 0,075 M citrátů sodném, 0,05 M fosfátu sodném, pH 6,5, 1% polyvinylpyrolidonu, 1% fikolu, 1% hovězím sérumalbuminu a 50 ng/ml sonikované DNA z lososího mlíčí. Hybridizační sonda byla značena postupem „random priming s hexamery. Hybridizace byla provedena při 42° C přes noc, membrány byly intenzivně omyty 0,03M chloridem sodným, 3mM citrátem sodným, 0,1% SDS při 42° C. Byla stanovena sekvence nukleotidů u 10 klonů dávajících pozitivní signál. Jeden z těchto klonů, sAH 406-3, obsahoval sekvenci odvoditelnou na základě původní peptidové sekvence proteinu s PAF-AH aktivitou purifikovaného z lidské plazmy. Sekvence DNA a aminokyselinová sekvence z ní odvozená jsou uvedeny v SEQ ID NO: 7 (DNA) a SEQ ID NO: 8 (aminokyseliny).

Klon sAH 406-3 obsahuje 1,52 kb dlouhý inzert s otevřeným čtecím rámcem, který kóduje předpokládaný protein skládající se ze 441 aminokyselin. Na N-konci se nachází relativně hydrofobní úsek o délce 41 aminokyselin před N-koncovou aminokyselinou stanovenou mikrosekvenací proteinu (izoleucin v pozici 42 v SEQ ID NO: 8). Kódovaný protein může mít buď dlouhou signální sekvenci, anebo signální sekvenci plus další peptid, který je odštěpen při vzniku zralého funkčního enzymu. Přítomnost signální sekvence je jedním ze znaků sekretovaných proteinů. Kromě toho se nalézá v proteinu kódovaném klonem sAH 406-3 konsensus motiv GxSxG (aminokyseliny 271275 v SEQ ID NO: 8), o kterém se předpokládá, že obsahuje serin aktivního místa u všech známých savčích a mikrobiálních lipáz a serinproteáz, viz Chapus et al., Biochimie, 70: 1223-1224 (1988) a Brenner, Nátuře, 334: 528-530 (1988).

Tabulka 2, níže, předkládá srovnání aminokyselinového složení lidské plazmatické PAF-AH, která je předmětem tohoto patentu, založeného na sekvenci SEQ ID NO: 8 s aminokyselinovým složením purifikovaného materiálu popsaném Stafforinim et al.(1987), viz výše.

• 0

Tabulka 2

Stafforini et al.

Klon sAH 406-3

Ala		26	24
Asp &	Asn	48	37
Cys		5	14
Glu &	Gin	36	42
Phe		22	12
Gly		29	58
His		13	24
Ile		31	17
Lys		26	50
Leu		40	26
Met		10	7
Pro		15	11
Arg		18	16
Ser		27	36
Thr		20	15
Val		13	14
Trp		7	Nestanoveno
Tyr		14	13

Aminokyselinové složení zralé formy lidské plazmatické PAF-AH, která je předmětem tohoto patentu, a aminokyselinové složení dříve purifikovaného materiálu, který byl označen jako lidská plazmatická PAF-AH, je zřetelně odlišné.

Srovnání nukleotidové a odvozené aminokyselinové sekvence hovězího mozkové cytoplazmatické PAF-AH (Hattori et al., viz výše) s nukleotidovou a aminokyselinovou sekvencí lidské plazmatické PAFAH, který je předmětem tohoto patentu, neodhalilo žádnou významnou strukturní podobnost těchto sekvencí.

Příklad 4

PCR provedená s cDNA z makrofágů a stimulovaných PBMC s využitím primerů hybridizujících s 5'nepřekládanou oblastí • · (nukleotidy 31 až 52 v SEQ ID NO: 7) a oblastí obsahující translační terminační kodon na 3'konci PAF-AH cDNA (nukleotidy 1465 až 1487 v SEQ ID NO:7) nalezla předpokládanou střihovou variantu (splice variant) lidského PAF-AH genu. Výsledkem této PCR reakce byly dva proužky na gelu, jeden z nich odpovídající očekávané velikosti PAFAH cDNA z Příkladu 3 a druhý kratší asi o 100 bp. Větší proužek byl identifikován na základě sekvenování s PAF-AH cDNA z Příkladu 3, zatímco kratší proužek postrádal exon 2 (viz Příklad 5 níže) PAF-AH sekvence, který kóduje předpokládanou signální a propeptidovou sekvenci plazmatického PAF-AH.

V kratším klonu je přítomna předpokládaná katalytická triáda a všechny cysteinové zbytky, proto je biochemická aktivita proteinu kódovaného tímto klonem pravděpodobně shodná s aktivitou plazmatického enzymu.

Aby se stanovil biologický význam této střihové varianty PAFAH, o které se předpokládá, že kóduje cytoplazmaticky aktivní enzym, bylo zkoumáno relativní množství obou forem v krevních makrofágách odvozených od monocytů pomocí metody „RNase protection. Ani jedna z obou mRNA nebyla přítomna v čerstvě izolovaných monocytech, avšak obě mRNA byly nalezeny v den 2 během in vitro diferenciace monocytů v makrofágy a přetrvávaly 6 dnů kultivace. Množství obou mRNA bylo přibližně stejné během celého období diferenciace. Naopak podobná analýza nervové tkáně detegovala pouze expresi mRNA úplné délky kódující extracelulární úplnou formu PAFAH.

Příklad 5

Rovněž byly izolovány genomické sekvence lidské plazmatické PAF-AH. Struktura PAF-AH genu byla stanovena izolací fágových klonů lambda a Pl, obsahujících lidskou genomickou DNA , pomocí DNA hybridizace v podmínkách vysoké stringence. Fragmenty fágových klonů byly dále klonovány a sekvenovány pomocí primerů přisedajících v pravidelných intervalech k cDNA klonu sAH 406-3. Navíc byly připraveny nové sekvenační primery homologní k oblastem intronů hraničícím s exony a využity k protisměrnému sekvenování přes hranice exon-intron za účelem potvrzení sekvence. Hranice exon/intron byly definovány jako body, kde se genomická sekvence a • · cDNA začínají odlišovat. Tato analýza zjistila složení lidského PAFAH genu z 12 exonů.

Exony 1, 2, 3, 4, 5, 6 a část exonu 7 byly izolovány z mužské fetální placentální knihovny konstruované v lambda FIX (Stratagene) . Fágové plaky byly přeneseny na nitrocelulózu, prehybridizovány a hybridizovány v 50% formamidu, 0,75M chloridu sodném, 75mM citrátu sodném, 50 mM fosfátu sodném ( pH 6,5), 1% polyvinylpyrolidonu, 1% fikolu, 1% hovězím sérumalbuminu a 50 ng/ml sonikované DNA z lososího mlíčí. Úplný cDNA klon sAH 406-3 byl užit jako hybridizační sonda k identifikaci fágových klonů obsahujících exony 2-6 a část exonu 7. Klon obsahující exon 1 byl identifikován pomocí fragmentu odvozeného z 5'konce tohoto cDNA klonu (nukleotidy 1 až 312 v SEQ ID NO: 7). Obě sondy byly značeny pomocí ³² P metodou „random priming” s hexamery. Hybridizace byla provedena při 42° C přes noc, membrány byly intenzivně omyty 30 mM chloridem sodným, 3mM citrátem sodným, 0,1% SDS při 42°C. DNA sekvence exonů 1, 2, 3, 4, a 6 spolu s částečnými sekvencemi sousedících intronů jsou uvedeny v SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13 a 14.

Zbytek exonu 7 a exony 8, 9, 10, 11 a 12 byly nakloňovány z Pl klonu izolovaného z lidské Pl genomické knihovny. Plaky Pl fágů byly přeneseny na nitrocelulózu, prehybridizovány a hybridizovány v 0,75M chloridu sodném, 50 mM fosfátu sodném (pH 7,4), 5 mM EDTA, 1% polyvinylpyrolidonu, 1% fikolu, 1% hovězím sérumalbuminu, 0,5% SDS a 0,1 mg/ml celkové lidské DNA. 2,6 kb EcoRI fragment genomické DNA odvozený od 3'konce klonu lambda izolovaného dříve byl užit jako sonda a označen pomocí ³² P metodou „random priming” s hexamery. Tento fragment obsahoval exon 6 a část exonu 7, přítomného ve fágovém klonu. Po hybridizaci přes noc při 65 ° C byly membrány omyty jak bylo popsáno výše. DNA sekvence exonů 7, 8, 9, 10, 11 a 12 spolu s částečnými sekvencemi sousedících intronů jsou uvedeny v SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19 a 20.

Příklad 6

Úplné klony cDNA plazmatické PAF-AH byly izolovány z cDNA knihovny z myší, psí, hovězí a slepičí sleziny, neúplný hlodavci klon byl izolován z cDNA knihovny z krysího brzlíku. Tyto klony

byly identifikovány pomocí hybridizace o nízké stringenci s lidskou cDNA (hybridizační podmínky byly stejné, jak bylo popsáno výše v případě exonů 1 až 6 v Příkladu 5, jen namísto 50% formamidu byl užit formamid 20%) . Jako sonda byl použit 1 kb Hind III fragment lidského PAF-AH cDNA klonu sAH 406-3 (nukleotidy 309 až 1322 v SEQ ID NO: 7). Kromě toho byl izolován neúplný opičí klon z cDNA z mozku makaka pomocí PCR a primerů navržených podle sekvence nukleotidů 285 až 303 a 851 až 867 ze SEQ ID NO: 7. Nukleotidové a odvozené aminokyselinové sekvence cDNA klonů z myši, psa, krávy, slepice, krysy a makaka jsou uvedeny v tomto pořadí v SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 25 a 26.

Srovnání odvozených aminokyselinových sekvencí cDNA klonů s lidským cDNA klonem poskytlo údaje o podílu identických aminokyselin v procentech, které jsou uvedeny v tab.3 níže.

Tabulka 3

	Člověk	Pes	Myš	Kráva	Slepice
Pes	80	100	64	82	50
Myš	66	64	100	64	47
Opice	92	82	69	80	52
Krysa	74	69	82	69	55
Kráva	82	82	64	100	50
Slepice	50	50	47	50	100
Asi 38%	aminokyselinových	zbytků je	kompletně	konzervováno ve

všech sekvencích. Nejproměnlivější oblasti se nacházejí na Nkonci (obsahují signální sekvenci) a na C-konci a nejsou významné pro enzymovou aktivitu, jak je ukázáno v Příkladu 10. Motiv GlyXaa-Ser-Xaa-Gly (SEQ ID NO: 27) nalezený v neutrálních lipázách a jiných esterázách je konzervován v hovězí, psí, myší, krysí a slepičí PAF-AH. Serin, nacházející se uprostřed tohoto motivu, slouží těmto enzymům jako aktivní nukleofilní místo.

Předpokládané aspartátové a histidinové složky aktivního místa (Příklad 10A) jsou rovněž konzervovány. Lidská plazmatická PAFAH, která je předmětem tohoto patentu, tedy pravděpodobně využívá katalytickou triádu a může zaujmout □'□..hydrolázovou • · · · • ·

konformaci typickou pro neutrální lipázy, i když jinak nevykazuje sekvenční homologii s lipázami.

Lidská plazmatická PAF-AH by měla obsahovat oblast, která specificky interaguje s lipoproteinovými částicemi (low density a high density ) v plazmě. N-koncová část molekuly obsahující dlouhé úseky vysoce mezidruhově konzervovaných aminokyselin, ale nikoliv katalytické triády enzymu, by mohla zprostředkovat tyto interakce.

Příklad 7

Expresní konstrukt pRC/CMV byl krátkodobě exprimován v buňkách COS 7 za účelem stanovení PAF-AH aktivity proteinu, kódovaného sAH 406-3 klonem cDNA lidského plazmatického PAF-AH (Příklad 3). PAF-AH aktivita v médiu z COS buněk byla zjišťována tři dny po transfekci těchto buněk pomocí DEAE dextranu.

Buňky byly zaočkovány v hustotě 300 000 buněk na jednu kultivační misku o průměru 60 mm. Následující den byly buňky inkubovány 2 hodiny v DMEM obsahujícím 0,5 mg/ml DEAE dextranu, 0,1 mM chloroquine a 5-10 pg plazmidové DNA. Poté byly buňky opracovány 10% DMSO v PBS po dobu 1 minuty, omyty médiem a inkubovány v DMEM obsahujícím 10% fetální telecí sérum, ve kterém byla předtím inaktivována endogenní PAF-AH aktivita pomocí diizopropylfluorofosfátu (DFP). Po třech dnech inkubace byla v médiích z transformovaných buněk zjišťována PAF-AH aktivita. Měření této aktivity byla prováděna v přítomnosti a nepřítomnosti buď 10 mM EDTA, nebo 1 mM DFP, aby se zjistilo, zda rekombinantní enzym vyžaduje vápník a zda je inhibován DFP, který je inhibitorem serin esteráz, jak bylo popsáno u PAF-AH Stafforinim et al. (1987), viz výše. Negativní kontroly zahrnovaly buňky transformované pRc/CMV bez inzertu, anebo s inzertem sAH 406-3 v opačné orientaci.

PAF-AH aktivita v supernatantech z transformovaných buněk byla zjišťována metodou Stafforiniho et al. (1990), viz výše, s následujícími modifikacemi. Stručně shrnuto, PAF-AH aktivita byla stanovována měřením hydrolýzy ³H acetátu z [acetyl-³H] PAF (New • · • · • · · ·

England Nuclear, Boston, MA) . Volný ³H acetát ve vodní fázi byl oddělen od značeného sunstrátu pomocí chromatografie v reverzní fázi na oktadecylsilikagelu (Baker Research Products, Phillipsburg, PA) . Stanovení byla prováděna s 10 μΐ supernatantu z transformovaných buněk v O,1M Hepes pufru, pH 7,2, v reakčním objemu 50 μΐ. V jedné reakci bylo užito celkem 50 pmol substrátu s poměrem značený : neznačený PAF 1:5. Reakční směsi byly inkubovány 30 minut při 37 °C a zastaveny přidáním 40 μΐ 10M kyseliny octové. Roztok byl pak promyt na koloně s oktadecylsilikagelem, propláchnuté poté 0,1 M acetátem sodným. Eluát každého vzorku byl odebrán a měřen na scintilačním počítači po dobu jedné minuty.

Jak je ukázáno na obr.2, média z buněk, transformovaných s sAH 406-3, obsahovala PAF-AH aktivitu o hodnotách čtyřikrát vyšších než pozadí. Tato aktivita nebyla ovlivněna přítomností EDTA, avšak byla inhibována 1 mM DFP. Tato pozorování dokazují, že klon sAH 406-3 kóduje enzym, jehož aktivita je v souladu s lidským plazmatickým enzymem PAF-AH.

Příklad 8

DNA kódující lidskou plazmatickou PAF-AH v úplné délce, její různé zkrácené formy a dále chimérickou myší-lidskou PAF-AH byla pomocí rekombinantních metod exprimována v E. coli a kvasinkách a trvale exprimována v savčích buňkách.

A. Exprese v E. coli

Pomocí PCR byl vytvořen protein kódující fragment cDNA klonu sAH 406-3 pro lidskou plazmatickou PAF-AH, vhodný k okamžitému dalšímu klonování v expresním vektoru v E. coli. Tento segment začíná na 5'konci lidského genu kodonem pro Ile₄₂ (SEQ ID NO: 8), Nkoncový aminokyselinový zbytek enzymu purifikovaného z lidské plazmy. V konstruktu byl zahrnut zbytek genu včetně původního terminačního kodonu. Byl použit následující 5' senseprimer:

* r • · • ·

SEQ ID NO: 28 ' TATTCTAGAATTATGATACAAGTATTAATGGCTGCTGCAAG 3 ' , který obsahoval Xbal klonovací místo translační iniciační kodon (podtržený). Byl použit následující 3'antisense primer:

SEQ ID NO: 29

5'ATTGATATCCTAATTGTATTTCTCTATTCCTG 3'

Tento primer zahrnoval terminační kodon sAH 406-3 a obsahoval EcoRV klonovací místo. PCR reakce byly provedeny tak, jak bylo popsáno v Příkladu 3. Výsledný PCR produkt byl štěpen enzymy Xbal a EcoRV a dále klonován ve vektoru pBR322 obsahujícím promotor Trp (deBoer et al., PNAS, 80:21-25 (1983)) těsně před klonovacím místem. Kmen E. coli XL-1 Blue byl transformován expresním konstruktem a kultivován v L půdě obsahující karbenicilin v koncentraci 100 μ9/ιη1. Transformanty rostly přes noc, byly centrifugovány a resuspendovány v lytickém pufru skládajícím se z 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCI, lOmM CHAPS, 1 mM EDTA, 100 μg/ml lysozymu a 0,05 trypsin inhibujících jednotek (TIU)/ml Aprotininu. Po jednohodinové inkubaci na ledu a dvouminutové sonikaci byla v lyzátech stanovena aktivita PAF-AH metodou popsanou v Příkladu 4. E. coli transformovaná expresním kostruktem (označeným trp AH) vytvářela protein s PAF-AH aktivitou. Viz tab.6 v příkladu 9.

Byly použity i konstrukty obsahující jiné promotory, řídící expresi lidského PAF-AH v E. coli - tacll promotor (deBoer, viz výše), arabinózový (ara B) promotor ze Salmonella typhimurium [Horwitz et al., Gene, 24:309-319 (1981)]) a promotor bakteriofága T7. Konstrukty obsahující Trp promotor (pUC trp AH) , tacll promotor (pUC tac AH) a araB promotor (pUC ara AH) byly sestrojeny na základě plazmidu pUC19 (New England Biolabs, ΜΑ), zatímco konstrukt s T7 promotorem (pET AH) byl utvořen z plazmidu pET15B (Novagen, Madison, WI). Konstrukt s hybridním promotorem (pHAB/PH), tvořený araB promotorem připojeným k ribozomovému vazebnému místu z T7 promotorové oblasti byl rovněž vytvořen z plazmidu pET15B. Všechny kostrukty produkovaly v E. coli proteiny s PAF-AH aktivitou v rozsahu 20 až 50 U/ml/OD₆oo. Tato aktivita odpovídá celkovému množství rekombinantního proteinu >1% všech buněčných proteinů.

Bylo rovněž zhodnoceno několik expresních konstruktů, které produkují v E. coli PAF-AH s prodlouženými N-konci. N-konec přírodní lidské PAF-AH byl na základě sekvenování aminokyselin stanoven jako Ile₄₂ (Příklad 2). Avšak sekvence bezprostředně před Ile 42 neodpovídá aminokyselinám tvořícím cílové místo pro odštěpení signálního peptidu [ tj. pravidlo -3-1 není splněno, jelikož v pozici -1 není přítomen lyzin, [viz von Heijne, Nuc. Acids Res., 14: 4683-4690 (1986)]. Je možné, že je sekrečním systémem buňky rozpoznávána klasičtější signální sekvence (Μχ-Απ nebo Μ!-Ρ₂ι) a poté následuje další endoproteolytické štěpení (Příklad 2). Celá PAF-AH kódující sekvence, začínající metioninem (nukleotidy 162 až 1487 ze sekvence SEQ ID NO: 7) byla upravena pro expresi v E. coli pomocí trp promotoru. Tento konstrukt tvořil aktivní PAF-AH, avšak jak je uvedeno v tab.4, jeho exprese dosahovala asi jedné padesátiny úrovně exprese původního konstruktu, začínajícího Ile₄₂ . Tyto výsledky naznačují, že prodloužení proteinu na jeho N-konci není kritické ani nutné pro aktivitu rekombinantního PAF-AH v E. coli.

Tab. 4

Aktivita PAF-AH (U/ml/ODgoo ý Kostrukt Lyzát Médium

pUC	trp	AH	(Ile42 na	N-konci) 177,7	0,030
pUC	trp	AH	Meti	3,1	0, 003
pUC	trp	AH	Valig	54, 6	0,033
V E.	coli mohou	být rovněž připraveny zkrácené	rekombinantní

formy lidské PAF-AH pomocí plazmidu o malém počtu kopií na buňku a promotoru, který je indukován přidáním arabinózy do kultivačního média. Jednou z takových forem PAF-AH, zkrácených na N-konci, je produkt rekombinantní exprese DNA kódující aminokyselinové zbytky Met₄₆ až Asn₄₄i polypetidu kódovaného úplnou PAF-AH cDNA (SEQ ID NO: 8). Je označen jako rPH.2. Pro produkci rPH.2 v bakteriálních buňkách byl užit plazmid pBAR2/PH.2 odvozený od pBR322, který obsahuje (1) nukleotidy 297 až 1487 ze sekvence SEQ ID NO: 7, která kóduje lidský PAF-AH začínající kodonem pro metionin v pozici 46, (2) araB-C promotory a araC gen z arabinózového operonu Salmonella typhimurium, (3) transkripčně terminační sekvenci z bakterifága T7 a (4) replikační počátek fága fl.

Konkrétně zahrnuje pBAR/PH.2 následující úseky DNA: (1) oblast od zrušeného AatlI místa v pozici 1994 k EcoRI místu v pozici 6274, tj. sekvence vektoru obsahující replikační počátek a geny odpovědné za rezistenci k ampicilinu nebo tetracyklinu odvozené od bakteriálního plazmidu pBR322; (2) oblast od EcoRI místa v pozici 6274 k Xbal místu v pozici 131, tj. DNA arabinózového operonu ze Salmonella typhimurium (Genbank accession number: M11045, M11046, M11047, J01797); (3) oblast od

Xbal místa v pozici 131 k Ncol místu v pozici 170, tj. DNA obsahující vazebné místo pro ribozom z pET-21b (Novagen, Madison, WI); (4) oblast od Ncol místa v pozici 170 k Xhol místu v pozici 1363, tj. sekvence lidské PAF-AH cDNA a (5) oblast od Xhol místa v pozici 1363 ke zrušenému AatlI místu v pozici 1993, tj . DNA fragment z pET-21b (Novagen), obsahující transkripčně terminační sekvenci bakteriofága T7 a replikační počátek bakteriofága f1.

Jiná forma PAF-AH, označená jako rPH.9, je produktem rekombinantní exprese DNA kódující aminokyselinové zbytky Met₄₆ až Ilen₄₂9 polypetidu kódovaného úplnou PAF-AH cDNA (SEQ ID NO: 8). DNA kódující rPH.9 byla vložena do téhož vektoru, který byl užit k produkci rPH.2 v bakteriálních buňkách. Tento plazmid byl pojmenován pBAR2/PH.9, skládá se z následujících úseků DNA: (1) oblast od zrušeného AatlI místa v pozici 1958 k EcoRI místu v pozici 6239, tj . sekvence vektoru obsahující replikační počátek a geny odpovědné za rezistenci k ampicilinu nebo tetracyklinu odvozené od bakteriálního plazmidu pBR322; (2) oblast od EcoRI místa v pozici 6239 k Xbal místu v pozici 131, tj. DNA arabinózového operonu ze Salmonella typhimurium (Genbank accession number: M11045, M11046, M11047, J01797); ); (3) oblast od Xbal místa v pozici 131 k Ncol místu v pozici 170, tj. DNA obsahující vazebné místo pro ribozom z pET-21b (Novagen, Madison, WI); (4) oblast od Ncol místa v pozici 170 k Xhol místu v pozici 1328, tj. sekvence lidské PAF-AH cDNA a (5) oblast od Xhol místa v pozici 1328 ke zrušenému AatlI místu v pozici 1958, tj. DNA fragment z pET-21b (Novagen, Madison, Wl), obsahující transkripčně terminační sekvenci bakteriofága T7 a replikační počátek bakteriofága fl.

Exprese PAF-AH proteinů v pBAR/PH.2 a v pBAR/PH.9 je řízena promotorem araB, který je v přítomnosti glukózy a nepřítomnosti arabinózy dokonale reprimován, ale funguje jako silný promotor po přidání L-arabinózy do média s vyčerpanou glukózou. Selekce buněk s plazmidem je dosaženo přidáním ampicilinu (nebo příbuzného antibiotika) nebo tetracyklinu do média. Pro expresi rekombinantního PAF-AH může být použita řada kmenů E.coli včetně (ale ne výhradně) kmenů prototrofnich v metabolismu arabinózy jako např. W3110, DH5D, BL21, C600, JM101 a jejich derivátů, kmenů nesoucích mutace snižující proteolýzu jako např. CAG629, KY1429 a kmenů neschopných rozkládat arabinózu jako např. SB7219 a MC1061. Výhoda použití kmene, který nedokáže rozkládat arabinózu, spočívá v tom, že induktor (arabinóza) exprese PAF-AH není odčerpáván z média během indukční periody, což vede k vyšším hladinám PAF-AH ve srovnání s hladinami, dosaženými u kmenů schopných matabolizovat arabinózu. Aktivní PAF-AH formy jsou exprimovány v různých kmenech E. coli v jakémkoliv vhodném médiu a za jakýchkoli vhodných podmínek. Bohatá média LB, EDM295 (minimální médium M9 doplněné kvasničným extraktem a kyselým hydrolyzátem kaseinu), stejně jako definovaná média (A675, tj. minimální médium A nastavené na pH 6,75, s glycerolem jako zdrojem uhlíku, doplněné stopovými prvky a vitamíny) dovolují značnou produkci rPAF-AH forem. Do medií je přidáván tetracyklin, který zajišťuje díky selekčnímu tlaku přítomnost plazmidu v kultuře.

Kmen E. coli MC1061 (ATCC 53338), nesoucí deleci arabinózového operonu a tudíž neschopný metabolizovat arabinózu, byl transformován plazmidem pBAR2/PH.2. Kmen MC1061 je auxotrofní na leucin, byl kultivován za stálého doplňování médii obsahujícími kaseinový extrakt a komplementujícími tak leucinovou mutaci. Buňky E.coli transformované pBAR2/PH.2 byly pěstovány při 30°C v růstových médiích obsahujících 2g/L glukózy. Glukóza má dvojí význam - slouží jako zdroj uhlíku pro růst buněk a jako represor arabinózového promotoru. Když poklesla hladina glukózy tt « ·« · «· ·* » > · · · · • · * · · • · · · · · na <50 mg/L, započalo doplňování živin pomocí koncentrátu (glukóza v koncentraci 300g/L). Doplňování glukózy se po dobu 16 hodin lineárně zvyšovalo rychlostí, která omezovala tvorbu kyselých vedlejších produktů. V tomto okamžiku bylo doplňování glukózy nahrazeno přidáváním glycerolu. Současně byla přidávána L-arabinóza (500g/L) do výsledné koncentrace 5 g/L'. Doplňování glycerolu bylo udržováno ve stálé výši po dobu 22 hodin. Buňky byly sklizeny pomocí filtrace na dutých vláknech, přitom se suspenze buněk asi lOkrát zahustila. Buněčný sediment byl uložen při -70 °C. Celková buněčná hmota dosahovala asi 80g/L (OD_É00 = 5060) s PAF-AH aktivitou 65-70 jednotek/OD/ml, což představuje asi 10% všech buněčných proteinů. Bakteriální kultura o konečném objemu asi 75 litrů obsahovala 50-60g PAF-AH.

Vysoké úrovně produkce rPAF-AH forem může být docíleno expresí pBAR2/PH.2 nebo PH.9 ve kmenech SB7219 a MC1061. Jiné kmeny neschopné odbourávat arabinózu jsou rovněž vhodné k dosažení vysoké hustoty bakteriální kultury. Doporučují se následující podmínky kultivace bakterií. Fermentační tanky obsahující kultivační médium se 2g/L glukózy jsou zaočkovány exponenciálně rostoucími kmeny SB7219;pBAR2/PH.2 a

SB7219;pBAR2/PH.9. Po spotřebování glukózy jsou fermentační tanky zásobovány roztokem glycerolu obsahujícím stopové prvky, vitamíny, hořčík a amonné soli tak, aby byl udržen zdravý exponenciální růst. Teplota fermentoru je udržována na 30°C, tanky jsou provzdušňovány a potřepávány tak, že je hladina rozpuštěného kyslíku nad 15% saturace. Když je hustota bakteriální kultury vyšší než llOg/L (mokrá váha), jsou živiny doplňovány konstantní rychlostí, ke kultuře je přidána Larabinóza (konečná koncentrace asi 0,5%). Tvorba produktu je sledována po dobu 16-22 hodin. Výtěžek dosahuje zpravidla hodnot 40-50 g/L (suchá váha buněk). Buňky jsou sklizeny centrifugací, uloženy při -70 °C a rPAF-AH je vyčištěn pro další analýzy. Specifické výtěžky vyšší než 150 jednotek/ml/OD₆₀o jsou dosahovány běžně.

» » ·

Β. Exprese v kvasinkách

Lidská rekombinantní PAF-AH byla rovněž exprimována v Saccharomyces cerevisiae. K řízení exprese rPAF-AH byl užit kvasničný promotor ADH2, produkce dosáhla hodnot 7 jednotek/ml/ ΟΒεοο (Tab. 5 ) .

Tabulka 5

Konstrukt	Promotor	Kmen	Aktivita enz; (U/ml/OD)
pUC tac AH	tac	E.coli W3110	30
pUC trp AH	trp	E.coli W3110	40
pUC ara AH	araB	E.coli W3110	20
pET AH	T7	E.coli BL21(DE3) (Novagen)	50
pHAB/PB	araB/T7	E.coli XL-1	34
pBAR2/PH.2	araB	MC1061	90
pYep ADH2 AH	ADH2	Yeast BJ2.28	7

C. Exprese PAF-AH v savčích buňkách 1. Exprese lidského PAF-AH cDNA konstruktu

Plazmidy konstruované k expresi PAF-AH využívají s výjimkou pSFN/PAFAH.l silný virový promotor původem z cytomegaloviru, polyadenylační místo z genu pro kravský růstový hormon a replikační počátek viru SV4 0 k zajištění vysokého počtu kopií plazmidu v COS buňkách. Plazmidy byly vneseny do buněk pomocí elektroporace.

Nejprve byla připravena sada plazmidů, ve kterých byla buď 5'hraniční sekvence (pDCl/PAFAH.1), anebo jak 5', tak 3'hraniční sekvence lidské PAF-AH cDNA (PDCl/PAFAH.2) , nahrazeny hraničními oblastmi jiných genů, které se vyznačují vysokou úrovní exprese v savčích buňkách. Transfekce těchto plazmidů do COS, CHO či 293 buněk vedla k produkci PAF-AH ve stejné výši (0,01 jednotek/ml tedy 2-4krát výše nad úrovní pozadí) , jaké bylo dosaženo s klonem sAH-406 po transientní expresi COS buněk (Příklad 7) . Byl konstruován další plazmid obsahující promotor Friendova slezinného viru namísto promotoru cytomegaloviru. cDNA pro lidskou PAF-AH byla vložena do • · · · · · plazmidu pmH-neo (Hahn et al., Gene, 127: 267 (1993)) pod kontrolu promotoru Friendova slezinného viru. Po transfekci buněk myelomové linie NSO plazmidem pSFN/PAFAH.l a otestování několika set klonů byly nalezeny dvě transfektanty (4B11 a 1C11), které dávaly 0,15 0,5 jednotek/ml altivity PAF-AH. Produktivita těchto dvou NSO transfektant odpovídá asi 0,1 mg/litr, předpokládáme-li specifickou aktivitu asi 5000jednotek/mg.

2. Exprese PAF-AH chimérických konstruktů tvořených myším a lidským genem

Konstrukt pRC/MS9 obsahující cDNA pro myší PAF-AH v savčím expresním vektoru pRc/CMV vedl po transfekci do COS buněk k produkci sekretované formy PAF-AH ve výši 5-10 jednotek/ml (lOOOkrát výše nad úrovní pozadí). Předpokládáme-li, že je specifická aktivita myší PAF-AH přibližně stejná jako u lidského enzymu, je myší cDNA exprimována asi 500krát až lOOOkrát více než lidská cDNA pro PAF-AH.

Aby mohl být prozkoumán rozdíl mezi úrovní exprese lidské a myší PAF-AH v COS buňkách, byly sestrojeny dva chimérické lidské-myší geny a sledovány z hlediska exprese v COS buňkách. První konstrukt, pRc/PH.MHCl, obsahuje kódující sekvenci pro 97 Nkoncových aminokyselin myšího PAF-AH polypeptidu (SEQ ID NO: 21) připojených k 343 C-koncovým aminokyselinám lidské PAF-AH v expresním vektoru pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA) . Druhý chimérický gen v plazmidu pRc/PH.MHC2 obsahuje kódující sekvenci pro 40 N-koncových aminokyselin myšího PAF-AH polypeptidu připojených ke 400 C-koncovým zbytkům lidské PAF-AH v pRc/CMV.

Po transfekci COS buněk plazmidem pRc/PH.MHCl došlo k akumulaci 1-2 jednotek/ml PAF-AH aktivity v médiu. V kondiciovaných médiích z buněčné kultury transformované plazmidem pRc/PH.MHC2 byla zjištěna jen 0,01 jednotky/ml PAF-AH aktivity. Z těchto pokusů plyne, že rozdíl v úrovni exprese myšího a lidského PAF-AH genu je alespoň částečně způsoben vlastnostmi polypeptidového segmentu vymezeného aminokyselinovými zbytky 40 až 97, anebo příslušným úsekem RNA či DNA, kódujícím tuto oblast PAF-AH proteinu.

3. Překódování prvních 290 bp kódující sekvence PAF-AH

Jedna z hypotéz vysvětlujících nízkou úroveň syntézy lidské

PAF-AH v transformovaných savčích buňkách předpokládá, že užití kodonů v přirozeném genu není optimální pro účinnou expresi. Nezdá se však pravděpodobné, že by typ užitých kodonů mohl být zodpovědný za 500-1000násobný rozdíl v úrovni exprese mezi lidským a myším genem, protože optimalizace užití kodonů vede jen lOnásobnému zvýšení exprese. Druhá hypotéza vysvětluje rozdílnou úroveň exprese myšího a lidského PAF-AH genu přítomností sekundární struktury v 5' kódující oblasti lidské PAF-AH mRNA, která vede k relativně rychlé degradaci mRNA, anebo způsobuje neúčinnou iniciaci či elongaci translace.

Za účelem ověření těchto hypotéz byl sestrojen syntetický fragment kódující původní lidský PAF-AH protein od N-konce až k aminokyselinovému zbytku 96, ve kterém byla většina kodonů nahražena (překódována) kodony pro tutéž aminokyselinu, avšak majícími odlišnou sekvenci. Změna z GTG na GTA ve druhém kodonů vedla k vytvoření Asp718 místa, které je na jednom konci syntetického fragmentu a které je rovněž přítomno v myší cDNA.

Druhý konec fragmentu obsahoval BamHI místo vyskytující se v kodonů 97 lidského genu. Asp718/BamHI fragment dlouhý asi 290 bp byl odvozen z PCR fragmentu připraveného pomocí duální asymetrické PCR; postupu pro konstrukci syntetických genů popsaného v Sandhu et al., BioTechniques, 12: 14-16 (1992). Syntetický Asp718/BamHI fragment byl ligován s DNA fragmenty, kódujícími zbytek molekuly lidské PAFAH, začínajícími nukleotidem 453 ze SEQ ID NO: 7. Poté byla sekvence kódující původní lidský PAF-AH enzym vložena do savčího expresního vektoru pRc/CMV (Invitrogen, San Diego), čímž byl vytvořen plazmid pRc/HPH.4. Úplná sekvence překódovaného genu je uvedena v SEQ ID NO: 30. Oblast v pRc/HPH.4 přiléhající k 5' konci sekvence kódující lidskou PAF-AH pochází z myší cDNA pro PAF-AH v pRc/MS9 (nukleotidy 1 až 116 ze SEQ ID NO: 21).

COS buňky byly tranzientně transformovány plazmidy pRc/HPH.4 (překódovaný lidský gen), pRc/MS9 (myší PAF-AH) a pRc/PH.MHCl (hybridní sekvence myš-člověk č.l) za účelem stanovení exprese • · · · • · • · lidské PAF-AH z pRc/HPH.4. V kondiciovaných médiích z transformovaných buněčných kultur byla zjišťována PAF-AH aktivita, která nabývala hodnot 5,7 jednotek/ml (myší gen), 0,9 jednotek/ml (hybridní sekvence myš-člověk č.l), a 2,6 jednotek/ml (překódovaný lidský gen). Překódování prvních 290 bp kódující sekvence pro lidskou PAF-AH se ukázalo být úspěšnou strategií a zvedlo hladinu exprese lidské PAF-AH z několika nanogramů/ml na asi 0,5 mikrogramu/ml během tranzientní transformace COS buněk. Překódovaný gen pro PAF-AH z plazmidu pRc/HPH.4 bude vložen do savčího expresního vektoru obsahujícího gen pro dihydrofolátreduktázu (DHFR) a tímto vektorem bude transformována DHFR negativní buněčná linie ovaria čínského křečka. Transformované buňky budou podrobeny selekci methotrexátem, tak budou získány klony, které tvoří velké množství lidské PAF-AH díky genové amplifikací.

Příklad 9

Lidská rekombinantní plazmatické PAF-AH (počínající Ile₄₂), exprimovaná v E.coli, byla přečištěna na úroveň jediného Coomassie modří obarveného proužku na SDS-PAGE pomocí různých metod. Rovněž byly stanovovány aktivity vykazované nativním enzymem PAF-AH.

A. Purifikace rekombinantní PAF-AH

První použitý purifikační postup je podobný tomu, který byl popsán v Příkladu 1 pro nativní PAF-AH. Následující kroky byly prováděny při 4°C. Pellet z 50 ml kultury E. coli produkující PAF-AH (transformované expresním konstruktem trp AH) byl lyžován tak, jak je popsáno v Příkladu 8. Pevné částečky byly odstraněny centrifugací při 10 OOOg po dobu 20 minut. Supernatant byl nanesen rychlostí 0,8 ml/min na kolonu Blue sepharose Fast Flow (2,5 cm x 4 cm; objem náplně 20 ml), která byla ekvilibrována pufrem D (25 mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, 0,5M NaCl, pH 7,5). Kolona byla promyta 100 ml pufru D a eluována rychlostí 3,2 ml/min 100 ml pufru A obsahujícího 0,5M KSCN. 15 ml aktivní frakce bylo naneseno na 1 ml kolonu Cu chelating Sepharose, ekvilibrovanou pufrem D. Tato kolona byla promyta 5 ml pufru D, dále následovala eluce 5 ml pufru D obsahujícího 100 mM • ttt

imidazol gravitačním tokem. Frakce s PAF-AH aktivitou byly analyzovány pomocí SDS-PAGE.

Výsledky purifikace jsou znázorněny v Tab.6, ve které se jednotka rovná hydrolýze μτηοΐ PAF za hodinu. Produkt purifikace získaný při 4°C se objevil na SDS-PAGE jako jediný intenzivně zbarvený proužek pod polohou markéru 43 kDa, s náznakem difúzního zbarvení těsně pod a nad sebou. Rekombinantní materiál je výrazně

čistší a	vykazuje vyšší	specifickou aktivitu ve	srovnání	s PAF-AH
preparátem z plazmy, popsaným v	Příkladu 1.
	Tabulka 6
Vzorek	Aktivita Ob] era (j ednotka/ (ml) ml)	Celková aktivita (j ednotka xlO3)	Konc. proteinů (mg/mlj	Specifická aktivita (j ednotka/ mg)	%návratnosti aktivity	Násobek načištěni
					krok	celk.	krok celk
Lyzát	4,5 939	4451	15,6	63	100	100	1 1
Blue	15 64	960	0,07	914	22	22	14,4 14,4
Cu	1 2128	2128	0,55	3869	220	48	4,2 61

Když byla totožná purifikační procedura provedena při laboratorní teplotě, objevila se kromě proužku pod markérem 43 kDa skupina proužků migrujících pod polohou markéru 29 kDa, která korelovala s PAF-AH aktivitou změřenou v plátcích gelu. Tyto proužky s nižší molekulovou váhou mohou být proteolytické fragmenty PAF-AH, které si uchovaly enzymatickou aktivitu.

Při laboratorní teplotě byl použit také další purifikační postup. Pelet (lOOg) E. coli produkujících PAF-AH (transformovaných expresním konstruktem pUC trp AH) byl resuspendován ve 200 ml lysovacího pufru (25mM Tris, 20mM CHAPS, 50mM NaCl, lmM EDTA, 50gg/ml benzamidin, pH 7,5) a lysován trojnásobným protlačením přes mikrofluidizér při 15000 psi. Pevné částice byly odstraněny centrifugací při 14300 x g po dobu jedné hodiny. Supernatant byl lOx zředěn v zřeďovacím pufru (25mM MES (2-[N-morpholino] ethanesulfonic acid), lOmM CHAPS, lmM EDTA, pH 4,9) a nanesen rychlostí 25ml za minutu na kolonu S Sepharosy Fast Flow (200ml)(kation-iontoměničová kolona) ekvilibrované v pufru E (25mM MES, lOmM CHAPS, ImM EDTA, 5OmM NaCl, pH 5,5). Kolona byla pronyta jedním litrem pufru E a eluována IM NaCl. Eluát byl sbírán do 50ml frakcí, a pH bylo upraveno na 7,5 pomocí 0,5ml 2M Trisu (báze). Frakce obsahující aktivitu PAF-AH byly spojeny a upraveny tak, aby obsahovaly 0,5M NaCl, Takto spojené frakce byly naneseny rychlostí 1 ml/min na kolonu Blue Sephárosy Fast Flow (2,5cm x 4cm; 20ml) ekvilibrovanou v pufru F (25mM Tris, lOmM CHAPS, 0,,5M NaCl, ImM EDTA, pH 7,5). Kolona byla promyta 100 ml pufru F a eluována pufrem F obsahujícím 3M NaCl ryclostí 4 ml/min. Tento Blue Sepharosový Fast Flow chromatografický krok byl opakován za účelem snížení hladiny endotoxinů ve vzorku. Frakce obsahující aktivitu PAF-AH byly spojeny a dialyzovány proti pufru G (25mM Tris, pH 7,5, 0,5M NaCl, 0,1% Tween 80, ImM EDTA).

Výsledky purifikace jsou ukázány v tabulce 7, jednotka rovná pmol hydrolýzy PAF za hodinu.	ve které se
Tabulka 7
Obj em Vzorek (ml)	Aktivita (j ednotka/ mi)	Celková aktivita (jednotka xlO3)	Konc. proteinů (mg/ml)	Specifická aktivita (jednotka/ mg)	%návratnosti aktivity	Násobek načištění
					krok celk.	krok celk

Lyzát	200	5640	1128	57,4 6	98	100	100	1	1
3	111	5742	637	3,69	1557	57	56	16	16
Blue	100	3944	394	0,84	4676	35	62	3	48

Získaný produkt purifikace vapadal na SDS-PAGE jako jediný intenzivní proužek pod značkou 43 kDa s troškou difuzního zbarvení přímo pod a nad proužkem. Rekombinantní materiál je podstatně čistší a vykazuje větší specifickou aktivitu v porovnání s přípravou PAF-AH z plazmy jak je popsána v Příkladu 1.

Ještě jeden purifikační protokol je uvažován tímto předkládaným vynálezem. Ten zahrnuje lyži buněk, pročištění a první kolonový krok. Buňky byly zředěny 1:1 v lyzovacím pufru (25mM Tris pH7,5, 150mM NaCl, 1% Tween 80, 2mM EDTA). Lyže byla provedena v chlazeném mikrofluidizéru při 15000-20000 psi. Bylo » ·

použito trojnásobného protlačení materiálu přes mikrofluidizér s cílem dosáhnout >99% rozbití buněk. Lyzát byl zředěn 1:20 v ředícím pufru (25mM Tris pH 8,5, lmM EDTA) a aplikován na kolonu naplněnou chromatografickým médiem Q-Sepharosa Big Bead (Pharmacia). Kolona byla ekvilibrována v roztoku 25mM Tris pH 8,5, lmM EDTA, 0,015% Tween 80. Eluát byl zředěn 1:10 v 25mM MES pH5,5, 1,2M síran amonný, lmM EDTA a nanesen na chromatografické médium Butyl Sepharose (Pharmacia) ekvilibrované stejným pufrem. Aktivita PAF-AH byla eluována roztokem 25mM MES pH5,5, 0,1% Tween 80, lmM EDTA.

Ještě další metoda purifikace enzymaticky aktivního PAF-AH z E-coli je uvažována v tomto vynálezu. Tato metoda zahrnuje následující kroky: a) příprava extraktu E. coli, která vede po lyži v pufru obsahujícím CHAPS k supernatantu obsahujícímu solubilizovaný PAF-AH; b) ředění výše zmíněnéhého supernatantu a jeho aplikacxe na anion-iontoměničovou kolonu ekvilibrovanou na pH okolo 8,0; c) eluce enzymu PAF-AH z výše uvedené anioniontoměničové kolony; d) nanesení výše uvedeného adjustovaného eluátu z výše uvedené anion-iontoměničové kolony na afinitní kolonu obsahující „blue day ligand; e)eluce výše uvedené kolony obsahující „blue day ligand pufrem obsahujícím 3,0M sůl; f) zředění eluátu z kolony obsahující „blue day ligand do pufru vhodného pro provedení hydroxylapatitové chromatografie g) provedení hydroxylapatitové chromatografie kde je promytí a eluce uskutečněna s pomocí pufrů (s obsahem či bez obsahu CHAPS); h) naředění výše uvedeného hydroxylapatitového eluátu na koncentraci solí vhodnou pro kation-iontoměničovou; i) nanesení výše uvedeného naředěného hydroxylapatitového eluátu na kationiontoměničovou kolonu při pH pohybující se v rozmezí přibližně 6,0 až 7,0; j) eluce PAF-AH z výše uvedené kation-iontoměničové kolony vhodným pufrem vhodného složení; k) provedení kationiontoměničové chromatografie za chladu a 1) složení kapalné nebo zmražené formy PAF-AH v nepřítomnosti CHAPSu.

Nejlépe je ve výše uvedeném kroku použít a) lyzovací pufr má složení: 25mM Tris, lOOmM NaCl, lmM EDTA, 20mM CHAPS, pH 8,0; v kroku b) ředění supernatantu pro anion-iontoměničovou chromatografií je 3-4 krát do 25mM Tris, lmM EDTA, lOmM CHAPS, • ·

pH 8,0 a kolona je Q-Sepharosová kolona ekvilibrovaná 25mM Tris, lmM EDTA, 50mM NaCl, lOmM CHAPS, pH 8,0; v kroku c) je anioniontoměničová kolona vymývána s použitím 25mM Tris, lmM EDTA, 350mM NaCl, lOmM CHAPS, pH 8,0; v kroku d) je eluát z kroku c) aplikován přímo na afinitní kolonu s „blue dye ligandem; v kroku e) je kolona eluována pufrem obsahujícím 3M NaCl, lOmM CHAPS, 25mM Tris, pH 8,0; v kroku f) je eluát z Blue dye zředěn pro hydroxylapatitovou chromatografií. Eluát je zředěn lOmM fosforečnanem sodným, lOOmM NaCl, lOmM CHAPS, pH 6,2; v kroku g) je hydroxylapatitová chromatografie doprovázena použitím hydroxylapatitové kolony ekvilibrované lOmM fosforečnanem sodným, lOOmM NaCl, lOmM CHAPS. Eluce je prováděna s použitím 50mM fosforečnanu sodného, lOOmM NaCl (s či bez lOmM CHAPS), pH 7,5; v kroku h) je provedeno naředění výše uvedeného hydroxylapatitového eluátu pro kation-iontoměničovou chromatografií pomocí pufru o pH v rozmezí přibližně 6,0 až 7,0 a obsahujícím fosforečnan sodný (s či bez CHAPS); v kroku i) je kolona s S-Sepharosou ekvilibrována 50mM fosforečnanem sodným (s či bez lOmM CHAPS), pH 6,8; v kroku j) je eluce provedena pufrem vhodného složení jako například 50mM fosforečnan draselný, 12,5mM kys. aspartová, 125mM NaCl, pH 7,5 a obsahujícího 0,01% Tween 80; v kroku k) je provedena kation-iontoměničová chromatografie při 2-8°C. Příkladem pro vhodné složení pufru použitelného v kroku 1) , který stabilizuje PAF-AH je 50mM fosforečnan draselný, 12,5mM kys. aspartová, 125mM NaCl, pH přibližně 7,4(s či bez přídavku Tween 80 a/nebo Plurinicu F68) nebo 25mM fosfátový (K⁺) pufr obsahující (přinejmenším) 125mM NaCl, 25mM arginin a 0,01% Tween80 (s či bez Pluronicku F68 v koncentraci přibližně 0,1 a 0,5%).

Aktivita rekombinantního PAF-AH

Nejvýraznější vlastností PAF acetylhydrolasy je výrazná specificita pro substráty s krátkými zbytky na sn-2 pozici substrátu. Tato přísná specificita odlišuje PAF acetylhydrolasu od ostatních forem PLA₂. Ke zjištění, zdali rekombinantní PAF-AH degraduje fosfolipidy s dlouhým řetězcem mastných kyselin na sn-2 pozici byla tedy testována hydrolýza l-palmitoyl-2-arachidonylsn-glycero-3-fosfocholinu (arachidonylPC). Tato látka je totiž • · · · ··· ·· · · · · · ··· ·· · ···· • · ··· · ··· ·· · upřednostňovaným substrátem dobře charakterizované formy PLA₂. Jak předpověděly již předchozí studie s nativním PAF-AH, tento fosfolipid nebyl v případě, že byl inkubován s rekombinantním PAF-AH hydrolyzován. V dalších experimentech byl do roztoku standardního hydrolyzačního testu přidán arachidonylPC v koncentraci 0 až 125μΜ. Cílem tohoto bylo zjištění, zdali toto přidání inhibuje hydrolýzu PAF rekombinantním PAF-AH. Dokonce ani při nejvyšší koncentraci PAF-AH (což byla koncentrace 5x vyšší než koncentrace PAF) nebyla zjištěna inhibice hydrolýzy PAF. Rekombinantní PAF-AH tedy vykazuje stejnou substrátovou specificitu jako nativní enzym - substráty s dlouhými řetězci nejsou rozeznávány. Kromě toho rekombinantní enzym PAF-AH rychle degraduje oxidovaný fosfolipid (gluraroylPC), který prošel oxidativním štěpením sn-2 mastných kyselin. Nativní plasmová PAFAH má několik dalších vlastností, které ji odlišují od ostatních fosfolipas včetně na vápenatých iontech nezávislých fosfolipasach a fosfolipasach odolných k látkám, které modifikují SH skupiny nebo štěpí disulfidy.

Nativní a rekombinantní plasmové enzymy PAF-AH jsou senzitivní k DFP, což naznačuje, že serin tvoří část jejich aktivního místa. Neobvyklou vlastností nativní plasmové PAF acetylhydrolasy je její těsná asocioce s lipoproteiny v krevním oběhu a skutečnost, že její katalytická efektivita je ovlivněna lipoproteinovým prostředím. Jestliže je rekombinantní PAF-AH, jak je popsána ve vynálezu, inkubována s lidskou plasmou (a přetím ošetřena DFP za účelem odstranění eendogenní enzymatické aktivity) asociuje se s nízko- a vysokohustotními lipoproteiny stejným způsobem jako nativní aktivita. Tento výsledek je důležitý, protože existují solidní důkazy o tom, že modifikace nízkohustotních lipoproteinů je nezbytná k ukládání cholesterolu pozorovanému při atheromě a že oxidace lipidů je iniciačním faktorem v tomto procesu. PAF-AH chrání nizkohustotní lipoproteiny před modifikací za oxidačních podmínek in vitro a mohou hrát tuto roli i in vivo. Podávání PAF-AH je proto doporučováno pro snížení oxidace lipoproteinů u atherosklerotických plaků a stejně tak při léčbě zánětů.

fl · · ·

Všechny tyto výsledky potvrzují, že klon cDNA sAH 406-3 kóduje protein s aktivitami lidské plasmové PAF acetylhydrolasy.

Příklad 10

V E.coli byly exprimovány i další různé rekombinantní PAF-AH produkty. Tyto produkty zahrnovaly analogy PAF-AH mající mutaci v jedné aminokyselině a fragmenty PAF-AH.

A. PAF-AH- produkty vzniklé substitucí aminokyselin

PAF-AH je lipáza, protože hydrolyzuje fosfolipid PAF. Ačkoli neexistuje žádná povšechná podobnost mezi PAF-AH a ostatními charakterizovanými lipázami, ve srovnání se strukturálně charakterizovanými lipázami byly nalezeny konzervované zbytky.

V aktivním centru byl identifikován serin. Serin společně se zbytkem aspartátu a histidinu tvoří katalytickou trojici , která reprezentuje aktivní místo lipáz. Tyto tři zbytky spolu nesousedí v primární aminokyselinové sekvenci, ale ze strukturních studií víme, že spolu tato tři rezidua sousedí v trojrozměrném prostoru.Ze srovnávání struktur savčích lipáz víme, že aspartátový zbytek je obvykle 24 aminokyselinovým zbytkem od C konce, směrem k aktivnímu místu se serinem.

Pomocí místně cílené mutegeneze a PCR byly modifikovány jednotlivé kodóny lidské PAF-AH, které kódovaly sekvence pro alaninový zbytek. Tyto mutanty byly exprimovány v E.coli. Tak, jak je ukázáno v tabulce 8, kde například zkratka „S108A značí, že serinový zbytek v pozici 108 byl zaměněn za alanin, bodové mutace Ser₂73, Asp₂₉₆ nebo His₃₅₁ kompletně zničily PAF-AH aktivitu.Vzdálenosti mezi jednotlivými aminokyselinovými zbytky v aktivním centru jsou pro PAF-AH a ostatní lipázy podobné ( od Ser k Asp je to 23 aminokyselin; od Ser k His je to 78 aminokyselin). Tyto pokusy také prokázaly, že Ser₂7₃, Asp_29s nebo His₃₅₁ jsou zbytky klíčové pro aktivitu a proto také jsou kandidáty pro triádu katalytických zbytků. Cysteinové zbytky jsou svou vlastností možnosti tvorby disulfidových můstků velmi často kritické pro zachování funkční integrity proteinu. Plazmatický PAF-AH enzym obsahuje pět cysteinových zbytků. K určení, který z cysteinových zbytků je • * · · · · • * kritický pro udržení enzymové aktivity , byly cysteiny jednotlivě nahrazeny mutací za serin a výsledné mutanty se exprimovaly v E.coli. Předběžné výsledky měření aktivity s částečně načištěnými preparáty těchto rekombinantních mutantních forem enzymu je ukázáno v druhém sloupci tabulky číslo 8, zatímco výsledky získané s více načištěnými enzymovými preparáty jsou shrnuty ve třetím sloupci tabulky 8. Data ukazují, že všechny mutantní formy vykazovaly skoro stejnou aktivitu, z tohoto usuzujeme, že pro aktivitu PAF-AH není nutný žádný cysteinový zbytek.Další mutanty měly také malý, nebo žádný vliv na katalytickou aktivitu PAF-AH. V tabulce 8, ++++ reprezentují aktivitu přirozeně se vyskytujícího typu PAF-AH rovnající se 40 až 60 U/ml/OD₆₀o. , +++ reprezentují aktivitu kolem 20 až 40 U/ml/OD₆₀₀, ++ 10 až 20 U/ml/OD₆oo, + 1 až 10 U/ml/OD₅₀₀ a znaménko - indikuje aktivitu menší než 1 U/ml/OD₆₀o,

Tabulka 8

Mutace_ Aktivita PAF-AH Specifická akt, purifikátů PAF-AH

Divoký (přirozeně	++++	6.9	mmol/mg/hod
se vyskytující) typ
S108A	++++
S273A	-
D28 6A	-
D286a	++
D296A	-
D304A	++++
D338A	++++
H351A	-
H395A,H399A	++++
C67S	+++	5.7	mmol/mg/hod
C229S	+	6.5	mmol/mg/hod
C291S	+	5.9	mmol/mg/hod
C334S	++++	6, 8	mmol/mg/hod
C407S	+++	6.4	mmol/mg/hod
C67S, C334S, C407S		6.8	mmol/mg/hod

9 ·9·· • ·

B. Fragmentální PAF-AH produkty

Pomocí štěpení exonukleázou III na 3'konci PAF-AH kódující sekvence po různě dlouhou dobu byly připraveny delece na C konci . Tyto zkrácené kódující sekvence byly potom ligovány do plazmidové DNA kódující stop kodóny ve všech třech čtecích rámcích. Pomocí DNA sekvenční analýzy , exprese proteinu a měření aktivity PAF-AH bylo charakterizováno deset DNA delečních konstruktů. Odstranění 21 až 30 aminokyselinových zbytků z C konce silně redukovalo katalytickou aktivitu a odstranění 52 aminokyselinových zbytků vedlo ke kompletnímu zničení aktivity. To je znázorněno na obrázku 3.

Podobné delece byly provedeny na amino konci PAF-AH. V E.coli byly připraveny fúzní proteiny PAF-AH s thioredoxinem na N- konci. Tím se docílila konsistentní vysoká hladina exprese aktivity PAF-AH ( LaVallie a další, Biotechnology, 11: strana 187 až 193, 1993). Odstranění devatenácti aminokyselinových zbytků z přirozeně se vyskytujícího N-konce proteinu (lle ₄₂) redukovalo aktivitu až o 99 %. Zatímco odstranění 26 aminokyselinových zbytků kompletně zničilo enzymatickou aktivitu fúzního proteinu (viz obrázek 3). Delece 12 aminokyselinových zbytků zvýšila enzymovou aktivitu čtyřikrát.

V následujících purifikačních procesech pro PAF-AH vycházejících z čerstvé lidské plasmy pomocí metod podobných těm, co byly popsány v Příkladu 1 ( k zakoncentrování eluátu z Blue Sepharosy byl použit místo Cu sloupce filtr Microcon 30 firmy Amicon), byly identifikovány další dvě N-koncové aminokyseliny vedle lle ₄₂, a to Ser₃₅ a Lys₅₅. Heterogenita může mít přirozený původ ve stavu enzymu v plazmě, či může být výsledkem purifikačního postupu.

Purifikovaný materiál popsaný výše byl také podroben analýze na glykosylaci. Purifikovaný nativní PAF-AH se inkuboval v přítomnosti nebo nepřítomnosti N-glykanázy, což jest enzym odstraňující karbohydráty vázané na N-konec glykoproteinů. Takto ošetřené vzorky PAF-AH byly potom podrobeny elektroforéze v 12 % SDS polyakrylamidovém gelu a poté označeny pomocí králičího polyklonálního antiséra ve Western blottu. Bílkovina, která nebyla inkubována s N-glykanázou putovala v gelu jako difužni ·· • · • · · · • · · « ·· · · proužek o molekulové hmotnosti 45 až 50 kDa, zatímco protein ošetřený glykanázou putoval jako ostře ohraničený pruh odpovídající molekulové hmotnosti 44 kDa. Tím je demonstrována skutečnost, že nativní PAF-AH je glykosylovaný.

Heterogenita na N-konci byla také pozorována v purifikovaných preparátech rekombinantního PAF-AH (Ile₄₂ N-konec). Tyto enzymové preparáty byly směsí polypetidů s N-konci začínajícími Ala₄₇ , Ile₄₂, nebo umělým iniciačním zbytkem Met_i sousedícím s

Ile ₄₂.

1. Předběžné srovnání fragmentů PAF-AH s PAF-AH

Z důvodu pozorované heterogenity rekombinantně připravených PAF-AH, byly připraveny další rekombinatní produkty, které byly také testovány na pozorovanou heterogenitu po expresi a následné purifikaci. Složení rekombinantních exprimovaných produktů pBAR2/PH.2 a pBAR2/PH.9 v kmenu MC1061 E.coli bylo analyzováno v různých časových intervalech během produkční fáze buněčného cyklu. Částečně načištěné vzorky rekombinantního PH.2 a PH.9 odebrané v různých časových intervalech mezi 5 až 22 hodinami po indukci exprese proteinu byly analyzovány pomocí laserové desorpční ionizační hmotové spektrometrie (MALDI-MS).

Byl-li použit PH.2 expresní vektor, byly pozorovány dva píky ve spektru částečně purifikovaného proteinu, které odpovídaly hmotové hodnotě přepokládané pro rPAF-AH protein. Tyto dva píky byly pozorovány ve všech časových intervalech, větší heterogenita byla pozorována jen v časovém intervalu odpovídajícímu stresovému působení způsobenému nahromaděním acetátu nebo vyčerpáním kyslíku v mediu během fermentace buněk. Přesnost měření MALDI-MS techniky je přibližně v rozsahu + 0.3 % hmotnosti jedné aminokyseliny. Pozorovaný produkt s vyšší hmotností odpovídá svým hmotnostním složením očekávanému celému produktu translace vektoru PH.2, mínus hmotnost methioninu, jako iniciátoru translace, o kterém se předpokládá, že byl posttranslačně odstraněn. Pík s nižší hmotností měl přibližně o 1200 atomovýh hmotnostních jednotek méně.

Byl-li použit expresní vektor PH.9, byl získán ve spektru částečně purifikovaného proteinu přednostně protein, který odpovídal • 9 ···· • É·

99 • · 9 * 9 9 • ·· >9 · * 9 9 9 • 9 9 9 9

9999 99 99 svou očekávanou hmotností proteinu rPAF-AH. Tento jediný pík byl pozorován ve všech časových okamžicích, v průběhu času se nezvyšovala ani heterogenita proteinu. Pozorovaná hmotnost tohoto proteinu byla v souladu s přítomností očekávaného translačního produktu pro vektor PH.9 o plné délce , opět mínus iniciační methionin.

2. Purifikace fragmentů PAF-AH

Rekombinantně exprimované produkty rPH.2 (expresní produkt DNA kódující Met₄₆ až Asn₄₄₁) a rPH.9 ( expresní produkt DNA kódující Met₄₆ až Ile₄₂9) byly purifikovány pro další srovnávací studie s produktem rPAF- AH (expresní produkt DNA kódující Ile ₄₂ až Asn₄₄₁) . RPH.9 byl produkován pomocí kmenu E.coli SB7219 a purifikovaný většinou pomocí chelátového purifikačního procesu využívajícího Zn, tak jak bylo popsáno výše. rPH.2 byl produkován v kmenu MCI061 v E.coli, tak jak bylo popsáno v předchozím textu a byl purifikován tak, jak je popsáno dále. Transformované buňky byly lyžovány naředěním buněk lyzačním pufrem (lOOmM sukcinát, 100 mM NaCl, 20 mM CHAPS, pH 6.0). Vzniklá hmota se mixovala a lyžovala se popraskáním buněk vysokým tlakem. Lyžované buňky se stočily a supernatant obsahujícíc rPH.2 se ponechal k dalšímu zpracování. Vyčeřený supernatant se naředil 5 krát 25 mM fosfátovým pufrem obsahujícím lmM EDTA, 10 mM CHAPS, pH 7.0. Naředěný supernatant se poté aplikoval na sloupec Sepharosy Q. Sloupec se promyl nejprve trojnásobkem objemu sloupce 25 mM Nafosfátovým pufrem obsahujícícm 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 7.0 ( Promytí 1), potom následovalo promytí desetinásobným objemem sloupce 25 mM Tris pufrem obsahujícím 1 mM EDTA, 10 mM CHAPS, pH 8.0. (Promytí 2) a následně deseti objemy sloupce 25 mM Tris pufrem obsahujícím 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8.0 (Promytí 3). Eluce byla zakončena pomocí 25 mM Tris pufru obsahujícího 1 mM EDTA, 350 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8.0. Eluát ze sloupec Q Sepharosy se potom naředil trojnásobkem svého objemu 25 mM Trisem, obsahujícím 1 mM EDTA, 10 mM CHAPS, pH 8.0 a byl navrstven na sloupec Blue Sepharosy. Sloupec byl promyt nejprve deseti objemy sloupce 25 mM Trisem, obsahujícím 1 mM EDTA, 10 mM CHAPS, pH 8.0. Po té následovalo promytí třemi objemy sloupce 25 mM · « · · · • · ♦ · *

49 4 9

9 9 4 4 4

9 9 9 4

4444 44 94 ····

Trisem obsahujícím 0.5 M NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8.0. Eluce byla zakončena pomocí promytí 25 mM Trisem obsahujícím 3.0 M NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8.0. Eluát ze sloupec Blue Sepharosy byl naředěn pětinásobkem 10 mM Na- fosfátového pufru obsahujícího 10 mM CHAPS, pH 6.2 a byl poté aplikován na chromatografický sloupec. Sloupec byl promyt desetinásobkem objemu sloupce 10 mM Na- fosfátovým pufrem obsahujícím 100 mM NaCl, 0.1 % Pluronic F68, pH 6.2. rPH.2 se eluoval ze sloupce 120 mM Na-fosfátovým pufrem obsahujícím 100 mM NaCl a 0,1 % Pluronic F-68, pH 7.5. U naředěného eluátu ze sloupce hydroxylapatitu bylo upraveno pH na pH 6.8 pomocí 0.5 N- sukcinylové kyseliny. Potom následovala chromatografie na sloupci Sepharosy SP. Sloupec SP Sepharosy byl promyt desetinásobkem svého objemu 50 mM fosfátem sodným obsahujícím 125 mM NaCl, 0.1 % Pluronic F68, pH 6.8. Eluce se prováděla 50 mM fosfátem sodným s 125 mM NaCl a 0.1 % Pluronic F68, pH 7.5. Eluovaný rPH.2 se nakonec upravil ředěním na konečnou koncentraci 4 mg/ml pomocí 50 mM fosfátu sodného obsahujícího 125 mM NaCl, 0,15% Pluronic F68, pH 7.5. Dále byl přidán Tween 80 do konečné koncentrace 0.02 %. Vytvořený produkt se přefiltroval přes 0.2 μιη membránu a uschoval pro další využití.

3. Porovnání PAF-AH fragmentů s PAF-AH pomocí sekvenace

Purifikované preparáty rPH.2 a rPH.9 byly porovnány s purifikovanými sloučeninami rPAF-AH pomocí N-terminálního sekvenování použitím sekvenátoru Applied Biosystems Model 473 Protein Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA) a pomocí C koncového sekvenování provedeného pomocí přístroje Hewlett-Packard Model G1009A C-terminal Protein Sequencer. Připravený rPH.2 vykazoval ve srovnání s rPAF-AH menší heterogenitu N-konce. Nkoncová analýza připraveného rPH.9 byla velmi podobná téže analýze u rPH.2, ale ve srovnání s rPH.2 byla pozorována u rPH.9 nižší heterogenita na C-konci .

Purifikovaný protein rPH.2 vykazoval většinu sekvencí obsahující N-koncový Ala₄₇ (okolo 86 až 89 %) a menší podíl sekvencí majících na N-konci Ala_4a (mezi 11 až 14 %), tento poměr byl celkem stabilní i za různých podmínek fermentace buněk. Purifikovaný protein rPH.9 také obsahoval ve většině sekvencí N-koncový Ala₄₇ ( ·· · · ···· ·· ···· · · · · · · · ··· · · · ···· ···· ·· · · · · «· ·· mezi 83 až 90 %) a menší podíl s N-koncovou aminokyselinou Ala₄₈ (okolo 10 až 17 %). Naproti tomu, snahy o přípravu polypeptidu v bakteriích začínajícího Ile ₄₂ (rPAF-AH) vyústily ve směs různých polypeptidu s N-koncovými aminokyselinami začínajícími Ala₄₇ (20 až 53%), Ile₄₂ (8 až 10 %) nebo uměle dodaným iniciátorem methioninem Met-1 (37 až 72 %) v sousedství Ile ₄₂. U rPH.2 a rPHÍ9 byl iniciační methionin účinně odstraněn pomocí aminoterminalpeptidázy po bakteriální syntéze peptidu, kdy zůstal Ala v pozici 47 (nebo alanin v pozici 48) jako koncový zbytek.

Sekvenování C-konce se provádělo velmi často na rPH.2, kde na C-konci byla objevena jako hlavní vyskytující se sekvence HOOC-Asn-Tyr (okolo 80 %), což je v dobré shodě s předpokládanou sekvencí C-konce translačního produktu, která je HOOC-Asn₄₄₁-Tyr₄₄o, zatímco sekvence HOOC-Leu se objevila jen ve 20 %. Po frakcionaci rPH.2 na SDS - PAGE, se provedlo další sekvenování primárního a sekundárního proužku.Sekvenování určilo jako C-terminální sekvenci HOOC-Leu-Met z nižšího sekundárního proužku (AHL popsaný dále k sekci B.5), který odpovídá translačnímu produktu zkrácenému o 10 aminokyselinových zbytků. Tento produkt vykazuje také nízkou hladinu HOOC-His. Další mapování peptidů ukázalo, že u některých produktů rPH.2 se vyskytují ještě další C-koncové sekvence. Přímým sekvenováním byl C-konec u rPH.9 primárně určen jako HOOC-Ile-His (okolo 78 až 91 %, což záleželo na šarži ). Tento výsledek je v dobré shodě s předpokládaným C koncem translačního produktu HOOCIle₄₂₉-His₄₂₈ . Zdá se však, že tato technika má určité pozadí (šum) , čímž by nebyly podchyceny nízké hladiny koncentrací jiných sekvencí.

4. Porovnání PAF-AH fragmentů s PAF-AH metodou MALDI-MS

MALDI-MS metoda byla aplikována na purifikované produkty rPH.2 a rPH.9. Spektrum naměřené pro rPH.2 vykázalo dva píky, které svou hmotnostní odpovídaly hodnotě očekávané pro rPH.AH produkty (viz obrázek 4). Toto spektrum je podobné spektru získanému od částečně purifikovaného proteinu popsanému v sekci B.l výše v textu. Druhý pík, odpovídající nižší molekulové hmotnosti, byl ve většině měření přítomen asi ve 20 až 30 % zastoupení . Spektrum rPH.9 ukázalo, že dominantní pík odpovídá předpokládané hmotnosti pro úplný translační • · produkt vektoru PH.9, od kterého se odečte hmotnost iniciačního methioninu (viz obrázek 5). U rPH.9 byl také pozorován vedlejší pík odpovídající nižší molekulové hmotnosti. Byl zastoupen asi u 5 % celkového množství vzorků.

5. Porovnání PAF-AH fragmenbtů s PAF-AH pomocí SDS-PAGE

Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) byla aplikována na purifikované šarže rPAF-AH, rPH.2 a rPH.9. U rPH.2 byl získán na elektroforeogramu velmi složitý obraz proužků, rozmístěných kolem místa odpovídajícího migračnímu rozsahu očekávanému pro rPAF-AH produkt. Toto místo bylo určeno pomocí odpovídajících molekulových standardů. Na jednom, či několika gelech byly pozorovány dva dominantní proužky, které měly v těsném sousedství každý svoje dva sekundární proužky, které byly umístěny nad a pod primárním proužkem. Tyto horní sekundární proužky, střední primární a spodní sekundární proužky byly označeny jako AHU, AHM a AHL. Všechny tyto proužky reagovaly s monoklonální protilátkou připravenou proti rPAF-AH ve Western blotu, a tak byly identifikovány jako produkty příbuzné rPAF-AH. Vrchní sekundární proužek AHU zvyšoval svoji intenzitu v závislosti na době skladování proteinu a pravděpodobně representoval modifikovanou formu produktu rPAF-AH. Výsledky získané z SDS-PAGE pro rPAF-AH produkty jsou podobné výsledkům získaným touž metodou pro rPH.2. Jsou zde dva větší pruhy, které migrují v blízkosti předpokládené molekulové hmotnosti pro rPAF-AH , dále dva minoritní pruhy nad a stín pod majoritními pruhy. Na rozdíl od těchto, rPH.9 poskytuje na SDS-PAGE jeden dominantní pruh bez zjevného štěpení. Dále byly také pozorovány slabě znatelné proužky odpovídající nižší molekulové hmotnosti a další proužek v pozici odpovídající hmotnosti dimeru. Nebyl patrný však žádný proužek odpovídající AHU pozici.

Složení purifikovaných preparátů rPH.2 a rPH.9 bylo dále analyzováno pomocí 2D gelů a izoelektrické fokusace (IEF) v močovině, která následovala za SDS-PAGE ve druhém rozměru.Pro rPH.9 je na dvojrozměrné elektroforéze pět hlavních skvrn rozdělených ve směru IEF. Heterogenita v počtu nábojů se v rámci jednotlivých šarží rPH.9 jevila jako konzistentní.

Na rozdíl od výše zmíněných výsledků. 2D gel pro rPH.2 se jevil daleko komplikovanější, protože obsahoval asi 15 skvrn rozdělených v IEF a SDS-PAGE.

6. Porovnání aktivity PAF-AH s aktivitou fragmentů PAF-AH

Purifikované produkty rPH.2 a rPH.9 vykazovaly oba enzymatickou aktivitu, která byla stejná jako u endogenního PAF-AH purifikovaného ze séra, oba produkty také vážou lipoprotein stejným způsobem jako purifikovaný endogenní PAF-AH.

Příklad 11

Předběžná analýza exprese lidských plazmatických mRNA pro PAFAH byla ve vzorcích lidských pletiv stanovována pomocí hybridizace v Northern blotu.

RNA byly připraveny ze vzorků lidské mozkové kůry, srdce, ledvin, placenty, thymu a madlí pomocí RNA Stát 60 (tel-Test „B, Friendswood, TX). Dále byla RNA připravena také z buněk podobných prekurzorům lidských hematopoietických buněk linie THP-1 (ATCC TIB 202), u které byla vyvolána diferenciace do fenotypu podobného makrofágu, a to užitím phorbolesteru phorbolmyristylacetátu (PMA). RNA získaná z pletiv a RNA připravená z premylocytické buněčné linie THP-1 před a jeden až tři dny po indukci, byly rozděleny pomocí elektroforézy v 1.2 % agarosovém formaldehydovém gelu a následně přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Klon o úplné délce PAF-AH cDNA, SAH406-3, připravený z lidské plazmy, byl označen metodou náhodného párování primerů (random priming) a byl hybridizován na membránu, za podmínek identických podmínkám popsaným v příkladu 3 pro prohlížení knihovny. Získané výsledky indikovaly, že sonda PAF-AH hybridizuje s pruhem odpovídajícím 1.8 kb ve vzorcích z brzlíku, mandlí a v malém rozsahu také s placentární RNA.

PAF se syntetizuje v mozku jak za normálních, tak patofyziologických podmínek. Vzhledem ke známým, zánět vyvolávajícím a potencionálně neurotoxickým vlastnostem této molekuly, se předpokládá jako kritický pro udržení zdraví nervového pletiva mechanismus lokalizace PAF syntézy nebo jeho rychlý katabolismus. Přítomnost PAF acetylhydrolázy v nervových tkáních ukazuje na její ochrannou roli v těchto pletivech. Je zajímavé, že obě PAF-AH, to znamená bovinní (hovězí) heterotrimerní intracelulární PAF-AH (její klonování je popsáno v práci Hattori a další, J. Biol. Chem. ,

269(37): strana 23150 až 23155 (1994) i PAF-AH podle předkládaného vynálezu, byly nalezeny v mozku.

K určení, zda jsou oba enzymy exprimovány ve stejných nebo jiných částech mozku, byl nakloňován lidský homolog bovinní cDNA pro intracelulární PAF-AH a pomocí Northern blotu byly porovnány vzory této v mozku exprimované mRNA s exprimovanou mRNA pro PAF-AH dle vynálezu stejnou metodou , jako byla popsána v předchozích paragrafech. V mozku byly metodou Northern blotu prozkoumány následující oblasti: malý mozek, dřeň, mícha, bazální jádro mozku, amygdala, podvěsek mozkový, talamus a týlní pól, čelní lalok a spánkový lalok mozkové kůry. Stopa přítomnosti obou enzymů byla detekována v každém z uvedených pletiv. Ve vyšším množství byla však spíše detekována heterotrimerní intracelulární forma enzymu, než forma sekretovaná. Analýza provedená pomocí Northern blotu potvrdila i pro další pletiva a buňky, že heterotrimerní forma intracelulárního enzymu se vyskytovala v těchto pletivech velmi hojně. Pletiva, kde byl enzym detekován jsou následující: tymus,prostata, varlata, vaječníky, tenké střevo, tračník, periferní krevní leukocyty, makrofágy, mozek, játra, kosterní svaly, ledviny, slinivka a žlázy nadledvinek. Tato všudypřítomná exprese této formy enzymu napovídá, že heterotrimerní intracelulární PAF-AH má v buňkách všeobecnou udržovací funkci.

Dále byla v kultuře zkoumána exprese RNA pro PAF-AH v monocytech izolovaných z lidské krve a během jejich spontánní diferenciace v makrofágy. V čerstvých monocytech bylo detekováno jen malé, nebo vůbec žádné množství RNA, ale exprese byla indukována a zesílila během diferenciace v makrofágy. Průvodním jevem bylo i zvýšení aktivity PAF-AH v mediu kultury diferencujících se buněk. Exprese transkriptu lidské plazmatické RNA pro PAF-AH byla také pozorována v buňkách THP-1, a to první den, ale už ne třetí den ···· · * · ♦ • * · · · * · · · · následující po indukci. Buňky THP-1 v bazálním stadiu neexprimovaly mRNA pro PAF-AH.

Příklad 12

Exprese PAF-AH v lidských a myších pletivech byla zkoumána pomocí hybridizace in šitu.

Lidská pletiva byla získána National Disease Research Interchange and Cooperative Human Tissue Network. Normální myší mozek a mícha, dále EAE mícha byly získány z S/JLJ myší. Normální myší embrya byla získána od jedenácti do osmnácti dnů po oplodnění.

Části pletiv byly umístěny do Tissue Tek II kryoformy (Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL) s malým množstvím OCT sloučeniny (Miles, Inc. Elkhart, IN). Ve formě byly vzorky vycentrovány, forma naplněna OCT sloučeninou , potom umístěna do nádoby s 2metylbutanem (C₂H₅CH (CH₃) ₂, Aldrich Chemical Company ,Inc., Milwaukee, WI) a nádobka byla umístěna do kapalného dusíku. Jakmile pletivo a OCT sloučenina v kryoformě zmrznou, jsou uchovávány v -80° C až do rozřezání bločku. Bločky s pletivy byly rozděleny na řezy o tloušťce 6 pm a připevněny k Vectabondem (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) potaženým sklíčkům a skladovány při -70° C a poté umístěny do teploty 50° C na dobu přibližně 5 minut k odstranění kondenzace a potom jsou vzorky fixovány ve 4% paraformaldehydu po dobu 20 minut při 4° C, dehydrovány (70%, 95%, 100% etanol) po dobu jedné minuty pro každý stupeň, nakonec jsou ponechány na vzduchu schnout po dobu 30 minut při pokojové teplotě.Pletiva jsou hybridizována in sítu s radioaktivně značenou jednovláknovou mRNA generovanou z DNA odvozené z interního 1 Kb HindlII fragmentu genu pro PAF-AH (nukleotidy 308 až 1323 ze Sekvence ID číslo: 7) pomocí in vitro RNA transkripce inkorporací ³⁵S-UTP (Amersham) nebo z DNA odvozené od heterotrimerní intracelulární cDNA pro PAF-AH identifikované Hattorim a dalšími. Sondy se používaly v různých délkách od 250 do 500bp. Hybridizace se prováděla přes noc (12 až 16 hodin) při 50° C; ³⁵S- značená sonda (6xl0⁵ cpm/ řez), tRNA (0.5 μg /řez) , dále byla přidána dietylpyrokarbonátem ošetřená voda (depc) do hybridizačního pufru, čímž se upravily koncentrace jeho složek na 50% formamidů, 0.3M NaCl, 20 mM Tris pH 7.5, 10 % síran dextranu, lx ·

···· · · · ···· ··· ·· · ···»

Denhardtův roztok, 100 mM dithiotreitol (DTT) a 5mM EDTA. Po hybridizaci se řezy promývaly 1 hodinu při pokojové teplotě v 4x SSC/10 mM DTT, potom 40 minut při 60° C v 50% formamidu/lxSSC/lOmM DTT, 30 minut při pokojové teplotě v 2 x SSC, 30 minut při pokojové teplotě v 0.1 x SSC. Řezy se potom dehydrovaly, sušily 2 hodiny na vzduchu a poté byly vyvolány (po skladování při 4° C v úplné tmě ) a obarveny kontrastním barvivém hematoxylin/eosin.

A. Mozek

Mozeček. Jak v lidském, tak myším mozku byl pozorován silný signál ve vrstvě Purkyňových buněk malého mozku, dále v košíčkových buňkách a ve středních částech jednotlivých neuronů v nucleus dentate (jedno ze čtyř hlubokých jader v malém mozku). V těchto buňkách byla dále pozorována i heterotrimerní forma PAF-AH. Dále byl nalezen signál i pro plazmatickou PAF-AH v granulárních a molekulárních vrstvách šedé hmoty mozkové.

Hippocampus. Silný signál byl zaznamenán v hippocampu, hlavně v jednotlivých buňkách, které se jevily jako buňky neuronové. Tyto buňky byly identifikovány jako polymorfní části střední části neuronů a granulárních buněk. Také v hippocampu byl nalezen signál pro heterotrimerní intracelulární formu PAF-AH.

Mozkový kmen: Jak v lidském, tak myším mozkovém kmenu byl v jednotlivých buňkách šedé hmoty zaznamenán silný signál .

Kůra: V částech lidské mozkové kůry, která byla získána z hlavní mozkové, týlní a spánkové kůry a také v celých částech myších mozků byl pozorován u jednotlivých buněk silný signál. Tyto buňky byly identifikovány jako pyramidální, hvězdicové a polymorfní buňky. Nebyly zpozorovány žádné rozdíly ve výsledcích získaných z různých vrstev kůry. Výsledky získané metodou hybridizace in šitu se lišily od výsledků získaných zkoumáním mozkové kůry metodou Northern blotu. Rozdíly pravděpodobně vyplývají z vyšší citlivosti metody hybridizace in šitu ve srovnání s metodou Northern blotu. Jak v malém mozku, tak v hypoccampu byly získány obdobné výsledky potvrzující expresi heterotrimerní formy intracelulárního PAF-AH. Hypofýza: O něco slabší signál byl zaznamenán na jednotlivých roztroušených buňkách distální části těchto lidských pletiv.

• · · · • ·

• ··· «· · · · · ·· ··

B. Lidský tračník

Jak u normálních, tak u tračníku pacientů s Crohnovou nemocí, se objevil signál u lymfatických agregátů přítomných v části sliznice, signál byl slabě vyšší u pacientů s Crohnovou nemocí. Vzorky z tračníku pacientů s Crohnovou nemocí vykazovaly také silný signál v lamina propria. Podobně, vyšší hladina signálu byla pozorována ve vzorcích z nemocného slepého střeva, i když zdravé střevo vykazovalo nízký, ale stále ještě detekovatelný signál. Vzorky od pacientů trpících ulcerózní kolitidou nevykazovaly žádný signál, a to ani v lymfatických agregátech, ani ve střevní sliznici.

C. Lidské mandle a brzlík

Byl zaznamenán silný signál u roztroušených skupin buněk v zárodečných centrech mandlí a brzlíku.

D. Lidské lymfatické uzliny

U vzorků pocházejících z lymfatických uzlin normálního dárce byl pozorován silný signál, zatímco ve vzorcích odebraných z lymfatických uzlin pacienta v septickém šoku byl zaznamenám signál velmi slabý.

E. Lidské tenké střevo

Jak vzorky tenkého střeva od zdravého dárce, tak vzorky střeva od pacientů trpících Crohnovou nemocí, poskytovaly pouze slabý signál v Peyerových plácích a střevní sliznici. Signál byl ve vzorcích nemocných dárců trochu vyšší.

F. Lidská slezina a plíce

Jak ve vzorcích pocházejících ze zdravé sleziny a plic, tak ve vzorcích ze slezin pacientů trpících abscesem sleziny a plic pacientů s rozedmou plic, nebyl nalezen žádný signál.

« « • · · ·

G. Myší mícha

U obou typů míchy, to znamená normální a AEE stadium 3 míchy, byl zaznamenám silný signál v šedé hmotě míchy. Exprese byla v míše v EAE stadiu 3 slabě vyšší. U míchy pocházející z EAE stádia 3 byly buňky v bílé hmotě mozkové a v perivaskulárním pojivu, pravděpodobně infiltrované makrofágy nebo leukocyty a vykazovaly signál, který nebyl patrný v normální míše.

H. Myší embrya

V jedenáctidenním embryu je signál zřetelný v centrálním nervovém systému ve čtvrté srdeční komoře, která zůstává konstantní v průběhu vývoje malého mozku a mozkového kmene embrya.

V průběhu dozrávání embrya se signál stává zřetelný v centrálním nervovém systému v míše (12 den), primární kůře a Gasseriho uzlině (14 den) a v hypofýze ( 16 den). V periferním nervovém systému se signál stává zřetelný (počínaje dnem 14 a 15) v nervech odbočujících z míchy a 17 den se objevuje silný signál v okolí základů čichových orgánů embrya. Exprese je také patrná od 14 dne v játrech a plicích, ve střevu od 15 a v posteriální části úst/hrdla ode dne 16. Od 18 dne lze signál určit diferencovaně jako signál v kůře, zadním mozku (malém mozku a mozkovém kmeni), v nervech odbočujících z bederní oblasti míchy , jako signál v zadní části úst/hrdla, játrech, ledvinách, dále jako možný slabý signál v plicích a střevě.

Souhrn

Exprese mRNA pro PAF-AH v mandlích, brzlíku, lymfatických uzlinách, Peyerových plácích , slepém střevu a v lymfatických agregátech tračníku je v dobrém souladu se závěry, že pravděpodobný převládající zdroj PAF-AH in vivo je v makrofágu, protože ve všech těchto uvedených pletivech jsou makrofágy silně zastoupeny, slouží zde jako fagocytózní a antigen prezentující buňky.

Exprese PAF-AH v zánětlivých pletivech se dá vysvětlit hypotézou, že hlavní roli v zánětlivém procesu hrají monocyty odvozené z makrofágů . Předpokládá se, že PAF-AH inaktivuje PAF a fosfolipidy podporující zánět a tím reguluje směrem dolů kaskádu zánětlivých procesů iniciovaných pomocí těchto mediátorů.

PAF je u krys detekován ve všech mozkových tkáních a je sekretován v kultuře granulárních buněk malého mozku. In vitro a in vivo pokusy ukázaly, že se PAF váže na specifické receptory v nervových tkáních a indukuje funkční a fenotypické změny, jako je mobilizace kalcia, regulace transkripce aktivující geny a diferenciaci nervových buněčných linií prekursoru, PC12. Tato pozorování objasňují roli PAF v mozku a v souladu s tím se uskutečnily pokusy využívající kultury tkání hyppocampu a analogů PAF a jeho antagonistů, které využívaly PAF jako důležitého zpětného mesenžeru pro dlouhotrvající hippocampalní zesílení. Proto vedle patologické role PAF v zánětlivém procesu se zdá, že se PAF podílí i na rutinním nervovém signálním procesu. Exprese extracelulární PAF-AH v mozku může tedy sloužit k regulaci trvání a velikosti signalizace zprostředkované PAF.

Příklad 13

Za použití PAF-AH jako antigenu produkovaného v E.coli byly připraveny monoklonální protilátky specifické pro lidský specifický plazmatický PAF-AH.

Myš linie 1342 byla imunizována 0, 19 a 40 den rekombinantním PAF-AH. Jako dávka těsně před fúzí byla použita k imunizaci myši dávka imunogenu v PBS. O čtyři dny déle byla myš usmrcena a sterilně vyňata její slezina. Ta byla potom vložena do misky s 10 ml bezsérového media RPMI 1640. Suspenze buněk byla připravena třením slezin mezi dvěma konci zmrazených mikroskopických sklíček ponořených do bezsérového media RPMI 1640 s dodaným 2 mM Lglutaminem, 1 mM pyruvátem sodným, 100 jednotek /ml penicilínu a lOOug/ml streptomycinu (RPMI) (GIBCO, Canada). Suspenze buněk byla filtrována přes sterilní buněčný filtr (70- mesh Nitex ) (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) a po té byly buňky dvakrát promyty centrifugací při 200 g po pět minut a pelety byly • · • · · · ·· · · · · · • · · ·· · ···· znovu resuspendovány ve 20 ml bezsérového media RPMI. Slezinné buňky ze třech nativních Balb/c myší byly připraveny podobným způsobem. NS-1 myelomové buňky, byly udržované v logaritmické fázi v RPMI s 11 % fetálního bovinního séra (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) po tři dny před fúzí, byly centrifugovány při 200 g po 5 minut a peleta byla dvakrát promyta stejným způsobem, jak je to popsáno výše.

Jedenkrát 10⁸ slezinných buněk bylo kombinováno s 2.0 x 10⁷ NS-1 buněk, centrifugováno a supernatant byl odsát.Sediment v kyvetě byl poklepáváním dna kyvety rozdělen a po té byl přidáván po dobu jedné minuty 1 ml 37° C teplého PEGu 1500 (50% v 75 mM Hepes, pH 8.0) (Boehringer Manheim) za stálého míchání , následovalo přidání 7 ml bezsérového media po dobu 7 minut. Následovalo přidání 8 ml RPMI a buňky se centrifugovaly při 200 g po dobu 10 minut. Po odstranění supernatantu byl pelet resuspendován ve 200 ml RPMI obsahujícím 15 % FBS, 100 μΜ hypoxantinu sodného, 0.4 μΜ aminopterinu, 16 μΜ thymidin (HAT) (Gibco), 25 jednotek/ ml IL-6 (Boehringer Mannheim) a 1.5 x 10⁶ tymocytů/ml a buňky byly vysety na deset desek Corning s plochým dnem s 96 jamkami (Corning, Corning New York).

Druhý, čtvrtý a šestý den následující po fúzi bylo vyměněno 100 μΐ media v jamce za čerstvé. Osmý den byla fúze testována pomocí ELISA, testovala se na přítomnost myšího IgG vázajícího rekombinantní PAF-AH. Mikrotitrační desky Immulon 4 (Dynatech, Cambridge, MA) byly potaženy rekombinantním PAF-AH v koncentraci lOOng/desku naředěným v 25 mM TRIS, pH 7.5. Inkubace se konala při 37° C po dobu dvou hodin. Po té byl potahovací roztok odsát a do jamek bylo nakapáno po 200 μΐ blokovacího roztoku (0.5% želatiny z rybí kůže (Sigma) zředěné pomocí CMF-PBS) a tento blokovací roztok se inkuboval 30 minut při 37° C. Po té byly desky třikrát promyty PBS obsahujícím 0.05% Tween 20 (PBST) a do každé jamky bylo přidáno 50 μΐ supernatantu z kultury. Po další 30 minutové inkubaci při 37 ⁰ C a následném trojnásobném promytí, byl do jamek na desce přidán konjugát kozích anti myších IgG (fc) s křenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pensylvania) naředěný v PBS 1: 3500. Desky se inkubovaly stejným způsobem jak bylo popsáno výše, čtyřikrát promyty PBST a potom • · • · · · • ··· ·· · · · · «· « · následovala inkubace se substrátem pro peroxidázu (100 μΐ /jamka) rozpuštěným v substrátovém pufru. Roztok měl následující složení: lmg/ml o- fenylendiamin (Sigma) a 0.1 μΙ/ml 30% H₂O₂ v 100 mM citrátu pH 4.5. Po pěti minutách byla barevná rekce zastavena přidáním 50 μΐ 15% H₂SO₄. Na fotometru odečítajícím hodnoty absorbance v roztoku (Dynatech reader) se odečetla absorbance při vlnové délce 4 90 nm - A₄₉₀.

Vybrané jamky z fúze byly dvakrát překlonovány metodou limitního ředění do 96 jamkové destičky. Po pěti dnech inkubace se vizuálně hodnotil počet kolonií v jamce. Hybridomy, které se klonovaly, byly následující 90D1E, 90E3A, 90E6C, 90G11D (ATCC HB 11724) a 90F2D (ATCC HB 11725).

Isotypy monoklonálních protilátek, produkovaných hybridomy, byly určeny pomocí systému Isostríp (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Výsledky ukázaly, že monoklonální protilátky produkované hybridomy fúze 90 byly typu IgGi·

Všechny monoklonální protilátky produkované hybridomy z fúze 90 bylo možno použít v ELISA testech, ale nevázaly se k PAF-AH ve Western biotech. K přípravě protilátek, které by mohly rozpoznávat PAF-AH ve Western blotu, se myši imunizovaly rekombinantním enzymem. Hybridomy byly připraveny metodou popsanou pro fúzi 90, ale testování probíhalo pomocí Western blotu a nikoli pomocí ELISA. Tak byly vybrány klony, které bylo možno použít k detekci pomocí této metody.

Pro Western analýzy se rekombinantní PAF-AH míchal se stejným objemem vzorkového pufru obsahujícího 125 mM Tris, pH 6.8, 4% SDS, 100 mM dithiothreitol a 0.05% brofenolovou modř. Před nanesením na elektroforézu se vzorek vařil po dobu 5 minut. Byl používán 12% SDS polyakrylamidový gel (Novex). Elektroforéza se prováděla při 40 mA, potom následoval elektrotransfer bílkoviny na polyvinylidenfluoridovou membránu (Pierce). Transfer trval 1 hodinu při 125 V v roztoku 192 mM glycinu, 25 mM Tris báze, 20 % metanol a 0.01% SDS. Membrána se nechala inkubovat přes noc v roztoku : 20 mM Tris, 100 mM NaCl (TBS) obsahujícím 5% hovězí sérum albumin (BSA, Sigma) . Blot se dále inkuboval 1 hodinu při pokojové teplotě s králičím polyklonálním antisérem naředěným 1: 8000 pomocí TBS pufru obsahujícího 5% BSA, potom následovalo promytí v TBS a inkubace s konjugátem kozích anti myších IgG konjugovaných s alkalickou fosfatázou rozpuštěným v TBS obsahujícím 5% BSA po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Blot byl opět promyt TBS a následovala inkubace se substrátem pro alkalickou fosfatázu, to je 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfátem v koncentraci 0,02% a 0.03% tetrazoliovou modří v Tris-Hcl, pH 9.5, 100 mM NaCl a 5 mM MgCl₂. Reakce byla zastavena pomocí opakovaného promývání vodou.

Vybrané jamky fúze, jejichž supernatanty byly pozitivní ve Westernové analýze, byly zpracovány tak, jak bylo popsáno výše. Hybridom 143A reagující s PAF-AH ve Western biotech byl klonován (ATCC HB 11900).

Polyklonální antiséra specifická pro lidský plazmatický PAF-AH byla připravena během tříměsíční imunizace králíků 100 gg purifikovaného rekombinantního enzymu ve Freundově adjuvants.

Příklad 14

K ohodnocení in vivo terapeutického vlivu rekombinantního PAFAH připraveného podle vynálezu byly provedeny experimentální studie na modelu akutního zánětu u otoku krysího chodidla ( Henriques a další, Br.J. Pharmacol., 106: 579-589 (1992).

Výsledky těchto studií prokázaly, že rPAF-AH blokuje vznik PAFindukovaného edemu. Dále byly provedeny paralelní studie sloužící ke srovnání účinnosti PAF-AH se dvěma komerčně dostupnými PAF antagonisty.

A. Příprava PAF-AH

E.coli transformované PAF-AH expresním vektorem puc trp AH byly lysovány v mikrofluidizéru, pevné části byly odcentrifugovány a buněčné supernatanty byly naneseny na sloupec S-Sepharosy (Pharmacia). Sloupec byl extensivně promýván pufrem obsahujícím 50 mM NaCl, 10 mM CHAPS, 25 mM MES a 1 mM EDTA, pH 5.5. PAF-A byl vymyt stoupající koncentrací NaCl, až do hodnoty IM. Jako další krok purifikačního procesu byla použita afinitní chromatografie na sloupci Blue Sepharosy (Pharmacia). Před nanesením PAF-AH na sloupec Blue Sepharosy byl vzorek naředěn 1 • · · · ···· · · · · · · · ··· ·· · ···· : 2 , tím došlo ke snížení koncentrace soli na 0.5 M a upravilo se pH na 7.5. Po extensivnim promývání sloupce Blue Sepharosy pufrem obsahujícím 0.5M NaCl, 25 mM Tris, 10 mM CHAPS a 1 mM EDTA, pH 7.5. PAF-AH byl ze sloupce vymýván zvyšující se koncentrací NaCl až na 3.0 M.

Čistota tímto způsobem izolovaného PAF-AH byla obvykle 95%, tak jak bylo určeno pomocí SDS-PAGE s aktivitou v rozsahu 5 000 ažlO 000 U/ml. Jako další kvalitativní kontroly provedené s PAF-AH preparáty zahrnovaly určení hladiny endotoxinu a hemolytické aktivity s čerstvě připravenými krysími erytrocyty. Jako pufr sloužící zároveň k uchování i jako nosič k administraci preparátu byl použit pufr obsahující 25 mM Tris, 10 mM CHAPS, 0.5 M NaCl, pH 7.5. Dávkování použité v pokusech bylo založeno na určení enzymové aktivity v testech přímo předcházejících pokusům.

B. Indukce otoku (edemu)

Ve všech pokusech byly použity krysí samice Long Evans (Charles River, Wilmington, MA) stáří mezi 6 a osmi týdny , které vážily mezi 180 a 200 g. Před provedením pokusu byla zvířata podrobena anestezi směsí anestetických přípravků Ketaset (Fort Dodge Laboratories,

Fort Dodge, ΙΑ) , Rompun (Miles, Shawnee Mission, KS) a AePromazin (Aveco, Fort Dodge, IA). Všechna anestetika byla podána podkožně v dávkách přibližně 2.5 mg Ketasetu, 1.6 mg Rompunu, 0.2 mg Ace Promazinu na jednu dávku podanou jednomu zvířeti. Otoky byly indukovány v chodidlech podáním buď PAF nebo zymosanu tak, jak je popsáno dále. PAF (Sigma -1402) byl čerstvě připraven pro provedení každého pokusu ze zásobního roztoku 19.1 mM uchovávaného ve směsi chloroform/metanol (9 : 1) při -20° C. Požadované objemy byly vysušeny pod dusíkovou atmosférou, naředěny 1:1000 v pufru obsahujícím 150 mM NaCl, 10 mM Tris p 7.5 a 0.25% BSA a sonikovány po dobu pěti minut. Zvířatům bylo aplikováno podkožně mezi bříška na zadním chodidle 50 μΐ PAF (konečná dávka 0,96 nmolů). Otok se objevil za hodinu, v některých případech po dvou hodinách. Zymosan A (Sigma A-8800) se připravoval čerstvý pro každý pokus, a to jako suspenze 10 mg/ml v PS. Zvířatům bylo aplikováno podkožně mezi • · • · * · bříška na zadním chodidle 50 μΐ zymosanu (konečná dávka 500 μ9) a otok se objevil po dvou hodinách.

Otok se kvantifikoval pomocí měření objemu chodidla bezprostředně před administrací PAF nebo zymosanu a potom v uvedeném čase po podání PAF a zymosanu. Otok se kvantifikoval zvýšením objemu chodidla v mililitrech. Měření objemu bylo prováděno na plethysmometru (UGO Basile, model 7150), kterým se dá změřit objem vody vytlačené ponořeným chodidlem. Z důvodu, aby byla srovnatelná velikost ponořené části chodidla v obou vymezených časových intervalech, zadní část nohy byla označena nesmývatelným inkoustem v místě, kde končí osrstění na patě. Opakovaná měření stejného chodidla za použití této techniky indikovala přesnost měření s chybou do 5 %.

C. Způsoby podávání a dávkování PAF-AH

PAF-AH byl podáván injekčně lokálně mezi bříška na chodidle, nebo systémově pomocí intravenózní injekce do ocasní žíly. Při lokálním podávání dostaly krysy 100 μΐ AF-AH (4000 -6000 U/ml podkožně mezi bříška pravé zadní nohy. Levá noha sloužila jako kontrola, byla do ní injikována dávka 100 μΐ nosiče (pufrovaný fyziologický roztok). Pro systémové podání PAF-AH bylo krysám podáváno uvedené množství jednotek PAF-AH ve 300 μΐ nosiče injekcí do ocasní žíly. Kontrolní zvířata dostala intravenózně do ocasní žíly stejný objem nosiče.

D. Lokální podávání PAF-AH

Krysám (N= 4) byla podána subkutánně mezi bříška na pravém chodidle injekční dávka

100 μΐ PAF-AH (4000-6000U/ml). Do levého chodidla byl injekčně vpraven jen nosič (100 μΐ pufrovaného fyziologického roztoku). Čtyřem dalším krysám byla podána pouze dávka nosiče. Všechny krysy byly ihned podrobeny podání PAF cestou subkutánních injekcí a jednu hodinu po podání byl měřen objem . Obrázek 6, kde je velikost otoku vyjádřena zvýšením objemu chodidla (ml) + SEM pro každou sledovanou skupinu, ukazuje, že vznik otoku indukovaného pomocí PAF je blokován lokálním podáním PAF-AH. U skupiny zvířat, kterým byl podán PAF-AH před podáním PAF, se « · • * · · • · · * projevilo v porovnání s kontrolní skupinou zvířat zmenšení otoku. Ve skupině myší ošetřených PAF-AH bylo pozorováno zvýšení objemu chodidla jen o 0.08 ml + 0.008(SEM), zatímco ve skupině ošetřené pouze nosičem vzrostl objem o 0.63+ 0.14 (SEM). Zvýšení objemu chodidla bylo způsobeno injekcí PAF do chodila, toto zvětšení objemu nebylo pozorováno v chodidlech, do kterých byl injekčně aplikován pouze nosič.

E. Intravenózní podávání PAF-AH

Krysy (N= 4 ve skupině) byly ošetřeny intravenózní injekcí PAF-AH (2000 U ve 300 μΐ nosiče)15 minut před podáním PAF. Otok se objevil 1 až 2 hodiny po podání PAF. Obrázek 7, na kterém je velikost otoku vyjádřena vzrůstem objemu v (ml) + SEM pro každou zkoumanou skupinu, ukazuje, že intravenózní aplikace PAF-AH blokuje vznik otoku zapříčiněný podáním PAF, a to jednu až dvě hodiny po jeho podání. Skupina, která byla ošetřena 2000U PAF-AH intravenózní cestou, vykázala v průběhu dvou hodin snížení zánětu. Průměrné zvýšení hodnoty objemu u skupiny léčené PAF-AH bylo 0.10 ml + 0.08 (SEM), oproti zvýšení 0.56 ml + 0.11 naměřeném u kontrolní skupiny ošetřené jen nosičem

F. Srovnání účinku PAF-AH v zabránění vzniku otoku indukovaného PAF nebo Zymosanem

Krysy (N= 4 ve skupině) byly ošetřeny intravenózní injekcí PAF-AH (2000 U ve 300 μΐ nosiče) nebo nosičem samotným. 15 minut před touto injekcí obdržela zvířata PAF nebo zymosan A a po jedné nebo dvou hodinách byl změřen objem chodidel. Na obrázku 8 je znázorněna velikost otoku jako průměrné zvýšení objemu v (ml) + SEM, a to pro všechny sledované skupiny. Z obrázku je zřejmé, že podání PAF-AH (2000 U) bylo účinné v redukci otoku chodidla vyvolaného PAF, avšak je neúčinné v blokování vzniku otoku v případě podávání zymosanu. Průměrné zvýšení hodnoty objemu u skupiny léčené PAF-AH bylo 0.08 ml + 0.02 (SEM), oproti zvýšení 0.49 ml +_ 0.03 naměřeném u kontrolní skupiny.

G. Účinné dávkování určené titraci PAF-AH vyvolávající ochranu

Ve dvou samostatných pokusech byl krysám (N= 3 až 4 ve skupině) podáván intravenózně PAF-AH v sérii ředění nebo pouze nosič v 300 μΐ objemech, a to 15 minut před podáním dávky PAF. Obě chodidla zvířat byla ošetřena PAF stejným způsobem, jako je popsán výše, otok se hodnotil po jedné hodině. Na obrázku 9 je znázorněna velikost otoku jako průměrné zvýšení objemu v (ml) + SEM, a to pro všechny sledované skupiny. Z obrázku je zřejmé, že podávání stoupajících dávek PAF-AH zabraňuje také se stoupající tendencí tvorbě otoku vyvolaného injekcí PAF krysám. V pokuse byla nelezena ID₅₀ pro PAFAH podávaný injekční cestou mezi 40 až 80 U na krysu.

H. Účinnost PAF-AH in vivo jako funkce času po podání

Ve dvou samostatných pokusech byl krysám (N= 3 až 4 ve skupině) podáván intravenózně PAF-AH (200 U v 300 μΐ nosiče) nebo pouze nosič. Po podání PAF-AH dostaly krysy dávku PAF, a to v časových intervalech počínajících 15 minut po podání PAF-AH až po 47 hodin po podání PAF-AH. Otok byl potom hodnocen jednu hodinu po podání PAF. Na obrázku 10 je znázorněna velikost otoku jako průměrné zvýšení objemu v (ml) + SEM, a to pro všechny sledované skupiny. Z obrázku je zřejmé, že podání 200U PAF-AH ochrání krysy před vznikem otoku indukovaného PAF po dobu nejméně 24 hodin.

I. Farmakokinetika PAF-AH

Čtyři krysy dostaly dávku 2000 PAF-AH intravenózní injekcí v 300 μΐ objemu. V různých časových bodech byla odebírána plazma a uchovávána při 4° C. Koncentrace PAF-AH v plazmě se určovala pomocí ELISA, používal se typ testu využívající dvojité vazby pomocí mAb. Ve zkratce se dá tento postup popsat následovně: monoklonální protilátka 90G11D (Příklad 13) se naředí v 50 mM uhličitanovém pufru pH 9.6 na koncentraci 100 ng/ml a nechá se navázat na mikrotitrační desku Immulon 4 přes noc při + 4° C. Po extensivním promytí pomocí PBS obsahujícího 0.05% Tween 20, se desky blokovaly 1 hodinu při pokojové teplotě 0.5% rybí kožní želatinou (Sigma) ředěnou v PBS. Vzorky séra ředěné v PBS obsahujícího 15 mM CHAPS byly na promytou desku naneseny • «

9 9999 v duplikátech a inkubovaly se po dobu 1 hodiny v pokojové teplotě. Po promytí byl přidán do každé jamky konjugát monoklonální protilátky 90F2D s biotinem (Příklad 13) v koncentraci 5 gg/ml naředěný v PBS. Konjugát se nechal inkubovat jednu hodinu při pokojové teplotě. Po promytí se přidalo do každé jamky 50 μΐ Extra avidinu (Sigma) v ředění 1 : 1000. Avidin se inkuboval jednu hodinu při pokojové teplotě. Po promytí se přidal substrát OPD a nechalo se vyvinout zbarvení, které se změřilo na fotometru. Z kalibrační křivky se potom podle naměřených hodnot odečetla aktivita enzymu. Z obrázku 11, kde body reprezentují průměr + SEM, je patrné, že v plazmě odebrané hodinu po podání, hladiny koncentrace PAF-AH dosahují předpokládanou koncentraci ve vzorcích o objemu plazmy 5 až 6 ml u krys vážících 180 až 200gramů, průměrně 374 U/ml + 58.2. Po jedné hodině hladiny koncentrace stabilně klesají, až dosáhnou po 24 hodinách průměrnou hodnotu 19.3 U/ml + 3.4, která je však stále znatelně vyšší, než koncentrace endogenní PAF-AH, která dosahovala v enzymatických testech přibližných hodnot kolem 4U/ml.

J. Účinnost PAF-AH ve srovnání s antagonisty PAF

Krysy (N= 4 ve skupině) byly ošetřeny jedním ze tří potenciálních přípravků zamezujících zánětu: antagonistou PAF CV3988 (Biomol L103) podávaný IP (2mg ve 200 μΐ EtOH), antgonistou PAF Alprazolam (Sigma A - 8800) podávaným IP (2 mg v 200 μΐ EtOH) nebo PAF-AH (2000 U) podávaným IV. Kontrolní skupina krys obdržela 300 μΐ nosiče IV. Antagonisté PAF byly administrovány IP, protože jsou rozpustné v etanolu. Krysám ošetřeným bud' CV3988 nebo Alprazolamem byl podán PAF po 30 minutách po podání těchto antagonistú, to proto, aby antagonisté PAF se dostaly do oběhu, zatímco PAF-AH a krysám ošetřeným nosičem bylo podávání uskutečněno po 15 minutách po administraci enzymu. Krysy ošetřené PAF-AH vykazovaly redukci v otocích indukovaných PAF, teprve za nimi se umístily další antagonisté CV3988 a Aprazolam. Toto je znázorněno na obrázku 12, kde je znázorněna velikost otoku jako průměrné zvýšení objemu v (ml) + SEM, a to pro všechny zkoumané skupiny.

• » · · · *

Shrneme -li dosažené výsledky, je patrné, že rPAF-AH účinně blokuje otoky vyvolané in vivo PAF. Podávání produktů PAF-AH se může dít buď lokálně, nebo systémově pomocí IV injekcí. Ve studiích dávkování se pohybovaly dávky IV injekcí v rozsahu 160 -2000 U/ krysu. Tyto dávky dramaticky snížily zánět vyvolaný PAF, zatímco dávka ID₅₀ se pohybovala v rozmezí 40 až 80 U/krysu. Výpočty založené na objemu plazmy pro krysu vážící 180 až 200 gramů dávají dobrý předpoklad k tomu, že koncentrace v plazmě rovnající se 25 až 40 U /ml účinně brání vzniku otoku vyvolanému PAF. Tyto předpoklady byly podpořeny předběžnými farmakokinetickými studiemi. Dávka 2000U PAF-AH byla shledána jako účinná při blokování edému vyvolaného PAF po dobu nejméně 24 hodin. Za 24 hodin po podávání byly v plazmě nalezeny koncentrace enzymu PAF-AH přibližně

U/ml. PAF-AH blokoval vznik otoku vyvolaného PAF daleko účinněji, než oba testovaní zmínění další antagonisti PAF.

Souhrnně lze říci, že tyto výsledky potvrzují, že PAF-AH účinně blokuje záněty indukované PAF a mohl by mít terapeutický význam při léčení nemocí, kde je PAF primární mediátor.

Příklad 15

Rekombinantní PAF-AH dle vynálezu byl testován in vivo na druhém modelu, zánětu pohrudnice (pleuritidě)vyvolaném PAF.Jak bylo prokázáno již dříve, PAF, je-li aplikován do pohrudničního prostoru, indukuje vaskulární prosakování. (Hebriques a další, viz výše.). Samice krys ( Charles River, 180 - 200 g) byly injikovány do ocasní žíly 200 μΐ 1% Evansovy modři rozpuštěné ve 300 μΐ rekombinantního enzymu PAF-AH (1500 μΐ/ml/hodina, připraveného tak, jak je popsáno v Příkladu 14) nebo pouze stejným objemem kontrolního pufru. Po patnácti minutách obdržely krysy 100μ1 injekci PAF (2nmol) do pohrudničního prostoru. Po jedné hodině působení PAF byly krysy zabity a odsáta kapalina, která vznikla promýváním pohrudniční dutiny 3 ml heparinizovaného PBS. Prosakování cév bylo měřeno množstvím Evansovy modři v pohrudničním prostoru proměřením absorbance při 620 nm. U krys, kterým byl nejprve podán PAF-AH, bylo prosakování cév daleko menší, než u kontrolní skupiny zvířat (reprezentovalo to více než 80% redukci zánětu).

991*

0 * • 0 9

0 9 ·«

Předcházející výsledky podporují možnost využití rekombinantního PAF-AH dle vynálezu jako léku při zánětu pohrudnice.

Příklad 16

Účinnost rekombinantního enzymu PAF-AH dle vynálezu byla také testována na modelu antigenem indukované tvorby eozinofilů.

Akumulace eozinofilů v dýchacích cestách je charakteristickou vlastností pozdní fáze imunitní odpovědi, která se vyskytuje při astmatu, rinitidě a ekzémech. Myši BALB/c (Charles River) byly zcitlivěny dvěma intraperitoneálními injekcemi obsahujícími lgg ovalbuminu (OVA) ve 4mg hydroxidu hlinitého (Imject alum, Pierce Laboratories, Rockford, IL) podanými ve dvoutýdenním intervalu. Čtrnáctý den následující druhou imunizaci byly zcitlivěné myši podrobeny imunologickému testu s aerosolizovaným OVA nebo fyziologickým roztokem jako kontrolou.

Před samotným testem byly myši náhodně rozděleny do čtyř skupin po čtyřech myších. Myši ve skupině 1 a 3 byly ošetřeny 140μ1 kontrolního pufru obsahujícího 25mM tris, 0,5M NaCl, lmM EDTA a 0,1% Tween 80 podaného intravenózní injekcí. Myši ve skupině 2 a 4 byly ošetřeny 750 jednotkami PAF-AH (aktivita 5500U/ml podanými ve 140μ1 PAF-AH pufru). Třicet minut po podání PAF-AH nebo pufru byly myši ve skupině 1 a 2 vystaveny aerosolizovanému PBS jak je popsáno dále, zatímco myši ve skupině 3 a 4 byly vystaveny aerolizovanému OVA. 24 hodin poté byly myši opět ošetřeny podruhé buď 140μ1 pufru (skupina 1 a 3) nebo 750 jednotkami PAF-AH ve 140μ1 pufru (skupina 2 a 4). Látky byly podané intravenózní injekcí.

Eozifilová infiltrace treachei byla indukována u zcitlivěných myší vystavením zvířat aerolizovanému OVA. Zcitlivěné myši byly umístěny do 50ml konických centrifugačních zkumavek (Cormimg) a nuceny dýchat aerolizovaný OVA (50mg/ml) rozpuštěný v 0,9% fyziologickém roztoku po 20 minut s použitím rozprašovače (Model 646, DeVilbiss Corp., Somerset, PA) . Kontrolní myši byly ošetřeny stejným způsobem s tou výjimkou, že byl v rozprašovači použit jen 0,9% fyziologický roztok. Osmačtyřicet hodin po expozici aerolizovaným OVA nebo fyziologickým roztokem byly myši usmrceny a trachei byly vyjmuty. Treachei z každé • · · · · · skupiny byly pevně zachyceny v OCT a skladovány při -7 0°C do doby nařezání preparátů.

K vyhodnocení eozinofilové infiltraci trachei byly tkáňové řezy ze čtyř skupin myší obarveny buď roztokem Luna a hematoxylin-eozinovým roztokem nebo peroxidasou. Dvanáct šestimikrometrových řezů bylo nařezáno z každé skupiny myší a podle toho očíslováno. Řezy očíslované lichými čísly byly obarveny barvou Luna dle následujícího postupu. Řezy byly fixovány 5 minut v alkoholu při laboratorní teplotě, opláchnuty tekoucí vodou třikrát vždy po 2 minutách při laboratorní teplotě a poté opláchnuty ve dvou výměnách destilované vody (dH₂O) po jedné minutě při laboratorní teplotě. Tkáňové řezy byly barveny barvou Luna 5 minut při laboratorní teplotě (barva Luna se skládá z 90 ml Weigertova železného hematoxylinu (Weigerťs Iron hematoxylin) a 10 ml 1% Biebrich Scarlet). Obarvené řezy byly ponořeny do 1% kyselého alkoholu 6x, opláchnuty v tekoucí vodě po 1 minutě při laboratorní teplotě, ponořeny do 0,5% roztoku uhličitanu lithného pětkrát opláchnuty tekoucí vodou po dobu 2 min při pokojové teplotě. Řezy byly dehydrovány etanolem o koncentracích 70 % - 95 % - 100 %, v každé koncentraci byly ponechány 1 minutu při pokojové teplotě, dále pročištěny dvakrát xylenem po dobu 1 minuty při pokojové teplotě a připevněny do Cytoseal 60.

Pro barvení peroxidas byly segmenty fixovány acetonem o teplotě 4°C po dobu 10 minut a usušeny na vzduchu. Ke každé části bylo přidáno 200 μΐ roztoku DAB a ponecháno 5 min při pokojové teplotě. Řezy byly 5 min opachovány vodovodní vodou při pokojové teplotě a dále byly na každý segment aplikovány 2 kapky 1 % kyseliny osmičelé po dobu 3 - 5 s. Řezy byly opláchnuty vodovodní vodou po dobu 5 min při pokojové teplotě a kontrastně obarveny Mayerovým hematoxylinem při 25°C při pokojové teplotě. Poté byly řezy 5 min oplachovány tekoucí vodou a dehydrovány etanolovou řadou 70 % - 95 % - 100 %, 1 minutu v každé koncentraci, při pokojové teplotě. Řezy byly dále pročištěny dvakrát xylenem po dobu 1 minuty při pokojové teplotě a upevněny v Cytosealu 60.

Byl hodnocen počet eosinofilů v submukosální tracheální tkáni. Trachea myší první a druhé skupiny obsahovala velmi málo samotných eosinofilů v submukosální tkáni. Podle předpokladu byly tracheje • · · · • · • · · • · · • · • · myší třetí skupiny, které byly předem ošetřeny pufrem a vystaveny poprachu OVA, velký počet eosinofilů v submukosální tkáni. Naproti tomu tracheje myší čtvrté skupiny, které byly předběžně ošetřeny PAF-AH a vystaveny poprášení OVA, obsahovaly pouze několik eosinofilů v submucosální tkáni ve srovnání s kontrolní skupinou a skupinami 1 a 2.

Terapeutické ošetření PAF-AH proto může být indikováno v případech pozdní imunitní odezvy, při které dochází k akumulaci eosinofilů, tak jak je tomu u astmatu a rinitidy.

Příklad 17

PAF-AH produkt, který je předmětem patentu, byl testován u dvou odlišných krysích modelů při ošetření nekrotických enterokolitid (NEC), akutních hemoragických nekróz střeva, ke kterým dochází u plodů s nízkou porodní váhou a způsobuje významnou chorobnost a mortalitu. V předchozích experimentech se ukázalo, že ošetření glukokortikoidy snížilo výskyt NEC u zvířat a nedonošených dětí a předpokládá se, že k aktivitě glukokortikoidů dochází prostřednictvím zvýšeně aktivity PAF-AH v plazmě.

A. Aktivita u krys s NEC indukovaným působením PAF

1. Prevence NEC

Rekombinantní PAF-AH produkt, rPH.2 (25.500 jednotek v 0,3 ml, skupiny 2 a 4) nebo samotný pufr (25 mM tris, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA a 0,1 % Tween 80) (skupiny 1 a 3), byly podány do ocasní žíly samičích krys Wistar (n=3) o váze 180 - 200 g. 15 minut po aplikaci rPH.2 nebo samotného pufu byl zvířatům injikován, tak jak popsal Furukawa, et al. (J.Pediatr. Res. 34: 237-241 (1993)), do abdominální aorty na úrovni superiorní mesenterické arterie buď samotný BSA (0,25 %) - fyziologický roztok (skupiny 1 a 2) nebo PAF (0,2 pg/100 gm) suspendovaný ve fyziologickém roztoku obsahujícím BSA (skupiny 3 a 4). tenká střeva byla po dvou hodinách odstraněno od slepé střevo přerušením Trietzova vazu, důkladně opláchnuta • · • · • · chladným fyziologickým roztokem a hodnocena. Pro mikroskopickém pozorování byly získány vzorky z horní, střední a dolní části tenkého střeva. Tkáně byly fixovány v pufrovaném formalínu a vzorky připraveny pro mikroskopické hodnocení obarvením hamatoxylinem a eosinem. Experiment byl třikrát opakován.

Při zevrubné prohlídce střev byl zjištěn normální nález ve skupinách ošetřených BSA ve fyziologickém roztoku. Podobně také injikovaný rPH.2 za nepřítomnosti PAF neměl žádný efekt na nález ve střevech (gross findings). Naopak injekce PAF do descendující aorty měla za následek rychlé a těžké diskolorace a hemoragii serózního povrchu střeva. Podobná hemoragie byla zaznamenána, jestliže byly segmenty tenkého střeva sledovány na straně sliznice a tenké střevo bylo zcela nekrotické. Pokud byl rPH.2 injikován do ocasní žíly 15 min před podáním PAF do aorty, byl nález na střevech normální.

Při mikroskopickém pozorování střev u skupin 1, 2 a 4 byla zjištěna normální vilosní architektura a normální populace buněk v lamina propria. Naopak u skupiny ošetřené samotným PAF byly zjištěny silné nekrózy a hemoragie v celé sliznici. Aktivity PAF-AH v plazmě byly stanoveny u stejných krys jako v předchozím experimentu. Aktivita PAF-AH byla stanovena jak je níže popsáno. Před injekcí do ocasní žily byly nejprve odebrány vzorky krve. Dále byly vzorky odebrány z véna cava bezprostředně před injekcí PAF a v době usmrcení. Krev byla sbírána v množství asi 50 μΐ do heparinizovaných kapilárních trubiček. Plazma byla získána centrifugací (980x g po dobu 5 minut). Enzym byl stanoven podle Yasuda a Johnston, Endocrinology, 130: 708-716 (1992).

Aktivita PAF-AH v plazmě byly u všech krys před injekcí 75 ± 2,5 jednotky (1 jednotka je rovna 1 nmol x min'¹ x ml¹ plazmy). Aktivity PAF-AH naměřené v plazmě byly po 15 minutách po injekci samotného pufru 75,2 ± 2,6 jednotky u skupiny la 76,7 ±3,5 jednotek u skupiny 3. Po 15 minutách byla zjištěna aktivita PAF-AH v plazmě zvířat, kterým bylo injikováno 25 500 jednotek rPH.2, 2249 ± 341 jednotek u skupiny 2 a 2494 ± 623 jednotek u skupiny 4. Aktivita u skupin 2 a 4 zůstala zvýšená (1855 ± 257 jednotek) až do doby usmrcení (2 1/4 hodiny po injekci rPH.2) (skupina 2 = 1771 ± 308; skupina 4 = 1939 ± 478). Z těchto výsledků vyplývá, že aktivita • · • · • · t · · · · ·

PAF-AH v plazmě krys, kterým byla injikována samotná přenosná látka (skupiny 1 a 3), se neměnila v průběhu experimentu. U zvířat, kterým byl injikován samotný PAF, se vyvinul NEC, zatímco všechny krysy, kterým byl podán rPH.2 a poté injekce PAF, byly zcela ochráněny.

2. Závislost prevence NEC na dávkování

Aby bylo možno zjistit u krys závislost ochranné aktivity proti NEC na dávkování, byla zvířata ošetřena zvyšujícími se dávkami rPH.2 15 min před podáním PAF. Dávky rPH.2 se pohybovaly v rozmezí 25,5 až 25.500 jednotek, které byly podány do ocasní žíly krys. Následně byl injikován PAF (0,4 gg v 0,2 ml fyziologického roztoku s BSA) 15 min po podání rPH.2 do abdominální aorty. 2 hodiny po podání PAF bylo tenké střevo odstraněno a byl hodnocen vznik NEC. Aktivita PAFAH v plazmě byla stanovena před exogenním podáním enzymu a 15 minut a 2 1/4 hodiny po podání rPH.2. Výsledky jsou průměrnou hodnotou ze 2-5 zvířat v každé skupině. U všech krys, které dostávaly méně než 2 000 jednotek enzymu, se rozvinul NEC. Aktivita PAF-AH v plazmě zvířat, kterým byly podávány nejnižší ochranné dávky enzymu (2040 jednotek), dosahovala po 15 minutách 363 jednotek na ml plazmy, což představovalo pětinásobné zvýšení oproti výchozí hodnotě. Pokud byl rPH.2 podán v dávce nižší než 1 020 celkových jednotek, byla průměrná aktivita enzymu v plazmě kolem 160 a nižší a u všech zvířat zjištěn vznik NEC.

3. Trvání ochrany proti NEC

Pro stanovení délky exogenního působení produktu PAF-AH potřebného k ochraně proti vzniku NEC, bylo krysám do ocasní žíly jednorázově injikováno fixní množství enzymu a následně aplikován PAF v různých časových intervalech. rPH.2 (8 500 jednotek v 0,3 ml) nebo samotný roztok bez účinné látky byl krysám podán do ocasní žíly a PAF (0,36 μg v 0,2 ml BSA ve fyziologickém roztoku) injikován do abdominální aorty v různých časových intervalech po podání enzymu. Tenká střeva byla vyjmuta 2 hodiny po injekci PAF a podrobena vyšetření a histologickému pozorování vzniku NEC. Aktivita PAF-AH v plazmě byla

stanovena v různých intervalech po podání enzymu a dvě hodiny po aplikaci PAF. V každé skupině byly stanoveny průměrné hodnoty enzymatické aktivity ± standardní odchylka.

Z výsledků vyplývá, že u žádné z krys nedošlo ke vzniku NEC během prvních 8 hodin po injekci rPH.2, zatímco u 100% zvířat, kterým byl následně aplikován PAF 24 a 48 hodin po injekci enzymu, došlo k rozvoji NEC.

4. Zvrat NEC

Aby bylo možné stanovit, zda může podávání PAF-AH zvrátit rozvoj NEC vyvolaný injekcí PAF, bylo zvířatům injikováno 25 000 jednotek enzymu do véna cava dvě minuty po podání PAF (0,4 gg) . U žádného zvířete se NAC nevytvořil. Avšak byl-li rPH.2 podán tímto způsobem 15 minut po injekci PAF, u všech zvířat se NEC vytvořil, což odpovídá rychlému průběhu rozvoje NEC indukovanému podáním PAF, jak již bylo popsáno dříve Furukava et al. (viz výše). Ze souhrnu těchto výsledků vyplývá, že relativně malé zvýšení aktivity (pětinásobné) PAF-AH v plazmě je schopno zabránit vzniku NEC. Tato pozorování spolu s předchozími zprávami o tom, že aktivita PAF-AH v plazmě králičích plodů [Maki,et al., Proč.Nati.Acad.Sci. (USA) 85: 728-732 (1988)] a nedonošených dětí [Caplan, et al., J.Pediatr. 116: 908-964 (1990)] byla relativně nízká, svědčí o tom, že profylaktické podání přípravků obsahujících lidský rekombinantní PAF-AH produkt dětem s nízkou porodní váhou může být použito při ošetření NEC.

B. Aktivita v neonatálním modelu NEC

Účinnost produktu PAF-AH, rPH.2, byla hodnocena u NEC modelu u nově narozených stresovaných krys dále popsaným postupem, a to podáním krmné směsi a asfyxií, což jsou dva rizikové faktory pro vznik choroby u lidí. V tomto modelovém systému došlo u 70-80 % zvířat do třetího dne života ke zjevnému a mikroskopickému poškození střeva podobné jako u neonatálního NEC. Krysí novorozenci byli získáni z březích krys Sprague-Dawley (Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN) , při anestezii CO₂ a porozeny abdominální incisí.

• · « ·

Novorozená zvířata byla shromážděna, osušena a po celou dobu experimentu umístěna v inkubátoru pro novorozence.

Nejprve bylo u jednotlivých skupin zvířat stanoveno dávkování a absorpční charakteristiky rPH.2. Normálním novorozeným krysím mláďatům byla v čase 0 podána enterálně nebo intraperitoneálně jedna ze tří dávek rPH.2 (3λ, 15λ nebo 75λ) a poté byla odebírána krev pro stanovení aktivity PAF-AH v plazmě po lh, 6h nebo 24 h. Aktivita PAF-AH byla měřena metodou inkubace se substrátem [Gray et al., Nátuře, 374: 549 (1995)] a ELISA s použitím anti-lidských rPAF-AH monoklonálních protilátek pro každý vzorek (90F2D a 90G11D, jak je popsáno v Příkladu 13). Imunohistochemický rozbor byl proveden standardními technikami pomocí protilátek ředěných 1:100 a inkubovaných přes noc.

U normálně narozených mláďat krys nebyla po aplikaci rPH.2 do střev, zjištěna zvýšená aktivita PAF-AH v plazmě v žádnou dobu experimentu, jak pomocí metody inkubace se substrátem, tak metodou ELISA. Při intraperitoneální aplikaci rPH.2 byla do jedné hodiny po aplikaci měřitelná cirkulující aktivita PAF-AH oběma metodami a tato aktivita vrcholila 6 h po podání látky. Vyšší dávky rPH.2 (od 3 do 75 λ, 10 až 250 U) vyvolaly vyšší aktivitu PAF-AH v plazmě. Po enterálním podání byla při imunohistochemické analýze zjištěna přítomnost rPAF-AH produktu v epitelových buňkách střevní sliznice. Aktivita byla soustředěna převážně v střevních vilech s minimální přítomností barviva v kryptických buňkách. Intenzivněji bylo obarveno ileum než jejunum a určité množství rPAF-AH produktu bylo imunochemicky detekováno v částech tračníku. Žádné pozorovatelné barvení nebylo zjištěno u kontrolních vzorků a vzorků získaných ze zvířat, kterým byla látka podána intraperitoneálně. Enterální aplikace produktu rPAF-AH měla tedy za následek lokální akumulaci v epitelu sliznice, zatímco intraperitoneální podání produktu rPAFAH zvýšilo hladinu cirkulujícího enzymu ale ne jeho lokální akumulaci ve sliznici.

U NEC modelu byl u novorozených krys indukován NEC podle Caplan et al., Pediatr. Pathol., 14: 1017-1028 (1994). Při tomto postupu byla zvířata každé tři hodiny krmena trubičkou rozpustnou krmnou směsí pro mláďata (Esbiliac, Borden Inc). Počáteční krmná dávka 0,1 ml/krmení byla později podle tolerance zvýšena na 0,4 ml/krmení až

• * do čtvrtého dne. U všech zvířat byla dvakrát denně vyvolána asfyxie vdechováním 100 % dusíku po dobu 50 sekund v uzavřené plastikové komoře a zvířata pak vystavena chladu (4° C) po dobu 10 min. Funkce střev a močového měchýře byla stimulována jemnou manipulací po každém krmení. Zvířata byla vyživována po dobu 96 hodin nebo dokud nevykazovala znaky úzkosti. Chorobná zvířata měla abdominální distenzi, krvavou stolici, dýchací potíže, cyanózu, letargii a byla usmrcena dekapitací. Po usmrcení byla střeva všech krys hodnocena na přítomnost nekróz a fixována ve formalínu pro pozdější histologickou analýzu. Vzorky byly uchyceny v parafínu, nařezány mikrotomem, obarveny hematoxylinem a eosinem a hodnoceny dvěma nezávislými pozorovateli. Poškození střev bylo označeno jako 1+ při odchlípnutých nebo oddělených epitelových buňkách, 2+ při odlupujících se epitelových buňkách do střední vilózní vrstvy, 3+ pro nekrózu celého vilu a 4+ pro transmurální nekrózu.

Pro stanovení účinnosti rPH.2 byla třem skupinám krys podána látka enterálně, intraperitoneálně nebo oběma způsoby. Preparát rPH.2 obsahoval 0,8 mg/ml proteinu a přibližně 4000 jednotek/mg PAFAH s poměrem endotoxin/protein <0,5 EU/mg. Při enterálním užití rPH.2 bylo zvířatům podáno 25λ (80U) látky zředěné v krmné dávce orogastrickou trubicí (každé tři hodiny). Při intraperitoneálním užití bylo zvířatům podáno 75λ intraperitoneální injekcí dvakrát denně. Kontrolním zvířatům byl aplikován odpovídající objem pufru (20 mM NaPO₄ , pH 7,4) bez rPH.2 a byly sledovány současně s každou experimentální skupinou. Mortalita a příznaky NEC u každé skupiny ošetření a rozdíly byly analyzovány pomocí Fischerova exaktního testu. Za významné byly považovány hodnoty při p <0,05. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 9.

Tabulka 9

	NEC	mrtvé
kontrola (i.p. podání)	7/10	8/10
rPH.2 (240 U i.p., dvakrát denně)	6/11	8/11
kontrola (enterální podání)	19/26	21/26
rPH.2 (80 U enterálně, po 3 h)	6/26	7/26
kontrola (i.p. + enterální podání)	10/17	12/17
rPH.2 (240 U i.p. dvakrát denně	3/14	7/14

a 80 U enterálně po 3 hodinách)

Údaje reprezentují souhrnné výsledky čtyř nezávislých experimentů při i.p. aplikaci, čtyř experimentů při enterálním podání a tří experimentů při i.p. + enterálním podání.

Enterální aplikace rPH.2 v porovnání s kontrolou významně snižovala jak výskyt NEC tak úhyn zvířat. Výsledky čtyř různých experimentů ukázaly, že předchozí ošetření zvířat rPH.2 snížilo NEC ze 19/26 (kontrola) na 6/26 (p<0,001). Intestinální poškození ošetřených a kontrolních zvířat bylo různé, ale ve většině případů se jednalo o midvillous nekrózy u několika segmentů, úplné nekrózy vilu v jiných částech, případně též místa s transmurálními nekrózami, zbývající části měly normální histologický nález.

Nej těžší stupeň NEC u ošetřených i kontrolních zvířat s intestinálním poškozením byl podobný (střední hodnota 2,8 u kontrol a 2,4 u krys předem ošetřených rPH.2, p>0,05).

Intraperitoneální podání rPH.2 nemělo, v tomto modelovém systému, na tvorbu NEC a úhyn zvířat významný vliv. Nástup symptomů u této skupiny a kontroly byl podobný (40+5 hodin u kontroly, 36 + 7 hodin u skupiny krys ošetřené rPH.2) a stupeň NEC byl u obou skupin také podobný (střední hodnota 2,6 u kontroly a 2,5 u skupiny krys ošetřené rPH.2).

Byly provedeny další experimenty, při kterých byl krysám podán rPH.2 jak enterálně tak intraperitoneálně, a to ve stejných dávkách jako při aplikaci jedním z těchto způsobů (25λ rPH.2 při každém krmení po třech hodinách a 75λ intraperitoneální injekcí dvakrát • *

denně). Výsledky ukazuje tabulka 9. Přestože nebyl mezi ošetřenou a kontrolní skupinou zjištěn významný rozdíl v počtu uhynulých zvířat, ošetření rPH.2 významně snižovalo výskyt NEC (10/17 u kontrol a 3/14 u krys ošetřených rPH.2, p = 0,04). U šesti ze sedmi uhynulých zvířat ze skupiny ošetřené rPH.2 byl zjištěn pozitivní nález E.coli v krvi těsně před smrtí.

Tyto výsledky potvrzují ochrannou roli PAF-AH produktů v neonatálním modelu NEC, který není indukován PAF. Enterální ošetření rPAF-AHproduktem bránilo vzniku NEC, zatímco intraperitoneální ošetření v těchto dávkách nemělo žádný zjevný účinek. Tyto výsledky svědčí o tom, že PAF-AH produkt doplněný do směsi pro umělou výživu novorozenců ohrožených vznikem NEC by mohl snížit výskyt tohoto onemocnění.

Příklad 18

Účinnost PAF-AH produktu při syndromu akutní respirační nedostatečnosti (ARDS - acute respirátory distress syndrome) byla sledována u morčat.

Intravenózně injikovaný PAF vyvolával u morčat těžký zápal plic připomínající počáteční ARDS u lidí. V průběhu několika minut po intravenózní aplikaci PAF, byl parenchym plic zaplněný zúženými bronchi a bronchiolami (Lellouch-Tubiana et al., viz výše). Krevní destičky a polymorfonukleární neutrofily počaly marginalizovat a buněčné agregáty byly snadno detekovatelné podél plicních arteriol [Lellouch-Tubiana Br.J. Exp Path., 66: 345-355 (1985)]. Infuze PAF také poškozovaly bronchiální epitelové buňky, které se odlučovaly ze stěn a akumulovaly v dýchacích cestách. Takové poškození epitelových buněk v dýchacích drahách je ve shodě s tvorbou hyalinních membrán, ke kterému dochází u lidí v průběhu rozvoje ARDS. Marginalizace neurofilů a destiček je rychle následována diapedezí těchto buněk do alveolárních sept a alveolárních prostorů plic. Buněčné infiltráty vyvolané PAF jsou provázeny významným vaskulárním prosakováním a vznikem edému v dýchacích cestách [Kirsch, Exp. Lung Res., 18: 447459 (1992)]. Vznik edému byl také potvrzen při in vitro studiích ,

·· · · · · · · • ··· · · · · ·· kdy PAF indukoval extravazaci fibrinogenu značeného ¹²⁵I v závislosti na podané dávce (10-1000 ng/ml) u promytých plic morčat [Basran, Br. J.Pharmacol., 77: 437 (1982)].

Na základě výše uvedených pozorování byl vytvořen ARDS model u morčat. Kanyla je pod anestezií umístěna do krční žíly morčat Hartly samčího pohlaví (přibližně 300-400 g) a PAF zředěný v transportní látce, kterou bylo 500 μΐ PBS s 0,25 % hovězího sérum albuminu (PBSBSA) , aplikován infuzí po dobu 15 minut v celkové dávce 100-400 ng/kg. V různých intervalech po infuzí PAF byla zvířata usmrcena a odebrána plicní tkáň. U morčat, kterým byl infuzí podán PAF, bylo již během 15 minut jasně patrné časově závislé poškození plic a zánět, který trval až 60 minut. V alveolárních prostorách morčat, kterým byl podán PAF, jsou přítomny neutrofily a červené krvinky, zatímco u kontrolních zvířat jejich přítomnost nebyla zjištěna. Bylo také prokázáno poškození epitelových buněk připomínající tvorbu hyalinních membrán u lidských pacientů s ARDS. Ve vzorcích bronchoalveolární laváže (BAL) odebraných z morčat, kterým byl infúzně podán PAF, byla zjištěna silná akumulace proteinů v zanícených plicích a prokázáno vaskulární prosakování.

V tomto modelovém systému ARDS u morčat bylo zjištěno, že rPH.2 zcela zabránil poškození plic vyvolanému PAF. Skupiny morčat byly předem ošetřeny buď rPH.2 (2000 jednotek v 500 μΐ) nebo jen samotným PAF-AH pufrem (500 μΐ). Po 15 minutách byl morčatům podán infúzně PAF (400ng/kg v 500 μΐ) a apliková po dobu 15 minut. Kontrolní skupině morčat bylo infúzně podáno 500 μΐ PBS-BSA. Po ukončení infúzí PAF byla zvířata usmrcena a odebrána BAL tekutina laváží plic X s 10 ml fyziologického roztoku obsahujícím 2 μ/ml heparinu, aby se předešlo srážení. Pro stanovení obsahu proteinů v BAL byly vzorky zředěny 1 : 10 fyziologickým roztokem a stanovena OD 280. V BAL tekutině morčat, kterým byl aplikován samotný pufr, byla zjištěna koncentrace proteinů 2,10 ±1,3 mg/ml. Naproti tomu BAL tekutina ze zvířat, kterým byl infúzně podán PAF, obsahovala 12,55 ± 1,65 mg/ml proteinů. U morčat předem ošetřených rPH.2 byl v BAL tekutině zjištěný obsah proteinů 1,13 ± 0,25 mg/ml, což je srovnatelné s kontrolou a dokazuje, že PAF-AH produkt zcela brání vzniku plicního edému indukovaného PAF.

• · • ·

Příklad 19

Účinnost produktu PAF-AH, rPH.2, byla hodnocena u dvou modelových systémů akutní pankreatitidy.

A. Aktivita u modelu pankreatitidy u krys

Samci krys Wistar (200-250 g) byly zakoupeny od Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Krysy byly chovány v místnosti s řízeným klimatem 23 ± 2 °C, 12 hodinovým cyklem světlo/tma a krmeny standardním laboratorním krmivém a vodou ad libitum. Zvířata byla náhodně rozdělena do kontrolní a experimentální skupiny. Krysy byly anestezovány 50 mg/kg pentobarbitalem sodným aplikovaným intraperitoneálně a poté jim byl zaveden polyvinylový katétr (velikost V3, Biolab products, Lake Havasu, AZ) do krční žíly. Katétr byl tažen subkutánně a ústil v dorsální cervikální oblasti. Zvířata byla ponechána aby se probrala s anestézie.

Krysy měly volný přístup k vodě ale byly přes noc ponechány bez potravy. Experimenty byly proveden následující den na zvířatech, která byla již při vědomí. Do zahájení experimentu byl katétr plněn konstantní infuzí fyziologického roztoku (0,2 ml/h). V den experimentu byl zvířatům intravenózně injikován rPH.2 nebo samotná přenosná kontrolní látka a následně podána infuze buď (1) 5 gg/kg caeruleinu po hodině po dobu 3,5 hodiny, nebo (2) 10 gg/kg caeruleinu po hodině po dobu 5 hodin, (Research Plus, Bayonne,

NJ). Ihned po ukončení infuzí byla zvířata anestezována pentobarbitalem sodným, otevřeny břišní dutiny a odsáto 5 ml krve z vnitřní vény cavy pro další stanovení. Zvířata byla poté usmrcena vykrvácením. Byly měřeny sérum amylasa sérum lipasa a sérum bilirubin a odebrán pankreas. Části pankreatu byly buď fixovány v 4 % roztoku fosfátového formaldehydového pufru pro histologická pozorování nebo ihned zmraženy na -80°C pro měření myeloperoxidasové aktivity. Další části pankreatu byly použity pro stanovení obsahu vody v pankreatu, pankreatické amylasy a trypsinu, jak je popsáno níže. Myeloperoxidasová aktivita, která • · • ·

ukazuje míru zabarvení neutrofilů byla stanovena v pankreatu a plicích, jak je dále popsáno. Data byla statisticky hodnocena pomocí nepárového Studentova t-testu. Uvedené hodnoty představují průměr + S.E.M. přinejmenším tří různých experimentů. Za významné jsou považovány výsledky při p < 0,05.

1. Obsah vody v pankreatu

Segmenty pankreatu byly osušeny a zváženy (čerstvá váha) a poté sušeny 34 hodin při 120 °C a opět zváženy (suchá váha). Voda pankreatu byla vypočítána jako rozdíl mezi čerstvou a suchou váhou a vyjádřena jako procento čerstvé váhy. Zvýšený obsah vody v pankreatu indikoval vznik edému.

2. Sérum a pankreatická amylasa

Aktivita amylasy v séru byla měřena pomocí substrátu 4,6ethylin (G₇)-p- nitrofenyl (GJ-aiD-maltoplastid (ET-G₇PNP) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) podle Pierre et al., Clin.Chem., 22: 1219 (1976). Aktivita amylasy v tkáních pankreatu byla měřena stejnou metodou po homogenizaci tkání v 10 mM fosfátovém pufru, pH 7,4.

3. Pankreatický trypsin

Aktivita trypsinu byla měřena fluorimetricky pomocí substrátu Boc-Gin-Ala-Arg-MCA. V kyvetě bylo smícháno 200 μΐ vzorku a 2,7 ml 50 mM Tris pufru (pH 8,0) obsahujícího 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂ a 0,1 % hovězí sérum albumin. Ke vzorku bylo přidáno 100 μΐ substrátu a po 20 sekundách preinkubace byla zahájena reakce. Fluorescence byla měřena při excitaci 380 nm a emisi 440 nm a vyjádřena směrnicí přímky. Aby bylo možné vyhodnotit společně různé experimenty, byla aktivita trypsinu ve frakcích vyjádřena jako procento celkové aktivity trypsinu.

• · • to · · · · • ·

Histologie a morfometrie

Pro světelnou mikroskopii byly náhodně vybrány řezy z přední, střední a zadní části pankreatu a fixovány v 10 % neutrálním fosfátovém formalínovém pufru. V parafínu uchycené segmenty o velikosti 5 pm byly obarveny hematoxylinem-eosinem (H & E) a hodnoceny zkušeným morfologem. Poškození nebo nekrózy acinárních buněk bylo stanoveno buď jako (a) přítomnost neostrostí u acinárních buněk nebo (b) vakuolizace a otok acinárních buněk a destrukce histo-architektury celého acinu nebo jen části, oba jevy musely souviset se zánětlivou reakcí. Množství poraněných nebo nekrotických buněk a celková plocha tvořená acinárními buňkami bylo kvantifikováno morfometricky pomocí videa a počítačové planimetrické analýzy obrazu (model CCD-72, Dage-MTl, Michigan city, IN) vybaveným softwarem pro analýzu obrazu NIH-1200. U každého vzorku bylo hodnoceno deset náhodně zvolených polí mikroskopu.

Rozsah poškozených nebo nekrotických buněk byl stanoven jako procento celkové plochy acinárních buněk s oblastmi splňujícími kritéria pro poškození nebo nekrózu.

5. Měření myeloperoxidasivé aktivity (MPO) v pankreatu a plicích

Zabarvení neutrofilů v pankreatu a plicích bylo stanoveno na základě myeloperoxidasové aktivity v tkáních. Vzorky tkání odebrané v době usmrcení byly uloženy při -70°C až do doby analýzy. Vzorky (50mg) byly rozmraženy a homogenizovány v 1 ml 20 mM fosfátového pufru (pH 7,4) a centrifugovány (10.000 x g, 10 min, 4°C). Získaný pelet byl resuspendován v 50 mM fosfátovém pufru (pH 6,0) obsahujícím 0,5 % hexadecyltrimetylamonium bromid (Sigma, St.

Louis, MO) a čtyřikrát za sebou zmražen a rozmražen. Suspense byly pak rozrušena sonikací podobu 40 sekund a centrifugována (10.000 x g, 5 min, 4°C). Reakční směs obsahující extrahovaný enzym, 1,6 mM tetrametylbenzidin (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO), 80 mM fosfátový pufr (pH 5,4) a 0,3 mM peroxid vodíku, byla inkubována při 37°C 110 sekund a měřena absorbance při 655 nm automatickým • · • · · · · · · · · · ··· 99 9 ··· • · · · · · ··· ·· • ·· ···· ··· • « · 9 9 9 9 9 9 9 ·· analyzátorem CobasBio. Tato absorbance pak byla přepočítána podle obsahu sušiny ve vzorku tkáně.

Měření pulmonální vaskulární permeability

Ucpání společného biliopankreatického kanálu má obvykle za následek těžkou pankreatitidu související s poškozením plic, které lze kvantifikovat podle vaskulární permeability plic a histologickým hodnocením.

Zvířatům bylo dvě hodiny před usmrcením intravenózně aplikováno 5 mg/kg fluorescein isothiokyanát albuminu ( FITC-albumin, Sigma Chemical Co., St.Louis, MO). Pulmonální mikrovaskulární permeabilita byla hodnocena na základě prosakování FITC-albuminu z vaskulárních kompartmentů do bronchoalveolárnách prostor. Stručný popis metody: ihned po usmrcení byl pravý bronchus blokován svorkou a trachea otevřena. Poté byla pravá plíce vymyta pomocí kanyly vložené do tracheji. Tři laváže fyziologickým roztokem (60 ml na laváž) byly spojeny a byla měřena fluorescence FITC v séru a laváži při excitaci 494 nm a emisi 520 nm. Vypočtený poměr fluorescence laváže ke krvi pak vyjadřoval míru mikrovaskulární permeability plic. Plíce byly také obarveny pomocí H & E a histologicky hodnoceny.

7. Účinek podání Caeruleinu a rPH.2

Infúze samotného caeruleinu 5 gg/kg/h po dobu 3,5 hodiny vyvolala u krys typickou mírnou indukovanou pankreatitidu, charakterizovanou hyperamylasií, pankreatickým edémem měřeným podle obsahu vody v pankreatu a histologickými změnami zahrnujícími výraznou vakuolizaci a pankreatický edém. Infúze fyziologického roztoku nevyvolávala u kontrolních zvířat žádné z těchto biochemických ani histologických změn. Intravenózní podání rPH.2 v dávkách 5, 10 nebo 20 mg/kg 30 min před začátkem infúze caeruleinu neovlivnila významně závažnost změn pankreatického edému (obsah vody) a histologický nález indukovaný infúzí samotného caeruleinu.

• · • ·

Podání rPH.2 neovlivnilo také caeruleinem indukovanou aktivaci pankreatického trypsinogenu nebo obsah amylasy.

Infúze vyšších dávek caerulinu, 10 μg/kg/h po dobu 5 hodin, vyvolala u krys těžší pankreatitidu s charakteristickým výrazným zvýšením amylasové aktivity v séru, vznikem pankreatického edému, silným zvýšením pankreatické aktivity MPO a významným zvýšením aktivace trypsinogenu a amylasové aktivity pankreatu. Histologie pankreatu odhalila nejen edém pankreatu a vakuolizaci alcinárních buněk, ale také několik nekrotických skvrn a několik infiltrovaných buněk.

Podání rPH.2 (5 nebo 10 mg/kg intravenózně) 30 min před počátkem infuze caeruleinu (10 μg/kg/h) zlepšilo většinu pankreatických změn, které vyvolala samotná infuze caeruleinu. Výsledky prezentuje Tabulka 10, viz dále. Ošetření rPH.2 v dávce 5 mg/kg mělo za následek pokles aktivity sérum amylasy (z 10984±1412 na 6763±1256). Vyšší dávky 10 mg/kg rPH.2 již nevyvolaly zlepšení hyperamylázie. Ošetření rPH.2 v dávce 5 nebo 10 mg/kg mělo také za následek snížení výskytu pankreatického edému indukovaného caeruleinem měrěného podle obsahu vody (90,61 ± 0,27 při samotném caeruleinu a 88,21 ± 0,61 pro caerulein s 5 mg/kg rPH.2). rPH.2 v dávce 5 mg/kg vyvolal silné zlepšení pankreatické aktivity NPO (2,92 + 0,32 -krát při samotném caeruleinu a 1,19 + 0,21 při caerulainu spolu s rPH.2, p < 0.05). Vyšší dávky rPH.2 nevyvolávaly již další zlepšení MPO aktivity. Dávka rPH.2 také neměnila významně rozsah aktivace trypsinogenu nebo obsah amylasy v pankreatu. Po předběžném ošetření rPH.2 bylo při histologické analýze zjištěno zlepšení v případě mikroskopických nekróz pankreatu a infiltrace.

Poškození plic související s pankreatitidou bylo pozorováno jak klinicky tak u několika modelů pankreatitidy. Infúze caerulinu v dávce 5 μg/kg/h po dobu 3,5 h , která vyvolává mírnou formu pankreatitidy, neměla za následek významné zasažení plic. Avšak infúze caerulinu v dávce 10 μg/kg/h po dobu 5 h, která vyvolávala těžší pankreatitidu, způsobila poškození plic kvantifikovatelné zvýšenou vaskulární permeabilitou plic (0,31 ± 0,04 až 0,79 ± 0,09), • · • · « 9

aktivitou MPO v plicích (odpovídající zabarvení neutrofilů) a infiltrací neutrofilů.

Podání rPH.2 v dávce 5 mg/kg 30 min před infúzí caeruleinu významně zlepšovala růst MPO aktivity v plicích, indukovaný infúzí samotného caeruleinu (3,55 ± 0,93 u samotného caeruleinu a 1,51 ± 0,26 u caeruleinu s rPH.2). Ošetření rPH.2 významně snížilo závažnost mikroskopických změn pozorovaných v plicní tkáni po infúzi caeruleinu. Zvýšená vaskulární permeabilita vyvolaná infúzí caeruleinu byla podáním rPH.2 snížena, ale rozdíl nebyl statisticky významný. Vyšší dávka rPH.2 (10 mg/kg) nesnižovala více poškození plic vyvolaná caeruleinem, než nižší dávky .

>· Ι· ·· »··· « • · · · · * · • ·· » · · · . · * » · ♦ » « · » » < · · · » · >···· »· ·· «

Tabulka 10

Kontrola (žádný CER)

Caerulein (CER) gg/kg/h

CER + mg/kg rPH.2

CER + mg/kg rPH.2 sérum amylasa (U/I)

961 + 174 10984 ± 1412

6763 ± 1256

8576 ± 1024 obsah vody v pankreatu 72,71 ± 0,64 90,61 ± 0,27 (% vlhké váhy)

88,21 ± 0,61

89,00 ± 0,94 pankreatický MPO (násobky kontroly)

1,0 2,92 ± 0,32

1,19 ± 0,21

1,42 + 0,19 aktivita pankreatického trypsinu 0,12 + 0,06 9,70 ± 2,50 (1000xsklon/ pg DNA)

8,33 ± 1,75

9,15 ± 1,28 obsah pankreatické 0,28 ± 0,06 0,42 ± 0,07 amylasy (U/pg DNA)

0,45 ± 0,04

0,46 ± 0,044 vaskulární permeabilita plic 0,31 ± 0,04 0,79 ± 0,09 (laváž/ sérum %)

0,70 ± 0,09

0,70 ± 0,07

MPO plic 1,0 3,55 ± 0,93 (násobky kontroly)

1,51 ± 0,26

1,64 ± 0,22

B. Aktivita u modelu pankreatitidy u vačice

Zdravé, náhodně odchycené americké vačice (Didelphis virginiana) obou pohlaví (2,0 kg až 4,0 kg) byly získány ze Scott86 ···· ·· · · ·· ·· · ·

Haas a chovány v místnostech s řízenou atmosférou 23 ± 2°C, 12 hodinovým cyklem světlo/tma a krmeny standardním laboratorním krmivém a vodou ad libitum. Po nočním půstu byla zvířata anestezována 50 mg/kg fenobarbitalu sodného i.p. (Veterinary Laboratories Inc., Lenexa, KS). Celiotomie byla prováděna prostřednictvím středové incize za sterilních podmínek a kanál společný pro žluč a pankreas byl podvázán za účelem vyvolání nekrotické pankreatitidy. Navíc byl cystický kanál podvázán tak aby žlučník nemohl fungovat jako zásobárna žluče. Zvířata byla náhodně rozdělena do kontrolních a experimentálních skupin. Počínaje druhým dnem po podvázání pankreatického kanálu, bylo experimentální skupině podáno rPH.2 v dávce 5 mg/kg tělesné váhy a den (aplikovány 4 mg/ml roztoku) intravenózně do ocasní žíly, zatímco kontrolní skupině bylo intravenózně podáno placebo ve stejném objemu. Po 1 a 2 dnech ošetření (3. a 4. den po ligaci pankreatického kanálu) byla zvířata usmrcena předávkováním fenobarbitalu sodného. Byly odebrány vzorky krve ze srdce pro stanovení obsahu sérum amylasy, sérum lipasy a sérum bilirubinu a odebrán pankreas.Části pankreatu byly jednak fixovány ve 4 % fosfátovém formaldehydovém pufru pro histologická pozorování nebo okamžitě zmraženy na -80°C pro stanovení myeloperoxidasové aktivity. Další části pankreatu sloužily pro stanovení obsahu vody a obsahu pankreatické amylasy, tak jak bylo popsáno výše v sekci A tohoto příkladu. Myeloperoxidasová aktivita, měřítko zabarvení neutrofilů, byla stanovena v pankreatu tak jak je výše popsáno. Pulmonární vaskulární permeabilita byla také stanovena výše uvedenou metodou.

Uvedené výsledky představují průměr ± střední chyba průměru (SEM) získaný ze tří a více nezávislých experimentů. Významnost změn vyla hodnocena Studentovým t-testem, pokud šlo o data uspořádaná ve dvou skupinách a analýzou variance (ANOVA) pokud byly porovnávány tři skupiny a více. Pokud anova indikovala významný rozdíl, byla data analyzována metodou Turkey jako post hoc test rozdílů mezi skupinami. Rozdíl byl považován za významný, pokud hodnota p<0.05. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 11. Ucpání společného biliopankreatického kanálku mělo za následek těžkou nekrotickou pankreatitidu,charakterizovanou hyperamylasií, hyperlipasemie a rozsáhlými nekrózami pankreatu. Navíc mělo ucpání společného • · · · · biliopankreatického kanálku za následek silné zvýšení hodnot bilirubinu v séru. Intravenozní podání rPH.2 (5 mg/kg/den) počínaje druhým dnem po ligaci pankreatického kanálku, zlepšilo většinu pankreatických změn indukovaných ucpáním kanálku a ve srovnání se zvířaty, kterým bylo podáno placebo. Jednodenní ošetření rPH.2 snížilo hladinu sérum amylasy ve srovnání se kontrolními zvířaty, přestože rozdíl nebyl statisticky významný a dvoudenní aplikace rPH.2 (4. den po ligaci pankreatického kanálku) významně snížil hladiny amylasy ve srovnání s placebo skupinou. Jednodenní a dvoudenní ošetření rPH.2 snížilo hladinu sérum lipasy na úroveň kontroly, avšak rozdíl nebyl statisticky významný. Dvoudenní aplikace rPH.2 snížila obsah pankreatické amylasy na úroveň kontrol, avšak při jednodenní aplikaci došlo ke zvýšení pankreatické amylasy. Ošetření rPH.2 neovlivnilo hladinu bilirubinu v séru, pankreatickou myeloperoxidasovou aktivitu ani obsah vody v pankreatu.

K hlavním charakteristickým změnám indukovaným obstrukcí biliopankreatického kanálku patřily nekrózy, infiltrace zanícených buněk, vakuolizace acinárních buněk a výrazné roztažení acinárních lumenů. Morfometrické sledování poškozených acinárních buněk pankreatu ukázalo silný ochranný účinek rPH.2 při ošetření den nebo dva předem. Při ošetření rPH.2 den předem bylo poškození acinárních buněk sníženo na 23 % celkové acinární tkáně, ve srovnání se 48 % poškozené tkáně zvířat, kterým bylo podáno placebo. Tento pokles poraněných buněk byl ještě více patrný po dvoudenní aplikaci rPH.2, kdy došlo ke snížení poškozených buněk na 35 % v porovnání se 60 % u zvířat, kterým bylo podáno placebo.

Vaskulární permeabilita plic, kvantifikovaná injekcí FITC, u skupiny, které byl aplikován rPH.2 se výrazně odlišovala od placebo skupiny při jednodenní a dvoudenní aplikaci. Histologická pozorování ukázala těžká poškození plic u všech skupin ošetřených placebem. Poškození plic bylo charakterizováno rozsáhlou žánětlivou reakcí s intersticiální a intraalveolární infiltrací především makrofágy, lymfocytů a neutrofilů a nepravidelným ale výrazným intersticiálním edémem a zesílením alveolárních membrán. Podání rPH.2 výrazně snížilo infiltraci zanícených buněk a zmenšilo intersticiální edém při obou délkách aplikace.

• · * · ·· · ·

Souhrn těchto výsledků jasně ukazuje, že intravenózní podání rPH.2 v dávce 5 mg/kg/den počínaje 48 hodin po ligaci pankreatického kanálku mělo za následek významné snížení zvýšených hladin amylasy a lipasy a poškození acinárních buněk kvantifikované morfometrickou analýzou sekcí obarvených H & E a k významnému poklesu závažnosti pankreatitidou indukovanému poškození plic.

Na tomto, z klinického hlediska vhodném modelu pankreatitidy, prokázal rPAF-AH produkt přínosný vliv na snížení závažnosti pankreatitidy.

Tabulka 11

Po dvoudenním ošetření (usmrcení 4. den)

Po j ednodennim ošetření (usmrcení 3. den) placebo rPH.2 5 mg/kg placebo

sérum bilirubin (mg/dl) sérum amylasa (U/l) sérum lipasa (U/l) obsah vody v pankreatu (%) pankreatický (OD/frakce sušina) pankreatická amylasa (U/pg DNA) vaskulární permeabilita

5,4910,96

7,1010,60

6,5410,55

5618+899

22261554

81,1010,56

MPO

13451286

706192

0,7610,09 plic (FITC laváž/ sérum %) poškozené acinární buňky 48 (% z celkové acinární tkáně) *p = 0,02 versus placebo **p < 0,001 versus placebo

42881675

12411263

81,5210,79

1142183

11011105

0,2110,04**

653811355

14241257

80,0511,07

11491232

950185

0,5710,13 rPH.2 5 mg/kg

4,9110,79

31061467*

10231295

79,3210,49

10331130

7121131

0,2310,04* » · · · • · • · · · · · · ··· · » · ···· ·· ··· · · · · · · ·

Příklad 20

Byla provedena studie hodnotící účinek PAF-AH produktu, rPH.2, na neurotoxicitu spojenou s infekcí HIV. Infekce centrálního nervového systému HIV-1 (human immunodeficiency virus, typ 1) působí neuronální ztráty apoptosou. Jsou-li monocyty infikované HIV-1 aktivovány různými antigenními stimuly včetně kontaktu s nervovými buňkami, vylučují vysoké hladiny neurotoxických cytokinů, včetně PAF, vyvolávajících zánět.

Byl studován vliv rPH.2 na neurotoxicitu upraveného média z monocytů infikovaných HIV.

Monocyty byly infikovány HIV a aktivovány jak je dále popsáno. Monocyty byly získány z periferálních buněk kostní dřeně (peripheral bone marrow cells - PBMC) HIV a hepatitis B seronegativních dárců po leukoforéze a purifikovány (> 98%) centifugačním vyčištěním (countercurrent centrifugal elutriation) tak jak popsali Genis et al., J. Exp. Med., 176: 1703-1718 (1992). Buňky byly kultivovány (lx 10⁴ buněk/ml v kultivačních lahvích T-75) v DMEM /Sigma, St. Louis, MO) s lidským rekombinantním faktorem stimulujícím kolonie makrofágů (MSCF - recombinant human macrophage colony stimulatory factor) (Genetic Institute, lne. Cambridge, MA). Za těchto podmínek se monocyty diferencovaly v makrofágy. Po 7-10 dnech kultivace byly makrofágy vystaveny HIV-1_ADA (pod číslem M60472) v přebytku infekčního agens (multiplicity of infection - MOI) 0,01 infekčních virionů/cílovou buňku. Za těchto podmínek bylo 20-50 % monocytů infikováno 7 dní po inokulaci HIV-1, což bylo potvrzeno imunofluorescenčními metodami a hybridizací in šitu [Kalter et al., J. Innumol., 146: 298-306 (1991)]. Kulturám bylo doplňováno čerstvé živné médium každý 2 až 3 den. Pět až sedm dní po infekci HIV, v době kulminace aktivity reverzní transkriptasy (10⁷ cpm/ml) stanovené podle Kalter et al., viz výše, byly kultury monocytů, a to jak infikovaných HIV-1 tak paralelní kultury neinfikovaných monocytů, stimulovány LPS (10 ng/ml) nebo samotnou přenosovou látkou po dobu 30 min, při 37°C a poté rychle zmraženy na -80°C a uchovány až do doby testování neurotoxicity.

Kultury lidských celebrálních kortikálních neuronových buněk byly odvozeny podle následujícího postupu. Lidská fetální mozková tkáň byla získána z telencefalonu ve druhém trimestru (13-16 týdnů těhotenství) modifikovaným postupem podle Bankera a Cowana, Brain Res., 126: 397-425 (1977). Stručný popis metody: mozková tkáň byla odebrána, omyta 30 ml chladného Hankova média BSS (obsahujícím Ca²⁺ a Mg²⁺ + 25 mM HEPES a 5X gentamicinu), separovány od adherent meninges a krve a nařezány na kousky o velikosti 2 mm³. Tkáň byla protlačena přes 230μΜ sáček Nitex a 10-15 krát jemně protažena přes Pasteurovu pipetu opálenou nad plamenem. Dále byla tkáň centrifugována při 550 rpm, 5 min, 4°C a pelet resuspendován v 5-10 ml MEM-hipp (D-glukosa, 5 g/1; L-glutamin, 2mM; HEPES, 10 mM; Na pyruvát, 1 mM; KCl, 20 mM) obsahující NI komponenty (insulin, 5 mg/1; transferin, 5 mg/1; selenit, 5 gg/l, progesteron, 20nM; putrescin, 100 μΜ) , stejně jako 10% fetální sérum (FCS), PSN směs antibiotik (penicilín, 50mg/l; streptomycin 50 mg/1; neomycin 100mg/l) a fungizon (2.5 g/1). Počet buněk a jejich životnost byly určeny pomocí naředění Hanksovým BSS obsahujícícm 0.4 % tryptofanovovou modř (1:1 v/v) a buňky byly počítány pomocí hemocytometru.Buňky byly pětkrát promyty 10 ml pipetou a vysety v ředění odpovídajícím hustotě 105 buněk/12 mm sklíčko krycí sklíčko, která byla předem potažena poly-L-lysinem (70K-150K MW, Sigma, St.louis, MO) a po nanesení buněk umístěna do 24 jamkových kultivačních desek.Do každé kultivační jamky byl potom přidán 1 ml media. Buňky se inkubovaly a kultivovaly po dobu 10 až 28 dnů při 370 C v inkubátoru s vlhkou atmosférou skládající se z 5 % C02 / 95 % vzduchu. Medium se měnilo každé tři dny.Za těchto podmínek byly kultury > z 60-70 % homogenní pro neurony, dále kultura obsahovala 20 - 30 % hvězdicových buněk, < 1% mikroglií a přibližně 10 % makrofágů a barvitelných mikroglií. Po 14 až 28 dnech kultivace, kultura neuronů exprimovala dostatečné množství Nmetyl-D-aspartátu (NMDA) nebo non-NMDA receptory byly usmrceny po podání excitotoxických dávek NMDA nebo alfaamino-3-hydroxy-5-metyl-4 isoxazol propionové kyseliny (AMPA).

Test na neurotoxicitu byl prováděn následujícím způsobem. Testované vzorky, mezi něž patřila (a) kondiciovaná media z LPSstimulovaných HIV-1 infikovaných monocytů, (b) kontrolní media, (c) kondiciované medium s přidaným rPH.2 v koncentraci 5^g/ml nebo (d) • · kondiciované medium s přidaným nosičem pro rPH.2, byly aplikovány na buňky kultury neuronů v koncentraci 1 : 10 v/v na dobu 24 hodin. Neurotoxicita se měřila pomocí identifikace apoptických jader in šitu na neuronech rostoucích na krycích sklíčkách, které byly fixovány 4% formaldehydem. K tomuto testu byl užíván komerční kit (Apop Tag; ONCOR, Gaithersburg,MD), který používal terminální deoxynukleotidyltransferázu (TdT) k vazbě digoxigenin-dUPT k 3'-OH konci nově štěpené DNA (TUNEL barvení). Digitální zpracování obrazů neuronů barvených TUNEL technikou ve více než 15 náhodně vybraných mikroskopických polích se analyzovalo na počet technikou TUNEL barvených jader/celkovému počtu neuronů zjištěných na 50 mikroskopických polích pomocí počítačové morfometrie (MCID, Imaging Research, St. Catherine, Ontario, Kanada).

Data byla vyjádřena v % jader neuronů pozitivních v barvení TUNEL + SEM a jsou ukázána na obrázku 13. Testy statistické průkaznosti mezi kontrolou a experimentálním léčením byly provedeny metodou ANOVA nebo párovými t-testy, s průkaznosti p< 0.05. Kvantifikace těchto kultur potvrdila, že kondiciované medium z HlV-infikovaných a aktivovaných monocytů indukovalo smrt buněk neuronů v rozsahu 25% z celkové populace cerebrálních korových neuronů. rPH.2 byl schopen redukovat tuto toxicitu na méně než 5 % z celkového počtu neuronů. rPH.2 sám o sobě nebyl neurotoxický, protože v koncentraci 50 gg/ml rPH.2 neměl ve srovnání s kulturou ošetřenou pomocí kontrolního media žádný vliv na smrt neuronových buněk . Tyto výsledky jasně prokázaly, že hlavní složkou vyvolávající neurotoxicitu při aplikaci kondiciovaného media z buněk HIV-1 infikovaných aktivovaných monocytů, musí být PAF, protože neurotoxicita může být téměř zcela potlačena společnou inkubací s produktem PAF-AH, což je enzym zodpovědný za metabolismus PAF v centrálním nervovém systému. Tato zjištění nastiňují možné terapeutické použití při léčení neurologických onemocnění CNS, která jsou spojena s infekcí HIV-1.

Příklad 21

Téměř 4 procenta japonské populace má nízkou či až nedekovatelnou hladinu aktivity PAF-AH v plazmě. Tato deficience je v korelaci s těžkými respirčními symptomy u dětí trpících astmatem

Miwa a další (J.Clin.Invest,82:1983-1991(1988)) , poukázali na to, že tyto stavy mohou být způsobeny deficiencí děděnou autosomálním recesivním způsobem.

K určení skutečnosti, zda tato deficience pochází z inaktivního, ale přítomného enzymu, či je způsobena nemožností syntézy PAF-AH, byla shromažďována plazma od mnoha pacientů deficientních na aktivitu PAF-AH (pomocí metody popsané v Příkladu 10 pro transfektanty) a dále byla testována přítomnost PAF-AH pomocí monoklonálních protilátek 90G11D (Příklad 13) pomocí ELISA metody popsané dále: Mikrotitrační desky Immunolon 4 s plochým dnem (Dynatech, Chantilly, VA) byly potaženy monoklonální protilátkou 90G11D v koncentraci 100ng/jamku a ponechány inkubovat do rána.

Potom byly jamky blokovány 1 hodinu při pokojové teplotě 0.5% želatinou z rybí kůže(Sigma) naředěné v CMF-PBS. Dále byly jamky čtyřikrát promyty. Plazma získaná od pacientů byla naředěna v PBS obsahujícím 15 mM CHAPS a byla přidána do každé jamky na destičce (50 μΙ/jamka) . Destičky se inkubovaly 1 hodinu při pokojové teplotě a potom byly čtyřikrát promyty. Následovalo přidání 50μ1 monoklonální protilátky 90F2D v koncentraci 5μg/ml, která byla biotinylovaná standardní metodou a naředěna v PBST do každé jamky. Deska se inkubovala 1 hodinu při pokojové teplotě a po té byla třikrát promyta. Následovalo přidání 50 μΐ Extra Avidinu (Sigma) naředěného 1 :1000 v CMT-PBST do každé jamky a deska se opět nechala inkubovat 1 hodinu při pokojové teplotě. Potom následovalo vyvolání aktivity.

Byly nalezeny přímé korelace mezi PAF-AH aktivitou a koncentrací enzymu. Nebyla-li v séru pacienta neměřena aktivita, bylo to vždy doprovázeno nemožností detekovat přítomnost enzymu. Podobně, vzorky plazmy vykazující poloviční hodnotu normální aktivity, obsahovaly polovinu normální hladiny PAF-AH. Tato zjištění potvrzují, že deficience aktivity PAF-AH je způsobena nemožností syntetizovat enzym nebo je způsobena tím, že moklonální protilátky nerozpoznávají inaktivní formu enzymu.

Byly navrženy další pokusy, které měly umožnit rozhodnutí, zda deficience je způsobena genetickou poruchou v genu pro lidský plazmatický PAF-AH. Byla izolována genomová DNA z PAF-AH deficientních jedinců a použita jako templát pro PCR reakce

0

0 0 0

0 s primery specifickými pro PAF-AH gen. Každá z kódujících sekvencí exonů byla nejprve amplifikována a sekvenována z jednoho jedince.

V exonu 9 byla nalezena záměna jednoho nukleotidu ( a to G za T v pozici 996 podle Sekvence id. Č.:7). Nukleotidová záměna vyústila v aminokyselinovou substituci fenylalaninu za valin v pozici 279 sekvence PAF-AH (V279F). Exon 9 byl amplifikován z genomové DNA ještě dalších 11 PAF-AH deficientních pacientů, u kterých byla nalezena stejná bodová mutace.

K určení, zda tato mutace pozmění enzym, byl v E.coli exprimován konstrukt s touto mutací nevykazující žádnou PAF-AH aktivitu, zatímco kontrolní konstrukt, který neobsahoval mutaci, byl plně aktivní. Záměna této aminokyseliny vede pravděpodobně ke strukturální modifikaci, která způsobuje pozorovanou deficienci aktivity a také neschopnost imunoreaktivity s PAF-AH protilátkami generovanými dle vynálezu.

PAF-AH specifické protilátky podle vynálezu tak mohou být použity v diagnostických metodách k detekci abnormálních hladin PAFAH v séru (normální koncentrace jsou mezi 1 až 5 U/ml) a ke sledování patologických podmínek spojených s PAF-AH. Co více, určení genetického poškození v PAF-AH genu umožňuje genetický výzkum zabývající se deficienci PAF-AH u japonských pacientů. Mutace způsobuje zisk restrikčního endonukleázového místa (Maell) a tak umožňuje aplikace jednoduché metody , analýzy - Restrition Fragment Length Polymorphism (RFLP), která je schopná rozlišit mezi normálními a mutantními alelami. (informaci o této aplikaci lze získat : Lewin, strana 136 až 141 v Genes V, Oxford University Press, New York, New York (1994)).

Pomocí metody štěpení DNA enzymem Mae II,byl proveden výzkum genomové DNA od 12 pacientů deficientních v PAF-AH, následoval Southern blot a hybridizace se sondou komplementární s exonem 9 (nukleotidy 1 až 396, podle Skvence id.č.: 17). U všech pacientů bylo nalezeno, že mají RFLP shodné s mutantními alelami.

• · • · · · • ·

Ačkoli je vynález popsán pomocí termínů specifických pro dané provedení, samozřejmě se však rozumí, že se mohou vyskytnout různé varianty a modifikace, které jsou jasné odborníkům v daném oboru. Proto tedy, na vynález mohou být kladena jen taková omezení, která se objevují v připojených patentových nárocích.

• · · · · • · · · · ·

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Žadatel: ICOS CORPORATION (ii) Název vynálezu: Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase (iii) Počet sekvencí: 30 (iv) Korespondenční adresa:

(A) Adresa: Marshall, 0’Toole, Gerstein, Murray & Borun (B) Ulice: 6300 Sears Tower, 233 South Wacker Drive (C) Město: Chicago (D) Stát: Illinois (E) Země: United States of America (F) PSČ (ZIP): 60606-6402 (v) Forma vhodná pro počítačové zpracování:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC compatible (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) Současné údaje o žádosti:

(A) Číslo žádosti:

(B) Datum registrace:

(C) Klasifikace:

(viii) Informace o právním zástupci/agentovi:

(A) Jméno: Rin-Laures, Li-Hsien (B) Registrační číslo: 33,547 (C) Reference/počet soudních případů: 27866/34026 (ix) Telekomunikační informace:

(A)	Telefon:	(312) 474-6300
(B)	Fax: (312	) 474-0448
(C)	Telex: 25	-3658
(2) INFORMACE	0 SEQ ID	NO:1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:

Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu lle Ala 15 10 15

Phe * · • · · · (2) INFORMACE O SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

Ile Gin Val Leu Met Ala Ala Ala Ser Phe Gly Gin Thr Lys Ile Pro 15 10 15 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

Met Lys Pro Leu Val Val Phe Val Leu Gly Gly 15 10 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Upraveno-místo (B) UMÍSTĚNÍ: skupina(13, 21, 27) (C) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka = Nukleotid na každé z těchto pozic je inosin (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

ACATGAATTC GGNATCYTTG NGTYTGNCCR AA 32 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA » « • · • <

• * · • · · (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

TATTTCTAGA AGTGTGGTGG AACTCGCTGG 30 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

CGATGAATTC AGCTTGCAGC AGCCATCAGT AC 32 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1520 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 162..1484 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

GCTGGTCGGA GGCTCGCAGT GCTGTCGGCG AGAAGCAGTC GGGTTTGGAG CGCTTGGGTC 60

GCGTTGGTGC GCGGTGGAAC GCGCCCAGGG ACCCCAGTTC CCGCGAGCAG CTCCGCGCCG 120

CGCCTGAGAG ACTAAGCTGA AACTGCTGCT CAGCTCCCAA G ATG GTG CCA CCC 173

Met Val Pro Pro

AAA TTG CAT GTG CTT TTC TGC CTC TGC GGC TGC CTG GCT GTG GTT TAT 221

Lys Leu His Val Leu Phe Cys Leu Cys Gly Cys Leu Ala Val Val Tyr

10 15 20

CCT TTT GAC TGG CAA TAC ATA AAT CCT GTT GCC CAT ATG AAA TCA TCA 269

Pro Phe Asp Trp Gin Tyr Ile Asn Pro Val Ala His Met Lys Ser Ser

30 35

GCA TGG GTC AAC AAA ATA CAA GTA CTG ATG GCT GCT GCA AGC TTT GGC 317

Ala Trp Val Asn Lys Ile Gin Val Leu Met Ala Ala Ala Ser Phe Gly

45 50

CAA ACT AAA ATC CCC CGG GGA AAT GGG CCT TAT TCC GTT GGT TGT ACA 365

Gin Thr Lys Ile Pro Arg Gly Asn Gly Pro Tyr Ser Val Gly Cys Thr

60 65

GAC Asp

TTA Leu 70

ATG TTT

GAT Asp

CAC His

ACT AAT AAG

GGC ACC TTC TTG CGT

TTA Leu

TAT Tyr

413

Met

Phe

Thr 75

Asn

Lys

Gly

Thr

Phe 80

Leu

Arg

TAT

CCA

TCC

CAA

GAT

AAT

GAT

CGC

CTT

GAC

ACC

CTT

TGG

ATC

CCA

AAT

461

Tyr 85

Pro

Ser

Gin

Asp

Asn 90

Asp

Arg

Leu

Asp

Thr 95

Leu

Trp

Ile

Pro

Asn 100

AAA

GAA

TAT

TTT

TGG

GGT

CTT

AGC

AAA

TTT

CTT

GGA

ACA

CAC

TGG

CTT

509

Lys

Glu

Tyr

Phe

Trp 105

Gly

Leu

Ser

Lys

Phe 110

Leu

Gly

Thr

His

Trp 115

Leu

ATG

GGC

AAC

ATT

TTG

AGG

TTA

CTC

TTT

GGT

TCA

ATG

ACA

ACT

CCT

GCA

557

Met

Gly

Asn

Ile 120

Leu

Arg

Leu

Leu

Phe 125

Gly

Ser

Met

Thr

Thr 130

Pro

Ala

AAC

TGG

AAT

TCC

CCT

CTG

AGG

CCT

GGT

GAA

AAA

TAT

CCA

CTT

GTT

GTT

605

Asn

Trp

Asn 135

Ser

Pro

Leu

Arg

Pro 140

Gly

Glu

Lys

Tyr

Pro 145

Leu

Val

Val

TTT

TCT

CAT

GGT

CTT

GGG

GCA

TTC

AGG

ACA

CTT

TAT

TCT

GCT

ATT

GGC

653

Phe

Ser 150

His

Gly

Leu

Gly

Ala 155

Phe

Arg

Thr

Leu

Tyr 160

Ser

Ala

Ile

Gly

ATT

GAC

CTG

GCA

TCT

CAT

GGG

TTT

ATA

GTT

GCT

GCT

GTA

GAA

CAC

AGA

701

Ile 165

Asp

Leu

Ala

Ser

His 170

Gly

Phe

Ile

Val

Ala 175

Ala

Val

Glu

His

Arg 180

GAT

AGA

TCT

GCA

TCT

GCA

ACT

TAC

TAT

TTC

AAG

GAC

CAA

TCT

GCT

GCA

749

Asp

Arg

Ser

Ala

Ser 185

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Phe 190

Lys

Asp

Gin

Ser

Ala 195

Ala

GAA

ATA

GGG

GAC

AAG

TCT

TGG

CTC

TAC

CTT

AGA

ACC

CTG

AAA

CAA

GAG

797

Glu

Ile

Gly

Asp 200

Lys

Ser

Trp

Leu

Tyr 205

Leu

Arg

Thr

Leu

Lys 210

Gin

Glu

GAG

GAG

ACA

CAT

ATA

CGA

AAT

GAG

CAG

GTA

CGG

CAA

AGA

GCA

AAA

GAA

845

Glu

Glu

Thr 215

His

Ile

Arg

Asn

Glu 220

Gin

Val

Arg

Gin

Arg 225

Ala

Lys

Glu

TGT

TCC

CAA

GCT

CTC

AGT

CTG

ATT

CTT

GAC

ATT

GAT

CAT

GGA

AAG

CCA

893

Cys

Ser 230

Gin

Tkla

Leu

Ser

Leu 235

Ile

Leu

Asp

Ile

Asp 240

His

Gly

Lys

Pro

GTG

AAG

AAT

GCA

TTA

GAT

TTA

AAG

TTT

GAT

ATG

GAA

CAA

CTG

AAG

GAC

941

Val 245

Lys

Asn

Ala

Leu

Asp 250

Leu

Lys

Phe

Asp

Met 255

Glu

Gin

Leu

Lys

Asp 260

TCT

ATT

GAT

AGG

GAA

AAA

ATA

GCA

GTA

ATT

GGA

CAT

TCT

TTT

GGT

GGA

989

Ser

Ile

Asp

Arg

Glu 265

Lys

Ile

Ala

Val

Ile 270

Gly

His

Ser

Phe

Gly 275

Gly

GCA

ACG

GTT

ATT

CAG

ACT

CTT

AGT

GAA

GAT

CAG

AGA

TTC

AGA

TGT

GGT

1037

Ala

Thr

Val

Ile 280

Gin

Thr

Leu

Ser

Glu 285

Asp

Gin

Arg

Phe

Arg 290

Cys

Gly

ATT

GCC

CTG

GAT

GCA

TGG

ATG

TTT

CCA

CTG

GGT

GAT

GAA

GTA

TAT

TCC

1085

Ile

Ala

Leu 295

Asp

Ala

Trp

Met

Phe 300

Pro

Leu

Gly

Asp

Glu 305

Val

Tyr

Ser

AGA

ATT

CCT

CAG

CCC

CTC

TTT

TTT

ATC

AAC

TCT

GAA

TAT

TTC

CAA

TAT

1133

100 • · • · ···· ·· ·· ··

Arg

lle 310

Pro

Gin

Pro

Leu

Phe 315

Phe

lle

Asn

Ser

Glu 320

Tyr

Phe

Gin

Tyr

CCT

GCT

AAT

ATC

ATA

AAA

ATG

AAA

AAA

TGC

TAC

TCA

CCT

GAT

AAA

GAA

1181

Pro

Ala

Asn

lle

lle

Lys

Met

Lys

Lys

Cys

Tyr

Ser

Pro

Asp

Lys

Glu

325

330

335

340

AGA

AAG

ATG

ATT

ACA

ATC

AGG

GGT

TCA

GTC

CAC

CAG

AAT

TTT

GCT

GAC

1229

Arg

Lys

Met

lle

Thr

lle

Arg

Gly

Ser

Val

His

Gin

Asn

Phe

Alá

Asp

345

350

355

TTC

ACT

TTT

GCA

ACT

GGC

AAA

ATA

ATT

GGA

CAC

ATG

CTC

AAA

TTA

AAG

1277

Phe

Thr

Phe

Ala

Thr

Gly

Lys

lle

lle

Gly

His

Met

Leu

Lys

Leu

Lys

360

365

370

GGA

GAC

ATA

GAT

TCA

AAT

GTA

GCT

ATT

GAT

CTT

AGC

AAC

AAA

GCT

TCA

1325

Gly

Asp

lle

Asp

Ser

Asn

Val

Ala

lle

Asp

Leu

Ser

Asn

Lys

Ala

Ser

375

380

385

TTA

GCA

TTC

TTA

CAA

AAG

CAT

TTA

GGA

CTT

CAT

AAA

GAT

TTT

GAT

CAG

1373

Leu

Ala

Phe

Leu

Gin

Lys

His

Leu

Gly

Leu

His

Lys

Asp

Phe

Asp

Gin

390

395

400

TGG

GAC

TGC

TTG

ATT

GAA

GGA

GAT

GAT

GAG

AAT

CTT

ATT

CCA

GGG

ACC

1421

Trp

Asp

Cys

Leu

lle

Glu

Gly

Asp

Asp

Glu

Asn

Leu

lle

Pro

Gly

Thr

405

410

415

420

AAC

ATT

AAC

ACA

ACC

AAT

CAA

CAC

ATC

ATG

TTA

CAG

AAC

TCT

TCA

GGA

1469

Asn

lle

Asn

Thr

Thr

Asn

Gin

His

lle

Met

Leu

Gin

Asn

Ser

Ser

Gly

425

430

435

ΑΤΑ GAG AAA TAC ΑΑΤ TAGGATTAAA ATAGGTTTTT TAAAAAAAAA AAAAAA 1520 lle Glu Lys Tyr Asn

440 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 441 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

Met Val Pro Pro Lys Leu His Val 1 5

Ala Val Val Tyr Pro Phe Asp Trp 20

Met Lys Ser Ser Ala Trp Val Asn 35 40

Ala Ser Phe Gly Gin Thr Lys lle 50 55

Val Gly Cys Thr Asp Leu Met Phe 65 70

Leu Phe Cys Leu Cys Gly Cys Leu 10 15

Gin Tyr lle Asn Pro Val Ala His 25 30

Lys lle Gin Val Leu Met Ala Ala 45

Pro Arg Gly Asn Gly Pro Tyr Ser 60

Asp His Thr Asn Lys Gly Thr Phe

80

101

Leu

Arg

Leu

Tyr

Tyr 85

Pro

Ser

Gin

Asp

Asn 90

Asp

Arg

Leu

Asp

Thr 95

Leu

Trp

lle

Pro

Asn 100

Lys

Glu

Tyr

Phe

Trp 105

Gly

Leu

Ser

Lys

Phe 110

Leu

Gly

Thr

His

Trp 115

Leu

Met

Gly

Asn

lle 120

Leu

Arg

Leu

Leu

Phe 125

Gly

Ser

Met

Thr

Thr 130

Pro

Ala

Asn

Trp

Asn 135

Ser

Pro

Leu

Arg

Pro 140

Gly

Glu

Lys

Tyr

Pro 145

Leu

Val

Val

Phe

Ser 150

His

Gly

Leu

Gly

Ala 155

Phe

Arg

Thr

Leu

Tyr 160

Ser

Ala

lle

Gly

lle 165

Asp

Leu

Ala

Ser

His 170

Gly

Phe

lle

Val

Ala 175

Ala

Val

Glu

His

Arg 180

Asp

Arg

Ser

Ala

Ser 185

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Phe 190

Lys

Asp

Gin

Ser

Ala 195

Ala

Glu

lle

Gly

Asp 200

Lys

Ser

Trp

Leu

Tyr 205

Leu

Arg

Thr

Leu

Lys 210

Gin

Glu

Glu

Glu

Thr 215

His

lle

Arg

Asn

Glu 220

Gin

Val

Arg

Gin

Arg 225

Ala

Lys

Glu

Cys

Ser 230

Gin

Ala

Leu

Ser

Leu 235

lle

Leu

Asp

lle

Asp 240

His

Gly

Lys

Pro

Val 245

Lys

Asn

Ala

Leu

Asp 250

Leu

Lys

Phe

Asp

Met 255

Glu

Gin

Leu

Lys

Asp 260

Ser

lle

Asp

Arg

Glu 265

Lys

lle

Ala

Val

lle 270

Gly

His

Ser

Phe

Gly 275

Gly

Ala

Thr

Val

lle 280

Gin

Thr

Leu

Ser

Glu 285

Asp

Gin

Arg

Phe

Arg 290

Cys

Gly

lle

Ala

Leu 295

Asp

Ala

Trp

Met

Phe 300

Pro

Leu

Gly

Asp

Glu 305

Val

Tyr

Ser

Arg

lle 310

Pro

Gin

Pro

Leu

Phe 315

Phe

lle

Asn

Ser

Glu 320

Tyr

Phe

Gin

Tyr

Pro 325

Ala

Asn

lle

lle

Lys 330

Met

Lys

Lys

Cys

Tyr 335

Ser

Pro

Asp

Lys

Glu 340

Arg

Lys

Met

lle

Thr 345

lle

Arg

Gly

Ser

Val 350

His

Gin

Asn

Phe

Ala 355

Asp

Phe

Thr

Phe

Ala 360

Thr

Gly

Lys

lle

lle 365

Gly

His

Met

Leu

Lys 370

Leu

Lys

Gly

Asp

lle 375

Asp

Ser

Asn

Val

Ala 380

lle

Asp

Leu

Ser

Asn

Lys

Ala

Ser

Leu

Ala

Phe

Leu

Gin

Lys

His

Leu

Gly

Leu

His

Lys

385

390

395

400

102 • ·

Asp

Phe

Asp

Gin

Trp 405

Asp

Cys

Leu

Ile

Glu 410

Gly

Asp Asp

Glu

lle

Pro

Gly

Thr 420

Asn

lle

Asn

Thr

Thr 425

Asn

Gin

His lle

Met 430

Asn

Ser

Ser 435

Gly

lle

Glu

Lys

Tyr 440

Asn

(2)

INFORMACE 0

SEQ

ID ’

NO: 9

Asn Leu 415

Leu Gin (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1123 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ: Nestanoveno (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:

AAATATAAAT	TTTAATAACA	CCACACATAA	ATTTCAAACT	ACTTTCCCTA	AGTTTCTAGC	60
TGAAGTTTTA	AATGAGTGTG	TTTTTAATTT	ATTAGAAAGT	GGATTGAAGA	GAAAACATTG	120
GAAGATGAAG	GAAGGCGTTT	CAGTTAAACC	CCAAATAACT	CTGTGTTACA	CTGAGCTATG	180
AAACGGCTCC	TTCTAGCTCC	ATTTCTCCTC	AGACCTAAGT	GCTATTCCTG	ATTGTCCTTC	240
ATTGTCATTT	CCAGGGAGAA	ATGACACCAG	CACAGTGGCA	GGCCTTCCAA	TCTGGAGCAC	300
GGTCCACACA	ACTTCCGAAT	TGGTGTTCAG	TGTAAAGTGT	ATCGGAGTGC	GGAAAATGCG	360
CAGGGCATTG	CCAACTATAG	ATGCTCGGAG	TAATTCAGTG	TATTCAGAGA	ACACGGTGAA	420
ACAAGGAAAA	CCGGCCTGAC	TGGGGGGTGA	ATTCAGCAGG	GAGTAAATCT	GATCGGCATC	480
AGGTCTGCGG	AAAGGAGCTG	GTGAGCACGA	CACCACCAGG	CATTGCCTGG	CTCTCTCCGC	540
GGCGGGCTAA	GTTAACCTCG	GGTCCAGGTG	CGGGCCATGG	TCTTGGGGAG	GGTGCTGGGT	600
GCGCTCGAGC	AGGCTACGTC	GGGAGCCGCC	GCTGCTAGTG	AGAGCCGGGC	CACACACGCT	660
CCTCCCCGGT	ACCTCCTCCA	GCATCACCAG	GGGAGGAGAG	GGTCGGGCAC	AAGGCGCGCT	720
AGGCGGACCC	AGACACAGCC	GCGCGCAGCC	CACCCGCCCG	CCGCCTGCCA	GAGCTGCTCG	780
GCCCGCAGCC	AGGGGGACAG	CGGCTGGTCG	GAGGCTCGCA	GTGCTGTCGG	CGAGAAGCAG	840
TCGGGTTTGG	AGCGCTTGGG	TCGCGTTGGT	GCGCGGTGGA	ACCCCCCAGG	GACCCCAGTT	900
CCCGCGAGCA	GCTCCGCGCC	GCGCCTGAGT	GAGGAGGGGC	CCCGGGGGCG	AGGCGGGAGT	960
GGGAGGAAGG	GCACGGTCGC	CGCGCTGGAG	GTCGGGACCC	CGGAGCGGCG	ACCGGCCGGG	1020
GTGGGCTCGC	TGAGTCGCAC	CCGCTCTGCT	GGCCGGTCCT	GGGCTCACAG	TCCCTGCAGC	1080

103 • · • · « · · · ···· · · ··

CCTCGGAAAC agcgctagga tccttcggga GAGGAGAGAT GAC 1123 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 417 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ: 145..287 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:10:

GTACCAATCT	AAAACCCAGC	ACAGAAAAAT	ACATGTTTTA	TTTTTTCCAA	GTGTTACTAG	60
TACCTCAGCC	TTTCTTGATT	TGTCAGCTTA	TTTAAGGCCT	CTTCATTGCA	TACTTCTTTT	120
TTCTTTTAAT	CATCTGCTTC	GAAGGAGACT	AAGCTGAAAC	TGCTGCTCAG	CTCCCAAGAT	180
GGTGCCACCC	AAATTGCATG	TGCTTTTCTG	CCTCTGCGGC	TGCCTGGCTG	TGGTTTATCC	240
TTTTGACTGG	CAATACATAA	ATCCTGTTGC	CCATATGAAA	TCATCAGGTA	AGAGGTGTAT	300
TTGTTCAAGG	TCTTGAGCAA	CTGATCTGTC	GCCATACTTC	AAGTGGGCCC	CAAGAAGTTG	360
CACATCTGCA	CATCTAAACA	AGTCCTATTT	AAAGGCTTAT	GGAGATCCTG	TATTCTC	417

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 498 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ: 251..372 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:

CATTAGGAGG	TAACAGTCCA	AGGCAGCTGA	GAGAAAGGCT	ATGTCTACTT	TCATCTCTTT	60
ACCCTCCAAA	ACCCCTACAC	AGTGTTTCAA	ACAGAGAGAC	CCTCAATAAT	TGCATATCTT	120
ACTTGTTAGG	TTGAGAAAGA	AAGAAGGCCA	GAAACTATGG	GAAGTAACTT	GATTCCGTTG	180
GAATTCTTTT	GCATAATAAA	ATCTGATATG	TAATGGATGA	CAAATGAGAT	AATATTTACC	240
TGTTTTTCAG	CATGGGTCAA	CAAAATACAA	GTACTGATGG	CTGCTGCAAC	GTTTGGCCAA	300

104 « · • · · ·

ACTAAAATCC	CCCGGGGAAA	TGGGCCTTAT	TCCGTTGGTT	GTACAGACTT	AATGTTTGAT	360
CACACTAATA	AGGTAATGCT	TTGATTTATA	CAACTTATCC	TGATACTCTA	ATATTGTCTG	420
TCGCTATGGA	CCACTAGAAG	GTGTTCAAAT	GTGACCTTGC	CCTCACCTGA	GAATGACTCA	480
TTTTCGAATT	TGTATTGT					498

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 433 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ: 130..274 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:12:

CAGCAGCCTA	AAGTCTTAGA	CTTTGTGAAC	ACAGAGGTAT	TGAGTCCCAC	TAATTAATAT	60
CGAAAATAGC	TGCTGGAATA	TGTTTGAGAC	ACAACTTCTC	TAAAAGTGCA	TTAATTTCTT	120
TCTTAACAGG	GCACCTTCTT	GCGTTTATAT	TATCCATCCC	AAGATAATGA	TCACCTTGAC	180
ACCCTTTGGA	TCCCAAATAA	AGAATATTTT	TGGGGTCTTA	GCAAATTTCT	TGGAACACAC	240
TGGCTTATGG	GCAACATTTT	GAGGTTACTC	TTTGGTAAGA	TTTCTGTTGA	TCCTTCTTTG	300
TAGGCTCTTG	CATGTATGAA	AACCTTGAAA	ACAACAAGAA	CTTCAAGTAG	TTAAGACCAA	360
AGTAGATTTT	TCTTCAGTCC	AAATAGCTCC	TAAAATGATA	AGGAAAGTAT	TTCTTTAAAG	420
CCCAGGCAAC	TAC					433

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 486 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ: 164..257 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:13:

TTGGTGGGTA TCTAGTAGCA GTCTTTTTAA TGAATCTACT ATTCATCCAT AAAAAAGTAG 60

ATATAAATCA GATGGGTCTG CATTTTATGC TAATGAGATA TGAATTAAAT TCACTAGCAA 120

105 • · • » to ·

CACTCAGAGA	AAACCTTAAC	TATAACCTTC	CATTGTTGTC	TAGGTTCAAT	GACAACTCCT	180
GCAAACTGGA	ATTCCCCTCT	GAGGCCTGGT	GAAAAATATC	CACTTGTTGT	TTTTTCTCAT	240
GGTCTTGGGG	CATTCAGGTA	ATGTTTGAGA	GGTTGAACAA	TTTTGGCTTC	CAGGAATAAA	300
TGACAATTTT	TTTATTCAAG	AAAGAAATAG	CAGAGTTTGG	AATGTCATGC	AGGCCCTTGT	360
CTGGAGGAGT	TGGGGTTCCT	CAATAATTGG	CTGTGGGTCT	ATTGATCAGT	CCTAGACCTG	420
TCTGGTCAAG	TAGTTTTTTC	CCTACTATCA	GCTCATTGGG	ATTAGCCTCA	CAGCAGAGAA	480
GAAAGG						486

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 363 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (ix) -VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ: 113..181 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:14:

CCCCAGGCTC	TACTACAGGG	TGTAATGGCC	TCCATGTTCC	CAGTTTTATT	AGTGACTCAG	60
CCTTGTAATT	CATGACTGGT	AGTTGTAATT	CTTCCCTCTT	TTTGTTTTGA	AGGACACTTT	120
ATTCTGCTAT	TGGCATTGAC	CTGGCATCTC	ATGGGTTTAT	AGTTGCTGCT	GTAGAACACA	180
GGTATGTTAC	CTGATATAAT	TGGGCTCTTT	GGCCAACTAC	AGGGAATGTC	AATGCTCATA	240
ACTATGTTTC	TAATTTTCAT	AAAAGTTTAT	TTAAAATGTT	GATGGAACTT	TCAAGTATGG	300
TAACATCATG	AGCAAAAAAG	GAGATTGAGT	TTTATCGACT	TAAAAGACTT	AAAAGCACCT	360
AAC						363

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 441 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ: 68..191

106 • · • · · · · • · · · · · (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:15:

GAACTGAGAA	ACATGGTCAG	ATGAGGAAGG	GAAGGAGCAT	GCATAAATAA	TTTTGCTTGT	60
ATTATAGAGA	TAGATCTGCA	TCTGCAACTT	ACTATTTCAA	GGACCAATCT	GCTGCAGAAA	120
TAGGGGACAA	GTCTTGGCTC	TACCTTAGAA	CCCTGAAACA	AGAGGAGGAG	ACACATATAC	180
GAAATGAGCA	GGTACATTGC	AGTGAAAGGA	GAGGTGGTTG	GTGACCTAAA	AGCATGTACA	240
AAAGGATGAC	ATTTGTTAAT	TTAATTTTAC	ACCTGGCAAG	TTATGCTCCT	AGCTCTCCTA	300
TTTCCCATTC	CCAAAAGATC	TGTCAATAGA	TTCCTGGAGC	AGTAAAATTC	CCTTAATGGA	360
ATATCTAGTT	CATAGTAAAA	ACAAAGGCAA	ATACAAAAAT	TTGGGAGATG	ACAGTGAATA	420
TTCAGAATTC	CTCGAGCCGG	G				441

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 577 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ: 245..358 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:16:

GGTTAAGTAA	ATCGTCTGAA	GTCACATAGT	AGGTAAGGCA	AAACAGAGCC	AGGATTTGGA	60
CTAAGGCTAT	ACCTATGTGC	AAAGCTGGGG	CCTGTGTCAT	TATGGTAGCA	AGTAATAGTC	120
ACTAATCAGA	TTTCCAGTTT	ATAACTGACC	AACGATTTTT	CCCAAATACA	GCTTCTACCT	180
AAACTTTAAA	ATAAGTGTTA	TAACTTTTTA	CTTTGTCATT	TCCTTCTTCT	AATAATTATA	240
TTAGGTACGG	CAAAGAGCAA	AAGAATGTTC	CCAAGCTCTC	AGTCTGATTC	TTGACATTGA	300
TCATGGAAAG	CCAGTGAAGA	ATGCATTAGA	TTTAAAGTTT	GATATGGAAC	AACTGAAGGT	360
AAGCTATAAA	AAGTAATTTT	TCTCTTGTCC	TACAGTTCTT	TATTGTTTTT	TGTCATTTAA	420
TTTTCTGCCT	ATATTGCAAG	GTACAATATG	ATAAAGGGCT	GCAACCAGCC	CCTCCCCAAT	480
GCGCACACAC	AGACACACAA	AGCAGTACAG	GTAAAGTATT	GCAGCAATGA	AGAATGCATT	540
ATCTTGGACT	AGATATGAAT	GCAAAGTTAG	TCAGTTT			577

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 396 párů bází

107 • « • · • · • · (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ: 108..199 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:17:

ATCAATGTAT	TTACCATCCC	CATGAAATGA	ACAATTATAT	GATTGACAAA	TCATTTCTTC	60
TAACACCACG	AAATAGCTAT	AAATTTATAT	CATGCTTTTT	CAAATAGGAC	TCTATTGATA	120
GGGAAAAAAT	AGCAGTAATT	GGACATTCTT	TTGGTGGAGC	AACGGTTATT	CAGACTCTTA	180
GTGAAGATCA	GAGATTCAGG	TAAGAAAATA	AGATAGTAAA	GCAAGAGAAT	AGTAAATTAT	240
TGGAAGAAAT	TATATTGTGA	GATATAATTT	TTATTCAAAT	TCTTAGTGAA	GGAAGGGGAT	300
CTCTTGGAGT	TTATAAGGCT	ATTCTTTTGC	CCCCATAAAA	TACTCTATAT	ACATTTTCCT	360
AGGCTAAAAC	ATCTCCTCTC	CTGCTATTAA	AATCTC			396

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 519 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ: 181..351 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:18:

CTTACAAAGT	TAATCATATC	CCTTTCCCAC	ATTGAAGTAT	GATACCTCTT	TATTCCAATC	60
AGATAACCCA	TAATAAACTG	GTATGGTGCG	TGTCCACCAA	TCCTAGCATT	ATTAGGATGT	120
CCTCAATGTT	GGCTAGTATG	TAACCAGTTT	AATTTCATCA	TTGTCAACAA	ATATCTACAG	180
ATGTGGTATT	GCCCTGGATG	CATGGATGTT	TCCACTGGGT	GATGAAGTAT	ATTCCAGAAT	240
TCCTCAGCCC	CTCTTTTTTA	TCAACTCTGA	ATATTTCCAA	TATCCTGCTA	ATATCATAAA	300
AATGAAAAAA	TGCTACTCAC	CTGATAAAGA	AAGAAAGATG	ATTACAATCA	GGTAAGTATT	360
AGTGACTTAT	TTCATTATGT	GAAACAAACT	TGAAGCTTGG	GTAAATATCA	ATCGATATCA	420
TTTGGTAACT	ATTAAAGAAT	TGCTGAATTG	GTTGTTTAGA	CTTTCAATAA	GGAGAGAATT	480
AGATAATCTC	AGTTTCTAAG	TACATTTAGT	CTACTCTTT			519

108 • · · · • · (2) INFORMACE O SEQ ID NO:19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 569 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ: 156..304 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:19:

TGAAACACAT	CTAAGTAGAT	CAAATTACAA	GTTTTATTTC	TTCTTTGGTT	TTCAGTAAAC	60
AGACCAACAA	GACCAGTACC	TTTCCTTACA	CTCTAACTAA	AAAAATAATA	ATTTTATCAA	120
ACAATGTGAC	TTTTAAATGT	CTTGTTCTCT	TTTAGGGGTT	CAGTCCACCA	GAATTTTGCT	180
GACTTCACTT	TTGCAACTGG	CAAAATAATT	GGACACATGC	TCAAATTAAA	GGGAGACATA	240
GATTCAAATG	TAGCTATTGA	TCTTAGCAAC	AAAGCTTCAT	TAGCATTCTT	ACAAAAGCAT	300
TTAGGTAAGA	AACTATTTTT	TTCATGACCT	AAACCGAGAT	GAATCTCGAG	GACAAAGCTG	360
TCTATCTTAA	TACAGCTTTA	GTACTATTTA	AACTATTTCC	AGTTGGTTTA	CAATGGAACA	420
AAGCAGTATA	TCAATTTGAA	AACAGAAATT	TGAGAAAGTC	aattttgctg	CTTTACATCT	480
CTATATCATA	GAAAGCAAAT	CAACTGTTAA	AGGTAATATT	CTTTGTATGA	GCTAGAGTGA	540
CTCATGTGAG	GATATCGAAC	GACGGTGCT				569

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 469 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ: 137..253 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:20:

GATACAGAGG	CACATCGTCT	CTACCATCCT	AACGGAACTT	GTGTAATTTG	TAAATCTTTA	60
TTGCCACCTA	GGGGCATCCA	AACTGTTTAA	TGCTCTCAAA	AGTTTAATAT	GTTGATTAAC	120
ACTTTATATT	TTATAGGACT	TCATAAAGAT	TTTGATCAGT	GGGACTGCTT	GATTGAAGGA	180
GATGATGAGA	ATCTTATTCC	AGGGACCAAC	ATTAACACAA	CCAATCAACA	CATCATGTTA	240

109 « ·

CAGAACTCTT CAGGAATAGA GAAATACAAT TAGGATTAAA

GTTTCAAAAC TGTCTAAAAT TATGTGTGTG TGTGTGTGTG

AGAGAGAGAG AGAGAGAATT TTAATGTATT TTCCCAAAGG

GCTATACTGT AATCGTGATT GAAGCTTGGA CTAAGAATTT

ATAGGTTTTT	TAAAAGTCTT	300
TGTGTGTGTG	AGAGAGAGAG	360
ACTCATATTT	TAAAATGTAG	420
TTTCCCTTT		469

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1494 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 117..1436 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:

GGCACGAGCT AGGATCTGAC TCGCTCTGGT GGCATTGCTG CGCTCAGGGT TCTGGGTATC 60

CGGGAGTCAG TGCAGTGACC AGAACATCAA ACTGAAGCCA CTGCTCAGCT CCTAAG 116

ATG Met 1

GTA CCA CTC

AAA Lys 5

CTG CAG GCG CTT

TTC TGC

CTC Leu

CTC Leu

TGC TGC

CTC Leu

164

Val

Pro

Leu

Leu

Gin

Ala

Leu

Phe 10

Cys

Cys

Cys 15

CCA

TGG

GTC

CAT

CCT

TTT

CAC

TGG

CAA

GAC

ACA

TCT

TCT

TTT

GAC

TTC

212

Pro

Trp

Val

His 20

Pro

Phe

His

Trp

Gin 25

Asp

Thr

Ser

Ser

Phe 30

Asp

Phe

AGG

CCG

TCA

GTA

ATG

TTT

CAC

AAG

CTC

CAA

TCG

GTG

ATG

TCT

GCT

GCC

260

Arg

Pro

Ser 35

Val

Met

Phe

His

Lys 40

Leu

Gin

Ser

Val

Met 45

Ser

Ala

Ala

GGC

TCT

GGC

CAT

AGT

AAA

ATC

CCC

AAA

GGA

AAT

GGA

TCG

TAC

CCC

GTC

308

Gly

Ser 50

Gly

His

Ser

Lys

Ile 55

Pro

Lys

Gly

Asn

Gly 60

Ser

Tyr

Pro

Val

GGT

TGT

ACA

GAT

CTG

ATG

TTC

GGT

TAT

GGG

AAT

GAG

AGC

GTC

TTC

GTG

356

Gly 65

Cys

Thr

Asp

Leu

Met 70

Phe

Gly

Tyr

Gly

Asn 75

Glu

Ser

Val

Phe

Val 80

CGT

TTG

TAC

TAC

CCA

GCT

CAA

GAT

CAA

GGT

CGC

CTC

GAC

ACT

GTT

TGG

404

Arg

Leu

Tyr

Tyr

Pro 85

Ala

Gin

Asp

Gin

Gly 90

Arg

Leu

Asp

Thr

Val 95

Trp

ATC

CCA

AAC

AAA

GAA

TAT

TTT

TTG

GGT

CTT

AGT

ATA

TTT

CTT

GGA

ACA

452

Ile

Pro

Asn

Lys 100

Glu

Tyr

Phe

Leu

Gly 105

Leu

Ser

Ile

Phe

Leu 110

Gly

Thr

CCC

AGT

ATT

GTA

GGC

AAT

ATT

TTA

CAC

CTC

TTA

TAT

GGT

TCT

CTG

ACA

500

Pro

Ser

Ile

Val

Gly

Asn

Ile

Leu

His

Leu

Leu

Tyr

Gly

Ser

Leu

Thr

115 120 125

110 • · • · · ·

• · · · · ·

• ·

• ·

« · · »

ACT

CCT

GCA

AGC

TGG

AAT

TCT

CCT

TTA

AGG

ACT

GGA

GAA

AAA

TAC

CCG

548

Thr

Pro

Ala

Ser

Trp

Asn

Ser

Pro

Leu

Arg

Thr

Gly

Glu

Lys

Tyr

Pro

130

135

140

CTC

ATT

GTC

TTT

TCT

CAT

GGT

CTC

GGA

GCC

TTC

AGG

ACG

ATT

TAT

TCT

596

Leu

Ile

Val

Phe

Ser

His

Gly

Leu

Gly

Ala

Phe

Arg

Thr

Ile

Tyr

Ser

145

150

155

160

GCT

ATT

GGC

ATT

GGC

TTG

GCA

TCT

AAT

GGG

TTT

ATA

GTG

GCC

ACT

GTC

644

Ala

Ile

Gly

Ile

Gly

Leu

Ala

Ser

Asn

Gly

Phe

Ile

Val

Ala

Thr

Val

165

170

175

GAA

CAC

AGA

GAC

AGA

TCT

GCA

TCG

GCA

ACT

TAC

TTT

TTT

GAA

GAC

CAG

692

Glu

His

Arg

Asp

Arg

Ser

Ala

Ser

Ala

Thr

Tyr

Phe

Phe

Glu

Asp

Gin

180

185

190

GTG

GCT

GCA

AAA

GTG

GAA

AAC

AGG

TCT

TGG

CTT

TAC

CTG

AGA

AAA

GTA

740

Val

Ala

Ala

Lys

Val

Glu

Asn

Arg

Ser

Trp

Leu

Tyr

Leu

Arg

Lys

Val

195

200

205

AAA

CAA

GAG

GAG

TCG

GAA

AGT

GTC

CGG

AAA

GAA

CAG

GTT

CAG

CAA

AGA

788

Lys

Gin

Glu

Glu

Ser

Glu

Ser

Val

Arg

Lys

Glu

Gin

Val

Gin

Gin

Arg

210

215

220

GCA

ATA

GAA

TGT

TCC

CGG

GCT

CTC

AGT

GCG

ATT

CTT

GAC

ATT

GAA

CAT

836

Ala

Ile

Glu

Cys

Ser

Arg

Ala

Leu

Ser

Ala

Ile

Leu

Asp

Ile

Glu

His

225

230

235

240

GGA

GAC

CCA

AAA

GAG

AAT

GTA

CTA

GGT

TCA

GCT

TTT

GAC

ATG

AAA

CAG

884

Gly

Asp

Pro

Lys

Glu

Asn

Val

Leu

Gly

Ser

Ala

Phe

Asp

Met

Lys

Gin

245

250

255

CTG

AAG

GAT

GCT

ATT

GAT

GAG

ACT

AAA

ATA

GCT

TTG

ATG

GGA

CAT

TCT

932

Leu

Lys

Asp

Ala

Ile

Asp

Glu

Thr

Lys

Ile

Ala

Leu

Met

Gly

His

Ser

260

265

270

TTT

GGA

GGA

GCA

ACA

GTT

CTT

CAA

GCC

CTT

AGT

GAG

GAC

CAG

AGA

TTC

980

Phe

Gly

Gly

Ala

Thr

Val

Leu

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Asp

Gin

Arg

Phe

275

280

285

AGA

TGT

GGA

GTT

GCT

CTT

GAT

CCA

TGG

ATG

TAT

CCG

GTG

AAC

GAA

GAG

1028

Arg

Cys

Gly

Val

Ala

Leu

Asp

Pro

Trp

Met

Tyr

Pro

Val

Asn

Glu

Glu

290

295

300

CTG

TAC

TCC

AGA

ACC

CTC

CAG

CCT

CTC

CTC

TTT

ATC

AAC

TCT

GCC

AAA

1076

Leu

Tyr

Ser

Arg

Thr

Leu

Gin

Pro

Leu

Leu

Phe

Ile

Asn

Ser

Ala

Lys

305

310

315

320

TTC

CAG

ACT

CCA

AAG

GAC

ATC

GCA

AAA

ATG

AAA

AAG

TTC

TAC

CAG

CCT

1124

Phe

Gin

Thr

Pro

Lys

Asp

Ile

Ala

Lys

Met

Lys

Lys

Phe

Tyr

Gin

Pro

325

330

335

GAC

AAG

GAA

AGG

AAA

AAT

GAT

TAC

AAT

CAA

GGG

CTC

AGG

CAC

CAG

AAC

1172

Asp

Lys

Glu

Arg

Lys

Asn

Asp

Tyr

Asn

Gin

Gly

Leu

Arg

His

Gin

Asn

340

345

350

TTT

GAC

GAC

TTT

ACT

TTT

GTA

ACT

GGC

AAA

ATA

ATT

GGA

AAC

AAG

CTG

1220

Phe

Asp

Asp

Phe

Thr

Phe

Val

Thr

Gly

Lys

Ile

Ile

Gly

Asn

Lys

Leu

355 360 365

111 • · · ·

ACA Thr

CTG Leu 370

AAA Lys

GGA Gly

GAA Glu

ATC Ile

GAT Asp 375

TCC Ser

AGA GTA GCC ATC

GAC Asp

CTC ACC AAC Leu Thr Asn

Arg

Val Ala

Ile 380

AAA

GCT

TCG

ATG

GCT

TTC

TTA

CAA

AAG

CAT

TTA

GGG

CTT

CAG

AAA

GAC

Lys

Ala

Ser

Met

Ala

Phe

Leu

Gin

Lys

His

Leu

Gly

Leu

Gin

Lys

Asp

385

390

395

400

TTT

GAT

CAG

TGG

GAC

CCT

CTG

GTG

GAA

GGA

GAT

GAT

GAG

AAC

CTG

ATT

Phe

Asp

Gin

Trp

Asp

Pro

Leu

Val

Glu

Gly

Asp

Asp

Glu

Asn

Leu

Ile

405

410

415

CCT

GGG

TCA

CCC

TTT

GAC

GCA

GTC

ACC

CAG

GCC

CCG

GCT

CAG

CAA

CAC

Pro

Gly

Ser

Pro

Phe

Asp

Ala

Val

Thr

Gin

Ala

Pro

Ala

Gin

Gin

His

420

425

430

TCT

CCA

GGA

TCA

CAG

ACC

CAG

AAT

TAGAAGAACT '

rGCTTGTTAC A(

:agt:

rGCC1

Ser

Pro

Gly

Ser

Gin

Thr

Gin

Asn

435

440

TTTAAAAGTA GAGTGACATG AGAGAGAG

1268

1316

1364

1412

1466

1494 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2191 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 92..1423 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:22:

CCGCGCGCTC CGGCCGGGGG ACCCTGGTTC CGGCGAGCGG CTCAGCGCGG CGCCCGGAAG

TTTAAGCTGA AACCACTGCT CAGCTTCCAA G ATG TTG CCA CCC AAA CTG CAT Met Leu Pro Pro Lys Leu His

5

GCG CTT TTC TGC CTC TGC AGC TGC CTC ACA CTG GTT CAT CCT ATT GAC

Ala Leu Phe Cys Leu Cys Ser Cys Leu Thr Leu Val His Pro Ile Asp

15 20

TGG CAA GAC CTA AAT CCT GTT GCC CAT ATT AGA TCA TCA GCA TGG GCC

Trp Gin Asp Leu Asn Pro Val Ala His Ile Arg Ser Ser Ala Trp Ala

30 35

AAT AAA ATA CAA GCT CTG ATG GCT GCT GCA AGT ATT AGG CAA AGT AGA

Asn Lys Ile Gin Ala Leu Met Ala Ala Ala Ser Ile Arg Gin Ser Arg

45 50 55

ATT CCC AAA GGA AAT GGA TCT TAT TCT GTC GGT TGT ACA GAT TTG ATG

Ile Pro Lys Gly Asn Gly Ser Tyr Ser Val Gly Cys Thr Asp Leu Met

65 70

112

160

208

256

304

112 • · • ·

•··· ·· · · · ·

TTT Phe

GAT Asp

TAT ACT AAT AAG

GGC Gly

ACC Thr

TTT TTG CGT TTG TAT TAT

CCA Pro

TCG Ser

352

Tyr Thr Asn 75

Lys

Phe 80

Leu

Arg

Leu

Tyr

Tyr 85

CAA

GAG

GAT

GAC

CAC

TCT

GAC

ACG

CTT

TGG

ATC

CCA

AAC

AAA

GAA

TAT

400

Gin

Glu

Asp

Asp

His

Ser

Asp

Thr

Leu

Trp

Ile

Pro

Asn

Lys

Glu

Tyr

90

95

100

TTT

TTT

GGT

CTT

AGT

AAA

TAT

CTT

GGA

ACA

CCC

TGG

CTT

ATG

GGC

AAA

448

Phe

Phe

Gly

Leu

Ser

Lys

Tyr

Leu

Gly

Thr

Pro

Trp

Leu

Met

Gly

Lys

105

110

115

ATA

TTG

AGC

TTC

TTT

TTT

GGT

TCA

GTG

ACA

ACT

CCT

GCG

AAC

TGG

AAT

496

Ile

Leu

Ser

Phe

Phe

Phe

Gly

Ser

Val

Thr

Thr

Pro

Ala

Asn

Trp

Asn

120

125

130

135

TCC

CCT

CTG

AGG

ACT

GGT

GAA

AAA

TAT

CCA

CTG

ATT

GTT

TTT

TCT

CAT

544

Ser

Pro

Leu

Arg

Thr

Gly

Glu

Lys

Tyr

Pro

Leu

Ile

Val

Phe

Ser

His

140

145

150

GGT

CTT

GGA

GCA

TTC

CGG

ACA

ATT

TAT

TCT

GCT

ATT

GGC

ATT

GAT

CTA

592

Gly

Leu

Gly

Ala

Phe

Arg

Thr

Ile

Tyr

Ser

Ala

Ile

Gly

Ile

Asp

Leu

155

160

165

GCA Ala

TCA CAT

GGG Gly

TTC Phe

ATC GTT Ile Val

GCT Ala 175

GCT ATA GAA

CAC AGA His Arg 180

GAT Asp

GGA Gly

TCC Ser

640

Ser

His 170

Ala

Ile

Glu

GCC

TCT

GCG

ACT

TAC

TAT

TTC

AAG

GAC

CAG

TCT

GCT

GCA

GAA

ATA

GGG

688

Ala

Ser

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Asp

Gin

Ser

Ala

Ala

Glu

Ile

Gly

185

190

195

AAC

AAA

TCT

TGG

TCT

TAT

CTT

CAA

GAA

CTA

AAA

CCA

GGG

GAT

GAG

GAG

736

Asn

Lys

Ser

Trp

Ser

Tyr

Leu

Gin

Glu

Leu

Lys

Pro

Gly

Asp

Glu

Glu

200

205

210

215

ATA

CAT

GTT

CGA

AAT

GAG

CAG

GTA

CAG

AAA

AGG

GCA

AAG

GAG

TGC

TCC

784

Ile

His

Val

Arg

Asn

Glu

Gin

Val

Gin

Lys

Arg

Ala

Lys

Glu

Cys

Ser

220

225

230

CAA

GCT

CTC

AAC

TTG

ATT

CTG

GAC

ATT

GAT

CAT

GGA

AGG

CCA

ATT

AAG

832

Gin

Ala

Leu

Asn

Leu

Ile

Leu

Asp

Ile

Asp

His

Gly

Arg

Pro

Ile

Lys

235

240

245

AAT

GTA

CTA

GAC

TTA

GAG

TTT

GAT

GTG

GAA

CAA

CTG

AAG

GAC

TCT

ATT

880

Asn

Val

Leu

Asp

Leu

Glu

Phe

Asp

Val

Glu

Gin

Leu

Lys

Asp

Ser

Ile

250

255

260

GAC

AGG

GAT

AAA

ATA

GCA

GTA

ATT

GGA

CAT

TCT

TTT

GGT

GGA

GCC

ACA

928

Asp

Arg

Asp

Lys

Ile

Ala

Val

Ile

Gly

His

Ser

Phe

Gly

Gly

Ala

Thr

265

270

275

GTT

CTT

CAG

GCT

CTT

AGT

GAA

GAC

CAG

AGA

TTT

AGG

TGC

GGG

ATT

GCC

976

Val

Leu

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Asp

Gin

Arg

Phe

Arg

Cys

Gly

Ile

Ala

280

285

290

295

TTG

GAT

GCA

TGG

ATG

CTT

CCA

CTG

GAT

GAT

GCA

ATA

TAT

TCC

AGA

ATC

1024

Leu

Asp

Ala

Trp

Met

Leu

Pro

Leu

Asp

Asp

Ala

Ile

Tyr

Ser

Arg

Ile

300

305

310

113 • · · ·

• · · ·

• ·

« ·

• ·

« · · ·

CCT

CAG

CCC

CTC

TTT

TTT

ATT

AAC

TCG

GAA

CGG

TTC

CAA

TTT

CCT

GAG

1072

Pro

Gin

Pro

Leu

Phe

Phe

Ile

Asn

Ser

Glu

Arg

Phe

Gin

Phe

Pro

Glu

315

320

325

AAT

ATC

AAA

AAA

ATG

AAA

AAA

TGC

TAC

TCA

CCT

GAC

AAA

GAA

AGA

AAA

1120

Asn

Ile

Lys

Lys

Met

Lys

Lys

Cys

Tyr

Ser

Pro

Asp

Lys

Glu

Arg

Lys

330

335

340

ATG

ATT

ACA

ATC

AGG

GGT

TCA

GTC

CAT

CAG

AAC

TTT

GCT

GAT

TTC

ACT

1168

Met

Ile

Thr

Ile

Arg

Gly

Ser

Val

His

Gin

Asn

Phe

Ala

Asp

Phe

Thr

345

350

355

TTT

ACA

ACT

GGC

AAA

ATA

GTT

GGA

TAC

ATA

TTC

ACA

TTA

AAA

GGA

GAT

1216

Phe

Thr

Thr

Gly

Lys

Ile

Val

Gly

Tyr

Ile

Phe

Thr

Leu

Lys

Gly

Asp

360

365

370

375

ATA

GAT

TCA

AAT

GTA

GCA

ATT

GAT

CTT

TGC

AAC

AAA

GCT

TCA

TTG

GCA

1264

Ile

Asp

Ser

Asn

Val

Ala

Ile

Asp

Leu

Cys

Asn

Lys

Ala

Ser

Leu

TVla

380

385

390

TTT

TTA

CAA

AAG

CAT

TTA

GGA

CTG

CGG

AAA

GAT

TTT

GAT

CAG

TGG

GAT

1312

Phe

Leu

Gin

Lys

His

Leu

Gly

Leu

Arg

Lys

Asp

Phe

Asp

Gin

Trp

Asp

395

400

405

TCT

TTG

ATT

GAA

GGA

AAA

GAC

GAA

AAT

CTT

ATG

CCA

GGG

ACC

AA.C

ATT

1360

Ser

Leu

Ile

Glu

Gly

Lys

Asp

Glu

Asn

Leu

Met

Pro

Gly

Thr

Asn

Ile

410

415

420

AAC

ATC

ACC

AAC

GAA

CAT

GAC

ACT

CTA

CAG

AAC

TCT

CCA

GAA

GCA

GAG

1408

Asn

Ile

Thr

Asn

Glu

His

Asp

Thr

Leu

Gin

Asn

Ser

Pro

Glu

Ala

Glu

425 430 435

AAA TCG AAT TTA GAT TAAAAGCACT TTTTTAAAGA TCTTGTTTAA AAACTGTCAA 14 63

Lys Ser Asn Leu Asp

440

AAAATGTGTG	TATGACTTTT	AATATATTTT	CTCAAATAAC	TCATATTGGA	AAATGTAGGC	1523
TATCCCATAA	AAGTGATTGA	AGCTTGGACT	AGGAGGTTTT	TTTCTTTAAA	GAAAGATTGG	1583
TGTCTATCGA	AATCATGCCA	GCCTAAATTT	TAATTTTACT	AAAATGATGC	TGTGTCAAAA	1643
TTAATAACTA	CTTTTACATT	CTTTAATGGA	CAAGTATAAC	AGGCACAAGG	CTAATGAAAA	1703
CGTGTTGCAA	TGACATAACA	ATCCCTAAAA	ATACAGATGT	TCTTGCCTCT	TTTTTCTATT	1763
ATAATTGAGT	TTTAGCAACA	TGTTATGCTA	GGTAGAATTT	GGAAGCACTT	CCCTTTGACT	1823
TTTGGTCATG	ATAAGAAAAA	TTAGATCAAG	CAAATGATAA	AAGCAGTGTT	TTACCAAGGA	1883
TTAGGGATAC	TGAACAATTT	CACTATGGTA	ACTGAATGGG	GAGTGACCAA	GGGTAAAAAT	1943
ATTAAAGCCA	AGGCAAAGGC	AGCAGATTAG	AATGGATTAA	AGAGAGTTTA	TAATTTGTTT	2003
GCATTTACTT	GATGGTTTAT	CTCATGGATT	CATGAGTCAA	GAAAGGTGCG	TAGGACAGGC	2063
CAGGGATTCC	AGTTATAACA	CATTATTCAC	CCAAAGGGTT	CTTTAATTCT	GTATGAGTAT	2123
TGGGAGTGGA	TTAGCACAAT	AGAGGCATAT	GTTGCTTTAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	2183

114 • · • · · · • ·

AAAAAAAA 2191 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1533 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 62..1394 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23:

CCGCGAGCAG TTCACCGCGG CGTCCGGAAG GTTAAGCTGA AACGGCAGCT CAGCTTCGGA 60

G ATG TTA CCG TCC AAA TTG CAT GCG CTT TTC TGC CTC TGC ACC TGC 106

Met Leu Pro Ser Lys Leu His Ala Leu Phe Cys Leu Cys Thr Cys

10 15

CTT Leu

GCA Ala

CTG GTT TAT

CCT Pro

TTT Phe

GAC TGG CAA

GAC Asp

CTG AAT

CCA Pro

GTT Val 30

GCC Ma

154

Leu

Val

Tyr 20

Asp

Trp

Gin 25

Leu

Asn

TAT

ATT

GAA

TCA

CCA

GCA

TGG

GTC

AGT

AAG

ATA

CAA

GCT

CTG

ATG

GCT

202

Tyr

lle

Glu

Ser 35

Pro

Ma

Trp

Val

Ser 40

Lys

lle

Gin

Ma

Leu 45

Met

Ala

GCT

GCA

AAC

ATT

GGT

CAA

TCT

AAA

ATC

CCC

AGA

GGA

AAT

GGA

TCT

TAT

250

Ala

Ala

Asn 50

lle

Gly

Gin

Ser

Lys 55

lle

Pro

Arg

Gly

Asn 60

Gly

Ser

Tyr

TCC

GTC

GGT

TGT

ACA

GAC

TTG

ATG

TTT

GAT

TAC

ACT

AAT

AAG

GGC

ACC

298

Ser

Val 65

Gly

Cys

Thr

Asp

Leu 70

Met

Phe

Asp

Tyr

Thr 75

Asn

Lys

Gly

Thr

TTC

TTG

CGT

TTG

TAT

TAT

CCA

TCT

CAA

GAT

GAT

GAT

CAC

TCC

GAC

ACC

346

Phe 80

Leu

Arg

Leu

Tyr

Tyr 85

Pro

Ser

Gin

Asp

Asp 90

Asp

His

Ser

Asp

Thr 95

CTT

TGG

ATC

CCA

AAC

AAA

GAA

TAT

TTT

TTG

GGT

CTT

AGT

AAA

TTT

CTT

394

Leu

Trp

lle

Pro

Asn 100

Lys

Glu

Tyr

Phe

Leu 105

Gly

Leu

Ser

Lys

Phe 110

Leu

GGA

ACA

CAC

TGG

CTT

GTG

GGC

AAA

ATT

ATG

GGC

TTA

TTC

TTC

GGT

TCA

442

Gly

Thr

His

Trp 115

Leu

Val

Gly

Lys

lle 120

Met

Gly

Leu

Phe

Phe 125

Gly

Ser

ATG

ACA

ACT

CCT

GCA

GCC

TGG

AAT

GCA

CAT

CTG

AGG

ACT

GGG

GAA

AAA

490

Met

Thr

Thr 130

Pro

Ala

Ma

Trp

Asn 135

Ma

His

Leu

Arg

Thr 140

Gly

Glu

Lys

TAC

CCA

CTA

ATT

ATT

TTT

TCT

CAT

GGT

CTT

GGA

GCA

TTC

AGG

ACG

ATT

538

Tyr

Pro

Leu

lle

lle

Phe

Ser

His

Gly

Leu

Gly

Ma

Phe

Arg

Thr

lle

115 • · · · • · • ·· · · · · · • · ♦ · · · ·

145

150

155

TAT

TCT

GCT

ATT

GGC

ATT

GAT

CTG

GCA

TCC

CAC

GGG

TTT

ATA

GTT

GCT

586

Tyr 160

Ser

Ala

Ile

Gly

Ile 165

Asp

Leu

Ala

Ser

His 170

Gly

Phe

Ile

Val

Ala 175

GCT

GTA

GAA

CAC

AGG

GAT

GGC

TCT

GCA

TCC

TCG

ACA

TAC

TAT

TTC

AAG

634

Ala

Val

Glu

His

Arg 180

Asp

Gly

Ser

Ala

Ser 185

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Phe 190.

Lys

GAC

CAG

TCT

GCT

GTA

GAA

ATA

GGC

AAC

AAG

TCT

TGG

CTC

TAT

CTC

AGA

682

Asp

Gin

Ser

Ala 195

Val

Glu

Ile

Gly

Asn 200

Lys

Ser

Trp

Leu

Tyr 205

Leu

Arg

ACC

CTG

AAG

CGA

GGA

GAG

GAG

GAG

TTT

CCT

TTA

CGA

AAT

GAG

CAG

TTA

730

Thr

Leu

Lys 210

Arg

Gly

Glu

Glu

Glu 215

Phe

Pro

Leu

Arg

Asn 220

Glu

Gin

Leu

CGG

CAA

CGA

GCA

AAG

GAA

TGT

TCT

CAA

GCT

CTC

AGT

TTG

ATT

CTG

GAC

778

Arg

Gin 225

Arg

Ala

Lys

Glu

Cys 230

Ser

Gin

Ala

Leu

Ser 235

Leu

Ile

Leu

Asp

ATT

GAT

CAC

GGG

AGG

CCA

GTG

ACG

AAT

GTA

CTA

GAT

TTA

GAG

TTT

GAT

826

Ile 240

Asp

His

Gly

Arg

Pro 245

Val

Thr

Asn

Val

Leu 250

Asp

Leu

Glu

Phe

Asp 255

GTG

GAA

CAG

CTG

AAG

GAC

TCT

ATT

GAT

AGG

GAT

AAA

ATA

GCC

ATT

ATT

874

Val

Glu

Gin

Leu

Lys 260

Asp

Ser

Ile

Asp

Arg 265

Asp

Lys

Ile

Ala

Ile 270

Ile

GGA

CAT

TCT

TTT

GGT

GGA

GCC

ACA

GTT

ATT

CAG

ACT

CTT

AGT

GAA

GAC

922

Gly

His

Ser

Phe 275

Gly

Gly

Ala

Thr

Val 280

Ile

Gin

Thr

Leu

Ser 285

Glu

Asp

CAG

AGA

TTC

AGG

TGT

GGC

ATT

GCT

CTG

GAT

GCA

TGG

ATG

TTT

CCC

GTG

970

Gin

Arg

Phe 290

Arg

Cys

Gly

Ile

Ala 295

Leu

Asp

Ala

Trp

Met 300

Phe

Pro

Val

GGT

GAT

GAA

GTA

TAT

TCC

AGA

ATT

CCT

CAA

CCC

CTC

TTT

TTT

ATC

AAC

1018

Gly

Asp 305

Glu

Val

Tyr

Ser

Arg 310

Ile

Pro

Gin

Pro

Leu 315

Phe

Phe

Ile

Asn

TCG

GAA

CGA

TTC

CAA

TAC

CCT

TCT

AAT

ATC

ATA

AGA

ATG

AAA

AAA

TGC

1066

Ser 320

Glu

Arg

Phe

Gin

Tyr 325

Pro

Ser

Asn

Ile

Ile 330

Arg

Met

Lys

Lys

Cys 335

TTC

TTA

CCT

GAT

AGA

GAA

CGA

AAA

ATG

ATT

ACA

ATC

AGG

GGT

TCG

GTC

1114

Phe

Leu

Pro

Asp

Arg 340

Glu

Arg

Lys

Met

Ile 345

Thr

Ile

Arg

Gly

Ser 350

Val

CAT

CAG

AAT

TTT

GTT

GAC

TTC

ACT

TTT

GCC

ACT

AGC

AAA

ATA

ATT

GGC

1162

His

Gin

Asn

Phe 355

Val

Asp

Phe

Thr

Phe 360

Ala

Thr

Ser

Lys

Ile 365

Ile

Gly

TAC

CTA

TTC

ACA

CTG

AAA

GGA

GAC

ATC

GAT

TCC

AAT

GTA

GCC

ATC

AGC

1210

Tyr

Leu

Phe 370

Thr

Leu

Lys

Gly

Asp 375

Ile

Asp

Ser

Asn

Val 380

Ala

Ile

Ser

CTT

AGC

AAC

AAA

GCT

TCC

TTA

GCG

TTC

TTA

CAA

AAA

CAT

TTA

GGA

CTT

1258

Leu

Ser

Asn

Lys

Ala

Ser

Leu

Ala

Phe

Leu

Gin

Lys

His

Leu

Gly

Leu

385 390 395

116

ΦΦΦ · · φ φ φ φ φ φ φ φ · · · •ΦΦΦ φφ ··

CAG AAA GAT TTT

GAT Asp

CAG Gin 405

TGG Trp

GAT Asp

TCT Ser

TTA Leu

GTT Val 410

GAA Glu

GGC Gly

GAA Glu

GAT Asp

CAC His 415

1306

Gin 400

Lys

Asp

Phe

AAT

CTT

ATT

CCA

GGG

ACC

AAC

ATT

AAC

ACA

ACC

AAC

CAC

CAA

GCC

ATT

1354

Asn

Leu

Ile

Pro

Gly

Thr

Asn

Ile

Asn

Thr

Thr

Asn

His

Gin

Ala

Ile

420

425

430

CTG

CAG

AAC

TCC

ACA

GGA

ATA

GAG

AGA

CCA

AAT

TTA

GAT

T AAAAGAGCTT

1404

Leu

Gin

Asn

Ser

Thr

Gly

Ile

Glu

Arg

Pro

Asn

Leu

Asp

435

440

TTTAAAAAGT	TTTGTTTACG	AACTTGTCTA	AAAGTGTGTG	TGTGTATGAT	TTAAATGTAT	1464
TTTCTCAAAT	AGCTCATATT	AAAAAATGTA	GGCTATAGCA	CAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	1524
AAAAAAAAA						1533

(2) INFORMACE 0 SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1876 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 468..1734 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:

CGGCGGGCTG	CTGGCCCTTC	CCGGCTGTTC	GTAGAGCCGG	ATCCTGCAGC	GCCCCTGAGA	60
CGAACCGCCC	CGATGCGGTG	CTCCTCAGCG	CCACGGGACG	CAGCCGGGGC	CGGCCGTGTT	120
GGCGCAGCTC	CCACGACGTA	CGCTTCCTTT	CCAGGCTCGA	GGAAAGCCTC	TCCCACAAAC	180
ACCGTCCCAG	CTGGGAAGTG	AGGCGGAGTT	TTGGTCCCTC	CCCTCCGGCA	GCGCCCGGCA	240
TTCCGTCCGT	CCGTCCGTCC	GTCCGTGCGG	CGCACGGCGC	CCTGCAGAGC	CGGGACACCG	300
CAGCAGGGTA	GGAGGACCCG	GAGGTGGTGT	GCAGCCACAG	GTTTCCATCC	TGCCCCCACC	360
TCCCGGGGAG	CAGCCCTGTG	CTATACCCAA	CCCCCCGCAC	AGAGCACTGA	GCCGGCTGCT	420
GCCTGCCTGC	ACCCCGCCGT	GGGACCTTCT	GCTCTTCCCA	ACAAGTG ATG GCA TCG	476

Met Ala Ser 1

CTG

TGG

GTG

AGA

GCC

AGG

AGG

GTG

TTC

ATG

AAA

AGT

CGT

GCT

TCA

GGT

524

Leu

Trp 5

Val

Arg

Ala

Arg

Arg 10

Val

Phe

Met

Lys

Ser 15

Arg

Ala

Ser

Gly

TTC

TCG

GCG

AAG

GCG

GCG

ACG

GAG

ATG

GGG

AGC

GGC

GGC

GCG

GAG

AAG

572

117 · · · • · · · 9 9

9

9

9999 99

• ·

• ·

• · 9 9

Phe

Ser

Ala

Lys

Ala

Ala

Thr

Glu

Met

Gly

Ser

Gly

Gly

Ala

Glu

Lys

20

25

30

35

GGC

TAT

CGG

ATC

CCC

GCC

GGG

AAG

GGC

CCG

CAC

GCC

GTG

GGC

TGC

ACG

620

Gly

Tyr

Arg

lle

Pro

Ala

Gly

Lys

Gly

Pro

His

Ala

Val

Gly

Cys

Thr

40

45

50

GAT

CTG

ATG

ACC

GGC

GAC

GCG

GCC

GAG

GGA

AGC

TTT

TTG

CGC

CTG

TAT

668

Asp

Leu

Met

Thr

Gly

Asp

Ala

Ala

Glu

Gly

Ser

Phe

Leu

Arg

Leu

Tyr

55

60

65

TAC

CTA

TCG

TGT

GAC

GAC

ACA

GAT

ACT

GAA

GAG

ACA

CCC

TGG

ATT

CCA

716

Tyr

Leu

Ser

Cys

Asp

Asp

Thr

Asp

Thr

Glu

Glu

Thr

Pro

Trp

lle

Pro

70

75

80

GAT

AAA

GAG

TAC

TAC

CAG

GGG

CTG

TCT

GAC

TTC

CTC

AAC

GTG

TAC

CGG

764

Asp

Lys

Glu

Tyr

Tyr

Gin

Gly

Leu

Ser

Asp

Phe

Leu

Asn

Val

Tyr

Arg

85

90

95

GCC

CTG

GGA

GAA

AGG

CTT

TTC

CAG

TAC

TAC

GTT

GGC

TCA

GTG

ACC

TGT

812

Ala

Leu

Gly

Glu

Arg

Leu

Phe

Gin

Tyr

Tyr

Val

Gly

Ser

Val

Thr

Cys

100

105

110

115

CCT

GCA

AAA

TCA

AAC

GCT

GCT

TTT

AAG

CCA

GGA

GAG

AAA

TAC

CCA

CTG

860

Pro

Ala

Lys

Ser

Asn

Ala

Ala

Phe

Lys

Pro

Gly

Glu

Lys

Tyr

Pro

Leu

120

125

130

CTC

GTT

TTT

TCC

CAT

GGA

CTT

GGA

GCT

TTT

CGG

ACC

ATC

TAT

TCT

GCT

908

Leu

Val

Phe

Ser

His

Gly

Leu

Gly

Ala

Phe

Arg

Thr

lle

Tyr

Ser

Ala

135

140

145

ATC

TGC

ATA

GAG

ATG

GCT

TCT

CAA

GGC

TTT

CTA

GTG

GCA

GCT

GTG

GAG

956

lle

Cys

lle

Glu

Met

Ala

Ser

Gin

Gly

Phe

Leu

Val

Ala

Ala

Val

Glu

150

155

160

CAC

AGA

GAT

GAA

TCG

GCT

TCA

GCA

ACG

TAT

TTC

TGT

AAA

AAG

AAG

GCT

1004

His

Arg

Asp

Glu

Ser

Ala

Ser

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

Lys

Lys

Lys

Ala

165

170

175

GAT

TCT

GAG

CCA

GAG

GAG

GAT

CAA

ACA

TCA

GGC

GTG

GAG

AAG

GAG

TGG

1052

Asp

Ser

Glu

Pro

Glu

Glu

Asp

Gin

Thr

Ser

Gly

Val

Glu

Lys

Glu

Trp

180

185

190

195

ATC

TAC

TAC

AGG

AAG

CTC

AGA

GCA

GGA

GAG

GAG

GAG

CGC

TGT

CTG

CGT

1100

lle

Tyr

Tyr

Arg

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

Glu

Arg

Cys

Leu

Arg

200

205

210

CAC

AAG

CAG

GTA

CAG

CAG

AGA

GCA

CAG

GAG

TGC

ATC

AAA

GCG

CTC

AAC

1148

His

Lys

Gin

Val

Gin

Gin

Arg

Ala

Gin

Glu

Cys

lle

Lys

Ala

Leu

Asn

215

220

225

CTC

ATT

CTT

AAG

ATC

AGT

TCA

GGA

GAG

GAA

GTG

ATG

AAT

GTG

CTG

AAC

1196

Leu

lle

Leu

Lys

lle

Ser

Ser

Gly

Glu

Glu

Val

Met

Asn

Val

Leu

Asn

230

235

240

TCA

GAC

TTT

GAC

TGG

AAC

CAC

CTG

AAG

GAT

TCT

GTT

GAT

ACT

AGC

AGA

1244

Ser

Asp

Phe

Asp

Trp

Asn

His

Leu

Lys

Asp

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Arg

245

250

255

ATA

GCT

GTG

ATG

GGA

CAC

TCT

TTT

GGT

GGT

GCT

ACA

GTT

ATT

GAG

AGC

1292

lle

Ala

Val

Met

Gly

His

Ser

Phe

Gly

Gly

Ala

Thr

Val

lle

Glu

Ser

118 • » · · 999

260 265 270 275

CTC AGC AAA

GAA Glu

ATT AGA TTT AGG TGT

GGC Gly 285

ATT lle

GCC Ala

CTT Leu

GAT Asp

GCG Ala 290

TGG Trp

1340

Leu

Ser

Lys

lle Arg 280

Phe Arg

Cys

ATG

CTC

CCG

GTA

GGC

GAT

GAC

ACT

TAC

CAA

AGC

AGT

GTG

CAG

CAA

CCA

1388

Met

Leu

Pro

Val

Gly

Asp

Asp

Thr

Tyr

Gin

Ser

Ser

Val

Gin

Gin

Pro

295

300

305

CTG

CTC

TTT

ATT

AAT

TCC

GAA

AAA

TTC

CAG

TGG

GCT

GCC

AAT

ATC

TTA

1436

Leu

Leu

Phe

lle

Asn

Ser

Glu

Lys

Phe

Gin

Trp

Ala

Ala

Asn

lle

Leu

310

315

320

AAG

ATG

AAG

AAG

CTT

AGC

TCC

AAT

GAT

ACC

AAC

AAG

AAA

ATG

ATC

ACC

1484

Lys

Met

Lys

Lys

Leu

Ser

Ser

Asn

Asp

Thr

Asn

Lys

Lys

Met

lle

Thr

325

330

335

ATC

AAA

GGA

TCG

GTA

CAT

CAG

AGC

TTT

CCT

GAT

TTT

ACT

TTT

GTG

AGT

1532

lle

Lys

Gly

Ser

Val

His

Gin

Ser

Phe

Pro

Asp

Phe

Thr

Phe

Val

Ser

340

345

350

355

GGA

GAA

ATC

ATT

GGA

AAG

TTT

TTC

AAG

TTA

AAA

GGA

GAA

ATA

GAC

CCA

1580

Gly

Glu

lle

lle

Gly

Lys

Phe

Phe

Lys

Leu

Lys

Gly

Glu

lle

Asp

Pro

360

365

370

AAT

GAA

GCT

ATT

GAT

ATA

TGC

AAC

CAC

GCT

TCA

TTG

GCC

TTC

CTG

CAG

1628

Asn

Glu

Ala

lle

Asp

lle

Cys

Asn

His

Ala

Ser

Leu

Ala

Phe

Leu

Gin

375 380 385

AAA CAT

CTG AGT

CTT AAG AGA GAT

TTT Phe

GAT Asp

AAG TGG

GAT TCA

CTC Leu

GTG Val

1676

Lys

His

Leu 390

Ser

Leu

Lys

Arg Asp 395

Lys

Trp

Asp 400

Ser

GAT

GGC

ATA

GGA

CCC

AAT

GTT

ATT

TCT

GGT

ACC

AAT

ATC

GAC

TTA

TCT

1724

Asp

Gly

lle

Gly

Pro

Asn

Val

lle

Ser

Gly

Thr

Asn

lle

Asp

Leu

Ser

405

410

415

CCA ACT GAG T AAG GAGT ACA AGAAGTACTG CAAAGGCCAC CAGCAGCAGG 1774

Pro Thr Glu

420

ACACCAACGT TGGCCACACA TTGCTTGGAG CTGAGATAGC ACTGGCCTCC CACACAGCTT 1834

TTGGAGTGTG AAACAACAAA AAAAAAAATC ACAGGGGAGC CG 1876 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 517 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 2..514

119 • · ··· · * · ···· • · ··· · * · · · · » • ♦ * · · · · · · · · ··«· ·· ·* «· ·* *· (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:25:

G GGG CAT TCT TTT GGA GGA GCA ACA GTT TTT CAA GCC CTA AGT GAA 46

Gly His Ser Phe Gly Gly Ala Thr Val Phe Gin Ala Leu Ser Glu

10 15

GAC Asp

CAG AGA

TTC Phe

AGA TGT

GGG Gly

ATT lle

GCC Ala

CTT Leu 25

GAT Asp

CCG Pro

TGG ATG

TTT· Phe 30

CCC Pro

94

Gin

Arg

Arg 20

Cys

Trp

Met

GTG

AGT

GAG

GAG

CTG

TAC

TCC

AGA

GTT

CCT

CAG

CCT

CTC

TTC

TTT

ATC

142

Val

Ser

Glu

Glu

Leu

Tyr

Ser

Arg

Val

Pro

Gin

Pro

Leu

Phe

Phe

lle

35

40

45

AAC

TCT

GCC

GAA

TTC

CAG

ACT

CCA

AAG

GAC

ATT

GCA

AAA

ATG

AAA

AAC

190

Asn

Ser

Ala

Glu

Phe

Gin

Thr

Pro

Lys

Asp

lle

Ala

Lys

Met

Lys

Asn

50

55

60

TTC

TAC

CAG

CCT

GAC

AAG

GAA

AGG

AAA

ATG

ATT

ACG

ATC

AAG

GGC

TCA

238

Phe

Tyr

Gin

Pro

Asp

Lys

Glu

Arg

Lys

Met

lle

Thr

lle

Lys

Gly

Ser

65

70

75

GTG

CAC

CAG

AAT

TTT

GCT

GAC

GGG

ACT

TTT

GTA

ACT

GGC

AAA

ATA

ATT

286

Val

His

Gin

Asn

Phe

Ala

Asp

Gly

Thr

Phe

Val

Thr

Gly

Lys

lle

lle

80

85

90

95

GGA

AAC

AAG

CTG

TCA

CTG

AAA

GGA

GAC

ATA

GAC

TCC

AGA

GTT

GCC

ATA

334

Gly

Asn

Lys

Leu

Ser

Leu

Lys

Gly

Asp

lle

Asp

Ser

Arg

Val

Ala

lle

100

105

110

GAC

CTC

ACC

AAC

AAG

GCT

TCC

TTG

GCT

TTC

TTA

CAA

AAA

CAT

TTA

GGA

382

Asp

Leu

Thr

Asn

Lys

Ala

Ser

Leu

Ala

Phe

Leu

Gin

Lys

His

Leu

Gly

115

120

125

CTT

CAT

AAA

GAC

TTT

GAT

CAG

TGG

GAC

TGT

CTG

GTG

GAG

GGA

GAG

AAC

430

Leu

His

Lys

Asp

Phe

Asp

Gin

Trp

Asp

Cys

Leu

Val

Glu

Gly

Glu

Asn

130

135

140

GAG

AAC

CTC

ATC

CCG

GGG

TCA

CCC

TTT

GAT

GTA

GTC

ACC

CAG

TCC

CCG

478

Glu

Asn

Leu

lle

Pro

Gly

Ser

Pro

Phe

Asp

Val

Val

Thr

Gin

Ser

Pro

145

150

155

GCT

CTG

CAG

AGT

TCT

CCC

GGA

TCA

CAC

AAC

CAG

AAT

TAG

517

Ala

Leu

Gin

Ser

Ser

Pro

Gly

Ser

His

Asn

Gin

Asn

160

165

170

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 580 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS

120 • 4 *444 • · ·«

4» · · · · · ·· « 44 · · · · * · • * · · · 4 · · · ► · • 4 4 4 4 4 · 444

4444 44 4» ·· ** *· (B) UMÍSTĚNÍ: 1..580 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:26:

CAA

GTA

CTG

ATG

GCT

GCT

GCA

AGC

TTT

GGC

GAA

CGT

AAA

ATC

CCT

AAG

48

Gin

Val

Leu

Met

Ala

Ala

Ala

Ser

Phe

Gly

Glu

Arg

Lys

Ile

Pro

Lys

1

5

10

15

GGA AAT Gly Asn

GGG Gly

CCT Pro 20

TAT Tyr

TCC Ser

GTT Val

GGT Gly

TGT Cys 25

ACA Thr

GAC Asp

TTA ATG Leu Met

TTT Phe 30

GAT Asp

TAC Tyr

96

ACT

AAA

AAG

GGC

ACC

TTC

TTG

CGT

TTA

TAT

TAT

CCA

TCC

CAA

GAT

GAT

144

Thr

Lys

Lys

Gly

Thr

Phe

Leu

Arg

Leu

Tyr

Tyr

Pro

Ser

Gin

Asp

Asp

35

40

45

GAT

CGC

CTT

GAC

ACC

CTT

TGG

ATC

CCA

TKÁT

AAG

GAG

TAT

TTT

TGG

GGT

192

Asp

Arg

Leu

Asp

Thr

Leu

Trp

Ile

Pro

Asn

Lys

Glu

Tyr

Phe

Trp

Gly

50

55

60

CTT

AGC

AAG

TAT

CTT

GGA

AAA

CAC

TGG

CTT

ATG

GGC

AAC

ATT

TTG

AGT

240

Leu

Ser

Lys

Tyr

Leu

Gly

Lys

His

Trp

Leu

Met

Gly

Asn

Ile

Leu

Ser

65

70

75

80

TTA

CTC

TTT

GGT

TCA

GTG

ACA

ACT

CCT

GCA

AAC

TGG

AAT

TCC

CCT

CTG

288

Leu

Leu

Phe

Gly

Ser

Val

Thr

Thr

Pro

Ala

Asn

Trp

Asn

Ser

Pro

Leu

85

90

95

AGG

CCT

GGT

GAA

AAA

TAC

CCA

CTT

GTT

GTT

TTT

TCT

CAT

GGT

CTT

GGA

336

Arg

Pro

Gly

Glu

Lys

Tyr

Pro

Leu

Val

Val

Phe

Ser

His

Gly

Leu

Gly

100

105

110

GCA

TTC

AGG

ACA

ATT

TAT

TCT

GCT

ATT

GGC

ATT

GAC

CTG

GCA

TCT

CAT

384

Ala

Phe

Arg

Thr

Ile

Tyr

Ser

Tkla

Ile

Gly

Ile

Asp

Leu

Ala

Ser

His

115

120

125

GGG

TTT

ATA

GTT

GCT

GCT

GTA

GAA

CAC

AGA

GAT

AGA

TCT

GCA

TCT

GCA

432

Gly

Phe

Ile

Val

Ala

Ala

Val

Glu

His

Arg

Asp

Arg

Ser

Ala

Ser

Tkla

130

135

140

ACT

TAC

TAT

TTC

AAG

AAC

CAA

TCT

GCT

GCA

GAA

ATA

GGG

AAA

AAG

TCT

480

Thr

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Asn

Gin

Ser

Ala

Ala

Glu

Ile

Gly

Lys

Lys

Ser

145

150

155

160

TGG

CTC

TAC

CTT

AGA

ACC

CTG

AAA

GAA

GAG

GAG

GAG

ATA

CAT

ATA

CGA

528

Trp

Leu

Tyr

Leu

Arg

Thr

Leu

Lys

Glu

Glu

Glu

Glu

Ile

His

Ile

Arg

165

170

175

AAT

AAG

CAG

GTA

CGA

CAA

AGA

GCA

AAA

GAA

TGT

TCC

CAA

GCT

CTC

AGT

576

Asn

Lys

Gin

Val

Arg

Gin

Arg

Ala

Lys

Glu

Cys

Ser

Gin

Ala

Leu

Ser

180

185

190

CTG

A

580

Leu (2) INFORMACE O SEQ ID NO:27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

121 • · • · • · · · • · • · · • · · (A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:27:

Gly Xaa Ser Xaa Gly 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 41 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:28:

TATTCTAGAA TTATGATACA AGTATTAATG GCTGCTGCAA G 41 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:29:

ATTGATATCC TAATTGTATT TCTCTATTCC TG 32 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1335 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:30:

ATGGTACCCC	CAAAGCTGCA	CGTCCTGTTT	TGTCTGTGTG	GATGTCTCGC	CGTCGTGTAC	60
CCCTTCGATT	GGCAGTATAT	CAACCCCGTG	GCTCACATGA	AGAGCAGCGC	CTGGGTGAAT	120
AAGATCCAGG	TGCTCATGGC	CGCACCAAGC	TTCGGTCAGA	CCAAGATTCC	TAGAGGCAAC	180
GGCCCCTACA	GCGTGGGCTG	CACCGATCTG	ATGTTCGACC	ATACCAACAA	AGGAACTTTT	240

122 • · ···· ·· · ·«· ··· ·· · ··· ·· ··· · · · · · · • ·· · · · · · · · ···· ·· ·· « · ·* · ·

CTGAGACTGT	ACTACCCCAG	CCAGGACAAC	GACAGACTGG	ATACTCTGTG	GATCCCAAAT	300
AAAGAATATT	TTTGGGGTCT	TAGCAAATTT	CTTGGAACAC	ACTGGCTTAT	GGGCAACATT	360
TTGAGGTTAC	TCTTTGGTTC	AATGACAACT	CCTGCAAACT	GGAATTCCCC	TCTGAGGCCT	420
GGTGAAAAAT	ATCCACTTGT	TGTTTTTTCT	CATGGTCTTG	GGGCATTCAG	GACACTTTAT	480
TCTGCTATTG	GCATTGACCT	GGCATCTCAT	GGGTTTATAG	TTGCTGCTGT	AGAACACAGA	540
GATAGATCTG	CATCTGCAAC	TTACTATTTC	AAGGACCAAT	CTGCTGCAGA	AATAGGGGAC	600
AAGTCTTGGC	TCTACCTTAG	AACCCTGAAA	CAAGAGGAGG	AGACACATAT	ACGAAATGAG	660
CAGGTACGGC	AAAGAGCAAA	AGAATGTTCC	CAAGCTCTCA	GTCTGATTCT	TGACATTGAT	720
CATGGAAAGC	CAGTGAAGAA	TGCATTAGAT	TTAAAGTTTG	ATATGGAACA	ACTGAAGGAC	780
TCTATTGATA	GGGAAAAAAT	AGCAGTAATT	GGACATTCTT	TTGGTGGAGC	AACGGTTATT	840
CAGACTCTTA	GTGAAGATCA	GAGATTCAGA	TGTGGTATTG	CCCTGGATGC	ATGGATGTTT	900
CCACTGGGTG	ATGAAGTATA	TTCCAGAATT	CCTCAGCCCC	TCTTTTTTAT	CAACTCTGAA	960
TATTTCCAAT	ATCCTGCTAA	TATCATAAAA	ATGAAAAAAT	GCTACTCACC	TGATAAAGAA	1020
AGAAAGATGA	TTACAATCAG	GGGTTCAGTC	CACCAGAATT	TTGCTGACTT	CACTTTTGCA	1080
ACTGGCAAAA	TAATTGGACA	CATGCTCAAA	TTAAAGGGAG	ACATAGATTC	AAATGTAGCT	1140
ATTGATCTTA	GCAACAAAGC	TTCATTAGCA	TTCTTACAAA	AGCATTTAGG	ACTTCATAAA	1200
GATTTTGATC	AGTGGGACTG	CTTGATTGAA	GGAGATGATG	AGAATCTTAT	TCCAGGGACC	1260
AACATTAACA	CAACCAATCA	ACACATCATG	TTACAGAACT	CTTCAGGAAT	AGAGAAATAC	1320
AATTAGGATT	CTAGA					1335

123 • · · · « ·

Obr. 1 • ·

r,

124

Obr. 2

PAF-AH activity (cpm)

PAF-AH PAF-AH PAF-AH* EDTA PAF-AH *DFP (antisense)

125 • · · • ·

Obr. 3

142 242

342 441

	S D 1 1	H í
rPAP - AH

PAF-AH

QCIIVltV

N - termmcl deletions

C-termincl deletions */126 • ·

Count s

10000 20000 30000 /10000 50000 60000 70000 80000 90000 100000

127 • · ·· ···· · · · · • · · · ···· ··· · · · · · · *

Obr. 5

r.

1OOOO 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 100000

128 • ·

Obr. 6 r,

EDEMA (ml)

□ PAr-AH Treated □ Carrier Treated

129

Obr. 7

□ Carrier Treated

130 • · • · · · • · · · · • · · · • · · · ·

Obr. 8

EDEMA (ml)

FOOT CHALLENGE □ Carrier Treated □ PAF-AH Treated

131 • · • ·

Experiment 1

Obr. 9A

Experiment 2

U

Obr. 9B

132 • · • · · ·

Experiment 1

Ώ PAF-AH Treated □ Carrier Treated

Obr. 10A

□ Carrier Treated

Obr. 10B

133 ♦ » • ·

Obr. 11 fa [Plasma PAF-AHj, units/ml

P;

134 • ·

Obr. 12

EDEMA (ml)

135 • · • to ···· ·· · tototo ··· toto · ···

Obr. 13

% TUNEL - positive neurons per 50X field

Claims (16)

1. PATENOVÉ NÁROKY

   1. Purifikovaný a izolovaný polypeptidový fragment lidské plazmové acetyhydrolasy destičky-aktivujícího faktoru (PAFAH; platelet-activating factor acetylhydrolase), který postrádá až prvních dvanáct N-koncových aminokyselin aminokyselinové sekvence lidské PAF-AH, popsané v SEQ ID NO: 8.
2. 2. Polypeptidový fragment PAF-AH dle nároku 1 vybraný ze skupiny skládající se z

   a) polypeptidu, který má Met₄₆ SEQ ID NO:8 jako iniciační Nkoncovou aminokyselinu

   b) polypeptidu, který má Ala₄₇ SEQ ID NO:8 jako iniciační Nkoncovou aminokyselinu

   c) polypeptidu, který má Ala₄₈ SEQ ID NO:8 jako iniciační Nkoncovou aminokyselinu.
3. 3. Polypeptidový fragment PAF-AH dle kteréhokoliv nároku 1 nebo 2, který postrádá až 30 C-koncových aminokyselin aminokyselinové sekvence SEQ ID NO:8.
4. 4. Polypeptidový fragment PAF-AH dle kteréhokoliv nároku 1 nebo 2, který má jako svůj C-koncový zbytek, zbytek vybraný ze skupiny skládající se z:

   a) Ile₄₂9

   b) Leu₄₃i a

   c) Asn₄₄₁
5. 5. Obměna polypeptidového fragmentu PAF-AH dle nároku 1, který má v sekvenci SEQ ID NO:8 nahrazenou aminokyselinu, a který

   j e vybr aný ze skupiny skládající se a) S 108 A b) S 273 A c) D 286 A d) D 286 N e) D 296 A

   ·· ·· 99 9999 99 ·· ···· ·· 9 9 9 9 9

   999 99 9 · · · · ···· ·· ·· 99 99 99

   f) D 304 A

   g) D 338 A

   h) H 351 A

   i) H 395 A

   j) H 399 A

   k) C 67 S

   l) C 229 S

   m) C 291 S

   n) C 334 S a

   o) C 407 S.
6. 6. Obměna lidského polypeptidu PAF-AH , který má v sekvenci SEQ ID NO:8 nahrazenou aminokyselinu, a který je vybraný ze skupiny skládající se z:

   a) D 286 A b) D 286 N c) D 304 A
7. 7. Izolovaný polynukleotid kódující polypeptidový fragment PAFAH, obměnu nebo obměněný fragment dle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 6.
8. 8. Izolovaný polynukleotid kódující lidský fragment PAF-AH nebo obměněný fragment mající Met₄₆ SEQ ID NO:8 jako N-koncový zbytek a Ile₄₂₉ nebo Asn₄₄i jako C-koncový zbytek.
9. 9. Polynukleotid dle kteréhokoliv nároků 7 nebo 8.
10. 10. DNA vektor obsahující DNA dle nároku 9.
11. 11. Hostitelská buňka stabilně transformovaná nebo transfikovaná DNA dle nároku 9 způsobem, který dovolí ve výše uvedené hostitelské buňce expresi PAF-AH polypeptidového fragmentu, obměny nebo obměněného fragmentu.
12. 12. Způsob produkce PAF-AH polypeptidového fragmentu, obměny nebo obměněného fragmentu plazmového PAF-AH stávající se ·· »· » · · · • ·· « * · z pěstování hostitelských buněk dle nároku 11 ve vhodném živném mediu a izolace výše zmíněného PAF-AH fragmentu, obměny nebo obměněného fragmentu z výše zmíněných buněk nebo media jejich růstu.
13. 13. PAF-AH polypeptidový fragment, obměna nebo obměněný fragment produkovaný způsobem dle nároku 12.
14. 14. Farmaceutická směs obsahující PAF-AH fragment, obměnu nebo obměněný fragment dle kteréhokoliv z nároků 1,6 nebo 13 a farmaceuticky přijatelné ředidlo, adjuvans nebo nosič.
15. 15. Způsob léčení savce snadno podléhajícího nebo trpícího patologickým stavem způsobenými PAF. Léčení zahrnuje z podávání farmaceutických směsí dle nároku 14 v množstvích dostatečných k doplnění aktivity PAF-AH a k inaktivaci patologických účinků PAF u výše zmíněného savce.
16. 16. Způsob dle nároku 15, kde výše zmíněným patologickým stavem je zánět pohrudnice, astma, rinitida, nekrotizujíeí enterokolitida, syndrom akutní respirační nedostatečnosti, akutní pankreatitida nebo neurologické nemoce spojené