NO326392B1

NO326392B1 - Fremgangsmate for fremstilling av en i det vesentlige ren, virusfri globulaer proteinformulering.

Info

Publication number: NO326392B1
Application number: NO20001949A
Authority: NO
Inventors: Robert William Van Holten; Jr George E Oulundsen
Original assignee: Millipore Corp
Priority date: 1997-10-14
Filing date: 2000-04-13
Publication date: 2008-11-24
Also published as: DE69839218T2; DE69839218D1; US6096872A; JP4255210B2; KR20010015753A; AU1081799A; NO20001949L; EP1030862A1; CA2306181A1; ATE388162T1; CN1163503C; CN1279688A; NO20001949D0; EP1030862A4; CN1576281B; CN1576281A; ES2302361T3; EP1030862B1; KR100547077B1; AU744845B2

Abstract

Et marint anker/arrangement er beskrevet hvor et marint anker (I, 23) drives vertikalt ned i forankringsbunnen (10) av en langstrakt følger (13), særlig av sin egen vekt og vekten av følgeren. Følgeren (13) har en nedre sjakkeldel. (103) tilpasset for å løsbart å holde ankere (1) via festetappen (2) ved hjelp av en dreiepinne (17) hvoretter ankeret (1) kan svinge i forhold til bundelen (103). For første penetrering holdes ankeret (1) i en posisjon med minimal fremdriftsmotstand, særlig med den fremre retningen F av mothaken (3) parallelt med følger aksen (20) og dette oppnås ved en brytepinne (9) mellom ankeret (1) og den nedre del (103). Når ankere' (1) er nedsenket til foretrukket dybde d, særlig i det / minste to ganger kvadratroten av det maksimale utsaf mothakearealet (sett normalt å retningen F), beveger' ankeret (23) til en posisjon for ankersetting for å tr/ på en innfestet ankerkabel (4/4a) for å forårsake at bryterpinnen (109) brytes og ankeret (3) roteres I omkring dreiepinneaksen til det stoppes av en ste (21) på følgere (13). Følgeren (13) kan deretter f vekk og gjenbrukes. Den ovenfor angitte / ankerarrangement gir en betydelig forbedret oppankringsytelse sammenlignet med eksister direkte nedsenkede arrangementer.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en i det vesentlige ren, virusfri globulær proteinformulering.

Feltet for den foreliggende oppfinnelsen er utvinning av et stort proteinøst materiale gjennom et lite poreeksklusjonsfilter i løpet av rensingen, viral reduksjon eller viral fjerningsprosessering. Fjerning av virus ved størrelseseksklusjon fra et stort biomolekyl slik som et gammaglobulin er vanligvis hindret ved problemene ved effektiv passering av et stort globulært protein gjennom et størrelseseksklusjonsfilter med ønsket liten porestørrelse nødvendig for farmasøytisk og diagnostisk anvendelse. Fjerning av virus fra proteinøse molekyler ved anvendelse av prosesserings rfemgangsmåtene ifølge oppfinnelsen resulterer i et produkt som er i det vesentlige fritt for virus.

Utvinning av stort proteinøst materiale gjennom et eksklusjonsfilter med små porer ved rensing, viral reduksjon eller viral fjerningsprosessering har gitt signifikante problemer for den farmasøytiske og diagnostiske industrien (se Roberts, P., Vox Sang, 1995; 69:82-83). Fjerning av virus fra et stort biomolekyl slik som et gammaglobulin (monoklonal eller polyklonal) ved størrelseseksklusjon hindres ved problemene ved effektiv passering av et stort globulært protein gjennom et størrelseseksklusjonsfilter med en 12-15 mm porestørrelse. Problemet er særlig klart når små virus uten kappe ønskes fjernet fra produkter med høy molekylvekt. En ytterligere komplikasjon ved prosessen er at proteinøse materialer slike som immunogiobuliner som skal utvinnes fra dimerer og trimerer, som har problemer med å passere gjennom filtrene eller ikke passerer i det hele tatt.

Dess mindre membranporestørrelsen er, dess mer effektiv er membranen i å utvinne de virale partiklene. Imidlertid, sammen med den mindre porestørrelsen, kommer en reduksjon i evnen til membranen til å la produktet uten virus passere fritt gjennom. Som ved virusreduksjonsteknikker må hver anvendelse bestemmes på sin egen verdi for hvert produkt og hvert virus. I de tilfeller hvor fjerning av små virus uten kappe er påkrevet, er anvendelsen av virusfiltre med minste porestørrelse (mindre enn 35 nm, og foretrukket mellom 12-30 nm) trolig essensiell og dette er ikke mulig med produkter med høy molekylvekt, eller med de som danner dimerer eller trimerer.

Problemet er angitt i publikasjonen til Roberts som omtalt ovenfor, hvor det er angitt at mens filtre med normale cutoff-verdier på 70,160 kD, og 15,35,40,50 og 70 nm kan være anvendelige for fjerning av små vimser og prioner, kan produkter med større molekylvekter slik som immunuglobuliner (IgG, ISO kD) og faktor VIII (350 kD) kun passere gjennom filter av største porestørrelse.

Ortho Diagnostic Systems Inc., MICRhoGAM® and RhoGAM® in Physicians Desk Reference, 49* Edition, April 1995, s. 1770-1771, Ronald Arky et al. beskriver rene anti-D immunogiobuliner som er tilgjengelige som sammensetninger inneholdende 5% immunogiobulin, Thimerosol og polysorbat 80. Disse sammensetningene er imidlertid fremstilt ved en fremgangsmåte som er svært forskjellig fra fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

WO-A1-9607740 beskriver monoklonalt anti-D antistoff. Heller ikke dette materialet fremstilles ved en fremgangsmåte som ligger nær fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

I Transfusion, oktober 1995, bind 35, nr. 10S, s. 13S, Van Holten, R.W. et al. anvendes en 180kD membran med veldefinert poredistribusjon for å fjerne virus fra humane plasmaderivater. Anti-D immunogiobulin resuspenderes i en buffer slik at IgG molekylene passerer uhindret gjennom membranen mens virus holdes tilbake. Også denne fremgangsmåten adskiller seg betydelig fra fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen innbefatter filtreringsprosessering og viral fjerning av et farmasøytisk preparat av et immunogiobulin.

Ved forebygging av hemolytiske sykdommer hos nyfødte blir moren injisert med Rho

(D)-immunoglobulin av human opprinnelse. Et slikt produkt er RhoGAM®, tilgjengelig fra foreliggende søker, og det fungerer ved å forebygge at den uimmuniserte Rho (D)-negative moren responderer på Rho (D)-antigen tilstede på røde blodlegemer og "mottatt" fra et Rho (D)-positivt spebarn. Ved således å forebygge anti-Rho (D)-produksjon av moren, blir det etterfølgende Rho (D)-positive spebarnet til denne moren beskyttet mot hemolytisk sykdom hos den nyfødte. Selv om dette vellykkede produktet nå produseres ved en Cohn-alkoholfraksjoneringstypeprosess, har flere forsøk å anvende alternative fremgangsmåter for å fremstille lignende materialer for dermed å tilveiebringe et økonomisk mer fordelaktig produkt, for å redusere store krav til plasma. Slike undersøkelser er blitt rapportert av Hoppe et al. i "Prevention of Rh Immunization Modified Production of IgG Anti-Rh For Intravenous Application By Ion Exchanged Chromatography", Vox Sang, 25:308-316, 1973) og Friesen et al. i "Column Ion-

Exchange Preparation and Characterization of an Rh Immune Globulin for Intravenous Use", Journal of Applied Biochemistry, 3,164-175 (1981).

Hoppe i Tyskland og Friesen i Kanada anvendte begge en DEAE-Sephadex kromatografisk kolonne i forbindelse med et fosfatbufret eluderingsmiddel. Hoppes løsning av anti-D som inneholdt plasma var fra frivillige som passerte en HB Ab-laboratorietest i minst seks måneder, hvor plasmaet ble lagret i mellomtiden. Således anvendte Hoppe et relativt sikkert, ikke-infisert plasma til å starte med. Imidlertid ble ingen ytterligere tester kjørt for å bestemme effektiviteten til DEAE-Sephadex hepatitis B overflateantigenet. Hoppes bekymring var i stedet rettet mot fjerning av de aggregerte materialene og isoleringen av et ufragmentert immunoelektroforetisk rent IgG som har en relativt høy antistoffkonsentrasjon. Friesen-publikasjonen beskriver en modifikasjon av Hoppe-fremgangsmåten for å utvikle en intravenøs Rh IgG for anvendelse i Kanada. Som Hoppe hadde gjort, testet Friesen hver enhet av Rh-plasma for HG Ag for å eliminere eventuelle donorer som testet positivt. Friesen anvendte radioimmunoundersøkelseskitet fra Abbott Laboratories, Nord-Chicago, ILL (Ausria I Kit). Denne testen er fremdeles ansett som en av de mest sensitive og ble også anvendt ved utviklingen av oppfinnelsen beskrevet senere. Friesen rapporterte at kliniske forsøk viste at materialet som ble produsert ved anvendelse av DEAE-Sephadex harpiks/fosfatbufferkombinasjon var effektiv og sikker for å forebygge Rh-immunisering. Friesen rapporterte imidlertid ingen ytterligere tester for å bestemme effektiviteten til DEAE-Sephadex/fosfatbufferkombinasjonen for fjerning av hepatitt B overflateantigen fra plasmaprøvene. Dette er i det minste fra regjeringen i USA sitt synspunkt særlig viktig siden radioimmunoundersøkelsestesten anvendt i screening av donorplasmaprøvene ikke er i stand til å detektere konstruksjoner av HB AG-partikler to eller tre størrelsesordener lavere som fremdeles kan være infisert. Det er denne bekymringen for potentiell infeksjon av et reagens produsert ved en slik fremgangsmåte som gjør at USAs regjering er blitt signifikant mer restriktiv når det gjelder å tillate produksjon av injiserbart immunogiobulin i reagenser ved fastfasemetodologier.

RhoGAM® Rho (D)-immunoglobulin (humant) var den første vellykkede profylaktiske anvendelsen av spesifikt antistoff for å oppnå antistofformidlet immunsupresjon. RhoGAM® er en IgG-immunoglobulinløsning som inneholder anti-Rho (D) ved en dose på 300 mikrogram anti-D aktivitet pr. dose. RhoGAM® kan gis til ikke-immunisert Rho (D)-negativ gravid kvinne på en passende tid for å forebygge fremtidig sykdom i hennes Rho (D)-positive avkom. Sykdommen kalles hemolytisk sykdom hos den nyfødte, eller mer spesifikt, Rh-erytroblastose fetalis.

En mindre dose anti-Rho (D), MICRhoGAM® Rho (D)-immunoglobulin (humant) mikrodose (50 mikrogram anti-Rho (D)) selges også av foreliggende søker for behandling av kvinner som har aborter eller mislykkede svangerskap tolv uker på vei eller tidligere. Mens den fulle dosen beskytter mottakeren for opptil 15 ml Rho (D)-positive røde blodlegemer, tilveiebringer den mindre dosen beskyttelse opp til 2,5 ml Rho (D)-positive røde blodlegemer. RhoGAM® anvendes som antenatal profylakse ved 26 til 28 ukers svangerskap. Andre indikasjoner inkluderer behandlet abort ved et hvilket som helst stadium i svangerskapet med fortsettende graviditet, abort eller terminering av graviditet ved eller i løpet av 13 ukers svangerskap, abdominal trauma eller genetisk amniocentese, kronisk villussampling (CVS) og perkutan umbilikal blodsampling (PUBS).

De fleste immunoglobulininjiserbare materialene godkjent for anvendelse av FDA og "Bureau of Biologics" er blitt fremstilt ved alkoholfraksjoneringsprosedyre utviklet av Dr. E. Cohn ved Harvard i løpet av 1940-årene og beskrevet i Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68,459 (1946). Denne prosedyren koblet med omhyggelig seleksjon av plasma negativt for hepatittinfektivitet, HIV, og andre blodbårede patogener bestemt av de mest sensitive testene som er tilgjengelige, er blitt utviklet for en så lang tidsperiode at USAs regjerning har tatt den posisjonen at de anser kun det resulterende produktet av denne prosedyren som sikkert. At produktene som fremstilles ved denne prosedyren i seg selv er trygge, kan enkelt demonstreres ved millioner av ikke-infiserte mottakere av produktet.

Flere vanlige fremgangsmåter for separering av gammaglobulin fra humant serum er blitt beskrevet inngående av Baumstart et al. i "A Preparative Method For The Separation of 7S Gamma Globulin From Human Serum", Archives of Biochemistry and Biophysics, 108, 514-522 (1964) og av A. Webb i "A 30-Minute Preparative Method For Isolation Of IgG From Human Serum", Vox Sang, 23:279-290 (1972). Selv om begge disse publikasjonene er mer opptatt av separasjonen og seleksjonen av forskjellige gammaglobulinklasser fra et serum som inneholder flere andre forurensende proteiner, adresserer de også fjerning av forurensende proteiner og materialer fra den opprinnelige serumprøven. Begge anvender et DEAE-Sephadex kolonnekromatografisk materiale med et fosfatbufret elueringsmiddel. Begge publikasjonene har i noen grad suksess når det gjelder fjerning av kontaminerende proteiner, imidlertid feiler begge når det gjelder problemet med å fjerne kontaminerende hepatittviralpartikler for å tilveiebringe et sikkert injiserbart reagens.

Det er formålet med den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe virus fjernet, rent immunogiobulin for injeksjon. Et slikt i det vesentlige rent produkt fremstilles ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Det er et videre formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe en produksjonsprosess for rensing av immunogiobuliner som er rimelige med hensyn til tidsforbruk, kvadratmeter og proteinutbytte.

Filtreringen som anvendes ifølge oppfinnelsen gjøres med en siktretensjonsmekanisme avhengig av størrelsesforholdet mellom viruset og gjennomsnittlig filterporestørrelse. Effektiviteten blir ikke påvirket av filtreringsbetingelsene temperatur, ionestyrke, virustitrervæske, trykk, pH, overflatespenning og andre variabler. Mens den påvirker evnen av IgG-partiklene til å passere gjennom filteret, påvirker ikke detergent og ionestyrkebetingelsene til oppfinnelsen viral fjerningen. Studier som er utført av søkeren har vist at buffersammensetningen som anvendes har minimal effekt på viruspartiklene med hensyn til viralinaktivering og viralkappefj eining.

Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen resulterer i et i det vesentlige rent immunogiobulin. Immunoglobulinet kan være en monoklonal eller polyklonal immunogiobulin, for eksempel monoklonalt eller polyklonalt anti-D immunogiobulin, mer spesielt RhoGAM® eller MICRhoGAM®.

Immunoglobulinformuleringen som også ifølge oppfinnelsen innbefatter fra ca. 4,0 vekt-% til 6,0 vekt-% immunogiobulin, fra ca. 24 til 36 ppm Thimerosol, og fra ca. 80 til 200 ppm polysorbat 80. Mer spesielt innbefatter immunoglobulinformuleringen ca. 5,0 vekt-% immunogiobulin, ca. 33 ppm Thimerosol og ca. 100 ppm polysorbat 80.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av en i det vesentlige ren, virusfri globulær proteinformulering, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: (a) blanding av en proteinfraksjon isolert fra humant plasma med en buffer av høy ionestyrke på 150 mM ± 20 % inneholdende en ikke-ionisk detergens; (b) utførelse av nanofiltrering på blandingen ved anvendelse av et nanofilter som har en nominell porestørrelse på mindre enn 30 nm; og (c) oppsamling av permeat fra nanofiltreringen, hvor nevnte permeat er et i det vesentlige rent, virusfritt protein, hvor proteinet har en molekylvekt på cirka 180 kg dalton eller mindre.

Nanofiltreringen innbefatter anvendelsen av et første nanofilter som har en cutoff-rating på mindre enn ca. 30 nm, foretrukket ca. 12 nm. Filtreringen kan ytterligere innbefatte anvendelsen av et andre nanofilter som har en cutoff-rating på ca. 10.000 K til ca. 60.000 K, foretrukket ca. 50.000 K, som fjerner metanol, konsentrerer proteinet og bytter ut bufferen til det som er best for produktstabiliteten. En slik buffer er for eksempel en buffer med lav ionestyrke, for eksempel 50 mM NaCl glycinbuffer.

Oppfinnelsen kan også anvendes ved en fremgangsmåte for fremstilling av et i det vesentlige rent anti-D antigen som innbefatter følgende trinn: (a) resuspendere presipitat II fra fraksjonert humant plasma; (b) blande sammen resuspendert presipitat II med prosesshjelpemidler; og (c) utføre nanofiltrering på immunoglobulinet. Prosesshjelpemidlene innbefatter en buffer med høy ionestyrke og en ikke-ionisk eksipient; hvor bufferen med høy ionestyrke innbefatter 150 mM NaCl glycinbuffer og den ikke-ioniske eksipienten innbefatter polysorbat 80.

Fremgangsmåtene kan også omfatte et trinn (d) som gjelder konsentrering av immunglobulin ved anvendelse av et nanofilter som har en cutoff-rating på ca. 50.000 K. Dette trinnet bytter også ut bufferen med høy ionestyrke med buffer med lav ionestyrke, for eksempel 50 mM NaCl glycinbuffer. Fig. 1 er et flytskjema som viser fraksjoneringsprosessen av humant plasma for å oppå anti-Rh globulin. Fig. 2 er en skjematisk tegning som viser Viresolve/ultrafiltreringssystemet anvendt i den virale fjerningsprosessen ifølge oppfinnelsen. Fig. 3 A er en skjematisk fremstilling av Viresolve-180 systemet slik det er satt sammen for sammenligningseksempel 3 som sammenligner lavionestyrkebuffer og polysorbat-80. Fig. 3B er en skjematisk fremstilling av det rekonfigurerte Viresolve-180 systemet etter avslutning av strørrmmgsekskursjonsdelen av sammenligningseksempel 3. Fig. 4 er en graf som viser siktingskoeffisienten mot strømningen for immunogiobulin G i lavionestyrkebuffer i strømnm<g>sekskursjoriseksperimentet i sammenligningseksempel 3. Fig. 5 er en graf som viser siktingskoeffisienten mot volum filtrert fra immunogiobulin G i lavionestyrkebuffer i reduksjonsvolumeksperimentet i sammenligningseksempel 3.

Den foreliggende oppfinnelsen anvender en kombinasjon av høy (rundt det fysiologiske området) ionestyrkebuffer og en ikke-ionisk eksipient som prosesshjelpemidler i løpet av viral reduksjon eller viral fjerning av et stort biomolekyl. Oppfinnelsen beskriver et eksklusjonsnanofilter med liten porestørrelse for å bli anvendt med et globulært proteinmolekyl slik som et immunogiobulin uten nevneverdig utbyttetap og uten signifikant forandring i irnmunoglobulinunderklasse, aggregatnivå eller stabilitet. Den høye ionestyrkebufferen og eksipienten anvendes kun som prosesshjelpemidler og kan reduseres ved nanofiltrering etter prosessen. Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen gir et produkt som er i det vesentlige fritt for virus. Virus fjernet ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen (størrelseseksklusjon) sikrer at alle potentielle kategorier av virus, både innkappede (for eksempel HIV, Hepatitis B virus) og ikke-kappede (for eksempel Hepatitis A virus, Parvovirus Bl9) fjernes fra produktet.

Fordelene ved prosesshjelpemidlene ifølge oppfinnelsen inkluderer (1) prosesstiden blir sterkt redusert og ledsagende utbytte blir større, siden prosesshjelpemidlene skifter likevekten bort fra proteindimeren, trimeren og aggregatdannelse, hvilket gjør at produktet dannes ved en økt proteinkonsentrasj on, (2) muligheten til å anvende mindre porestørrelsesmembraner som gir større forsikring om viral fjerning av mindre ikke-kappede virus, (3) immunoglobulinet føres gjennom membranen uten at dette påvirker IgG-underklasse eller stabilitet, og (4) prosessutstyr og derfor tilveiebringelse av gulvplass kan optimaliseres for høyest produktutbytte pr. filterareal.

De store molekylene behandlet i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen

inkluderer store globulære proteiner slik som albumin, immunogiobuliner (for eksempel IgG og fragmenter derav), blodkoaguleringsfaktorer slik som faktorene VIII, DC og XI, veksthormoner, apolipoproteiner, enzymer (for eksempel strepokinase), hvor alle av de ovenfor nevnte er enten naturlig forekommende eller genmodifisert.

Porestørrelsen til nanofiltreringsenhetene som anvendes ved fremstilling av i det vesentlige rene, virusfrie immunoglobulinfrie produkter som oppnås ifølge oppfinnelsen er mindre enn ca. 30 nm, mest foretrukket mindre enn ca. 15 nm. Imidlertid kan en hvilken som helst membran som har filter-cutoff-nivå tilstrekkelig til å redusere eller eliminere ikke-kappet virus fra en proteinløsning anvendes ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan Viresolve-180 (Millipore Corporaion, Bedford, MA) enhet anvendes, hvor en slik enhet har en molekylvektporestørrelse på mindre enn ca. 180 KD molekylvekt eller ca. 12 nm. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er også tiltenkt anvendelsen av 70 KD nanofilterporestørrelsesenheter som vanligvis anvendes ved filtrering av små rekombinante proteiner, cytokin- og lymfokinprodukter så vel som blodfraksjoneirngsprodukter.

Den foreliggende anvendelsen av en ikke-ionisk eksipient som et nanofiltreringshjelpemiddel er ny. De ikke-ioniske eksipientene anvendt ved oppfinnelsen inkluderer vinylpolymerer, polyoksyetylen-polyoksypropylenpolymerer eller kopolymerer (Pluronics®, polysakkarider, proteiner, poly(etylenoksid), og akrylamidpolymerer og derivater eller salter derav. Det er å forstå at poly(etylenoksid) inkluderer polyetylenglykol. Vinylpolymerene som anvendes ved oppfinnelsen kan velges ut fra gruppen som består av polyakrylsyre, polymetakrylsyre, polyvinylpyrrolidon og polyvinylalkohol. Polysakkaridene anvendelige ved oppfinnelsen kan velges ut fra gruppen som består av cellulose eller cellulosederivater, glykosaminoglykaner, agar, pektin, algininsyre, dekstran, stivelse og kitosan. Glykosaminoglykanene kan velges ut fra gruppen som består av hyaluronsyre, kondroitin og beslektede molekyler. Proteinene anvendelige ved oppfinnelsen kan velges ut fra gruppen som består av gelatin og fibronektin. Selv om noen av materialene angitt ovenfor ikke passerer gjennom et nanofilter, kan deres tilstedeværelse på retentatsiden derav være tilstrekkelig til å oppnå formålet ved den foreliggende oppfinnelsen.

Cellulosederivatene kan inkludere alkylcellulose og hydroksyalkylcellulose, for eksempel metylcellulose, hydroksyetylcellulose, karboksymetylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose og hydroksypropylcellulose.

Mest foretrukket for nanofiltrering av globulære proteiner i henhold til oppfinnelsen er ioniske detergenter, ikke-ioniske detergenter med polyoksyetylen eller sukkerhodegrupper, lysofolipider, og gallesalter og kombinasjoner derav. Særlig foretrukket er de ikke-ioniske polyoksyetylendetergentene for eksempel polysorbatene, Pluronics, Brij, Sterox-AJ, tritoner og Tweens. Mest foretrukket er polysorbat 80.

Den ikke-ioniske eksipienten anvendt ved oppfinnelsen kan være tilstede i proteinløsningen til å begynne med i fremgangsmåten i området på fra ca. 0,015 g/l til ca. 0,024 g/l, mest foretrukket ca. 0,02 g/l eller 20 ppm. Slike konsentrasjoner av eksipient i løpet av prosessen bestemmes slik at den ikke påvirker viralfjerningen. Særlig foretrukne ikke-ioniske eksipienter er polysorbat 80, som anvendes mest foretrukket i løpet av prosessen i en konsentrasjon på 0,002% eller 20 ppm for prosessen. Dette området er ved eller innenfor den kritiske micellekonsentrasjonen for polysorbat 80. Ved bestemmelse av konsentrasjoner for andre eksipienter kan rettledning finnes i kunnskapen om den kritiske micellekonsentrasjonen for eksipienten. Mengdene eksipienter angitt i dette avsnittet er spesifikke for anti-D immunogiobulin, imidlertid er det tiltenkt at nevnte mengder vil være anvendbare for andre formuleringer av IgG, for eksempel immunserumglobulin (menneske og hest) og hepatitt B immunglobulin. Den endelige eksipientkonsentrasjonen i produktet kan være opp til ca. 0,1-0,2 vekt-%; mer foretrukket ca. 80-200 ppm, mest foretrukket, i tilfellet polysorbat 80, ca. 100 ppm. Generelt vil mengdene av eksipient tilstede i sluttproduktet være tilnærmet lik for alle IgG-molekyler som administreres i tilnærmet lik dose. En ytterligere fordel er anvendelse av en eksipient som er et skumdemperhjelpemiddel i løpet av filtreringsprosessen.

Humant plasma anvendt i forbindelse med oppfinnelsen kan oppnås ved fremgangsmåten til Cohn et al. ("Cohn-prosessen"), referert til ovenfor, ved batch eller kolonnebytterkromatografi, eller ved affinitetskromatografi.

I fremgangsmåten hvori presipitat II (fra Cohn et al.-prosessen) materialet fortynnes til ca. 4,6-5,0 mg/ml (ca. 0,5%) og som senere må konsentreres ti ganger ved ultrafiltrering, er det viktig å anvende en lav begynnerkonsentrasjon av eksipient; eksipientkonsentrasjon i området angitt ovenfor og foretrukket ca. 0,002% vil ikke gi vesentlig negativ påvirkning av prosessen. Slik ugunstig effekt kan for eksempel være med kappet virus, dissosiering av viruset fra dets kappe og passasje av viruspartikler inn i filtratet. Studier utført av søkerne ved anvendelse av vesikulær Stomatitis-virus, et kuleformet, kappet RNA-inneholdende virus, viste at ved konsentrasjonene av eksipient anvendt ifølge oppfinnelsen (100 ppm eller 0,01% ved 5X for prosessen) fant ingen vesentlig virusaktivering sted.

Proteinkonsentrasjonen som anvendes ved utførelsen av den foreliggende oppfinnelsen vil være i området fra ca. 0,1 vekt-% til ca. 1 vekt-%. Opp til ca. 1 vekt-% kan anvendes hvor proteinmaterialet er monomerisk eller monoklonalt. For presipitat II-immunoglobulin er den begynnende proteinkonsentrasj onen anvendt i prosessen ca. 4,6-5,0 mg/ml (ca. 0,46-0,5%).

Cohn, US-patent nr. 2.390.074, beskriver en fremgangsmåte for fraksjonering av blod hvorved gammaglobuliner fremstilles. Gammaglobuliner fremstilt ved Cohn-metoden inneholder 19 S globulin, plasminogen og lipider. Mens dette gammaglobulinet er svært egnet for profylakse ovenfor sykdommer slik som meslinger og tetavius, er tilstedeværelsen av 19 S globulinet, plasminogenet og lipidene unødvendige forurensninger og kan nedsette effektiviteten ved å hindre immunisering av Rh-faktoren på fostererytrocyttene.

I det vesentlige rent anti-Rh globulin fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir fremstilt fra humant plasma som inneholder albumin, plasminogen, alfa, beta og gammaglobuliner og forskjellige lipider. Spesifikt er anti-Rh globulinet et gammaglobulin.

Fraksjoneringen av humant plasma for å oppnå anti-Rh globulin utføres ifølge fremgangsmåtene angitt i US-patent nr. 3.449.314 til Pollack et al. Med referanse til det ledsagende flytskjemaet i flg. 1 er evnen til å fraksjonere humant plasma avhengig av løseligheten av de forskjellige komponentene i plasmaet. I hvert trinn i fraksjoneringen er separasjon av fraksjonen og til sist fjerning av de komponentene som er uønsket i anti-Rh globulinet bestemt av den kritiske kontrollen av pH, temperatur, konsentrasjon av presipitanten og ionestyrken til systemet.

Forskjellige organiske løsemidler med lav dielektrisk konstant, slik som aceton og alkoholer, presipiterer proteiner og er blitt anvendt ved fraksjonering av plasma. De organiske løsemidlene som anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen inkluderer forskjellige alkoholer og aceton, foretrukket metanol. Metanol er foretrukket på grunn av dets lave toksisitet og sikre håndtering (for eksempel eksplosjonsfare) sammenlignet med andre organiske løsemidler.

For å hindre denaturering av proteinene i løpet av fraksjoneringen blir presipitasjonen utført ved lave temperaturer. Siden proteinløselighet er temperaturavhengig, må temperaturen som velges for hvert trinn av fraksjoneringen være den lavest mulige som tillater den ønskede separasjonen for å hindre denaturering.

Med referanse til flytskjemaet i flg. 1, forløper fraksjoneringen fra helt humant plasma. Plasmaet avkjøles til ca. 1°C og blir deretter sentrifugert for å separere et kaldt uløselig presipitat fra en supernatant. Supernatanten blir videre fraksjonert for å gi presipitat I og supernatant I. Presipitat I som i prinsippet består av fibrinogen blir kastet. Supernatant I blir videre fraksjonert for å gi supernatant II+III og presipitat II+III. Supernatant II+III, som kastes, inneholder alfa- og betaglobulin og lipider. Presipitat II+III består i prinsippet av beta- og gammaglobuliner og isoagglutininer, men inneholder også protrombin, plasminogen, kolesterol og andre lipider. Presipitat II+III, etter ytterligere fraksjonering gir supernatant II+III W og presipitat II+III W. Betaglobulinet, kolesterol og andre lipider blir stort sett fjernet i supernatant II+III som kastes. Presipitat II+III W består i prinsippet av gammaglobuliner, isoagglutininer, plasminogen og protrombrin og noe betaglobulin, kolesterol og andre lipider. Etter ytterligere fraksjonering gir presipitat II+III W supernatant III + presipitat III. Presipitat III, som kastes, inneholder isoagglutininer, plasminogen og protrombin. Supernatant III består i prinsippet av gammaglobuliner og mindre mengder fibrinogen og lipider. Det siste trinnet i fraksjoneringen gir presipitat II som i det vesentlige er ren gamma G globulin nesten fullstendig fritt for 19S globulin, plasminogen og lipider. Presipitat II fremstilt ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er et anti-Rh gammaglobulin.

I foretrukne fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen er immunogiobulin utgangsstoffet for resuspensjon av presipitat fl-pasta fra den modifiserte Cohn-prosessen. Lyofilisert presipitat II-pasta kan anvendes hvis proteinet blir lyofilisert under nærvær av eksipient ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

Det flytende fortynningsmidlet som anvendes for å resuspendere presipitat II-pastaen ifølge oppfinnelsen inkluderer de farmasøytisk akseptable fortynningsmidlene valgt fra injeksjonsvann, U.S.P. ("W.F.I."), normalt saltvann U.S.P., eller en hvilken som helst av et antall egnede bufre, hvor sistnevnte gir fordelene ved å gi en stabil pH. Egnede bufre er de som velges fra gruppen som består av fosfatbufre, sitratbufre, boratbufre, acetatbufre og glycinbufre ved en pH på ca. 6,4. Foretrukket er den begynnende fortynningen tre ganger pasta i forhold til vekt av W.F.I. som senere fortynnes i buffer med høy ionestyrke før den første nanofiltreringen. Også egnet som begynnende fortynningsmiddel er bufferen med høy ionestyrke tiltenkt heri. Foretrukket anvendes en ionestyrke på 150 mM +/- 20%, foretrukket 150 mM +/- 20% NaCl glycinbuffer; pH 6,4.

I løpet av fremgangsmåten og filtreringen av immunoglobulinene ifølge oppfinnelsen er en høy ionestyrkebuffer foretrukket anvendt som et prosesshjelpemiddel for å redusere dimer- og trimerdannelsen av immunoglobulinet, hvilket gjør det mulig med en mer fullstendig passering gjennom filteret. Egnede fortynningsmidler av høy ionestyrke er de som er angitt ovenfor for resuspensjonsfortynningsmidler, imidlertid ved en relativt høyere ionestyrke og ved en pH på ca. 6,4. Foretrukket er slike prosesshjelpemidler tilstede ved en ionestyrke på ca. 150 mM +/- 20% konsentrasjon mest foretrukket, hvilket er tilnærmet fysiologisk ionestyrke. I den mest foretrukne utførelsesformen av den foreliggende oppfinnelsen er prosesshjelpemidlet med høy ionestyrke 150 mM NaCl-glycinbuffer, pH 6,4.

Ved behandling av immunoglobulinet kan den ikke-ioniske eksipienten vanligvis blandes sammen med bufferen med høy ionestyrke ved begynnelsen av filtreringstrinnet i prosessen. Referanse gjøres i dette henseendet til eksempel 2A og 3 A for fremstilling av buffer med høy ionestyrke som inneholder polysorbat 80. Prosesshjelpemidlene som anvendes ved oppfinnelsen kan justeres relativt til hverandre slik at ionestyrkeinnholdet kan reduseres hvis polysorbat 80-konsentrasjonen økes.

Konserveringsmidler kan anvendes i de farmasøytiske produktene som fremkommer ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Foretrukne konserveirngsmidler er de farmasøytisk akseptable konserveringsmidlene slike som trimerosol og natriumazid, hvor førstnevnte kan anvendes ved 26-36 ppm, i denne oppfinnelsen, 33 ppm (0,003%). Imidlertid er det i immunoglobulinformuleringene oppnådd ifølge oppfinnelsen, og særlig RhoGAM®- og MICRhoGAM®- formuleringene som er designet for enkelanvendelse, parenteraler, ikke nødvendig å anvende konserveringsmidler.

I proteinkonsentrasjons- og det organisk løsemiddeltjemingstrinnet i henhold til oppfinnelsen kan for eksempel anvendelse av et andre nanofiltreirngsfilter med liten porestørrelse, for eksempel et filter fra ca. 10.000 K opp til ca. 60.000 K cutoff, for eksempel Biomax-50 (50.000 K cutoff) filter (Millipore Corporataion, Bedford, MA) filter, kan bufferen med høy ionestyrke valgfritt byttes med en med relativt lav ionestyrke, for eksempel 50 mM buffer. Dette protrinkonsentrasjonstrinnet gjøres for å konsentrere nanofiltrert proteinprodukt samtidig som det fjernes noe av eksipienten og det organiske løsemidlet.

I løpet av filtreringen ved anvendelse av Viresolve-180 membransystemet er det transmembrane trykket foretrukket i området fra c. > 0 til ca. 20,7 kPa (3,0 psi), mest foretrukket mindre enn ca. 10,32 kPa (1,5 psi). Siktekoeffisienten vil foretrukket være større enn ca. 60%.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan bli utført ved omgivelsestemperaturer. Å utføre fremgangsmåten ved kjøleskapstemperatur vil generelt forlenge filtreringstiden, idet slike temperaturer (for eksempel 16-17°C) generelt vil øke viskositeten. Temperaturen til produktene i løpet av bearbeidingen kan være fra ca. 0°C til like over ca. 45°C, mer foretrukket fra ca. 15-30°C, mest foretrukket ca. 20-25°C.

Følgende begreper som anvendes heri har følgende betydninger:

I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, og med referanse til fig. 2, forløper produksjonsskalabearbeiding som resulterer i det vesentlige i rent (viralfjernet) immunogiobulin, for eksempel RhoGAM®, ved nanofiltrering som følger: Rho (D) immunogiobulin renses til trinn "Precipitat II pasta" ved anvendelse av Cohn-rensingsmetoden (Cohn et al., J. Am. Chem. Soc, vol. 68, s. 459-475), hvori metanol erstattes med etanol, resuspendert i vann for injeksjon (WFI), U.S.P. avkjølt til fra 2-8°C. Volumet av W.F.I. beregnes ved anvendelse av følgende formel:

Presipitat II vekt (kg) x 3 l/kg = påkrevet Vol. av W.F.I. (L)

Hver kilo presipitat II pasta resuspenderes i 3 1 W.F.I.

Blandingen roteres (ingen skumming) i 3-8 timer i Hold Tank-produkt (1) og lagres ved 4°C inntil videre anvendelse. "Steam in place" (SIP) fremgangsmåte utføres på det virale fjerningssystemet, som innbefatter installering av en Viresolve CIP/SIP-modul (Millipore Corporation, Bedford, MA) inn i viral fjemingsfilterholder (2) og en Pellicon CIP/SIP-modul (Millipore Corporation, Bedford, MA) på ultrafiltreringsfilterholderen (3). CIP/SIP-fremgangsmåten utføres også på systemet og 50 mM NaCl-glycinbufferlagringstank (4).

"Clean in Place" (ClP)-prosedyren er en fremgangsmåte for å vaske prosessutrustning

uten å ta fra hverandre utstyrsdelene. Kravene til utstyret omfatter at alle rør er i rustfritt stål, er i tilfredsstillende orden og innstilt og har et minimum antall pakninger. Formålet ved CIP er å eliminere manuell vasking og krysskontarninering og tap. Fremgangsmåten kan valideres. Rengjøringselementer inkluderer tid, temperatur, kjemikalier og

mekaniske parametre. Residutypen som er igjen etter fremgangsmåten vil bestemme vasken som skal anvendes i CIP-prosessen. En fagmann i farmasi er kjent med fremgangsmåten og utstyret som anvendes i CIP.

Ved å følge CIP-prosedyren blir en Viresolve-180 modul, 20 stabel (2) for ca. 401 volum av resuspendert presipitat II volum installert i stedet for Viresolve CIP/SIP modul (2). (Et 10 stabel Viresolve-180 filter anvendes for 10-161, og et 20 stabel for

> 16-401 endelig produktvolum). Fire Biomax-50 kassetter (Millipore Corporation, Bedford, MA) installeres i stedet for Pellicon CIP/SIP modul (3). To Biomax-50 kassetter anvendes med 10-161 resuspendert presipitat II volum, fire kassetter anvendes for > 16-401 volum. Viresolve-180 modulen desinfiseres med klor og renses til < 0,3 ppm klor er tilstede igjen bestemt ved dietylfenylendiamin (DPD)-prosedyren.

En trykkholdtest utføres på modul (2) etter desinfiseringen. Modulen må motstå minimum 68,9 kPa (10 psi) og vise et trykkfall på < 6,89 kPa (1) psi i løpet av 5 minutters testeperiode.

Biomax-50 membranene (3) skylles med WFI, U.S.P. Bestemmelse av benzalkoiumklorid (Roccal) utføres på en ferdig permeabel strømningsprøve; hvor benzalkoniumkloridinnholdet må være < 10 ppm. En diffusjonstest utføres på Biomax-50 kassettene; frigivningsraten beregnes som følger:

Frigivningsrate må være < 18 cc/rnin./kassett.

En vkalfjernmgsultraflltrering ved anvendelse av en Viresolve-180 (2) utføres på 50 mM NaCl-glycinbufferen. Virdfjernmgsresirkuleringstanken (T-l) (5) tilsettes 50 mM NaCl-glycinbuffer. Maksimalt 2501 blir tilsatt med et minimum på 1301.

Bufferen resirkuleres i T-l (5) samtidig som bufferpermeat samles opp i en tank off-line.

Viralfjerningsresirkuleringstanken T-l (5) tilsettes minimum 601 av 150 mM NaCl-glycinbufferen for å spyle tanken og membranen.

Presipitat II-resuspensjonen blir behandlet som følger. Presipitat II blandes ved en rate som danner en virvel uten å skumme i 15-30 minutter til fullstendig suspendering. Prosent protein ved refraktiv indeks (mg/ml protein) utføres ved anvendelse av et håndholdt protometer på presipitat II-resuspensjonen. Det påkrevde sluttvolumet av fortynnet presipitat II for å oppnå 5,0 mg/ml proteinkonsentrasjon beregnes ved anvendelse av følgende formel:

Det påkrevde volumet av 150 mM NaCl-glycinbuffer beregnes ved anvendelse av følgende formel:

Buffer blir tilsatt for å fortynne presipitat II og blandet i en hastighet tilstrekkelig til å danne en virvel uten å skumme i minst 30 minutter. Den sammenblandede løsningen lagres ved 15-30°C i maksimalt 2,5 timer før ytterligere bearbeiding.

Batchen til det fortynnede presipitatet II blir tilsatt til den virale fjerningsresirkuleringstanken (T-l) for ultrafiltrering. TMP-startpunktet blir satt på ca. 3,0. Imidlertid kan det gå enda høyere, men hvis det når ca. 12, kan imidlertid membranen polariseres og retentatet bør vaske membranen (ved å redusere permeatet). Viresolve-startpunktet beregnes som følger:

Hvis resultatet ovenfor er < 50, ble 50 satt inn som Viresolve-mvåstartpunktet. 1/3 av totalvolumet avrundes til den nærmeste hele L.

Ultrafiltrermgskonsentrasjonsslutrpunktet ble beregnet som følger:

Hvis resultatet ovenfor er < 20, blir 20 satt inn som konsentrasjonssluttpunkt. Ullrafiltrermgsdiaflltrermgssluttpunktet beregnes som følger:

Konsentrasjon sluttpunkt - 3 = Diaf. sluttpunkt

Diaflltreringstotaltsettpunkt beregnes som følger:

Konsentrasjon sluttpunkt x 5,5 = diafiltreirngstotalt startpunkt (L)

For å starte ultralfiltrermg/konsentrasjonsprosessen, blir Viresolve-180 iMmatningspumpe (Pl) (7) raten satt til 75-83% for 20-stabelen, eller 37-42% for 10-stabel filtreringsstørrelsen. TMP-kontrollen kobles til; TMP kontrolleres ved raten på permeatpumpen (P2); hvis transmembrantrykket går til 2,0, vil pumpen redusere raten. Viresolve-permeatpumpe (P2) (8) raten blir satt forsiktig opp til 18%, eller 9% for 10-stabel filtrene. Idet P2 stenges, blir retentattrykket (P3) på > 34,5 kPa (5,0 psi) opprettholdt. Idet TMP likevektsinnstilles, blir pumperateområdet satt til 9-11% for 10-stabel filtre; 18-23% for 20-stabel filtre. TMP-trykket blir imidlertid ikke kontrollert; imidlertid er det foretrukket relativt lavt, for eksempel på ca. mindre enn 20,7 kPa (3,0 psi), eller kan membranen bli polarisert. Skulle TMP bli høyere, for eksempel rundt 82,7 kPa (12 psi), kan permeatet stoppes slik at retentantet kan vaske membranen. UV-måleren (UV1) (9) bør være mellom den lavere grensen på 4,0 A.U. og den øvre grensen på 7,7 A.U. Permeatstrømmen (FT1) er mellom den lavere grensen på 0,81 l/min. (LPM) og den øvre grensen på 0,98 LPM; mellom 0,40 LPM-0,49 LPM for et 10-stabel filter. Prosesstemperaturen holdes ved ca. 15-30°C. Disse betingelsene overvåkes gjennom virdtjernmgen/ultraiiltreringsprosessen. UV-måleren (UV1) (9) er mellom den laveste grensen på 6,4 A.U. og den øvre grensen på 7,7 A.U. Siktekoeffisienten bør være ca. > 75%.

Når T-2 (6) volumet når ca. 75-100 L, blir Pelliconsystemet (3) montert og blandingen starter. UF-irinmatningspumpen (P5) (10) blir startet/montert, og UF-permeatstrømningsraten kontrollert ved pumpehastigheten. UF-innmatningstrykket (PT4) og UF-retentattrykket (PT5) opprettholdes som følger:

UF-innmatningstrykk: < 206,8 kPa (30 psi)

UF-retentattrykk: < 88,9 kPa (10 psi)

Et differential holdes mellom innmatningstrykk og retentattrykk på < 137,9 kPa (20 psi).

Volumnivåene i den fortynnede presipitat Il-innmatningstanken T-l (5) overvåkes (i forhold til vekt) og responderes til ved belastningsceller på T-l.

Diafiltrering ved konstant volum utføres i T-l (5). Denne diafiltreringen anvendes for å vaske restproteinet gjennom systemet og Viresolve-180 membranen øker dermed utbyttet. En 3X 150 mM NaCl-glycmbufferdiafiltrering utføres; en startmengde buffer tilsettes ved samme hastighet som den blir fjernet med gjennom Viresolve-180 permeatet. Idet diafiltreringstrinnene er ferdige, blir T-l (5) og Viresolve-180 modulen (2) desinfisert som beskrevet tidligere ved anvendelse av klorprosessen, som sikrer at eventuelle virus som finnes blir inaktivert. Bulken i T-2 (6) konsentreres ved diafiltrering ved konstant volum i T-2 (6), med viralfjernet 50 mM NaCl-glycinbuffer. Dette trinnet konsentrerer bulkproduktet og bytter den høye ionestyrkebufferkonsentrasjonen med en lavere ionestyrkekonsentrasjon, fjerner metanolen fra Cohn-prosessen og ca. halvparten av polysorbat-80. Etter at diafiltreringsprosessen er fullstendig, blir nivået i T-2 (6) avlest i liter. En prøve trekkes fra T-2 (6) for å utføre en digital spesifikk konduktansbestemmelse på UV-permeatprøven. Resultatet må falle mellom 4,95-5,67 x 10"<3> mhos/cm. Hvis kravene ikke tilfredsstilles i første test, må diafiltrering ved konstant volum fortsette til testresultatene er innenfor dette påkrevde området.

T-2 nivået etter 5,5 x diafiltreringen bør være < 95% av det resuspenderte presipitat II-volumet. Hvis T-2 nivået er > 95% av det resuspenderte presipitat Il-volumet, må konsentreringen av bulken fortsette til T-2 volumet møter kravet til øvre volumnivå. Idet det øvre volumnivået er tilfredsstilt, blir UF-permeatet slått av (11) og bulken blandet ved resirkulering, og en 10,5 ml prøve fjernet aseptisk (12). Prosent proteinbestemmelse gjøres ved refraktiv indeks ved anvendelse av et håndholdt protometer på en 0,5 ml alikot av prøven. Hvis proteinkonsentrasjonen ikke er minst ca. 5,5%, må prøven ytterligere konsentreres til en slik minimumprosent oppnås. Bulken tas bort til en midlertidig kolbe og bulkvekten beregnes gravimetrisk ved anvendelse av følgende formel:

Bulkjustering kan gjøres ved å bestemme volumet av 50 mM NaCl-glycinbuffer som skal tilsettes for å oppnå endelig bulkvolum ved anvendelse av følgende formel:

Det påkrevde volumet av 50 mM NaCl-glycinbuffer som skal tilsettes beregnes som følger:

En start pH-bestemmelse gjøres på den gjenværende prøvealikoten ved først å fortynne alikoten 1:10 med 0,9% NaCl og titrere til en pH på 6,3-6,4 med 1:100 fortynning av 0,5N HC1 eller 0,5N NaOH.

Hvis justering er påkrevet, blir mengden av ufortynnet 0,5N reagens som kreves for å justere pHen til bulken beregnet som følger:

Integritetstesting utføres på Viresolve-180 filtermodulen i henhold til aksepterte metoder. Integritetstestverdien må være > 1,2, og modulen må være desinfisert med klor som nevnt ovenfor og renset.

0,5N ufortynnet reagens beregnet ved anvendelse av formelen tidligere, og hvis ønskelig, 100X ThimerosoUøsning tilsettes til bulken. Påkrevd mengde Thimerosolløsning som skal tilsettes, hvis ønskelig, beregnes som følger:

50 mM NaCl-glycinbuffer tilsettes til bulken og beregnes ved følgende formel:

Bulken pumpes tilbake til T-2 og fortsetter å blande i T-2 i 10-60 minutter etter at endelig volum oppnås, deretter blir 10,5 ml alikot av bulkprodukt aseptisk fjernet for bestemmelse av pH. pH må være 6,3-6,4. Hvis pH er utenfor dette området, må en alikot fortynnes og titreres til akseptabel pH som tidligere og den påkrevde mengden av ufortynnet 0,5N reagens må beregnes og tilsettes tilbake til bulken under blanding, som tidligere.

Proteinprosenten bestemmes ved refraktiv indeks ved anvendelse av håndholdt protometer som tidligere. Hvis proteinkonsentrasjonen er > 5,0%, som er akseptabel, kan bulken passere gjennom til neste trinn. Hvis proteinkonsentrasjonen er mindre enn den akseptable prosentsatsen, blir bulkproduktet avvist.

Bulken blir valgfritt filtrert gjennom et 0,2 um Optiseal-filter (13), med trykket ikke overstigende 103,4 kPa (15 psi) i løpet av filtreringsprosessen, og deretter blir bulken mikrobiologisk og serologisk testet.

En "clean-in-place"-prosedyre, som består av rensing med WFI og damp, utføres på det virale fjerningssystemet (CIP-prosedyre beskrevet tidligere).

Akseptable kriterier for produktet er angitt i tabell 1.

Adrninistrasjonsrnåten til preparatene som kan oppnås ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan bestemme setene og/eller cellene i organismen som forbindelsen(e) vil bli levert til. Forbindelsene oppnådd ifølge oppfinnelsen kan administreres alene, men vil generelt bli administrert i en blanding med en farmasøytisk bærer eller et fortynningsmiddel utvalgt med henblikk på den tiltenkte administrasjonsmåten og standard farmasøytisk praksis. Preparatene kan injiseres par enter alt, for eksempel intra-arterielt eller intravenøst. Preparatene kan også avleveres oralt, subkutant eller intramuskulært. For parenteral administrasjon kan de for eksempel anvendes i form av en steril vandig løsning som kan inneholde andre bestanddeler, for eksempel tilstrekkelig salt eller glukose for å gjøre løsningen isotonisk.

For oral administrasjon kan EPO-sammensetningene som kan oppnås ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes i form av tabletter, kapsler, pastiller, pulvere, siruper, eliksirer, vandige løsninger og suspensjoner og lignende. I tilfellet tabletter kan bærere anvendes som inkluderer laktose, natriumcitrat og salter og fosforsyrer. Forskjellige desintegrasjonsmidler slik som stivelse og smøremidler, slik som magnesiumstearat, blir vanligvis anvendt i tabletter. For administrasjon i kapselform er anvendelige fortynningsmidler laktose og polyetylenglykoler med høy molekylvekt. Når vandige løsninger kreves for oral anvendelse, kan visse søtnings-og/eller aromamidler tilsettes.

De i det vesentlige rene immunoglobulinene som oppnås kan administreres til et subjekt slik som et pattedyr, som inkluderer menneske. For administrasjon ved behandling av lidelser, vil legen eller veterinæren endelig bestemme den hensiktsmessige dosen for et gitt menneske eller dyr, og denne kan forventes å variere i henhold til vekt, alder og individuell respons så vel som beskaffenheten og alvorligheten til individets symptomer.

I tilfellet i det vesentlige rent anti-D immunogiobulin oppnådd ifølge oppfinnelsen vil pr.-dose dosering variere fra ca. 300 fig for RhoGAM® og til ca. 50 mg for MICRhoGAM®, hvor hver av disse administreres ifølge retningslinjer og for formålet diskutert tidligere og i henhold til litteraturen for hvert respektivt produkt. Hvert av produktene nevnt ovenfor kan også multidoseres, for total levering som må bestemmes av den behandlende lege.

Følgende eksempler er tilveiebrakt kun for å illustrere oppfinnelsen.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1

Fremstilling av viralfjemet RhoGAM® ved ultrafiltrering går som følger.

Rho (D) immunoglubulin 3,250 kg renset til trinn "presipitat II-pasta" ved anvendelse av modifisert Cohn-rensningsmetode (referert til ovenfor) ble resuspendert i 9,7501 vann for injeksjon (WFI), U.S.P. avkjølt til 5°C. Blandingen ble rotert (ingen skumming) i 4 timer og lagret ved 4°C inntil videre bruk. Vekten av resuspendert PPT II var 3,250 kg.

Ved å følge SIP-prosedyren ble en Viresolve-180R modul (Millipore Corporation) (10 stabler) for ca. 13,01 volum av resuspendert presipitat II-volum installert. To Biomax-50 kassetter ble installert i stedet for Pellicon CIP/SIP-modulen. Viresolve-180 modulen ble desinfisert med klor og renset. Biomax-50 membranene ble skyllet med WFI, U.S.P.-bestemmelse av benzalkoniumklorid (Roccal) ble bestemt på endelig gjennomstrømmet skylleprøve; hvor benzalkoniumkloridinnholdet var 6 ppm. En difiusjonstest ble utført på Biomax-50 kassettene; frigivningshastigheten ble beregnet som beskrevet tidligere; totalt volum frigitt var 2 ml i løpet av 5 minutter og den virkelige frigivningshastigheten var 0,4 cc/minutt.

En viralfjermngs-ultrafiltrering ved anvendelse av en Viresolve-180 ble utført på 190,01 av 50 mM NaCl-glycinbufferen. Viralfjernings-resirkuleringstanken (T-l) ble tilsatt 100 150 mM NaCl-glycinbuffer. Bufferen ble resirkulert i T-l under oppsamling av bufferpermeatet i den tidligere desinfiserte 50 mM NaCl-glycinbufferlagringstanken. Volumet av gjennomtrengt oppsamlet buffer var 123,3 1 ved 21,7°C og oppsamlingen var fullstendig i løpet av 50 minutter. Viralt fjernet buffer ble lagret ved omgivelsestemperatur ved ca. 25°C.

En 150 mM NaCl-glycinbuffer (se eksempel 2A) spyling ble utført ved å forbinde bufferinnmatningstanken til den virale fjenungsresirkuleringstanken (T-l). T-l ble tilsatt 601 av 150 mM NaCl-glycinbufferen for å spyle.

Presipitat II-resuspensjonen ble utført som følger. Presipitatet II (3.250 g) ble blandet ved en hastighet som dannet en virvel uten skumming, i 20 minutter, til den ble fullstendig suspendert. Prosent protein med refraktiv indeks (mg/ml protein) ble utført ved anvendelse av et håndholdt protometer på presipitat II-resuspensjonen og var 49 mg/ml (ca. 5,0% protein).

Det påkrevde volumet av fortynnet presipitat II ble beregnet for å oppnå en proteinkonsentrasjon på 5,0 mg/ml:

ELLER

Det nødvendige volumet av 150 mM NaCl-glycinbuffer som inneholder 20 ppm polysorbat 80 (se eksempel IA) ble beregnet ved anvendelse av følgende formel:

ELLER

(127,4 L) -(13,0 L) = 114,4 L buffer som skal tilsettes 114,41 buffer ble tilsatt til 13 1 fortynnet presipitat II og blandet i en hastighet tilstrekkelig til å danne en virvel uten skumming i 45 minutter.

Viralfierrungs-resirkuleringstanken ble tilsatt 100,01 fortynnet Ppt. II. Viralfjernings resirkuleringstanken (pumpe nr. 1) ble startet opp ved en innmatningspumperaten på 40% for 10 stabel Viresolve-180 modulen som anvendes. Viralfjernings permeatpumpestrørningsraten (pumpe nr. 2) ble satt til 0,450 LPM (10,0%) for 10-stabelmodulen for å opprettholde et begynnende transmembrantrykk (TMP) på 11,0 kPa (< 1,6 psi). Det virkelige trykket ble holdt ved 11,0 kPa (1,6 psi). Produktpumpehastigheten (pumpe nr. 3) ble justert til nivåkontroll. TMP ble holdt ved < 20,7 kPa (3,0 psi) gjennom prosessen ved å overvåke proteinkonsentrasjonen på retentatsiden av viralfjemings-resirkulasjonstanken. In-line UV-monitoren ble observert og holdt i et område på 6,4-7,7 absorbansenheter som korresponderer til et proteininnhold på 4,5-5,5 mg/ml.

Etter at ca. 751 permeat fra viralfj erningstanken var tilsatt til ultrafiltreringstanken (UF), ble ultraflltreringsinnmatriingspumpen (pumpe nr. 5) startet opp ved 10%. Pumperaten ble økt (til 30%) til UF-permeatstrømningsraten var lik strømningsraten til virdfierningspermeatet og deretter satt til 25% for å opprettholde volumet. UF-permeatstrømningsraten var 0,4 LPM og VC-permeatstrømningsraten var 0,460 LPM. UF-tankkonstantvolumet som ble opprettholdt var 75,3 1. UF-innmatningstrykket var 37,2 kPa (5,4 psi), UF-peimeattrykket 1,38 kPa (0,2 psi) og UF-retentattrykket 2,07 kPa (0,3 psi).

Diafiltrering ved konstant volum ble utført i T-l idet tanken inneholdt ca. 15-201. Diafiltrering ble holdt ved et minimum på tre buffemtbyttinger av 150 mM NaCl-glycinbuffer (ca. 601 totalvolum). Viralfjerningstankpumper og blander ble skrudd av når diafiltreringen var ferdig. VC-resirkulasjonstank konstantvolumet ble holdt ved 16,2 1. Totalbuffervolumet byttet ut var 491. Virdfjermngsdiafiltreringen var fullstendig i løpet av 4 timer fra tidspunktet UF-innmatningspumpen hadde blitt startet.

Bulken i T-2 ble resirkulert og derved konsentrert ved diafiltrering ved konstant volum i T-2, med den viralfjernede mengden av 50 mM NaCl-glycinbuffer (som ikke inneholder polysorbat 80). Bulken ble derved konsentrert til ca. opprinnelig startvolum av resuspendert Ppt. II. Permeatventilen var fullt åpen, og UF-innmatningspumperaten var 65%; innmatningstrykket ble holdt under 206,8 kPa (30 psi) og trykkforskjellen holdt ved 96,5-117,2 kPa (14-17 psi) ved å påføre baktrykk på retentatloopen. UF-konstantvolumet som ble opprettholdt var 201 og totalbuffervolumet byttet ut var 1101. En prøve ble trukket fra T-2 for å gjøre en digital spesifikk konduktansbestemmelse av UF-permeatprøven. Resultatet var 5,29 x IO"<3> mhos/cm. Idet volumnivået ble møtt, ble UF-permeatet skrudd av og bulken blandet ved resirkulering og en 10,5 ml prøve ble aseptisk fjernet. Prosent proteinbestemmelse ble gjort ved refraktiv indeks ved anvendelse av et håndholdt protometer på en 0,5 ml alikot av prøven. Proteinkonsentrasjonen var 4,8%.

Det påkrevde sluttvolumet av bulken for å oppnå et 5% proteininnhold ble beregnet som følger:

ELLER

Bulken ble ytterligere konsentrert for å nå den påkrevde 5% proteinkonsentrasjonen til et sluttvolum på 11,424.

En begynnende pH-bestemmelse ble gjort på den gjenværende prøvealikoten ved å først fortynne alikoten 1:10 med 0,9% NaCl og titrere til en pH på 6,3-6,4 med 1:100 fortynning av 0,5N HC1 eller 0,5N NaOH. pH var 6,58.

For å justere pHen, ble 1,8 ml av titrat 0,5N HC1 i 0,9 NaCl tilsatt og den endelige pHen var 6,31. Hvis justering er påkrevet, ble mengden ufortynnet 0,5N reagens som kreves for å justere pHen av bulken beregnet som følger:

ELLER, i dette tilfellet:

11,4241 x 1,8 ml = 20,563 ml ufortynnet 0,5N reagens

Integritetsstesting ble utført på Viresolve-180 filteimodulen i henhold til aksepterte metoder. Integritetstestverdien må være > 1,2, og modulen må desinfiseres med klor som ovenfor og renses.

Påkrevd volum av 100X Thimerosolløsnig ble beregnet:

ELLER

Under konstant blanding av bulken ble 99,7 ml 100X Thimerosol tilsatt.

Bulken ble justert til det beregnede påkrevde sluttvolumet med 0,701 av viralfjemet 50 mM NaCl-glycinbuffer og blandet i ti (10) minutter.

En 10,5 ml alikot av bulkproduktet ble aseptisk fjernet for bestemmelse av pH. pH må være 6,3-6,4. Virkelig pH var 6,54. Siden pH var på utsiden av det angitte området, ble en alikot fortynnet og titrert til en akseptabel pH som tidligere og den påkrevde mengden av ufortynnet 0,5N reagens må beregnes og tilbaketilsettes til bulken under røring, som tidligere.

Volum av titrat var 1,7 ml for å oppnå en slutt-pH på 6,35.

Endelig proteinprodukt møtte akseptanskriteriet som følger:

Protein = 5,0%

pH = 6,3

Polysorbat 80 på to tester (A319) var 104,6 og 106,7; gjennomsnitt var 105,7.

Metanolinnhold målt med gasskromatograf var 32,4 ppm.

EKSEMPEL IA

150 mM NaCl-glycinbufferen anvendt i eksempel 1 ble fremstilt som følger:

Passende mengde buffer som skal fremstilles ble beregnet som følger:

(13 1 x 101) x 2 - 60 = 3201 av buffer som skal fremstilles

Mengden materialer som kreves ble bestemt og målt for å kalibrere depyrogenert beholder:

Polysorbatinnveiingsbeholderen ble renset flere ganger med totalt ca. 2 liter vann for injeksjon, U.S.P. og hver rensealikot ble tilsatt til batchen. Totalt 101 ble tilsatt. Mengden av følgende materialer ble bestemt:

Blandingen ble fortynnet med vann for injeksjon, U.S.P. og sluttmengden ble blandet i 60 minutter. pHen ble bestemt, og kravet var 6,3-6,5. pHen var 6,46. Hvis kravene ikke var møtt, er det nødvendig å tilsette 1,0N HC1 eller 1,0N NaOH til den påkrevde pHen oppnås, og løsningen bør blandes i 15-30 minutter etter hver tilsetning og pH-bestemmelse bekreftet.

Digital spesifikk konduktansbestemmelse ble utført hvor kravet ved 25°C er 14,15 til 15,59 x 10"<3> mhos/cm. Resultatet var 15,38 x 10"<3> mhos/cm. Hvis kravene ikke var møtt, er det nødvendig å kaste løsningen og fremstille nytt reagens.

Polysorbat-80 målingen ble utført, og testprøven må være 15 til 24 ppm polysorbat 80. Konsentrasjonen var 22,8 ppm.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av viral fjernet RhoGAM® ved ultrafiltrering gjøres som i eksempel 2 ovenfor med følgende modifikasjoner: Rho (D) immunogiobulin 6,802 kg renset til trinn "Presipitat II-pasta" ved anvendelse av modifisert Cohn-rensingsmetode ble resuspendert i 20,4061 vann for injeksjon (WFI), U.S.P. avkjølt til 4°C. Blandingen ble virvlet (ingen skumming) i 4 timer og lagret ved 4°C til ytterligere anvendelse.

Ved å følge SIP-prosedyren ble en Viresolve-180R modul (Millipore Corporation) (20 stabler) for ca. 27,2081 volum av resuspendert presipitat II-volum installert. To

Biomax-50 kassetter ble installert i stedet for Pellicon CIP/SIP-modulen. Viresolve-180 modulen ble desinfisert med klor og renset som beskrevet tidligere. Biomax-50 membranene ble skylt med WFI, U.S.P.-bestemmelse av benzalkoniumklorid (Roccal) ble utført på en endelig gjennomstrømmet skylleprøve og benzalkoniumkloridinnholdet var 8 ppm. En diffusjonstest ble utført på Biomax-50 kassettene hvor frigivningsraten ble bestemt som beskrevet tidligere, og totalvolumet som ble frigitt var 22 cc i løpet av 5 minutter, og den virkelige frigivningshastigheten var 4,4 cc/minutt.

En virdfjerningsultrafiltrering ved anvendelse av en Viresolve-180 ble utført på 2451 av 50 mM NaCl-glycinbufferen. Viralfjerrnngsresirkuleringstanken (T-l) ble tilsatt 245 1 av 50 mM NaCl-glycinbuffer. Bufferen ble resirkulert i T-l samtidig som bufferpermeatet ble samlet opp i den tidligere desinfiserte 50 mM NaCl-glycinbufferlagringstanken off line. Volum gjennomtrengt buffer samlet opp var 213 1. Viralfjernet buffer ble lagret ved omgivelsestemperatur ved ca. 17,2-25,5°C (63-78°F).

En 150 mM NaCl-glycinbuffer (se eksempel 2A for fremstilling) skylling ble utført ved å feste bufferinnmatnings tanken til viralfjerrungsresirkulermgstanken (T-l). T-l ble tilsatt 601 av den 150 mM NaCl-glycinbufferen for skylling.

Presipitat II-resuspensjonen ble behandlet som følger. Presipitatet II (6.802 kg) ble blandet i en hastighet som ga en virvel uten skumming, i 55 minutter, til fullstendig suspensjon. Prosent protein ved refraktiv indeks (mg/ml protein) ble bestemt ved anvendelse av et håndholdt protometer på presipitat II-resuspensjonen og var 59 mg/ml.

Det påkrevde volumet av fortynnet presipitat II ble beregnet for å oppnå en proteinkonsentrasj on på 5,0 mg/ml:

ELLER

Det påkrevde volumet av 150 mM NaCl-glycinbuffer ble beregnet ved anvendelse av følgende formel:

ELLER

(321,054 L) - (27,208 L) = 293,846 L buffer å tilsette

Proteinkonsentrasj onen var ca. 5,9%.

Buffer (293,8461) ble tilsatt til 27,2081 fortynnet presipitat II og blandet i en hastighet tilstrekkelig til å danne en virvel uten skumming i 30 minutter.

Viralfjernings resirkuleringstanken ble tilsatt 1071 fortynnet Ppt. II. Virdfiernings resirkuleringstanken (pumpe nr. 1) ble startet ved en innmatningspumpehastighet på 80% for 20 stabel Viresolve-180 modulen som anvendes. Virdfjemings permeatpumpestrømingshastigheten (pumpe nr. 2) ble innstilt til 0,91 LPM (20%) for 20-stabelmodulen for å opprettholde et begynnende transmembrantrykk (TMP) på

< 11,03 kPa (1,6 psi). Det virkelige trykket som ble holdt var 8,27 kPa (1,2 psi). Produktpumpehastigheten (pumpe nr. 3) ble justert til likt kontroUhastigheten. TMP ble holdt ved < 20,7 kPa (3,0 psi) gjennom prosessen ved å overvåke proteinkonsentrasjonen på retentatsiden av virdfjernings resirkuleringstanken. In-line UV-monitoren ble observert og holdt i et område på 6,4-7,7 absorbansenheter som korresponderte til et proteininnhold på 4,5-5,5 mg/ml.

Etter at ca. 75 1 av permeatet fra virdfj erningstanken var tilsatt ultrafiltreringstanken (UF), ble dttaflltrermgsinnmatningspumpen (pumpe nr. 5) startet ved 10%. Pumperaten økte (til 25%) til UF-permeatstrømningsraten var lik strømningsraten på virdfjerningspermeatet, og deretter satt til 25% for å opprettholde volumet. UF-permeatstrømningsraten var 0,91 LPM og VC-permeatstrømningsraten var 0,91 LPM. UF-tankkonstantvolumet ble holdt ved 1521. UF-innmatningstrykket var 27,6 kPa (4,0 psi), UF-permeattrykket 07, kPa (0,1 psi) og UF-retentattrykket 4,8 kPa (0,7 psi).

Konstant volumdiaifltrering ble utført i T-l idet tanken inneholdt ca. 15-201. Diafiltreringen ble opprettholdt med minimum tre bufferutbyttinger av 150 mM NaCl-glycinbuffer (ca. 601 totalvolum). Virdfjerningstankpumpene og blander en ble skrudd av når diafiltreringen var ferdig. VC-resirkulasjonstank konstantvolumet ble holdt ved 151. Totalbuffervolumutbyttingen var 451.

Bulken i T-2 ble resirkulert og dermed konsentrert ved diafiltrering ved konstant volum i T-2, med den viralfjernede mengden 50 mM NaCl-glycinbuffer. Bulken ble derved konsentrert til ca. opprinnelig startvolum av resuspendert Ppt. II. Permeatventilen var fullt åpen, og UF-innmatningspumperaten var 70%; innmatningstrykket ble holdt under 206,8 kPa (30 psi) og trykkforskjellen holdt ved 96,5-117,2 kPa (14-17 psi) ved å pålegge tilbaketrykk på retentatloopen. UF-konstantvolumet som ble opprettholdt var 221 og totalbuffervolumutbyttet var 121,21. En prøve ble tatt fra T-2 for å gjøre en digital spesifikk konduktansbestemmelse på UF-permeatprøven. Resultatet var 5,47 x 10"<3> mhos/cm. Idet volumnivået var møtt, ble UF-permeatet skrudd av og bulkblandingen resirkulert og 10,5 ml prøve ble aseptisk fjernet. Prosent proteinbestemmelse ble gjort ved refraktiv indeks ved anvendelse av et håndholdt protometer på en 0,5 ml alikot av prøven. Proteinkonsentrasjonen var 7,9%.

Bulken fra T-2 ble fjernet over i en midlertidig bulkkolbe og hele kolben veiet (totalvekt). Bulken ble returnert til T-2, og den tomme midlertidige bulkkolben ble veid:

ELLER

58,180 kg - 25,24 kg = 32,94 kg bulkvekt.

ELLER

En begynnende pH-bestemmelse ble gjort på den gjenværende prøvealikoten ved å først fortynne alikoten 1:10 med 0,9% NaCl og titrert til en pH på 6,3-6,4 med 1:100 fortynning av 0,5N HC1 eller 0,5N NaOH. pH var 6,55.

For å justere pHen, ble 1,35 ml av titrant 0,5N HC1 i 0,9% NaCl tilsatt og den endelige pHen var 6,35. Hvis justering er påkrevet, ble mengden ufortynnet 0,5N reagens påkrevet for å justere pHen av bulken beregnet som følger: Påkrevd sluttvolum (1) - volum av 1:100 titrant påkrevd (ml) = volum av ufortynnet 0,5N reagens (ml)

ELLER, i dette tilfellet:

34,1281 x 1,35 ml = 46,1 ml ufortynnet 0,5N reagens

Integritetstesting ble utført på Viresolve-180 filtermodulen i henhold til aksepterte metoder. Integritetstestverdien må være > 1,2, og modulen må være desinfisert med klor som ovenfor og renset.

Påkrevd volum av 100X Thimerosolløsning ble beregnet:

ELLER

34,1281 = 0,3411 av 100X Thimerosolløsning (1).

Under konstant blanding av bulken ble 341 ml av 100X Thimerosol tilsatt. Bulken ble justert for å beregne påkrevet endelig volum med 0,8011 av viral fjernet 50 mM NaCl-glycinbuffer og blandet i ti (10) minutter.

En 10,5 ml alikot av bulkproduktet ble aseptisk fjernet for bestemmelse av pH. pH må være 6,3-6,4. Virkelig pH på de to avlesningene var 6,38 og 6,345.

Endelig proteinprodukt oppfylte akseptanskriteriene som følger:

Protein = 5,3%

pH = som ovenfor

Metanolinnholdet bestemt ved gasskromatogram var 53,9 ppm.

Polysorbat 80 = 101,7 ppm, 102,2 ppm på to tester; gjennomsnittet var 101,9.

EKSEMPEL 2A

150 mM NaCl-glycinbufferen anvendt i eksempel 2 ble fremstilt som følger:

Hensiktsmessig mengde buffer å fremstille ble beregnet som følger:

(Resuspendert pastavolum (1) x 101) x 2 + 60 = Omtrentlig volum av buffer å

fremstille

(27,208 1 x 101) x 2 + 60 = 604,161 av buffer å fremstille

Mengden materialer som er påkrevet ble bestemt og målt til en kalibrert depyrogenert beholder:

Polysorbatveiebeholderen ble renset flere ganger med totalt ca. 2 liter vann for injeksjon, U.S.P. og hver rensealikot ble tilsatt til batchen og gir 604,161. Mengden av følgende materialer ble bestemt:

Blandingen ble fortynnet med vann for injeksjon, U.S.P. og endelig mengde ble blandet i 60 minutter. pHen ble bestemt, hvor kravet er 6,3-6,5. pHen var 6,38. Hvis kravet ikke var møtt, er det nødvendig å tilsette 1,0N HC1 eller 1,0N NaOH til den påkrevde pHen oppnås, og løsningen bør blandes i 15-30 minutter etter hver tilsetning og pH-bestemmelsen må bekreftes.

Digital spesifikk konduktansbestemmelse ble utført hvor kravet ved 25°C er 14,15 til 15,59 x 10"<3> mhos/cm. Resultatet var 15,18 x 10"<3> mhos/cm. Hvis kravene ikke er tilfredsstilt, er det nødvendig å kaste prøven og fremstille nytt reagens.

Polysorbat-80 målingen ble utført, og testprøven må være 15 til 24 ppm polysorbat 80. Konsentrasjonen var 19,5 ppm.

SAMMENLIGNINGSEKSEMPLER

POLYSORBAT 80 VERSUS IKKE POLYSORBAT 80

SAMMENLIGNINGSEKSEMPEL IA - SOM INNEHOLDER POLYSORBAT 80

Presipitat II-pasta (10 g) ble suspendert i 30 ml WFI. En slik resuspendert pasta (40 ml) ble blandet med 360 ml 150 mM NaCl-glycinbuffer (fortynnet 10X) som inneholdt 100 ppm (0,1 g/1) polysorbat 80 som ga et totalvolum på 400 ml. Permeatstrømningen gjennom Millipore Multipleks-pumpeplattformen (1/3 kvadratfotmodul) ble kjørt ved 21,8 ml/minutt, mens fluksen var 0,06 ml/min./cm<2>. Etter 39 minutter med kjøring holdt transmembrantrykket seg under 8,96 kPa (1,3 psi) med siktekoefflsienten større enn 80%. Fri passasje av IgG polyklonalt anti-D materiale ble sikret ved anvendelse av høyt ionestyrkebuffersystem med polysorbat 80.

SAMMENLINGNINGSEKSEMPEL IB - SOM IKKE INNEHOLDER

POLYSORBAT 80

Presipitat II-pasta (10 g) ble suspendert i 30 ml WFI. Slik resuspendert pasta (40 ml) ble blandet med 360 ml 150 mM NaCl-glycinbuffer (fortynnet 10X) som ikke inneholdt polysorbat 80, som ga et totalvolum på 400 ml. Permeatstrømmen gjennom Millipore Multipleks-pumpeplattformen (1/3 kvadratfotmodul) ble kjørt ved 21,8 ml/minutt, mens fluksen var 0,06 ml/min./cm<2>. Etter 39 minutter med kjøring var transmembrantrykket 42,1 kPa (6,1 psi) med siktekoefflsienten raskt redusert til ca. 60%. Fri passasje av IgG polyklonalt anti-D materiale ble sikret ved anvendelse av buffersystem med høy ionestyrke med polysorbat 80.

Resultatene av denne sammenligningsstudien viser nødvendigheten av tilstedeværelsen av polysorbat 80 i buffersystemet med høy ionestyrke.

SAMMENLIGNINGSEKSEMPEL 2

LAV IONESTYRKE VERSUS HØY IONESTYRKEBUFFER

SAMMENLIGNINGSEKSEMPEL 2A - LAV IONESTYRKEBUFFER

Presipitat II-pasta (1,35 g) ble suspendert i 4,5 ml WFI. En slik resuspendert pasta (5,0 ml) ble blandet med 45 ml 50 mM NaCl-glycinbuffer som inneholdt 0,1 g/l Polysorbat 80, som ga et totalvolum på 50 ml. Permeatstrørnningen gjennom Viresolve-180 "Small Area Module" (SAM, 10 cm<2>) (Millipore Corporation, Bedford, MA) ble kjørt med en strømning på tvers på 15,6 ml/minutt samtidig som fluksen Var 0,64 rnl/min./cm<2>. Etter 28 minutter med kjøring ble siktekoefflsienten raskt redusert til ca. 31%.

SAMMENLINGNINGSEKSEMPEL 2B - HØY IONESTYRKEBUFFER

Resuspendert presipitat II-pasta (46,0 ml) i 50 mM NaCl-glycinbuffer som inneholder 100 ppm (0,01%) polysorbat 80 fra sammenligningseksempel 2A, til hvilket 0,29 g NaCl er blitt tilsatt for å fremstille 150 mM NaCl-glycinbuffer ble anvendt. Permeatstrømningen gjennom Viresolve-180 "Small Area Module" (SAM, 10 cm<2>)

(Millipore Corporation, Bedford, MA) ble kjørt ved 15,6 ml/minutt, mens fluksen var 0,64 ml/min./cm<2>. Etter 40 minutters kjøring var siktekoefflsienten 46%.

Resultatene av denne sammenligningsstudien mellom buffersystemer med lave og høye ionestyrker som beskrevet i sammenligningseksemplene 2 A og 2B viser at ionekonsentrasjonen til buffersystemet i løpet av prosessen har en målbar og signifikant påvirkning på proteinets passasjepunkt gjennom Viresolve-membranen.

SAMMENLIGNINGSEKSEMPEL 3

LYOFILISERT PRESIPITAT II-PASTAPRODUKT LØST I WFI, LAV IONESTYRKE

Et humant IgG-produkt ble testet med Viresolve/180 1/3 ft<2> modul for å bestemme ytelsen til membranen med dette molekylet. To typer eksperimenter ble utført; fluksekskursjon og volumreduksjon. Den begynnende testingen ga basismembrandata ved å måle proteinsikten som en funksjon av fluks. Dataene fra fluksekskursjonen ble anvendt for volumreduksjonseksperimentet for å etterligne en prosesskjøring. Ingen proteinpassasje ble observert i løpet av fluksekskursjonen for produktet i "Water For Injection" (WFI). Etterfølgende eksperimenter anvendte produktet i glycinbuffer (som inneholder 0,01% polysorbat-80). En proteinmassegjenvinning på 89,1% ble oppnådd ved anvendelse av denne løsningen med en 83,3% volumøkning.

Eksperimentene ble utført for å evaluere siktekoefflsienten og proteinmassegj en vinning av produktet ved prosessering gjennom Viresolve/ 180-modulen. Dataene generert ved disse eksperimentene ble anvendt for å bestemme systemdriftsbetingelsene.

Det begynnende eksperimentet ble utført i et kaldt rom ved 4°C ved anvendelse av produktet løst i WFI. Alle etterfølgende eksperimenter ble utført ved romtemperatur med 1/3 ft2 Viresolve/180-moduler. Alle totalproteinkonsentrasjonene ble bestemt ved avlesning av den optiske tettheten (O.D.) ved 280 nm. Alle prøvene ble fortynnet i og avlest mot produktbuffer.

Fluksekskursjon

1) Systemet ble anbrakt som vist i fig. 3A ved anvendelse av Viresolve/180-modul #0010 fra lot #K2EM0536 (Millipore Corporation, Bedford, MA). 2) 500 ml presipitat II lyofilisert pulver som hadde blitt lyofilisert i WFI ved en konsentrasjon på ca. 1% protein, ble pumpet over i en innmatningsbeholder med 1000 ml kapasitet. En prøve av produktet ble satt for å bestemme den begynnende proteinkonsentrasjonen. Beholderen ble tilknyttet systemet og røret ble primet for å fjerne luft. 3) Produktet ble resirkulert i 30 minutter med en tverrstrømningsraten på 500 ml/min. (Permeatpumpen var slått av.) 4) En 1 ml prøve ble tatt av retentatporten for å bestemme om signifikant proteinabsorpsjon hadde funnet sted (RO). Bemerk: Alle prøvene ble tatt i 1 ml med mindre annet er angitt. 5) Permeatstrømningen ble startet med en strømningsrate med 1,09 ml/min. (J = 0,003 ml/min./cm<2>). Permeatstrømningen ble kontrollert med en Watson Marlow 5030 pumpe med et 308 MC/A pumpehode. Produktet ble resirkulert tilbake til innmatningsloopen i 35 minutter. 6) Etter 35 minutters resirkulering ble retentatet (RI) og en permeat (Pl) prøve samlet opp. På dette punktet ble prosessen fjernet fra det kalde rommet og plassert ved romtemperatur. Resirkuleringen ble fortsatt ved samme strømningsrater i 30 minutter. 7) Etter 30 minutters resirkulering ved romtemperatur ble et retentat (R2) og et permeat (P2) samlet opp. 8) Tverretrømningen ble deretter økt til ca. 600 ml/min. og resirkulert i 15 minutter. Et retentat (R3) og et permeat (P3) ble samlet opp. 9) Produktet ble fortynnet til 0,5% med produktbufferen. Tverrstramningsraten og permeatstrømningsraten holdt seg konstant. Et retentat (R4) og et permeat (P4) ble samlet opp etter 20 minutters resirkulering. 10) To ytterligere permeatfluksrater ble testet. 0,005 rnl/min./cm<2> (1,82 ml/min.) og 0,01 ml/min./cm<2> (3,63 ml/min.). Hver resirkulerte i minst 30 minutter.

Kombinert fluksekskursjon og volumreduksjon

Et andre eksperiment ble utført på humant IgG løst i glycinbuffer.

1) Systemet ble anbrakt som vist i fig. 3 A ved anvendelse av Viresolve/180-modul 30009 fra lot 3K2EM0536. 2) 990 ml av produkt ved ca. 0,1% ble pumpet over i en innmatningsbeholder med 11 kapasitet. En 1 ml prøve ble tatt for å bestemme den virkelige finkonsentrasjonen. Bemerk: Alle prøvene som ble tatt ble tatt i 1 ml med mindre annet er angitt.

Beholderen ble knyttet til systemet og røret ble primet for å fjerne luft.

3) Produktet ble resirkulert i 30 minutter ved en strømningsrate på tvers på 50 ml/min. (Permeatpumpen var slått av.) Tverrstrømningsraten ble kontrollert med en Watson Marlow 5030 pumpe med et 501RL pumpehode. Etter resirkulering ble en prøve

(RO) tatt for å teste proteinadsorpsjonen.

4) Fire permeatfluksrater ble testet: 0,003,005,0,030 og 0,050 ml/min./cm<2>. Produktet ble resirkulert i 30 minutter ved permeatfluksrate. Strømningen på tvers ble økt til 600 ml/min. for 0,05 ml/min./cm2 fluksraten. Etter 30 minutter ble det tatt en permeat- og en retentatprøve. 5) Etter avslutning av fluksekskursjonsdelen av eksperimentet ble permeatpumpen slått av. Systemet ble rekonfigurert som det fremgår av fig. 3B. En begynnende prøve ble

tatt av IS ml.

6) Produktet ble deretter prosessert ved en fluks på 0,05 ml/min./cm<2> (18,2 ml/min.).

Bemerk: Målt fluks var 0,043 ml/min/cm<2> (15,7 ml/min.).

7) Retentat- og permeatprøver ble samlet opp ved 100,250 og 500 ml av produkt prosessert. 8) Diafiltrering (ved permeatstrømningsraten) med produktbufferen ble initiert etter prosessering av 645 ml av IgG-løsningen. Denne diafiltreringen fortsatte med totalt 500 ml prosessert gjennom Viresolve/180-modulen. Retentat- og permeatprøver ble

samlet opp ved 745,895 og 1145 ml prosessert.

9) Den gjenværende løsningen ble bearbeidet i volumreduksjonsmodusen ned til stoppverdien til systemet. Retentat- og permeatprøvene ble tatt ved 1245 og 1475 ml

totalt bearbeidet volum.

10) Et endelig diafiltreringstrinn ble utført for å avdekke produktkonsentrasjonen i stoppvolumet. Diafiltreringen ble fortsatt i totalt fire 50 ml volumer. Hvert

diafiltreringsvolum ble samlet opp separat.

11) En prøve av det totale bulkpermeatet og en prøve fra hvert oppsamlet diafiltreringsvolum ble samlet opp. En sluttretentatprøve ble også tatt ved slutten av eksperimentet for å bestemme konsentrasjonen av produktet som var igjen i innmatningsbeholderen.

RESULTATER

Fluksekskursjon

Ingen produktpassasje ble observert i løpet av det begynnende

fluksekskursjonseksperimentet. Prosessen ble gjort ved romtemperatur (til å begynne med ved 4°C) i et forsøk på å forbedre produktløseligheten. Ingen økning i produktpassasjen ble observert. Andre fremgangsmåter for å indusere proteinpassering omfatter heving av tverrstrømmen, fortynning av produktet og økning av permeatlfuksraten for å tvinge proteinpassasje. Siktekoefflsienten holdt seg på null for alle testbetingelsene.

Til å begynne med ble produktprøven suspendert i WFI. Løsningen synes tåkete og et løselighetsproblem ble forventet. Ytterligere produkt ble deretter løst i glycinbuffer og denne løsningen ble anvendt for resten av testingen.

Kombinert fluksekskursjon og volumreduksjon

Tabell 6 viser resultatene av fluksekskursjonseksperimentet utført på IgG suspendert i glycinbuffer. Tabellen angir data samlet opp på produktet ved ca. 0,1% totalprotein.

Tabellen angir produktkonsentrasjonsverdier i absorbansenheter (AU). En fortynningsfaktor er blitt beregnet i verdiene.

Siktingskoeffisienten versus flukskurven for IgG i glycinbuffer er plottet i fig. 4.

Følgende er produktkonsentrasjonsdataene (AU) fra volumreduksjonseksperimentet.

Siktekoefflsienten versus volumfiltrert kurve for volumreduksjonseksperimentet er plottet i fig. 5.

Proteinmassegj envinning

Diafiltreringen gir større proteinmassegjenvinning, men resulterer i øket produktvolum og produktfortynning. Volumprosentøkningene for hvert diafiltreringstrinn er som følger:

På basis av proteinsiktingsdata oppnådd fra eksperimentene fremgikk følgende informasjon:

1) Proteinabsorpsjon på Viresolve/180 synes å være neglisjerbar.

2) Tåken som ble observert i løsningen av produkt suspendert i WFI pluss det faktum at det ikke var noen proteinpassasje med denne løsningen, indikerer at det er et stabilitetsspørsmål med dette produktet og WFI. Proteinpassasje gjennom Viresolve-membranen ble oppnådd ved protein suspendert i glycinbuffer. 3) Siktekoefflsienten faller jevnt idet proteinet blir konsentrert på oppstrømssiden av membranen i løpet av prosessen. 4) Den lave siktingskoeffisienten på slutten av prosessen (-25%) indikerer at signifikant proteinpolarisering finner sted på membranoverflaten.

KONKLUSJON

Forundersøkelsen ble utført med Viresolve/180-membran ved anvendelse av humant IgG produkt suspendert i to forskjellige bufre: WFI og glycinbuffer. Det ble ikke observert proteinpassasje ved anvendelse av produktet suspendert i WFI. Det ble observert en svak tåke med startløsningen som indikerer at proteinet ikke var fullt løst. Dette vil forårsake umiddelbar polarisering av membranen, som blokkerer membranen for proteinpassering. Resultatene av fluksekskursjonen viser at det er akkurat dette som finner sted, at uoppløst protein blinder membranen som hindrer proteinpassasje.

Det er markert forskjell i klarhet av løsningen som inneholdt produkt i glycinbuffer; og denne løsningen var ikke tåkete. Fluksekskursjonen for denne løsningen ga en siktkoeffisient på ca. 50% for alle flukshastighetene som ble testet (0,003 ml/min./cm<2 >til 0,5 ml/min./cm<2>). Konsentrasjonen av produktet i glycinbuffer var ca. 0,1% (totalt protein).

0,1%-løsningen ble anvendt for å utføre volumreduksjonseksperimentet. En produktgjenvinning på 89,1% ble oppnådd med en 83,3 volum-% økning. Et diafiltrermgstrinn i prosessen ble anvend i et forsøk på å begrense proteinkonsentrasjonen på oppstrømssiden av membranen i løpet av prosessen. Et slurtdiafiltreringstrinn ble også anvendt for å gjenvinne proteinet i stoppvolumet av systemet.

Siktekoefflsienten falt jevnt i løpet av prosessen fra en startsiktekoeffisient på 57,8% til en sluttsiktekoefflsient på 26,9%. Dette indikerer at et vesentlig proteinsjikt blir bygd opp på membranen i løpet av prosessen. Midtprosessdiafiltreringen satte ned fallet i siktekoefflsienten, men økte den ikke eller holdt den stabil. Sluttdiafiltrermgstrinnet gjenvant noe av proteinet fra stoppvolumet og membranoverflaten. Proteinkonsentrasjonen til disse sluttdiaflltreringsvolumene var ca. 25 til 50% av startløsningen, og dette indikerer at den nye bufferen vasket av diafiltreringen langsomt fjerner proteinpolariseringssjiktet til membranen. Det er ønskelig å ha noe mer produktutbytte fra membranen i løpet av diafiltreringen da dette reduserer produktfortynningen og prosesstiden. En utvidet sluttdiafiltrering vil gjenvinne mer protein, men vil forårsake større produktfortynning.

Produktet som ble testet hadde 5-12% dimerer i løsning. Disse dimerene består av aktivt produkt. Tilstedeværelsen av dimerer vil uten tvil forårsake proteinpolarisering på membranoverflaten og dimerene, hvis de holder seg intakt, vil fanges oppstrøms.

Dette sammenligningseksempelet viser at under betingelsene som anvender lyofilisert utgangsmateriale og lavionestyrkebuffer ble en lav siktekoefflsient oppnådd som demonstrerer at selv ved svært fortynnede betingelser passerer proteinet gjennom filteret med mindre enn 50% effektivitet. Utstyr som inneholder langt større filterareal vil kreves for å behandle dette materialet i samme tidsperiode som tilveiebrakt i den optimaliserte validerbare prosessen i eksemplene 1 og 2.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en i det vesentlige ren, virusfri globulær proteinformulering, karakterisert ved at den omfatter trinnene: (a) blanding av en proteinfraksjon isolert fra humant plasma med en buffer av høy ionestyrke på 1 SO mM ± 20 % inneholdende en ikke-ionisk detergens; (b) utførelse av rianofiltrering på blandingen ved anvendelse av et nanofilter som har en nominell porestørrelse på mindre enn 30 nm; og (c) oppsamling av permeat fra nanofiltreringen, hvor nevnte permeat er et i det vesentlige rent, virusfritt protein, hvor proteinet har en molekylvekt på cirka 180 kg dalton eller mindre.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet omfatter immunogiobulin.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet omfatter anti-D immunogiobulin.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den nominelle porestørrelsen av nanofllteret er cirka 12 nm.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet er til stede i blanding ved en konsentrasjon på 0,1-1 %.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet er til stede i blandingen ved en konsentrasjon på cirka 0,5 %.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at bufferen er 150 mM ± 20 % NaCl-glycin buffer.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at bufferen er av pH 6,4.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at bufferen er 150 mM ± 20 % NaCl-glycin pH 6,4 buffer.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den ikke-ioniske detergensen er ved en konsentrasjon på cirka 0,015 g/l til ca. 0,024 g/1.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den ikke-ioniske detergensen er ved en konsentrasjon på cirka 0,02 g/l.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den ikke-ioniske detergensen er ved en konsentrasjon ved den kritiske micellekonsentrasjonen.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den ikke-ioniske detergensen er ved en konsentrasjon innenfor den kritiske micellekonsentrasjonen.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den ikke-ioniske detergensen er ved en konsentrasjon på cirka 80-200 ppm.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den ikke-ioniske detergensen er ved en konsentrasjon på cirka 100 ppm.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pro teinfraksjonen isoleres fra humant plasma ved sats vis kromatografi, ionebyttekromatografi eller affinitetskromatografi.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinfraksjonen isoleres fra humant plasma ved en alkoholfraksjoneringsprosess.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at alkoholen anvendt i fraksjoneringsprosessen er metanol.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den ikke-ioniske detergensen er en ikke-ionisk polyoksyetylendetergens.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at den ikke-ioniske polyoksyetylendetergensen er polysorbat-80.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at bufferen er 150 mM NaCl-glycin buffer.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at den ikke-ioniske detergensen er ved en konsentrasjon på 0,015 g/l til cirka 0,024 g/l.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at den ikke-ioniske detergensen er ved en konsentrasjon på cirka 0,02 g/l.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at den ikke-ioniske detergensen er en ikke-ionisk polyoksyetylendetergens.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at den ikke-ioniske polyoksyetylendetergensen er polysorbat-80.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at permeatet videre bearbeides ved å anvende et andre nanofilter som har en nominell porestørrelse på cirka 10 kilo dalton til cirka 60 kilo dalton, hvori det i det vesentlige rene immunoglobulinet tilbakeholdes i retentatet etter bearbeidelse med det andre nanofilteret.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at den nominelle porestørrelsen av det andre nanofilteret er cirka 50 kg dalton.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at proteinet er immunogiobulin.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at immunoglobulinet er anti-D immunogiobulin.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 29, karakterisert ved at det i det vesentlige rene proteinet anvendes for å fremstille en oppløsning inneholdende 300 mikrogram av nevnte protein.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 29, karakterisert ved at det i det vesentlige rene proteinet anvendes for å fremstille en oppløsning inneholdende 50 mikrogram av nevnte protein.