JP2001503755A - Ｎｏまたはプロスタサイクリン産生を刺激する薬剤の治療的使用およびデリバリー装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、内膜過形成、高血圧症およびアテローム性動脈硬化症、ならびに、一酸化窒素またはプロスタサイクリンを産生する薬剤による治療に感受性の症状の治療における用途を有する。ＶＥＧＦの代わりに、ＶＥＧＦ受容体のアゴニストなどの等価な薬剤がかかるアゴニストをコードする核酸と同様に投与される。該薬剤は、例えば本体壁と血管外膜表面との間にリザーバーを画定する装置であって、該リザーバーに、送られるべき薬剤を含有してなる医薬製剤が少なくとも部分充填されている装置を用いて、血管外膜表面を介して成功裏に投与される。

Description

【発明の詳細な説明】 ＮＯまたはプロスタサイクリン産生を刺激する薬剤の治療的使用およびデリバ リー装置 発明の分野 本発明は、成長因子の治療的使用、ならびに、特に血管内膜過形成および他の 症状、とりわけ高血圧症の治療および予防に関する。本発明は、さらに、有効薬 剤を送る（輸送する）ために用いることができる装置に関する。 発明の背景 内膜過形成は、血管の内皮と内弾性膜との間、特に、そこに見られる内膜層に おけるか、または、動脈における、細胞の数の増加である。内膜過形成は、しば しば、血管壁における平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖が原因である。 内膜過形成が生じると、内膜層または血管壁の新たな肥厚、すなわち、狭窄が 生じる。かくして、該血管は、閉塞する。 また、血管の障害が取り除かれた場合、術後に生じる内膜過形成により、再び 動脈が閉塞する。これは、再狭窄として知られている。 動脈平滑筋細胞の増殖は、一般に、血管、例えば、動脈が手術の間に変形させ られるかまたは妨害された場合に生じる。例えば、内膜過形成は、静脈を動脈に 吻合するバイパス移植後および一般に外科的吻合後に新たな狭窄を生じさせるこ とがある。狭窄を生じることがある外科的方法の２つの例は、冠状動脈バイパス 移植および膝上大腿膝窩動脈バイパス移植（above-knee femoro-popliteal arte rial bypassgraft）である。 同様に、再狭窄は、例えば、バルーン式血管形成術のような血管の障害を取り 除くために用いられるバルーン式血管形成術後に生じることがある。 内膜過形成は、狭窄または再狭窄のいずれを生じさせるにしても、種々の手術 の後に重大な課題を残す。 アテローム硬化性心臓血管疾患は、ヨーロッパおよび南アメリカにおける主な 死 亡原因であり、血流を妨害するかまたは減少させる動脈内腔の閉塞、可能な遠位 塞栓形成を伴う斑上に生じた血栓症、動脈瘤拡大および最終的な破裂に導く動脈 壁の脆弱化の結果として生ずる非常に重大な病的状態を誘発する。部位および疾 患分布により、治療にはいくつかのオプションが存在し、動脈バイパス移植が最 も一般的な外科的介入である。冠状動脈疾患については、これは、現在、アメリ カ合衆国では最も一般的な手術となってきており、１９９０年以来毎年２００， ０００件を超える手術が行われ、英国では毎年２０，０００件を超える手術が行 われている。大動脈、腎血管、腸間膜血管および末梢血管では、外科的バイパス 術の負担は増加しつづけており、アメリカ合衆国およびヨーロッパでは人口１０ ０，０００人当たり３５−７０人の手術率である。合わせると、毎年行われてい る外科的バイパス術の件数は、ほぼ１００万件である。 術後の最初の２４か月では、非常に有意な数の動脈バイパス移植が失敗に終わ る（閉塞する）。推定値は、２０％〜３０％の範囲である。これは、英国で毎年 行われている心臓および末梢動脈バイパス術の総数（約２５，０００−３０，０ ００件）に対して６，０００〜７，０００件が２年以内に失敗すると予測される ことを意味している。「再」手術についての失敗率は、もっと高い。失敗の財政 上の費用は、アメリカ合衆国では、冠状動脈手術後の失敗率が３３％から２５％ にわずかに低下した場合でさえ健康管理予算から７億５０００万ドルまで削減で きると算出された。 手術から５年以内の移植失敗については、３つの主な原因がある。第一には、 手術の３０日以内の初期に生じることが認められており（＜５％）、技術的なエ ラー（例えば、粗悪な吻合技術）を示す。後の２４ヶ月後の失敗は、一般に、本 来のアテローム性動脈硬化症経過が進行した結果としてである。しかしながら、 それは、失敗の大多数（＜７０％）を形成する１〜２４ヶ月の間に閉塞するこれ らの移植片である。これらの場合、それは、最後には完全な閉塞を生じる、動脈 内腔が進行的に狭くなること、すなわち狭窄を生じるＳＭＣ内膜過形成である。 典型的には、ＳＭＣ内膜過形成は、遠位の動脈吻合および該吻合に対向する自然 血管壁の周囲に位置する。かくして、それは、この部位での主要な病因であるが 、血管形成術後に生じるような前の内膜過形成部位での再狭窄ではない。ＳＭＣ 内膜過形成は、より近 位の動脈吻合で移植片自体に沿って生じることもある。 血管形成術後の再狭窄は、血管形成術後の最初の６ヶ月間に２０％〜５０％の より高い失敗率を生じることがある。狭窄および再狭窄は、共に、依然として、 術後の主な課題である。 現在までのところ、内膜過形成を治療または予防するための多くの方法が試験 されてきたが、臨床的に満足のいくようなものは全くなかった。 血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、天然タンパク質である。ヒトにおいては、 １２１、１６５、１８９および２０６アミノ酸の少なくとも４つの形態が存在す る。ヒトＶＥＧＦの４つの形態のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、Houck et al. ，Molecular Endocrinology（1991）vol 5，No．12，pages 1806-1814に記載さ れている。部分的なゲノム配列も記載されている。ヒトＶＥＧＦのｃＤＮＡ配列 もまた、ウシＶＥＧＦ ｃＤＮＡ配列と一緒に、Leung et al.，Science（1989） 246:1306-1309に記載されている。 これらの４つの形態は、本明細書ではＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５、 ＶＥＧＦ−１８９およびＶＥＧＦ−２０６と記載される。この番号付けは、各ケ ースで成熟タンパク質におけるアミノ酸の数を表す。該翻訳タンパク質は、また 、細胞内プロセシングの間に自然に開裂される２６アミノ酸プレ配列を含む。 ＶＥＧＦは、血管内皮細胞（ＥＣ）の分割を刺激し、内皮透過性を増大させ、 網膜血管中で内皮「生存因子」として作用するという脈管形成における役割を果 たすことが知られている。例えば、組換えタンパク質の形態またはプラスミドか ら発現された場合のＶＥＧＦは、虚血性の脚に動脈内注射した場合、新しい血管 の発生を誘発することができる。この特性により、該ＶＥＧＦは、手術の間に内 皮が傷つけられた動脈を修復する際に用いられてきた。かくして、Asahara et a l.，Circulation（1995）91:2793では、ラット頚動脈の内皮を露出させる血管形 成術の後に該頚動脈の内部にカニューレを介してＶＥＧＦを送った；ＶＥＧＦが 、内膜過形成の抑制に寄与すると思われる動脈の再内皮形成を刺激することが見 出された。 ＶＥＧＦタンパク質および遺伝子は、PCT出願WO 90／13649に記載されており 、血管上皮の外傷、糖尿病性潰瘍および血管創傷の治療のためのそれらの使用が 提案 されている。ＶＥＧＦフラグメントは、PCT出願WO 91／02058に記載されており 、例えば、潰瘍の治療における、血管形成および内部血管表面の再内皮形成にお けるそれらの使用が提案されている。 英国特許出願公開第2298577号には、動静脈バイパス移植術用非拘束性多孔性 外部ステントが記載されている。このステントは、内腔の大きさならびに中膜お よび内膜の肥厚に対して有益な効果を及ぼす。 PCT出願WO 94/23668には、２つの構成要素の間に形成されたリザーバーを含む 、薬剤の血管への局所デリバリー用装置が記載されている。その使用は、移植、 すなわち、血管を切り離し、次いで、血管壁に装置を固定することを必要とする 。該装置は、一部多孔性である。リザーバーは、内腔血流と直接接触する。これ は、感染の危険性を伴う。 米国特許第3797485号には、薬物の血管外膜表面へのデリバリー用装置が記載 されている。それは、液体形態の薬物のデリバリー用永久壁および経皮管を提供 するものである。目的は、薬物が別の部位に移されることである。 発明の概要 本発明は、内膜過形成により生じる上記症状の全てを治療および／または予防 することを目的とする。驚くべきことに、ＶＥＧＦの特性が同定され、これは、 種々の方法で内膜過形成に対して用いられうることを示す。 ウサギの動脈の外周にカラー（collar）を付けた。この方法は、通常、ウサギ の動脈中で、バイパス術後にヒトの動脈中で起こりうる狭窄と類似する、動脈壁 の肥厚を生じさせる内膜過形成を生じる。このカラーを用い、プラスミド／リポ ソームベクターを用いてＶＥＧＦをコードするＤＮＡを動脈壁に送ると、ＶＥＧ Ｆ遺伝子は、内皮層を含む動脈壁で過剰発現した。内膜過形成は、阻害された。 外膜カラーが全ての試験された遺伝子デリバリーシステムを用いる動脈遺伝子導 入に適することが見出された。 このことは、ＶＥＧＦが、内皮が損傷を受けた場合に再内皮形成を刺激するこ とに加えて、内皮の全体または大部分が無傷である場合に内膜過形成が生じる状 況で内膜過形成抑制能を有することを示している。したがって、血管形成術後の 再狭窄 を抑制することにおけるだけではなく、他の外科的状況下で新しい狭窄を予防ま たは治療することにおいても潜在的に有用である。かくして、ＶＥＧＦが内皮の 再成長または治癒を刺激することが見出されたところでは、新しい知見と従前の 知見との間に差異がある。新しい知見は、ＶＥＧＦの作用の異なるメカニズムに より生じると思われる。 さらにまた、新しい知見は、有効な薬剤が血管の外部に送られて、内膜過形成 を治療することができるということを示す。このことは、いくつかの長所を有す る。詳しくは、治療薬は、内腔内デリバリーの場合と同様に血流により過形成部 位から洗浄されない。デリバリーリザーバーは、血管の周囲に維持でき、血管内 皮に損傷を与える（自体、内膜過形成を誘発することがある）内腔内手技を必要 しない。 さらに詳しくは、本発明は、ＳＭＣ内膜過形成に逆らう薬剤の動脈壁外膜表面 （すなわち、外中膜においてこれらの細胞に最も近い）への直接適用を可能にす る。内膜過形成性病変を発生させると思われる部位は、手術時に容易に露出され るので、用いられるいずれの薬剤もこれらの部位で特異的に適用することができ る。 ＶＥＧＦは、単にＥＣおよび単球上で発現されるだけの特異的高結合性チロシ ンキナーゼ受容体ｆｌｋ−１／ＫＤＲおよびｆｌｔ−１を介してその既知の効果 を媒介する。理論により制限されることなく、過形成の阻害におけるＶＥＧＦの 効果もまた、同一受容体を介して媒介されると思われる。したがって、本発明は 、また、内膜過形成を治療または予防するための、ＶＥＧＦが結合する受容体の 他のアゴニスト、または、同一作用機序を有する他の物質の使用にも及ぶ。ＶＥ ＧＦ受容体の特異的な位置決定もまた、内膜肥厚の治療について示唆されている 多くの他の成長因子およびサイトカインと比較してＶＥＧＦの優れた点を与える ；単球の不在下、動脈壁における高結合性ＶＥＧＦ受容体は、単にＥＣ上で発現 されるだけであるので、ＶＥＧＦの該効果は、ＥＣに対して、より特異的である 。 例えば、一酸化窒素（ＮＯ）合成阻害物質Ｌ−ＮＡＭＥの投与は、上記カラー モデルにおける内膜過形成に対するＶＥＧＦの効果を中和するので、内皮の全体 または大部分が損傷受けていない状況下におけるＶＥＧＦの内膜過形成阻害メカ ニズムは、少なくとも部分的には、一酸化窒素（ＮＯ）経路を介するものである ことが見 出された。かくして、ＶＥＧＦは、ＮＯ産生を刺激する。 ＶＥＧＦは、内膜過形成の阻害に寄与する他の生物学的効果を及ぼすことも可 能である。詳しくは、ＶＥＧＦ過剰発現が、プロスタサイクリンの産生、細胞質 ホスホリパーゼＡ₂の活性化およびＥＣによるフォン・ビルブラント因子分泌を 刺激することが見出された。それは、ＶＥＧＦのＮＯ産生刺激およびそのプロス タサイクリン産生刺激が連携して内膜過形成を抑制するように作用する場合であ る。 ＶＥＧＦがＮＯおよびプロスタサイクリン産生を刺激するように作用するとい う知見は、さらに、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦを結合する受容体のアゴニストが他 のＮＯ関連および／またはプロスタサイクリン関連症状の治療に有用であること を示唆する。詳しくは、Forte et al.，Lancet（1997）349:837-42には、高血圧 症に罹患している個体ではＮＯレベルが低いことが示されている。したがって、 ＶＥＧＦは、種々の形態の高血圧症の治療または予防に有用である。同様に、Ｖ ＥＧＦは、アテローム性動脈硬化症の治療に有用である。 本発明の態様によると、ＶＥＧＦについて見出された所定の特徴のいずれかを 有する薬剤が内膜過形成、例えば、狭窄の治療薬または予防薬の製造のために用 いられる。該薬剤は、移植の形態で提供される。さらに詳しくは、該薬剤は、Ｎ Ｏまたはプロスタサイクリンの産生を刺激する；それは、ＶＥＧＦが結合する受 容体のアゴニスト、例えば、ＶＥＧＦ自体もしくはそのフラグメント、またはか かるアゴニストをコードする核酸である。 本発明の別の態様によると、患者における治療薬の血管へのデリバリー用装置 は、血管の周囲でシールを与えるのに適合させた本体からなっており、該薬剤が 使用時に血管外膜表面と接触するようになるように該薬剤が装置内に保持されて いるかまたは装置に装着されている。かかる装置は、生分解性であり得、永久的 な経皮デリバリーチューブを必要としない。 発明の説明 上記で示唆し、実施例に示すとおり、一酸化窒素シンターゼおよびそれをコー ドする核酸を含む種々の薬剤は、本発明における使用に適している。該薬剤は、 本明細書では、しばしば、ＶＥＧＦタンパク質または核酸と記載され、これらの 言及お よびＶＥＧＦ自体に対する言及が例として挙げられる。上記ＶＥＧＦのいずれの 形態も本発明の目的のために用いられる。 本明細書では、これらのＶＥＧＦタンパク質配列に対する言及は、プレ配列を 含む配列およびプレ配列を欠いている配列の両方に適用される。ＶＥＧＦタンパ ク質は、プレ配列を有していてもいなくても本発明の実施に適している。同様に 、ＶＥＧＦ核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）配列に対する言及は、プレ配列をコード する配列およびプレ配列をコードしない配列の両方に適用される。 Houck et al．（上掲）には、１４１位（成熟タンパク質に相当する、Houck e t al.の表示法では１１５位）でアミノ酸アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）を含 むＶＥＧＦ−１６５の配列が記載されている。Houck et al.には、ＶＥＧＦ−１ ２１、ＶＥＧＦ−１８９およびＶＥＧＦ−２０６においてこのアミノ酸をリシン （ＫまたはＬｙｓ）と記載されており、Houck et al.に引用された（ＶＥＧＦ− ２０６の）ｃＤＮＡ配列は、これを支持している。したがって、本発明では、１ ４１位のアミノ酸は、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）またはリシン（Ｌｙｓま たはＫ）である。各アミノ酸は、本発明の核酸配列において適当なトリプレット コドンによりコードされている（ＤＮＡに関しては、これらのコドンは、リシン についてはＡＡＡまたはＡＡＧであり、アスパラギンについてはＡＡＴまたはＡ ＡＣである）。これは、とりわけ、ＶＥＧＦ−１６５に適用される。 ４つの形態は、同一遺伝子によりコードされるが、ＲＮＡレベルでの選択的ス プライシングにより生じる。かくして、ヒトＶＥＧＦの全長形態および３つの公 知のトランケート形態がある。ＶＥＧＦ−１２１およびＶＥＧＦ−１６５は、可 溶性であり、分泌形態である。同様に、２６アミノ酸プレ配列は、疎水性であり 、該タンパク質の溶解性を低下させると思われる。かくして、プレ配列を有して いないＶＥＧＦの形態は、より高い溶解性を有すると思われるので好ましい。Ｖ ＥＧＦの全ての形態が本発明の実施に適しているが、分泌形態が好ましい。本発 明の実施に適するＶＥＧＦタンパク質は、他の種に源を発していてもよいが、ヒ トＶＥＧＦが好ましい。例えば、マウス、ウサギおよびウシＶＥＧＦは、クロー ン化されており、それらの配列は、入手可能である。 参考のために、ＶＥＧＦ−１２１、１６５、１８９および２０６は、当該技術 分野では、ＶＥＧＦ−１２０、１６４、１８８および２０５とも称される。 ＶＥＧＦタンパク質および核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、本発明の実施に適 する薬剤である。 ＶＥＧＦタンパク質を用いる場合、配列番号２（ＶＥＧＦ−１２１）、４（Ｖ ＥＧＦ−１６５）、６（ＶＥＧＦ−１８９）または８（ＶＥＧＦ−２０６）のア ミノ酸配列を有するＶＥＧＦタンパク質が好ましい。ＶＥＧＦの分泌形態が好ま しく、従って、ＶＥＧＦ−１２１およびＶＥＧＦ−１６５がとりわけ好ましい。 本発明の実施において、例えば配列番号１、３、５または７の配列を有する、 ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８９またはＶＥＧＦ−２０ ６をコードするＶＥＧＦ ＤＮＡを用いるのが好ましい。ヒトＶＥＧＦの分泌形 態をコードするＤＮＡ配列が好ましい。かくして、配列番号１および３のＤＮＡ 配列がとりわけ好ましい。 しかしながら、本発明の実施に適するＶＥＧＦ ＤＮＡおよびタンパク質は、 これらの特異的配列に限定されない。むしろ、本発明は、他の密接に関係するＤ ＮＡおよびタンパク質配列の使用を提供するものでもある。 本発明のＤＮＡ配列は、多くの点で配列番号１、３、５または７のものと関係 がある。例えば、本発明の実施に適するＤＮＡ配列は、同タンパク質、すなわち 配列番号２、４、６または８のタンパク質をコードする変性配列であってもよい 。 別法としては、本発明のＤＮＡ配列は、配列番号１、３、５または７のものと 実質的に相同であり、アミノ酸配列において配列番号２、４、６または８のもの とは異なるタンパク質をコードするが、ＶＥＧＦ活性を有するタンパク質をコー ドする。典型的には、本発明で用いるためのＤＮＡ配列は、配列番号１、３、５ または７の配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少 なくとも９５％、または、少なくとも９９％の配列ホモロジーを有する。 同様に、本発明で用いるためのＶＥＧＦ ＤＮＡ配列は、ＶＥＧＦ活性を保有 するＶＥＧＦのフラグメントをコードする。このフラグメントは、少なくとも１ ５アミノ酸長、例えば、４０までまたはそれ以上のアミノ酸である。適当なフラ グメン トの例は、２０アミノ酸長であり、例えば、配列番号６として示される活性ＶＥ ＧＦタンパク質の配列１−２０、１１−３０、２１−４０、３１−５０、４１− ６０、５１−７０、６１−８０、７１−９０、８１−１００、９１−１１０、１ ０１−１２０、１１１−１３０、１２１−１４０、１３１−１５０、１４１−１ ６０、１５１−１７０、１６１−１８０、１７１−１９０、１８１−２００、１ ９１−２１０および１９６−２１５である。 本発明で用いるためのＤＮＡ配列は、例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ 、または、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ間のハイブリッドであるか、または、そ れらは、合成または半合成であってもよい。それらは、いずれの種に源を発して もよいが、ヒトＶＥＧＦをコードするＤＮＡが好ましい。それらは、一本鎖また は二本鎖であってもよい。配列番号２、４、６および８のタンパク質をコードす るゲノムＤＮＡは、とりわけ好ましい。 本発明で用いるためのＤＮＡ配列は、１以上のヌクレオチドの欠失、挿入また は置換により、配列番号１、３、５または７に示される配列とは異なる。ただし 、それらは、ＶＥＧＦ活性を有するタンパク質をコードする。同様に、それらは 、配列番号１、３、５または７に関してトランケートされるか、または、１以上 のヌクレオチドにより伸長されていてもよい。ただし、それらは、ＶＥＧＦ活性 を有するタンパク質をコードする。 ＲＮＡ配列もまた、本発明の実施に適している。詳しくは、本発明は、配列番 号１、３、５または７のものに対応するＲＮＡ配列の使用を提供するものである ；これらは、好ましいＲＮＡ配列である。本発明は、また、ＤＮＡ配列について 上記したいずれかの点でこれらの配列と関係があるＲＮＡ配列の使用を提供する ものである。本発明のＲＮＡ配列は、一本鎖または二本鎖であってもよい。本発 明のＲＮＡは、いずれの起源のものであってもよい。例えば、それらは、いずれ の種に源を発してもよいが、ヒトＶＥＧＦ、とりわけ、配列番号２、４、６また は８に示される配列を有するヒトＶＥＧＦをコードするＲＮＡが好ましい。半合 成ＥＮＡと同様に、合成ＤＮＡもまた用いられる。さらにまた、ＤＮＡ転写形態 細菌プラスミドは、イン・ビボまたはイン・ビトロで用いられる。 本発明の実施に適するＲＮＡ配列において、Ｔ残基をＵにより置換することは 、当業者により明白であろう。 本発明で用いるためのＶＥＧＦタンパク質は、上記定義の本発明のＤＮＡまた はＲＮＡ配列によりコードされる。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号２ 、４、６および８のタンパク質であるが、本発明は、また、配列番号２、４、６ または８のものとは異なるがＶＥＧＦ活性を有する非常に密接に関係する配列を 有する他のタンパク質の使用を提供するものでもある。 本発明によると、内膜過形成の治療または予防に関する限りにおいては、ＶＥ ＧＦ活性は、血管、とりわけ、動脈における内膜過形成を完全にまたは部分的に 阻害または予防する能力である。上記の配列において天然ＶＥＧＦとわずかに異 なるタンパク質は、この特性を保持しているが、必ずしもＶＥＧＦと同程度では ない。同様に、かかるタンパク質は、天然ＶＥＧＦよりも強いＶＥＧＦ活性を示 す。これは、ＶＥＧＦのアゴニスト、例えば、ペプチド、ペプトイドまたは他の 小さい分子に適用される。 本発明がＶＥＧＦの他の特性に関する限りにおいては、ＶＥＧＦ活性は、ＶＥ ＧＦ以外の分子のこれらの特性を再現する能力である。例えば、本発明がＮＯ産 生を刺激するためのＮＯ関連症状に対するＶＥＧＦの活性に関する限りにおいて は、ＶＥＧＦ活性は、ＮＯ産生を刺激する能力を含む。本発明がプロスタサイク リン関連症状に対するＶＥＧＦの活性に関する限りにおいては、ＶＥＧＦ活性は 、プロスタサイクリン産生を刺激する能力を含む。本発明の実施に適するＶＥＧ Ｆタンパク質はまた、典型的には、インビトロおよび／またはインビボで動脈Ｅ Ｃの増殖を促進する能力、または、ＶＥＧＦが結合する受容体に結合して、まる でＶＥＧＦのようにそれらを活性化する能力など、当該技術分野ですでに知られ ているＶＥＧＦの生物学的特性の１つ以上を示す。 本発明の実施に適するＶＥＧＦタンパク質は、実質的には、配列番号２、４、 ６または８のＶＥＧＦと相同であり、典型的には、少なくとも７０％、少なくと も８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％相 同である。 本発明の実施に適するＶＥＧＦタンパク質は、１以上のアミノ酸の欠失、挿入 または置換により配列番号２、４、６または８に示される配列とは異なる。ただ し、それらは、ＶＥＧＦ活性を有する。同様に、それらは、配列番号２、４、６ または８に関して１以上のアミノ酸によりトランケートされるか、または、１以 上のアミノ酸により配列番号２、４、６または８に関して伸長される。ただし、 それらは、ＶＥＧＦ活性を有する。置換に関しては、保存的置換が好ましい。典 型的には、保存的置換は、例えば、電荷および／または大きさおよび／または極 性および／または疎水性に関して、置換アミノ酸が天然ＶＥＧＦ中に存在するも のと類似の性質を有するものである置換である。同様に、保存的置換は、典型的 には、該タンパク質のＶＥＧＦ活性に対してほとんど影響を及ぼさない。 配列において天然ＶＥＧＦと異なる本発明で用いるためのＶＥＧＦタンパク質 は、活性において天然ＶＥＧＦと異なるように工学処理される。例えば、それら は、より強いＶＥＧＦ活性を有するように処理される。かかる操作は、典型的に は、当該技術分野で知られている組換え技術を用いて核酸レベルで行われる。 上記ＶＥＧＦタンパク質を用いることに対する別法としては、ＶＥＧＦアゴニ ストを用いることが可能である。これは、本明細書に記載した全ての医薬用途に 、特にアテローム性動脈硬化症の治療に適用される。 一般に、ＶＥＧＦアゴニストは、ＶＥＧＦが結合する受容体に結合する分子で あり、実質的には、本明細書に記載のＶＥＧＦ活性を生じさせるという同一の効 果を及ぼす。詳しくは、アゴニストは、ｆｌｋ−１／ＫＤＲまたはｆｌｔ−１受 容体に結合する。かくして、本発明のアゴニストは、ＶＥＧＦのアゴニストおよ びＶＥＧＦを結合する受容体のアゴニストと称される。 ＶＥＧＦアゴニストは、いずれかの化学構造を有する。例えば、ＶＥＧＦアゴ ニストは、例えば、１０まで、２０まで、５０まで、または、１００までのアミ ノ酸からなるペプチドまたはポリペプチドである。アゴニストは、同様に、修飾 ペプチドまたはペプトイドである。グリコシル化、硫酸化、ＣＯＯＨ−アミド化 およびアセチル化、例えば、Ｎ−末端アセチル化を含む適当な修飾がなされる。 さらに、または、別法としては、修飾アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸が存 在する。 いくつかの好ましいアゴニストは、ＶＥＧＦ活性を有する、所望により上記の とおり修飾されていてもよい、ＶＥＧＦのフラグメントである。ＶＥＧＦのとり わけ好ましいアゴニストフラグメントは、配列番号４のアミノ酸１〜２０（Ｍ.. .Ｈ）からなる；このペプチドは、Ahmed et al.，Lab．Invest．（1997）76:779 により、ヒトトロホブラスト細胞におけるＦｌｔ−１受容体のアゴニストである と報告されている。 別の関連するアゴニストはまた、ＶＥＧＦのＮ末端領域から誘導される。例え ば、配列番号４に関しては、ＶＥＧＦのペプチドアゴニストは、ＶＥＧＦのＮ末 端（アミノ酸番号１）を含んでおり、２５〜３０、０〜４０、０〜５０または５ ０〜１００の範囲のアミノ酸までのＶＥＧＦのアミノ酸配列を有する。同様に、 好ましいアゴニストは、ＶＥＧＦのＮ末端領域から誘導されるが、Ｎ末端のトラ ンケートバージョンを含む。例えば、配列番号４におけるアミノ酸番号１で始ま る代わりに、それらは、配列番号４のアミノ酸番号２、３、４、５、６、７、８ 、９または１０で始まり、２５〜３０、３０〜４０、４０〜５０または５０〜１ ００の範囲のアミノ酸までのＶＥＧＦのアミノ酸配列を有する。 本発明のペプチドアゴニストはまた、ＶＥＧＦ配列の他の部分からも誘導され る。例えば、さらなる好ましいペプチドアゴニストは、配列番号６のＶＥＧＦ− １８９配列のアミノ酸１４５〜１６９（Ｒ...Ｐ）からなるペプチドである。 別の関連するアゴニストもまた、ＶＥＧＦのこの領域から誘導される。例えば 、配列番号６に関しては、ＶＥＧＦのペプチドアゴニストは、１３５〜１５５の 範囲のアミノ酸から１６０〜１８０の範囲のアミノ酸までのＶＥＧＦのアミノ酸 配列を有する。例えば、この領域から誘導されるペプチドアゴニストは、１３５ 〜１４０、１４０〜１４５または１４５〜１５０の範囲のアミノ酸から１６０〜 １６５、１６５〜１７０または１７０〜１７５の範囲のアミノ酸までのＶＥＧＦ のアミノ酸配列を有する。 上記定義のＶＥＧＦのペプチドフラグメントは、好ましくは、１０〜２０、２ ０〜２５、２５〜３０、３０〜４０または４０〜５０アミノ酸の全長を有する。 他の好ましいアゴニストは、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質のフラグメントである 。 ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質は、ＶＥＧＦのアゴニスト作用によく似ており、Ｆｌ ｋ−１／ＫＤＲ受容体を介して作用する内皮細胞における脈管形成を刺激するこ とができる；Albini et al.，Oncogene（1996）12:289-297およびNature Medici ne（1996）2(12):1321-1375を参照。かくして、ＨＩＶ Ｔaｔタンパク質のアミ ノ酸４６−６０のようなＨＩＶ−１ Ｔａｔ配列から誘導されるペプチドは、内 皮細胞の増殖および移動を刺激することが示された；Albini et al.，Oncogene （1996）12:289-297を参照。ＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質のアミノ酸４１〜６ ５からなるペプチドは、本発明の別の好ましいペプチドアゴニストである。 本発明のアゴニストはまた、それらのアゴニスト特性が保持される限りは、Ｖ ＥＧＦタンパク質について上記したいずれかの点で天然ＶＥＧＦのものとは異な るアミノ酸配列を有する。 本発明のアゴニストがペプチドである場合、それらは、本発明に従って治療を 達成するために、それらをコードする核酸配列からイン・ビボで得られる。かく して、アゴニストコード化核酸は、本明細書に記載するとおり、遺伝子治療によ り送られる。 別法としては、非ペプチドＶＥＧＦアゴニストを用いることができる。例えば 、受容体と相互作用するＶＥＧＦの部分の形状がよく似ている小さい分子を用い てもよい。 本発明の実施において、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦをコードする核酸またはＶＥＧＦ アゴニストまたはＶＥＧＦアゴニストをコードする核酸は、適当な形態で、血管 、好ましくは動脈に送られる。核酸は、ベクターと結合していない「裸の」形態 で、または、遺伝子治療ベクターにより、送られる。適当な遺伝子治療ベクター によりそれらを送ることが好ましい。詳しくは、ウイルスベクターまたは非ウイ ルスベクターを用いてもよい。 適当なウイルスベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、シウド 型レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびバキュロウイ ルスが挙げられる。適当な非ウイルスベクターとしては、オリゴヌクレオチド、 プラスミド、リポソーム、陽イオンリポソーム、ｐＨ感受性リポソーム、リポソ ーム−タ ンパク質複合体、イムノリポソーム、リポソーム−タンパク質−ポリリシン誘導 体、水−油型エマルジョン、ポリエチレンイミンおよびデンドリマー（dendrime r）が挙げられる。好ましいベクターとしては、モロニーネズミ白血病ウイルス （ＭＭＬＶ）由来レトロウイルス、シウド型水疱性口内炎ウイルスタンパク質− Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）含有レトロウイルス、アデノウイルス、プラスミドおよびプラ スミド／リポソーム複合体が挙げられる。 適当な場合、２つ以上の型のベクターを一緒に用いることができる。例えば、 プラスミドベクターをリポソームと共に用いてもよい。適当なリポソームとして は、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、３β −[Ｎ−(Ｎ',Ｎ'−ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール(ＤＣ− Ｃｈｏｌ)、または、正に荷電した脂質（Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ) プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ））からなるもの が挙げられる。 本発明のウイルスベクターは、好ましくは、無能力にされており、例えば、複 製不全である。すなわち、それらは、それらの複製に必要な１つ以上の機能的遺 伝子を欠いており、イン・ビボでそれらの非制御増殖を予防し、ウイルス感染の 望ましくない副作用を回避する。好ましくは、ウイルスコートまたはキャプシド にＶＥＧＦ核酸を取込んでいるウイルスゲノムをパッケージすることが必要な最 小ゲノム要素を除いて、ウイルスゲノムの全てを除去する。例えば、ロングター ミナルリピート（ＬＴＲ）およびパッケージングシグナル以外の全てのウイルス ゲノムを欠失させるのが望ましい。アデノウイルスの場合、欠失は、典型的には 、Ｅ１領域で行われ、所望により、Ｅ２、Ｅ３および／またはE4領域のうちの１ つ以上で行われてもよい。 本発明のウイルスは、いずれか適当な技術により無能力にされてよい。例えば 、ゲノム欠失は、複製のために必要とされる遺伝子の完全な除去または一部のみ の除去を含む。完全な除去が好ましい。一般に、好ましい欠失は、ウイルス遺伝 子の初期転写のために必要とされる遺伝子のものである。 複製応答能を有する自己制限または自己破壊ウイルスベクターを使用してもよ い。 一般に、本発明に用いるためのＶＥＧＦ核酸は、好ましくは上記定義のベクタ ー により、それらが動脈に送られた後にイン・ビボでのそれらの発現を確実する発 現構築物内に含まれる。かかる構築物は、典型的には、ＶＥＧＦ核酸の発現を指 向する能力を有するプロモーター（および、所望により、該プロモーターの調節 因子）、翻訳開始コドンおよび該プロモーターに操作可能に連結されたＶＥＧＦ 核酸からなる。好ましくは、これらの成分は、５'−３'方向に並べられる。 該構築物は、また、他の適当な成分を含有してもよい。例えば、該構築物は、 シグナル配列をコードする核酸を含有していてもよく、従って、翻訳される場合 に発現されたＶＥＧＦタンパク質を所定の細胞タイプまたは細胞コンパートメン トに指向させる能力を有するようなＶＥＧＦ核酸に対する位置にある。いずれの かかるシグナル配列も、典型的には、ＶＥＧＦ核酸に対して３'側または５'側に 隣接した位置にあり、従って、シグナル配列およびＶＥＧＦタンパク質は、Ｃ− 末端またはＮ−末端でシグナル配列を用いて、単一融合タンパク質として翻訳さ れる。 該構築物は、プロモーターによりもたらされる発現の程度を増強するエンハン サーを含有していてもよい。選択されたプロモーターによりもたらされる発現を 増強するエンハンサーを用いてもよい。例えば、ＣＭＶ初期遺伝子プロモーター の場合、ＣＭＶ初期遺伝子エンハンサーを用いてもよい。 所望により、該構築物は、ＶＥＧＦ核酸に対して３'側に転写終結因子を含有 していてもよい。いずれの適当な終結因子を用いてもよい。 所望により、該構築物は、ＶＥＧＦ核酸に対して３'側に操作可能に連結され たポリアデニル化シグナルを含有していてもよい。 所望により、該構築物は、培養物において形質転換細胞を選択させるために、 例えば抗生物質耐性を有する、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含有して いてもよい。例えば、細胞は、適切に、抗生物質耐性について選択されてもよい 。 所望により、該構築物は、例えば、ＶＥＧＦ核酸に対して３'側または５'側に 、１つ以上のイントロン、または、他の非コード化配列を含有していてもよい。 適当なプロモーターを用いて、本発明の核酸の発現を制御してもよい。一般に 、ウイルスプロモーターまたは治療される対象体の種において機能するのに適合 したプロモーターを用いるのが好ましい。かくして、ヒト対象体の場合、ウイル スプロ モーター、とりわけ、ヒトに感染するウイルスから誘導されたプロモーター、ま たは、ヒト遺伝子から誘導されたプロモーターを用いるのが好ましい。所望によ り、プロモーターは、いずれか適当なエンハンサーと組み合わせて用いられても よい。 望ましくは、「強い」プロモーター、すなわち、本発明のＶＥＧＦタンパク質 を高レベルで発現させるものが用いられる。ＶＥＧＦタンパク質の過剰発現を達 成するプロモーターが望ましい。好ましいプロモーターとしては、所望によりサ イトメガロウイルス(ＣＭＶ)エンハンサーと組み合わせられていてもよいＣＭＶ プロモーター；ヒトβアクチンプロモーター；シミアンウイルス４０（ＳＶ４０ ）初期遺伝子プロモーター；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；およ びレトロウイルスロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモータ一が挙げられ る。 プロモーターおよび他の構築成分は、ＶＥＧＦ核酸に操作可能に連結される。 かくして、それらは、ＶＥＧＦ核酸の発現に対いてそれらの効果を発揮するよう に配置される。例えば、プロモーターの場合、プロモーターは、ＶＥＧＦ核酸の 発現を指向しうるようにＶＥＧＦ核酸に対して配置される。望ましくは、構築成 分は、発現に対してそれらの最大効果をそれらに発揮させるように配置される。 本発明において用いるための核酸または構築物は、当該技術分野で知られてい る適当な手段によりウイルスゲノムに取り込まれる。次いで、ウイルスゲノムは 、適当な方法によりウイルスコートまたはキャプシドにパッケージされる。詳し くは、適当なパッケージングセルラインを用いて、本発明のウイルスベクターが 得られる。典型的にはそれらのゲノムに取り込まれるこれらのパッケージングラ インは、複製不全ゲノムから欠失された遺伝子を含むので、これらのパッケージ ングラインは、本発明の複製不全ウイルスゲノムを補足する。かくして、パッケ ージングラインの使用により、培養物中で本発明のウイルスベクターが生じる。 適当なパッケージングラインとしては、ＰＡ３１７細胞、Ψ−２細胞、ＣＲＥ細 胞、ＣＲＩＰ細胞、Ｅ−８６−ＧＰ細胞、Ｆｌｙ細胞、ライン２９３細胞および ２９３ＧＰ細胞の誘導体が挙げられる。 非ウイルスベクターの場合、核酸は、当該技術分野で公知の適当な手段によっ て非ウイルスベクターに取り込まれる。 所望により、ベクター、とりわけウイルスベクターは、核酸または構築物を治 療されるべき対象体の細胞のゲノムへ組込むように、または、細胞質中で核酸ま たは構築物を遊離状態にするように選択される。組込みベクターが好ましい。 上記の、好ましくはウイルスまたは非ウイルスベクターと結合した、本発明で 用いるためのＶＥＧＦタンパク質またはＶＥＧＦ核酸は、過形成を治療するため に、適当な方法で動脈に投与される。例えば、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦをコード する核酸は、例えば、内腔を介して、血管の外壁、例えば、動脈の外壁に、また は、血管内皮、例えば、動脈内皮に投与される。浸出した化合物は、血流により 迅速に押し流され、血中半減期が短いので、局所遺伝子導入は、組換えＶＥＧＦ タンパク質の投与よりも優れていると思われる。 送られるとすぐに、本発明のＶＥＧＦ核酸は、発現されて、ＶＥＧＦタンパク 質を産生し、次いで、内膜過形成が治療または予防される。発現は、血管壁、例 えば、動脈壁においていずれの細胞型でも生じる。 好ましくは、発現は、発現されたＶＥＧＦが血管、例えば、動脈の内皮に到達 できるような位置で生じる。例えば、発現は、平滑筋細胞中および／または内皮 中で生じる。最も好ましくは、発現は、少なくとも、血管、例えば、動脈の内皮 中で生じる。 例えば、ＶＥＧＦタンパク質または核酸は、治療または予防されるべき過形成 部位の周囲への直接注入によるか、または、血管、例えば、動脈の内腔中への注 入により、血管、例えば、動脈の外側に送られる。 さらに好ましくは、ＶＥＧＦタンパク質または核酸は、治療されるべき過形成 部位に接近して、血管、例えば、動脈に外部から設置された移植片により送られ る。かかる移植片は、ＶＥＧＦタンパク質もしくは核酸またはベクターを含有し ており、薬剤のリザーバーを設けている。ＶＥＧＦタンパク質または核酸（好ま しくは、ベクターを結合している）は、移植片が治療されるべき対象体に導入さ れる前または後に該移植片に導入される。例えば、該移植片は、血管付近に設置 され、次いで、ＶＥＧＦタンパク質または核酸が、例えば、注射により、移植片 に導入される。 好ましくは、該移植片は、血管、例えば、動脈と直接接触して設置される。こ れ は、血管の物理的歪みが平滑筋細胞増殖を誘発し、レトロウイルスベクターによ る遺伝子導入の効力を増大させるので、レトロウイルスベクターを用いてＶＥＧ Ｆ核酸を送る場合にとりわけ好ましい。過形成自体により誘発される増殖のよう なこの増殖は、ＶＥＧＦタンパク質または核酸のデリバリーにより解消されるか 、または、少なくとも改善される。同様に、標的細胞が分割している場合に遺伝 子導入の効力の増大を示す他のベクターを用いる場合には、移植片が動脈と接触 しているのが好ましい。例えば、細胞増殖は、また、プラスミド／リポソーム複 合体を用いて遺伝子導入効力を増強する。 かかる移植片は、適当な形態である。好ましくは、該移植片は、治療または予 防されるべき過形成部位またはその近くで、動脈を、部分的または完全に、好ま しくは完全に取り巻くカラーの形態である。 血管外遺伝子デリバリーは、内皮を損傷または露出させるバルーンカテーテル 法または高圧液体法などの方法を回避する。トランスフェクトされた遺伝子は、 好ましくは、シラスティックまたは生分解性移植片、好ましくは、血管の外側に 、好ましくは血管の外周に設置されたカラーを介して適用される。内皮は、ほと んど損傷を受けない。これは、デリバリーのこの形態の主な利点である。 本発明によると、ベクターがカラーの血管外膜表面上で直接適用される場合、 外膜との密接な接触が維持される。ウサギ動脈において、カラーのみが、典型的 には、術後７−１４日以内に新内膜を形成させる。該カラーは、また、外膜表面 でベクターを高濃度に維持する。 移植片、好ましくは、カラーは、いずれか適当な物質から作製される。シラス ティック移植片、すなわち、シリシリコーンゴムからなる移植片は、選択的に好 ましいものである。最も好ましくは、生分解性移植片である。適当な生分解性物 質が用いられる。 移植片、例えば、カラー内では、ＶＥＧＦタンパク質または核酸は、いずれの 方法でも含有される。好ましくは、移植片、例えばカラーの構造は、ＶＥＧＦタ ンパク質または核酸が血管壁と直接接触して保持されるようなものである。かく して、１つの具体例では、移植片の構造は、血管壁と移植片の壁との間にスペー スを残し ておく。このスペース中にＶＥＧＦ核酸またはタンパク質を導入することができ 、したがって、それらは、血管壁と接触することによる。好ましくは、移植片の 末端は、血管壁と接触しており、かくして、ＶＥＧＦ核酸またはタンパク質の漏 出を予防する。好ましくは、カラーの外壁は、ＶＥＧＦ核酸またはタンパク質に 対して不透過性、または、実質的に不透過性であり、かくして、周辺組織中への その漏出を予防するか、または、少なくとも制限し、血管へのそのデリバリーを 確実にする。 所望により、ＶＥＧＦ核酸またはタンパク質を含有するスペースは、一層以上 の、ＶＥＧＦまたは核酸に対して透過性または半透過性の物質により血管壁から 分離されていてもよい。これは、緩やかなデリバリーが意図され、ＶＥＧＦタン パク質または核酸が血管壁に送られる速度の制限が望まれる場合に望ましい。 所望により、移植片、例えば、カラーは、浸透圧ポンプとして作用するように 設計されてもよい。 所望により、ＶＥＧＦは、カラー内の媒体、例えば、固体またはゲル媒体内に 含有されていてもよい。これは、ＶＥＧＦタンパク質または核酸が組織へ漏出す ることを防止するのに役立つ。この場合、カラーの外壁は、移植片の末端で血管 と接触している必要はない。 別法としては、ＶＥＧＦ核酸またはタンパク質は、使用時に血管と接触してい る移植片の表面に塗布されてもよい。別法としては、ＶＥＧＦ核酸またはタンパ ク質は、移植片の構造全体に分散させられていてもよい。 このような移植片、とりわけ、カラーの使用のいくつかの利点は、（ｉ）それ らが、持続性デリバリーを可能にするデリバリーリザーバーを与えること；（ii ）内腔内操作が必要ではなく、動脈内皮が無傷のままであること；および（iii ）上記で説明したとおり、移植片により生じる歪み（例えば、カラーの場合には 収縮）が遺伝子デリバリーの効力を増強することである。 本発明の装置は、概して、少なくとも、使用時に第１血液運搬管（blood-carr yingvessel）の縦方向に沿って伸長し、該管を少なくとも部分的に取り巻くよう な形状の実質的に不透過性の第１本体部を含む本体（ここで、第１本体部は、使 用時に第１血液運搬管の外膜表面に対してシールするのに適合した縦方向に空間 を設けた シール部を含む）、および、少なくとも１つの薬剤を収容し、第１血液運搬管の 外膜表面へ送るのに適合したシール部間の中間部からなる。 本発明の装置の好ましい具体例を、添付図面を引用して、単に例示する： 図１は、血管の周囲の所定個所にある本発明の装置の略縦断面図であり； 図２は、図１に示されるＡ−Ａ線に沿った、同具体例の略冠状断面図であり； 図３は、端−端吻合の周囲にある装置の第２の具体例の略斜視図を示し； 図４は、図３の具体例の鉛直面での縦断面図であり； 図５は、シール部について別の構造を有する具体例の変形例を示す以外は、図 ４のものと同様の図であり； 図６は、端−側吻合の周囲にある装置の第３の具体例の略斜視図を示し； 図７は、図６の具体例の鉛直面での縦断面図であり； 図８は、側−側吻合の周囲にある装置の第４の具体例の略斜視図を示し； 図９は、図８の具体例の鉛直面での縦断面図であり； 図１０は、一部包埋血管を示す側−側吻合の周囲にある装置の第５の具体例の 略斜視図を示し； 図１１は、図１０の具体例の鉛直面での縦断面図である。 バックグランドによると、一般に、動脈バイパス移植片を用いて、天然血管が 、通常、アテロームにより、閉塞されるか、または、有意に狭窄された場合に組 織への血流を修復または改良する。自家静脈もしくは動脈、または、ダクロン（ Dacron）もしくはＰＴＦＥなどの合成物質のいずれを用いる場合でも、一般に、 ３つの方法（「端−端」（図４）；「端−側」（図７）；または「側−側」（図９ ））のうちの１つの方法で移植片を天然血管に吻合する。これらの技術のうち、 端−側および側−側が端−端よりも非常に一般的である。血流の方向は、矢印で 示される。 図１および２は、血管壁２内の血液１、および、例えば生分解性物質の、壁４ により定義された空間３を含む外膜カラーを示す。カラー５は、カラーの両端で 血管壁に接している。この具体例は、他の具体例について以下に記載すると同様 の方法で用いられる。 図３および４に示される具体例は、端−端吻合への適用を示す。該装置は、移 植 片１３の天然血管１４への端−端吻合により作製される血液運搬管の縦方向に沿 って伸長し、該管を取り巻く略管状本体１２からなる。 図４から最も明らかであるように、装置の本体１２は、その両端に設けられた 、縦方向に空間を設けるシール部１５を有する。使用時に装置を端−端吻合部位 １６上に位置させる場合、これらのシール部１５は、移植片１３および天然血管 １４の外膜表面に対してシールする。本体１２の物質の半径厚さは、中間部１７ におけるよりもシール部１５での方が厚い。その結果、シール部１５が移植片１ ３および血管１４の外膜表面に対してシールした場合、装置の本体１２の内部と 移植片１３および血管１４の囲まれた端部の外膜表面との間に空間が形成される 。この空間は、密封リザーバー１８を構成し、吻合１６と一緒に縦方向に並べら れていることが示される。 このリザーバーにより、１つ以上の薬剤を含有する医薬製剤が、吻合部位１６ で移植片および血管１３、１４の外膜表面と接触して配置される。該製剤が流体 またはゲルの形態である場合、それは、例えば、皮下注射針および注射器を用い て本体１２の壁を介して密封リザーバー１８へ注入され得る。該製剤に含有され る薬剤は、有利には、抗増殖効果を及ぼして、吻合部位１６およびそれに隣接す る領域での平滑筋細胞内膜過形成を抑制する。 該医薬製剤は、流体またはゲル形態である必要はなく、例えば、練り歯磨きと 同様のコンシステンシーを有するラニーペースト（runny paste）であってもよ い。したがって、それは、それが暴露される拍動している（pulsing）外膜表面 と接触したままであり、血管を収縮させる。 吻合部位１６上に該装置を配置するために、円筒状本体１２を移植片１３およ び血管１４のいずれか一方の上で、それらを吻合する前に、軸方向にスライドさ せる。次いで、外科医は、吻合部位１６で移植片１３および血管１４を一緒に接 合することができ、次いで、本体１２を図１４に示した位置を占めるように吻合 部位１６上でスライドさせて、各外膜表面へのシール部１５のシールを可能にす る。 別法としては、装置の本体１２は、図示されるように、その全長に沿って縦ス リット１９を設けていてもよい。この場合、外科医は、患者の体へ装置１２を導 入せず に、移植片１３および血管１４を吻合することができる。吻合が成功裏に完了し た後、外科医は、適当な大きさの本体１２を選択し、スリット１９に沿って可撓 性本体１２を開き、吻合した移植片および血管１３、１４上でそれをスリップさ せ、次いで、例えば、ティスシール（Tisseal）の名称の下に販売されているド ロンビン接着剤またはシアノメタクリレートをベースとする接着剤などの慣用的 な「組織接着剤」を用いて、スリット１９で本体の縦方向の両端を一緒にシール することにより、吻合した移植片および血管の周囲にそれを適用することができ る。 リザーバー１８内に収容された医薬製剤の効果を集中させるため、および、周 辺組織へのその薬剤の漏出を回避するために、本体１２は、実質的に、該製剤に 対して不透過性である。該物質は、また、有利には、製剤中の有効薬剤が消耗さ れてしまうと思われる設定時間の間、例えば１〜５日間、生分解性である。該物 質は、また、周辺組織からの反応をあまり激しく促進しないように選択される。 本体に適する物質の例としては、ゼラチン、アルギナートまたはコラーゲンが挙 げられる。これらの物質は、また、本体を可撓性にし、成形または押出による該 装置の製造を可能にする。 本体１２の壁材は、また、皮下注射針により穴をあけることが必要な場合に密 封リザーバー１８の保全性を保つように、セルフシール性であるのが有利である 。別法としては、または、さらに、該針の除去後に現れる壁における漏出口は、 「組織接着剤」などでシールしてもよい。 別の大きさの本体１２の範囲は、異なる大きさの血管の上に設置されるように 設定される。下肢血管は、一般に、外径約６−８mmである。冠状血管は、外径約 ３−５mmである。したがって、直径約３−１０mmの本体サイズの範囲は、外科医 にとって無菌パケット中で利用可能である。さらに、本体の大きさを変更して、 リザーバー１８の容量に影響を及ぼしてもよい。リザーバー１８の適当な大きさ は、１０mlまで、好ましくは、２−５mlである。 拍動性の血流により生じた血液運搬管１３、１４の膨張に順応させるために、 少なくとも本体のシール部１５は、有利には、血管壁の膨張に順応させるために 伸ばすことが可能である。該装置による血管壁の収縮を回避し、同時にシールを 無傷に 維持することが非常に望ましい。 図５は、別のシール部を示す。本体１２の物質の半径厚さは、本体の長さに沿 って一定であり、中間部１７は、シール部１５での本体１２の内径に対して実質 的に膨らんでいる。シール部１５は共に、例えば、各々、約８−１５mmの軸方向 の長さ「Ｘ」上で移植片１３および血管１４の各外膜表面と接触するように、縦 方向に伸びる尾部を持って形成される。シール部１５についてのこれらの長い尾 部は、「フラップ弁」のように作用してリザーバー１８のシールを促進するよう に作製できるが、「フラップ弁」を通る流れが望まれないことは明らかである。 別法としては、該尾部を内部へ折り畳んで（図示されない）、その末端で本体の 厚さを２倍にし、図４で示されるものと類似の形態で中間部における半径厚さよ りも厚い半径厚さのシール部を形成してもよい。 液密シールを形成するかまたは形成を促進するために、外科医は、例えば、「 組織接着剤」のような上記タイプの接着剤を用いて、外膜表面にシール部１５を 接着してもよい。しかしながら、これは、必須ではない。例えば、シール部１５ での本体１２の大きさが血管１３、１４の胴回りに適合するように選択される場 合、接着剤を用いる必要はない。代わりに、外科医は、シール部１５での本体１ ２の内径と外膜表面の直径との間の半径方向の障害物に頼ってもよい。これは、 詳しくは、図５の長く尾を付けたシール部の具体例についてと同様である。しか しながら、該シール部は、血管を収縮させるほど血管上で締め付けるべきではな い。 図６および７は、端−側吻合と共に用いられる装置の具体例を示す。これらの 図は、第１本体部２１および９０°未満の角度でそれから分枝して略Ｙ字形本体 を形成する第２本体部２２を有する本体２０を示す。第１および第２本体部２１ 、２２は、９０°までおよび９０°を含む他の分枝角度でお互いに分枝してもよ く、後者の場合、本体は、略Ｔ字形である。外科医は、有利には、一連の異なる 大きさおよび異なる形状の本体が利用可能であり、これから吻合した血管の配置 および大きさに対して最も適当な装置を選択してもよい。例えば、第１本体部２ ２は、長さ約１−１０cmであり；第２本体部２２は、長さ１−５cmであってもよ い。 第１本体部２１は、略管状であり、天然血管２３を取り囲むように示される。 第 ２本体部２２もまた、略管状であり、吻合部位２９で端−側形態で天然血管２３ に吻合された移植片２４を取り囲むように示される。図７からわかるように、第 １本体部２１の両端は、シール部２５を設けており、第２本体部２２の終端は、 シール部２６を設けている。上記具体例におけると同様に、これらのシール部２ ５、２６は、有利には、「組織接着剤」を用いて、各々、血管２３および移植片 ２４の外膜表面にシールされる。 図７は、第１本体部２１の内部と血管２３の外膜表面との間に形成された密封 リザーバー２７を示す。該リザーバー２７は、第２本体部２２の内部にまで及ん でいる。かくして、この密封リザーバー２７は、吻合部位２９といっしょに並べ られる。リザーバー２７には、有利には、皮下注射針および注射器を用いて、有 効薬剤を含有する液状医薬製剤が注入される。 装置の血管２３および移植片２４への設置を容易にするために、装置の本体２ ０は、図７に示した断面図の平面で分離しており、該平面について対照的である ２つの対照的な二分した部分を含有する無菌パッケージにおいて外科医に提供さ れる。このような場合、外科医は、移植片２４を血管２３に吻合した後、２つの 、同一本体二分割部分を組み立てて、例えば上記のような接着剤を用いて、同一 の二分した部分の対向する縁部を一緒にシールすることが必要である。 別法としては、第１本体部２１のみが、図６に示すように、縦スリット２８を 設けていてもよい。この場合、外科医は、移植片２４の端部上で第２本体部２２ をスライドさせる。次いで、外科医は、移植片２４の自由端を血管２３に吻合し 、次いで、第２本体部２２を移植片２４の下方にスライドさせ、吻合部位２９を 覆い、スリット２８を用いて第１本体部２１の中心に血管２３を供給し、これに より取り囲むことができる。次いで、外科医は、スリット２８で第１本体部２１ の対向する縦方向の縁部同士をシールして、そこに密封リザーバー２７を形成す る。 本体部２１および２２について他の形状を用いてもよいのは明らかである。例 えば、第１および第２本体部２１および２２は、お互いに別々に提供され、患者 においてin situの場合のみ密封リザーバー２７を形成するようにお互いに固定 される。 図８および９は、側−側吻合の状況下で用いるのに適する装置の具体例を示す 。 装置の本体３０は、第２および第３本体部３２、３３が枝分かれしている第１本 体部３１からなることを示す。この分枝は、図８に示すとおり、略Ｘ字形本体を 形成する。 ３つの本体部３１、３２、３３は全て、形状が略管状である。該装置は、対か の第３本体部３３を除くと、概して、図６および７に示したものと同様である。 第１本体部３１は、閉塞した天然血管３４を取り囲み、その外膜表面にシール 部３５によりシールされる。第２および第３本体部３２、３３は、移植片３６を 取り囲み、各シール部３７、３８で移植片の外膜表面にシールされる。図９にお いて最も明確に示されるとおり、シール部３５、３７、３８の効果は、本体３０ の内部と囲まれた血管の外膜表面との間に密封リザーバー３９を形成することで あり、該リザーバー３９は、上記方法で医薬製剤を少なくとも部分充填すること ができる。 図８および９に示す装置の設置を容易にするために、該装置は、有利には、少 なくとも２つの部品で外科医に提供される。例えば、第１本体部３１は、第２お よび第３本体部３２、３３からなる第２要素とは分けて提供される。該本体部に 縦スリット（図示されない）を設けることにより、該本体部は、血管３４および 移植片３６を取り囲むように設置され、次いで、これらの縦スリットに沿ってシ ールされ、接触線に沿ってお互いにシールされて、吻合部位４０の周囲に密封リ ザーバー３９が設けられる。 図１０および１１は、図８および９に示した装置の変形例を示す（共通部分に ついては同一の照合数字を用いる）。本発明の装置についてとりわけ適している 使用は、冠状動脈バイパス移植手術においてである。かかる状況下で、第１血管 ３４は、図示されるとおり、心臓壁５０に部分包埋されている冠状動脈である。 図８および９に示される形態の装置は、第１本体部が部分包埋冠状動脈３４の周 囲全体に広がることができないので、部分包埋冠状動脈３４に設置できなかった 。したがって、図１０および１１の具体例では、本体３１の第１本体部５１は、 その縦方向に対する横断面で見ると完全な円を描かない；代わりに、略弓形であ る。図示した具体例では、約１８０°の弧を描く。これは、第１本体部５１を部 分包埋冠状動脈３４の露出部分のみに設置させて、それを部分的にのみ取り巻く ことができる。この装置 では、第１本体部５１の縦方向に伸びている縁部４１は、例えば、組織接着剤を 用いて、冠状動脈３４の外膜壁または図示されるように心臓壁５０の表面のいず れかに外科医によりシールされる。 図１０および１１の装置は、また、第１血液運搬管が動脈により供給される臓 器の壁において部分包埋されている動脈である他の手術にも適用可能である。か かる臓器としては、脳、膀胱および子宮が挙げられる。 図示された具体例は、吻合部位およびそれに続く部位の血液運搬管に薬剤を送 るための装置の使用に集中していたが、本発明は、かかる使用に限定されない。 該装置は、例えば、さらに一般的には、非吻合血液運搬管の外膜に薬剤を送るた めに用いられてもよい。例えば、バルーン血管形成術後、図３〜５に示される形 態の装置をバルーン血管形成部位の領域で動脈の外周に設置して、該動脈の外膜 表面を介してそれに１種類以上の薬剤を送ってもよい。 上記具体例では、密封リザーバーは、血液運搬管の外膜表面と少なくとも第１ 本体部の内部との間で半径空間または隙間の形態を取ることが示されており、該 空間には、医薬製剤が少なくとも部分充填されている。しかしながら、かかる空 間は、必須ではない。例えば、別の具体例では、本体は、略不透過性可撓性外層 、および、該製剤で含浸され、使用時に外膜表面と接触するように配置される可 撓性内層を有してもよい。 外層は、例えば、固体コラーゲンから作られ、内層は、それに架橋結合された 海綿状コラーゲンから作られ、該海綿状層は、送られるべき薬剤を含有する医薬 組成物で含浸され得る。かかる条件下で、該装置は、既に含浸されている製剤と 一緒に設置するために外科医に提供されるか、例えば、上記のとおり注入される ことにより、設置後に該製剤で湿潤させられる。 別法としては、薬剤を本体の内部表面に塗布していてもよく、使用時に該表面 を血管と接触させる。別法としては、薬剤を本体の構造全体に分散させていても よい。 装置の本体は、捩り応力に耐えるのに充分な強度を有するのが望ましい。この 目的のために、本体は、例えば、コラーゲンフィルムなどの内層、または、縦、 横もしくは螺旋状のリブを設けて形成されてもよい。リブは、リザーバーをコン パート メントに細分割し、さらなる安定性を与えるために設けられる。 当該タンパク質または核酸は、臨床環境により生じる内膜過形成の治療または 予防のために用いられる。例えば、血管形成術、例えば、バルーン血管形成術； バイパス術、例えば、静脈を動脈に吻合する冠状バイパス術；他の吻合術、例え ば、足における吻合術；および動脈内膜切除術、例えば、頚動脈内膜切除術を含 むいずれのタイプの手術の後に生じる過形成も治療することが可能である。動脈 損傷または高血圧症、例えば、肺動脈高血圧症に伴う内膜過形成を治療すること も可能である。本発明は、いずれかのタイプの血管における、例えば、動脈また は静脈、好ましくは動脈における、内膜過形成の治療を提供するものである。 本発明によると、確立された内膜過形成を治療もしくは改善するか、または、 内膜過形成が発生しないように予防することが可能である。同様に、内膜過形成 が発生する可能性を減少させること、または、確立された内膜過形成もしくは発 生すると思われる過形成の重篤度を低下させることが可能である。本発明による 治療は、例えば、術後に生じる過形成の機会を減少させるために、手術の前、間 または後に行われる。 好ましくは、ＶＥＧＦ核酸またはタンパク質は、新しい狭窄を予防または治療 するために投与される。しかしながら、それは、再狭窄を治療または予防するた めにも用いることができる。 本発明のタンパク質または核酸は、好ましくは、医薬上許容される担体を含有 してなる医薬製剤の形態で送られる。いずれの適当な医薬製剤も用いられる。 例えば、適当な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質、 および、予定されたレシピエントの血液と一緒に製剤を等張性にする溶質を含有 する水性または非水性無菌注射溶液；ならびに、沈殿防止剤および増粘剤を含む 水性および非水性無菌懸濁剤が挙げられる。該製剤は、単位投与または多投与容 器、例えば、密封されたアンプルまたはバイアル中で提供され、使用直前に無菌 液体担体、例えば、注射用蒸留水の添加のみを必要とする冷凍または凍結乾燥条 件下で保存される。 上記で詳述した成分に加えて、本発明の製剤は、当該製剤のタイプに関する当 該 技術分野で慣用的な他の薬剤を含んでもよい。可能な製剤のうち、無菌無パイロ ジェン水性および非水性溶液が好ましい。 当該タンパク質、核酸およびベクターは、適当な用量で、適当な投与方針を用 いて送られる。多くの因子によって投与量および投与方針を治療されるべき個々 の症状の最適な治療を確実にするように適合させることは、当業者に明らかであ る。かかる因子のいくつかは、治療されるべき対象体の年齢、性および臨床状態 である。 ＶＥＧＦをコードする裸の核酸またはかかる核酸からなる構築物のデリバリー について、典型的な用量は、用量当たり０.１−５０００μg、例えば、５０−２ ０００μg、例えば、５０−１００μg、１００−５００μgまたは５００−２０ ００μgなどである。ＶＥＧＦタンパク質のデリバリーについては、適当な用量 としては、１〜１０００μg、例えば、１〜１０μg、１０〜１００μg、１００ 〜５００μgの用量が挙げられる。 ウイルスまたは非ウイルスベクターによるＶＥＧＦ核酸のデリバリーのために 用いられる用量は、ベクターがＶＥＧＦ核酸を細胞に送る効力、およびＶＥＧＦ 核酸が細胞中で発現される効力を含む多くの因子に左右される。 例えば、ウイルスベクターは、１０⁴〜１０¹⁴cfuまたはpfu／ml、例えば、１ ０⁴〜１０⁶、１０⁶〜１０⁸、１０⁸〜１０¹⁰、１０¹⁰〜１０¹²または１０¹²〜１ ０¹⁴cfuまたはpfu／mlの用量で送られる。１０⁵〜１０⁹cfuまたはcfu／mlの範囲 の用量が好ましい。pfu（プラーク形成単位）なる用語は、アデノウイルスを含 むある種のウイルスに適用され、ウイルス溶液の感染力に相当し、適当な細胞培 養物の感染および一般に４８時間後の感染細胞のプラークの数の測定により決定 される。cfu（コロニー形成単位）なる用語は、レトロウイルスを含むその他の ウイルスに適用され、一般に選択可能なマーカーと一緒に１４日間インキュベー トした後に当該技術分野で知られている手段により決定される。ウイルス溶液の cfuまたはpfu値を決定するための技術は、当該技術分野でよく知られている。 レトロウイルスについては、１０⁵〜１０⁶cfu／mlの範囲の用量が特に好まし い。シウド型レトロウイルスについては、１０⁷pfu／mlの範囲の用量が特に好ま しい。アデノウイルスについては、１０⁹pfu／mlの範囲の用量が特に好ましい。 同様に、かかる用量が緩やかなデリバリーのための本発明の移植片内に含まれ てもよい。 非ウイルスベクターと結合したＶＥＧＦ核酸もまた、上記したいずれの投与手 段によっても、または、移植片から緩やかに、いずれかの適当な用量で送られて もよい。適当な用量は、典型的には、核酸０.１〜１０００μg、例えば、１〜１ ００μg、１００〜５００μgまたは５００〜１０００μg、１０００〜２０００ μg、２０００〜３０００μgまたは３０００〜５０００μgである。好ましい用 量は、５〜５０μg、例えば、１０〜２０μgの範囲である。 投与方針は、例えば、投与経路、レシピエントの種およびレシピエントの健康 状態によっても変化するであろう。しかしながら、単回投与、および、数日間、 数週間または数ヶ月間に及ぶ多回投与が考えられる。また、上記で説明したとお り、ＶＥＧＦタンパク質および核酸のデリバリーは、血管、好ましくは動脈の周 囲に設置するのに適する移植片により行われる；好ましくは、移植片は、カラー の形態である。かかる移植片は、緩やかなデリバリーを行う。例えば、デリバリ ーは、数時間、数日間、数週間または数ヶ月間生じる。 本発明のタンパク質および核酸は、例えば、局所投与、皮膚投与、非経口投与 、筋肉内投与、皮下投与または経皮投与などのいずれの投与形態によっても、ま たは、血流中への直接注射または動脈壁中もしくはその周囲への直接注射による か、または粘膜組織への直接塗布によって投与されてもよい。好ましくは、投与 は、上記したとおり、移植による。 本発明のタンパク質、核酸およびベクターは、いずれの哺乳動物においても内 膜過形成を治療するために用いられる。ヒト患者の治療が好ましい。 本発明は、内膜過形成治療用または予防用キットを提供するものでもある。こ れらのキットは、（ｉ）薬剤として、上記で定義したとおり、好ましくは、ベク ターと結合した、ＶＥＧＦタンパク質または核酸；および（ii）ＶＥＧＦタンパ ク質または核酸が導入されるカラーの形態の本発明の移植片を有してなる。好ま しくは、ＶＥＧＦ核酸またはタンパク質は、上記で定義した医薬上許容される担 体を含有してなる医薬製剤の形態で提供される。成分（ｉ）および（ii）は、い ずれの適当な 方法でもパッケージされる。例えば標準試薬および／または溶液および／または 装備品などの当該技術分野で知られている他の成分もまた含有されてもよい。 本発明は、また、内膜過形成の治療または予防方法であって、本発明のＶＥＧ Ｆタンパク質、核酸またはアゴニストの有効な非毒性量を該処置を必要とする患 者に投与することからなる方法を提供するものでもある。 本発明の移植片、とりわけ、上記で定義したようなカラーの形態の移植片は、 ＶＥＧＦ以外の薬剤の、血管、例えば、動脈へのデリバリーのために用いること ができる。いずれの適当な薬剤もこの方法で送られて、いずれの所望の治療目的 をも達成する。 プラスミド／リポソーム複合体、ＭＭＬＶレトロウイルス、ＶＳＶ−Ｇレトロ ウイルスおよびアデノウイルスがカラーを付けた動脈中で発現させることが観察 された。遺伝子導入効率は、アデノウイルスおよびシウド型ＶＳＶ−Ｇレトロウ イルスについて最高であり、比較的高いトランスフェクション効率も生じた。複 製不全ＶＳＶ−Ｇレトロウイルスの利用性は、従来、示されていなかった。アデ ノウイルストランスフェクトされた動脈のいくつかの内皮細胞において発現が見 られた。外膜から内膜への浸透が生じたので、これらの結果は、ＶＥＧＦ以外の 遺伝子を用いる内腔外遺伝子導入によりヒト疾患において内皮機能が変化する一 般的な可能性を高める。これは、また、他の場合には動脈壁において作用する拡 散可能なまたは分泌された遺伝子産生物の外膜および外中膜における発現のため に有用でもある。好ましくは、かかるデリバリーは、上記で定義したとおり、内 膜過形成の治療をもたらすが、それは、さらなるまたは別の治療目的ももたらす 。 このようなデリバリーのための好ましい治療薬としては、動脈壁において一酸 化窒素（ＮＯ）産生を刺激するＶＥＧＦ以外のタンパク質が挙げられる。内膜過 形成の治療または予防をもたらすＮＯシンターゼ、特に、誘発性ＮＯシンターゼ （ｉＮＯＳ）のデリバリーが特に好ましい。 他の好ましい治療薬としては、内皮ＶＥＧＦ受容体を活性化するアゴニストが 挙げられる（上記参照）。これらのアゴニストは、典型的には、小さい合成分子 である。ＶＥＧＦタンパク質のペプチドフラグメントを含むペプチドを用いても よい。 この場合、治療は、ＶＥＧＦについて上記したとおり、ペプチド自体またはそれ をコードする核酸のデリバリーにより行われる。これらは、好ましくは、同経路 により、すなわち、本明細書で定義した移植片を介して送られるが、それらは、 全身的に送られる。 好ましくは、治療薬は、医薬上有効なポリペプチドまたはタンパク質をコード する核酸の形態である。さらに好ましくは、この核酸は、上記で定義したとおり 、構築物内に含まれる。さらに好ましくは、核酸または構築物は、上記定義のベ クター、例えば、上記定義のウイルスまたは非ウイルスベクターにより動脈に送 られる。 かくして、動脈外遺伝子導入は、血管、好ましくは動脈壁への遺伝子物質のデ リバリーのために用いることができる。実施例により、内側ＳＭＣの変化および 内皮変化が外膜側から達成できることを見ることができ、血管、例えば、動脈の 疾患の新しい治療方法を開発させる。 したがって、本発明は、血管内膜過形成治療薬または予防薬の製造における、 ＮＯＳ（所望により、ｉＮＯＳ）またはＮＯＳ（好ましくは、ｉＮＯＳ）をコー ドする核酸の使用を提供するものである；ここで、ＮＯＳタンパク質または核酸 は、ＶＥＧＦについて上記で定義した、移植片、好ましくはカラー中で提供され る。 本発明は、また、（ｉ）ＮＯＳ（所望によりｉＮＯＳ）タンパク質または核酸 ；および（ii）本発明の移植片を含有してなるキットを提供するものでもある。 これらのキットは、ＶＥＧＦについて上記したとおりである。これらは、血管内 膜過形成の治療または予防に適している。 本発明は、また、治療または予防されるべき過形成付近でＮＯＳタンパク質ま たは核酸を含有してなる本発明の移植片を移植し、これにより、ＮＯＳタンパク 質または核酸のデリバリーを行うことからなる血管内膜過形成の治療方法を提供 するものでもある。 ＮＯＳ核酸は、好ましくは、ＶＥＧＦについて上記したとおり、ベクターと結 合している。治療は、ＶＥＧＦについて上記したと同様に行われ、用量および医 薬製剤もまた、ＶＥＧＦについて上記したと同様である。 本発明は、また、ＮＯＳ（所望により、ｉＮＯＳ）、タンパク質または核酸か ら なる本発明の移植片を提供するものでもある。 ＶＥＧＦが動脈壁中でＮＯおよびプロスタサイクリン産生を刺激するという知 見は、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体のアゴニストが他のＮＯ関連および／また はプロスタサイクリン関連症状の治療において有用であろうということを示唆し ている。 とりわけ、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦが結合する受容体のアゴニストは、高血圧 症（hypertensionまたはhigh blood pressure）を治療するために用いられる。F orte et al.，Lancet（1997）349:837-42は、低いＮＯレベルが本態性（すなわ ち、全身性）高血圧症に罹患している個体の特徴であることを見出した。ＮＯは 、血管壁を弛緩することが知られている；Forte et al.は、悪化したＮＯ産生が この弛緩を低下させ、血管を収縮させ、血圧を上昇させることを示唆している。 さらに、本態性高血圧症に罹患している個体では、プロスタサイクリンのレベリ ルが抑制される。 ＶＥＧＦがＮＯおよびプロスタサイクリン産生を刺激するので、それは、高血 圧と戦うのに有用である。 第１は、本態性高血圧症、すなわち、任意の位置または体の至る所での全身性 抗血圧である。全身性症状である本態性高血圧症の治療については、それは、本 発明のＶＥＧＦタンパク質またはアゴニストが、遺伝子治療により、全身性方法 で、例えば、ＶＥＧＦタンパク質またはアゴニストをコードするＶＥＧＦ核酸の 全身性デリバリーにより送られる 第２は、肺性心、すなわち、肺動脈の高血圧による右心不全である。これは、 本明細書に記載したＶＥＧＦ核酸、タンパク質およびアゴニストを投与すること により、とりわけ、ＤＮＡの発現を伴って動脈カラー（上記を参照）を介してＶ ＥＧＦＤＮＡを動脈に送り、動脈壁でタンパク質を得ることにより、治療可能で ある。 第３は、原発性肺高血圧症、すなわち、肺での高血圧である。これは、通常、 最後には心不全および死に至らしめ、現在、連続プロスタサイクリン輸液または 肺移植によって治療可能なだけである。本明細書では、好ましい治療技術は、Ｖ ＥＧＦまたはそのアゴニストをコードする核酸を用いて核酸肺組織を形質転換ま たはトランスフェクトし、これにより、イン・ビボでＶＥＧＦを発生させ、ＮＯ および／またはプロスタサイクリン産生を刺激することである。 したがって、本発明は、イン・ビボでの一酸化窒素（ＮＯ）またはプロスタサ イクリン産生刺激薬の製造における、管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦを コードする核酸、ＶＥＧＦのアゴニスト、およびＶＥＧＦを結合する受容体のア ゴニストをコードする核酸分子から選択される薬剤の使用を提供するものである 。 ＶＥＧＦタンパク質または核酸またはＶＥＧＦを結合する受容体のアゴニスト 、またはかかるアゴニストをコードする核酸からなる本発明のキットもまた、高 血圧症の治療に適している。 本発明はまた、本発明のＶＥＧＦタンパク質、核酸またはアゴニストの有効な 非毒性量を患者に投与することからなる高血圧症の治療または予防方法を提供す るものでもある。かかる治療は、本明細書に記載したとおり行われる。原発性肺 高血圧症については、好ましい方法は、本明細書に記載したとおり、ＶＥＧＦを コードする核酸またはＶＥＧＦを結合する受容体のアゴニストをコードする核酸 を用いる肺組織の形質転換である。 本発明により治療することができる別の症状は、ＮＯ関連および／くまたはプ ロスタサイクリン関連症状でもあるアテローム性動脈硬化症である。アテローム 性動脈硬化症の治療に関する場合、本明細書定義したＶＥＧＦアゴニストを用い るのが好ましい。 かくして、本発明は、イン・ビボでのＮＯおよび／またはプロスタサイクリン 産生の刺激によるアテローム性動脈硬化症治療薬の製造における、血管内皮成長 因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦをコードする核酸、ＶＥＧＦのアゴニスト、および ＶＥＧＦが結合する受容体のアゴニストをコードする核酸分子から選択される薬 剤の使用を提供するものである。 本発明はまた、本発明のＶＥＧＦタンパク質、核酸またはアゴニストの有効な 非毒性量を患者に投与することからなるアテローム性動脈硬化症の治療方法また は予防方法を提供するものである。かかる治療は、本明細書に記載したとおり行 われる。 アテローム性動脈硬化症治療については、デリバリーの好ましい形態は、本発 明のＶＥＧＦタンパク質、または、好ましくは、本発明のＶＥＧＦアゴニストの 、例えば、錠剤形態での、経口デリバリーである。 以下の実施例により本発明を説明する。以下の略語を用いる： ＢＳＡ ウシ血清アルブミン ＤＭＥＭ ダルベッコの修飾イーグル培地 ＦＣＳ ウシ胎児血清 ＨＵＶＥＣ ヒト臍帯静脈内皮細胞 ＩｇＧ イムノグロブリンＧ ＭＡＰキナーゼ マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ ｍＡｂ モノクローナル抗体 ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水 ＰＧＩ₂ プロスタサイクリン ｃＰＬＡ₂ シトゾルホスホリパーゼＡ₂ ＰＩＧＦ 胎盤成長因子 ＳＤＳＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル 電気泳動 ＶＥＧＦ 血管内皮成長因子 ｖＷＦ ヴォン・ヴィレブランド因子 ＶＳＭＣ 血管平滑筋細胞 実施例１ 内膜平滑筋細胞増殖を生じる薬剤として、および、遺伝子およびベクターのた めのリザーバーとして作用する頚動脈の周囲に挿入されたシリコーンカラーを用 いて、内膜の肥厚に対する内皮細胞（ＥＣ）−特異的ＶＥＧＦ遺伝子導入の効果 を研究した。該モデルは、ＥＣ完全性を保存し、いずれの血管内操作も用いずに 、直接血管外遺伝子導入を可能にした。 実施例１．１ 遺伝子導入：全身麻酔下、ニュージーランド白ウサギ３２匹の頚動脈において 、該動脈の周囲に不活性シリコーンカラーを挿入することにより内膜肥厚を誘発 した（Booth et al.，Atherosclerosis（1989）76:257-268）。該カラーの設置 から５日後、麻酔下で該カラーを静かに開き、該カラーの中にプラスミド／リポ ソーム複 合体５００μlを注入することにより（すなわち、動脈の外膜表面上で）遺伝子 導入を行った。該研究のいずれの工程においても、全く血管内操作を含まなかっ た。 プラスミド／リポソーム複合体：ｐＣＭＶ５−ＶＥＧＦ−１６４プラスミド（ マウスＶＥＧＦ ｃＤＮＡ（Breier et al.，Development（1992）114:521-32； ヌクレオチド１−５８３）を含有する）２５μgをリポフェクチン（ＢＲＬ）２ ５μlと複合体形成させ、リンゲル溶液で５００μlに希釈した。複合体を、遺伝 子導入前に少なくとも１５分間室温で維持する。この研究で用いた濃度では、プ ラスミド／リポフェクチン複合体がイン・ビトロでウサギ動脈ＥＣに対して有毒 ではなかったことが予め判定された。対照動脈を、イー・コリ（E．coli）ｌａ ｃＺ ｃＤＮＡ（Kalnins et al.、上掲）（ヌクレオチド１−３１００）発現プ ラスミドを含有する同様のプラスミド／リポソーム複合体でトランスフェクトし た。この研究に用いたプラスミドは、キアジェン・メガ（Qiagen Mega）カラム を用いてイー・コリ培養物（ＤＨ５α）から単離し、フェノール／クロロホルム 抽出を３回およびエタノール沈殿法を１回行って精製し（Ausubel et al.，eds ．Current Protocols in Molecular Biology．New York，NY:Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons（1991）4.2.3-4.2.4）、１μg／μlに調節 し、微生物または内毒素汚染を含まないことを分析した（リムルス（Limulus） アッセイ、検出限界０.２ng）。動物を、遺伝子導入手術の３日後（ｎ＝８）、 ７日後（ｎ＝１２）および１４日後（ｎ＝１２）に屠殺した；動脈を注意深く取 り出し、３等分した；近位の３分の１は、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中 で１５分間浸漬固定し、ＯＣＴ化合物（マイ Invest．（1995）95:2692-2698）中に包埋した。中間の３分の１は、上記と同様 に４時間固定し、１５％スクロース中で４８時間洗浄し、パラフィン中に包埋し た。遠位の３分の１は、ＯＣＴ化合物中に直接包埋し、液体窒素中で冷凍した。 ４つの動脈において、ｍＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲ（下記を参照）のために 遠位の３分の１を用いた。試料の起源の情報を持っていない２人の独立した観察 者による内 230-236）のために中間位置からランダムに選択した１０個の切片を用いた。２ つ の独立した測定値の平均値を用いて、結果（平均±ＳＤ）を算出した。グループ 間の内膜／中膜厚さ比の差異を、ＡＮＯＶＡ、次いで、変形ｔ−検定（^*ｐ＜０. ０５）により分析した。 ＲＴ−ＰＣＲ:ｍＲＮＡ単離(マイクローファーストトラック（Micro-FastTrac k）、インビトロジェン（Invitrogen）)のために遺伝子導入の７日後に回収した ＶＥＧＦ（ｎ＝２）およびｌａｃＺ（ｎ＝２）トランスフェクト動脈の遠位部分 を用い、従前の記載（Hiltunen et al.，Circulation（1995）92:3297-3303）に 従って、ランダムヘキサマープライマー（cＤＮＡサイクルキット、インビトロ ジェン）を用いてＡＭＬＶリバーストランスクリプターゼ(反応あたり５Ｕ、ベ ーリンガー(Boehringer))を用いて第１標準ｃＤＮＡに逆転写させた。Ｔａｑポ リメラーゼ(ベーリンガー)およびトランスフェクトｐＣＭＶ５−ＶＥＧＦ−１６ ４構築物に対して特異的なプライマーを用いて３５サイクルＰＣＲを行った（５ '−プライマー：配列番号９；３'−プライマー：配列番号１０；ＰＣＲサイクル パラメーター：９０℃で1分、６０℃で１分、７２℃で１分、最後のサイクルが ５分であることを除く）。ＶＥＧＦトランスフェクト動脈中で所望の長さ（５４ ７ｎｔ）を有する増幅フラグメントが見られた。ゲルの両側にＤＮＡサイズマー カー（１ｋｂラダー、ＢＲＬ）が示される。 ＶＥＧＦまたはｌａｃＺ遺伝子導入の７日後にウサギ頚動脈の特徴を示す顕微 鏡写真を撮影した。トランスフェクトされた動脈の免疫染色法は、以下のことを 示した：ｌａｃＺ−プラスミド／リポソーム（ＳＭＣ特異的ＭＡｂ ＨＨＦ−３ ５、１：５００希釈、エンゾ・ダイアグノスティクス（Enzo Diagnostics））で トランスフェクトされた対照動脈は、典型的な内膜肥厚を示した；ＶＥＧＦプラ スミド／リポソーム（ＳＭＣ特異的ＭＡｂ ＨＨＦ−３５）でトランスフェクト された動脈は、限定された内膜肥厚のみを示した;内皮は、研究した全ての血管 切片に存在した(Ａ，ＥＣ特異的ＭＡｂ ＣＤ３１に対する連続切片、希釈１：５ ０、ＤＡＫＯ）；ＶＥＧＦ−およびｌａｃＺ−トランスフェクトされた動脈にお いて炎症は全く検出されなかった(マクロファージ特異的ＭＡｂ ＲＡＭ−１１、 希釈１：５００、ＤＫＯ)；遺伝子導入の１４日後に、ＶＥＧＦトランスフェク ト動脈の外膜に血管新生が見ら れた（ヘマトキシリン−エオシン染色法）。 ビジン−ビオチンホースラディッシュペルオキシダーゼ系（ベクター・エリート （Vector Elite）、ベクター・ラブズ（Vector Labs））を用いた。免疫染色法 のための対照は、無関連クラスーおよび種−適合イムノグロブリンを用いるイン キュベーションおよび一次抗体が省略されたインキュベーションを含んだ。従前 の記載 トラータジーン（Stratagene））から合成したアンチセンスＶＥＧＦリポプロー ブ（５８３ｎｔ）を用いてin situハイブリダイゼーションを行った。すなわち 、パラフィン包埋切片をプロテアーゼＫで前処理し、アセチル化し、３５−Ｓ− ＵＴＰ（デュポン（DuPont）、ＮＥＮ）標識リボプローブ（６×１０⁶cpm／ml） を用いて５２℃で１６時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、最 後に、６０℃で３０分間、０.１×ＳＳＣで洗浄した。シグナル検出のためにオ ートラジオグラフィーを用いた（イーストマン−コダック（Eastman-Kodak）Ｎ ＡＢ−２）。 用いた対照ハイブリダイゼーションにより、マイナスの結果が得られた。切片を ヘマトキシリンで対比染色した。 実施例１．２ 実施例１．１の記載に従って、遺伝子導入を行った。ＶＥＧＦ（ｎ＝５）また はｌａｃＺ（ｎ＝５）遺伝子導入の１日前から、ウサギに飲料水中でＬ−ＮＡＭ Ｅ（７０mg／kg／d）を供給し始めた。遺伝子導入の７日後に動物を屠殺し、上 記に従っ内膜肥厚の差異はなくなった。 実施例１．３ ＨＵＶＥＣの集密培養物を無血清培地で２回洗浄し、所定濃度の組換えヒトＶ ＥＧＦの存在下で１５分間、または１０ng／ml ＶＥＧＦの存在下で所定の時間 、この培地と一緒にインキュベートした。いくつかの実験では、細胞を１００μ Ｍ Ｌ −ＮＡＭＥで１時間前処理し、次いで、１０ng／ml ＶＥＧＦを用いるかまたは 用いずに１０分間処理した。培地を取り出し、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７ .６）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭピロリン酸ナトリウム 、５０ｍＭ ＮａＦ、０.１ｍＭ Ｎａ₃ＶＯ₄、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１％トリ トンＸ−１００（溶解緩衝液）の添加により、４℃で細胞を迅速に溶解させた。 溶解物を１５０００×ｇで１０分間遠心分離にかけることにより浄化し、浄化し た溶解物をＰＹ２０抗ホスホチロシンｍＡｂと一緒に４０℃で２時間免疫沈澱法 を行った。溶解物をタンパク質Ａ−アガロースと一緒にさらに１時間インキュベ ートすることにより免疫沈澱物を回収した。免疫沈澱物を溶解緩衝液で３回洗浄 し、次いで、タンパク質を２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液で抽出し、免疫 沈澱したタンパク質を膜に移動させ、次いで、ＰＹ２０ ｍＡｂでイムノブロッ ティングを行った。これは、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ受容体に対応する主要な２０５ ｋＤタンパク質のリン酸化を誘発することを示す（１００、１２５、１４５、１ ９０および２０５での主要なチロシンリン酸化タンパク質）。Ｌ−ＮＡＭＥは、 ＶＥＧＦへの応答をなくす。 組換えＶＥＧＦを、２５ng／mlの濃度で２時間まで（亜硝酸産生は、約１６μ Ｍの外膜レベルから増加し、１.８−２μＭで維持された）、または、０、２.５ 、２５ng／mlの所定濃度で１０分間、添加した。２５ng／ml ＶＥＧＦを１０分 間添加した後、ＶＥＧＦ応答に対するＬ−ＮＡＭＥ（１００μＭ）前処理（１時 間）の効果を測定した。キャピラリー検出法を用いて亜硝酸産生を測定した（Le one et al.，in Methods in Nitric Oxide Research，Feelisch and Stanler，e ds．John Wiley & Sons，New York（1996）499-508）。レベルは、ＶＥＧＦの存 在下、約１９および約２.１μＭに上昇した；Ｌ−ＮＡＭＥの添加により対照レ ベル（約１７μＭ）に減少した。 結果：ｌａｃＺ形質導入動脈と比較して、ＶＥＧＦ遺伝子導入は、術後１週間 目に内膜肥厚を有意に減少させることが見出された（内膜／中膜比０.３対１.１ 、＜０.０５、各々）。この効果は、２週間後に低下した。これは、おそらく、 プラスミド／リポソーム媒介遺伝子導入が、典型的には、遺伝子導入後２-３日 の間に最高のタンパク質発現を有するトランスフェクト遺伝子の一時的発現を誘 発するに過 ぎないという事実によるものである。トランスフェクト動脈において副作用また は炎症は、全く検出されなかった。 トランスフェクトＶＥＧＦの発現は、導入遺伝子に対して特異的なプライマー を用いるＲＴ−ＰＣＲにより、および、in situハイブリダイゼーションにより 確認された。ＶＥＧＦおよびｌａｃＺ発現のほとんどは、線維芽細胞およびＳＭ Ｃにおける外膜および外中膜で生じた。遺伝子導入の１４日後にＶＥＧＦトラン スフェクト動脈のうち３つにおいて外膜血管新生が見られた。ｌａｃＺトランス フェクト動脈においては、血管新生は検出されなかった。 カラーモデルを用いるｌａｃＺ−プラスミド／リポソーム遺伝子導入により、 動脈細胞の０.０５％において局所遺伝子導入を生じることは、従来、示されて いた。低い遺伝子導入効率にもかかわらず、カラーの内側で産生されたＶＥＧＦ の分泌形態は、遺伝子導入の１４日後に３つのＶＥＧＦトランスフェクト動脈に おける血管新生の存在により示されるように、局所的な動脈微小環境中で生物学 的効果を生じる。急性低酸素症における場合、分泌されたＶＥＧＦは、拡散によ りＥＣに達し、ＥＣ上のＶＥＧＦ受容体に結合すると思われる。 内膜肥厚に対するＶＥＧＦの阻害効果は、直接または間接ＶＥＧＦ誘発ＥＣ由 来因子または次にＳＭＣ増殖を阻害する活性のいずれかによると仮定された。詳 しくは、内膜肥厚に対するＶＥＧＦの効果は、ＮＯ経路を介して媒介されると仮 定された。この仮説は、遺伝子導入実験の間、動物にＮＯシンターゼ阻害物質Ｌ −ＮＡＭＥを投与することにより、ニュージーランド白ウサギ（ｎ＝８）のサブ セットにおいて試験された。Ｌ−ＮＡＭＥがＶＥＧＦ−およびｌａｃＺ−トラン スフェクト動脈間の内膜肥厚の差異をなくしたことが見出された。動脈壁におけ るＶＥＧＦに対する主要な標的細胞は、ＥＣである。ＶＥＧＦ受容体を有する他 の細胞型は、単球であるが、特異的抗体を用いて免疫組織化学により判定すると 、単球は、これらの条件下でカラーを取り付けた頚動脈からなくなっている。 これらの結果（内膜肥厚の差異能）は、ＮＯ産生の刺激を介する内膜肥厚のＶ ＥＧＦ誘発阻害と矛盾しなかった。したがって、ＶＥＧＦがＥＣの培養物中でＮ Ｏ産生を直接刺激するかを試験した。ＶＥＧＦは、１−２５ng／mlの濃度範囲内 でＶＥ ＧＦ受容体に相当する主要な２０５ｋＤａタンパク質のチロシンリン酸化を誘発 した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）へのＶＥＧＦの添加は、亜硝酸レベル の測定によりモニターされるとおり、ＮＯ産生の時間−および濃度一依存性増加 を生じた。ＮＯ産生に対するＶＥＧＦの効果は、ＶＥＧＦの添加の３０秒後に見 ちれ、５分後に最高に達し、２時間まで保持された。ＶＥＧＦの最大効果の半分 は、５ng／mlで得られた。ＶＥＧＦ誘発リン酸化およびＮＯ産生は、１００μＭ Ｌ−ＮＡＭＥの存在下で完全になくなった。かくして、ＶＥＧＦ遺伝子導入は 、トランスフェクト動脈のＥＣにおけるＮＯ産生を刺激し、少なくとも部分的に ＮＯ媒介メカニズムを介してＳＭＣ増殖を制限すると思われる。該知見は、内皮 ＮＯシンターゼｃＤＮＡによる動脈のトランスフェクトが内膜肥厚を減少させる という従前の観察結果（Von der Leyon et al.，PNAS（1995）92:1137-1141）と 矛盾しない。 Callow et al.（上掲）およびAsahara et al.（上掲）は、ＶＥＧＦタンパク 質の投与が露出した動脈におけるＥＣ増殖を刺激するという結論を下したが、内 膜肥厚の阻害に関する実際のメカニズムは、研究されなかった。カラーを取り付 けた頚動脈では、内膜肥厚は、解剖学的に無傷の内皮の存在下で刺激される。し たがって、ここで報告された内膜肥厚に対する動脈ＶＥＧＦ遺伝子導入の阻害効 果は、ＶＥＧＦ刺激性再内皮形成によるものである。これらの結果によると、Ｖ ＥＧＦは、ＨＵＶＥＣにおけるＮＯ産生を直接誘発することができ、この結果、 これは、ＶＥＧＦが内膜肥厚を阻害することができる１つのメカニズムである。 ＶＥＧＦはまた、ＴＧＦ−βまたはプロスタサイクリンを含むＳＭＣ増殖を消極 的に調節することができる他の因子の産生も刺激する。 実施例２ 遺伝子デリバリーのためにプラスミド／リポソーム複合体を用い、モロニーネ ズミ白血病ウイルス由来（ＭＭＬＶ）レトロウイルス、シウド型水疱性口内炎ウ イルスタンパク質−Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）含有レトロウイルスおよびアデノウイルス を外膜に適用したシラスティックカラーを用いてウサギ頚動脈に送った。該カラ ーは、１）遺伝子デリバリーリザーバーを提供するため；２）内腔内操作を行わ ず、内皮を全体的に解剖学的に無傷のままにしておくため；および３）カラーの 設置が動脈平滑 筋細胞（ＳＭＣ）増殖を誘発し、標的細胞増殖が望まれる場合にレトロウイルス 遺伝子導入効率を増強するために用いられる。 遺伝子導入：ニュージーランド白ウサギ（１.８−２.５kg）を用いた。麻酔薬 は、 et al.，J．Clin Invest.（1995）95:2692-2698）であった。正中頚切開により 左頚動脈を露出させた。生物学的に不活性な２cmのシラスティックカラー（フィ ンランド、クオピオのメディジーン・オサケ・ユキチュア（Medi Gene Oy））を 、いずれかの端部でわずかに外膜に触れるように頚動脈の周囲に設置した(Booth et al．上掲)。カラー設置手術の４−５日後、遺伝子導入を行った。遺伝子導 入のために、動物を再度麻酔した。外科的に再露出されたカラーを静かに開き、 遺伝子導入溶液（下記参照）５００μlを充填した。切開部を閉じ、後に動脈を 遺伝子導入効率について分析した。 組織学的分析：カラーを設置した動脈を注意深く取り出し、３等分した：近位 の３分の１を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中で１５分間浸 漬固定し、次いで、ＯＣＴ化合物（アメリカ合衆国のマイルス・サイエンティフ ィック）中に包埋させた。中間の３分の１を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ （ｐＨ７.４）中で４時間浸漬固定し、１５％スクロース（ｐＨ７.４）で４８時 間洗浄し、次いで、パラフィン中に包埋させた。遠位の３分の１をＯＣＴ化合物 中に包埋させ、冷凍切片のために処理した。ランダムに選択した１０個の切片を β−ガラクトシダーゼ活性のためにＸ−ゲルで１２時間染色し、遺伝子導入効率 の測定のために用いた 上掲）。遺伝子導入効率は、ランダムに選択した２０個の１００Ｘフィールド中 で核酸の総数の割合としてのβ−ガラクトシダーゼ含有細胞のパーセンテージと して算出した。免疫細胞化学および細胞型および／または内膜／中膜厚さ比の分 析のために、カラーを設置した動脈の各３分の１部分からランダムに選択された 切片を用いた（Booth et al.上掲）。 以下の抗体を用いて細胞型を同定した：ＳＭＣ：ＨＨＦ−３５ ｍＡｂ（１： ５００希釈、アメリカ合衆国のエンゾ・ダイアグノスティクス）、α−アクチン ｍＡ ｂ（１：１０００希釈;シグマ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Co.)）； マクロフアージ：ＲＡＭ−１１ ｍＡＢ（１：１０００希釈；アメリカ合衆国の ダコ（Dako））、抗−ＣＤ６８ ｍＡｂ（１：２５０希釈、ダコ）；内皮細胞： 抗ＣＤ３１ ｍＡｂ（１：５０希釈；ダコ）；多形核白血球；抗ＣＤ４５ ｍＡｂ （１：１００希釈；ダコ）；および抗ウサギＴ−細胞：ＭＣＡ ８０５ ｍＡｂ( １：１０００希釈;ダコ)。シグナル検出のためにアビジン−ビオチン−ホースラ ディッシュペルオキシダーゼ系を用いた(ベクター・ラボラトリーズ(Vector labo ratories)) 対比染色した。 増殖指数の決定：５−ブロモ−２'−デオキシウリジン（ｂｒｄＵ）標識化(So maet al.，Arterioscler．Thromb.（1993）13:571-578)を用いて、カラーを設置 した動脈における増殖指数を決定した。すなわち、ニュージーランド白ウサギ（ ｎ＝１２）に、屠殺の３時間前にＢｒｄＵ（体重１kg当たり４０mg）を注射した 。７０％エタノール中で頚動脈を一夜固定し、パラフィン中に包埋した。核のヨ ウ化ピリジニウム染色法に従って、連続切片（動物あたり２０切片）を染色して 、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（ダコ）を用いてＢｒｄＵを検出した。標識指数 をＢｒｄＵ陽性核のパーセンテージとして計算した。対側頚動脈を擬似手術し、 対照として用いた。 プラスミド／リポソーム：以下のとおり、ｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ（ ｌａｃＺ）発現プラスミド（プロメガ（Promega））をリポフェクチン試薬（Ｂ ＲＬ）と複合体形成させた：プラスミド２５μgをリポフェクチン２５μglとゆ っくりと混合し、リンゲル溶液で５００μlに希釈した。プラスミド／リポフェ クチン溶液中で沈殿物は見られなかった。該混合物を室温で少なくとも１５分間 放置し、２時間以内に遺伝子導入のために用いた。プラスミド調製物を、リポ多 糖汚染がないことについてチェックした（リムルス・アッセイ、シグマ・ケミカ ル・カンパニー）。 レトロウイルス：該研究のために、ＬａｃＺ含有ｐＬＺＲＮＬ ＭＭＬＶレト ロ 85:6538-6542）またはＬａｃＺ ＶＳＶ−Ｇシウド型レトロウイルス（Yee et al .，PNAS（1994）91:9564-9568）を用いた。共に、５'ＬＴＲにより、ｌａｃＺの 発現 が駆動される。複製不全ＬＺＲＮＬ両栄養性レトロウイルスをＰＡ３１７細胞中 に 力価５×１０⁵cfu／mlで用いた。複製不全ＶＳＶ−Ｇシウド型レトロウイルスは 、一過性トランスフェクションを用いて（Yee et al.上掲）２９３ＧＰ細胞中で 産生された。シウド型レトロウイルスを、超遠心分離を用いて濃縮し、力価１× １０⁷cfu／mlで用いた。使用前、レトロウイルス調製物を、細菌学的汚染または ヘルパーウイルスがないことについてチェックした（Yee et al.上掲）。 アデノウイルスベクター：該研究のために、複製不全Ｅｌ欠失アデノウイルス を用いた(Gosh-Choudhury et al.，Gene（1986）50:161-171；Simari et al.，J ．Clin．Invest.（1996）98:225-235）。相同的組換え（Gosh-Choudhury et al. ，上掲；Simari et al.，上掲）を用いて、β−アクチン−プロモーターおよび ＣＭＶエンハンサー下の核標的β−ガラクトシダーゼｃＤＮＡをアデノウイルス ゲノムのＥｌ欠失領域にクローン化させた。複製不全アデノウイルスを２９３細 胞中に産生させ、超遠心分離により濃縮した。遺伝子導入実験のために力価１× １０⁹pfu／mlを用いた。アデノウイルス調製物を、ヘルパーウイルスまたは細菌 学的汚染がないことについて分析した（Gosh-Choudhury et al.，上掲）。 結果：外膜カラーにより、手術の７−１４日後に新内膜過形成が生じた。内皮 を該研究の全体にわたって解剖学的に無傷のままであった。ＢｒｄＵ標識は、手 術の３日後に２３％のピーク増殖指数を示した。新内膜は、ＳＭＣのみから構成 された。プラスミド／リポソーム複合体は、０.０１％未満の効率で外膜および 外中膜中への検出可能な遺伝子導入を生じさせた。未トランスフェクトまたはリ ポソーム処理のカラーを取り付けた動脈は、β−ガラクトシダーゼについての染 色を示さなかった。 おそらく、レトロウイルス遺伝子導入のみが増殖細胞中で生じるだけなので、 外膜レトロウイルス遺伝子導入は、カラーなしではあまり効果的ではなかった。 複製不全ＭＭＬＶレトロウイルスを用いた遺伝子導入効率は、低かつた（０.０ １％未満）。ＶＳＶ−Ｇシウド型レトロウイルスを用いた遺伝子導入効率は、０ .１％であった。ＭＭＬＶおよびＶＳＶ−Ｇレトロウイルスを用いると、β−ガ ラクトシダー ゼ染色が外膜および外中膜中で見られた。 複製不全アデノウイルスは、効果的な遺伝子導入をもたらし、β−ガラクトシ ダーゼ染色が外膜および外中膜中で検出された。興味深いことには、染色は、い くつかの内皮細胞およびいくつかの内膜細胞中でも見られた。ｌａｃＺアデノウ イルス構築物は、β−ガラクトシダーゼに対する核局在化シグナルを含有するの で、強いＸ−ゲル染色は、トランスフェクト細胞の核中にあった。遺伝子導入効 率は、分析切片において染色された核の総数から概算すると、約１０％であった 。ＶＳＶ−Ｇレトロウイルスおよびアデノウイルストランスフェクト動脈では、 いくつかの炎症細胞が見られた。プラスミド／リポソームトランスフェクト動脈 では、炎症細胞は全く見られなかった。 この実施例では、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子の外膜お よび外中膜への導入は、全ての遺伝子導入系を用いて生じた。アデノウイルスも また、β−ガラクトシダーゼ遺伝子をいくつかの内皮細胞中に導入した。５日後 、アデノウイルスベクターにより、細胞の１０％までがβ−ガラクトシダーゼ活 性を示すという最高の遺伝子導入効率が得られた。シウド型ＶＳＶ−Ｇレトロウ イルスもまた、外膜および外中膜中で細胞の０.１％において遺伝子導入を行う のに効果的であった。プラスミド／リポソーム複合体およびＭＭＬＶレトロウイ ルスは、細胞の＜０.０１％を感染させた。いずれの遺伝子導入系を用いても逆 組織反応は見られなかった。 かくして、複製不全アデノウイルス、ＶＳＶ−Ｇシウド型レトロウイルスおよ びプラスミド／リポソーム複合体は、カラー法を用いて動脈壁への遺伝子導入の ために用いることができる。中膜ＳＭＣおよび内皮に対する効果は、外膜側から 達成することができる。 実施例３ この実施例では、ＶＥＧＦによるＰＧＩ₂の刺激を試験した。 細胞培養：ＨＵＶＥＣをクロネティクス（Clonetics）から入手し、２％ＦＢ Ｓで補足した製造者自身の培地中で培養させるか、または、コラゲナーゼ消化に より新鮮な臍帯から増殖させ、２０％ＦＣＳおよび内皮細胞増殖サプリメントで 補足し た培地１９９において１％ゼラチン被覆プレート上で培養した（Wheeler-Jones et al.，Biochem．J.（1996）315:407-416）。実験目的のために、ＨＵＶＥＣの 一次培養物を３７℃で５分間の０.０５％トリプシン／０.０２％ＥＤＴＡによる 処理により分散させ、次いで、９０mm、６０mmまたは３５mmのプラスチック皿中 、または、２４ウエルプレート上で再度平板培養した。培養物を３７℃で５％Ｃ Ｏ₂および９０％空気を含有する加湿雰囲気中に維持し、６-８日後、または細胞 が集密単層を形成した時に用いた。 ＰＧＩ₂アッセイ：２４ウエルプレート中のＨＵＶＥＣの集密培養物を無血清 Ｍ１９９（ｐＨ７.４）中で２回洗浄し、ＶＥＧＦを含有する培地に暴露した。 従前の記載（Wheeler-Jones et al.，上掲）に従って、ＰＧＩ₂の安定な分解物 である６−ケト−ＰＧＦ_1aのラジオイムノアッセイにより細胞上清のＰＧＩ₂含 量を定量化した。 アラキドン酸放出：実質的に従前の記載（Domin and Rozengurt，J．Biol．Ch em．（1993）268:8927-8934）に従ってアラキドン酸放出を測定した。集密ＨＵ ＶＥＣ培養物を[５,６,８,９,１１,１２,１４,１５−³Ｈ]アラキドン酸（１ｍＣ ｉ／ml、２１１Ｃｉ／ミリモル）と一緒に２４時間インキュベートした。次いで 、該細胞を培地１９９で２回洗浄し、０.３％ＢＳＡ（実質的に脂肪酸を含まな い）およびＶＥＧＦまたはトロンビンで補足したこの培地１ml中でインキュベー トした。処理後、培地を取り出し、１６,０００×ｇで５分間マイクロセントリ フュージ中で遠心分離し、上清の放射能をシンチレーションカウンター中でカウ ントすることにより測定した。 ウェスタンブロット法：上記ならびに結果および図面の説明の記載に従って、 細胞の静止状態培養物の因子による処理、および、細胞溶解を行った。ＳＤＳ− ＰＡＧＥ後、タンパク質をイモビロン（Immobilon）膜（ミリポア・インコーポ レイテッド（Millipore Inc.））に移した。ＭＡＰキナーゼアッセイのために、 ＰＢＳ（ｐＨ７.２）中５％脱脂粉乳を用いて膜をブロックし、所定の一次抗体 （１mg／ml）を含有するＰＢＳ／０.０５％トゥイーン−２０中で３−５時間イ ンキュベートしたｃＰＬＡ₂に対する抗体を用いるイムノブロットのために、膜 を０.２％(ｗ／ｖ) Ｉ−ブロック（トロピックス（Tropix））を含有するＴＢＳＴ５０ｍＭ／トリス ／ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０.０２％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０（ｐＨ７ .４）（ＴＢＳＴ）中で３時間ブロックし、次いで、ＴＢＳＴ中、一次抗血清と 一緒にインキュベートした。次いで、膜をＴＢＳＴ中で６回洗浄し（各々１０分 間洗浄）、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体を含有するＴＢＳＴ中で１時間インキ ュベートした。製造者の使用説明書に従って、ＨＲＰコンジュゲート抗マウスま たは抗ウサギＩｇＧおよびＥＣＬ^TM試薬を用いるケミルミネッセンスにより、免 疫反応性バンドを視覚化した。 ＭＡＰキナーゼアッセイ：所定の因子で細胞を処理し、氷冷ＰＢＳで２回迅速 に洗浄し、すぐに、沸騰している２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液１００ｍ ｌの添加により抽出した。細胞抽出物を掻取ることにより回収し、９５℃に１０ 分間加熱し、１２.５％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で移動させた。 イモビロン膜への移動後、Ｔｙｒ２０４（Payne et al.，EMBO J.（1991）10:88 5-892）でのリン酸化により活性化されたｐ４２およびｐ４４ＭＡＰキナーゼ（ Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２）を特異的に認識するタンパク質を抗体でイムノブ ロットした。 ｃＰＬＡ₂移動度シフトアッセイ：６０mm皿中の集密静止状態ＨＵＶＥＣを無 血清培地１９９（ｐＨ７.４）中で２回洗浄し、次いで、図面の説明で詳述した 因子を含有する培地に所定の時間暴露させた。従前の記載（Wheeler-Jones et a l.，上掲）に従って、細胞溶解物を調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリ ルアミド）によりタンパク質を分離し、膜への移動後、ｃＰＬＡ₂に対するポリ クローナル抗血清（BorschHaubold et al.，J．Biol．Chem.（1995）270:25885- 25892；および、Kramer et al.,J．Biol．Chem.（1996）271:27723-27729）を用 いてイムノブロットした。 ｖＷＦ分泌のアッセイ:所定の因子で処理したＨＵＶＥＣの集密培養物から得 られた培地の試料中でＥＬＩＳＡ（Wheeler-Jones et al.，上掲）によりｃＷＦ 分泌を測定した。プレートは、抗ｖＷＦ ｍＡｂ ＣＬＢＲＡｇ３５で被覆されて おり、アッセイの検出下限は、約１.０ｍＵ／mlであった。 材料：組換えＶＥＧＦは、ユービーアイ（ＵＢＩ）またはアール・アンド・デ ィ・ システムズ（Ｒ＆Ｄ Systems)から入手した。組換えＰｌＧＦは、ワーナー・リ ゾー（Werner Risau）教授の寄贈物であり、また、アール・アンド・ディ・シス テムズからも入手された。ポリクローナルｃＰＬＡ₂抗血清は、ラス・クラマー （Ruth Kramer））博士（インディアナポリスのイーライ・リリー（Eli Lilly） ）から快く提供された。抗ｖＷＦ ｍＡｂ ＣＬＢＲＡｇ３５は、ジェイ・エイ・ ヴァン・モウリク（J．A．Mourik）博士（オランダ、アムステルダムのセントラ ル・ブラッド・ラボラトリー（Central Blood Laboratory））からの寄贈物であ った。ｐ４２／ｐ４４ＭＡＰキナーゼの活性化リン酸化形態に対する抗体は、ニ ュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド（New England Biol abs Inc.）から購入した。[５,６,８,９,１１,１２,１４,１５−³Ｈ]アラキドン 酸、ＥＣＬ^TM試薬およびＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧは、アマシャム（ Amersham）（イギリス）から入手された。ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲートＩ ｇＧは、ピアス・インコーボレイテッド(Pierce Inc.)）から入手された。用い られる全ての他の試薬は、入手可能な最高純度のグレードのものであった。 結果：ＨＵＶＥＣの集密培養物をＶＥＧＦで２時間までの様々な時間処理し、 これらの時点で培地を取り出し、ＰＧＩ₂の安定な代謝性分解物である６−ケト ＰＧＦ_1aの存在についてアッヤイした。ＶＥＧＦは、ＰＧＩ₂の産生の時間依存 性増加を生じ、これは、因子添加後の１５分ほどで検出可能であり、６０分間ま で増加し続け、その後、２時間まで持続した。対照細胞は、試験された時間経過 の間、ＰＧＩ₂産生の非常にわずかな増加を示しただけであった。ＰＧＩ₂産生の ＶＥＧＦ刺激は、また、濃度依存性であった。６０分間インキュベートした後、 ＰＧＩ₂合成の増加は、５ng／mlで検出可能であり、１０ng／mlで最大値の半分 であり、１５ng／mlで最大に達した。一貫して、ＶＥＧＦ誘発ＰＧＩ₂合成が２ ５ng／mlでわずかに低下することに注目した。 さらに、Ｆｌｔ−１ ＶＥＧＦ受容体に対して特異的なリガンドであるＶＥＧ Ｆ関連因子ＰｌＧＦがＨＵＶＥＣ中でＰＧＩ₂合成を誘発するかを試験した。５ つの独立した試験において、ＰｌＧＦは、ＶＥＧＦよりも有意に弱くＰＧＩ₂合 成を刺 激した。さらに、ＶＥＧＦおよびＰｌＧＦの両方の応答を、内皮細胞および血小 板におけるプロスタノイド合成の有効なインデューサーであるトロンビンの応答 と比較した。ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦおよびトロンビンの効果を平行培養物中で直接 比較したいくつかの独立した試験において、２５ng／ml ＶＥＧＦ、６０ng／ml ＰｌＧＦおよび１Ｕ／mlトロンビンと一緒に６０分間インキュベートすることに より産生された６−ケトＰＧＦ_1aの平均増加倍数は、各々、平均対照非刺激レベ ルの２.０倍、１.３倍および４.４倍であった。 ＰＧＩ₂合成のＶＥＧＦ刺激がＰＬＡ₂のイソ形態の活性化により媒介された場 合、ＶＥＧＦは、アラキドン酸の細胞からの迅速な移動を生じると予測される。 これを試験するために、ＨＵＶＥＣを放射性標識アラキドン酸と一緒に２４時間 プレインキュベートし、次いで、ＶＥＧＦで様々な時間で抗原投与した。ＶＥＧ Ｆは、プレ標識細胞の培地中に放出された標識の増加を生じ、これは、因子添加 後、１０分で明らかになり、３０分で最大に達した。平行培養物中で測定した場 合、ＶＥＧＦ刺激性アラキドン酸放出のための時間経過は、トロンビンについて のものと非常に類似していた。ＶＥＧＦ刺激性アラキドン酸放出についての濃度 依存性は、ＰＧＩ₂産生について得られたものと非常に類似しており、２.５−５ ng／mlで最大効果の半分であり、１０−２０ng／mlで最大であった。トロンビン およびＶＥＧＦのＰＧＩ₂産生を刺激する相対的な能力と同様に、一貫して、最 大ＶＥＧＦ誘発アラキドン酸化放出は、トロンビンについて得られたものよりも 低かった。４つの独立した試験において、ＶＥＧＦおよびトロンビンは、各々、 基本的な非刺激レベルの１.６倍および３.４倍の標識アラキドン酸の放出の平均 増加を生じた。ＰｌＧＦは、プレ標識ＨＵＶＥＣからのアラキドン酸放出の検出 可能な有意な増加を生じなかった。 迅速なＶＥＧＦ刺激性アラキドン酸放出についてのもっともらしく思われる１ つのメカニズムは、ＰＬＡ₂のシトゾル形態により触媒化されるアラキドン酸の 直接酵素的放出である。ｃＰＬＡ₂は、ＭＡＰキナーゼ依存性リン酸化により活 性化させることができ、ＭＡＰキナーゼを含む他の酵素のリン酸化および活性化 と同様に、ｃＰＬＡ₂のその活性化形態への転換は、速移動形態から遅移動形態 へのＳＤＳ− ＰＡＧＥゲルにおけるその移動度のシフトによりモニターリングすることができ る。したがって、ＶＥＧＦに対する応答におけるｃＰＬＡ₂の活性化は、ｃＰＬ Ａ₂に対する特異的抗体（BorschHaubold et al.，上掲、および、Kramer et al. ，上掲）を用いてＨＵＶＥＣ抽出物のウェスタンブロット分析法により測定され た。対照の非刺激ＨＵＶＥＣの抽出物において、ｃＰＬＡ₂に対する抗体は、ほ ぼ等しい強度の、ほぼＭｒ ９７,０００について移動する２つの明瞭なバンドを 認識した。ｃＰＬＡ₂は、８５ｋＤａの予測分子量を有するが、このタンパク質 は、９７ｋＤａバンドとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて移動することが従前に報 告されていた（BorschHaubold et al.，上掲、および、Kramer et al.，上掲） 。 ２５ng／mlのＶＥＧＦは、ｃＰＬＡ₂の遅移動形態の免疫反応性の著しい増加 、および、付随する速移動形態の相対的な減少を生じ、これは、ＶＥＧＦ添加の ２分後に検出可能であり、１５分後に最大に達し、６０分後まで持続した。５つ の独立した試験において、一貫して、ＶＥＧＦは、ｃＰＬＡ₂の遅移動形態の免 疫反応性の著しい増加を生じた。ｃＰＬＡ₂の電気泳動移動度のＶＥＧＦ誘発性 低下もまた、濃度依存性であり、２.５ng／mlで遅移動形態が著しく増加し、試 験された最高濃度５−１０ng／mlで最大に増加した。ＶＥＧＦは、ｃＰＬＡ₂の 速移動形態のレベルの見掛の低下を生じるが、この種は、試験された全てのＶＥ ＧＦ濃度および処理時間で明らかであった。トロンビンはまた、速移動形態から 遅移動形態へのｃＰＬＡ₂の移動の著しいシフトを生じ、共に、ＶＥＧＦ処理Ｈ ＵＶＥＣの抽出物中で検出されたものについて正確に同時移動した。同実験にお けるＶＥＧＦおよびトロンビンの効果の直接比較は、ＰＧＩ₂合成およびアラキ ドン酸放出について得られた結果と同様に、トロンビンは、該酵素の速移動形態 の実質的に完全な消失を伴って、ｃＰＬＡ₂のゲル遅延のさらに著しい増加を生 じた。ＰｌＧＦは、速移動形態から遅速度形態への免疫反応性ｃＰＬＡ₂の移動 度において検出可能なシフトを生じなかった。 さらに、ＶＥＧＦがまた、ＨＵＶＥＣによるｖＷＦ分泌を誘発したかを試験し た。ＶＥＧＦは、ｖＷＦの時間および濃度依存性産生を刺激した。ｖＷＦは、２ ５ng／ml ＶＥＧＦの細胞への添加後３０分程度でＨＵＶＥＣ培地中で検出可能 であり、 試験された時間経過の間、増加し続け、３時間後、対照細胞におけるよりも２. ５倍高いレベルに到達した。ＶＥＧＦの効果についての濃度依存性は、約１０ng ／mlで最大値の半分、および、試験された最高濃度である２５mg／mlで最大効果 の応答を伴ってＰＧＩ₂産生について得られたものと同様であった。ＰＧＩ₂合成 について得られた結果と同様に、ＶＥＧＦの効果は、トロンビンのものよりも一 貫して弱いが、それに匹敵した（図１２）。ＶＥＧＦとは対照的に、ＰｌＧＦは 、ＨＵＶＥＣにおけるｖＷＦの検出の可能な刺激を生じなかった。走化性チャン バーにおけるＨＵＶＥＣの移動に対するＶＥＧＦおよびＰｌＧＦの効果の比較に より、ＶＥＧＦは、走化性の濃度依存性増加を刺激するが、ＰｌＧＦは、５−６ ０ng／mlの濃度範囲で検出可能な増加を生じなかったことが判明した。 ＶＥＧＦは、ＨＵＶＥＣにおけるｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰキナーゼを活性化す る。ＭＡＰキナーゼが他の因子によりｃＰＬＡ₂活性化に関係した場合、これは 、ＭＡＰキナーゼカスケードがＶＥＧＦ誘発性ｐＧＩ₂合成およびｃＰＬＡ₂活性 化を媒介する可能性を生じた。集密的ＨＵＶＥＣにおけるｐ４２／ｐ４４ ＭＡ Ｐキナーゼ活性のＶＥＧＦ刺激性活性化についての濃度依存性を試験した。細胞 のＶＥＧＦへの１５分間暴露により、０.５ng／ml程度の低い濃度で検出可能な 増加を生じ、１〜５ng／mlで最大の半分の増加を生じ、１０ng／mlで最大効果を 生じ、５０ng／mlまで持続した。ＶＥＧＦの著しい効果とは対照的に、１−６０ ng／mlの濃度範囲のＰｌＧＦは、如何なる場合も、ＨＵＶＥＣにおけるＭＡＰキ ナーゼ活性の検出可能な増加をあまり生じなかった。ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰキ ナーゼのＶＥＧＦ刺激は、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰキナーゼを特異的にリン酸化 および活性化する、二重特異性トレオニンおよびチロシンキナーゼであるＭＡＰ キナーゼキナーゼの選択阻害物質であるＰＤ９８０５９（Dudley et al.，PNAS USA（1995）92:7686-7689）での３０分間の前処理より完全に阻害された。該阻 害物質の効果は、５ｍＭで５０％よりも大きい阻害、および、対照に対するＭＡ Ｐキナーゼ活性の低下を伴う濃度依存性であり、１０−２０ｍＭで非刺激レベル である。 ＶＥＧＦ誘発アラキドン酸移動経路におけるＭＡＰキナーゼの役割は、最初に 、ＰＧＩ₂合成に対するＰＤ９８０５９の効果を試験することにより研究された 。Ｈ ＵＶＥＣの３０ｍＭ ＰＤ９８０５９での３０分間の前処理は、２５ng／ml ＶＥ ＧＦまたは１Ｕ／mlトロンビンと一緒の次なる６０分間インキュベーションによ り誘発されるＰＧＩ₂産生を完全に阻害した。ＶＥＧＦ誘発性ＰＧＩ₂合成に対す るＰＤ９８０５９の効果は、約５ｍＭで最大の半分の効果、および、１０ｍＭで 刺激されたＰＧＩ₂産生に対する最大阻害効果を伴う濃度依存性であった。ＰＤ ９８０５９は、ＶＥＧＦ処理細胞におけるＰＧＩ₂産生の対照細胞において測定 された値よりも下に低下したことを示したが、この効果は、１０ｍＭよりも高い 阻害物質濃度で明らかなだけであった。 次に、ＰＤ９８０５９が、ｃＰＬＡ₂の電気泳動移動度のＶＥＧＦに誘発され た減少に対して効果を及ぼすかを試験した。２５ｍＭのＰＤ９８０５９での前処 理は、ｃＰＬＡ₂の遅移動形態のＶＥＧＦ刺激増加を完全にブロックした。ＰＧ Ｉ₂合成に対するＰＤ９８０５９の効果と同様に、該阻害物質は、ｃＰＬＡ₂ゲル 移動度のＶＥＧＦ依存性低下を逆転させるだけではなく、対照レベル以下に遅移 動形成の免疫反応性を低下させ、対照レベル以上に遅移動形態の免疫反応性を上 昇させた。 ＶＥＧＦ誘発ｃＰＬＡ₂活性化およびＰＧＩ₂合成に対するＰＤ９８０５９の効 果の選択性は、ＶＥＧＦ刺激ｖＷＦ産生がＰＤ９８０５９による阻害の影響を受 け易いかを試験することにより研究された。ｃＰＬＡ₂活性化およびＰＧＩ₂合成 に対するＰＤ９８０５９の効果とは対照的に、ＨＵＶＥＣの２5ｍＭのＭＡＰキ ナーゼキナーゼ阻害物質による前処理は、次のＶＥＧＦの添加により生じたｖＷ Ｆの分泌を予防したり有意に低下させたりしない。ＰＤ９８０５９は、また、基 底またはトロンビン刺激性ｖＷＦ分泌に対して効果を全く及ぼさなかった。 結論：ＶＥＧＦは、１５分以内で検出可能であり、１０ng／mlで最大の半分で あり、６０分後に１５ng／mlで最大であったＰＧＩ₂合成の時間および濃度依存 性増加を刺激した。１０個の独立した試験において、平均最大ＶＥＧＦ刺激性Ｐ ＧＩ₂合成は、６０分後、２５ng／mlで基底の２倍以上のレベルであった。ＶＥ ＧＦ関連因子である胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）は、対照レベルの１.３倍弱い増 加を誘発し、トロンビン（１Ｕ／ml、６０分）は、対照レベルの４.４倍高い平 均最大増加を誘発した。ＶＥＧＦは、より迅速な速度（最大の半分のアラキドン 酸移動が１０分後 に起こり、３０分後に最大であった）を伴う以外はＰＧＩ₂合成について得られ たものと同様の濃度依存性を伴ってアラキドン酸のＨＵＶＥＣからの放出を刺激 した。活性化のマーカーとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける移動度シフトを用いる シトゾルホスホリパーゼＡ₂（ｃＰＬＡ₂）活性化の測定は、ＶＥＧＦが時間およ び濃度依存性方法（ｃＰＬＡ₂の遅移動および活性化形態の増加が２分程度の速 さで生じ、２.５ng／ml程度の低さで検出可能であり、１５分後に５ng／mlで最 大に到達する）でｃＰＬＡ₂活性を刺激したことを示した。ＰＧＩ₂合成を誘発す る他の薬剤と同様に、ＶＥＧＦはまた、３０分以内で検出可能であり、１０ng／ mlで最大の半分であり、２５ng／mlでの３時間処理後に対照レベルよりも２.５ 倍高いレベルに到達したフォン・ビレブラント因子（ｖＷＦ）の分泌の著しい時 間および濃度依存性増加を生じた。ＶＥＧＦは、１ng／ml程度の低さで検出可能 であり、５−１０ng／mlで最大値に到達したｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰキナーゼの 迅速かつ一過性の活性化を誘発した。対照的に、ＰｌＧＦは、ＭＡＰキナーゼ活 性に対してあまり効果を及ぼさなかった。ＭＡＰキナーゼキナーゼの選択的阻害 物質であるＰＤ９８０５９は、ＶＥＧＦ刺激性ＭＡＰキナーゼ活性、ＰＧＩ₂合 成およびｃＰＬＡ₂ゲル遅延の完全な阻害を生じたが、ＶＥＧＦ誘発性ｖＷＦ分 泌に対して効果を及ぼさなかった。これらの知見は、ＶＥＧＦがｃＰＬＡ₂媒介 アラキドン酸放出を介するＰＧＩ₂合成を刺激することができるという最初の証 拠を提供する。これらの知見は、また、この生合成経路のＶＥＧＦ刺激が、少な くとも一部分、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰキナーゼの活性化を介して生じることを 示す。 ここで示された結果は、ＶＥＧＦがＨＵＶＥＣにおけるＰＧＩ₂産生の著しい 時間および濃度依存性増加を刺激することを示す。ＶＥＧＦの効果は、トロンビ ンのものよりも弱いが、２つの因子に対する応答は、平均して２.５のファクタ ーにより変化した。ＶＥＧＦは、アラキドン酸のヒト内皮細胞からの迅速な移動 およびゲル遅延アッセイにより判断されるようなｃＰＬＡ₂の迅速な活性を刺激 する。アラキドン酸移動に対するＶＥＧＦの効果を測定するために用いられる方 法は、³Ｈ−アラキドン酸で前標識した細胞からの³Ｈ−標識の放出に基づく。ア ラキドン酸放出の研究は、培地中に存在するＢＳＡを用いて行われるので、ＨＵ ＶＥＣから放出 された主要産生物は、³Ｈ−アラキドン酸であると思われる。ＶＥＧＦ誘発ＰＧ Ｉ₂産生、アラキドン酸放出およびｃＰＬＡ₂活性化についての濃度依存性は、お 互いに類似していた（全て、５−１０ng／mlの範囲内）。これらの結果は、アラ キドン酸放出およびＰＧＩ₂合成のＶＥＧＦ刺激がＨＵＶＥＣにおけるこの因子 について高結合性受容体を介して媒介されることを示す。 アラキドン酸およびｃＰＬＡ₂移動度シフトは、共に、ＰＧＩ₂合成よりも迅速 に生じ、ＰＧＩ₂の増加した産生が、少なくとも一部分、増加したｃＰＬＡ₂活性 および構成酵素ＣＯＸ−１に対する基質である細胞内アラキドン酸の利用性の次 なる増加の直接的結果であると思われるという見解と一致する。ＶＥＧＦは、ホ スホリパーゼＣ−ｇチロシンリン酸化およびホスホイノシチド代謝を刺激するこ とが知られているので、ホスホリパーゼＣ−ｇ（および／または、ホスホリパー ゼＤ）およびジアシル−およびモノアシルグリセロールリパーゼの続発性作用を 含む他のメカニズムは、ＰＧＩ₂合成のＶＥＧＦ誘発アラキドン酸代謝に機用す ることは完全にもっともらしい。 ＶＥＧＦ関連因子、ＰｌＧＦ、Ｆｌｔ−１に対して特異的なリガンドがＰＧＩ₂ の発生を刺激するかを研究した。結果は、ＰｌＧＦがＰＧＩ₂合成のを誘発する ことができるが、ＶＥＧＦよりも弱いことを示唆した。ＰｌＧＦの有意な効果は 、アラキドン酸放出またはｃＰＬＡ₂移動度シフトについて全く検出されなかっ た。ＰｌＧＦは、Ｆｌｔ−１ ＶＥＧＦ受容体にのみ抗結合性を伴って結合する ので、これらの結果は、ＨＵＶＥＣ中でのＶＥＧＦによるＰＧＩ₂産生の刺激が ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体により主に媒介され、Ｆｌｔ−１がこの経路の刺激に 対して寄与することもあるという結論とほとんど一致する。しかしながら、Ｆｌ ｔ−１媒介ＰＧＩ₂合成は、ｃＰＬＡ₂リン酸化よりもメカニズムを含むことは明 らかである。少なくとも２つの説明は、Ｐｌｇｆに対する比較的低い応答を説明 する。Ｆｌｔ−１は、弱い応答を誘発するか、および／または、Ｆｌｔ−１は、 ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１よりも低いレベルで存在する。 ここで示した結果は、ＶＥＧＦが時間および濃度依存性方法でｖＷＦの分泌を 誘発したことを示す。ｖＷＦ分泌に対するＶＥＧＦの効果についての濃度依存性 は、 ＰＧＩ₂合成およびアラキドン酸移動についてと厳密に一致している。ＰＧＩ₂合 成に対するＰｌＧＦの比較的弱い効果とは対照的に、ＰｌＧＦは、ＨＵＶＥＣに よるｖＷＦ放出の検出可能な増加を刺激しなかった。 ＶＥＧＦがｃＰＬＡ₂の電気泳動移動度の迅速なシフトを生じるという知見は 、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰキナーゼの増加したリン酸化および結果としての活性 化と一致する。これは、血小板中でｃＰＬＡ₂リン酸化および活性化を刺激する ことが知られているトロンビンがＨＵＶＥＣ中でのｃＰＬＡ₂移動度の同様のシ フトを生じたというここで示された知見により支持される。ここで示された結果 は、ＶＥＧＦがｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰキナーゼを活性化し、ＭＡＰキナーゼキ ナーゼの選択的阻害物質であるＰＤ９８０５９によるこの経路の阻害がＰＧＩ₂ 産生およびＶＥＧＦにより誘発されたｃＰＬＡ₂の増加したゲル遅延をブロック することも示す。ＰＤ９８０５９の効果は、ＶＥＧＦＤまたはトロンビンのいず れかにより刺激されるｖＷＦ分泌に対して効果を及ぼさないので、少なくとも部 分的に、選択的であった。ＶＥＧＦの著しい効果と対照的に、ＰｌＧＦは、ＭＡ Ｐキナーゼ活性を有意には増加させなかった。ＰｌＧＦのＭＡＰキナーゼ活性を 刺激する能力が明らかにないことは、概して、ＶＥＧＦと比較してＰＧＩ₂産生 に対するこの因子の非常に弱い効果およびｃＰＬＡ₂ゲル遅延を促進する能力が 明らかにないことと一致する。 ＨＵＶＥＣにおけるＰＧＩ₂産生のアッセイは、合成の有意な基底レベルの存 在を示した。おもしろいことには、ＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害物質はまた、刺 激を受けていない細胞である対照におけるＰＧＩ₂産生を完全に破壊した。ＭＡ Ｐキナーゼカスケードの活性化を介するＰＧＩ₂発生の媒介と一致して、ＰＤ９ ８０５９はまた、対照レベル以下にｃＰＬＡ₂の遅移動性リン酸化形態のレベル を低下させ、対照レベル以上に速移動性のあまりリン酸化されていない形態のレ ベルを増加させた。ＭＡＰキナーゼ活性のアッセイは、ＰＤ９８０５９により阻 害可能であった基底活性の有意なレベルを示唆した₂これらの知見は、ＭＡＰキ ナーゼ活性がＶＥＧＦおよびトロンビン依存性ｃＰＬＡ。活性化に起因するだけ ではなく、基底ＭＡＰキナーゼ活性が構成ｃＰＬＡ₂活性およびＰＧＩ₂産生の維 持を必要とすることを示唆する。 他のシグナル発生メカニズムは、細胞内[Ｃａ²⁺]の上昇を含む、ＰＧＩ₂合成 およびアラキドン酸放出のＶＥＧＦ刺激に寄与することがもつともらしく思われ る。 ＶＥＧＦは、現在まで、主に、内皮細胞成長および移動を促進する血管形成因 子に関係付けられてきた。ここで示した知見は、さらなる活性を明らかし、した がって、内皮機能の調節およびＶＥＧＦの機能の理解の両方に、ならびに狭窄、 再狭窄、アテローム性動脈硬化症および高血圧症などの血管障害の治療および予 防に重要に関係している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 37/50 Ａ６１Ｐ 9/00 37/24 (31)優先権主張番号 ９７１７７９１．９ (32)優先日 平成９年８月21日(1997．8．21) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ユレ―ヘルットゥアラ，セッポ フィンランド、エフイーエン―70211クオ ピオ、ペー・オー・ボックス1627、アー・ イー・ビルタネン・インスティテュート、 ユニバーシティ・オブ・クオピオ (72)発明者 バーカー，スティーブン・ジョージ・エド ワード イギリス、ダブリュー１エヌ・８エイエ イ、ロンドン、モーティマー・ストリー ト、ザ・ミドルセックス・ホスピタル、サ ー・ジュールズ・ソーン・ビルディング、 デパートメント・オブ・サージェリー、 ザ・バスキュラー・ユニット

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血管内膜過形成の治療薬または予防薬の製造のための、ＮＯまたはプロス タサイクリン産生を刺激する薬剤の使用。 ２．血管が動脈である請求項１記載の使用。 ３．外科的手術により誘発されたかまたは肺動脈高血圧症に伴う狭窄の治療ま たは予防のための請求項１または２の使用。 ４．外科的手術が血管形成術、冠状動脈バイパス手術、外科手術的吻合または 動脈内膜切除術である請求項３記載の使用。 ５．血管の狭窄または再狭窄の治療または予防のための、請求項１〜４のいず れか１項記載の使用。 ６．薬剤が一酸化窒素シンターゼ、ＶＥＧＦを結合する受容体のアゴニスト、 または、該シンターゼもしくはアゴニストをコードする核酸である請求項１〜５ のいずれか１項記載の使用。 ７．薬剤がヒトＶＥＧＦの機能を有するタンパク質または該タンパク質をコー ドする核酸である請求項１〜６のいずれか１項記載の使用。 ８．タンパク質が配列番号２、４、６または８の配列またはその活性フラグメ ントを有する請求項７記載の使用。 ９．薬剤がウイルスまたは非ウイルスベクターと結合した核酸である請求項６ 〜８のいずれか１項記載の使用。 １０．治療または予防されるべき過形成部位またはその付近に設置されるのに 適しており、請求項１〜９のいずれか１項記載の薬剤を含有することを特徴とす る治療用移植片。 １１．シラスティック移植片または生分解性移植片である請求項１０記載の移 植片。 １２．治療または予防されるべき過形成部位またはその付近の血管の周囲に設 置するためのカラーの形態である請求項１０または１１記載の移植片。 １３．含有される薬剤に対して実質的に不透過性の外壁を有する請求項１０〜 １ ２のいずれか１項記載の移植片。 １４．イン・ビボでの一酸化窒素（ＮＯ）および／またはプロスタサイクリン 産生の刺激により治療または予防できる症状の治療薬の製造のための、請求項６ 〜９のいずれか１項記載の薬剤の使用。 １５．症状が高血圧症、例えば、本態性高血圧症、肺動脈高血圧症または肺性 心である請求項１４記載の使用。 １６．血管の周囲にシールを設けるのに適合した本体からなる患者の血管への 治療薬デリバリー用装置であって、該治療薬が使用時に該治療薬を血管の外膜表 面と接触させるように装置内に保持されているかまたは装置と連結していること を特徴とする装置。 １７．本体壁と血管外膜表面との間にリザーバーを画定しており、該リザーバ ーに、送られるべき薬剤を含有してなる医薬製剤が少なくとも部分充填されてい る請求項１６記載の装置。 １８．製剤がリザーバー中に注入可能な液体もしくはゲルまたはペーストの形 態である請求項１７記載の装置。 １９．本体部の物質がセルフシール性である請求項１８記載の装置。 ２０．リザーバーが液体１０mlで、好ましくは、少なくとも２−５mlを含有す ることができる請求項１７〜１９のいずれか１項記載の装置。 ２１．本体物質の厚さがその長さに沿って概略一定であり、リザーバーが、使 用時に、血管に対してシールする離間部間での第１本体部の膨張により形成され る請求項１７〜２０のいずれか１項記載の装置。 ２２．本体物質の厚さが血管に対してシールする離間シーリング部よりも中間 部において薄く、薄くなった厚みがリザーバーを形成する、請求項１７〜２０の いずれか１項記載の装置。 ２３．本体の内面が、薬剤を含有してなる医薬製剤を含浸する能力を有するス ポンジ状物質からなる請求項１６〜２２のいずれか１項記載の装置。 ２４．本体の内面が薬剤を含有してなる医薬製剤を含浸している請求項１６〜 ２２のいずれか１項記載の装置。 ２５．本体の物質が生分解性である請求項１６〜２４のいずれ１項記載の装置 。 ２６．該物質がゼラチン、アルギナートまたはコラーゲンである請求項２５記 載の装置。 ２７．本体が成形または押出される請求項１６〜２６のいずれか１項記載の装 置。 ２８．本体が拍動性血流により生じた血管の膨張を受け入れることができる可 撓性シール部を含んでなる請求項１６〜２７いずれか１項記載の装置。 ２９．本体が長さ８−１５mmの細長いシール部を含んでなる請求項１６〜２８ のいずれか１項記載の装置。 ３０．本体が略管状である請求項１６〜２９のいずれか１項記載の装置。 ３１．本体が枝分かれして略Ｙ字形または略Ｔ字形の本体を形成する２つの略 管状部を有する請求項１６〜２９のいずれか１項記載の装置。 ３２．本体が少なくとも使用時に枝分かれして略Ｘ字形本体を形成する３つの 略管状部を有する請求項１６〜２９のいずれか１項記載の装置。 ３３．１つの本体部の、その縦方向に対する横断面が略弓形であり、これによ り、血管が組織中に部分包埋されている場合に第１血管の露出部分をそれで取り 巻くことができ、第１本体部の縦方向に伸びている縁部が使用時に第１血管の外 膜壁または隣接組織にシールされるように配置される請求項３１または３２記載 の装置。 ３４．本体が血管上へのその設置を容易にするために縦スリットを有する請求 項１６〜３３のいずれか１項記載の装置。 ３５．本体が捩り強さを増大させるために内層または螺旋状強化剤を含む請求 項１６〜３４のいずれか１項記載の装置。 ３６．血管の周囲に請求項１６〜３５のいずれか１項記載の装置を設置し、薬 剤が装置中に未だない場合には、薬剤を装置に導入することを特徴とする請求項 １〜１０のいずれか１項記載の薬剤を血管へ送るための方法。