NO326303B1 - Anvendelse av VEGF protein for behandling av intimal hyperplasi - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av VEGF protein for behandling av intimal hyperplasi

Intimal hyperplasi er økning i antallet celler mellom endotelet og den indre elastiske hinne i et blodkar, spesielt i intimal-laget som finnes der, eller i en arterie. Intimal hyperplasi skyldes ofte proliferering av glattmuskelceller (SMC) i blodkarveggen.

Når intimal hyperplasi oppstår, kan det fås ny fortykkelse av intimal-laget eller av karveggen, dvs. stenose. Blodkaret kan således bli tilstoppet.

Når en tilstopping i et blodkar er blitt eliminert, kan intimal hyperplasi som oppstår etter kirurgisk inngrep, føre til at arterien blir tilstoppet igjen. Dette er kjent som restenose.

Proliferering av arterielle glattmuskelceller finner vanligvis sted når et blodkar, f.eks. en arterie, blir deformert eller ødelagt under kirurgisk inngrep. Intimal hyperplasi kan for eksempel føre til ny stenose etter

bypasstransplantasjoner hvor det blir dannet anastomose mellom en vene og en arterie, og generelt etter kirurgisk innføring av anastomose. To eksempler på kirurgiske metoder som kan gi opphav til stenose, er hjerte-bypass-transplantater og arterie-bypass-transplantater over kneet i det femoropopliteale område.

Likeledes kan restenose oppstå etter ballong-angioplastiske metoder som anvendes for å fjerne tilstoppinger i blodkar, for eksempel ballong-angioplastiske metoder.

Intimal hyperplasi er et hovedproblem etter forskjellige kirurgiske prosesser, enten det fører til stenose eller restenose.

Aterosklerotisk kardiovaskulær sykdom er den viktigste årsak til død i Europa og Nord-Amerika og forårsaker en meget betydelig sykelighetsfrekvens etter tilstopping av arteriehulrommet, idet blodstrømmen enten forhindres eller reduseres, trombose avleiret på en plakk, med eventuell distal embolisering, og arterievegg-svekking, som fører til aneurismal dilatering og til slutt til sprekking. Avhengig av sted og sykdomsutbredelse finnes det flere valgmuligheter for behandling, idet arterie-bypass-transplantasjon er den mest vanlige kirurgiske inn-gripen. Når det gjelder koronararteriesykdom, er dette nå blitt den mest vanlige kirurgiske metode i USA, idet > 200 000 operasjoner er blitt utført hvert år siden 1990, og >20 000 operasjoner utføres hvert år i Storbritannia. I aorta-, nyre-, mesenterial- og perifere kar fortsetter mengden av kirurgiske bypassutførelser å øke, med operasjonsverdier i USA og Europa på 35-70 pr. 100 000 innbyggere. Samlet ligger antallet av kirurgiske bypass-operasjoner utført hvert år nær opp til én million.

I de første 24 måneder etter et kirurgisk inngrep svikter et meget betydelig antall av arterie-bypass-transplantatene (tilstoppes). Oppgitte verdier er fra 20 til 30%. Dette betyr at for alle hjerte- og perifer-arterie-bypassoperasjoner som utføres hvert år i Storbritannia (ca. 25 000 - 30 000), kan det ventes at mellom 6 000 og 7 000 svikter i løpet av to år. Svikttallene for «på ny»-operasjoner er enda høyere. De finansielle omkostninger på grunn av svikt er så høye at det i USA er blitt beregnet at selv en beskjeden reduksjon i sviktverdier etter koronaroperasjoner, fra 33 til 25%, kan redusere budsjettet innenfor helsevesenet med opp til 750 milioner dollar.

Det er tre hovedgrunner til transplantatsvikt innen fem år etter kirurgisk inngrep. Den første er kjent for å finne sted tidlig, innen 30 dager etter operasjonen (<5%), og representerer teknisk feil (f.eks. dårlig anastomoseteknikk). Senere svikt, etter 24 måneder, skjer vanligvis som resultat av utvikling av den opprinnelige aterosklerotiske prosess. Det er imidlertid de transplantater som forårsaker tilstopping etter mellom 1 og 24 måneder som utgjør hovedmengden av svikt (<70%). I disse tilfeller er det intimal SMC-hyperplasi som er ansvarlig for progressiv innsnevring, dvs. stenose, av arteriehulrommet, noe som til slutt resulterer i fullstendig tilstopping. Den intimale SMC-hyperplasi befinner seg typisk rundt den distale arterielle anastomose og den naturlige karvegg like overfor anastomosen. Den er således en primær sykelighet på dette sted og ikke restenose på et sted med tidligere intimal hyperplasi, som vil kunne oppstå etter angioplastisk behandling. Intimal SMC-hyperplasi kan oppstå ved den mer proksimale arterielle anastomose og langs selve transplantatet.

Restenose etter angioplastisk behandling kan føre til enda høyere sviktverdier, fra 20 til 50% i de første 6 måneder etter den angioplastiske behandling. Stenose og restenose forblir begge hovedproblemer etter kirurgisk inngrep.

Inntil i dag er det blitt testet tallrike metoder for behandling og forebygging av intimal hyperplasi, men ingen har vært klinisk tilfredsstillende.

Vaskulær endotelial vektsfaktor (VEGF) er et naturlig forekommende protein. Hos mennesker finnes minst fire former, med 121,165,189 og 206 aminosyrer. cDNA og aminosyresekvensene hos de fire former for human VEGF er angitt i Houck et al, Molecular Endocrinology (1991) vol. 5, nr. 12, sider 1806-1814. En partiell genomsekvens er også angitt. cDNA-sekvensen for human VEGF er også angitt i Leung et al, Science (1989) 246:1306-1309, sammen med den bovine VEGF-cDNA-sekvens.

Disse fire former er omtalt i det foreliggende som VEGF-121, VEG F-165, VEGF-189 og VEGF-206. Det må være klart at denne nummerering angir antallet aminosyrer i det fullt utviklede protein i hvert tilfelle. Det translaterte protein innbefatter også en presekvens på 26 aminosyrer som naturlig spaltes under intracellulær bearbeidelse.

VEGF er kjent for å spille en rolle ved angiogenesen, hvor den stimulerer delingen av vaskulære endotelceller (EC), øker endotel-permeabiliteten og virker som en endotel-«overlevelsesfaktor» i netthinne-kar. For eksempel kan VEGF, i form av rekombinant protein eller uttrykt fra et plasmid, bevirke utvikling av nye blodkar ved intra-arteriell injeksjon i iskjemiske lemmer. Denne egenskap har ført til anvendelse av den til reparering av arterier hvis endotel er blitt ødelagt under kirurgisk inngrep. Således avga Asahara et al, Circulation (1995) 91:2793 VEGF via en kanyle til det indre av karotidarterier hos rotte etter angioplastisk inngrep som hadde blottlagt endotelet i arterien; det ble funnet at VEGF stimulerte reendotelialiseringen av arterien, som i sin tur viste seg å bidra til undertrykkelse av intimal hyperplasi.

VEGF-protein og -gen er beskrevet i WO-A-9 013 649, og anvendelse av dem for behandling av skade på det vaskulære epitel, diabetiske ulcera og blodkarsår er foreslått. VEGF-fragmenter er beskrevet i WO-A-9 102 058, samt anvendelse av dem ved angiogenese og re-endotelialisering av indre vaskulære overflater, f.eks. ved behandling av ulcera.

GB-A-2 298 577 beskriver en ikke-restriktiv, porøs ytre stent for arteriovenøs bypass-transplanteringsmetoder. Denne stent har gunstige effekter på hulromsstørrelsen og på medial og intimal fortykkelse.

WO-A-9 423 668 beskriver en innretning for lokal avgivelse av et middel i et blodkar, innbefattende et reservoar dannet mellom to elementer derav. Anvendelse av den fordrer implantasjon, dvs. gjennomskjæring av karet og deretter festing av innretningen til karveggene. Innretningen er delvis porøs. Reservoaret er i direkte kontakt med lumen-blodstrømmen. Dette innebærer risiko for infeksjon.

US-A-3 797 485 beskriver en innretning for avgivelse av et legemiddel til adventitia-overflaten av et blodkar. Den er forsynt med permanente vegger og transkutane rør for avgivelse av legemiddel i flytende form. Meningen er at legemidlet skal gå til et annet sted.

Overraskende nok er det blitt identifisert egenskaper hos VEGF som viser at den kan anvendes mot intimal hyperplasi på forskjellige måter.

Det ble anbrakt en muffe rundt utsiden av arterien hos en kanin. Denne metode forårsaker normalt intimal hyperplasi i kaninens arterie, noe som fører til en fortykkelse av arterieveggen som er lik stenosen som kan oppstå i arterier hos mennesker etter bypass-operasjoner. Når muffen ble anvendt til å avgi DNA som koder for VEGF, til arterieveggen ved anvendelse av en plasmid/liposom-vektor, ble VEGF-genet over-eksprimert i arterieveggen, innbefattende endotel-laget. Intimal hyperplasi ble inhibert. Det er funnet at adventitia-muffen er nyttig for arteriegen-overføring med alle de testede genavgivelsessystemer.

Dette viser at i tillegg til at VEGF stimulerer reendotelialiseringen i tilfeller hvor endotelet er ødelagt, kan den undertrykke intimal hyperplasi i situasjoner hvor intimal hyperplasi oppstår når endotelet er helt eller overveiende uskadd. Den er derfor potensielt nyttig ikke bare til undertrykkelse av restenose etter angioplasti, men også til forebygging eller behandling av de novo-stenose i andre kirurgiske situasjoner. Det er således en motsetning mellom de nye funn og tidligere funn, hvor det ble funnet at VEGF stimulerer gjen-vekst, eller tilheling, av endotelet. Det er sannsynlig at de nye funn fremkommer på grunn av en annen virkningsmekanisme for VEGF.

Videre viser de nye funn at effektive midler kan avgis til det ytre av blodkaret for behandling av intimal hyperplasi. Dette har flere fordeler. Spesielt blir ikke det terapeutiske middel vasket bort fra hyperplasi-stedet ved blodstrømmen, som ved intralumen-avgivelse. Det kan opprettholdes et avgivelses-reservoar rundt blodkaret, og det er ikke behov for noen intralumen-manipuleringer som ødelegger endotelet i blodkaret (og selv kan utløse intimal hyperplasi).

Mer spesielt muliggjøres det heri at midler for motvirking av intimal SMC-hyperplasi kan påføres direkte på adventitia-overflaten av arterieveggen (dvs. nærmest cellene i det ytre medium). Hvilket som helst middel som anvendes, kan påføres spesifikt på de steder som mest sannsynlig vil utvikle en intimal hyperplastisk skade, siden disse steder lett eksponeres på operasjons-tidspunktet.

VEGF formidler sine kjente virkninger via spesifikke høyaffinitets-tyrosin-kinasereseptorer flk-1/KDR og fit-1, som bare uttrykkes på EC og monocytter. Uten at man ønsker å være bundet av noen teori, anses det sannsynlig at virkningene av VEGF ved inhibering av hyperplasi også formidles via de samme reseptorer. Andre agonister til reseptorene som VEGF bindes til kan anvendes for behandling eller forebygging av intimal hyperplasi. Den spesifikke beliggenhet av VEGF-reseptorer gir også en fordel hos VEGF sammenliknet med mange andre vekstfaktorer og cytokiner som er foreslått for behandling av intimal fortykkelse: virkningene av VEGF er mer spesifikke overfor EC siden høyaffinitets-VEGF-reseptorer i arterieveggen i fravær av monocytter bare uttrykkes på EC.

Det er for eksempel funnet at mekanismen for VEGFs inhibering av intimal hyperplasi i situasjoner hvor endotelet er helt eller overveiende uskadet, i det minste delvis virker via nitrogenoksid-(NO)-veien, idet administrering av NO-synteseinhibitoren L-NAME motvirker VEGFs virkninger på intimal hyperplasi i muffemodellen beskrevet ovenfor. Således stimulerer VEGF NO-dannelsen.

Det er også mulig at VEGF har andre biologiske virkninger som bidrar til dens inhibering av intimal hyperplasi. Det er spesielt funnet at VEGF-overekspresjon stimulerer dannelsen av prostacyklin, aktivering av cytosolisk fosfolipase A2 og sekresjon av von Willebrands faktor fra EC. Det kan være tilfelle at VEGFs stimulering av NO-dannelse og dens stimulering av prostacyklindannelse virker etter hverandre under undertrykkelse av intimal hyperplasi.

Det funn at VEGF virker til stimulering av NO- og prostacyklin-dannelse tyder også på at VEGF og agonister til reseptorene som VEGF bindes til, vil være nyttige ved behandling av andre NO-tilknyttede og/eller prostacyklin-tilknyttede tilstander. Spesielt har Forte et al., Lancet (1997) 349:837-42, vist at NO-nivåene er lave hos individer som lider av hypertensjon. VEGF kan derfor være nyttig ved behandling eller forebygging av forskjellige former for hypertensjon. Likeledes kan VEGF være nyttig ved behandling av aterosklerose.

Ett aspekt ved foreliggende oppfinnelse omfatter anendelse av et middel som er et VEGF protein som har evnen til å fremme proliferasjonen av endotelceller in vitro og/eller in vivo, eller en nukleinsyre kodende for proteinet for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av intimal hyperplasi i et blodkar hvor endotelet er helt eller overveiende intakt.

Foreliggende opfinnelse vedrører videre anvendelse ifølge krav 1, hvor blodkaret er en arterie.

Videre omfatter oppfinnelsen anvendelse ifølge krav 1 for behandling eller forebygging av stenose bevirket ved et kirurgisk inngrep eller i tilknytning til pulmonalarterie-hypertensjon hvor det kirurgiske inngrep er angioplasti, koronar-bypass-kirurgi, kirurgisk innsetting av anastomose, eller endarteriektomi. . Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse i henhold til hvilket som helst av de foregående krav, til behandling eller forebygging av stenose av blodkaret eller restenose av blodkaret.

Det er videre foretrukket anvendelse hvor proteinet har en sekvens ifølge SEKV ID nr. 2, 4, 6 eller 8, eller et aktivt fragment derav.

Videre omfattes anvendelse i henhold til hvilket som helst av de foregående kravene, hvor midlet er en nukleinsyre i tilknytning til en viral eller ikke-viral vektor.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-8 for anvendelse ved levering av et middel til et blodkar i en pasient, hvor midlet er anbrakt i legeme tilpasset for å tilveiebringe en forsegling rundt karet, idet midlet blir holdt innenfor eller assosiert med innretningen, idet ved anvendelse kommer midlet i kontakt med karets adventitia-overflate.

Som foreslått ovenfor og vist i eksemplene, er forskjellige midler, innbefattende nitrogenoksid-syntase og en nukleinsyre som koder for denne, egnet for anvendelse ved oppfinnelsen. Midlet vil ofte bli beskrevet i det foreliggende som VEGF-proteinet eller -nukleinsyren, og disse henvisninger, og henvisninger til selve VEGF, er gitt som eksempel. Hvilken som helst av de former av VEGF som er beskrevet ovenfor, kan anvendes for denne oppfinnelses formål.

I det foreliggende skal henvisninger til disse VEGF-proteinsekvenser forstås slik at de henviser både til sekvenser som omfatter pre-sekvensen og sekvenser

som mangler pre-sekvensen. VEGF-proteiner med og uten pre-sekvensen er egnet for utøvelsen av oppfinnelsen. Likeledes angår henvisninger til VEGF-nukleinsyre-(DNA og RNA)-sekvenser både sekvenser som koder for pre-sekvensen og sekvenser som ikke koder for pre-sekvensen.

Det skal bemerkes at Houck et al., som ovenfor, oppgir at sekvensen for VEGF-165 innbefatter aminosyren asparagin (N eller Asn) i stilling 141 (115 i kodesystemet ifølge Houck et al., som svarer til det fullt utviklede protein). Houck et al. oppgir denne aminosyre som lysin (K eller Lys) i VEGF-121, VEGF-189 og VEGF-206, og cDNA-sekvensen (for VEGF-206) angitt i Houck et al. understøtter dette. Ved oppfinnelsen kan derfor aminosyren i stilling 141 være asparagin (N eller Asn) eller lysin (Lys eller K). Hver aminosyre kodes for ved hjelp av det tilsvarende triplett-kodon i nukleinsyresekvenser ifølge oppfinnelsen (for DNA kan disse kodoner være AAA eller AAG for lysin og AAT eller AAC for asparagin). Dette gjelder spesielt V EG F-165.

De fire former kodes for ved det samme gen, men dannes ved alternativ spleising på RNA-nivået. Det finnes således en hel-lengde-form av human VEGF og tre kjente avkortede former. VEGF-121 og VEGF-165 er løselige og er utsondrede former. Likeledes er pre-sekvensen på 26 aminosyrer hydrofob og antas å redusere proteinets løselighet. Således er former av VEGF uten pre-sekvensen foretrukket, siden de ventes å ha høyere løselighet. Alle former av VEGF er egnet for utøvelse av oppfinnelsen, skjønt utsondrede former er foretrukket. VEGF-proteiner egnet for utøvelse av oppfinnelsen kan også stamme fra andre arter, skjønt human VEGF er foretrukket. For eksempel er muse-, kanin-og ku-VEGF blitt klonet, og deres sekvenser er tilgjengelige.

For referanse skal det bemerkes av VEGF-121, -165, -189 og -206 også omtales på området som VEGF-120, -164, -188 og -205.

VEGF-proteiner og -nukleinsyrer (DNA og RNA) er egnede midler for utøvelse av oppfinnelsen.

Når VEGF-protein anvendes, er VEGF-protein med aminosyresekvensen SEKV ID nr. 2 (VEGF-121), 4 (VEGF-165), 6 (VEGF-189) eller 8 (VEGF-206) foretrukket. Utsondrede former av VEGF er foretrukket, og således er VEGF-121 og VEGF-165 spesielt foretrukket.

Imidlertid er VEGF-DNA og proteiner egnet for utøvelse av oppfinnelsen ikke begrenset til disse spesifikke sekvenser. Oppfinnelsen tilveiebringer snarere også anvendelse av andre nær beslektede DNA- og proteinsekvenser.

DNA-sekvensene kan være beslektet med sekvensene SEKV ID nr. 1, 3, 5 eller 7 på en rekke måter. For eksempel kan DNA-sekvenser egnet for utøvelse av oppfinnelsen være degenererte sekvenser som koder for det samme protein, proteinet med SEKV ID nr. 2,4, 6 eller 8.

Alternativt kan DNA-sekvensene ifølge oppfinnelsen være hovedsakelig homologe med sekvensene SEKV ID nr. 1, 3, 5 eller 7, og kode for et protein som har en annen aminosyre-sekvens enn SEKV ID nr. 2, 4, 6 eller 8, men som koder for et protein med VEGF-aktivitet. DNA-sekvenser for anvendelse ved oppfinnelsen har typisk minst 70%, minst 80%, minst 90%, minst 95% eller minst 99% sekvenshomologi med sekvensen SEKV ID nr. 1, 3, 5 eller 7.

Likeledes kan VEGF-DNA-sekvenser for anvendelse ved oppfinnelsen kode for fragmenter av VEGF som bibeholder VEGF-aktivitet. Aktuelle fragmenter har for eksempel en lengde på minst 15 aminosyrer, f.eks. opp til 40 aminosyrer eller flere. Eksempler på egnede fragmenter har en lengde på 20 aminosyrer, f.eks. sekvensene 1-20, 11-30, 21-40, 31-50, 41-60, 51-70, 61-80, 71-90, 81-100, 91-110, 101-120, 111-130, 121-140, 131-150, 141-160, 151-170, 161-180, 171-190,181-200, 191-210 og 196-215 av det aktive VEGF-protein vist som SEKV ID nr. 6.

DNA-sekvenser for anvendelse ved oppfinnelsen kan for eksempel være genom-DNA eller -cDNA, eller hybrider mellom genom-DNA og -cDNA, eller de kan være syntetiske eller halvsyntetiske. De kan stamme fra hvilken som helst art, skjønt DNA som koder for human VEGF, er foretrukket. De kan være enkeltkjedede eller dobbeltkjedede. Genom-DNA som koder for proteinene med SEKV ID nr. 2, 4, 6 og 8, er spesielt foretrukket.

DNA-sekvenser for anvendelse ved oppfinnelsen kan være forskjellige ved delesjon, innsetting eller substituering av ett eller flere nukleotider, under forutsetning av at de koder for et protein med VEGF-aktivitet. Likeledes kan de være avkortet eller forlenget med én eller flere nukleotider, under forutsetning av at de koder for et protein med VEGF-aktivitet.

RNA-sekvenser kan også anvendes. RNA-sekvensene kan være enkeltkjedede eller dobbeltkjedede. RNA kan være av hvilken som helst opprinnelse. De kan for eksempel stamme fra hvilken som helst art, skjønt RNA som koder for human VEGF, spesielt human VEGF med sekvensen vist i SEKV ID nr. 2, 4, 6 eller 8, er foretrukket. Syntetiske DNA kan også anvendes, og likeledes halvsyntetiske RNA. Videre kan det anvendes DNA transkribert fra bakterie-plasmider in vivo eller in vitro.

Fagfolk på området vil forstå at i RNA-sekvenser egnet for utøvelse av oppfinnelsen vil T-restene være erstattet av U.

VEGF-proteiner for anvendelse ved oppfinnelsen kodes for av DNA- eller RNA-sekvenser som definert ovenfor. Foretrukne proteiner ifølge oppfinnelsen er proteinene med SEKV ID nr. 2, 4, 6 og 8, skjønt oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse av andre proteiner med nær beslektede sekvenser som er forskjellige fra sekvensene SEKV ID nr. 2, 4, 6 eller 8, men har VEGF-aktivitet.

I henhold til oppfinnelsen er VEGF-aktivitet, for så vidt som det gjelder behandling eller forebygging av intimal hyperplasi, evnen til fullstendig eller delvis å inhibere eller forebygge intimal hyperplasi i et blodkar, spesielt en arterie. Proteiner som har litt forskjellig sekvens fra naturlig forekommende VEGF, som beskrevet ovenfor, bibeholder denne egenskap, skjønt ikke nødvendigvis i en så stor utstrekning som VEGF. Likeledes kan slike proteiner oppvise sterkere VEGF-aktivitet enn naturlig forekommende VEGF. Det samme gjelder agonister til VEGF, for eksempel peptider, peptoider eller andre små molekyler.

For så vidt som oppfinnelsen angår andre egenskaper hos VEGF, er VEGF-aktiviteten evnen hos andre molekyler enn VEGF til å reprodusere disse egenskaper. For så vidt som oppfinnelsen for eksempel angår VEGFs aktivitet ved NO-tilknyttede tilstander til stimulering av NO-dannelsen, innbefatter VEGF-aktiviteten evnen til stimulering av NO-dannelsen. For så vidt som oppfinnelsen angår VEGFs aktivitet ved prostacyklin-tilknyttede tilstander, innbefatter VEGF-aktivitet evnen til å stimulere prostacyklindannelsn. VEGF-proteiner som er egnet for utøvelse av oppfinnelsen, oppviser også typisk én eller flere av de biologiske egenskaper hos VEGF som allerede er kjent på området, så som evnen til å aktivere proliferering av arterie-EC in vitro og/eller in vivo, eller evnen til å bindes til reseptorene som VEGF bindes til, og aktivere dem på den måte VEGF gjør dette.

VEGF-proteiner egnet for utøvelse av oppfinnelsen kan være hovedsakelig homologe med VEGF med SEKV ID nr. 2, 4, 6 eller 8, typisk minst 70%, minst 80%, minst 90%, minst 95% eller minst 99% homologe.

VEGF-proteiner som er egnet for utøvelse av oppfinnelsen, kan være forskjellige fra sekvensen vist i SEKV ID nr. 2,4, 6 eller 8 ved delesjon, innsetting eller substitusjon av én eller flere aminosyrer, under forutsetning av at de har VEGF-aktivitet. De kan likeledes være avkortet med én eller flere aminosyrer med hensyn til SEKV ID nr. 2, 4.6 eller 8, eller forlenget med hensyn til SEKV ID nr. 2, 4, 6 eller 8 med én eller flere aminosyrer, under forutsetning av at de har VEGF-aktivitet. Når det gjelder substitusjoner, er konservative substitusjoner foretrukket. Konservative substitusjoner er typisk substitusjoner hvor den substituerte aminosyre har liknende beskaffenhet som den som finnes i naturlig forekommende VEGF, for eksempel med hensyn til ladning og/eller størrelse og/eller polaritet og/eller hydrofobitet. Likeledes har konservative substitusjoner typisk liten eller ingen virkning på proteinets VEGF-aktivitet.

VEGF-proteiner for anvendelse ved oppfinnelsen som er forskjellige når det gjelder sekvens fra naturlig forekommende VEGF, kan konstrueres slik at de får en aktivitet som er forskjellig fra naturlig forekommende VEGF. De kan for eksempel konstrueres slik at de får sterkere VEGF-aktivitet. Slike manipuleringer vil typisk bli utført på nukleinsyrenivået under anvendelse av rekombinante teknikker kjent på området.

Som alternativ til anvendelse av et VEGF-protein som beskrevet ovenfor, er det mulig å anvende en VEGF-agonist. Dette gjelder alle de medisinske anvendelser beskrevet i det foreliggende, spesielt behandling av aterosklerose.

En VEGF-agonist er vanligvis et molekyl som bindes til en reseptor til hvilken VEGF bindes, og har hovedsakelig samme virkninger, som fører til VEGF-aktivitet, som beskrevet i det foreliggende. En agonist kan spesielt bindes til flk-1/KDR- eller flt-1-reseptorene. Agonister ifølge oppfinnelsen omtales således både som agonister til VEGF og til reseptorene som VEGF bindes til.

En VEGF-agonist kan ha hvilken som helst kjemisk struktur. En VEGF-agonist kan for eksempel være et peptid eller polypeptid på for eksempel opp til 10, opp til 20, opp til 50 eller opp til 100 aminosyrer. En agonist kan likeledes være et modifisert peptid, eller et peptoid. Hvilken som helst egnet modifisering kan utføres, innbefattende glykosylering, sulfatering, COOH-amidering og acetylering, f.eks. N-terminal acetylering. I tillegg, eller alternativt, kan det være tilstede modifiserte aminosyrer og/eller L-aminosyrer.

En del foretrukne agonister er fragmenter, eventuelt modifisert som beskrevet ovenfor, av VEGF, som har VEGF-aktivitet. Ett spesielt foretrukket agonistfragment av VEGF består av aminosyrer 1-20 (M...H) i SEKV ID nr. 4; dette peptid er rapportert å være en agonist til Flt-1-reseptoren i humane trofoblastceller, av Ahmed et al., Lab. Invest. (1997) 76:779.

Ytterligere beslektede agonister kan også fås fra det N-terminale område av VEGF. Under henvisning til SEKV ID nr. 4 kan for eksempel peptid-agonister til

VEGF omfatte den N-terminale del av VEGF (aminosyre nr. 1) og ha aminosyre-sekvensen som hos VEGF opp til en aminosyre i området 25-30,30-40,40-50 eller 50-100. Likeledes kan foretrukne agonister stamme fra det N-terminale område av VEGF, men omfatte en avkortet versjon av den N-terminale del. I stedet for at man begynner ved aminosyre nr. 1 i SEKV ID nr. 4, kan de for eksempel begynne ved aminosyre nr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 i SEKV ID nr. 4 og ha aminosyre-sekvensen som hos VEGF opp til en aminosyre i området 25-30, 30-40, 40-50 eller 50-100.

Peptid-agonister kan også stamme fra andre deler av VEGF-sekvensen. For eksempel er en ytterligere foretrukket peptid-agonist et peptid som består av aminosyrene 145-169 (R...P) i VEGF-189-sekvensen i SEKV ID nr. 6.

Ytterligere beslektede agonister kan også fås fra dette område av VEGF. Under henvisning til SEKV ID nr. 6 kan for eksempel peptid-agonister til VEGF ha aminosyresekvensen som hos VEGF fra en aminosyre i området 135-155 til en aminosyre i området 160-180. Peptid-agonister som stammer fra dette område, kan for eksempel ha sekvensen som hos VEGF fra en aminosyre i området 135-140,140-145 eller 145-150 til en aminosyre i området 160-165,165-170 eller 170-175.

Peptidfragmenter av VEGF som definert ovenfor, har fortrinnsvis en total lengde på 10-20, 20-25, 25-30, 30-40 eller 40-50 aminosyrer.

Andre foretrukne agonister er fragmenter av HIV-Tat-proteinet. HIV-Tat-proteinet etterlikner agonist-virkningene hos VEGF og kan stimulere angiogenesen i endotelceller ved virkning via Flk-1/KDR-reseptoren; se Albini et al, Oncogene (1996) 12:289-297, og Nature Medicine (1996) 2(12):1321-1375. Således er peptider avledet fra HIV-1 Tat-sekvensen så som aminosyrene 46-60 i HIV Tat-proteinet blitt vist å stimulere vekst og vandring av endotelceller; se Albini et al., Oncogene (1996) 12:289-297. Peptidet som består av aminosyrene 41-65 i HIV-1 Tat-proteinet, er en ytterligere foretrukkket peptid-agonist ifølge oppfinnelsen.

Agonister kan også ha aminosyresekvenser som er forskjellige fra aminosyresekvensene hos naturlig forekommende VEGF på én av måtene beskrevet ovenfor for VEGF-proteiner, så lenge deres agonistegenskaper bibeholdes.

Når agonistene er peptider, kan de dannes in vivo fra nukleinsyresekvenser som koder for dem, for bevirking av behandling. Således kan agonist-kodende nukleinsyrer fås ved genterapi, som beskrevet i det foreliggende.

Ved utøvelsen av oppfinnelsen kan VEGF, en nukleinsyre som koder for VEGF, eller en VEGF-agonist eller en nukleinsyre som koder for en VEGF-agonist, avgis til et blodkar, fortrinnsvis en arterie i hvilken som helst egnet form. Nukleinsyrer kan avgis i «naken» form ikke forbundet med en vektor, eller ved hjelp av en genterapi-vektor. Det er foretrukket å avgi dem ved hjelp av hvilken som helst egnet genterapivektor. Spesielt kan det anvendes virus- eller ikkevirus-vektorer.

Egnede virus-vektorer innbefatter adenovirus, retrovirus, pseudotype-retrovirus, herpesvirus, vacciniavirus og baculovirus. Egnede ikkevirus-vektorer innbefatter oligonukleotider, plasmider, liposomer, kationiske liposomer, pH-følsomme liposomer, liposom-protein-komplekser, immunliposomer, liposom-protein-polylysin-derivater, vann-i-olje-emulsjoner, polyetyleniminer og dendrimer. Foretrukne vektorer innbefatter Moloney-museleukemivirus-(MMLV)-avledede retrovirus, pseudotypede vesikulærstomatittvirus-protein-G-(VSV-G)-holdige retrovirus, adenovirus, plasmider og plasmid/liposom-komplekser.

Hvor hensiktsmessig, kan to eller flere vektortyper anvendes sammen. For eksempel kan en plasmidvektor anvendes sammen med liposomer. Egnede liposomer innbefatter for eksempel slike som omfatter dioleylfosfatidyletanolamin (DOPE), 3(3-[N-(N',N'-dimetylaminoetan)karbamoyl]kolesterol (DC-Chol) eller det positivt ladede lipid (N-[1-(2,3-dioleyloksy)propyl]-N,N,N-trietylammonium

(DOTMA).

Virusvektorer er fortrinnsvis hemmet, f.eks. uten replikasjon. Det vil si at de mangler ett eller flere funksjonelle gener som er nødvendig for replikasjon av dem, noe som hindrer ukontrollert proliferering av dem in vivo og utelukker uønskede bivirkninger av virusinfeksjon. Fortrinnsvis fjernes hele virus-genomet, bortsett fra de minimale genom-elementer som er nødvendige for innpakking av virusgenomet som innbefatter VEGF-nukleinsyren, i viruskappen eller -kapsidet. Det er for eksempel ønskelig å utelukke hele virusgenomet bortsett fra de lange terminale gjentatte enheter (LTR) og et innpakkingssignal. Når det gjelder adenovirus, utføres delesjonene typisk i E1-området og eventuelt i ett eller flere av E2-, E3-og/eller E4-områdene.

Virus kan hemmes ved hjelp av hvilken som helst egnet teknikk. For eksempel kan genom-delesjoner innbefatte fullstendig fjerning av gener som er nødvendige for replikasjon, eller bare delvis fjerning. Fullstendig fjerning er foretrukket. Vanligvis er delesjoner av gener som er nødvendige for tidlig transkripsjon av virusgener, foretrukket.

Replikasjonsdyktige selvbegrensende eller selvødeleggende virusvektorer kan også anvendes.

Vanligvis vil VEGF-nukleinsyren for anvendelse ved oppfinnelsen, finnes i en ekspresjonskonstruksjon som sikrer ekspresjon av dem in vivo etter at de er

blitt avgitt til arterien, fortrinnsvis ved hjelp av en vektor som definert ovenfor. Slike konstruksjoner omfatter typisk en promoter som kan styre ekspresjonen av VEGF-nukleinsyren (og eventuelt en regulator for promoteren), et translasjons-startkodon og, operabelt knyttet til promoteren, VEGF-nukleinsyren. Disse komponenter er

fortrinnsvis anordnet i en 5'-3'-orientering.

Konstruksjonen kan også omfatte hvilke som helst andre egnede komponenter. Konstruksjonen kan for eksempel omfatte en nukleinsyre som koder for en signalsekvens, som befinner seg i en posisjon i forhold til VEGF-nukleinsyren som er slik at når den translateres, kan den styre det uttrykte VEGF-protein til en gitt celletype eller cellekammer. Hvilken som helst slik signalsekvens vil typisk befinne seg umiddelbart 3' eller umiddelbart 5' i forhold til VEGF-nukleinsyren, slik at signalsekvensen og VEGF-proteinet translateres som et enkelt fusjonsprotein, med signalsekvensen i den C- eller N-terminale ende.

Konstruksjonen kan også omfatte en forsterker som forsterker graden av ekspresjon tilveiebrakt av promoteren. Hvilken som helst forsterker som forsterker ekspresjonen tilveiebrakt av den valgte promoter, kan anvendes. Når det for eksempel gjelder CMV-tidlig-gen-promoteren, kan CMV-tidlig-gen-forsterkeren anvendes.

Eventuelt kan konstruksjonen omfatte en transkripsjons-terminator 3' i forhold til VEGF-nukleinsyren. Hvilken som helst egnet terminator kan anvendes.

Eventuelt kan konstruksjonen omfatte et polyadenyleringssignal operabelt bundet 3' i forhold til VEGF-nukleinsyren.

Eventuelt kan konstruksjonen omfatte ett eller flere selekterbare markørgener, f.eks. for antibiotika-resistens, for muliggjøring av selektering av transformerte celler i kultur. Celler kan for eksempel selekteres med hensyn til antiobiotika-resistens i rekkefølge.

Eventuelt kan konstruksjonen omfatte ett eller flere introner, eller andre ikke-kodende sekvenser, foreksempel 3' eller 5' i forhold til VEGF-nukleinsyren.

Det kan anvendes hvilken som helst egnet promoter for regulering av ekspresjonen av nukleinsyren. Det er vanligvis foretrukket å anvende en viruspromoter eller er promoter tilpasset slik at den virker innenfor arten for individet som skal behandles. Når det gjelder et menneske, er det således foretrukket å anvende viruspromotere, spesielt promotere som stammer fra virus som infiserer mennesker, eller promotere som stammer fra humane gener. Det kan eventuelt anvendes en promoter i kombinasjon med hvilken som helst egnet forsterker.

Det er ønskelig å anvende en «sterk» promoter, dvs. en promoter som sikrer høye nivåer av ekspresjon av VEGF-proteinet ifølge oppfinnelsen. Promotere som oppnår over-ekspresjon av VEGF-proteinet, er ønskelige. Foretrukne promotere innbefatter cytomegalovirus-(CMV)-promoteren, eventuelt i kombinasjon med CMV-forsterkeren, den humane p-aktinpromoter; apevirus 40-(SV40)-tidlig-gen-promoteren; Rous-sarkomvirus-(RSV)-promoteren; og den repeterte langterminus-retrovirus-(LTR)-promoter.

Promotere og andre konstruksjonskomponenter er operabelt knyttet til VEGF-nukleinsyren. De har således en posisjon slik at de kan utøve sin effekt på ekspresjonen av VEGF-nukleinsyren. Når det for eksempel gjelder en promoter, har promoteren en posisjon i forhold til VEGF-nukleinsyren slik at den kan styre ekspresjon av VEGF-nukleinsyren. Det er ønskelig at konstruksjons-komponenter har en slik posisjon at de har mulighet til å utøve sin maksimale effekt på ekspresjonen.

Nukleinsyrene eller konstruksjonene anvendt ved oppfinnelsen kan innarbeides i virusgenomer på hvilken som helst egnet måte kjent på området. Virus-genomer kan så innpakkes i viruskapper eller -kapsider ved hjelp av hvilken som helst egnet metode. Spesielt kan det anvendes hvilken som helst egnet innpaknings-cellelinje til dannelse av virusvektorer ifølge oppfinnelsen. Disse innpakningslinjer supplerer de replikasjonsmanglende virusgenomene siden de innbefatter, typisk innlemmet i sine genomer, genene som er blitt utelukket fra det replikasjons-manglende genom. Således muliggjør anvendelse av innpakningslinjer at virusvektorer kan dannes i kultur. Egnede innpakningslinjer innbefatter derivater av PA317-celler, \|/-2-celler, CRE-celler, CRIP-celler, E-86-GP-celler, «Fly»-celler, linje 293-cellerog 293GP-celler.

Når det gjelder ikkevirus-vektorer kan nukleinsyre innlemmes i ikkevirus-vektorene på hvilken som helst egnet måte kjent på området.

Vektorer, spesielt virusvektorer, kan velges etter ønske for oppnåelse av innlemming av nukleinsyren eller konstruksjonen i genomet i cellene hos individet som skal behandles, eller for at nukleinsyren eller konstruksjonen skal være fri i cytoplasma. Integrerbare vektorer er foretrukket.

VEGF-proteiner eller VEGF-nukleinsyrer for anvendelse ved oppfinnelsen, fortrinnsvis knyttet til en virus- eller ikkevirus-vektor, som beskrevet ovenfor, kan administreres til arterier på hvilken som helst egnet måte for utføring av behandling av hyperplasi. VEGF eller en nukleinsyre som koder for VEGF, kan for eksempel administreres til den ytre vegg i blodkaret, f.eks. en arterie, eller til blodkar-endotelet, f.eks. et arterie-endotel, for eksempel via lumen. Det er sannsynlig at lokal genoverføring er fordelaktig fremfor administrering av rekombinant VEGF-protein siden infuserte forbindelser hurtig renses bort av blodstrømmen og kort halveringstid i blodet.

Straks VEGF-nukleinsyrene er avgitt, blir de eksprimert under dannelse av VEGF-proteiner, som i sin tur setter i verk behandling eller forebygging av intimal hyperplasi. Ekspresjon kan finne sted i hvilken som helst celletype eller -typer i blodkarveggen, f.eks. en arterievegg.

Fortrinnsvis skjer ekspresjonen på et slikt sted at den uttrykte VEGF kan nå endotelet i blodkaret, f.eks. en arterie. Ekspresjonen kan for eksempel finne sted i glattmuskelcellene og/eller i endotelet. Mest foretrukket finner ekspresjonen sted i det minste i endotelet i blodkaret, f.eks. en arterie.

VEGF-protein eller -nukleinsyre kan for eksempel avgis til utsiden av blodkaret, f.eks. en arterie, ved direkte injeksjon rundt stedet for hyperplasien som skal behandles eller forebygges, eller ved injeksjon i hulrommet i blodkaret, for eksempel arterien.

Proteinene eller nukleinsyrene kan anvendes til behandling eller forebygging av intimal hyperplasi som oppstår på grunn av hvilke som helst kliniske forhold. Det er for eksempel mulig å behandle hyperplasi som oppstår etter hvilken som helst type kirurgisk metode, innbefattende angioplasti, for eksempel ballong-angioplasti; bypass-kirurgi, så som koronar-bypass-kirurgi hvor det dannes anastomose mellom en vene og en arterie; andre anastomose-metoder, for eksempel anastomose-dannelse i bena; og endarteriektomi, for eksempel karotidarterie-endarteriektomi. Det er også mulig å behandle intimal hyperplasi forbundet med arterieødeleggelse eller hypertensjon, for eksempel pulmonalarterie-hypertensjon.

Det er mulig å behandle eller bedre etablert intimal hyperplasi eller å forebygge at intimal hyperplasi oppstår. Det er likeledes mulig å redusere sannsynligheten for at intimal hyperplasi skal oppstå, eller å redusere graden av etablert intimal hyperplasi eller hyperplasi som sannsynligvis vil oppstå. Behandling kan finne sted før, under eller etter en kirurgisk prosess, for eksempel for redusering av sjansen for at hyperplasi skal oppstå etter prosessen.

VEGF-nukleinsyren eller -proteinet administreres fortrinnsvis med det formål å forebygge eller behandle nydannet stenose. Det kan imidlertid også anvendes til behandling eller forebygging av restenose.

Proteinene eller nukleinsyrene avgis fortrinnsvis i form av et farmasøytisk preparat omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer. Hvilket som helst egnet farmasøytisk preparat kan anvendes.

Egnede preparater kan for eksempel innbefatte vandige og ikke-vandige sterile injeksjonsløsninger som kan inneholde antioksidanter, buffere, bakteriostatiske midler, baktericide midler, antibiotika og oppløste materialer som gjør preparatet isotont med blodet hos den påtenkte mottaker; og vandige og ikke-vandige sterile suspensjoner som kan innbefatte suspenderingsmidler og fortykningsmidler. Preparatene kan presenteres i enhetsdose- eller flerdose-beholdere, for eksempel forseglede ampuller og medisinglass, og kan oppbevares i frosset eller frysetørret (lyofilisert) tilstand som bare fordrer tilsetting av den sterile flytende bærer, for eksempel vann for injeksjon, umiddelbart før anvendelse.

Det må være klart at i tillegg til de bestanddeler som er spesielt nevnt ovenfor, kan medikamentene som blir fremstilt ifølge denne oppfinnelse innbefatte andre midler som er vanlige på området i forbindelse med den aktuelle preparattype. Blant de mulige preparater er sterile pyrogenfrie vandige og ikke-vandige løsninger foretrukket.

Proteinene, nukleinsyrene og vektorene kan avgis i hvilken som helst egnet dosering og under anvendelse av hvilket som helst egnet doseringssystem. Fagfolk på området vil forstå at doseringsmengden og -systemet kan tilpasses slik at det sikres optimal behandling av den spesielle tilstand som skal behandles, avhengig av tallrike faktorer. En del slike faktorer kan være alder, kjønn og klinisk tilstand hos det individ som skal behandles.

For avgivelse av rene nukleinsyrer som koder for VEGF, eller konstruksjoner omfattende slike nukleinsyrer, er typiske doser fra 0,1 til 5 000 ug, for eksempel 50-2000 ug, så som 50-100 ug, 100-500 ug eller 500-2000 ug pr. dose. For avgivelse av VEGF-protein innbefatter egnede doser doser på fra 1 til 1000 ug, for eksempel fra 1 til 10 ug, fra 10 til 100 ug, fra 100 til 500 ug eller fra 500 til 1000 ug.

Doseringen som anvendes for avgivelse av VEGF-nukleinsyrer ved hjelp av virus- eller ikkevirus-vektorer, vil avhenge av mange faktorer, innbefattende effektiviteten med hvilken vektorene avgir VEGF-nukleinsyrer til celler, og effektiviteten med hvilken VEGF-nukleinsyrene uttrykkes i cellene.

For eksempel kan virusvektorer avgis i doser på fra 10<4> til 1014 cfu eller pfu pr. ml, for eksempel 104-106,106-108,108-1010,1010-1012 eller 1012-10<14> cfu eller pfu pr. ml. Doser i området 10<5->10<9> cfu eller pfu pr. ml er foretrukket. Betegnelsen pfu (plakkdannende enhet) gjelder visse virus, innbefattende adenovirus, og svarer til infektiviteten av en virusløsning, og bestemmes ved infisering av en passende cellekultur, og måling, vanligvis etter 48 timer, av antallet plakk av infiserte celler. Betegnelsen cfu (kolonidannende enhet) gjelder andre virus, innbefattende retrovirus, og bestemmes ved hjelp av midler kjent på området vanligvis etter 14 dagers inkubering med en selekterbar markør. Teknikkene for bestemmelse av cfu- eller pfu-titeren for en virusløsning er velkjent på området.

Når det gjelder retrovirus, er doseringer i området 10<5->10<6> cfu/ml spesielt foretrukket. Når det gjelder pseudotypede retrovirus, er doseringer i områder 10<7 >cfu/ml spesielt foretrukket. Når det gjelder adenovirus, er doseringer i området 10<9 >pfu/ml spesielt foretrukket.

VEGF-nukleinsyrer knyttet til ikkevirus-vektorer kan også avgis i hvilken som helst egnet dosering, ved hvilken som helst administreringsmåte, som beskrevet ovenfor, eller gradvis fra et implantat. Egnede doser er typisk fra 0,1 til 1000 ug nukleinsyre, for eksempel fra 1 til 100 ug, fra 100 til 500 ug, fra 500 til 1000 ug, fra 1000 til 2000 ug, fra 2000 til 3000 ug eller fra 3000 til 5000 ug. Foretrukne doser er i området fra 5 til 50 ug, for eksempel fra 10 til 20 ug.

Doseringsprogrammene vil også variere i henhold til for eksempel administeringsmåten, mottakerens art og mottakerens tilstand. Man tenker seg imidlertid enkeltdoser og multippeldoser spredt over tidsrom på dager, uker eller måneder. Som forklart ovenfor, kan dessuten avgivelsen av VEGF-proteiner og - nukle-insyrer skje ved hjelp av et implantat som er egnet for tilpassing rundt et blodkar, fortrinnsvis en arterie; implantatet er fortrinnsvis i form av en muffe. Et slikt implantat vil bevirke gradvis avgivelse. Avgivelse kan for eksempel finne sted i løpet av et tidsrom på timer, dager, uker eller måneder.

Proteiner og nukleinsyrer kan administreres ved hjelp av hvilken som helst administreringsform, for eksempel topisk, kutan, parenteral, intramuskulær, subkutan eller transdermal administrering, eller ved direkte injeksjon i blodstrømmen, direkte injeksjon i eller rundt arterieveggen eller ved direkte påføring på slimhinnevev. Fortrinnsvis skjer administreringen ved hjelp av et implantat, som beskrevet ovenfor.

Proteinene, nukleinsyrene og vektorene kan anvendes til behandling av intimal hyperplasi hos hvilket som helst pattedyr. Behandling av mennesker er foretrukket.

Det er blitt observert at plasmid/liposom-komplekser, MMLV-retrovirus, VSV-G-retrovirus og adenovirus fører til ekspresjon i arterier som har påsatt muffe. Genoverføringseffektiviteten var høyest for adenovirus, og pseudotypede VSV-G-retrovirus ga også en forholdsvis høy transfeksjonseffektivitet. Anvendelsen av de replikasjons-manglende VSV-G-retrovirus ved arteriegen-overføring er ikke blitt vist tidligere. Ekspresjon kunne sees for en del endotelceller hos de adenovirus-transfekterte arterier. Siden det hadde skjedd gjennomtrengning fra adventitia til intima, fremsetter disse resultater den generelle mulighet å forandre endotelfunksjonen ved sykdom hos mennesker ved ekstralumenal genoverføring under anvendelse av andre gener enn VEGF. Dette kan også være nyttig for ekspresjon i adventitia og ytre medier av diffunderbare eller utsondrede genprodukter som så virker annet sted i arterieveggen. Slik avgivelse utvirker fortrinnsvis behandling av intimal hyperplasi, som definert ovenfor, skjønt det også kan utvirke ytterligere eller alternative terapeutiske mål.

De terapeutiske midler vil fortrinnsvis være i form av nukleinsyre som koder for et farmasøytisk aktivt polypeptid eller protein. Mer foretrukket vil denne nukleinsyre befinne seg i en konstruksjon, som definert ovenfor. Enda mer foretrukket vil nukleinsyren eller konstruksjonen avgis til arterien ved hjelp av en vektor som definert ovenfor, for eksempel en virus- eller ikkevirus-vektor som definert ovenfor.

Således kan ekstra-arteriell genoverføring anvendes for avgivelse av genmateriale i veggen hos blodkar, fortrinnsvis arterier. Av eksemplene kan det sees at forandringer i medial-SMC og til og med endotelforandring kan oppnås fra adventitia-siden, idet det muliggjøres utvikling av nye metoder for behandling av blodkarsykdom, f.eks. arteriesykdom.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. Følgende forkortelser er anvendt:

BSA - bovint serumalbumin

DMEM - Dulbeccos modifiserte Eagles-medium

FCS - føtalt kalveserum

HUVEC - humane navlevene-endotelceller

IgG - immunglubolin G

MAP-kinase - mitogen-aktivert proteinkinase

mAb - monoklonalt antistoff

PBS - fosfatbufret saltoppløsning

PGI2 - prostacyklin

cPLA2 - cytosolisk fosfolipase A2

PIGF - plancenta-vektsf aktor

SDS PAGE - natriumdodekylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese

VEGF - vaskulærendotel-vekstf aktor

vWF - vonWillebrands faktor

VSMC - vaskulære glattmuskelceller

Eksempel 1

Effekten av endotelcelle-(EC)-spesifikk VEGF-genoverføring på fortykkelsen av intima ble undersøkt under anvendelse av en silikonmuffe innsatt rundt karotid-arterier, som virket både som midlet som forårsaket intimal glattmuskelcelle-vekst, og som reservoar for genet og vektoren. Modellen konserverte EC-integritet og muliggjorde direkte ekstravaskulær genoverføring uten noen intravaskulær manipulering.

Eksempel 1. 1

Genoverføring: Intimal fortykkelse ble indusert i karotid-arteriene hos 32 hvite New Zealand-kaniner ved innføring av en inert silikonmuffe rundt arteriene under generell bedøvelse (Booth et al., Atherosclerosis (1989) 76:257-268). Genoverføring ble utført fem dager etter anbringelse av muffen ved forsiktig åpning av muffen under bedøvelse og injisering av 500 ul plasmid/liposom-komplekser i muffen (dvs. på adventitia-overflaten av arterien). Ingen intravaskulære manipuleringer var innblandet i noen trinn ved undersøkelsene. Plasmid/liposom-komplekser: 25 ug pCMV5-VEGF-164-plasmid (inneholdende muse-VEGF-cDNA (Breier et al., Development (1992) 114:521-32; nukleotider 1-583) ble kompleksbundet med 25 ul Lipofectin (BRL) under fortynning til 500 ul med Ringer-løsning. Kompleksene ble holdt ved romtemperatur i minst 15 minutter før genoverføringen. Det var bestemt på forhånd at ved konsentrasjonen som ble anvendt ved den foreliggende undersøkelse, var ikke plasmid/lipofectin-kompleksene toksiske overfor kanin-aorta-EC in vitro. Kontrollarterier ble transfektert med et liknende plasmid/liposom-kompleks inneholdende E. coli lacZ cDNA-(Kalnins et al., som ovenfor) (nukleotider 1-3100)-ekspresjonsplasmid. Plasmidene som ble anvendt for undersøkelsene, ble isolert fra E. coli-kulturer (DH5a) under anvendelse av Qiagen Mega-kolonner, og renset under anvendelse av tre fenol/kloroform-ekstraheringer og én etanolutfelling (Ausubel et al., red. Current Protocols in Molecular Biology, New York, NY: Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons (1991) 4.2.3-4.2.4), justert til 1 ug/ul og analysert til å være fri for en hver mikrobiologisk eller endotoksin-forurensning (Limulus-analyse, påvisningsgrense 0,2 ng). Dyrene ble avlivet 3 (n=8), 7 (n=12) og 14 (n=12) dager etter genoverføringsoperasjonen; arteriene ble forsiktig fjernet og delt i tre like deler: den proksimale tredje ble nedsenkings-fiksert i 4% paraform-aldehyd/PBS i 15 minutter og innstøpt i OCT-forbindelse (Miles Scientific) (Ylå-Herttuala et al., J. Clin. Invest. (1995) 95:2692-2698). Den midtre tredjedel ble fiksert som ovenfor i 4 timer, skyllet i 15% sakkarose i 48 timer og innstøpt i paraffin. Den distale tredjedel ble direkte innstøpt i OCT-forbindelse og frosset i flytende nitrogen. I fire arterier ble den distale tredjedel anvendt for mRNA-isolering og RT-PCR (se nedenfor). Ti tilfeldig valgte snitt fra den midtre del ble anvendt for bestemmelse av intima/media-tykkelsesforholdet (Ylå-Herttuala et al., Arteriosclerosis (1986) 6; 230-236) av to uavhengige iakttakere uten kjennskap til prøvenes opprinnelse. Middelverdiene for de to uavhengige målingene ble anvendt til beregning av resultatene (middel ± SD). Forskjeller i intima/media-tykkelsesforholdene mellom gruppene ble analysert ved hjelp av ANOVA, fulgt av modifisert t-test (<*> p<0,05).

RT-PCR: Distale deler av VEGF (n=2)- og lacZ (n=2)-transfekterte arterier oppsamlet 7 dager etter genoverføringen ble anvendt for mRNA-isolering (Micro-FastTrack, Invitrogen) og ble reversert-transkribert til den første kjede-cDNA under anvendelse av reversert AMLV-transkriptase (5E pr. reaksjon, Boehringer) under anvendelse av tilfeldige heksamer-primere (cDNA-syklus-sett, Invitrogen) som beskrevet (Hiltunen et al., Circulation (1995) 92:3297-3303). En PCR på 35 cykluser ble utført med Taq-polymerase (Boehringer) og primere spesifikke for den transfekterte pCMV5-VEGF-164-konstruksjon (5'-primer: SEKV ID nr. 9; 3'-primer: SEKV ID nr. 10; PCR-cyklusparametere: 1 min 90°C, 1 min 60°C, 1 min 72°C, bortsett fra den siste cyklus 5 min). Amplifisert fragment med en ventet lengde (547 nt) kunne sees i de VEGF-transfekterte arterier. DNA-størrelsesmarkører (1 kb stige, BRL) er vist på begge sider av gelen.

Det ble tatt mikroskopibilder, som viste karakteregenskapene hos kanin-karotidarterier 7 dager etter VEGF- eller lacZ-genoverføring. Immunfarginger av de transfekterte arterier viste: Kontrollarterie transfektert med lacZ-plasmid/liposomer (SMC-spesifikt MAb HHF-35,1:500 fortynning, Enzo Diagnostics) viste typisk intimal fortykkelse; Arterie transfektert med VEGF-plasmid/liposomer (SMC-spesifikt MAb HHF-35) viste bare begrenset intimal fortykkelse; endotel var tilstede i alle undersøkte vaskulære segmenter (seriesnitt til A, EC-spesifikt MAb CD31, fortynning 1:50, DAKO); ingen tegn til inflammasjon ble påvist i VEGF- og lacZ-transfekterte atrerier (makrofag-spesifikt MAb RAM-11-fortynning 1:500, DKO); nyvaskularisering i adventitia av VEGF-transfektert arterie ble sett 14 dager etter gen-overføring (Hematoxylin-eosin-farging).

Avidin-biotin-pepperrot-peroksidasesystemet (Vector Elite, Vector Labs) ble anvendt for immunfargingene (Ylå-Herttuala et al., PNAS (1990) 87: 6959-6963). Kontroller for immunfargingene innbefattet inkuberinger med irrelevante klasse- og art-tilpassede immunglobuliner og inkuberinger hvor de primære antistoffer var utelatt. Hybridiseringer in situ ble utført under anvendelse av en antisense-VEGF-riboprobe (583 nt) syntetisert fra pBluescript SK-plasmid (Stratagene) som beskrevet (Ylå-Herttula et al., (1990), som ovenfor). Kort angitt ble paraffin-innstøpte snitt for-behandlet med Proteinase K, acetylert og hybridisert under anvendelse av 35-S-UTP (DuPont, NEN)-merkede riboprober (6 x 10<6> cpm/ml) ved 52°C i 16 timer. Endelig vasking etter hybridiseringen skjedde med 0,1 x SSC ved 60°C i 30 minutter. Autoradiografi ble anvendt for signalpåvisning (Eastman - Kodak NAB-2). Kontroll-hybridiseringer med en ikke-hybridiserende sense-riboprobe (Ylå-Herttuala et al., (1990), som ovenfor) ga negative resultater. Snittene ble mot-farget med hematoxylin.

Eksempel 1. 2

Genoverføring ble utført som beskrevet i eksempel 1.1. L-NAME (70 mg/kg/d) ble gitt til kaninene i drikkevann, idet man startet én dag før VEGF (n=5)-eller lacZ (n=5)-genoverføring. Dyrene ble avlivet 7 dager etter genoverføring og analysert med hensyn til intima/media-tykkelsesforholdet og histologi som beskrevet ovenfor (Ylå-Herttuala et al., Arteriosclerosis (1986) 6:230-236; Ylå-Herttuala et al., (1990) som ovenfor). Forskjellen i intima-fortykkelse ble opphevet.

Eksempel 1. 3

Sammenflytende kulturer av HUVEC ble vasket to ganger med serumfritt medium og inkubert med dette medium enten i nærvær av de angitte konsentrasjoner av rekombinant human VEGF i 15 minutter, eller med 10 ng/ml VEGF i de viste tidsrom. Ved en del forsøk ble cellene for-behandlet i 1 time med 100 uM L-NAME og deretter behandlet enten med eller uten 10 ng/ml VEGF i 10 minutter. Mediet ble fjernet, og cellene ble hurtig lysert ved 4°C ved tilsetting av 10 mM Tris/HCI (pH 7,6), 5 mM EDTA, 50 mM NaCI, 30 mM natriumpyrofosfat, 50 mM NaF, 0,1 mM Na3V04,1 mM PMSF og 1% Triton X-100 (lysebuffer). Lysatene ble klaret ved sentrifugering ved 15 000 x g i 10 minutter, og immunutfellinger ble utført ved inkubering av klarede lysater med PY20 anti-fosfotyrosin-mAb i 2 timer ved 40°C. Immunutfelningene ble oppsamlet ved inkubering av lysatene i ytterligere 1 time med protein A-agarose. Immun-utfeiningene ble vasket tre ganger med lysebuffer, og proteinene ble deretter ekstrahert med 2 x SDS-PAGE-prøvebuffer. Etter SDS-PAGE ble immunutfelte proteiner overført til membraner og deretter undersøkt ved immunblot-analyse med PY20 mAb. Dette viser at VEGF bevirker fosforylering av et hovedprotein på 205 kD svarende til VEGF-reseptor (tyrosin-fosforylerte hovedproteiner ved 100,125,145,190 og 205). L-NAME opphever responsen overfor VEGF.

Rekombinant VEGF ble tilsatt ved konsentrasjonen på 25 ng/ml i tidsrom på opp til 2 timer (nitrittdannelsen ble øket fra intima-nivået med k. 16 uM og forble på 1,8-2 uM) eller ved de angitte konsentrasjoner på 0, 2,5, 25 ng/ml i 10 minutter. Effekt av L-NAME (100 uM)-forbehandling (1 time) på VEGF-responsen ble målt etter tilsetting av 25 ng/ml VEGF i 10 minutter. Nitrittdannelsen ble målt under anvendelse av kapillærpåvisningsmetoden (Leone et al., i Methods in Nitric Oxide Research, Feelisch og Stanler, red. John Wiley & Sons, New York (1996) 499-508). Nivået steg til k. 19 og k. 2,1 uM i nærvær av VEGF; det ble redusert til kontroll-nivået (k. 17 uM) etter tilsetting av L-NAME.

Resultater: Det ble funnet at, sammenliknet med lacZ-transduserte arterier, reduserte VEGF-genoverføring i betydelig grad intima-fortykkelse én uke etter operasjonen (intima/media-forhold 0,3 sammenstilt med henholdsvis 1,1<0,05). Effekten ble redusert etter to uker, noe som sannsynligvis skyldes at den plasmid/liposom-formidlede genoverføring typisk bare bevirker temporær ekspresjon av det transfekterte gen med maksimal proteinekspresjon mellom 2-3 dager etter gen-overføringen (Nabel et al., Ann. Rev. Physiol. (1994) 56:741-761).

Immunhistokjemisk analyse av arteriene viste at intima-fortykkelse nesten utelukkende besto av SMC. Endotel-laget var tilstede i alle de undersøkte segmenter. Det ble ikke påvist noen uheldige virkninger eller inflammasjon i de transfekterte arterier.

Ekspresjon av den transfekterte VEGF ble bekreftet med RT-PCR under anvendelse av primere spesifikke for transgenet og ved in situ-hybridisering. Størstedelen av VEGF- og lacZ-ekspresjonen fant sted i adventitia og ytre medier i fibroblaster og SMC. Adventitia-nyvaskularisering kunne sees i tre av de VEGF-transfekterte arterier 14 dager etter genoverføringen. Ingen ny-vaskularisering ble påvist i lacZ-transfekterte arterier.

Det er tidligere vist at lacZ-plasmid/liposom-genoverføring med anvendelse av muffemodellen fører til en lokal genoverføring i 0,05% av arterieceller. Til tross for den lave genoverføringseffektivitet fører den utsondrede form av VEGF dannet inne i muffen, til biologiske effekter i det lokale arterie-mikromiljø, som angitt ved tilstedeværelse av ny-vaskularisering i tre VEGF-transfekterte arterier 14 dager etter gen-overføring. Som ved akutt hypoksi, antas utsondret VEGF å nå EC ved diffusjon og å bindes til VEGF-reseptorer på EC.

Man fremsatte den hypotese at de inhiberende virkninger av VEGF på intima-fotrykkelse skyldtes enten en direkte eller indirekte VEGF-bevirket EC-avledet faktor eller aktivitet som i sin tur kunne inhibere SMC-prolifereringen. Man fremsatte spesielt den hypotese at virkningene av VEGF på intima-fotrykkelsen ble formidlet via NO-veien. Denne hypotese ble testet i et sub-sett av hvite New Zealand-kaniner (n=8) ved at dyrene fikk NO-syntaseinhibitor L-NAME under gen-overføringsforsøkene. Det ble funnet at L-NAME opphever forskjellen i intima-fortykkelse mellom VEGF- og lacZ-transfekterte arterier. Hoved-målcellene for VEGF i arterieveggen er EC. De eneste andre celletyper som har VEGF-reseptorer, er monocytter, men etter hva man kan bedømme ut fra immuncytokjemi med spesifikke antistoffer, er monocytter fraværende fra karotid-arteriene med påsatt muffe, under disse betingelser.

Disse resultater (evnen når det gjelder forskjell i intima-fotrykkelse) var i overensstemmelse med VEGF-bevirket inhibering av intima-fortykkelse via stimulering av NO-dannelse. Det ble derfor undersøkt om VEGF direkte kunne stimulere NO-dannelsen i kulturer av EC. VEGF bevirket tyrosin-fosforylering av et hovedprotein på 205 kDa svarende til VEGF-reseptoren i konsentrasjonsområdet 1-25 ng/ml. Tilsetting av VEGF til dyrkede humane navlevene-endotelceller (HUVEC) forårsaket en tids- og konsentrasjonsavhengig økning i NO-dannelsen ifølge overvåking ved måling av nitrittnivåene. Virkningen av VEGF på NO-dannelsen kunne sees så tidlig som 30 sekunder etter tilsetting av VEGF, nådde et maksimum etter 5 minutter og ble opprettholdt i opp til 2 timer. Den halv-maksimale virkning av VEGF ble oppnådd ved 5 ng/ml. VEGF-bevirket fosforylering og NO-dannelse ble fullstendig utelukket i nærvær av 100 uM L-NAME. Det er således sannsynlig at VEGF-genoverføring stimulerer NO-dannelse i EC i de transfekterte arterier og begrenser SMC-proliferering i det minste delvis via en NO-formidlet mekanisme. Disse funn er forenlig med de tidligere observasjoner at transfektering av arterier med endotel-NO-syntase-cDNA reduserer intima-fortykkelsen (Von der Leyon et al., PNAS (1995) 92:1137-1141).

Callow et al. (som ovenfor) og Asahare et al. (som ovenfor) konkluderte med at administrering av VEGF-protein stimulerte EC-proliferering i avdekkede arterier, men de virkelige mekanismer som inngår ved inhibering av intima-fortykkelse, ble ikke undersøkt. I karotidarterien med påsatt muffe stimuleres intima-fortykkelsen i nærvær av et anatomisk intakt endotel. Det er derfor usannsynlig at den inhiberende virkning av arterie-VEGF-genoverføring på intima-fortykkelsen rapportert her skyldes VEGF-stimulert re-endotelialisering. I henhold til disse resultater kan VEGF direkte bevirke NO-dannelse i HUVEC slik at dette er én mekanisme ved hvilken VEGF kan inhibere intima-fortykkelse. VEGF kan også stimulere dannelsen av andre faktorer som negativt kan regulere SMC-prolifereringen, innbefattende TG F-p eller prostacyklin.

Eksempel 2

Under anvendelse av plasmid/liposom-komplekser for gen-avgivelse ble Moloney-museleukemivirus-avledede (MMLV)-retrovirus, pseudotypede vesikkel-stomatittvirusprotein G (VSV-G)-holdige retrovirus og adnovirus avgitt i kanin-karotidarterien under anvendelse av en silastinmuffe påsatt på adventitia. Muffen anvendes på grunn av at 1) den tilveiebringer et genavgivelses-reservoar; 2) ingen intralumen-manipuleringer utføres, og endotelet forblir anatomisk intakt hele veien; og 3) innsetting av muffen gir arterie-glattmuskelcelle-(SMC)-proliferering og forøker retrovirus-genoverføringseffektiviteten hvor målcelle-proliferering er nødvendig.

Gen-overføring: Hvite New Zealand-kaniner (1,8-2,5 kg) ble anvendt. Bedøvelsen var fentanyl-fluanison (0,3 mg/kg)/midazolam (1 mg/kg) (Ylå-Herttuala et al., J. Clin. Invest. (1995) 95:2692-2698). Et midtlinje-halsinnsnitt blottla den venstre karotid-arterie. En biologisk inert 2 cm silastinmuffe (MediGene Oy, Kuopio, Finland) ble anbrakt rundt karotid-arterien slik at den var i lett kontakt med adventitia i begge ender (Booth et al., som ovenfor). Gen-overføring ble utført 4-5 dager etter muffepåsettingsoperasjonen. Dyrene ble bedøvet på nytt for gen-overføring. Muffen, som var blitt blottlagt på nytt ved kirurgi, ble forsiktig åpnet og fylt med 500 ul av genoverføringsløsningen (se nedenfor). Innsnittet ble lukket og arteriene senere analysert med hensyn til genoverføringseffektivitet.

Histologisk analyse: Arterier med påsatt muffe ble forsiktig fjernet og delt i tre like deler: den proksimale tredjedel ble fiksert ved nedsenking i 4% paraformaldehyd/PBS (pH 7,4) i 15 minutter, fulgt av innstøping i OCT-forbindelse (Miles Scientific, USA). Den mediale tredjedel ble fiksert ved nedsenking i 4% paraform-aldehyd/PBS (pH 7,4) i 4 timer, skyllet i 15% sakkarose (pH 7,4) i 48 timer og innstøpt i paraffin. Den distale tredjedel ble innstøpt i OCT-forbindelse og bearbeidet for frysesnitt. Ti tilfeldig valgte snitt ble farget med X-gal med hensyn til p-galaktosidase-aktivitet i 12 timer og anvendt for bestemmelse av genoverføringseffektivitet (Nabel et al., Science (1990) 249:1285-1288; Ylå-Herttuala et al., (1995), som ovenfor). Genoverførings-effektiviteten ble beregnet som prosentandel av de (3-galaktosidaseholdige celler som andel av det totale antall kjerner i 20 tilfeldig valgte 100X felter. Tilfeldig valgte snitt fra hver tredjedel av de muffe-påførte arterier ble anvendt for immuncytokjemi og analyse av celletyper og/eller intima/media-tykkelsesforhold (Booth et al., som ovenfor).

Celletypene ble identifisert under anvendelse av følgende antistoffer. SMC: HHF-35 mAb (fortynning 1:500, Enzo Diagnostics, USA), cc-aktin-mAb (fortynning 1:1000; Sigma Chemicals Co.); makrofager: RAM-11 mAb (fortynning 1:1000; Dako, USA), anti-CD68-mAb (fortynning 1:250, Dako); endotelceller: anti-CD31-mAb (fortynning 1:50; Dako); polymorfonukleære leukocytter: anti-CD45-mAb (fortynning 1:100; Dako); og anti-kanin-T-celler: MCA 805-mAb (fortynning 1:1000; Dako). Avidin-biotin-pepperrotperoksidasesystemet ble anvendt for signalpåvisning (Vector Laboratories) (Ylå-Herttuala et al., (1995), som ovenfor). Etter immunfarging ble vevssnittene mot-farget med hematoksylin. Bestemmelse av proliferasjonsindeksen: Proliferasjonsindeksen for arteriene med muffe ble bestemt under anvendelse av 5-brom-2'-deoksyuridin-(BrdU)-merkingen (Soma et al., Arterioscler. Thromb. (1993) 13:571-578). Kort angitt ble hvite New Zealand-kaniner (n=12) injisert med BrdU (40 mg/kg kroppsvekt) 3 timer før avliving. Karotidarteriene ble fiksert i 70% etanol over natten og innstøpt i paraffin. Seriesnitt (20 snitt pr. dyr) ble farget for påvisning av BrdU under anvendelse av FITC-merket anti-muse-IgG (Dako), etter propidiumjodid-farging av kjernene. Merkingsindeksen ble beregnet som prosentandelen av de BrdU-positive kjerner. Operasjon ble simulert for kontralaterale karotidarterier, og disse ble anvendt som kontroller.

Plasmid/liposomer: pCMV-p-galaktosidase (lacZ)-ekspresjonsplasmid (Promega) ble kompleksbundet med Lipofectin-reagens (BRL) som følger: 25 ug plasmid ble langsomt blandet med 25 ul Lipofectin-reagens under fortynning til 500 ul med Ringer-løsning. Det ble ikke observert noen utfelninger i plasmid/Lipofectin-løsningen. Blandingen fikk stå ved romtemperatur i minst 15 minutter og ble anvendt for genoverføring innen 2 timer. Plasmid-preparatene ble undersøkt med hensyn til fravær av lipopolysakkarid-forurensning (Limulus-analyse, Sigma Chemical Co.).

Retrovirus: LacZ-holdige pLZRNL MMLV-retrovirus (Ylå-Herttuala et al., (1995), som ovenfor; Miyanohara et al., PNAS (1988) 85:6538-6542 eller LacZ VSV-G-pseudotypede retrovirus (Yee et al., PNAS (1994) 91:9564-9568) ble anvendt til undersøkelsene. I begge drives ekspresjonen av lacZ ved 5'-LTR. Replikasjonsmanglende LZRNL-amfotrope retrovirus ble innpakket i PA317-celler og anvendt ved en titer på 5 x 10<5> cfu/ml som beskrevet (Ylå-Herttuala et al.,

(1995), som ovenfor). Replikasjonsmanglende VSV G-pseudotypede retrovirus ble dannet i 293 GP-celler under anvendelse av forbigående transfektering (Yee et al., som ovenfor). Pseudotypede retrovirus ble konsentrert under anvendelse av ultrasentrifugering og anvendt ved en titer på 1 x 10<7> cfu/ml. Før bruk ble retrovirus-preparatene undersøkt med hensyn til fravær av eventuelle bakteriologiske forurensninger eller hjelpervirus (Yee et al., som ovenfor). Adenovirus-vektorer: Replikasjonsmanglende E1 -utelukkede adenovirus ble anvendt for undersøkelsene (Gosh-Choudhury et al., Gene (1986) 50:161-171; Simari et al., J. Clin. Invest. (1996) 98:225-235). Kjerne-målsøkings-p-galaktosidase-cDNA under en p-aktin-promoter og en CMV-forsterker ble klonet i det E1-utelukkede område av adenovirus-genomet under anvendelse av homolog rekombinering (Gosh-Choudhury et al., som ovenfor, Simari et al., som ovenfor). Replikasjonsmanglende adenovirus ble dannet i 293 celler og konsentrert ved hjelp av ultrasentrifugering. Titer på 1 x 10<9> pfu/ml ble anvendt for genoverføringsforsøkene. Adenovirus-preparatene ble analysert med hensyn til fravær av hjelpervirus eller bakteriologiske forurensninger (Gosh-Choudhury et al., som ovenfor). Resultater: Adventitia-muffen førte til neointimal hyperplasi 7-14 dager etter operasjonen. Endotelet forble anatomisk intakt gjennom hele undersøkelsene. BrdU-merking viste en topp-prolifereringsindeks på 23% 3 dager etter operasjonen. Neointima besto utelukkende av SMC. Plasmid/liposom-komplekser førte til en påvisbar genoverføring inn i adventitia og ytre medier, med en effektivitet på under 0,01%. Ikke-transfekterte eller liposombehandlede arterier med påsatt muffe viste ingen farging med hensyn til (3-galaktosidaseaktivitet.

Adventitia-retrovirus-genoverføring var mindre effektiv uten muffen, antakelig på grunn av at retrovirusgen-overføringen bare skjer i prolifererende celler. Genoverføringseffektiviteten med replikasjonsmanglende MMLV-retrovirus var lav (under 0,01%). Genoverføringseffektiviteten med VSV-G-pseudotypede retrovirus var 0,1%. Under anvendelse av MMLV- og VSV-G-retrovirus ble p-galaktsidasefarging observert i adventitia og ytre medier.

Replikasjonsmanglende adenovirus ga effektiv genoverføring, idet p-galaktosidase-farging ble påvist i adventitia og ytre medier. Farging ble også, interessant nok, observert i en del endotelceller og i en del intima-celler. Siden lacZ-adenoviruskonstruksjonen inneholdt et kjernelokaliseringssignal for p-galaktosidase, var intens X-gal-farging lokalisert i kjernen hos de transfekterte celler. Genoverføringseffektiviteten var ca. 10%, vurdert ut fra det totale antall fargede kjerner i de analyserte snitt. En del inflammatoriske celler kunne sees i VSV-G-retrovirus- og adenovirus-transfekterte arterier. Ingen inflammatoriske celler kunne sees i de plasmid/liposom-transfekterte arterier.

I dette eksempel skjedde overføringen av p-galaktosidase-(lacZ)-markørgenet til adventitia og ytre medier med alle genoverføringssystemer. Adenovirus overførte også p-galaktosidase-genet til en del endotelceller. Etter 5 dager ga adenovirus-vektorer den høyeste genoverføringseffektivitet, idet opp til 10% av cellene viste p-galaktosidase-aktivitet; Pseudotypede VSV-G-retrovirus var også effektive når det gjaldt oppnåelse av genoverføring i 0,1% av cellene i adventitia og ytre medier. Plasmid/liposom-komplekser og MMLV-retrovirus infiserte <0,01% av cellene. Det ble ikke observert noen uheldige vevsreaksjoner for noen av genoverføringssystemene.

Således kan replikasjonsmanglende adenovirus, VSV-G-pseudotypede retrovirus og plasmid/liposom-komplekser anvendes til genoverføring til arterieveggen under anvendelse av muffemetoden. Virkninger på medial-SMC og til og med endotel kan oppnås fra adventitia-siden.

Eksempel 3

I dette eksempel ble stimulering av PGI2 med VEGF undersøkt. Cellekultur: HUVEC ble enten anskaffet fra Clonetics og dyrket i fabrikantens eget medium supplert med 2% FBS, eller de ble dyrket fra friske navlestrenger ved kollagenase-nedbrytning og dyrket på 1% gelatinbelagte plater i medium 199 supplert med 20% FCS og endotelcellevekst-supplement (Wheeler-Jones et al., Biochem. J. (1996) 315:407-416). For eksperimentelle formål ble primærkulturer av HUVEC dispergert ved behandling med 0,05% trypsin/0,02% EDTA i 5 minutter ved 37°C og deretter gjen-utplatet enten i 90 mm, 60 mm eller 35 mm plastskåler, eller på 24-brønnsplater. Kulturene ble holdt i fuktet atmosfære inneholdende 5% C02 og 90% luft ved 37°C, og anvendt etter 6-8 dager eller når cellene hadde dannet et sammenflytende monolag.

PGI2-analyse: Sammenflytende kulturer av HUVEC i 24-brønnsplater ble vasket to ganger i serumfritt M199 (pH 7,4) og eksponert for medium inneholdende VEGF. PGI2-innholdet i celle-supernatantene ble kvantifisert ved hjelp av radioimmunanalyse av 6-keto-PGF1a, det stabile nedbrytningsprodukt av PGI2 som beskrevet tidligere (Wheeler-Jones et al., som ovenfor). Arakidonsyre-frigjøring: Arakidonsyre-frigjøring ble bestemt hovedsakelig som beskrevet (Domin og Rozengurt, J. Biol. Chem. (1993) 268:8927-8934). Sammenflytende HUVEC-kulturer ble inkubert i 24 timer med [5,6,8,9,11,12,14,15-<3>H]arakidonsyre (1 mCi/ml, 211 Ci/mmol). Cellene ble deretter vasket to ganger med medium 199 og inkubert i 1 ml av dette medium supplert med 0,3% BSA (hovedsakelig fettsyrefritt) og VEGF eller trombin. Etter behandling ble mediet fjernet og sentrifugert i en mikrosentrifuge ved 16 000 x g i 5 minutter, og radioaktiviteten i supernatanten ble bestemt ved telling i en scintillasjonsteller.

Western Blotting-metoder: Behandling av hvilende kulturer av celler med faktorer, og celle-lysering ble utført som beskrevet ovenfor, under resultatene og i figurteksten. Etter SDS-PAGE ble proteinene overført til Immobilon-membraner (Millipore Inc.). For MAP-kinase-analyser ble membranene blokkert under anvendelse av 5% ikke-fet tørrmelk i PBS, pH 7,2, og inkubert i 3-5 timer i PBS/0,05% Tween-20 inneholdende primært antistoff (1 mg/ml) som angitt. For immunblot med antistoff overfor cPLA2 ble membranene blokkert i 3 timer i TBST 50 mM Tris/HCI, 150 mM NaCI, 0,02% (på volumbasis) Tween 20 pH 7,4 (TBST) inneholdende 0,2% (på vekt/volum-basis) l-blokk (Tropix) og deretter inkubert med primært antiserum i TBST. Membranene ble deretter vasket seks ganger (10 minutter for hver vasking) i TBST og inkubert i 1 time i TBST inneholdende HRP-konjugert sekundært antistoff. Immunreaktive bånd ble visualisert ved hjelp av kjemiluminescens under anvendelse av HRP-konjugert anti-mus- eller anti-kanin-IgG og ECL™-reagens i henhold til fabrikantens instruksjoner. MAP-kinase-analyse: Cellene ble behandlet med faktorer som angitt, vasket hurtig to ganger med iskald PBS og umiddelbart ekstrahert ved tilsetting av 100 ml kokende 2x SDS-PAGE-prøvebuffer. Cellé-ekstraktene ble oppsamlet ved skraping, oppvarmet til 95°C i 10 minutter og kjørt på 12,5% akrylamid-SDS-PAGE-geler. Etter overføring til Immobilon-membraner, ble proteinene analysert ved immunblotting med et antistoff som spesifikt oppfatter p42- og p44-MAP-kinaser (Erk-1 og Erk-2) aktivert ved fosforylering ved Tyr204 (Payne et al., EMBO J. (1991) 10:885-892).

cPLA2-mobilitetsskiftanalyse: Sammenløpende hvilende HUVEC i 60 mm skåler ble vasket to ganger i serumf ritt medium 199 (pH 7,4) og deretter eksponert i de angitte tidsrom for medium inneholdende faktorer som angitt detaljert i figurteksten. Cellelysater ble tillaget som tidligere beskrevet (Wheeler-Jones et al., som ovenfor). Proteinene ble separert ved hjelp av SDS-PAGE (10% akrylamid), og ble, etter overføring til membraner, analysert ved immunblotting med polyklonalt antiserum overfor cPLA2 (BorschHaubold et al., J. Biol. Chem. (1995) 270: 25885-25892; og Kramer et al., J. Biol. Chem. (1996) 271:27723-27729). Analyse av vWF-sekresjon: vWF-sekresjon ble målt ved hjelp av ELISA (Wheeler-Jones et al., som ovenfor) i prøver av medium oppnådd fra sammenflytende kulturer av HUVEC som var blitt behandlet med faktorer, som angitt. Platene ble belagt med anti-vWF-mAb CLBRAg35, og den nedre påvisningsgrense for analysen var ca. 1,0 mE/ml.

Materialer: Rekombinant VEGF ble enten anskaffet fra UBI eller fra R & D Systems. Rekombinant PIGF var en gave fra professor Werner Risau og ble også anskaffet fra R & D Systems. Polyklonalt cPLA2-antiserum ble vennligst levert av dr. Ruth Kramer (Eli Lilly, Indianapolis). Anti-vWF-mAb CLBRAg35 var en gave fra dr. J.A. Van Mourik (Central Blood Laboratory, Amsterdam, Nederland). Antistoff overfor den aktiverte fosforylerte form av p42/p44-MAP-kinase ble kjøpt fra New England Biolabs Inc. [5,6,8,9,11,12,14,15-<3>H]arakidonsyre, ECL™-reagenser og HRP-konjugert anti-mus-IgG var fra Amersham, Storbritannia. Geite-anti-kanin-HRP-konjugert IgG ble anskaffet fra Pierce Inc. Alle de andre anvendte reagenser var av den reneste tilgjengelige kvalitet.

Resultater: Sammenflytende kulturer av HUVEC ble behandlet i forskjellige tidsrom opp til 2 timer med VEGF, og mediet ble fjernet på disse tidspunkter og analysert med hensyn til tilstedeværelse av 6-keto-PGFia, et stabilt metabolsk nedbrytningsprodukt av PGI2. VEGF forårsaket en tidsavhengig økning i dannelsen av PGI2, som var påvisbart så tidlig som 15 minutter etter tilsetting av faktoren, den fortsatte å øke i opp til 60 minutter, og ble deretter opprettholdt i opp til 2 timer. Kontrollcellene oppviste bare en liten økning i PGI2-dannelsen i løpet av det undersøkte tidsforløp. VEGF-stimulering av PGI2-dannelsen var også konsentrasjonsavhengig. Etter en inkubering på 60 minutter, kunne det påvises en økning i PGI2-syntesen ved 5 ng/ml, den var halv-maksimal ved 10 ng/ml og nådde et maksimum ved 15 ng/ml. Det ble i overensstemmelse med dette observert at VEGF-bevirket PGI2-syntese undergikk en liten reduksjon ved 25 ng/ml.

Det ble også undersøkt om hvorvidt den VEGF-beslektede faktor PIGF, en spesifikk ligand for Flt-1-VEGF-reseptoren, kunne frembringe PGI2-syntese i HUVEC. I 5 uavhengige forsøk stimulerte PIGF PGI2-syntesen i betydelig mindre grad enn VEGF. Responsene både på VEGF og PIGF ble også sammenliknet med responsen på trombin, en potent induktor for prostanoid-syntese i endotelceller og blodplater. Ved flere uavhengige forsøk hvor virkningene av VEGF, PIGF og trombin ble sammenliknet direkte i parallelle kulturer, var middeløkningene med hensyn til 6-keto-PGFia, dannet ved 60 minutters inkuberinger med 25 ng/ml VEGF, 60 ng/ml PIGF og 1 E/ml trombin, henholdsvis 2,0,1,3 og 4,4 ganger over middelverdien for ikke-stimulert nivå av kontrollene.

Hvis VEGF-stimulering av PGI2-syntesen ble formidlet ved aktivering av en isoform til PLA2, ville det forutsees at VEGF ville bevirke hurtig mobilisering av arakinodinsyre fra cellene. For testing av dette ble HUVEC for-inkubert med radiomerket arakidonsyre i 24 timer og deretter utsatt for VEGF i forskjellige tidsrom. VEGF bevirket en økning i merkemateriale frigitt i mediet av for-merkede celler, som viste seg i 10 minutter og nådde et maksimum 30 minutter etter tilsetting av faktoren. Ifølge måling i parallelle kulturer var tidsforløpet for VEGF-stimulert arakidonsyre-frigivning meget likt tidsforløpet for trombin. Konsentrasjons-avhengigheten når det gjaldt VEGF-stimulert arakidonsyre-frigivning var meget lik den som ble oppnådd for PGI2-dannelse, med halvmaksimal virkning ved 2,5-5 ng/ml og et maksimum ved 10-20 ng/ml. I likhet med de relative evner hos trombin og VEGF til stimulering av PGI2-dannelsen, var maksimal VEGF-bevirket arakidonsyre-frigjøring tilsvarende lavere enn det som ble oppnådd for trombin. I fire uavhengige forsøk forårsaket VEGF og trombin middel-økninger i frigivningen av merket arakidonsyre på henholdsvis 1,6 og 3,4 ganger over det ikke-stimulerte basalnivå. PIGF forårsaket ingen påvisbar betydelig økning i arakidonsyrefrigjøringen fra for-merkede HUVEC.

Én sannsynlig mekanisme for hurtig VEGF-stimulert arakidonsyre-frigjøring er direkte enzymatisk frigjøring av arakidonsyre katalysert med cytosol-formen av PLA2. cPLA2 kan aktiveres ved MAP-kinaseavhengig fosforylering, og i likhet med fosforyleringen og aktiveringen av andre enzymer innbefattende MAP-kinaser, kan omdannelsen av cPLA2 til dens aktiverte form kontrolleres ved hjelp av en skift i dens mobilitet i SDS-PAGE-geler fra en hurtig til en langsomt vandrende form. Følgelig ble aktivering av cPLA2 som svar på VEGF bestemt ved Western blot-analyse av HUVEC-ekstrakter under anvendelse av et spesifikt antistoff overfor cPLA2 (BorschHaubold et al., som ovenfor, og Kramer et al., som ovenfor). I ekstrakter av ikke-stimulerte kont ro 11-HUVEC oppfattet antistoff overfor cPLA2 to atskilte bånd med omtrent lik intensitet og som vandrer med omtrent Mr 97 000. Skjønt cPLA2 har en forutsett molekylvekt på 85 kDa, er dette protein tidligere blitt rapportert å vandre i SDS-PAGE som et 97 kDa bånd (BorschHaubold et al., som ovenfor, og Kramer et al., som ovenfor).

VEGF i en konsentrasjon på 25 ng/ml ga en markert økning i immunreaktiviteten av den langsomt vandrende form av cPLA2 og en tilsvarende relativ reduksjon i den hurtigere vandrende form, som var påvisbar etter 2 minutter, nådde et maksimum etter 15 minutter og ble opprettholdt i opp til 60 minutter etter VEGF-tilsetting. Ved fem uavhengige forsøk forårsaket VEGF konsekvent en markert økning i immunreaktiviteten av den mer langsomt vandrende form av cPLA2. Den VEGF-bevirkede reduksjon i den elektroforetiske bevegelighet av cPLA2 var også konsentrasjonsavhengig, med en bemerkelsesverdig økning i den langsomt vandrende form ved en konsentrasjon på 2,5 ng/ml og en maksimal økning ved 5-10 ng/ml, den høyeste testede konsentrasjon. Skjønt VEGF forårsaket en tilsynelatende reduksjon i nivået for den hurtigere vandrende form av CPLA2, var det tydelig at dette enzym var tilstede ved alle de undersøkte VEGF-konsentrasjoner og behandlingstider. Trombin forårsaket også et påfallende skift i mobiliteten av cPLA2 fra en hurtigere til en mer langsomt vandrende form, som begge vandret nøyaktig sammen med dem som ble påvist i ekstrakter av VEGF-behandlede HUVEC. Direkte sammenlikning av virkningene av VEGF og trombin i det samme forsøk viste at, i likhet med resultatene oppnådd for PGI2-syntese og arakidonsyre-frigjøring, forårsaket trombin en mer markert økning i gel-retarderingen av cPLA2 med praktisk talt fullstendig forsvinnen av den hurtigere vandrende form av enzymet. PIGF forårsaket ikke noe påvisbart skift i mobiliteten av immunreaktiv cPLA2 fra hurtigere til mer langsomt vandrende former.

Det ble videre undersøkt om hvorvidt VEGF også bevirket vWF-sekresjon hos HUVEC. VEGF stimulerte en tids- og konsentrasjonsavhengig dannelse av vWF. vWF kunne påvises i HUVEC-medium så tidlig som 30 minutter etter tilsetting av 25 ng/ml VEGF til celler, og fortsatte å øke i løpet av det undersøkte tidsforløp, idet den nådde et nivå på 2,5 ganger over nivået i kontrollcellene etter 3 timer. Konsentrasjonsavhengigheten for virkningen av VEGF var lik den som ble oppnådd for PGI2-dannelse med en halvmaksimal respons ved ca. 10 ng/ml og en maksimal effekt ved 25 ng/ml, den høyeste testede konsentrasjon. Når det likeledes gjaldt resultatene oppnådd for PGI2-syntese, var virkningen av VEGF sammenliknbar med, skjønt tilsvarende svakere enn, virkningen av trombin (fig. 12 A). I motsetning til VEGF, forårsaket ikke PIGF noen påvisbar stimulering av vWF-sekresjonen i HUVEC. Sammenlikning av virkningene av VEGF og PIGF på vandringen av HUVEC i kjemotakse-kamre viste at skjønt VEGF stimulerte en konsentrasjonsavhengig økning i kjemotakse, forårsaket ikke PIGF noen påvisbar økning i konsentrasjonsområdet 5-60 ng/ml.

VEGF aktiverer p42/p44 MAP-kinaser i HUVEC. Dersom MAP-kinaser har inngått ved cPLA2-aktivering med andre faktorer, innebærer dette muligheten for at MAP-kinase-kaskaden kan formidle VEGF-bevirket PGI2-syntese og cPLA2-aktivering. Konsentrasjonsavhengigheten når det gjaldt VEGF-stimulert aktivering av p42/p44-MAP-kinaseaktiviteten i sammenflytende HUVEC ble undersøkt. Utsettelse av cellene for VEGF i 15 minutter ga en påvisbar økning i aktiviteten ved en konsentrasjon så lav som 0,5 ng/ml, en halv-maksimal økning mellom 1 og 5 ng/ml, og en maksimal effekt ved 10 ng/ml som ble opprettholdt opp til 50 ng/ml. I motsetning til den påfallende effekt av VEGF, forårsaket PIGF i konsentrasjonsområdet 1-60 ng/ml liten, hvis noen, påvisbar økning i MAP-kinaseaktiviteten i HUVEC. VEGF-stimulering av p42/p44-MAP-kinaser ble fullstendig inhibert ved en 30 minutters for-behandling med PD98059, en selektiv inhibitor for MAP-kinase (Dudley et al., PNAS USA (1995) 92:7686-7689), dobbelt-spesifisitets-treonin- og tyrosin-kinasen som spesifikt fosforylerer og aktiverer p42/p44-MAP-kinaser. Effekten av inhibitoren var konsentrasjonsavhengig, med mer enn 50% inhibering ved 5 mM og en reduksjon av MAP-kinaseaktiviteten til det ikke-stimulerte kontrollnivå ved 10-20 mM.

MAP-kinase-kaskadens rolle ved den VEGF-bevirkede arakidonsyre-mobiliseringsvei ble i begynnelsen undersøkt ved undersøkelse av virkningen av PD98059 på PGI2-syntesen. For-behandling av HUVEC med 30 mM PD98059 i 30 minutter inhiberte fullstendig PGI2-dannelsen bevirket ved en etterfølgende 60 minutters inkubering med enten 25 ng/ml VEGF eller 1 E/ml trombin. Virkningen av PD98059 på VEGF-bevirket PGI2-syntese var konsentrasjonsavhengig, med en halvmaksimal effekt ved ca. 5 mM og en maksimal inhiberende effekt på stimulert PGI2-dannelse ved 10 mM. Det ble også konstatert at PD98059 reduserte PGI2-dannelsen i VEGF-behandlede celler til under verdiene målt i kontrollceller, skjønt denne virkning bare var synlig ved konsentrasjoner av inhibitoren på over 10 mM.

Det ble deretter undersøkt om hvorvidt PD98059 hadde noen virkning på den VEGF-bevirkede reduksjon i den elektroforetiske mobilitet av cPLA2. For-behandling med PD98059 ved 25 mM blokkerte fullstendig den VEGF-stimulerte økning i den langsomt vandrende form av cPLA2.1 likhet med virkningene av PD98059 på PGI2-syntesen, reverserte inhibitoren ikke bare den VEGF-avhengige reduksjon i cPLA2-gelmobiliteten, men reduserte også immunreaktiviteten av den mer langsomt vandrende form til under, og øket immunreaktiviteten hos den hurtigere vandrende form til over, kontrollnivåene.

Selektiviteten av virkningen av PD98059 for VEGF-bevirket cPLA2-aktivering og PGI2-syntese ble undersøkt ved testing av om hvorvidt VEGF-stimulert vWF-dannelse også var påvirkelig overfor inhibering med PD98059. For-behandling av HUVEC med MAP-kinase-kinase-inhibitoren ved 25 mM verken forhindret eller reduserte i noen betydelig grad sekresjonen av vWF forårsaket av en etterfølgende tilsetning av VEGF, i motsetning til virkningen av PD98059 på cPLA2-aktiveringen og PGI2-syntesen. PD98059 hadde heller ingen virkning verken på basal eller trombinstimulert vWF-sekresjon.

Oppsummering: VEGF stimulerte en tids- og konsentrasjonsavhengig økning i PGI2-syntesen som var påvisbar innen 15 minutter, halv-maksimal ved 10 ng/ml og maksimal ved 15 ng/ml etter 60 minutter. Ved 10 uavhengige forsøk var middelmaksimal VEGF-stimulert PGI2-syntese 2 ganger over basalnivåene ved 25 ng/ml etter 60 minutter. Den VEGF-beslektede faktor, placenta-vekstfaktor (PIGF), induserte en meget svakere 1,3 gangers økning, og trombin (1 E/ml, 60 min.) induserte en middelmaksimal økning på 4,4 ganger over kontrollnivåene. VEGF stimulerte frigjøringen av arakidonsyre fra HUVEC med en liknende konsentrasjonsavhengighet som den som ble oppnådd for PGI2-syntese, men med hurtigere kinetikk: halv-maksimal arakidonsyre-mobilisering fant sted etter 10 minutter og var maksimal etter 30 minutter. Måling av cytosolisk fosfolipase-A2-(cPLA2)-aktivering under anvendelse av mobilitetsskift i SDS-PAGE som markør for aktivering viste at VEGF stimulerte cPLA2-aktiviteten på en tids- og konsentrasjonsavhengig måte: en økning i den langsomt vandrende og aktiverte form av cPLA2 oppsto så tidlig som etter 2 minutter og var påvisbar så langt ned som 2,5 ng/ml, og nådde et maksimum etter 15 minutter og ved 5 ng/ml. I likhet med andre midler som gir PGI2-syntese, bevirket VEGF også en påfallende tids-og konsentrasjonsavhengig økning i sekresjon av von Willebrand-faktor (vWF) i HUVEC som var påvisbar innen 30 minutter, halv-maksimal ved 10 ng/ml og nådde 2,5 ganger over kontrollnivåene etter en 3 timers behandling med 25 ng/ml VEGF. VEGF induserte en hurtig og forbigående aktivering av p42/p44-MAP-kinaser som var påvisbar så langt ned som 1 ng/ml og nådde et maksimum ved 5-10 ng/ml. I motsetning til dette hadde PIGF liten virkning på MAP-kinaseaktiviteten. PD98059, en selektiv inhibitor til MAP-kinase-kinase, forårsaket fullstendig inhibering av VEGF-stimulert MAP-kinaseaktivitet, PGI2-syntese og cPLA2-gelretardasjon, men hadde ingen virkning på VEGF-bevirket vWF-sekresjon. Disse funn gir det første bevis på at VEGF kan stimulere PGI2-syntesen via cPLA2-formidlet arakidonsyre-frigjøring. Disse funn viser også at VEGF-stimulering av denne biosyntesevei kan finne sted, i det minste delvis, via aktivering av p42/p44-MAP-kinaser.

Resultatene presentert her viser at VEGF stimulerer en påfallende tids- og konsentrasjonsavhengig økning i PGI2-dannelsen i HUVEC. Virkningen av VEGF var svakere enn virkningen av trombin, skjønt responsene overfor de to faktorer varierte gjennomsnittlig med en faktor på bare 2,5. VEGF stimulerer den hurtige mobilisering av arakidonsyre fra humane endotelceller, og ifølge bedømmelse ved en gelretardasjonsanalyse, den hurtige aktivering av cPLA2. Metoden som ble anvendt for bestemmelse av virkningen av VEGF på arakidonsyre-mobilisering, er basert på frigjøring av <3>H-merkemateriale fra celler som er for-merket med 3H-arakidonsyre. Siden undersøkelsene av arakidonsyre-frigjøring ble utført med BSA som var tilstede i mediet, er det meget sannsynlig at hovedproduktet frigjort fra HUVEC er <3>H-arakidonsyre. Konsentrasjons-avhengighetene når det gjaldt VEGF-bevirket PGI2-dannelse, arakidonsyre-frigjøring og cPLA2-aktivering var lik hverandre (alle i området 5-10 ng/ml). Disse resultater viser at VEGF-stimulering av arakidonsyre-frigjøring og PGI2-syntese formidles via høyaffinitets-reseptorer for denne faktor i HUVEC.

Arakidonsyre-frigjøring og cPLA2-mobilitetsskift skjedde hurtigere enn PGI2-syntese, i overensstemmelse med den oppfatning at det er meget sannsynlig at øket dannete av PGI2 i det minste delvis er en direkte følge av øket cPLA2-aktivitet og en etterfølgende økning i tilgjengeligheten av intracellulær arakidonsyre, substratet for det grunnleggende enzym COX-1. Siden VEGF er kjent for å stimulere fosfolipase C-g-, tyrosinfosforylerings- og fosfoindositid-metabolismen, er det helt sannsynlig at andre mekanismer som innbefatter den sekvensielle innvirkning av fosfolipase C-g (og/eller fosfolipase D) og diacyl- og monoacylglycerol-lipaser, også kan bidra til VEGF-bevirket arakidonsyre-mobilisering av PGI2-syntese.

Det ble også undersøkt om hvorvidt den VEGF-beslektede faktor, PIGF, en spesifikk ligand for Flt-1, kunne stimulere dannelsen av PGI2. Resultatene tyder på at PIGF kan indusere PGI2-syntese, men svakere enn VEGF. Det ble ikke påvist noen virkning av betydning av PIGF verken på arakidonsyre-frigjøringen eller cPLA2-mobilitetsskiftet. Siden PIGF bindes med høyaffinitet bare til Flt-1-VEGF-reseptoren, er disse resultater mest i overensstemmelse med den konklusjon at stimulering av PGI2-dannelsen med VEGF i HUVEC hovedsakelig formidles ved KDR/Flk-1 -reseptorer, men at Flt-1 også kan bidra til stimulering av denne vei. En hver Flt-1-mediert PGI2-syntese vil imidlertid vise seg å innbefatte en annen mekanisme enn cPLA2-fosforylering. Det kan være minst to forklaringer på den relativt lavere respons overtor PIGF. Enten bevirker Flt-1 en svakere respons, og/eller Flt-1 er tilstede ved lavere nivåer enn KDR/Flk-1.

Resultatene vist i det foreliggende viser at VEGF bevirket sekresjon av vWF på en tids- og konsentrasjonsavhengig måte. Konsentrasjonsavhengigheten når det gjaldt virkningen av VEGF på vWF-sekresjonen var i nøye overensstemmelse med avhengigheten for PGI2-syntese og arakidonsyre-mobilisering. I motsetning til den relativt svake virkning av PIGF på PGI2-syntesen, stimulerte ikke PIGF en påvisbar økning i vWF-frigjøring ved HUVEC.

Det funn at VEGF forårsaker et hurtig skift i elektroforetisk mobilitet av cPLA2, er i overensstemmelse med øket fosforylering, og følgelig aktivering, av p42/p44-MAP-kinasene. Dette understøttes ved det funn som er presentert her, at trombin, som er kjent for å stimulere cPLA2-fosforylering og -aktivering i blodplater, forårsaket et liknende skift i cPLA2-mobiliteten i HUVEC. Resultatene presentert her viser også at VEGF aktiverer p42/p44-MAP-kinaser og at inhibering av denne vei med en selektiv inhibitor for MAP-kinase-kinase, PD98059, blokkerer PGI2-dannelsen og den økte gel-retardering av cPLA2 bevirket av VEGF. Virkningen av PD98059 var i det minste delvis selektiv, siden den ikke hadde noen virkning på vWF-sekresjonen, stimulert enten med VEGF eller trombin. I motsetning til den slående virkning av VEGF, ga ikke PIGF noen betydelig økning i MAP-kinaseaktiviteten. Den tilsynelatende manglende evne hos PIGF til å stimulere MAP-kinaseaktiviteten er stort sett i overensstemmelse med den mye svakere virkning av denne faktor på PGI2-dannelsen sammenliknet med VEGF, og med den tilsynelatende manglende evne hos denne faktor til å befordre cPLA2-gelretardasjon.

Analyser av PGI2-dannelse i HUVEC viste tilstedeværelse av et betydelig basalnivå av syntese. Interessant nok avskaffet MAP-kinase-kinase-inhibitoren også PGI2-dannelsen i ikke-stimulerte kontrollceller. I overensstemmelse med formidling av PGI2-dannelsen via aktivering av MAP-kinase-kaskaden, reduserte PD98059 også nivået for den langsomt vandrende fosforylerte form av cPLA2 til under kontrollnivået og økte nivået for den hurtig vandrende mindre fosforylerte form til over kontrollnivået. Analyser av MAP-kinaseaktiviteten tydet på et betydelig nivå av basal-aktivitet, som også var inhiberbar med PD98059. Disse funn tyder på at MAP-kinaseaktivering kan være ansvarlig ikke bare for VEGF- og trombin-avhengig cPLA2-aktivering, men at at basal-MAP-kinaseaktivitet også kan være nødvendig for opprettholdelse av grunnleggende cPLA2-aktivitet og PGI2-dannelse.

Det er sannsynlig at andre signaliseringsmekanismer kan bidra til VEGF-stimulering av PGI2-syntese og arakidonsyrefrigjøring, innbefattende forhøying av intracellulært [Ca<++>].

VEGF er inntil i dag hovedsakelig blitt ansett som en angiogen faktor som aktiverer endotelcellevekst og -vandring. Funnene presentert her åpenbarer ytterligere aktiviteter og kan derfor ha viktige bibetydninger både med hensyn til regulering av endotelfunksjonen og for forståelse av funksjonen av VEGF, samt for behandling og forebygging av blodkarsykdommer så som stenose, restenose, aterosklerose og hypertensjon.

Claims (9)

1. Anvendelse av et middel som er et VEGF protein som har evnen til å fremme proliferasjonen av endotelceller in vitro og/eller in vivo, eller en nukleinsyre kodende for proteinet for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av intimal hyperplasi i et blodkar hvor endotelet er helt eller overveiende intakt.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor blodkaret er en arterie.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2 for behandling eller forebygging av stenose bevirket ved et kirurgisk inngrep eller i tilknytning til pulmonalarterie-hypertensjon.

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvor det kirurgiske inngrep er angioplasti, koronar-bypass-kirurgi, kirurgisk innsetting av anastomose, eller endarteriektomi.

5. Anvendelse i henhold til hvilket som helst av de foregående krav, til behandling eller forebygging av stenose av blodkaret.

6. Anvendelse i henhold til hvilket som helst av de foregående krav, til behandling eller forebygging av restenose av blodkaret.

7. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor proteinet har en sekvens ifølge SEKV ID nr. 2, 4, 6 eller 8, eller et aktivt fragment derav.

8. Anvendelse i henhold til hvilket som helst av de foregående kravene, hvor midlet er en nukleinsyre i tilknytning til en viral eller ikke-viral vektor.

9. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 -8 for anvendelse ved levering av et middel til et blodkar i en pasient, hvor midlet er anbrakt i legeme tilpasset for å tilveiebringe en forsegling rundt karet, idet midlet blir holdt innenfor eller assosiert med innretningen, idet ved anvendelse kommer midlet i kontakt med karets adventitia-overflate.