ES2290553T3 - Procedimiento para prefiltrar una solucion de proteinas. - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para eliminar de manera selectiva los constituyentes de obturación y las partículas víricas de una solución acuosa de proteínas o péptidos que comprende: filtrar en primer lugar una solución de proteínas o péptidos que contiene dichos constituyentes de obturación y los virus mediante un dispositivo que contiene uno o más medios de eliminación de los constituyentes de obturación en un modo de operación de filtración con flujo normal, recuperar la solución de proteínas o péptidos libre de constituyentes de obturación, y en segundo lugar, filtrar directamente dicha solución de proteínas o péptidos a través de una o más membranas de ultrafiltración que tengan un corte de pesos moleculares comprendido entre aproximadamente 200 kD y aproximadamente 1000 kD para retener las partículas víricas en dicha una o más membranas de ultrafiltración a un nivel de al menos 3 LRV, y para recuperar una solución acuosa de proteínas o péptidos libre de virus, caracterizada porque el primer dispositivo de filtro está en forma de una almohadilla fibrosa y el medio de eliminación del constituyente de obturación comprende tierra de diatomeas.

Description

Procedimiento para prefiltrar una solución de proteínas.
Antecedentes de la invención
Esta invención se refiere a un procedimiento para prefiltrar de manera selectiva una corriente que contiene una o más biomoléculas de proteínas o péptidos antes de la etapa de filtración vírica final. De manera más concreta, esta invención se refiere a un procedimiento para prefiltrar una corriente que contiene una proteína o péptido para eliminar de manera selectiva los agregados y otros constituyentes que podrían obturar el filtro vírico ocasionando una terminación prematura de la vida esperada del filtro.
Las soluciones de proteína derivadas de plasma tales como la proteína inmunoglobulina (IgG1) y otras proteínas (naturales o recombinantes) tales como los anticuerpos monoclonales y los péptidos contienen de manera rutinaria diversos constituyentes que pueden bloquear u obturar un filtro vírico. Estos constituyentes de obturación incluyen, pero no se limitan a agregados tales como agregados de proteínas, normalmente trímeros o polímeros mayores de proteínas; proteínas desnaturalizadas, lípidos; triglicéridos; y similares. Cuando se utilizan procedimientos convencionales de filtración, estos constituyentes de obturación no son deseables puesto que el filtro, especialmente el filtro de aclaramiento vírico, resulta rápidamente obturado incluso a concentraciones bajas de agregados de 0,01 - 0,1%. De acuerdo con esto, ha sido necesario utilizar procedimientos caros de cromatografía en gel o cromatografía de exclusión por tamaños para efectuar una prefiltración selectiva de la corriente de proteínas o péptidos para eliminar estos constituyentes antes de que se realice la filtración vírica. De manera alternativa, se puede usar una membrana de ultrafiltración operada en un modo de diafiltración constante para realizar la etapa de prefiltración, Véase la Patente de los Estados Unidos 6.365.395.
De manera adicional, puesto que la etapa de eliminación vírica está cerca del final del tren de purificación del producto, cualquier filtración o prefiltración no debe añadir ningún material extraíble a la corriente de proteínas o péptidos. Lo que se desea es tener una etapa de prefiltración que proporcione la eliminación deseada de los constituyentes de obturación limitando a la vez la introducción de materiales extraíbles en la corriente.
De acuerdo con esto, sería deseable proporcionar un procedimiento para prefiltrar una solución de proteínas o péptidos para evitar la obturación prematura del dispositivo de filtración utilizado en el procedimiento, minimizando a la vez la introducción de materiales extraíbles en la corriente.
Resumen de la invención
En términos generales, la presente invención proporciona un procedimiento para prefiltrar una solución que contiene una proteína o péptido antes de la filtración vírica. De manera más específica, se definen las características esenciales y opcionales de la invención en las maxi- y sub-reivindicaciones acompañantes, de manera respectiva.
La primera etapa de filtración se efectúa usando un dispositivo de filtro (TFF) para filtración frontal (normal).
Se puede efectuar la segunda etapa de filtración para retener de manera selectiva el virus con una o más membranas de ultrafiltración, bien por filtración en flujo tangencial (TFF) o mediante filtración (NFF) frontal (normal) en la que se produce un aglomerado y una corriente libre de virus. La una o más membranas de ultrafiltración retienen las partículas de virus permitiendo a su vez el paso de la proteína o el péptido a través de ellas. Tras la etapa de filtración vírica, puede limpiarse la membrana vírica con agua o una solución acuosa de tampón para recuperar cualquier biomolécula que pueda haber sido retenida por la membrana.
De manera preferible, el primer dispositivo de filtración está formado por composiciones que están sustancialmente libres de materiales extraíbles bien antes o posteriormente a la filtración.
El uso de la etapa de prefiltración para eliminar los constituyentes de obturación de una solución de proteínas o péptidos proporciona ventajas sustanciales sobre los procedimientos de filtración de la técnica anterior. Puesto que el dispositivo de la primera etapa (que elimina los constituyentes de obturación) se opera en el modo de flujo normal puede ser de un solo uso, y no existir procedimiento de limpieza que pudiera estar sujeto a procedimientos de validación, y similares. De manera adicional, el modo de operación en flujo normal es menos caro de adquirir y operar, ya que necesita una inversión de capital pequeña para instalar dicho sistema, en comparación con el sistema de tipo ultrafiltración TFF. De manera adicional, puesto que la membrana utilizada en la segunda etapa de eliminación de las partículas víricas no se contamina con constituyentes de obturación, su vida útil es larga.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un dispositivo de filtración de acuerdo con una primera forma de realización de la presente invención en una vista en sección transversal.
La Figura 1A muestra la primera forma de realización de la Figura 1 en uso en una carcasa en una vista en sección transversal.
La Figura 2 muestra un dispositivo de filtración de acuerdo con una segunda forma de realización de la presente invención.
La Figura 3 muestra un dispositivo de filtración de acuerdo con una tercera forma de realización de la presente invención en una vista en sección transversal.
Las Figuras 3A y 3B muestran las disposiciones alternativas de la forma de realización de la Figura 3 en una vista en sección transversal.
La Figura 4 muestra un dispositivo de filtración de acuerdo con una cuarta forma de realización de la presente invención.
La Figura 5 es un diagrama de flujo que ilustra una primera forma de realización preferida del procedimiento de esta invención.
La Figura 6 es un diagrama de flujo que ilustra otra forma de realización preferida del procedimiento de esta invención.
La Figura 7 es una gráfica del VMAX de tres procedimientos diferentes, el primero de la técnica anterior y dos de las formas de realización de la presente invención.
Descripción de las formas de realización específicas
De acuerdo con esta invención, se prefiltra una solución que contiene una proteína o péptido con un medio de retención para retener de forma selectiva los constituyentes de obturación a la vez que se permite el paso de las proteínas o péptidos a través del anterior antes de la etapa de filtración para la eliminación vírica. Esta etapa de filtración se efectúa usando un dispositivo que contiene un medio de eliminación de uno o más constituyentes de obturación, tal como tierra de diatomeas y mezclas de la misma que incluyen silicatos, pero no se limitan a las clases (porosa y no porosa) y perlita y similares. Cuando se utilizan estos materiales, se efectúa una eliminación sustancialmente completa de los constituyentes de obturación, permitiendo a la vez la recuperación de más de aproximadamente el 85% de las proteínas o péptidos, de manera preferible de más de aproximadamente el 90% de las proteínas o péptidos.
El dispositivo está en forma de una almohadilla fibrosa, tal como una almohadilla lenticular fibrosa de celulosa, plásticos o mezclas de los dos, que contiene uno o más medios de eliminación de los constituyentes de obturación, o puede usar una o más capas de un material de filtro en lámina que contiene uno o más medios de eliminación de los constituyentes de obturación tal como un filtro, o este puede ser un lecho que contiene uno o más medios de eliminación de los constituyentes de obturación a través del cual fluye la corriente antes de entrar en la etapa de filtración de aclaramiento vírico.
El medio de eliminación del constituyente de obturación puede ser uno o más de un medio seleccionado entre tierra de diatomeas y las mezclas de la misma con silicatos, perlita, alúmina, sílices y similares. Un medio preferido es una tierra de diatomeas lavada con ácido, conocido como medio Celpure® disponible en Advanced Minerals Corporation de Lompac, California. Este es un material preferido en el que la etapa de lavado ácido elimina la mayor parte del material extraíble del medio, tal como diversos iones metálicos, que de otra forma pueden terminar en la corriente del proceso durante el uso.
El medio deberá tener un área superficial específica de al menos 0,5 metros cuadrados por gramo (0,5 m^{2}/g), de manera preferible, de más de 1 m^{2}/g, y debería tener un tamaño de menos de aproximadamente 50 micrómetros de diámetro, comprendido preferiblemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 micrómetros. Deberá usarse en una cantidad suficiente para proporcionar la eliminación adecuada de los constituyentes de obturación a un coste razonable, y deberá usarse en cantidades que se puedan contener en el formato de dispositivo seleccionado. La cantidad de medio incorporado en el dispositivo es similar a la de los dispositivos existentes en la técnica, y oscila normalmente entre aproximadamente un 10% y aproximadamente un 90%, de manera preferible entre aproximadamente un 25% y aproximadamente un 75% en peso.
La Figura 1 muestra un dispositivo lenticular que es adecuado para la presente invención. El dispositivo lenticular 2 está comprendido por una estructura de soporte central formada por una serie de costillas radiales 4 que se extienden hacia fuera desde un nodo central 6. El nodo 6 está hueco y conforma la salida del dispositivo 2 cuando se monta en un vástago de recogida central (tal como se muestra en la Figura 1A). La superficie externa de las costillas 4 está recubierto por una o más capas de un material formado a partir de un material fibroso celulósico de algodón o lana y/o sintético 8 que incorpora uno o más medios de eliminación de los constituyentes de obturación. Se sellan los bordes externos del material 8 y las costillas 4 en una disposición impermeable a los líquidos por un sello del borde externo 10. De manera preferible, el dispositivo es al menos una estructura en dos capas, con cualquiera de las dos capas de celulosa y/o material fibroso sintético o al menos una capa de material celulósico y/o fibroso sintético de la parte superior de una membrana microporosa montada en cada lado de las costillas 4.
El medio de eliminación del constituyente de obturación está contenido por toda la estructura, normalmente por el material fibroso y/o un ligante. O, de manera adicional, se usa como ligante (si se usa) una resina o material que imparta una carga deseada a la estructura para mejorar la adhesión, tal como un formaldehído de melamina, o se puede usar también un ligante catiónico de epiclorohidrina, especialmente una resina catiónica de poliamido poliamina epiclorohidrina que es bien conocida en la técnica.
La cantidad de medio incorporado en el dispositivo es similar a la de los dispositivos existentes en la técnica, y está comprendida normalmente entre aproximadamente un 20% y aproximadamente un 80%, de manera preferible entre aproximadamente un 50% y aproximadamente un 75% en peso. Se conocen bien en la técnica dichos dispositivos, su fabricación y el uso, véanse las Patentes de los Estados Unidos 4.305.782; 4.309.247; 4,645.567; 4.859.340; 4.981.591 y 5.085.780.
La Figura 1A muestra una serie de dichos dispositivos lenticulares montados en una tubería central 12 que está en comunicación fluida con la salida 14 de la carcasa 16. Se muestra también una entrada 18 que permite al fluido entrar en la carcasa 16, fluir a través de los dispositivos 2 de la tubería central 12 y a continuación la salida 14.
La Figura 2 muestra el diseño de un cartucho de filtración 20 que contiene una o más láminas de membrana 24 en las que se han incorporado uno o más medios de constituyentes de obturación como material de relleno. El dispositivo basado en membrana que se muestra está en forma de cartucho, tal como se conoce bien en la técnica. Otros dispositivos de membrana usan discos apilados tales como los dispositivos MILLIDISK disponibles en Millipore Corporation, y se puede usar en la presente invención cualquiera de los formatos de dispositivo que contienen membranas usados en configuraciones de flujo normal El cartucho 20 tiene dos tapones terminales, un tapón en la parte superior 21 que es sólido y no tiene abertura en él y un tapón en la parte inferior 22 que contiene una abertura 25 que puede actuar como salida (preferido) o como entrada (menos preferido). Un nodo central poroso hueco 23 está entre los dos tapones terminales 21, 22 y la membrana se coloca por el exterior de este nodo. El interior del nodo forma un espacio 27. La(s) membrana(s) 24, el nodo 23 y los tapones terminales 21, 22 se sellan de manera impermeable a los líquidos cada uno con respecto al otro, de tal manera que el fluido procedente del exterior del dispositivo debe fluir a través de
la(s) membrana(s) 24 y el nodo para alcanzar el espacio 27 y eventualmente la abertura 25 (en esta forma de realización es la salida).
Se conoce bien en la técnica la incorporación del material de relleno a las membranas, véanse las Patentes de los Estados Unidos 5.531.899 y 5.039.197. Se forman estas membranas seleccionando un material de matriz tal como un material plástico que incluye, pero no se limita a celulosas, celulosas regeneradas, polietilenos, polipropilenos, copolímeros EVA, PVDF, polisulfonas, poliétersulfonas, poliarilsulfonas, polifenilsulfonas, poliamidas, polimidas, nylons y similares; un porógeno, tal como un aceite mineral, sal, azúcar, almidón o un no solvente para el material de la matriz, tal como PvP o incluso agua y uno o más rellenos seleccionados entre los medios de eliminación de los constituyentes de obturación.
Se usan comúnmente dos procedimientos principales para formar membranas rellenas. En el primero se funde la matriz, se añaden el relleno y el porógeno (tal como aceite mineral) y se extrude la masa fundida completa, que se calandra o enrolla con forma de lámina plana. A continuación se extrae el porógeno para formar la membrana porosa rellena. En algunos casos, se tensiona a continuación la lámina en dirección paralela o perpendicular para crear incluso mayor número y tamaños o poros. En el segundo procedimiento común, se disuelve la matriz en un solvente con un porógeno que es un no solvente o solvente débil para la matriz. Se añade el relleno tal como en el primer procedimiento, y se agita la solución para formar una solución homogénea. A continuación, ésta se moldea por colada en forma de lámina y el solvente se expulsa o intercambia en una solución no solvente tal como agua. Se elimina también el porógeno, bien de manera simultánea o secuencial y se forma de esta manera una lámina de material de membrana porosa. Normalmente, las membranas son al menos microporosas (de 0,05 micrómetros de promedio de tamaño de poro a aproximadamente 10 micrómetros) o más grande para permitir un buen caudal o características del flujo.
De manera alternativa, se pueden conformar las membranas como materiales no tejidos tales como láminas fibrosas unidas mediante hilado que tienen el relleno incorporado tanto en la solución de hilado o unido a las fibras hiladas antes de que se adapten (tal como si simplemente se empolvaran las fibras hiladas con un polvo del medio, en el que éste se incorpora simplemente en la estructura superficial de las fibras).
La figura 3 muestra una tercera forma de realización en la que se han empaquetado uno o más medios de eliminación de los constituyentes de obturación 31 en una carcasa 30 que tiene una entrada 32, una salida 34, y un volumen interno 36. Puede retenerse el medio en la carcasa mediante diversos medios bien conocidos. Tal como se muestra, un filtro o tamiz 38 que tiene tamaños de poro más pequeños que los de las partículas del medio de filtración 31 retiene el medio 31 del escape de la carcasa 30 y de la entrada de la corriente de fluido. Se muestra el flujo del fluido mediante la flecha 39. El medio tal como se muestra es de un único tamaño. De manera alternativa, se pueden usar diversos medios dimensionados para crear un lecho de medio más concentrado. Esto se puede llevar a cabo mediante la mezcla de diversas partículas dimensionadas de medio 31A, 31B, 31C conjuntamente tal como se muestra en la Figura 3A o mediante la disposición de las diversas partículas dimensionadas 31A, 31B, y 31C en lechos del mismo tamaño dispuestos secuencialmente, tal como se muestra en la Figura 3B.
La Figura 4 muestra una forma de realización alternativa de la Figura 3 en la que el medio se captura en una estructura macroporosa tal como un monolito 40.
Se pueden usar también otros diseños y configuraciones para formar el dispositivo que contiene el medio, y esto significa que quedan abarcados por la presente invención. El punto clave es que haya suficiente cantidad de medio para eliminar una parte sustancial de los constituyentes de obturación a buenas velocidades de caudal y flujo, de tal manera que se proporciona una eliminación suficiente de los constituyentes.
En la primera etapa 110 de una forma de realización preferida del procedimiento de esta invención tal como se muestra en la Figura 5, se utiliza un modo de filtración a presión constante. Se retiene una solución 112 que contiene proteínas o péptidos mediante el depósito presurizado 115, y se bombea a la unidad del medio de filtración 116 mediante la presión en el tanque a través del conducto 118. La solución se somete a un modo de filtración en flujo normal, quedando retenidos los constituyentes de obturación por el medio, y la solución libre de constituyentes de obturación es descargada en forma de filtrado a partir de la primera etapa 110. Se pasa directamente el filtrado a través del conducto 120 para el procesamiento adicional corriente abajo que incluye la segunda etapa de filtración 122 (explicada en detalle a continuación), y a continuación hasta un conducto de salida 124. Trabajando de esta manera se retienen los constituyentes de obturación por medio de la unidad 116, mientras que la proteína o el péptido pasan a través del medio 116.
De manera alternativa, se podría usar una bomba para crear la presión constante del sistema aunque no se prefiere, ya que se necesitaría controlar cuidadosamente la bomba de salida para una presión constante mediante válvulas o la velocidad de la bomba, y se requeriría un sistema de retroalimentación para asegurar que la presión se mantiene constante.
Se muestra en la Figura 6 una segunda forma de realización de la presente invención, en la que se usa un modo de operación en flujo constante. En este sistema se usa una bomba 126 localizada entre el depósito 128 (normalmente no presurizado en comparación con el recipiente presurizado de la forma de realización de la Figura 5) y la primera etapa de filtración 130 para mantener el flujo constante. Se bombea la solución 131 a través del conducto 132 hasta la entrada de la bomba 134 y a continuación se bombea a través del conducto 136 hasta la primera etapa de filtración 130. De nuevo, el filtro de la primera etapa 130 puede ser cualquiera de los mencionados en la descripción de la Figura 5. La solución se somete a un modo de filtración en flujo normal, reteniéndose los constituyentes de obturación por el filtro de la primera etapa 130 y descargándose como filtrado la solución libre de constituyentes de obturación desde la primera etapa 130. El filtrado se pasa directamente a través del conducto 138 para el procesamiento adicional corriente abajo que incluye la segunda etapa de filtración 140 (explicada en detalle a continuación), y a continuación hasta un conducto de salida 142. Si se desea, se puede añadir un bucle de recirculación (no se muestra) en la salida (no se muestra) de la primera etapa de filtración, y recircular el filtrado a través de la etapa de filtración una o más veces para reducir adicionalmente el nivel del constituyente de obturación en el filtrado. El uso de una válvula (no se muestra) es el medio más simple para controlar el flujo entre el bucle de recirculación y el conducto corriente abajo. Se ha encontrado que es suficiente un paso de recirculación. Son generalmente innecesarios los pasos adicionales de recirculación y aumentan el tiempo y los costes de fabricación innecesariamente.
En la segunda etapa de filtración (122 o 140) se lleva a cabo una filtración para la eliminación vírica después de la eliminación de los constituyentes de obturación. Se eliminan los virus de la solución libre de constituyentes de obturación mediante un filtro de flujo normal (NFF) o un filtro de filtración con flujo tangencial (TFF) tal como se describe en el Documento USSN 09/706.003, presentado el 3 de Noviembre de 2000.
Los dispositivos adecuados representativos de la primera etapa incluyen aquellos formados a partir de medio
fibroso formado por fibras celulósicas, fibras sintéticas o las mezclas de las mismas, tales como almohadillas
MILLISTAK®+ disponibles en Millipore Corporation de Billerica, Massachusetts.
Se puede efectuar la filtración con uno o con una pluralidad de dispositivos en los que se pone en contacto la solución de alimentación que contiene la proteína o el péptido con los dispositivos de flujo en paralelo o en serie.
Cuando se eliminan los virus de una solución sustancialmente libre de constituyentes de obturación que contiene proteínas o péptidos, el filtrado de la etapa de eliminación del constituyente de obturación se dirige a una etapa de filtración vírica. La etapa de filtración vírica utiliza una o más membranas de filtración vírica (normalmente de ultrafiltración) que se pueden llevar a cabo tanto en modo TFF como en el modo NFF. En cualquier modo, la filtración se lleva a cabo bajo condiciones para retener el virus, generalmente con un diámetro de 20 a 100 nanómetros (nm) en la superficie de la membrana, permitiendo a la vez el paso de la biomolécula a través de la membrana. De manera adicional, cuando se completa la filtración de la corriente de alimentación, se limpia la membrana con agua o con una solución acuosa de tampón para eliminar cualquier biomolécula retenida. El uso de la etapa de limpieza permite obtener rendimientos mayores de proteínas o péptidos sustancialmente libres de virus.
Las membranas de ultrafiltración adecuadas representativas que se pueden utilizar en la etapa de eliminación vírica incluyen aquellas formadas a partir de celulosa regenerada, poliétersulfona, poliarilsulfonas, polisulfona, polimida, poliamida, difluoruro de polivinilideno (PVDF) o similares y se conocen como membranas VIRESOLVE® y membranas RETROPORE® disponibles en Millipore Corporation de Billerica, Massachusetts. Se pueden suministrar éstas en forma de cartucho (NFF) tal como filtros víricos NFP VIRESOLVE®, o como cassettes (para TFF), tales como cassettes PELLICON® disponibles en Millipore Corporation de Billerica, Massachusetts.
\newpage
Los filtros víricos utilizados en el procedimiento de esta invención se caracterizan por el valor de retención log (LRV; el logaritmo negativo del coeficiente de tamizado) para las partículas víricas y otras, partículas que aumentan monotómicamente con el diámetro de la partícula; en el intervalo de tamaño de interés para los virus de 20 a 100 nm de diámetro. Empíricamente, el LRV aumenta continuamente con el tamaño del área proyectada de la partícula (el cuadrado del diámetro de la partícula). Cuando uno se preocupa con la eliminación de las partículas víricas de pequeño tamaño de una solución que contiene proteínas o péptidos, se obtienen LRV satisfactorios de al menos aproximadamente 3. Sin embargo, se reduce el corte de pesos moleculares reduciendo por tanto la recuperación de proteínas o péptidos. Por tanto, el usuario escogerá una membrana que proporcione un LRV y una recuperación satisfactoria de biomoléculas. En cualquier caso, las membranas utilizadas en el procedimiento de esta invención son capaces de producir un LRV de 3 para virus y se pueden extender hasta una altura de 8 o mayor en la que el tamaño de la partícula vírica está comprendido entre 10 y 100 nm de diámetro. De manera adicional, las membranas de eliminación de virus utilizadas en el procedimiento de esta invención se caracterizan por un corte de peso molecular de la proteína comprendido entre aproximadamente 500 y 1000 kilo Daltons (kD). En todos los casos, se retiene la relación empírica con el área proyectada de la partícula. Los valores de reducción log para las partículas víricas (solutos únicos en solución; en ausencia de proteína) dependen del tamaño de la partícula vírica. Con virus de pequeña dimensión, tal como el de la hepatitis, se puede obtener un LRV mayor de aproximadamente 3 y con virus de dimensiones más grandes tales como el virus del SIDA, se puede obtener, por ejemplo, un LRV mayor de 6.
El siguiente ejemplo ilustra la presente invención y no se pretende que limite la misma.
Ejemplo 1
Se añadió una solución de alimentación que contenía el constituyente de obturación IgG la (Gamma Globulina Humana al 5% SeraCare, disponible en SeraCare, Inc, nº de Cat HS-9000) a un tampón fosfato (10 g/L de tampón FA, pH 7,2, de Fisher Scientific, nº de Cat. DF 2314150) y EDTA (sal de disodio calcio del ácido etilendiamino tetra ácido 1 mM disponible en Sigma Aldrich, nº de Cat ED2SC).
A continuación se modificó la solución de alimentación para representar una carga de constituyentes de obturación al 10% filtrando el 90% de la alimentación a través de una membrana que eliminó los constituyentes de obturación (membrana PLCXK como membrana UF de celulosa con un corte molecular nominal de 1000 kDaltons, disponible en Millipore Corporation de Billerica, Massachusetts).
La Figura 7 muestra los resultados del rendimiento (litros de fluido procesado/metro cuadrado de material antes de que se produzca el taponamiento del material) en la solución de alimentación a los constituyentes de obturación al 10% mediante tres modos diferentes de trabajo.
El Modo nº 1 usó el filtro vírico de flujo normal convencional sin ninguna etapa de eliminación del constituyente de obturación usando un filtro vírico NFP VIRESOLVE® de 13,5 cm^{2} disponible en Millipore Corporation de Billerica, Massachusetts, que se proporcionó para eliminar de manera selectiva los constituyentes de obturación de una solución de proteínas en un procedimiento de filtración de flujo normal (NFF).
El Modo nº 2 usó la primera forma de realización de la presente invención usando un dispositivo MILLISTAK® disponible en Millipore Corporation de Billerica, Massachusetts, que tenía 13,0 centímetros cuadrados de medio. El filtro estaba compuesto por celulosa fibrosa cargada y tierra de diatomeas lavada con ácido (tierra de diatomeas Celpure® 60 disponible en Advanced Minerals Corporation de Lompoc, California) unida a la celulosa fibrosa mediante un ligante catiónico. Se continuó esto por una etapa de eliminación vírica usando un filtro NFP VIRESOLVE® de 13,5 cm^{2} disponible en Millipore Corporation de Billerica, Massachusetts.
El Modo nº 3 usó otra forma de realización de la presente invención usando un dispositivo MILLISTAK® tal como se describió en el Modo nº 2. Se hizo pasar otra vez el fluido filtrado a través del medio una segunda vez, seguido por una etapa de eliminación vírica usando un filtro NFP VIRESOLVE® de 13,5 cm^{2} disponible en Millipore Corporation de Billerica, Massachusetts.
La Figura 7 muestra la Vmax (rendimiento) del ejemplo. El Modo nº 1 representa una etapa en la que no se eliminan constituyentes de obturación. Los Modos 2 y 3 representan diferentes experimentaciones en diferentes días con diferentes lotes de material de alimentación.
Se puede observar una importante mejora global en el rendimiento y el flujo obtenido con la etapa NFF de eliminación del constituyente de obturación. La Vmax fue un 200% mayor que la Vmax obtenida sin la etapa NFF de eliminación.
La presente invención proporciona un medio simple para la eliminación de los constituyentes de obturación de una corriente de proteínas antes de la filtración vírica. Esto reduce el ensuciamiento y la obstrucción que se podría producir de otra forma, aumentando el rendimiento y el flujo de manera importante. Adicionalmente, esto se lleva a cabo necesariamente sin la necesidad de filtración con flujo tangencial (TFF) que es más costosa de adquirir y de hacerla funcionar y que necesita limpieza entre usos. La presente invención permite disponer de un filtro del constituyente de obturación que permite eliminar el coste de limpieza y almacenamiento de la membrana entre usos, y el coste y el tiempo de validar los procedimientos propios para hacer lo anterior con agencias reguladoras tales como la FDA.

Claims (5)

1. Un procedimiento para eliminar de manera selectiva los constituyentes de obturación y las partículas víricas de una solución acuosa de proteínas o péptidos que comprende:
filtrar en primer lugar una solución de proteínas o péptidos que contiene dichos constituyentes de obturación y los virus mediante un dispositivo que contiene uno o más medios de eliminación de los constituyentes de obturación en un modo de operación de filtración con flujo normal,
recuperar la solución de proteínas o péptidos libre de constituyentes de obturación, y
en segundo lugar, filtrar directamente dicha solución de proteínas o péptidos a través de una o más membranas de ultrafiltración que tengan un corte de pesos moleculares comprendido entre aproximadamente 200 kD y aproximadamente 1000 kD para retener las partículas víricas en dicha una o más membranas de ultrafiltración a un nivel de al menos 3 LRV, y para recuperar una solución acuosa de proteínas o péptidos libre de virus, caracterizada porque el primer dispositivo de filtro está en forma de una almohadilla fibrosa y el medio de eliminación del constituyente de obturación comprende tierra de diatomeas.
2. El procedimiento de la reivindicación 1
a)
que comprende de manera adicional la etapa de limpieza de las biomoléculas retenidas en dicha una o más membranas de ultrafiltración, o
b)
en el que se efectúa la filtración con dicha una o más membranas de ultrafiltración mediante filtración con flujo tangencial, o
c)
en el que se efectúa la filtración con dicha una o más membranas de ultrafiltración en un modo de trabajo de filtración con flujo normal.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la almohadilla fibrosa comprende
a)
una o más capas de filtros de adsorción de lecho profundo, ó
b)
una o más capas de membranas microporosas rellenas, o
c)
uno o más lechos que contienen dicho uno o más medios de eliminación de los constituyentes de obturación.
4. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que
a)
la almohadilla fibrosa comprende una o más capas de membranas microporosas rellenas en las que las membranas se forman de un material seleccionado entre el grupo constituido por celulosa regenerada, poliétersulfona, poliarilsulfona, polisulfona, polimida, poliamida o difluoruro de polivinilideno, o
b)
la almohadilla fibrosa comprende una o más capas de filtros de adsorción de lecho profundo fabricados de un material seleccionado entre el grupo constituido por fibras celulósicas, fibras sintéticas y las mezclas de las mismas, o
c)
la almohadilla fibrosa comprende una o más capas de filtros de adsorción de lecho profundo fabricados de un material seleccionado entre el grupo constituido por fibras celulósicas, fibras sintéticas y las mezclas de las mismas y la tierra de diatomeas se mezcla con uno o más medios de eliminación del constituyente de obturación seleccionados entre el grupo constituido por silicatos y perlita.
5. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el medio de eliminación del constituyente de obturación comprende tierra de diatomeas lavada con ácido.
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