CN1576281B

CN1576281B - 清除病毒的方法

Info

Publication number: CN1576281B
Application number: CN2004100633208A
Authority: CN
Inventors: R·W·范霍尔滕; G·E·小乌伦森
Original assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc; Millipore Corp
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc; EMD Millipore Corp
Priority date: 1997-10-14
Filing date: 1998-10-14
Publication date: 2012-08-08
Anticipated expiration: 2018-10-14
Also published as: WO1999019343A1; KR100547077B1; KR20010015753A; EP1030862A4; EP1030862B1; NO326392B1; DE69839218D1; CA2306181C; CA2306181A1; CN1279688A; CN1576281A; CN1163503C; ATE388162T1; JP2002500164A; US6096872A; AU744845B2; AU1081799A; JP4255210B2; ES2302361T3; DE69839218T2

Abstract

生产基本无病毒免疫球蛋白尤其是抗D免疫球蛋白的方法，以及所得产品。具体地说，本发明提供在高离子强度缓冲液中用诸如聚山梨酸酯80的赋形剂超微过滤抗D免疫球蛋白的方法。附加步骤包括用渗滤浓缩抗D蛋白和降低赋形剂浓度。

Description

清除病毒的方法

本申请是中国专利申请98811286.8，“清除病毒的方法”的分案申请。

发明领域

本发明所属领域为：在纯化、减少或清除病毒的过程中，通过小孔径排阻滤膜(filter)回收大蛋白类物质。通过大小排阻将病毒与大生物分子(例如γ球蛋白)分离的障碍在于难以令大的球蛋白通过所需小孔径滤膜以供制药或诊断性应用。用本发明方法从蛋白分子中清除病毒可得到基本无病毒的产品。

发明背景

在纯化、减少或清除病毒的过程中，通过小孔径排阻滤膜(filter)回收大蛋白类物质是目前制药和诊断行业中的重要问题(参见Roberts，P.，Vox Sang，1995；69：82-83)。通过大小排阻将病毒与大生物分子(例如单克隆或多克隆γ球蛋白)分离的障碍在于难以令大的球蛋白通过12-15nm孔径的排阻滤膜。如果要从高分子量产品中清除小的无包膜病毒时，这一问题特别突出。该过程的复杂性还在于，欲回收的蛋白类物质例如免疫球蛋白会形成二聚体和三聚体，它们很难或根本就不能通过滤膜。

孔径越小，膜截留病毒颗粒的效果越好。然而，随着孔径的减小，膜允许除病毒产品自由通过的能力随之下降。对所有的除病毒技术来说，每一种应用都必须针对每一种产品和每一种病毒进行评价。如果需要清除小的无包膜病毒，可能必须使用孔径小于35nm，更好的是12-30nm之间的病毒滤膜，但这不能用于高分子量的产品或会形成二聚体和三聚体的产品。

上述Roberts的文献中描述了这一问题，其中谈到，虽然标称截留值为70、160kD，孔径15、35、40、50和70nm的滤膜可用于清除小病毒和朊病毒，但大分子量产品例如免疫球蛋白(IgG，150kD)和VIII因子(350kD)只能通过孔径更大的滤膜。

本发明方法包括免疫球蛋白药剂的过滤和病毒清除。

为了防止新生儿溶血病，给母亲注射人源Rho(D)免疫球蛋白。此类产品之一是由本发明的受让人出品，它防止未受免疫的Rho(D)阴性母亲“来自”Rho(D)阳性婴儿红细胞上的Rho(D)抗原产生应答，由此发挥其作用。这样，通过防止母亲产生抗Rho(D)抗体，避免了她的Rho(D)阳性婴儿患新生儿溶血病。虽然，目前用Cohn醇分离法成功生产得这一产品，但数位研究者曾试图用其他方法来生产类似产品，以期经济地获得更优良的产品，减少对血浆的大量需求。这样的研究性努力可参见Hoppe等的报道：“预防Rh免疫，用离子交换层析的生产静脉注射用IgG-抗Rh改良法”，Vox Sang，25：308-316(1973)，以及Friesen等的“离子交换柱制备和静脉注射用的Rh免疫球蛋白特性分析”，Jounal ofApplied Biochemistry，3，164-175(1981)。

德国的Hoppe和加拿大的Friesen都将DEAE-Sephadex层析柱与磷酸盐缓冲洗脱液联用。Hoppe的含抗D血浆来自通过了至少6个月HB Ag试验室检测的志愿者，血浆被临时保存。所以，Hoppe使用了较安全的无感染血浆作为起始原料。然而，他没有进行其他检测以测定DEAE-Sephadex去除乙肝表面抗原的效果。相反，Hoppe考虑的是去除凝聚体和分离抗体浓度较高的完整的、免疫电泳纯IgG。Friesen所做的则是对Hoppe方法的改良，以开发出供加拿大使用的静脉用Rh IgG。和Hoppe一样，Friesen对每一份Rh血浆进行HB AG检测以剔除阳性供体。Friesen使用Abbort Laboratories，North Chicago，ILL的放射性免疫分析试剂盒(Ausria I试剂盒)。目前，该测试仍被认为是最灵敏的试验之一，并被用于后文所述的本发明中。Friesen称，临床试验显示，用DEAE-Sephadex树脂/磷酸盐缓冲液组合生产的物质能够有效而安全的防止Rh免疫。然而，Friesen的报道中没有测定DEAE-Sephadex树脂/磷酸盐缓冲液组合清除血浆样品中乙肝表面抗原的效果。至少从美国政府的角度来看，这是非常重要的，因为用于筛选供体血浆样品的放射性免疫分析试验不能检测出浓度再低两三个数量级的HB AG颗粒，而这样的浓度仍可能具有感染性。正是因为用这种方法生产的制剂可能具有感染性，所以，美国政府在批准用固相法生产的可注射免疫球蛋白产品时特别严格。

(人)Rho(D)免疫球蛋白是第一个成功地预防性抑制抗体介导的免疫的特异性抗体。

是一种IgG免疫球蛋白溶液，所含抗Rho(D)的剂量为每剂抗Rho(D)活性300微克。可在合适的时候将

给予未经免疫的Rho(D)阴性孕妇，防止她的Rho(D)阳性后代患病。所述的疾病为新生儿溶血病，更具体的说是胎儿Rh成红细胞增多症。

本发明受让人还出售一种较低剂量的抗Rho(D)，

(人)Rho(D)免疫球蛋白小剂型(50微克抗Rho(D))，治疗妊娠12周或更早时流产的妇女。全剂量保护接受者抗高至15ml的Rho(D)阳性红细胞，小剂量则提供抗高至2.5ml的Rho(D)阳性红细胞的保护。被用于妊娠26至28周时的产前预防。其它适应症包括妊娠各阶段的继续妊娠的先兆性流产，在妊娠13周或之后发生的流产或妊娠终止，腹部创伤或基因羊膜穿刺，绒膜绒毛取样(CVS)和经皮脐带血取样(PUBS)。

FDA和生物部批准使用的多数免疫球蛋白类注射物质目前是用哈佛大学E.Cohn博士40年代开发的醇分离法生产的，参见Cohn等，J.Am.Chem.Soc.68，459(1946)。与该方法联用的是用目前最灵敏的检测方法仔细挑选检测肝炎感染性、HIV及其它血液携带病原呈阴性的血浆，该方法应用的如此之久，以至于美国政府只承认用该方法所得制剂是安全的。无数的产品接受者没有被感染，这就可以证明该方法所得产品的确安全。

有几种从人血浆中分离γ球蛋白的常规方法值得注意：Baumstark等，“从人血清中分离7Sγ球蛋白的制备方法”，Archives of Biochemistry and Biophysics，108，514-522(1964)和A.Webb“30分钟从人血清中分离IgG的制备方法”，Vox Sang，23：279-290(1972)，本发明参考了以上两篇文献。虽然两篇论文都更侧重于从含多种其它污染性蛋白的血清中分离和挑选各种γ球蛋白，但也的确涉及从原血清样品中清除污染性蛋白等物质。它们都采用DEAE-Sephadex柱层析材料和磷酸盐缓冲洗脱液。两人在去除污染蛋白方面都获得了一定程度的成功，然而都没有涉及清除污染性肝炎病毒颗粒以提供安全的注射制剂。

本发明的目的之一是提供清除了病毒的纯注射免疫球蛋白。所述基本纯的产品是用本发明方法制备的。

本发明目的还在于提供纯化免疫球蛋白的生产工艺，较好地满足了时间、空间和蛋白质得率方面的要求。

本发明的过滤是通过筛-截留机制实现的，该机制依赖于病毒与滤膜平均孔径之间的相互关系。其效率不受温度、离子强度、病毒效价、压力、pH、表面张力及其它变量等过滤条件的影响。虽然，本发明的除垢剂和离子强度条件影响着IgG颗粒通过滤膜的能力，但它们不影响病毒的清除。为本发明受让人进行的研究显示，就病毒的灭活和包膜去除而言，所用缓冲液组成对病毒颗粒的影响极小。

发明概述

本发明方法得到了基本纯的免疫球蛋白。所述免疫球蛋白可以是单克隆或多克隆免疫球蛋白，例如单克隆或多克隆抗D免疫球蛋白，更具体的说是或MICRhoGAMI。

本发明免疫球蛋白制剂含4.0-6.0重量％免疫球蛋白，约24-36ppm乙基汞硫代水杨酸钠(Thimerosol)和约80-200ppm聚山梨酸酯80。更好的是，本发明制剂含5.0重量％免疫球蛋白，约33ppm乙基汞硫代水杨酸钠和约100ppm聚山梨酸酯80。

本发明设计了一种制造大的球蛋白的基本纯制剂的方法，步骤包括(a)用醇分离人血浆；(b)重悬产生的沉淀II；(c)将沉淀II重悬液与含赋形剂的高离子强度缓冲液混合；和(d)进行免疫球蛋白的超微过滤。所述醇可以是甲醇。高离子强度缓冲液可以是150mM NaCl-甘氨酸。所述赋形剂是非离子聚氧乙烯除垢剂，例如聚山梨酸酯80。

超微过滤包括使用截留值低于约30nm，低于12nm更好的第一超微滤膜。过滤还可以包括使用截留值约10kD至约60kD，约50kD更好的第二超微滤膜，它去除甲醇，浓缩蛋白质，并改变成最有利于产品稳定性的缓冲液。所述缓冲液例如低离子强度缓冲液，例如50mM NaCl-甘氨酸缓冲液。

本发明还设计了生产基本纯抗D抗原的方法，步骤包括：

(a)重悬自人血浆中分离的沉淀II；

(b)将沉淀II重悬液与加工助剂混合；

(c)进行免疫球蛋白的超微过滤。加工助剂包含高离子强度缓冲液和非离子赋形剂；高离子强度缓冲液包含150mM NaCl-甘氨酸缓冲液，非离子赋形剂包含聚山梨酸酯80。

本发明方法还可以包括步骤(d)：用截留值约50kD的超微滤膜浓缩免疫球蛋白。这一步骤还将高离子强度缓冲液改变成了低离子强度缓冲液，例如50mMNaCl-甘氨酸缓冲液。

附图简述

图1是分离人血浆，获得抗Rh球蛋白的流程图。

图2是用于本发明除病毒过程的Viresolve/超滤系统图。

图3A是为比较实施例3而安装的Viresolve-180系统，其中包含低离子强度缓冲液和聚山梨酸酯80。

图3B是比较实施例3的通量变化部分关闭后重建的Viresolve-18C系统。

图4显示比较实施例3的通量变化实验中，低离子强度缓冲液中免疫球蛋白G的筛选系数对通量图。

图5显示比较实施例3的体积减少实验中，低离子强度缓冲液中免疫球蛋白G的筛选系数对通量图。

本发明的详细说明

本发明将高离子强度(大致在生理学范围)缓冲液与非离子赋形剂组合，作为减少或清除大生物分子中病毒的加工助剂。本发明许对例如免疫球蛋白的球蛋白分子使用小孔径超微排阻滤膜，但不造成明显的得率损失，也不显著改变球蛋白亚型，凝聚水平或稳定性。高离子强度缓冲液与赋形剂只作为加工助剂，可在处理后由超微过滤去除。本发明方法得到了基本无病毒的产品。用本发明方法(大小排阻法)清除病毒确保从产品中去除各类潜在病毒，包括有包膜的(例如HIV、乙肝病毒)和无包膜的(例如甲肝病毒、细小病毒B19)。

本发明加工助剂的优点在于：(1)处理时间大大缩短的同时得率提高，因为加工助剂将平衡向形成二聚体、三聚体和凝聚体的反方向移动，提高了待处理的蛋白质浓度；(2)允许使用能更好地确保清除无包膜小病毒的小孔径滤膜；(3)通过滤膜的被处理免疫球蛋白未改变其亚型和稳定性；以及(4)可以优化处理设备和生产空间，从而得到的最高的单位面积产品得率。

用本发明方法处理的大分子包括大的球蛋白，例如白蛋白、免疫球蛋白(例如IgG)及其片段，血液凝聚因子，例如VIII、IX和XI因子，生长激素，载脂蛋白，酶(例如链激酶)，上述分子既可以是天然存在的也可以是基因工程获得的。

生产本发明基本纯无病毒免疫球蛋白产品所用的超微过滤单元的孔径小于约30nm，小于约15nm更好。然而，截留值足以减少或消除蛋白质溶液中无包膜病毒的任何滤膜都可用于本发明的处理方法。例如，可使用Viresolve-180(Millipore Corporation，Bedford，MA)单元，该单元分子量孔径截留值小于180kD，或小于12nm。本发明方法还可使用目前用于过滤小重组蛋白、细胞因子和淋巴因子产品以及血液分离产品的70kD孔径超微过滤单元。

直接明使用非离子赋形剂作为超微过滤加工助剂具有新颖性。本发明的非离子赋形剂包括乙烯聚合物，聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物或共聚物(Pluronics)，多糖，蛋白质，聚氧乙烯，丙烯酰胺聚合物及它们的衍生物或盐。已知，聚氧乙烯包括聚乙二醇。用于本发明的乙烯聚合物可选自：聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。用于本发明的多糖可选自：纤维素或纤维素衍生物，糖胺聚糖、琼脂、果胶、藻酸、葡聚糖、淀粉和脱乙酰几丁质。糖胺聚糖可选自：透明质酸，软骨素及相关分子。用于本发明的蛋白质选自明胶和纤连蛋白。虽然上述物质中有些不能通过超微滤膜，但它们存在于滤膜截留液侧就足以达到本发明的目的。

纤维素衍生物可包括烷基纤维素和羟基烷基纤维素，例如甲基纤维素，羟乙基纤维素，羧甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素和羟丙基纤维素。

本发明认为对球蛋白超微过滤来说，最好的是离子型除垢剂，具有聚氧乙烯或糖头基团(head group)的非离子除垢剂，溶血磷脂，胆盐，以及它们的混合物。特别好的是非离子聚氧乙烯除垢剂，例如聚山梨酸酯，Pluronics，Brij，Sterox-AJ，Tritons和Tweens。最好的是聚山梨酸酯80。

处理方法之初，本发明非离子赋形剂在蛋白质溶液的含量范围约0.015-0.024g/L，最好是约0.02g/L或20ppm。处理过程中，这样的赋形剂浓度已确定不会影响病毒的清除。非离子赋形剂中最好的是聚山梨酸酯80，用于处理时的最佳浓度是0.002％或20ppm。该范围正是或低于聚山梨酸酯80的临界胶体浓度。在确定本发明其它赋形剂的浓度时，可参照该赋形剂的临界胶体浓度。在此所述的赋形剂用量是专门针对对抗D免疫球蛋白而言的，然而，上述用量也适用于其它IgG制剂，例如(人和马)血清球蛋白和乙肝免疫球蛋白。产品中赋形剂的最终浓度可达约0.1-0.2％w/v；更好的是约80-200ppm；最好的是，约100ppm的聚山梨酸酯80。通常，对以相同剂量给予的所有IgG分子来说，赋形剂在最终产品中的含量是相同的。使用赋形剂的另一个优点是它可在过滤过程中作为消泡助剂。

本发明所用人血浆可用上文引用的Cohn等的方法(“Cohn法”)，用分批或柱交换层析，或用亲合层析获得。

本发明方法中，沉淀II(Cohn等的方法所产生)物质被稀释至约4.6-5.0mg/ml(约0.5％)，并且必须在以后通过超滤浓缩10倍，此间，使用低初浓的赋形剂是十分重要的；上述范围内，以约0.002％为佳的赋形剂浓度对方法没有不利影响。以有包膜病毒为例所述的不利影响可能是病毒与其包膜解离，病毒颗粒进入滤液。为本发明受让人用水泡性口炎病毒(这是一种子弹形、有包膜、含RNA的病毒)所做的研究显示，在本发明所用的赋形剂浓度(用于处理的5X溶液为100ppm或0.01％)，没有发生明显的病毒激活。

本发明处理所用的蛋白质浓度范围约为0.1-1重量％。约1％的浓度可用于单体或单克隆的蛋白物质。就本发明所用沉淀II免疫球蛋白而言，用于处理的蛋白质初始浓度约为4.6-5.0mg/ml(约0.45-0.5％)。

本发明参考的Cohn的美国专利2,390,074公开了通过分离血液来制备γ球蛋白的方法。用Cohn法制得的γ球蛋白含有19S的球蛋白，纤溶酶原和脂质。虽然该γ球蛋白特别适合预防例如麻疹和破伤风等疾病，19S的球蛋白，纤溶酶原和脂质却是不需要的污染物，它们会降低γ球蛋白预防对胎儿红细胞上Rh因子免疫应答的效力。

用有望获准的本发明方法制备的基本纯抗Rh球蛋白是从人血浆制备的，人血浆中含白蛋白，纤溶酶原，α、β和γ球蛋白，以及多种脂质。特别需要指出的是，本发明的抗Rh球蛋白是γ球蛋白。

根据本发明参考的已经被普通转让的Pollack等的美国专利3,449,314，分离人血浆制备抗Rh球蛋白。参照附图1的流程图，该方法分离人血浆的能力依赖于各种血浆成分的溶解度。在分离的各阶段，组分的分离与最终去除不希望留在抗Rh球蛋白中的各成分取决于对系统pH、温度、沉淀剂浓度和离子强度的严格控制。

血浆分离中使用了多种低介电常数有机溶剂，例如酮和醇，它们会使蛋白质沉淀。本发明方法所用有机溶剂包括各种醇和酮，优选的是甲醇。优选甲醇是因为与其它有机溶剂相比，它毒性较低，处理起来较安全(例如，爆炸危险性小)。

为了避免蛋白质在分离中变性，沉淀在低温下进行。由于蛋白质的溶解度是温度依赖性的，为了避免变性，每步分离所选温度必须是达到所需分离目的的最低温度。

参照附图1的流程图，分离从人全血浆开始。将血浆冷却至约1℃，离心，将低温下不溶的沉淀与上清液分离。进一步分离上清液，得到沉淀I和上清液I。丢弃主要含纤维蛋白原的沉淀I。进一步分离上清液I，得到上清液II+III和沉淀II+III。丢弃上清液II+III，其中含α和β球蛋白以及脂质。沉淀II+III主要是β和γ球蛋白以及同种凝集素，但也含凝血酶原、纤溶酶原、胆固醇和其它脂质。沉淀II+III经进一步分离，得上清液II+IIIW和沉淀II+IIIW。β球蛋白、胆固醇和其它脂质被基本清除到丢弃的上清液II+IIIW中。沉淀II+IIIW主要是γ球蛋白、同种凝集素、纤溶酶原和凝血酶原，以及部分β球蛋白、胆固醇和其它脂质。进一步分离沉淀II+IIIW得到上清液III和沉淀III。丢弃的沉淀III含同种凝集素，纤溶酶原与凝血酶原。上清液III主要是γ球蛋白和微量纤维蛋白原及脂质。分离最后得到沉淀II，它主要是纯γ球蛋白，几乎完全没有19S球蛋白、纤溶酶原和脂质。本发明方法制备的沉淀II是抗Rhγ球蛋白。

在本发明优选实施例中，重悬的免疫球蛋白起始材料是改良Cohn法制得的沉淀II浆料。如果在本发明所考虑的赋形剂存在下冷冻干燥蛋白质，则可以使用经冷冻干燥的沉淀II浆料。

本发明用来重悬沉淀II浆料的稀释液包括药学上认可的稀释剂，选自注射用水，U.S.P.(“W.F.I.”)，普通生理盐水U.S.P.，或各种合适的缓冲液，缓冲液的优点在于可提供稳定的pH。合适的缓冲液选自pH约为6.4的磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液，乙酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液。较好的是，最初的稀释剂是重量为浆料3倍的W.F.I.，然后经高离子强度缓冲液稀释后再进行第一次超微过滤。本发明采用的高离子强度缓冲液也适合作为最初的稀释剂。采用的离子强度宜为150mM+/-20％，较好的是150mM+/-20％NaCl甘氨酸缓冲液；pH6.4。

在本发明处理和过滤免疫球蛋白的过程中，宜用高离子强度缓冲液作为加工助剂减少免疫球蛋白二聚体和三聚体的形成，从而使球蛋白更充分地通过滤膜。合适的高离子强度稀释剂即前文所述的重悬稀释剂，但离子强度更高，pH约为6.4。较好的是，所述加工助剂的离子强度约为最佳的150mM+/-20％，这接近生理离子强度。在本发明的最佳实施例中，高离子强度加工助剂是150mM NaCl甘氨酸缓冲液，pH6.4。

在处理本发明免疫球蛋白时，在过滤步骤开始时可将非离子赋形剂与高离子强度缓冲液混合。这可参照制备含聚山梨酸酯80的高离子强度缓冲液的实施例2A和3A。本发明的加工助剂可根据其它组分相对调节，这样，当聚山梨酸酯80浓度升高时，可减少离子强度组分。

可在本发明处理方法所得的药物产品中使用防腐剂。较好的是药学上认可的防腐剂，例如乙基汞硫代水杨酸钠和叠氮钠，前者的使用浓度可以是26-36ppm，本发明中是33ppm(0.003％)。然而，在一次性胃肠外给药的本发明免疫球蛋白制剂，尤其是

和

制剂中，不必使用防腐剂。

在本发明用小孔径第二超微滤膜浓缩蛋白质并清除有机溶剂的步骤中，高离子强度缓冲液可能被转换成较低的离子强度，例如50mM的缓冲液，所述滤膜的截留值约10-60kD，例如Biomax-50(截留值50kD)滤膜(Millipore Corporation，Bedford，MA)。这一蛋白质浓缩步骤浓缩了蛋白质产品，同时去除了部分赋形剂和有机溶剂。

在用Viresolve-180膜系统进行过滤时，跨膜压力以约＞0-3.0psi为宜，最好低于约1.5psi.。筛分系数以高于约60％为佳。

本发明的处理可在环境温度下进行。低温下进行处理一般会延长过滤时间，因为这样的温度(例如16-17℃)通常会增加粘度。处理过程中的产品温度可以是约0℃或略高于45℃，更好的是约15-30℃，最好的是约20-25℃。

本文中以下用语的意义如下所述：

横流流速溶液流经滤膜表面的流速，ml/min

透过液通过滤膜的纯化产品

截留液被滤膜截留的物质

通量透过液流速/面积

换算比透过液流速/横流流速

筛分系数透过液中蛋白质浓度/截留液中蛋白质浓度

在本发明实施例之一中，参照附图2，如下进行生产规模的处理，以得到基本纯(清除了病毒)的免疫球蛋白，例如

用Cohn纯化法(Cohn等，J.Am.Chem.Soc.，Vo1.68，p.459-475)，但将乙醇换成甲醇，将Rho(D)免疫球蛋白纯化成“沉淀II浆料”，重悬在注射用水(WFI)U.S.P.中，冷却至2-8℃。用以下公式计算WFI体积：

沉淀II重量(kg)×3L/kg＝所需WFI体积(L)

每kg沉淀浆料重悬在3LWFL中。

混合物在维持罐-产品(1)中涡流搅拌(无泡沫)3-8小时，使用前保存于4℃。对除病毒系统进行就地蒸汽消毒(SIP)，所述系统包括安装在除病毒滤膜夹具中的Viresolve CIP/SIP模块(Millipore Corporation，Bedford，MA)(2)和装在超滤膜夹具上的Pellicon CIP/SIP模块(Millipore Corporation，Bedford，MA)(3)。还对系统和50mM NaCl-甘氨酸缓冲液储罐(4)进行CIP/SIP。

就地清洗(CIP)过程是一种无需拆卸零部件的设备清洗过程。对设备的要求是：所有管道都是不锈钢的，斜度和排布合理，垫圈尽可能少。CIP的目的是免除手工清洗和避免批次间的交叉污染。可对该过程进行检验。清洗要素包括时间，温度，化学和机械参数。处理后残留物的类型将决定CIP所用的清洗剂。制药业的一般技术人员都熟悉CIP的过程和要求。

SIP之后，Viresolve CIP/SIP模块(2)换装成用于40L沉淀II重悬液的20叠Viresolve-180R模块。(10叠Viresolve-180滤膜可用于10-16L最终产品，20叠可用于＞16-40L最终产品)。Pellicon CIP/SIP模块(3)换装成4个Biomax-50滤框(Millipore Corporation，Bedford，MA)。2个Biomax-50滤框可用于10-16L沉淀II重悬液，4个Biomax-50滤框可用于＞16-40L沉淀II重悬液。Viresolve-180模块用氯消毒并清洗，直至二乙基苯二胺(DPD)测定的氯含量≤0.3ppm。

消毒后对模块(2)进行稳压测试。模块必须至少能承受10psi压力，并且，所需5分钟测试后的压降≤1psi。

用WFI U.S.P.，冲洗Biomax-50滤膜。对最后透过的冲洗样品进行苯扎氯铵(Roccal)测定；苯扎氯铵含量必须≤10ppm。对Biomax-50滤框进行扩散测试；如下计算释放速度：

释放体积(cc)÷时间(min)÷滤框数＝释放速度(cc/min/滤框)

释放速度必须≤18cc/min/滤框。

用Viresolve-180(2)对50mM NaCl甘氨酸缓冲液进行除病毒超滤。在除病毒循环罐(T-1)(5)中加入50mM NaCl甘氨酸缓冲液。加入的最大体积是250L，最小是130L。

缓冲液在T-1(5)中循环，同时将缓冲液透过液收集在一离线罐中。

在除病毒循环罐(T-1)(5)中加入至少60L的150mM NaCl甘氨酸缓冲液，用于洗罐和洗膜。

如下处理沉淀II重悬液。以形成涡流但不发泡的速度搅拌沉淀II15-30分钟，直到完全悬浮。用手持突眼计测定沉淀II悬浮液的折光率蛋白质百分浓度(mg/ml蛋白)。为达到5.0mg/ml蛋白质浓度所需的沉淀II稀释液最终体积用以下公式计算：

所需150mM NaCl甘氨酸缓冲液体积用以下公式计算：

所需沉淀II稀释液体积(L)-沉淀II悬浮液体积(L)＝加入缓冲液体积(L)

加缓冲液是为了稀释沉淀II，以形成涡流但不发泡的速度搅拌混合至少30分钟。下一步处理之前，混合物在15-30℃最多保存2.5小时。

将沉淀II稀释液分批加入除病毒循环罐T-1(5)进行超滤。TMP设定值约为3.0。然而，它可能会升高。如果达到了约12，滤膜可能被极化，应允许截留液在滤膜上流洗(透过液减少)。如下计算Viresolve液位设定值：

如果以上结果小于50，则以50作为Viresolve液位设定值。将1/3总体积圆整到最接近的整数(L)。如下计算超滤浓缩终点：

如果以上结果小于20，则以20作为浓缩终点。

如下计算超滤渗滤终点：

浓缩终点-3＝渗滤终点

渗滤膜总设定值的计算如下：

浓缩终点×5.5＝渗滤膜总设定值(L)

超滤/浓缩过程开始时，Viresolve-180进料泵(P1)的速度调节为对应于20叠滤膜的75-83％，或对应于10叠滤膜的37-42％。控制TMP；则TMP由渗透泵(P2)速度来控制；如果跨膜压力达到3，则降低泵速。将Viresolve渗透泵(P2)(8)的速度缓慢升高到18％，若用10叠滤膜则升高到9％。调高P2后，则截留压(PT3)稳定在≥5.0psi。TMP达到平衡后，将泵速设定在对应于10叠滤膜的9-11％和对应于20叠滤膜的18-23％。然而，不控制TMP压力，则该压力最好较低，例如低于3.0psi，否则，滤膜会极化。如果TMP升高，例如接近12psi，可以停止渗透，使得截留液在滤膜上流洗。UV值(UV1)(9)必须介于下限4.0A.U.与上限7.7A.U.之间。透过液流速(FT1)介于下限0.81L/min(LPM)与上限0.98L/min(LPM)之间；若为10叠滤膜，则介于0.40-0.49LPM之间。处理温度保持在约15-30℃。在除病毒/超滤过程中，对以上条件进行全程监控。UV值(UV1)(9)介于下限6.4A.U.与上限7.7A.U.之间。筛分系数应≥约75％。

当T-2(6)的体积达到约75-100L时，建立Pellicon系统(3)，开始混合。启动/调高UF进料泵(P5)(10)，由泵速控制UF渗透流速。UF进料压(PT4)和UF截留压(PT5)保持为：

UF进料压：≤30psi

UF截留压：≤10psi

保持进料压和截留压之间的压差≤20psi。

进料压(psi)-截留压(psi)＝压差(psi)

进料罐T-1(5)内沉淀II稀释液的体积水平由T-1上的测压元件监测(通过重量)并做出响应。

在T-1(5)中进行恒容渗滤。这次渗滤使得残留的蛋白质通过系统和Viresolve-180滤膜，从而提高得率。进行3次150mM NaCl-甘氨酸缓冲液渗滤；加入固定量的缓冲液，加入速度与其通过Viresolve-180渗透去除时的相同。渗滤完成后，如前所述，用氯消毒T-1(5)和Viresolve-180模块(2)，确保任何滞留的病毒被灭活。在T-2(6)内用无病毒50mM NaCl-甘氨酸缓冲液进行的恒容渗滤浓缩其中的内含物。这一步骤浓缩了产品，并将高离子强度缓冲液浓度转变成了低离子强度缓冲液浓度，去除了Cohn过程中的甲醇以及约一半的聚山梨酸酯80。渗滤完成后，记录T-2(6)中的液位(L)。从T-2(6)中取样，进行UF透过液样品的数字比电导测定。结果必须落于4.95-5.67×10^-3mhos/cm范围内。如果第一次测试不满足以上要求，必须继续恒容渗滤，直到测试结果落于上述范围内。

5.5X渗滤后T-2液位必须≤95％沉淀II重悬液体积。如果T-2液位高于95％沉淀II重悬液体积，继续浓缩，直到T-2内体积达到上述体积要求。达到上述体积水平后，关闭UF渗滤(11)，环流混合内含物，无菌取样10.5ml(12)。用手持式突眼计测定0.5ml样品中的蛋白质含量。如果蛋白质浓度低于5.5％，必须进一步浓缩样品，直至达到上述最低百分比。将内含物排放到一个临时容器中，用以下公式通过重力计算内含物的重量：

临时罐的装满重量(kg)-临时罐的自重(kg)＝T-2内产品重量(kg)

用以下公式确定达到最终产品体积所需加入的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液体积，可调节产品量：

需加入的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液体积是如此计算的：

所需最终体积(L)-T-2内的产品总体积(L)＝需加入的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液体积(L)

用剩余样品测定最初pH，先用0.9％NaCl以1∶10稀释小份样品，然后用0.5NHCl或0.5N NaOH的1∶100稀释液滴定到pH6.3-6.4。

如果需要调整，如下计算调整产品pH所需未稀释0.5N试剂的量：

所需最终体积(L)-1∶100的滴定剂需量(ml)＝未稀释0.5N试剂的量(ml)

用已认可的方法检测Viresolve-180滤膜模块的完整性。完整性测定值必须不低于1.2，必须如前所述对模块进行氯消毒和清洗。

将由上述公式算得的未稀释0.5N试剂与可能需要100X乙基汞硫代水杨酸钠溶液加入产品。如下计算可能需要加入的乙基汞硫代水杨酸钠溶液的量：

根据以下公式计算加入产品的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液：

罐2的液位(L)+50mM NaCl-甘氨酸缓＝最终所需产品体积

冲液所需体积(L) 的罐2液位(L)

达到所需的最终体积后，用泵将产品返回到T-2中，在T-2中继续混合10-60分钟，然后无菌取样10.5ml产品，测定pH。pH应是6.3-6.4。如果pH不在该范围内，必须如前所述稀释样品并滴定，直到达到认可的pH，应如前所述计算非稀释0.5N试剂的需量，并在混合时加还到产品中。

如前所述，用手持式突眼计，通过折光率测定蛋白质含量。如果蛋白质含量≥可接受的5.0％，则产品可进入下一步骤。如果蛋白质浓度低于可接受的百分比，则产品报废。

可用0.2μ的Optiseal滤膜(13)过滤产品，过滤过程中的压力不超过15psi，然后对产品进行微生物学和血清学测定。

对除病毒系统进行包括使用WFI和蒸汽的就地清洗过程(前文所述CIP)。

表1列出了可接受的产品标准。

表1

本发明制剂的给药方式决定了化合物将到达的生物体内的部位和/或细胞。本发明化合物可以单用，但通常与根据所需给药途径和标准制药实践所选的药用载体或稀释剂混合使用。例如，制剂可胃肠外注射，动脉注射或静脉注射。制剂也可以通过口腔、皮下或肌内途径传递。就胃肠外给药而言，化合物可以无菌水溶液的形式使用，溶液中还可以包含其它溶质，例如另溶液具有等渗性的足够的盐或葡萄糖。

就经口给药而言，本发明的EPO组合物可以片剂、胶囊、锭剂、粉剂、糖浆、酒剂、水溶液和悬浮液等形式使用。如果是片剂，可用载体包括乳糖、柠檬酸钠和磷酸盐。片剂中常使用诸如淀粉等崩解剂和诸如硬脂酸镁等润滑剂。如果以胶囊形式给药，可用的吸收剂是乳糖和高分子量的聚乙二醇。在要求口服水溶液时，可加入某些甜味剂和/或赋味剂。

本发明的基本纯免疫球蛋白可给予包括人在内的哺乳动物等对象。就治疗中的给药而言，开具处方的医师将最终决定对特定人或动物对象合适的剂量，这可能随个体的体重、年龄、反应以及症状的特性和严重程度而不同。

就本发明基本纯的抗D免疫球蛋白而言，每剂的剂量为300μg

和约50μg

两药的给予都遵照前文及相关产品说明中的指导，并用于其中所述的目的。上述产品也都可以多次给药，以达到主治医生所确定的总传递量。

以下实施例用于说明本发明，而不是限定本发明的范围。

实施例

实施例1

通过以下超滤方法生产无病毒的

用改良的Cohn纯化法(见前文)将Rho(D)免疫球蛋白3.250kg纯化至“沉淀II”，将其重悬在9.750L注射用水(WFI)U.S.P.中，冷却至5℃。混合物涡流搅拌(不发泡)4小时，使用前保存于4℃。沉淀II重悬液的重量为3.250kg。

SIP后，安装适合约13.0L沉淀II重悬液的Viresolve-180R模块(MilliporeCorporation)(10叠)。Pellicon CIP/SIP模块换装为2个Biomax-50滤框。Viresolve-180R模块用氯消毒并洗涤。用WFI U.S.P.，冲洗Biomax-50滤框。测定最后透过的冲洗样品的苯扎氯铵(Roccal)；苯扎氯铵浓度为6ppm。对Biomax-50滤框进行扩散测试；如前所述计算释放速度；5分钟内的总释放体积是2ml，实际释放速度是0.4cc/min。

用Viresolve-180以190.0L 50mM NaCl-甘氨酸缓冲液进行除病毒超滤。在除病毒循环罐(T-1)中加入50mM NaCl-甘氨酸缓冲液100L。缓冲液在T-1中循环，同时将缓冲液透过液收集在一个预先消毒过的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液储罐中。21.7℃时收集到的透过缓冲液体积是123.3L，收集进行50分钟。除病毒后的缓冲液保存在约25℃的环境温度下。

将缓冲液进料罐与除病毒循环罐(T-1)连接，用150mM NaCl-甘氨酸缓冲液(参见实施例2A)冲洗。在T-1中加入60L 150mM NaCl-甘氨酸缓冲液进行冲洗。

如下处理沉淀II重悬液。搅拌沉淀II(3250g)20分钟，直到完全悬浮，搅拌速度形成涡流但不发泡。用手持式突眼计，通过折射率(mg/ml蛋白质)测定沉淀II重悬液的蛋白质含量，结果为49mg/ml(约5.0％蛋白质)。

计算使得蛋白质浓度为5.0mg/ml所需的沉淀II稀释液体积，：

或

用以下公式计算所需含20ppm聚山梨酸酯80的150mM NaCl-甘氨酸缓冲液的体积：

所需沉淀II稀释液体积(L)-沉淀II重悬液体积(L)＝加入缓冲液体积(L)

或

(127.4L)-(13.0L)＝114.4L加入的缓冲液

将114.4L缓冲液加入13L沉淀II稀释液中混合，混合速度足以形成涡流但不发泡，混合45分钟。

在除病毒循环罐中加入100.0L沉淀II稀释液。启动除病毒循环罐(1号泵)，若用10叠的Viresove-180模块，则进料泵的速度为40％。若是10叠的模块，将除病毒渗透泵(2号泵)的速度调至0.450LPM(10.0％)，以保持最初跨膜压力低于1.6psi.。实际压力保持在1.6psi.。调整产品泵(3号泵)速度至控制水平。在处理全过程中，通过监测除病毒罐截留侧的蛋白质浓度保持TMP不超过3.0psi.。观察在线UV监测器，将吸光度保持在对应于4.5-5.5mg/ml的蛋白质浓度的6.4-7.7单位。

在约75L透过液从除病毒罐进入超滤罐(UF)后，启动超滤进料泵(5号泵)，速度为10％。调高泵速(至30％)，直到UF透过液流速等于除病毒透过液的流速，然后设定在25％以保持恒定体积。UF透过液流速为0.4LPM，VC透过液流速为0.460LPM。保持UF罐内体积恒定在75.3L。UF进料压力为5.4psi.，UF渗透压力为0.2psi.，UF截留压力为0.3psi。

当T-1内含物降到15-20L后，进行恒容渗滤。用150mM NaCl-甘氨酸缓冲液(总体积约60L)至少交换3次以维持渗滤。渗滤完成后，关闭除病毒罐的泵和搅拌器。保持VC循环罐内体积恒定在16.2L。交换缓冲液总体积为49L。自UF泵启动开始，完成除病毒渗滤约需4小时。

对T-2内的产品进行循环，用清除了病毒的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液(无聚山梨酸酯80)进行恒容渗滤浓缩。将产品浓缩到接近初始沉淀II重悬液体积。将透过液阀完全打开，UF泵速为65％；通过给截留回路(loop)施加背压(back pressure)保持进料压力低于30psi，保持压力差为14-17psi。将UF体积维持在20L，交换缓冲液总体积为110L。从T-2中取样，测定UF透过液样品的数字比电导。结果为5.29×10^-3mho/cm。达到体积液位后，关闭UF渗透，循环混合产品，无菌取样10.5ml。取0.5ml样品，用手持式突眼计通过折射率测定蛋白质含量。蛋白质浓度为4.8％。

要达到5％蛋白质含量所需的最终产品体积计算如下：

或

进一步浓缩产品至11.424L的最终体积，以达到5％的蛋白质浓度要求。

用剩余样品测定最初pH，先将样品用0.9％NaCl稀释10倍，然后用0.5N HCl或0.5N NaOH的100倍稀释液滴定至pH6.3-6.4。pH为6.58。

为了校正pH，加入1.8ml滴定液即以0.9％NaCl配制的0.5N HCl溶液，最终的pH为6.31。如果需要校正，如下计算校正pH所需非稀释0.5N试剂的量：

所需最终体积(L)-所需100倍稀释的滴定液体积(ml)＝非稀释0.5N试剂体积(ml)或，在本实施例中，

11.424L×1.8ml＝20.563ml非稀释0.5N试剂

根据已知方法测试Viresolve-180滤膜模块的完整性。完整性测试值必须大于1.2，模块必须如前所述用氯消毒并清洗。

计算所需100X乙基汞硫代水杨酸钠溶液的体积：

或

不断混合产品，同时加入99.7ml的100倍乙基汞硫代水杨酸钠溶液。

用0.70L清除了病毒的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液将产品调节到所需的最终体积，混合10分钟。

无菌取样10.5ml产品测定pH。pH应是6.3-6.4。实际pH是6.54。因为pH不在上述范围内，所以稀释样品并滴定到可接受的pH，计算所需非稀释0.5N试剂的量，返还到产品中混合。

11.9L ×1.7ml ＝20.2ml

所需最终体积(L)×1.7ml 所需稀释液100倍稀释所需非稀释0.5N试剂

液体积的体积(ml)

达到pH6.35所需滴定液体积为1.7ml。

如下所述，最终的蛋白质产品满足上述接受标准：

蛋白质＝5.0％

两次测试的聚山梨酸酯80(A₃₁₉)为104.6和106.7，平均值为105.7。

气相层析测得的甲醇含量为32.4ppm。

实施例1A

如下制备实施例1中使用的150mM NaCl-甘氨酸缓冲液：

计算需制备的缓冲液量：

[重悬浆体积(L)×10L]×2+60＝缓冲液制备体积

[13L×10L]×2+60＝制备320L缓冲液

确定并测定所需原料量，加入清除了热原的容器中。

表2

多次用2L注射用水，U.S.P.，清洗称量聚山梨酸酯的容器，将每次的洗涤液都加入原料中。共加入10L。确定以下物质的量：

用注射用水，U.S.P.，稀释混合物，将最后所得混合物量混合60分钟。测定pH；要求是6.3-6.5。实际pH为6.46。如果不合要求，则需添加1.0N HCl或1.0NNaOH，直到达到要求的pH；每次添加后都必须将溶液混合15-30分钟，并确认pH测定结果。

测定数字比电导；要求是25℃时为14.15-15.59×10^-3mhos/cm。结果是15.38×10^-3mhos/cm。如果不合要求，则报废并重新制备。

测定聚山梨酸酯80；测试样品必须含15-24ppm聚山梨酸酯80。实际浓度为22.8ppm。

实施例2

在实施例2中，如前所述进行以下改动，通过超滤生产无病毒

：

用改良的Cohn纯化法将Rho(D)免疫球蛋白6.802kg纯化至“沉淀II浆料”，重悬在20.406L注射用水(WFI)U.S.P.中，冷却至4℃。涡流搅拌(不发泡)混合物4小时，使用前保存于4℃。

SIP后，安装用于27.208L沉淀II重悬液的Viresolve-180R模块(MilliporeCorporation)(20叠)。Pellicon CIP/SIP模块换装为2个Biomax-50滤框。Viresolve-180R模块用氯消毒并洗涤。用WFI U.S.P.，冲洗Biomax-50滤框。测定最后透过的冲洗样品的苯扎氯铵(Roccal)；苯扎氯铵浓度为8ppm。对Biomax-50滤框进行扩散测试；如前所述计算释放速度；5分钟内的总释放体积是22cc，实际释放速度是4.4cc/min。

用Viresolve-180以245L 50mM NaCl-甘氨酸缓冲液进行除病毒超滤。在除病毒循环罐(T-1)中加入245L 50mM NaCl-甘氨酸缓冲液。缓冲液在T-1中循环，同时将缓冲液透过液收集在一个预先消毒过的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液离线储罐中。收集到的透过缓冲液体积是213L。除病毒后的缓冲液保存在约63-78F的环境温度下。

将缓冲液罐与除病毒循环罐(T-1)连接，用150mM NaCl-甘氨酸缓冲液(参见实施例2)冲洗。在T-1中加入60L 150mM NaCl-甘氨酸缓冲液进行冲洗。

如下处理沉淀II重悬液。搅拌沉淀II(6.802kg)55分钟，直到完全悬浮，搅拌速度形成涡流但不发泡。用手持式突眼计，通过折射率(mg/ml蛋白质)测定沉淀II重悬液的蛋白质含量，结果为59mg/ml。

计算所需沉淀II稀释液体积，使得蛋白质浓度为5.0mg/ml：

或

用以下公式计算所需150mM NaCl-甘氨酸缓冲液体积：

或

(321.054L)-(27.208L)＝293.846L加入缓冲液

蛋白质浓度约为5.9％。

将293.846L缓冲液加入27.208L沉淀II稀释液中混合，混合速度足以形成涡流但不发泡，混合30分钟。

在除病毒循环罐中加入107L沉淀II稀释液。启动除病毒循环罐(1号泵)，对于20叠的Viresove-180模块，进料泵的速度为80％。对于20叠的模块，将除病毒渗透泵(2号泵)的速度调至0.91LPM(20％)，以保持初始跨膜压力(TMP)低于1.6psi.。实际压力保持在1.2psi.。调整产品泵(3号泵)至控制水平。在处理全过程中，通过监测除病毒罐截留侧的蛋白质浓度保持TMP低于3.0psi.。观察在线UV监测器，将吸光度单位保持在对应于4.5-5.5mg/ml的蛋白质浓度的6.4-7.7。

在约75L透过液从除病毒罐进入超滤罐(UF)后，启动超滤泵(5号泵)，速度为10％。调高泵速(至25％)，直到UF透过液流速等于除病毒透过液的流速，然后设定在25％以保持体积恒定。UF透过液流速为0.91LPM，VC透过液流速为0.91LPM。保持UF罐内体积恒定在152L。UF进料压力为4.0psi.，UF渗透压力为0.1psi.，UF截留压力为0.7psi。

当T-1内含物到15-20L后，进行恒容渗滤。用150mM NaCl-甘氨酸缓冲液(总体积约60L)至少交换3次以维持渗滤。渗滤完成后，关闭除病毒罐的泵和搅拌器。保持VC循环罐内体积恒定在15L。交换缓冲液的总体积为45L。

对T-2内的产品进行循环，用清除了病毒的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液进行恒容渗滤浓缩。将产品浓缩到接近初始沉淀II重悬液体积。将透过液阀完全打开，UF泵速为70％；通过给截留回路(loop)施加背压(back pressure)保持进料压力低于30psi，保持压力差为14-17psi。将UF体积维持在22L，交换缓冲液总体积为121.2L。从T-2中取样，测定UF透过液样品的数字比电导。结果为5.47×10^- ³mho/cm。达到体积液位后，关闭UF渗透，循环混合产品，无菌取样10.5ml。取0.5ml样品，用手持式突眼计通过折射率测定蛋白质含量。蛋白质含量为7.9％。

将产品从T-2转移到临时罐中，测定容器的总重量(毛重)。将产品返回到T-2，称量空的临时罐重量：

毛重(kg)-空罐重量(kg)＝产品重量(kg)

或

58.180kg-25.24kg＝32.94kg产品

要达到5％蛋白质含量所需的最终产品体积计算如下：

或

用剩余样品测定最初pH，先用0.9％NaCl将样品稀释10倍，然后用0.5N HCl或0.5N NaOH的100倍稀释液滴定至pH6.3-6.4。pH为6.55。

为了校正pH，加入1.35ml滴定液即以0.9％NaCl配制的0.5N HCl溶液，最终的pH为6.35。如果需要校正，如下计算校正pH所需非稀释0.5N试剂的量：

所需最终体积(L)-所需滴定液100倍稀释液体积(ml)＝非稀释0.5N试剂体积(ml)或，在本实施例中，

34.128L×1.35ml＝46.1ml非稀释0.5N试剂

计算所需100X乙基汞硫代水杨酸钠溶液的体积：

或

不断混合产品，同时加入341ml的100倍乙基汞硫代水杨酸钠溶液。

用0.801L清除了病毒的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液将产品调节到所需的最终体积，混合10分钟。

无菌取样10.5ml产品测定pH。pH应是6.3-6.4。两次读数的实际pH是6.38和6.354。。

最终的蛋白质产品满足接受标准：

蛋白质＝5.3％

pH＝如上

气相层析测得的甲醇含量为53.9ppm。

两次测试的聚山梨酸酯80＝101.7ppm和102.2ppm，平均值为101.9ppm。

实施例2A

如下制备实施例2中使用的150mM NaCl-甘氨酸缓冲液：

计算需制备的缓冲液量：

[重悬浆体积(L)×10L]×2+60＝缓冲液制备体积

[27.208L×10L]×2+60＝制备604.16L缓冲液

确定并测定所需原料量，加入清除了热原的容器中。

表4

多次用2L注射用水，U.S.P.，洗涤称量聚山梨酸酯的容器，将每次的洗涤液都加入原料中，补足到604.16L。确定以下物质的量：

表5

用注射用水，U.S.P.，稀释混合物到要求体积，将最后所得混合物混合60分钟。测定pH；要求是6.3-6.5。实际pH为6.38。如果不合要求，则需添加1.0N HCl或1.0N NaOH，直到达到要求的pH；每次添加后都必须将溶液混合15-30分钟，并确认pH测定结果。

测定数字比电导；要求是25℃时为14.15-15.59×10^-3mhos/cm。结果是15.18×10^-3mhos/cm。如果不合要求，则报废并重新制备。

测定聚山梨酸酯80；测试样品必须含15-24ppm聚山梨酸酯80。实际浓度为19.5ppm。

比较实施例

含聚山梨酸酯80与无聚山梨酸酯80

比较实施例1A-含聚山梨酸酯80

将沉淀II浆料(10g)重悬在30ml WFI中。将该重悬浆(40ml)与360ml含100ppm(0.1g/L)聚山梨酸酯80的150mM NaCl-甘氨酸缓冲液混合，令总体积为400ml。流过Millipore Multiplex泵送平台(1/3sq.ft.模块)的透过液流速为21.8ml/min，通量为0.06ml/min./cmsq.。运行39分钟后，跨膜压力仍低于1.3psi，筛分系数高于80％。用高离子强度的含聚山梨酸酯80缓冲液保证IgG多克隆抗D球蛋白能自由通过。

比较实施例1B-无聚山梨酸酯80

将沉淀II浆料(10g)重悬在30ml WFI中。将该重悬浆(40ml)与360ml无聚山梨酸酯80的150mM NaCl-甘氨酸缓冲液混合(稀释10倍)，令总体积为400ml。流过Millipore Multiplex泵送平台(1/3sq.ft.模块)的透过液流速为21.8ml/min，通量为0.06ml/min./cmsq.。运行39分钟后，跨膜压力为6.1psi，筛分系数迅速降至60％。用高离子强度的含聚山梨酸酯80缓冲液保证IgG多克隆抗D球蛋白自由通过。

以上比较研究的结果显示，高离子强度缓冲系统中必须含聚山梨酸酯80。

比较实施例2

低离子强度与高离子强度

比较实施例2A-低离子强度

将沉淀II浆料(1.35g)重悬在4.5ml WFI中。将该重悬浆(5.0ml)与45ml含0.1g/L聚山梨酸酯80的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液混合，令总体积为50ml。流过Viresolve-180小面积模块(SAM，10sq.cm)(Millipore Corporation，Bedford，MA)的透过液流速为15.6ml/min，通量为0.64ml/min./cmsq.。运行28分钟后，筛分系数迅速降至31％。

比较实施例2B-高离子强度

将沉淀II浆料(46.0g)重悬在比较实施例2A中含100ppm(0.01％)聚山梨酸酯80的50mM NaCl-甘氨酸缓冲液中，其中已加了0.29g NaCl，使它成为150mMNaCl-甘氨酸缓冲液。流过Viresolve-180小面积模块(SAM，10sq.cm)(MilliporeCorporation，Bedford，MA)的透过液流速为15.6ml/min，通量为0.64ml/min./cmsq.。运行40分钟后，筛分系数为86％。

以上比较实施例2A和2B对低离子强度和高离子强度缓冲系统所作的比较研究结果显示，处理过程中缓冲系统的离子浓度对蛋白质通过Viresolve滤膜具有可测知的、显著的影响。

比较实施例3

溶解于WFI，低离子强度的冷冻干燥沉淀II浆料产品

概述

用Viresolve/180(1/3ft²)模块测试人IgG产品，以测定该滤膜对该分子的性能。进行了两种实验；通量变化和体积减少。初期测试测定蛋白质筛分与通量的关系，提供基本膜数据。在体积减少实验中用通量变化实验所得数据模拟过程的运行。用溶于注射用水(WFI)的产品在通量变化实验中没有发现有蛋白质通过。此后的实验用产品的甘氨酸缓冲液(含0.01％聚山梨酸酯80)溶液。用该溶液，蛋白质质量回收率为89.1％，体积增加83.3％。

目的

实验的目的是评价用Viresolve/180模块处理产品时的筛分系数和蛋白质质量回收率。所得的数据被用来确定系统的操作条件。

实验

在4℃的冷室，用产品的WFI溶液进行初期实验。此后的实验都在室温下用1/3ft²的Viresolve/180模块进行。所有蛋白质浓度均通过读取280nm光密度(O.D.)测定。所用样品均以产品缓冲液稀释并以此为背景读数。

通量变化

1)如图3A所示安装系统，采用Viresolve/180模块#0010，产品批号为#K2EM0536(Millipore Corporation，Bedford，MA)。

2)500ml沉淀II在WFI中的冷冻干燥粉末配制成约1％的蛋白质浓度，用泵将其装入1000ml的原料包中。产品取样测定最初蛋白质浓度。将原料包与系统连接，用管子先抽去空气。

3)将产品循环30分钟，横流流速为500ml/min。(渗透泵是关闭的)

4)从截留液口取1ml样品测定是否出现显著的蛋白质吸收(R0)。注：如非另作说明，所有取样均为1ml。

5)最初的透过液流速是1.09ml/min(J＝0.003ml/min/cm²)。用装有308MC/A泵头的Watson Marlow 503U泵控制透过液流速。用35分钟将产品循环返回到进料回路。

6)35分钟的循环后，采集一份截留液样品(R1)和一份透过液样品(P1)。此时，过程由冷室转移到室温下。以相同流速，再循环30分钟。

7)室温下循环30分钟后，采集一份截留液样品(R2)和一份透过液样品(P2)。

8)然后将横流提高到约600ml/min，循环15分钟。采集截留液样品(R3)和透过液样品(P3)。

9)用产品缓冲液将产品稀释至0.5％。保持横流流速与透过液流速恒定。循环20分钟后采集截留液样品(R4)与透过液样品(P4)。

10)再测定两次透过液通量速率。0.005ml/min/cm²(1.82ml/min)和0.01ml/min/cm²(3.63ml/min)。每次至少循环30分钟。

通量变化与体积减少相结合

第2个实验是对溶于甘氨酸缓冲液的人IgG进行的。

1)如图3A所示安装系统，采用Viresolve/180模块#0009，产品批号为#K2EM0536。

2)用泵将浓度约1％的990ml产品装入1L的原料包中。取1ml样品测定实际蛋白质浓度。注：如非另作说明，所有取样均为1ml。将原料包与系统连接，用管子先抽去空气。

3)将产品循环30分钟，横流流速为500ml/min(渗透泵是关闭的)。用装有501RL泵头的Watson Marlow 503U泵控制横流流速。循环后，取样测定蛋白质浓度。

4)测定4次透过液通量速率：0.003，0.005，0.030和0.050ml/min/cm²。产品以每一通量速率循环30分钟。将横流流速升高到600ml/min，通量为0.05ml/min/cm²。30分钟后，采集截留液和透过液样品。

5)实验的通量变化部分结束后，关闭渗透泵。按照图3B重建系统。取最初样品15ml。

6)然后以0.050ml/min/cm²(18.2ml/min)的通量处理产品。注：测得的通量为0.043ml/min/cm²(15.7ml/min)。

7)采集100，250和500ml产品时取样截留液和透过液。

8)在处理了645ml IgG溶液时开始用产品缓冲液进行渗滤(以透过液流速)。渗滤持续到500ml处理产品通过Viresolve/180模块。在收集到745，895和1145ml经处理产品时取样截留液和透过液。

9)剩余溶液以体积减少模式进行处理，直至减少到系统的滞留体积。在总处理体积达1245和1475ml时取样截留液和透过液。

10)最后用一步渗滤回收浓缩滞留体积内的产品。连续进行4次50ml的渗滤。分别收集每次的渗滤液。

11)采集汇集后总透过液的样品和各份渗滤液的样品。实验结束时采集最后的截留液样品，测定进料包中残留的产品浓度。

结果

通量变化

在最初的通量变化实验中没有观察到产品通过。为了提高产品的溶解度，将过程转移到室温下(最初是在4℃)。没有看到产品通过增加。引导蛋白质通过的其它方法包括提高横流流速，稀释产品和提高透过液通量速率以迫使蛋白质通过。在所有测试条件下，筛分系数始终为0。

将最初的样品悬浮在WFI中。溶液变得浑浊，出现了预计的溶解度问题。然后将其余产品溶解在甘氨酸缓冲液中，用该溶液进行其余测试。

通量变化与体积减少相结合

表6显示了对悬浮于甘氨酸缓冲液中的IgG进行的通量变化实验结果。表中是采自总蛋白约0.1％的产品的数据。表中以吸光单位(AU)表示产品浓度值。该值已将稀释因数计算在内。

初浓度：1.68AU

R0浓度：1.81AU

表6

附图4是IgG甘氨酸缓冲液溶液的筛分系数对通量曲线。

以下是体积减少实验得出的产品浓度(AU)数据。

初处理体积： 963ml

初浓度：～0.1％(1.80AU)总蛋白

横流流速： 600ml/min

测得通量： 0.043ml/min/cm²(流速：15.7ml/min)

产品1的透过液体积： 645ml

渗滤体积： 500ml

产品2的透过液体积： 330ml

表7提供了体积减少实验中采集的蛋白质浓度和筛分系数数据。表中以吸光单位(AU)表示产品浓度。稀释因数已计算在内。

表7

表8提供了体积减少实验中每一步的总蛋白浓度数据。稀释因数已计算在内。

表8

处理步骤	总体积(ml)	浓度(AU/ml)
			产品1透过液	645	1.15
渗滤	500	0.81
			产品2透过液	330	0.68
第一次渗滤	53	0.84
			第二次渗滤	60	0.59
第三次渗滤	50	0.50
			第四次渗滤	100^*	0.44

^*第四次渗滤加最终体积减少。

图5是体积减少实验的筛分系数对过滤体积的曲线。

讨论

蛋白质质量回收率

表9

体积减少

处理步骤	总体积(ml)	浓度(AU/ml)	蛋白质质量(AU)
				初始	963	1.80	1733.4
产品1透过液	645	1.15	741.8
				渗滤	500	0.81	405.0
产品2透过液	330	0.68	224.4
				第一次渗滤	53	0.84	44.5
第二次渗滤	60	0.59	35.4
				第三次渗滤	50	0.50	25.0
第四次渗滤^*	100	0.44	44.0

^*第四次渗滤加最终体积减少

截留液样品的总蛋白质量：20.6AU

透过液样品的总蛋白质量：6.2AU

渗滤提高了蛋白质的回收率，但导致产品体积增加和稀释。每次渗滤增加的体积百分比如下：

渗滤：体积增加55.7％

第一次渗滤：体积增加61.3％

第二次渗滤：体积增加67.6％

第三次渗滤：体积增加72.8％

第四次渗滤：体积增加83.3％

根据实验得出的蛋白质筛分数据，得到以下信息：

1)Viresolve/180对蛋白质的吸收可忽略。

2)产品悬浮于WFI时见到浑浊，而且用该溶液无蛋白质通过，说明该产品与WFI存在稳定性问题。将蛋白质悬浮于甘氨酸缓冲液时则有蛋白质通过Viresolve膜。

3)处理过程中，随着蛋白质在膜的上游侧浓缩，筛分系数逐步下降。

4)过程最后的低筛分系数(～25％)表明膜表面发生了显著的蛋白质极化。

结论

用悬浮于两种不同缓冲液：WFI和甘氨酸缓冲液中的人IgG，用Viresolve/180滤膜进行了可行性研究。用悬浮于WFI的产品没有蛋白质通过。初始溶液略有浑浊，说明蛋白质没有完全溶于溶液。这会造成滤膜的中度极化，阻止蛋白质通过。通量变化实验结果说明了这种情况的确发生了：未溶解的蛋白堵塞了膜，阻止蛋白通过。

产品甘氨酸溶液的澄清度显著不同：该溶液完全没有浑浊。该溶液的通量变化试验显示：对于所有被测通量(0.003ml/min/vm²至0.5ml/min/vm²)，筛分系数约为50％。甘氨酸缓冲液中的产品浓度约为0.1％(总蛋白)。

用0.1％溶液进行体积减少实验。产品回收率达89.1％时体积增加83.3％。在处理过程中采用渗滤来限制滤膜上游侧的蛋白质浓缩。还用最后的渗滤来回收系统滞留体积中的蛋白质。

在处理过程中，筛分系数从最初的57.8％稳步下降到最后的26.9％。这说明，处理过程中，有明显的蛋白质层沉积在滤膜上。过程中的渗滤减慢了筛分系数降低的速度，但不能使它提高或保持稳定。最后的渗滤步骤的确回收到了滞留体积和滤膜表面的部分蛋白。最后渗滤液中的蛋白质浓度约为初始溶液的25-50％；这说明，渗滤的新鲜缓冲液洗涤缓慢去除了滤膜的蛋白质极化层。这有利于更多的产品在渗滤中通过滤膜，减少了产品稀释并缩短了处理时间。延长最后的渗滤可回收到更多蛋白，但会降低产品浓度。

经测定，产品溶液中含5-12％二聚体。这些二聚体是活性产品的一部分。当然，二聚体的存在会引起膜表面的蛋白质极化，而且，如果二聚体保持完整，将在上游被截获。

比较实施例显示，在使用冷冻干燥起始原料和低离子强度缓冲液的条件下，得到的筛分系数较低，即使在高稀释度条件下，通过滤膜的蛋白质也少于50％。要使得实施例1和2的过程优化并获准，在相同时间内处理该物质将需要具有更大滤膜面积的设备。

本领域技术人员懂得，以上描述和实施例说明本发明的实施，而不是限定。可对本文中的细节进行多种改变，这些都不背离本发明的范围和宗旨。

Claims

1.一种由以下方法制备的无病毒抗D免疫球蛋白制剂，所述方法包括：

(a)将分离自人血浆的含抗D免疫球蛋白的免疫球蛋白组分与含15-24ppm聚山梨酸酯80且离子强度为150mM+/-20％、pH为6.3-6.5的缓冲液混合；

(b)用公称孔径小于等于30nm的超微滤膜对混合物进行超微过滤；

(c)收集超微过滤的滤过液，所述滤过液含抗D免疫球蛋白，

所述制剂的pH为6.3-6.4，蛋白质含量为4.0-6.0％，乙基汞硫代水杨酸钠的含量为24-36ppm，聚山梨酸酯80的含量为80-200ppm，甲醇含量小于50ppm。

2.如权利要求1所述无病毒抗D免疫球蛋白制剂，所述缓冲液为150mMNaCl-甘氨酸缓冲液，所述超微过滤还包括使用截留值为50kD的第二超微滤膜。

3.如权利要求1所述无病毒抗D免疫球蛋白制剂，所述方法还包括步骤(d)用截留值为50kD的超微滤膜通过过滤将加工助剂改变为50mM NaCl-甘氨酸缓冲液和浓缩免疫球蛋白滤过液。