PL189744B1 - Zastosowanie środka będącego białkiem VEGF oraz wszczep do stosowania leczniczego - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie srodka bedacego bialkiem VEGF majacym zdolnosc proliferacji in vi- tro i/lub in vivo komórek sródblonka albo kwasem nukleinowym kodujacym to bialko do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki rozrostu blony wewnetrznej naczynia krwio- nosnego, którego sródblonek jest calkowicie lub w znacznej czesci nieuszkodzony. 10. Wszczep do stosowania leczniczego przystosowany do umieszczenia w miejscu lub w poblizu miejsca rozrostu, które sie leczy lub któremu sie zapobiega, gdzie sródblonek jest calkowicie lub w znacznej czesci nieuszkodzony, znamienny tym, ze zawiera srodek zdefiniowany w zastrz. 1. P L 189744 B 1 PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie środka będącego białkiem VEGF oraz wszczep Zo stosowania leczniczego.

Rozrost błony wewnętrznej naczyń stanowi zwiększanie liczby komórek pomiędzy śnódałenkiem i wewnętrzną elastyczną warstewką, naczynia krwionośnego, szczególnie w znajdującej się tam błonie wewnętrznej, lub w tętnicy. Rozrost błony wewnętrznej naczyń

189 744 jest często powodowany proliferacją komórek mięśni gładkich (SMC) w ściance naczynia krwionośnego.

Gdy zachodzi rozrost błony wewnętrznej naczyń może zajść de novo zgrubianie błony wewnętrznej lub ścianki naczynia, to jest jego zwężenie. Tak więc naczynie krwionośne może ulec zamknięciu.

Także po usunięciu zaczopowania w naczyniu krwionośnym rozrost błony wewnętrznej naczyń zachodzący po zabiegu chirurgicznym może prowadzić do ponownego zaczopowania tętnicy. Jest to znane jako nawrót zwężenia.

Proliferacja komórek mięśni gładkich tętnic zachodzi zwykle gdy naczynie krwionośne, np. tętnica, zostanie zdeformowane lub zaburzone podczas zabiegu chirurgicznego. Przykładowo rozrost błony wewnętrznej naczyń może prowadzić do de novo zwężenia po wszczepieniu połączeń omijających, w których żyła jest zespalana z tętnicą, oraz po chirurgicznym zespoleniu w ogólności. Dwoma przykładami chirurgicznych procedur, które mogą spowodować zwężenie, są wszczepienie wieńcowych połączeń omijających i ponadkolanowe wszczepienie tętniczego połączenia omijającego udowo-podkolanowego.

Podobnie, nawrót zwężenia może zachodzić po balonowej angioplastyce stosowanej do usuwania zaczopowania w naczyniach krwionośnych, np. w przypadkach angioplastyki z użyciem cewnika z balonikiem.

Rozrost błony wewnętrznej naczyń, bez względu na to, czy prowadzi do zwężenia, czy nawrotu zwężenia, pozostaje głównym problemem po różnych operacjach chirurgicznych.

Miażdżyca tętnic w układzie sercowo-naczyniowym jest główną przyczyną śmierci w Europie i Ameryce Północnej i powoduje znaczącą zachorowalność wskutek zaczopowania światła tętnic, uniemożliwiającego lub zmniejszającego przepływ krwi, zakrzepicy nałożonej na płytki miażdżycowe, z możliwą dystalną embolizacją, osłabieniem ścianek tętnic, prowadzącym do tętniakowego rozszerzenia i w końcu pęknięcia. W zależności od miejsca i rozkładu choroby istnieje kilka możliwości leczenia, przy czym wszczepienie tętniczego połączenia omijającego jest najpospolitszą interwencją chirurgiczną. Przy chorobie wieńcowej stało się ono obecnie najpospolitszym zabiegiem chirurgicznym ze wszystkich w Stanach Zjednoczonych z >200000 operacjami przeprowadzanymi corocznie od 1990 r. i >20000 operacjami przeprowadzanymi corocznie w Wielkiej Brytanii. W przypadku naczyń aortalnych, nerkowych, krezkowych i obwodowych liczba chirurgicznych zabiegów wytwarzania przepływu omijającego wciąż wzrasta, z częstością operacji w Stanach Zjednoczonych i Europie 35 - 70 na 100000 osób. Łącznie, liczba chirurgicznych zabiegów wytwarzania przepływu omijającego przeprowadzonych corocznie zbliża się do miliona.

W pierwszych 24 miesiącach po zabiegu chirurgicznym znacząca liczba tętniczych wszczepionych połączeń omijających zawodzi (zostaje zaczopowana). Podawane liczby wahają się od 20% do 30%. Oznacza to, że dla wszystkich procedur przepływu omijającego w przypadku tętnic sercowych i obwodowych przeprowadzanych corocznie w Wielkiej Brytanii (około 25000 - 30000), pomiędzy 6000 i 7000 może się okazać nieudanymi w okresie dwu lat. Stopień zawodności powtarzanych zabiegów jest jeszcze wyższy. Tak duże są koszty nieudanych operacji, że w Stanach Zjednoczonych obliczono, iż nawet niewielki spadek liczby nieudanych operacji naczyń wieńcowych, z 33% do 25%, może oszczędzić do 750 milionów dolarów z budżetu ochrony zdrowia.

Istnieją trzy główne powody odrzucania przeszczepów w okresie 5 lat od zabiegu chirurgicznego. Pierwszy pojawia się zwykle wcześnie, w czasie 30 dni od operacji (<5%), i reprezentuje błąd techniczny (np. słabą technikę zespalania). Późniejsze niepowodzenia, po 24 miesiącach, są zwykle wynikiem postępów początkowego procesu miażdżycowego. Jednakże właśnie te przeszczepy, które ulegają zaczopowaniu pomiędzy pierwszym i 24 miesiącem, stanowią większość niepowodzeń (<70%). W tych przypadkach rozrost komórek mięśni gładkich błony wewnętrznej naczyń jest odpowiedzialny za postępujące zwężanie, to jest stenozę, światła tętnic, powodujące na koniec całkowite zaczopowanie. Typowo rozrost komórek mięśni gładkich błony wewnętrznej naczyń umiejscawia się wokół dystalnego tętniczego zespolenia i ścianki rodzimego naczynia przeciwnej do zespolenia. Tak więc pierwotna patologia w tym miejscu, a nie nawrót zwężenia w miejscu poprzedniego rozrostu błony wewnętrz4

189 744 nej naczyń, może zajść po angioplastyce. Rozrost komórek mięśni gładkich błony wewnętrznej naczyń może zachodzić w bliższym zespoleniu tętniczym i wzdłuż samego przeszczepu.

Nawrót zwężenia po angioplastyce może prowadzić do jeszcze większej liczby niepowodzeń, od 20 do 50% w pierwszych 6 miesiącach po angioplastyce. Zwężenie i nawrót zwężenia pozostają głównymi problemami po zabiegu chirurgicznym.

Do dziś przetestowano liczne sposoby leczenia lub profilaktyki rozrostu błony wewnętrznej naczyń, lecz żaden nie był klinicznie zadowalający.

Czynnik wzrostowy śródbłonka naczyń (VEGF) jest naturalnie występującym białkiem. U ludzi występują co najmniej cztery formy, mające 121, 165, 189 i 206 aminokwasów. Sekwencje cDNA i aminokwasowe czterech postaci ludzkiego VEGF podają Houck i inni w Molecular Endocrinology (1991), tom 5, nr 12, str. 1806-1814. Podano także częściową sekwencję genomową. Sekwencję cDNA ludzkiego VEGF podali także Leung i inni w Science (1989) 246:1306-1309, wraz z sekwencją cDNA bydlęcego VEGF.

Te cztery postaci są określane w opisie jako VEGF-121, VEGF-165, VEGF-189 i VEGF-206. Należy rozumieć, że ta numeracja odnosi się w każdym przypadku do liczby aminokwasów w dojrzałym białku. Translatowane białko obejmuje także 26 aminokwasów wstępnej sekwencji, która, w naturze, jest odcinana podczas przetwarzania wewnątrzkomórkowego.

Wiadomo, że VEGF odgrywa rolę w angiogenezie, gdzie pobudza dzielenie naczyniowych komórek śródbłonka (EC), zwiększa przepuszczalność śródbłonka i działa jako śródbłonkowy „czynnik przeżycia” w naczyniach siatkówki. Przykładowo VEGF w postaci zrekombinowanego białka lub przy ekspresji z plazmidu może indukować rozwój nowych naczyń krwionośnych, gdy wstrzykuje się go dotętniczo do niedokrwionycn członków. Ta właściwość doprowadziła do jego stosowania w naprawie tętnic, których śródbłonki zostały uszkodzone podczas zabiegu chirurgicznego. Tak więc Asahara i inni w Circulation (1995) 91: 2793, podawali VEGF, przez cewnik, do wnętrza tętnic szyjnych szczurów po angioplastyce, która odsłoniła śródbłonek tętnicy. Stwierdzono, że VEGF pobudzał odtwarzanie śródbłonka tętnicy, co z kolei przyczyniało się do hamowania rozrostu błony wewnętrznej naczyń.

W publikacji WO-A-9013649 ujawniono białko i gen VEGF oraz zaproponowano ich zastosowanie do leczenia urazu nabłonka naczyń, wrzodów cukrzycowych i ran naczyń krwionośnych. W publikacji WO-A-9102058 opisano fragmenty VEGF oraz ich zastosowanie w angiogenezie i odtwarzaniu śródbłonka wewnętrznych powierzchni naczyń, np. w leczeniu wrzodów.

W GB-A-2298577 ujawniono nieściskającą, porowatą, zewnętrzną rurkę do tętniczo-żylnych zabiegów wszczepiania połączeń omijających. Ta rurka korzystnie wpływa na wielkość światła oraz pogrubianie mięśniówki i błony wewnętrznej.

W publikacji WO-A-9423668 ujawniono urządzenie do miejscowego podawania środka do naczynia krwionośnego, w którego skład wchodzi zbiomik utworzony między jego dwoma elementami. Jego zastosowanie wymaga wszczepienia, to jest rozcięcia naczynia i przymocowania urządzenia do ścianek naczynia. Urządzenie jest częściowo porowate. Zbiomik bezpośrednio styka się z przepływem krwi w świetle. Wprowadza to ryzyko infekcji.

W US-A-3797485 ujawniono urządzenie do dostarczania leku na przydankową powierzchnię naczynia krwionośnego. Ma ono stałe ścianki i przezskóme rurki do dostarczania leku w postaci cieczy. Celem było to, że lek powinien przemieszczać się w inne miejsce.

Niniejszy wynalazek ma na celu leczenie i/lub profilaktykę wszystkich opisanych powyżej stanów, w stopniu, w jakim powstają one wskutek rozrostu błony wewnętrznej naczyń. Nieoczekiwanie ustalono właściwości VFGF wskayniacp na to żp rnotna oo ctoeować wtZS- — ~ 1---- c -Iz- · — Ζ.ΧΖ . . zSzZZ«.Z ZZM W » O W T « Z»ciw rozrostom błony wewnętrznej naczyń na różne sposoby.

Umieszczono kołnierz wokół zewnętrznej strony tętnicy królika. Ta procedura zwykle powoduje rozrost błony wewnętrznej naczyń w tętnicy królika i prowadzi do pogrubienia ścianki tętnicy, co jest podobne do zwężenia mogącego zajść w ludzkich tętnicach po operacjach wytworzenia przepływu omijającego. Gdy kołnierza użyto do dostarczania DNa kodującego VEGF do ścianki tętnicy z użyciem wektora plazmid/liposom, gen VEGF ulegał nadekspresji w ściance tętnicy, w tym w warstwie śródbłonka. Rozrost błony wewnętrznej naczyń

189 744 został zahamowany. Stwierdzono, że kołnierz przydankowy jest odpowiedni do tętniczego przenoszenia genu dla wszystkich badanych układów dostarczania genów.

Pokazuje to, że VEGF, poza pobudzaniem odtwarzania śródbłonka w przypadkach, gdy śródbłonek jest uszkodzony, jest w stanie tłumić rozrost błony wewnętrznej naczyń w sytuacjach, gdy rozrost błony wewnętrznej naczyń pojawia się, jeśli śródbłonek jest w całości lub częściowo nieuszkodzonych. Tak więc jest potencjalnie przydatny nie tylko w tłumieniu nawrotu zwężenia po angioplastyce, ale również w profilaktyce lub leczeniu de novo zwężenia w innych sytuacjach chirurgicznych. Istnieje więc kontrast pomiędzy nowymi odkryciami i dotychczasowymi odkryciami gdyż stwierdzono, że VEGF pobudza ponowny wzrost lub uzdrawianie śródbłonka. Możliwe, że nowe odkrycia wynikają z różnego mechanizmu działania VEGF.

Ponadto nowe odkrycia wskazują, że skuteczne środki można dostarczać na zewnątrz naczynia krwionośnego, w celu leczenia rozrostu błony wewnętrznej naczyń. Osiąga się w ten sposób kilka korzyści. W szczególności środek leczniczy nie jest wymywany z miejsca rozrostu przez strumień krwi, jak przy dostarczaniu do światłą. Zbiomik dostarczający może być utrzymywany wokół naczynia krwionośnego i nie ma potrzeby żadnych manipulacji w świetle naczynia, które uszkadzają śródbłonek naczynia krwionośnego (i mogą same powodować rozrost błony wewnętrznej naczyń).

W szczególności korzystne są środki do przeciwdziałania rozrostowi komórek mięśni gładkich błony wewnętrznej, do stosowania bezpośrednio na przydankową powierzchnię ścianki tętnicy (to jest najbliżej tych komórek w zewnętrznej mięśniówce). Dowolny stosowany środek można umieścić konkretnie w miejscach, w których może najłatwiej rozwinąć się zmiana rozrostowa błony wewnętrznej, ponieważ te miejsca są łatwo odsłaniane podczas operacji.

VEGF mediuje swoje znane działanie poprzez specyficzne wysokiego powinowactwa receptory kinazy tyrozynowej flk-1/KDR i flt-1, eksprymowane tylko na EC i monocytach. Bez powoływania się na teorię uważa się za możliwe, że wpływ VEGF na hamowanie rozrostu jest także pośredniczony przez te same receptory. W związku z tym wynalazek rozciąga się także na zastosowanie innych agonistów receptorów, z którymi wiąże się VEGF, lub innych substancji mających taki sam mechanizm działania, w leczeniu lub profilaktyce rozrostu błony wewnętrznej naczyń. Specyficzne rozmieszczenie receptorów VEGF także jest zaletą VEGF w porównaniu z wieloma innymi czynnikami wzrostowymi i cytokinami proponowanymi do leczenia pogrubiania błony wewnętrznej; działanie VEGF jest bardziej specyficzne względem EC, ponieważ w nieobecności monocytów, receptory VEGF wysokiego powinowactwa w ściance tętnicy są eksprymowane tylko na EC.

Stwierdzono np., że mechanizm hamowania przez VEGF rozrostu błony wewnętrznej w sytuacjach gdy śródbłonek jest w całości lub w części nieuszkodzony, zachodzi co najmniej częściowo poprzez szlak tlenku azotu (NO), gdyż podawanie inhibitora syntezy NO, L-NAME, przeciwdziała wpływowi VEGF na rozrost błony wewnętrznej naczyń w modelu kołnierza opisanym powyżej. Tak więc VEGF pobudza wytwarzanie NO.

Jest także możliwe, że VEGF ma inne działanie biologiczne, które przyczynia się do hamowania przezeń rozrostu błony wewnętrznej. W szczególności stwierdzono, że nadekspresja VEGF pobudza wytwarzanie prostacykliny, uaktywnianie cytozolowej fosfolipazy At. i wydzielanie czynnika von Willebranda przez EC. Być może pobudzanie przez VEGF wytwarzania NO i wytwarzania prostacykliny działają wspólnie hamując rozrost błony wewnętrznej naczyń.

Zatem przedmiotem wynalazku jest zastosowanie środka będącego białkiem VEGF mającym zdolność proliferacji in vitro i/lub in vivo komórek śródbłonka albo kwasem nukleinowym kodującym to białko do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki rozrostu błony wewnętrznej naczynia krwionośnego, którego śródbłonek jest całkowicie lub w znacznej części nieuszkodzony.

Korzystnie zgodnie z wynalazkiem naczynie krwionośne stanowi tętnica.

Korzystne jest zastosowanie środka będącego białkiem VEGF mającym zdolność proliferacji in vitro i/lub in vivo komórek śródbłonka albo kwasem nukleinowym kodującym to białko do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zwężenia spowodowanego przez zabieg chirurgiczny lub związanego z nadciśnieniem w tętnicy płucnej, a zwłaszcza przez zabieg

189 744 chirurgiczny, którym jest angioplastyka, chirurgiczny zabieg wytworzenia wieńcowego przepływu omijającego, chirurgiczne zespolenie lub endarterektomia.

Korzystne jest zastosowanie środka będącego białkiem VEGF mającym zdolność proliferacji in vitro i/lub in vivo komórek śródbłonka albo kwasem nukleinowym kodującym to białko do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zwężenia naczynia krwionośnego.

Korzystne jest zastosowanie środka będącego białkiem VEGF mającym zdolność proliferacji in vitro i/lub in vivo komórek śródbłonka albo kwasem nukleinowym kodującym to białko do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki nawrotu zwężenia naczynia krwionośnego.

Korzystnie białko ma sekwencję SEQ ID NO.: 2, 4, 6 lub 8, albo jej aktywny fragment.

Korzystnie środkiem jest kwas nukleinowy w połączeniu z wektorem wirusowym lub niewirusowym.

Korzystne jest zastosowanie środka będącego białkiem VEGF mającym zdolność proliferacji in vitro i/lub in vivo komórek śródbłonka albo kwasem nukleinowym kodującym to białko, z dostarczaniem środka do naczynia krwionośnego pacjenta w korpusie przystosowanym do szczelnego przylegania do naczynia, w którym to korpusie ten środek jest utrzymywany wewnątrz tego korpusu lub jest związany z tym korpusem tak, że podczas stosowania ten środek styka się z przydankową powierzchnią naczynia.

Wynalazek dotyczy ponadto wszczepu do stosowania leczniczego przystosowanego do umieszczenia w miejscu lub w pobliżu miejsca rozrostu, które się leczy lub któremu się zapobiega, gdzie śródbłonek jest całkowicie lub w znacznej części nieuszkodzony, którego cechą jest to, że zawiera powyżej zdefiniowany środek.

Korzystnie wszczep według wynalazku jest silastikowym lub biodegradowalnym wszczepem.

Korzystnie wszczep według wynalazku ma postać kołnierza do umieszczania wokół naczynia krwionośnego w miejscu lub w pobliżu miejsca rozrostu, które się leczy lub któremu się zapobiega.

Korzystnie wszczep według wynalazku ma zewnętrzną ściankę zasadniczo nieprzepuszczalną dla zawartego w nim środka.

Jak sugerowano powyżej i pokazano w przykładach, różne środki, w tym syntaza tlenku azotu i kodujący ją kwas nukleinowy, są przydatne do stosowania zgodnie z wynalazkiem. Środek będzie często opisywany tutaj jako białko lub kwas nukleinowy VEGF, i takie odniesienia oraz odniesienia do samego VEGF, podano jedynie przykładowo. Można stosować dowolną postać VEGF opisaną powyżej dla celów wynalazku.

W opisie odniesienia do tych sekwencji białka VEGF należy rozumieć jako odniesienia do sekwencji zawierających presekwencję, jak i też sekwencji pozbawionych presekwencji. Białka VEGF z presekwencją i bez niej są przydatne w realizacji wynalazku. Podobnie, odniesienia do sekwencji kwasu nukleinowego (DNA i RNA) VEGF odnoszą się do sekwencji kodujących presekwencję i sekwencji nie kodujących presekwencji.

Należy zauważyć, że Houck i inni, powyżej, podają, że sekwencja VEGF-165 zawiera aminokwas, asparaginę (N lub Asn) w pozycji 141 (115 w notacji Houcka i innych, co odpowiada dojrzałemu białku). Houck i inni podają ten aminokwas jako lizynę (K lub Lys) w VEGF-121, VEGF-189 i VEGF-206, a sekwencja cDNA (VEGF-206) wymieniona przez Houcka i innych wspiera ten pogląd. Tak więc w wynalazku aminokwas w pozycji 141 może być asparaginą (N lub Asn) lub lizyną (Lys lub K). Każdy aminokwas jest kodowany przez odpowiedni trypletowy kodon w sekwencjach kwasu nukleinowego (dla DNA te kodony mogą oznaczać AAA lub aAg dla lizyny oraz AAT lub AAC dla asparaginy). Odnosi się to szczególnie do VEGF-165.

Cztery postacie są kodowane przez ten sam gen, lecz tworzone przez alternatywne składanie na poziomie RNA. Tak więc istnieje pełnej długości postać ludzkiego VEGF i trzy znane postacie skrócone. VEGF-121 i VEGF-165 są rozpuszczalne i ulegają wydzielaniu. Podobnie 26 aminokwasowa presekwencja jest hydrofobowa i może obniżać rozpuszczalność białka. Z tego względu postacie VEGF bez presekwencji są korzystne, gdyż można się spodziewać ich wyższej rozpuszczalności. Wszystkie postacie VEGF są przydatne w realizacji wynalazku, chociaż są korzystne postacie ulegające wydzielaniu. Białka VEGF przydatne w reali189 744 zacji wynalazku mogą także pochodzić od innych gatunków, chociaż ludzki VEGF jest korzystny. Przykładowo sklonowano mysi, króliczy i krowi VEGF, a ich sekwencje są dostępne.

Należy zauważyć, że VEGF-121, 165, 189 i 206 są także określane jako VEGF-120, 164, 188 i 205.

Białka i kwasy nukleinowe (DNA i RNA) VEGF są odpowiednimi środkami w realizacji wynalazku.

Gdy stosuje się białko VEGF, korzystne jest to białko VEGF mające sekwencję aminokwasową SEQ ID NO. 2 (VEGF-121), 4 (VEGF-165), 6 (VEGF-189) lub 8 (VEGF-206). Wydzielnicze postacie VEGF są korzystne, toteż VEGF-121 i VEGF-165 są szczególnie korzystne.

Korzystnie stosuje się DNA VEGF kodujący VEGF-121, VEGF-165, VEGF-189 lub VEGF-206, np. o SEQ ID NO. 1, 3, 5 lub 7. Korzystne są sekwencje DNA kodujące wydzielnicze postacie ludzkiego VEGF. Tak więc szczególnie korzystne są DNA SEQ ID No.: 1 i 3.

Jednak DNA i białka VEGF przydatne w realizacji wynalazku nie ograniczają się do tych konkretnych sekwencji. Można także stosować inne ściśle spokrewnione sekwencje DNA i białka.

Sekwencje DNA mogą być spokrewnione z SEQ ID NO.: 1, 3, 5 lub 7 na wiele sposobów. Przykładowo sekwencje DNA przydatne w realizacji wynalazku mogą być zdegenerowanymi sekwencjami kodującymi to samo białko, białko o SEQ ID NO.: 2, 4, 6 lub 8.

Alternatywnie, sekwencje DNA mogą być zasadniczo homologiczne z SEQ ID NO.: 1, 3, 5 lub 7 i kodować białko różniące się aminokwasową sekwencją od SEQ ID NO.: 2, 4, 6 lub 8, lecz mające aktywność VEGF. Zwykle sekwencje DNA do stosowania zgodnie z wynalazkiem wykazują co najmniej 70%, co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 95% lub co najmniej 99% homologii sekwencji z SEQ ID NO.: 1, 3, 5 lub 7.

Podobnie, sekwencje DNA VEGF do stosowania zgodnie z wynalazkiem mogą kodować fragmenty VEGF, które zachowują aktywność VEGF. Interesujące fragmenty zawierają np. od co najmniej 15 aminokwasów, np. do 40 lub większą liczbę aminokwasów^. Przykładami odpowiednich fragmentów są fragmenty o długości 20 aminokwasów, np. sekwencje 1-20, 11-30, 21-40, 31-50, 41-60, 51-70, 61-80, 71-90, 81-100, 91-110, 101-120, 111-130, 121-140, 131-150, 141-160, 151-170, 161-180, 171-190, 181-200, 191-210 i 196-215 aktywnego białka VEGF pokazanego jako SEQ ID NO.: 6.

Sekwencje DNA do stosowania zgodnie z wynalazkiem mogą być np. genomowymi DNA lub cDNA, albo hybrydami pomiędzy genomowym DNA i cDNA, bądź też mogą być syntetyczne lub półsyntetyczne. Mogą pochodzić z dowolnego gatunku, chociaż korzystne są DNA kodujące ludzki VEGF. Mogą być jednoniciowe lub dwuniciowe. Genomowe DNA kodujące białka o SEQ ID NO.: 2,4,6 i 8 są szczególnie korzystne.

Sekwencje DNA do stosowania zgodnie z wynalazkiem mogą się różnić od sekwencji pokazanych jako SEQ ID NO.: 1, 3, 5 lub 7 delecją, inserccąlub substytucjąjednego lub wielu nukleotydów, jeśli tylko kodują białko wykazujące aktywność VEGF. Podobnie, mogą być skrócone względem SEQ ID NO.: 1, 3, 5 lub 7 lub wydłużone o jeden lub większą liczbę nukleotydów, jeśli tylko kodują białko wykazujące aktywność VEGF.

Sekwencje RNA są także przydatne w realizacji wynalazku. W szczególności przedmiotem wynalazku jest zastosowanie sekwencji RNA odpowiadających SEQ ID NO.: 1, 3, 5 lub 7; są to korzystne sekwencje RNA. Można także stosować sekwencje RNA spokrewnione z tymi sekwencjami w dowolny sposób, opisany powyżej dla sekwencji DNA. Sekwencje RNA dla potrzeb wynalazku mogą być jednoniciowe lub dwuniciowe. RNA mogą być dowolnego pochodzenia, np. mogą pochodzić z dowolnych gatunków, chociaż RNA kodujące ludzki VEGF, szczególnie ludzki VEGF maiacv sekwencję nokazana jako SEO ID NO.: 2. 4. 6 lub 8

- >—' U u J u X c a * są korzystne. Można także stosować syntetyczne DNA, jak też półsyntetyczne RNA. Ponadto można stosować DNA transkrybowane z plazmidów bakteryjnych in vivo lub in vitro.

Fachowcy rozumieją, że w sekwencjach RNA przydatnych do stosowania zgodnie z wynalazkiem reszty T będą zastąpione przez U.

Białka VEGF do stosowania zgodnie z wynalazkiem są kodowane przez zdefiniowane powyżej sekwencje DNA lub RNA. Korzystnymi białkami są białka o sEq ID NO.: 2, 4, 6 i 8, chociaż wynalazek dotyczy także zastosowania innych białek o ściśle spokrewnionych sekwencjach, które różnią się od SEQ ID NO.: 2, 4, 6 lub 8, lecz wykazują aktywność VEGF.

189 744

Zgodnie z wynalazkiem, o ile odnosi się do leczenia lub profilaktyki rozrostu błony wewnętrznej naczyń, aktywność VEGF stanowi zdolność do całkowitego lub częściowego hamowania rozrostu lub zapobiegania rozrostowi błony wewnętrznej naczyń w naczyniu krwionośnym, szczególnie tętnicy. Białka, które różnią się nieznacznie sekwencją od naturalnie występującego VEGF, jak opisano powyżej, zachowują tę właściwość, chociaż niekoniecznie w tak dużym zakresie jak VEGF. Podobnie, takie białka mogą wykazywać silniejszą aktywność VEGF niż naturalnie występujący VEGF. To samo odnosi się do agonistów VEGF, np. peptydów, peptoidów lub innych małych cząsteczek.

O ile wynalazek dotyczy innych właściwości VEGF, aktywność VEGF jest zdolnością cząsteczek innych niż VEGF do reprodukowania tych właściwości. Przykładowo, w przypadku aktywności VEGF wobec związanych z NO stanów dla pobudzania wytwarzania NO, aktywność VEGF obejmuje zdolność do pobudzania wytwarzania NO. W przypadku aktywności VEGF wobec stanów związanych z prostacykliną, aktywność VEGF obejmuje zdolność do pobudzania wytwarzania prostacykliny. Białka VEGF przydatne w realizacji wynalazku także typowo wykazują jedną lub więcej biologicznych właściwości VEGF, które są już znane, takich jak zdolność do pobudzania namnażania EC w tętnicach ce aftro i/lub ce afao, albo zdolność do wiązania receptorów wiążących VEGF i aktywowania ich na sposób VEGF.

Białka VEGF przydatne w realizacji wynalazku mogą być zasadniczo homologiczne z VEGF o SEQ ID NO.: 2, 4, 6 lub 8, zazwyczaj co najmniej w 70%, co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 95%, lub co najmniej w 99% homologiczne.

Białka VEGF przydatne w realizacji wynalazku mogą różnić się od sekwencji pokazanej jako SEQ ID NO.: 2, 4, 6 lub 8, delecją, insercjąlub substytucją jednego lub większej liczby aminokwasów, jeśli tylko wykazują aktywność VEGF. Podobnie, mogą być skrócone o jeden lub większą liczbę aminokwasów względem SEQ ID NO.: 2, 4, 6 lub 8 lub wydłużone względem SEQ ID NO.: 2, 4, 6 lub 8 o jeden lub większą liczbę aminokwasów, jeśli tylko wykazują aktywność YEGE. Jeśli chodzi o substytucje, korzystne są substytucje konserwatywne. Typowo substytucje konserwatywne są substytucjami, w których podstawione aminokwasy mają podobny charakter do obecnego w naturalnie występujących VEGF, np. w kategoriach ładunku i/lub rozmiaru i/lub polamości i/lub hydrofobawości. Podobnie, konserwatywne substytucje typowo mają mały lub żaden wpływ na aktywność VEGF białka.

Białka VEGF do stosowania zgodnie z wynalazkiem, które różnią się sekwencją od naturalnie występującego VEGF, można skonstruować tak, aby różniły się aktywnością od naturalnie występującego VEGF. Można je np. skonstruować tak, aby wykazywały silniejszą aktywność VEGF. Takie manipulacje będą typowo prowadzone na poziomie kwasu nukleinowego z użyciem rekombinacyjnych technik znanych fachowcom.

Jako alternatywę do stosowania białka VEGF jak opisano powyżej, możliwe jest stosowanie agonisty VEGF. Dotyczy to wszystkich medycznych zastosowań opisanych tutaj, szczególnie leczenia miażdżycy tętnic.

Ogólnie, agonista VEGF oznacza cząsteczkę, która wiąże się z receptorem, z którym wiąże się VEGF i działa zasadniczo tak samo, prowadząc do aktywności VEGF, jak opisano tutaj. W szczególności, agonista może wiązać się z receptorami flk-1/KDR lub flt-1. Agonistami są więc agoniści VEGF i receptorów, z którymi wiąże się VEGF.

Agonista VEGF może mieć dowolną budowę chemiczną. Przykładowo agonista VEGF może być peptydem lub polipeptydem mającym np. do 10, do 20, do 50 lub do 100 aminokwasów. Agonista może być także zmodyfikowanym peptydem lub peptoidem. Można dokonać dowolnych odpowiednich modyfikacji, w tym glikozylacji, siarczanowania, amidowania COOH i acetylowania, np. N-końcowego acetylowania. Dodatkowo lub alternatywnie mogą być obecne zmodyfikowane aminokwasy i/lub L-aminokwasy.

Pewnymi korzystnymi agonistami są fragmenty VEGF, ewentualnie modyfikowane jak opisano powyżej, wykazujące aktywność VEGF. Jeden szczególnie korzystny agonistyczny fragment VEGF zawiera aminokwasy 1 do 20 (M...H) SEQ ID NO.: 4; ten peptyd opisano jako będący agonista receptora Flt-1 w ludzkich trofoblastach, Ahmed i in., Lab. Ieaest. (1997)76:779. ,

Dodatkowe spokrewnione związki agonistyczne można także otrzymać z N-końcowego regionu VEGF. Biorąc np. pod uwagę SEQ ID NO.: 4, peptydowy agonista VEGF może

189 744 obejmować koniec N VEGF (aminokwas nr 1) i mieć aminokwasową sekwencję VEGF do aminokwasu z zakresu 25 do 30, 30 do 40, 40 do 50 lub 50 do 100. Podobnie, korzystne związki agonistyczne można uzyskać z N-końcowego regionu VEGF, lecz obejmują one obciętą wersję końca N. Przykładowo zamiast rozpoczynać od aminokwasu nr 1 w SEQ ID NO.: 4, mogą się one zaczynać od aminokwasu nr 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub 10 z SEQ ID NO. : 4, i mieć sekwencję aminokwasową VEGF do aminokwasu z zakresu od 25 do 30, 30 do 40, 40 do 50 lub 50 do 100.

Peptydowe związki agonistyczne mogą także pochodzić z innych części sekwencji VEGF. Przykładowo kolejnym korzystnym agonistą peptydu jest peptyd złożony z aminokwasów 145 do 169 (R...P) sekwencja VEgF-189 z SeQ ID No.: 6.

Dodatkowe spokrewnione związki agonistyczne można także otrzymać z tego regionu VEGF. Przykładowo, w odniesieniu do SEQ ID NO.: 6, peptydowe związki agonistyczne VEGF mogą zawierać sekwencję aminokwasową VEGF od aminokwasu w regionie od 135 do 155 do aminokwasu w regionie od 160 do 180. Przykładowo peptydowe związki agonistyczne pochodzące z tego regionu mogą mieć sekwencję VEGF od aminokwasu w regionie od 135 do 140, 140 do 145 lub 145 do 150 do aminokwasu w regionie od 160 do 165, 165 do 170 lub 170 do 175.

Peptydowe fragmenty VEGF, jak zdefiniowano powyżej, korzystnie mają łączną długość od 10 do 20, 20 do 25, 25 do 30, 30 do 40 lub 40 do 50 aminokwasów.

Innymi korzystnymi agonistami są fragmenty białka Tat HIV. Białko Tat HIV naśladuje działanie agonistyczne VEGF i może pobudzać angiogenezę w komórkach śródbłonka, działając przez receptor Flk-1/KDR; patrz Albini i inni, Oncogene (1996) 12:289-297, oraz Nature Medicine (199G) 2(12): 1321-1375. Tak więc wykazano, że peptydy pochodzące z sekwencji Tat HIV-1, takie jak aminokwasy 46-60 białka Tat HIV, pobudzają wzrost i migrację komórek śródbłonka; patrz Albini i inni, Oncogene (1996) 12:289-297. Peptyd złożony z aminokwasów 41 do 65 białka Tat HIV-1 jest kolejnym korzystnym peptydowym agonistą do stosowania zgodnie z wynalazkiem.

Związki agonistyczne mogą także zawierać aminokwasowe sekwencje różniące się od sekwencji naturalnie występującego VEGF w dowolny sposób opisany powyżej dla białka VEGF, pod warunkiem, że zachowują właściwości agonistyczne.

Gdy agonistami są peptydy, mogą być generowane in vivo z kodujących je sekwencji kwasu nukleinowego, w celu przeprowadzenia terapii. Tak więc kodujące agonistę kwasy nukleinowe można dostarczać metodą terapii genowej, jak tutaj opisano.

Alternatywnie można stosować niepeptydowych agonistów VEGF. Można np. stosować małe cząsteczki naśladujące kształtem części VEGF oddziaływujące z jego receptorami.

W realizacji wynalazku VEGF, kwas nukleinowy kodujący VEGF lub agonistę VEGF lub kwas nukleinowy kodujący agonistę VEGF, można dostarczać do naczynia krwionośnego, korzystnie do tętnicy w dowolnej odpowiedniej postaci. Kwasy nukleinowe można dostarczać w postaci „nagiej”, nie związanej z wektorem, lub za pomocą wektora terapii genowej. Korzystne jest dostarczanie ich za pomocą dowolnego odpowiedniego wektora terapii genowej. W szczególności można stosować wektory wirusowe lub niewirusowe.

Do odpowiednich wektorów wirusowych należą adenowirusy, retrowirusy, pseudotypowe retrowirusy, wirusy opryszczki, wirusy krowianki i bakulowirusy. Do odpowiednich niewirusowych wektorów należą ollgonukleotydy, plazmidy, liposomy, liposomy kationowe, liposomy wrażliwe na pH, kompleksy liposom-białko, immunoliposomy, pochodne liposom-białko-polilizyna, emulsje woda-olej, polietylenoiminy i dendrymery. Do korzystnych wektorów należą retrowirusy pochodne wirusa mysiej białaczki Moloneya (MMLV), pseudotypowe retrowirusy zawierające białko-G wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G), adenowirusy, plazmidy i kompleksy plazmid/liposom.

Gdy jest to odpowiednie, można stosować łącznie dwa lub większą liczbę typów wektorów. Przykładowo wektor plazmidowy można stosować w połączeniu z liposomami. Do odpowiednich liposomów należą np. liposomy zawierające dioleoilofosfatydyloetanoloaminę (DOPE), 3-P-[N-(N',N'-dimetyloaminoetano)karbamoilo]cholesterol (DC-Chol), lub dodatnio naładowany lipid (N-[l-(2,3-dioleilloksy)propylo]-N,N,N-trietyloamoniowy (DOtMA).

189 744

Wirusowe wektory są korzystnie zablokowane, np. pozbawione zdolności replikacji. Oznacza to, że brak im jednego lub kilku funkcjonalnych genów koniecznych do ich replikacji, co zapobiega ich niekontrolowanemu namnażaniu in vivo i eliminuje niepożądane skutki uboczne infekcji wirusowej. Korzystnie usuwa się całość wirusowego genomu poza minimum genomowych elementów koniecznych do opakowania wirusowego genomu zawierającego kwas nukleinowy VEGF w wirusową otoczkę lub kapsyd. Przykładowo jest pożądane wycięcie całego genomu wirusowego poza Długimi Terminalnymi Powtórkami (LTR) i sygnał opakowywania. W przypadku adenowirusów, delecje typowo wykonuje się w regionie El i ewentualnie w jednym lub kilku regionach E2, E3 i/lub E4.

Wirusy można zablokować dowolnymi odpowiednimi technikami. Przykładowo genomowe delecje mogą obejmować pełne usunięcie genów koniecznych dla replikacji, albo tylko częściowe ich usunięcie. Pełne usunięcie jest korzystne. Ogólnie, korzystne delecje obejmują geny konieczne do wczesnej transkrypcji genów wirusowych.

Można także stosować kompetentne do replikacji samoograniczające się lub samoniszczące wektory wirusowe.

Ogólnie kwas nukleinowy VEGF do stosowania zgodnie z wynalazkiem będzie zawarty w konstrukcie ekspresji zapewniającym ich ekspresję in vivo po dostarczeniu do tętnicy, korzystnie za pomocą wektora określonego powyżej. Takie konstrukty zawierają zazwyczaj promotor zdolny do kierowania ekspresją kwasu nukleinowego VEGF (i ewentualnie regulator promotora), kodon startu translacji i operatywnie związany z promotorem kwas nukleinowy VEGF. Korzystnie, te składniki są to ułożone w orientacji 5'-3'.

Konstrukt może także zawierać dowolne inne odpowiednie składniki. Przykładowo konstrukt może zawierać kwas nukleinowy kodujący sekwencję sygnałową, umieszczony w takiej pozycji względem kwasu nukleinowego vEGF, że podczas translacji może kierować eksprymowane białko VEGF do danego typu komórki lub przedziału komórki. Dowolna taka sekwencja sygnałowa będzie typowo umieszczona w położeniu sąsiadującym 3' lub 5' względem kwasu nukleinowego VEGF, tak że sekwencja sygnałowa i białko VEGF są translatowane jako pojedyncze białko fuzyjne, z sekwencją sygnałową na końcu C lub N.

Konstrukt może także zawierać wzmacniacz, który wzmacnia stopień ekspresji zapewniany przez promotor. Można stosować dowolny wzmacniacz, który wzmacnia ekspresję zapewnianą przez wybrany promotor. Przykładowo w przypadku wczesnego promotora genu CMV można stosować wczesny wzmacniacz genu CMV.

Ewentualnie konstrukt może zawierać terminator transkrypcji 3' względem kwasu nukleinowego VEGF. Można stosować dowolny odpowiedni terminator.

Ewentualnie konstrukt może zawierać sygnał poliadenylacji operatywnie związany 3' względem kwasu nukleinowego VEGF.

Ewentualnie konstrukt może zawierać jeden lub większą liczbę selekcyjnych genów znacznikowych, np. oporności na antybiotyk, aby umożliwić selekcję transformowanych komórek w hodowli. Przykładowo komórki można selekcjonować kolejno na podstawie oporności na antybiotyki.

Ewentualnie konstrukt może zawierać jeden lub większą liczbę intronów, albo innych niekodujących sekwencji, np. 3' lub 5' względem kwasu nukleinowego VEGF.

Dowolny odpowiedni promotor można stosować do kontrolowania ekspresji kwasu nukleinowego. Ogólnie, korzystne jest stosowanie promotora wirusowego lub promotora przystosowanego tak, aby działał w gatunku leczonego pacjenta. Tak więc w przypadku człowieka jako pacjenta, korzystnie jest stosować promotory wirusowe, zwłaszcza promotory pochodzące z wirusów infekuiacvch ludzi, lub nromotorv Dochodzące z ludzkich genów Ewentualnie.

t, V 'i Ł V ' promotor można stosować w połączeniu z odpowiednim wzmacniaczem.

Pożądane jest stosowanie „mocnego” promotora, czyli promotora zapewniającego wysokie poziomy ekspresji białka VEGF według wynalazku. Pożądane są promotory dające nadekspresję białka VEGF. Korzystne promotory obejmują promotor cytomegalowirusa (CMV), ewentualnie w połączeniu ze wzmacniaczem CMV; ludzki promotor β-aktyny; wczesny promotor genu małpiego wirusa 40 (SV40); promotor wirusa mięsaka Rousa (RSV); oraz promotor retrowirusowy z długimi terminalnymi powtórkami (LTR).

189 744

Promotory i inne składniki konstruktu są operatywnie połączone z kwasem nukleinowym VEGF. Tak więc są one umieszczone w takiej kolejności, aby mogły wywierać wpływ na ekspresję kwasu nukleinowego VEGF. Przykładowo w przypadku promotora, promotor jest umieszczony względem kwasu nukleinowego VEGF tak, że może kierować ekspresją kwasu nukleinowego VEGF. Dogodnie składniki konstruktu są umieszczone w sposób zapewniający wywieranie przez nie maksymalnego wpływu na ekspresję.

Kwasy nukleinowe lub konstrukty stosowane zgodnie z wynalazkiem mogą być włączone w wirusowe genomy dowolnymi odpowiednimi sposobami znanymi fachowcom. Wirusowe genomy można następnie opakować w wirusowe otoczki lub kapsydy dowolnym odpowiednim sposobem. W szczególności można stosować dowolną odpowiednią linię komórek opakowujących do generowania wirusowych wektorów według wynalazku. Te linie opakowujące uzupełniają pozbawione zdolności do replikacji wirusowe genomy, gdyż zawierają, zazwyczaj wstawione w ich genomy, geny wycięte z genomu pozbawionego zdolności do replikacji. Tak więc zastosowanie linii opakowujących pozwala na generowanie wirusowych wektorów według wynalazku w hodowli. Odpowiednie linie opakowujące obejmują pochodne komórek PA3 17, komórek Ψ-2, komórek CRE, komórek cRiP, komórek E-86-GP, komórek Fly, linii komórek 293 i komórek 293GP.

W przypadku wektorów niewirusowych kwas nukleinowy można wstawiać w niewirusowe wektory dowolnymi odpowiednimi sposobami znanymi fachowcom.

W razie potrzeby wektory, zwłaszcza wektory wirusowe, można dobrać tak, aby uzyskać integrację kwasu nukleinowego lub konstruktu z genomem komórki leczonego pacjenta, lub pozostawić swobodny kwas nukleinowy lub konstrukt w cytoplazmie. Korzystne są wektory integracyjne.

Białka VEGF lub kwasy nukleinowe VEGF do stosowania zgodnie z wynalazkiem, korzystnie połączone z wektorem wirusowym lub niewirusowym, jak opisano powyżej, można podawać do tętnic w dowolny odpowiedni sposób w celu terapii rozrostu. Przykładowo VEGF lub kwas nukleinowy kodujący VEGF można podawać na zewnętrzną ściankę naczynia krwionośnego, np. tętnicy, lub do śródbłonka naczynia krwionośnego, np. śródbłonka tętnicy, np. przez jej światło. Lokalne przeniesienie genu będzie prawdopodobnie korzystniejsze od podawania zrekombinowanego białka VEGF, gdyż wstrzykiwane związki są szybko wypłukiwane przez przepływ krwi i wykazują krótki okres półtrwania we krwi.

Po dostarczeniu, kwasy nukleinowe VEGF ulegają ekspresji z wytworzeniem białka VEGF, co z kolei umożliwia leczenie lub profilaktykę rozrostu błony wewnętrznej naczyń. Ekspresja może zajść w dowolnym typie lub typach komórek w ściance naczynia krwionośnego, np. tętnicy.

Korzystnie, ekspresja zachodzi w takim miejscu, że eksprymowany VEGF może osiągnąć śródbłonek naczynia krwionośnego, np. tętnicy. Przykładowo ekspresja może zachodzić w komórkach mięśni gładkich i/lub w śródbłonku. Najkorzystniej ekspresja zachodzi co najmniej w śródbłonku naczynia krwionośnego, np. tętnicy.

Przykładowo białko lub kwas nukleinowy VEGF można dostarczać na stronę zewnętrzną naczynia krwionośnego, np. tętnicy, przez bezpośrednie wstrzykiwanie wokół miejsca rozrostu, gdzie prowadzi się leczenie lub profilaktykę, albo przez wstrzykiwanie w światło naczynia krwionośnego, np. tętnicy.

Korzystniej, białko lub kwas nukleinowy VEGF dostarcza się dzięki wszczepowi umieszczonemu na zewnątrz naczynia krwionośnego, np. tętnicy, w pobliżu leczonego miejsca rozrostu. Taki wszczep zawiera białko lub kwas nukleinowy VEGF albo wektor i stanowi zbiomik środka. Białko lub kwas nukleinowy VEGF (korzystnie w połączeniu z wektorem) można wprowadzać do wszczepu przed wprowadzeniem lub po wprowadzeniu wszczepu do organizmu leczonego pacjenta. Przykładowo wszczep może być umieszczony w sąsiedztwie naczynia krwionośnego, z późniejszym wprowadzaniem białka lub kwasu nukleinowego VEGF do wszczepu, np. przez wstrzykiwanie.

Korzystnie wszczep umieszcza się w bezpośrednim kontakcie z naczyniem krwionośnym, np. tętnicą. Jest to szczególnie korzystne, gdy do dostarczania kwasów nukleinowych VEGF stosuje się wektory retrowirusowe, gdyż fizyczne zniekształcenie naczynia krwionośnego może wywoływać namnażanie komórek mięśni gładkich, co zwiększa skuteczność

189 744 przenoszenia genu przez wektory retrowirusowe. Takie namnażanie, podobnie jak namnażanie wywołane przez sam rozrost, jest pokonywane lub co najmniej złagodzone przez dostarczanie białka lub kwasu nukleinowego VEGF. Podobnie korzystne jest, aby wszczep stykał się z tętnicą, w przypadku stosowania innych wektorów, które wykazują zwiększoną skuteczność przenoszenia genu, gdy ich docelowe komórki dzielą się. Przykładowo namnażanie komórki może także polepszyć skuteczność przenoszenia genu kompleksami plazmid/liposom.

Takie wszczepy mogą mieć dowolną odpowiednią, postać. Korzystnie wszczep jest w postaci kołnierza, który otacza, częściowo lub całkowicie, korzystnie całkowicie, tętnicę, w miejscu lub w pobliżu miejsca rozrostu, gdzie prowadzi się leczenie lub profilaktykę.

Pozanaczyniowe dostarczanie genu pozwala na uniknięcie takich zabiegów jak użycie cewnika z balonikiem lub stosowanie płynu pod wysokim ciśnieniem, co może prowadzić do uszkodzenia lub odsłonięcia śródbłonka. Transfekowane geny korzystnie stosuje się poprzez wszczep silastikowy lub biodegradowalny, korzystnie , kołnierz umieszczony przy, korzystnie wokół, zewnętrznej strony naczynia krwionośnego. Śródbłonek nie doznaje uszkodzeń lub doznaje niewielkich uszkodzeń. Jest to główna korzyść z tej postaci dostarczania.

Gdy zgodnie z wynalazkiem wektory stosuje się bezpośrednio na przydankową powierzchnię naczynia krwionośnego z użyciem kołnierza, zachowuje się ścisły kontakt z przydanką. W tętnicach królika sam kołnierz typowo prowadzi do utworzenia nowej błony wewnętrznej naczynia w ciągu 7-14 dni po operacji. Kołnierz zachowuje także wysokie stężenie wektora na powierzchni przydankowej.

Wszczepy, korzystnie kołnierze, można wytworzyć z dowolnego odpowiedniego materiału. Wszczepy silastikowe, to jest wszczepy z kauczuku silikonowego, stanowią jedno korzystne rozwiązanie. Najkorzystniejsze są wszczepy ulegające biodegradacji. Można stosować dowolny odpowiedni materiał substancję ulegający biodegradacji.

W implancie, np. kołnierzu, białko lub kwas nukleinowy VEGF może być zawarty w dowolny sposób. Korzystnie, struktura wszczepu, np. kołnierza, jest taka, że białko lub kwas nukleinowy VEGF są utrzymywane w bezpośrednim kontakcie ze ścianką naczynia krwionośnego. Tak więc, w jednej odmianie, struktura wszczepu pozostawia przestrzeń pomiędzy ścianką naczynia krwionośnego i ścianką wszczepu. W przypadku kołnierza, wszczep tworzy w ten sposób pusty pojemnik wokół naczynia krwionośnego. Do tej przestrzeni można wprowadzać kwasy nukleinowe lub białka VEGF, tak że znajdą się w kontakcie ze ścianką naczynia krwionośnego. Korzystnie skrajne części wszczepu znajdują się w kontakcie ze ścianką naczynia krwionośnego, co zapobiega ucieczce kwasu nukleinowego lub białka VEGF. Korzystnie, zewnętrzna ścianka kołnierza jest nieprzepuszczalna, lub zasadniczo nieprzepuszczalna dla kwasu nukleinowego lub białka VEGF, co zapobiega jego ucieczce lub co najmniej ogranicza jego ucieczkę do otaczającej tkanki i zapewnia jego dostarczanie do naczynia krwionośnego.

Ewentualnie przestrzeń zawierającą kwas nukleinowy lub białko VEGF można oddzielić od ścianki naczynia krwionośnego jedną lub kilkoma warstwami substancji przepuszczalnej lub półprzepuszczalnej dla VEGF lub kwasu nukleinowego. Może to być pożądane, jeśli celowe jest dostarczanie stopniowe i wskazane jest ograniczenie szybkości, z jaką białko lub kwas nukleinowy VEGF dostarcza się do ścianki naczynia krwionośnego.

Ewentualnie wszczep, np. kołnierz, może być skonstruowany tak, aby działać jak pompa osmotyczna.

Ewentualnie VEGF może być zawarty w środowisku we wnętrzu kołnierza, np. stałym lub żelowym środowisku. Może to pomóc w zapobieganiu ucieczce białka lub kwasu nukleinowego VEGF do tkanki. W tym przvnadku zewnętrzna ścianka kołnierza nie musi znajdo wać się w kontakcie z naczyniem krwionośnym na skraju wszczepu.

Alternatywnie kwasem nukleinowym lub białkiem VEGF można powlekać powierzchnię wszczepu, która znajduje się w kontakcie z naczyniem krwionośnym. Alternatywnie kwas nukleinowy lub białko VEGF można zdyspergować w strukturze wszczepu.

Do pewnych korzyści wynikających ze stosowania wszczepów w ten sposób, a zwłaszcza kołnierzy, należą: (i) wszczepy stanowią zbiomik dostarczający, pozwalający na przedłużone dostarczanie; (ii) nie są konieczne manipulacje w świetle, a śródbłonek tętnicy pozostaje

189 744 nietknięty; oraz (iii) zniekształcenie (np. zwężenie w przypadku kołnierza) powodowane przez wszczep może polepszyć skuteczność dostarczania genu, jak wyjaśniono powyżej.

Środek leczniczy można dostarczać do naczynia krwionośnego u pacjenta za pomocą specjalnego urządzenia. Urządzenie to ogólnie zawiera korpus obejmujący co najmniej pierwszą zasadniczo nieprzepuszczalną część korpusu, która jest ukształtowana tak, aby w użyciu rozciągać się na długość i co najmniej częściowo otaczać pierwsze naczynie krwionośne, przy czym pierwsza część korpusu obejmuje oddalone od siebie wzdłużnie części uszczelniające zapewniające podczas stosowania szczelny kontakt z przydankową powierzchnią pierwszego naczynia krwionośnego oraz część pośrednią pomiędzy częściami uszczelniającymi, która podczas stosowania jest przystosowana do magazynowania i dostarczania co najmniej jednego środka na przydankową powierzchnię pierwszego naczynia krwionośnego. Takie urządzenia mogą być biodegradowalne i nie wymagać trwałych przeskómych rurek zasilających.

Poniżej opisano korzystne odmiany urządzeń, tylko poprzez przykłady, w odniesieniu do załączonych rysunków, na których: fig. 1 przedstawia schematycznie urządzenie umieszczone wokół naczynia krwionośnego, w przekroju wzdłużnym; fig. 2 - schematycznie tę samą odmianę urządzenia w przekroju poprzecznym, wzdłuż linii A-A pokazanej na fig. 1; fig. 3 - schematycznie drugą odmianę urządzenia położonego wokół zespolenia końca z końcem, w widoku perspektywicznym; fig. 4 - odmianę urządzenia z fig. 3, w przekroju wzdłużnym, w płaszczyźnie pionowej; fig. 5 jest widokiem podobnym do widoku z fig. 4 i przedstawia zmodyfikowaną postać odmiany urządzenia, z alternatywną konstrukcją części uszczelniającej, w ujęciu podobnym do fig. 4; fig. 6 przedstawia schematycznie trzecią odmianę urządzenia usytuowanego wokół zespolenia typu koniec z bokiem, w widoku perspektywicznym; fig. 7 - odmianę urządzenia z fig. 6, w przekroju wzdłużnym, w płaszczyźnie pionowej; fig. 8 - schematycznie czwartą odmianę urządzenia usytuowanego wokół zespolenia typu bok z bokiem, w widoku perspektywicznym; fig. 9 - odmianę urządzenia z fig. 8, w przekroju wzdłużnym, w płaszczyźnie pionowej; fig. 10 - schematycznie piątą odmianę urządzenia połażanega wokół zespolenia typu bok z bokiem, ukazując częściowo osadzone naczynie krwionośne, w widoku perspektywicznym; a fig. 11 - odmianę urządzenia z fig. 10, w przekroju wzdłużnym, w płaszczyźnie pionowej.

Jako tło można podać, że tętnicze wszczepienia połączeń omijających stosuje się zwykle dla odtworzenia lub polepszenia przepływu krwi do tkanek, gdy własne naczynia są zaczopowane lub znacznie zwężone, zwykle przez ognisko miażdżycowe. Bez względu na to, czy stosuje się autologiczną żyłę lub tętnicę, czy też materiał syntetyczny, taki jak Dacron lub PTFE, przeszczepy zespala się zwykle z własnymi naczyniami jednym z trzech sposobów: „koniec z końcem” (fig. 4); „koniec z bokiem” (fig. 7); lub „bok z bokiem” (fig. 9). Spośród tych technik, techniki typu koniec z bokiem oraz bok z bokiem są znacznie częściej spotykane niż typu koniec z końcem. Kierunek przepływu krwi przedstawiają strzałki.

Figury 1 i 2 pokazują krew 1 w ścianie naczynia 2, i kołnierz przydankowy obejmujący pustą przestrzeń 3 określoną ścianką 4 np. z substancji ulegającej biodegradacji. Kołnierz 5 dotyka ścianki naczynia w swoich skrajnych fragmentach. Tę odmianę można stosować w taki sam sposób, jak opisano poniżej dla innych odmian.

Odmianę urządzenia zilustrowaną na fig. 3 i 4 pokazano w zastosowaniu z zespoleniem typu koniec z końcem. Urządzenie obejmuje zasadniczo rurkowy korpus 12, który podczas stosowania rozciąga się podłużnie i otacza naczynie krwionośne utworzone przez zespolenie typu koniec z końcem przeszczepu 13 z własnym naczyniem krwionośnym 14.

Jak najlepiej widać na fig. 4, korpus 12 urządzenia ma na swych przeciwnych końcach oddalone od siebie w kierunku wzdłużnym części uszczelniające 15. Gdy, podczas stosowania, urządzenie umieszcza się na miejscu 16 zespolenia typu koniec z końcem, te części uszczelniające 15 uszczelniają stykając się z przydankową powierzchnią przeszczepu 13 i własnego naczynia krwianaśnega 14. Grubość materiału korpusu 12 w kierunku promieniowym jest większa na części uszczelniającej 15 niż w części pośredniej 17. W związku z tym, gdy części uszczelniające 15 uszczelniają stykając się z przydankowymi powierzchniami przeszczepu 13 i naczynia 14, powstaje przestrzeń pomiędzy wnętrzem korpusu 12 urządzenia i przydankowymi powierzchniami zamkniętych końców przeszczepu 13 i naczynia 14. Ta przestrzeń stanowi szczelny zbiomik 18 i pokazano ją wyrównaną podłużnie z zespoleniem 16.

189 744

Zbiomik pozwala na umieszczenie środka farmaceutycznego zawierającego jeden lub większą liczbę substancji w kontakcie z przydankową powierzchnią przeszczepu i naczyniami 13, 14 w miejscu zespolenia 16. Gdy preparat ma postać płynu lub żelu, może np. być wstrzykiwany z użyciem igły; hipodermicznej i strzykawki, przez ściankę korpusu 12, do uszczelnionego zbiornika 18. Środki zawarte w kompozycji korzystnie mają działanie przeciwrozrostowe, zapobiegające rozrostowi komórek mięśni gładkich błony wewnętrznej naczyń w miejscu zespolenia 16 i w sąsiadujących z nimi obszarze.

Preparat farmaceutyczny nie musi być w postaci płynu lub żelu, i może być np. płynącą pastą o konsystencji podobnej do pasty do zębów. Pozostaje on następnie w kontakcie z pulsującą przydankową powierzchnią, z którą się styka, zaciskając naczynie.

Dla umieszczenia urządzenia nad miejscem zespolenia 16, cylindryczny korpus 12 można przesuwać osiowo nad przeszczepem 13 lub naczyniem krwionośnym 14 przed ich zespoleniem. Chirurg może następnie połączyć przeszczep 13 i naczynie 14 ze sobą w miejscu zespolenia 16 i korpus 12 można następnie przesunąć z powrotem nad miejsce zespolenia 16, aby zajął położenie pokazane na fig. 4, dla umożliwienia szczelnego dociśnięcia części uszczelniających 15 do odpowiednich przydankowych powierzchni.

Alternatywnie korpus 12 urządzenia można, jak pokazano, zaopatrzyć w podłużną szczelinę 19 na całej jego długości. W ten sposób, chirurg może zespolić przeszczep 13 i naczynie 14 bez wprowadzenia urządzenia 12 do organizmu pacjenta. Po udanym zespoleniu chirurg może następnie wybrać odpowiednich rozmiarów korpus 12 i nałożyć go wokół zespolonego przeszczepu i naczynia otwierając elastyczny korpus 12 wzdłuż szczeliny 19, nasuwając go nad zespolony przeszczep i naczynie 13, 14, a następnie dociskając przeciwne podłużne krawędzie korpusu na szczelinie 19 ze sobą, np. stosując konwencjonalny „klej do tkanek”, taki jak klej trombinowy sprzedawany pod nazwą Tisseal, lub klej oparty na cyjanometakrylanie.

Dla skumulowania działania środka farmaceutycznego zawartego w zbiorniku 18 i dla uniknięcia wyciekania środków do otaczającej tkanki, korpus 12 jest zasadniczo nieprzepuszczalny dla preparatu. Ponadto substancja korzystnie ulega biodegradacji w ustalonym czasie, np. okresie 1 do 5 dni, po których środki czynne w kompozycji powinny wyczerpać się. Substancję dobiera się też tak, aby nie sprzyjała zbyt gwałtownej reakcji z otaczającą tkanką. Do przykładowych odpowiednich materiałów na korpus należy żelatyna, alginian lub kolagen. Te materiały także nadają korpusowi elastyczność i pozwalają na wytwarzanie urządzenia metodą formowania lub wytłaczania.

Materiał ścianki korpusu 12 może także korzystnie być samouszczelniający, aby zachowywać integralność uszczelnionego zbiornika 18, jeśli musi się go nakłuwać igłą hipodermiczną. Alternatywnie lub dodatkowo, dowolny przeciek w ściance odkryty po usunięciu igły można uszczelnić „klejem do tkanek” lub tym podobnym.

Można wytworzyć serię różnych rozmiarów korpusów 12 dopasowanych do różnych rozmiarów naczyń. Naczynia dolnych kończyn mają zwykle zewnętrzną średnicę około 6-8 mm. Naczynia wieńcowe mają zwykle zewnętrzną średnicę około 3-5 mm. Odpowiednio, można wytworzyć korpusy o średnicy w zakresie około 3-10 mm dostarczane chirurgowi w jałowych pakietach. Ponadto rozmiar korpusu można zmieniać w zależności od objętości zbiornika 18. Odpowiedni zbiorniczek 18 ma pojemność do 10 ml, korzystnie 2-5 ml.

Dla skompensowania rozszerzania naczyń krwionośnych 13, 14 powodowanego przez pulsacyjnie przepływającą przez nie krew, co najmniej części uszczelniające 15 korpusu mogą się korzystnie rozciągać kompensując rozszerzanie ścianek naczyń. Jest bardzo pożądane unikanie ściskania ścianek naczyń nrzez urządzenie, przy równoczesnym zachowaniu nienaru* X »- ' Λ. * szonego uszczelnienia.

Figura 5 przedstawia różne części uszczelniające. Grubość w kierunku promieniowym materiału korpusu 12 jest stała na długości korpusu, a pośrednia część 17 jest poszerzona wewnętrznie względem wewnętrznej średnicy korpusu 12 na częściach uszczelniających 15. Obie części uszczelniające 15 są uformowane z końcówkami wystającymi w kierunku podłużnym, np. każda kontaktuje się z odpowiednimi przydankowymi powierzchniami przeszczepu 13 i naczynia 14 na długości „X” w kierunku osiowym około 8-15 mm. Te długie końcówki części uszczelniających 15 można wytworzyć tak, aby działały jako „zawory kla189 744 powe” uszczelniając dodatkowo zbiomik 18, chociaż nie jest oczywiście potrzebny żaden przepływ przez „zawór klapowy”. Alternatywnie, końcówki mogą być zwinięte do środka (nie pokazano) dla podwojenia grubości korpusu na końcach z wytworzeniem części uszczelniających o większej promieniowej grubości niż grubość korpusu w pośredniej części, podobnie jak pokazano na fig. 4.

Dla utworzenia lub ułatwienia utworzenia szczelnych dla płynu połączeń, chirurg może złączyć części uszczelniające 15 z przydankowymi powierzchniami, np. za pomocą wspomnianego wyżej typu kleju, np. „kleju do tkanek”. Może to nie być jednakże istotne. Tak np. jeśli rozmiary korpusu 12 na częściach uszczelniających 15 dobierze się tak, aby pasowały do obwodu naczyń 13, 14, stosowanie kleju może nie być konieczne. Zamiast tego chirurg może polegać na promieniowym zachodzeniu na siebie wewnętrznej średnicy korpusu 12 w części uszczelniającej 15 i średnicy przydankowych powierzchni. Jest tak szczególnie w przypadku odmiany z długą końcówką uszczelniającą z fig. 5. Części uszczelniające nie powinny jednakże uciskać tak silnie naczynia, aby je przewężać.

Figury 6 i 7 przedstawiają odmianę urządzenia, którą stosuje się w powiązaniu z zespoleniem typu koniec z bokiem. Pokazano tu korpus 20 mający pierwszą część korpusu 21 i drugą część korpusu 22, rozgałęziające się pod kątem mniejszym niż 90° z wytworzeniem ogólnie korpusu w kształcie litery Y. Należy rozumieć, że obydwie części, pierwsza i druga część korpusu 21, 22, mogą być rozgałęzione pod innym kątem rozgałęzienia do 90° włącznie, i w tym ostatnim przypadku korpus będzie ogólnie w kształcie litery T. Chirurg może korzystnie dysponować serią korpusów różnych rozmiarów i różnego kształtu, spośród których może wybrać urządzenie najodpowiedniejsze ze względu na układ i rozmiary zespolonego n · c D, n m i za r.r-i Λ 1z o»»n i w ϊ O 1 »-c ζα zał/zata 1 1 O zas'' o za λίπ Ć* naUjfiia. ΠΙΓΐοΖα v^^C1 -OipUSU mi op. uuw vrvuig i-av ęln uikgoovi, diugd korpusn 22 moee mie5 1-5 cm dbioości.

Pierwsza ezęsć korpusu oi jeut c^góbsie rurkoevai kokacano jąjako ątaczaj ącą wlaąną naczynie krwionośne 23. Druga część korpusu 22 jest także ogólnie rurkowa i pokazano ją jako otaczającą przeszczep 24 zespolony z własnym naczyniem krwionośnym 23 na sposób komec z bokiem, w miejscu zespolenia 29. Jak pokazano na fig. 7, przeciwne końce pierwszej części korpusu 21 mają części uszczelniające 25, a dalszy koniec drugiej części korpusu 22 ma część uszczelniającą 26. Jak we wcześniejszej odmianie, te części uszczelniające 25, 26 mogą być korzystnie zetknięte szczelnie z prćydckkawymi powierzchniami naczynia krwionośnego 23 i przeszczepu 24 odpowiednio z użyciem „kleju do tkanek”.

Figura 7 przedstawia uszczelniony zbiamiZ 27 utworzony pomiędzy wnętrzem pierwszej części korpusu 21 i przydckZawa powierzchnią naczynia krwionośnego 23. Zbiomik 27 rozciąga się do wnętrza drugiej części korpusu 22. Ten uszczelniony ćbiamik 27 jest więc umieszczony w sposób dopasowany do miejsca 29 zespolenia. Zbiomik 27 można korzystnie napełnić przez wstrzyknięcie ciekłym preparatem farmaceutycznym zawierającym substancje czynne, stosując igłę hipodermiczną i strzykawkę.

Dla ułatwienia zαmaoawαkia urządzenia do naczynia 23 i przeszczepu 24, korpus 20 urządzenia można dostarczać chirurgowi w sterylizowanym opakowaniu zawierającym dwie symetryczne połówki, rozcięte i symetryczne względem powierzchni przekroju zilustrowanej na fig. 7. W takim przypadku, chirurg będzie musiał złożyć dwie identyczne połowy korpusu ze sobą po zespoleniu przeszczepu 24 z naczyniem 23 i uszczelnić stykające się krawędzie identycznych połówek ze sobą, np. stosując klej, jak opisano poprzednio.

Alternatywnie, tylko pierwsza część korpusu 21 może zawierać podłużną szczelinę 28, jak pokazano na fig. 6. W ten sposób chirurg może nasunąć drugą część korpusu 22 na koniec przeszczepu 24. Chirurg będzie mógł następnie zespolić wolny koniec przeszczepu 24 z naczyniem krwionośnym 23, po czym zsunąć drugą część korpusu 22 z powrotem po przeszczepie 24 w celu zakrycia miejsca zespolenia 29, wykorzystując szczelinę 28 do wprowadzenia naczynia krwionośnego 23 do środka pierwszej części korpusu 21, który je otoczy. Chirurg może następnie szczelnie połączyć ze sobą przeciwległe podłużne krawędzie pierwszej części korpusu 21 na szczelinie 28 z wytworzeniem uszczelnionego zbiornika 27.

Należy zdawać sobie sprawę, że można stosować inne konfiguracje części korpusu 21 i 22. Tak np. pierwsza i druga część korpusu 21 i 22 mogą być dostarczane odrębnie od siebie

189 744 i mocowane do siebie z wytworzeniem zamkniętego zbiornika 27 dopiero in situ w organizmie pacjenta.

Figury 8 i 9 ilustrują odmianę urządzenia odpowiednią do stosowania w sytuacji zespolenia typ bok z bokiem. Korpus 30 urządzenia pokazano jako zawierający pierwszą część korpusu 31, od której odgałęzia się druga i trzecia część korpusu 32, 33. Rozgałęzienie tworzy ogólnie korpus w kształcie litery X, jak pokazano na fig. 8.

Wszystkie trzy części korpusu 31, 32, 33, mają ogólnie kształt rurkowy. Urządzenie jest ogólnie podobne do zilustrowanego na fig. 6 i 7, poza dodatkową trzecią częścią korpusu 33.

Pierwsza część korpusu 31 otacza okludowane własne naczynie krwionośne 34 i jest szczelnie zamocowana do jego przydankowej powierzchni przez części uszczelniające 35. Druga z trzecią częścią korpusu 32, 33 otaczają przeszczep 36 i szczelnie zamocowane do przydankowej powierzchni przeszczepu przez odpowiednie części uszczelniające 37, 38. Jak najlepiej pokazano na fig. 9, części uszczelniające 35, 37, 38 mają wytwarzać szczelny zbiornik 39 między wnętrzem korpusu 30 i przydankowymi powierzchniami obejmowanego naczynia, i zbiomik 39 może być co najmniej częściowo wypełniony preparatem farmaceutycznym w sposób opisany wcześniej.

Dla ułatwienia zamocowania urządzenia zilustrowanego na fig. 8 i 9, urządzenie jest korzystnie dostarczane chirurgowi w co najmniej dwu częściach. Tak np. pierwsza część korpusu 31 może być dostarczona odrębnie od drugiego składnika zawierającego drugą i trzecią część korpusu 32, 33. Zaopatrując części korpusu w podłużne szczeliny (nie pokazane), części korpusu można dopasować tak, aby otaczały naczynie 34 i przeszczep 36 i następnie uszczelnić wzdłuż tych podłużnych szczelin i ze sobą wzdłuż linii zetknięcia, z wytworzeniem szczelnego zbiornika 39 wokół miejsca zespolenia 40.

Figury 10 i 11 przedstawiają wariant urządzenia pokazanego na fig. 8 i 9 (zastosowano te same odnośniki liczbowe dla takich samych części). Jednym szczególnie odpowiednim zastosowaniem urządzenia jest zabieg chirurgiczny przepływu omijającego tętnicę wieńcową. W takiej sytuacji pierwsze naczynie krwionośne 34 może, jak pokazano, być tętnicą wieńcową, która jest częściowo umieszczona w ściance serca 50. Urządzenie w postaci pokazanej na fig. 8 i 9 nie może być zamocowane do częściowo zagłębionej tętnicy wieńcowej 34, gdyż pierwsza część korpusu nie będzie mogła rozciągać się w pełni wokół tętnicy 34. Odpowiednio, w odmianach z fig. 10 i 11, pierwsza część 51 korpusu 31 nie opisuje pełnego koła w przekroju poprzecznym do jej rozmiaru wzdłużnego; zamiast tego ma ogólnie łukowaty obrys przekroju poprzecznego. W zilustrowanej odmianie urządzenia łuk ten opisuje kąt około 180°. Pozwala to na umocowanie pierwszej część korpusu 51 tylko na odsłoniętej części częściowo zagłębionej tętnicy wieńcowej 34, otaczając ją tylko częściowo. W tym układzie rozciągające się podłużnie krawędzie 41 pierwszej części 51 korpusu są uszczelniane przez chirurga w kontakcie z przydankową ścianką tętnicy wieńcowej 34 lub, jak pokazano, z powierzchnią ścianki serca 50, np. stosując klej do tkanek.

Urządzenie z fig. 10 i 11 nadaje się także do stosowania w innych zabiegach chirurgicznych, w których pierwszym przenoszącym krew naczyniem jest tętnica częściowo zagłębiona w ściance organu zasilanego tą tętnicą. Takie organy obejmują mózg, pęcherz i macicę.

Urządzenie można np. zastosować ogólniej do dostarczania środków na przydankową powierzchnią niezespolonych naczyń krwionośnych. Tak np. po balonowej angioplastyce urządzenie w postaci pokazanej na fig. 3 do 5 można umieścić wokół zewnętrznej strony tętnicy w regionie miejsca balonowej angioplastyki, aby dostarczać do niej jeden lub większą liczbę środków przez przydankową powierzchnię tętnicy.

W odmianach opisanych powyżej uszczelnione zbiorniki pokazano w postaci promieniowej przestrzeni lub prześwitu pomiędzy przydankową powierzchnią naczynia krwionośnego i wnętrzem co najmniej pierwszej części korpusu, która to przestrzeń jest co najmniej częściowo wypełniona przy zastosowaniu preparatem farmaceutycznym. Taka przestrzeń nie jest jednakże istotna. Tak np. w alternatywnej odmianie, korpus może mieć ogólnie nieprzepuszczalną elastyczną zewnętrzną warstwę i elastyczną wewnętrzną warstwę, która jest impregnowana preparatem i ułożona tak, aby w zastosowaniu być w kontakcie z przydankową. powierzchnią.

189 744

Zewnętrzną warstwę można np. wykonać ze stałego kolagenu, a wewnętrzną warstwę z gąbczastego kolagenu związanego z tym poprzednim, przy czym gąbczasta warstwa może być nasączana preparatem farmaceutycznym zawierającym dostarczany środek. W takiej sytuacji urządzenie można dostarczać chirurgowi dla zamocowania z preparatem już nasączającym wnętrze, lub może być ono zwilżone preparatem po zamocowaniu, np. przez wstrzyknięcie, jak opisano wcześniej.

Alternatywnie, środkiem można powlekać wewnętrzną powierzchnię korpusu, która przy zastosowaniu styka się z naczyniem krwionośnym. Alternatywnie, środek można zdyspergować w strukturze korpusu.

Jest pożądane, aby korpus urządzenia miał dostateczną wytrzymałość, aby wytrzymać siły skręcające. W tym celu korpus można uformować np. z wewnętrzną warstwą, np. warstwą kolagenu, albo z podłużnymi, poprzecznymi lub spiralnymi żebrami. Można wytworzyć żebra, które dzielą zbiomik na przedziały i polepszają dodatkowo trwałość.

Białka lub kwasy nukleinowe można stosować do leczenia lub profilaktyki rozrostu błony wewnętrznej naczyń wynikającego z dowolnych klinicznych okoliczności. Tak np. możliwe jest leczenie rozrostu powstającego po dowolnego typu chirurgicznej procedurze, w tym angioplastyce, np. balonowej angioplastyce; po zabiegu chirurgicznym tworzenia przepływu omijającego, takim jak zabieg chirurgiczny tworzenia wieńcowego przepływu omijającego, w którym żyłę zespala się z tętnicą; po innych procedurach zespolenia, np. zespoleniu w nogach; oraz endarterektomii, np. endarterektomii tętnicy szyjnej. Możliwe jest także leczenie rozrostu błony wewnętrznej naczyń związanego z uszkodzeniem lub nadciśnieniem tętniczym, np. nadciśnieniem w tętnicy płucnej. Wynalazek dostarcza sposobu-leczenia rozrostu błony wewnętrznej naczyń w dowolnym typie naczynia krwionośnego, np. w tętnicy lub żyle, korzystnie tętnicy.

Zgodnie z wynalazkiem, możliwe jest leczenie lub łagodzenie ustalonego rozrostu błony wewnętrznej albo zapobieganie powstawaniu rozrostu błony wewnętrznej naczyń. Podobnie możliwe jest zmniejszenie prawdopodobieństwa rozrostu błony wewnętrznej naczyń, lub zmniejszenie ostrości ustalonego rozrostu błony wewnętrznej naczyń lub rozrostu, który może nastąpić. Leczenie może zajść przed, podczas, lub po chirurgicznej procedurze, np. w celu zmniejszenia możliwości rozrostu po procedurze.

Korzystnie kwas nukleinowy lub białko VEGF podaje się w celu zapobiegania lub leczenia zwężenia de novo. Można je jednak także stosować do leczenia lub profilaktyce nawrotu zwężenia.

Białka lub kwasy nukleinowe stosowane zgodnie z wynalazkiem korzystnie podaje się w postaci preparatu farmaceutycznego zawierającego farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Można stosować dowolny odpowiedni preparat farmaceutyczny.

Tak np. odpowiednie preparaty mogą obejmować wodne i niewodne sterylne roztwory do iniekcji, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, środki bakteriostatyczne, bakteriobójcze antybiotyki i substancje rozpuszczone nadające preparatowi izotoniczność z krwią przewidzianego biorcy; oraz wodne i niewodne sterylne zawiesiny, które mogą zawierać środki tworzące zawiesiny i zagęstniki. Preparaty mogą być w pojemnikach z dawką jednostkową lub z wieloma dawkami, np. w szczelnych ampułkach i fiolkach, i można je przechowywać w stanie zamrożonym lub wysuszonym sublimacyjnie (zliofilizowanym), wymagającym jedynie dodania sterylnego ciekłego nośnika, np. wody do iniekcji, bezpośrednio przed użyciem.

Należy rozumieć, że poza składnikami konkretnie wspomnianymi powyżej, preparaty mogą zawierać inne zwykłe środki stosowane z uwzględnieniem typu konkretnego preparatu. Spośród możliwych preparatów korzystne są sterylne wolne od pirogenów roztwory wodne i niewodne.

Białka, kwasy nukleinowe i wektory można dostarczać w dowolnej odpowiedniej dawce z zastosowaniem dowolnego odpowiedniego trybu dawkowania. Fachowcy wiedzą że wielkość dawki i tryb można dobrać tak, aby zapewnić optymalne leczenie konkretnego leczonego stanu, zależnie od wielu czynników. Do takich czynników może należeć wiek, płeć i stan kliniczny leczonego pacjenta.

W przypadku podawania niezwiązanych kwasów nukleinowych kodujących VEGF lub konstruktów zawierających takie kwasy nukleinowe, typowe dawki wynoszą 0,1-5000 pg,

189 744 np. 50-2000 jag, czyli 50-100 (ig, 100-500 gg lub 500-2000 gg/dawkę. W przypadku podawania białka VEGF, odpowiednie dawki obejmują dawki od 1-1000 gg np. 1-10 gg, 10-100 gg, 100-500 gg lub 500-1000 gg.

Dawkowanie zastosowane przy dostarczaniu kwasów nukleinowych VEGF przy pomocy wirusowych lub niewirusowych wektorów będzie zależało od wielu czynników, w tym skuteczności, z jaką wektory dostarczają kwasy nukleinowe VEGF do komórek, oraz skuteczności, z jaką kwasy nukleinowe VEGF ulegają ekspresji w komórkach.

Przykłdowo wektory wirusowe można dostarczać w dawkach od 10⁴ do 10^H cfu lub pfu/ml, np. 104 do 10⁶, 10⁶ do 10⁸, 10⁸ do 10¹⁰, 10¹⁰ do 10¹² lub 10¹² do 10^H cfu lub pfu/ml. Korzystne są dawki w przedziale od 10⁵ do 10⁹ cfu lub pfu/ml. Określenie pfu (jednostka tworząca łysinki) stosuje się do pewnych wirusów, w tym adenowirusów, i odpowiada infekcyjności roztworu wirusa, która jest określana przez zainfekowanie odpowiedniej kultury komórek i zmierzenie, zwykle po 48 godzinach, liczby łysinek zainfekowanych komórek. Termin cfu (jednostka tworząca kolonie) stosuje się do innych wirusów, w tym retrowirusów, i określa się go środkami znanymi fachowcom, zwykle po 14 dniach inkubacji z markerem selekcyjnym. Techniki określania miana cfu lub pfu roztworu wirusa są dobrze znane fachowcom.

W przypadku retrowirusów szczególnie korzystne są dawki w przedziale od 10⁵ do 106 cfu/ml. W przypadku pseudotypowych retrowirusów szczególnie korzystne są dawki około 10⁷ cfu/ml. W przypadku adenowirusów szczególnie korzystne są dawki około 10⁹ pfu/ml.

Podobnie, takie dawki można wprowadzać do wszczepów według wynalazku do stopniowego dostarczania.

Kwasy nukleinowe VEGF związane z niewirusowymi wektorami można także dostarczać w dowolnych odpowiednich dawkach, dowolnym sposobem podawania, jak opisano powyżej, lub stopniowo z wszczepu. Odpowiednie dawki wynoszą typowo 0,1-1000 gg kwasu nukleinowego, np. 1-100 gg, 100-500 gg lub 500-1000 gg, 1000-2000 gg, 2000-3000 gg lub 3000-5000 gg. Korzystne dawki mieszczą się w przedziale 5-50 gg, np. 10-20 gg.

Schematy dawkowania będą się także wahać, np. w zależności od drogi podawania, gatunku biorcy i stanu biorcy. Jednakże przewiduje się możliwość stosowania pojedynczych dawek i wielokrotnych dawek rozłożonych na okres dni, tygodni lub miesięcy. Ponadto, jak wyjaśniono powyżej, dostarczanie białka i kwasów nukleinowych VEGF można prowadzić za pomocą wszczepu odpowiedniego do dopasowania wokół naczynia krwionośnego, korzystnie tętnicy; korzystnie wszczep ma postać kołnierza. Taki wszczep będzie zapewniał stopniowego dozowania. Tak np. dozowanie może trwać godziny, dni, tygodnie lub miesiące.

Białka i kwasy nukleinowe można podawać dowolną drogą podawania, np. miejscową, skórną, pozajelitową, domięśniową, podskórną lub przezskómą, albo przez bezpośrednie wstrzyknięcie do prądu krwi, bezpośrednie wstrzyknięcie do lub wokół ścianki tętnicy lub bezpośrednie podanie do śluzówek. Korzystne jest podawanie za pomocą wszczepu, jak opisano powyżej.

Opisane powyżej białka, kwasy nukleinowe i wektory można stosować do traktowania rozrostu błony wewnętrznej naczyń u dowolnego ssaka. Korzystne jest leczenie ludzi.

Wszczepy według wynalazku, szczególnie określone powyżej wszczepy w postaci kołnierzy, można także stosować do dostarczania środków innych niż VEGF do naczyń krwionośnych, np. tętnic. Dowolny odpowiedni środek można dostarczać w ten sposób w celu osiągnięcia dowolnego żądanego celu leczniczego.

Stwierdzono, że kompleksy plazmid/liposom, retrowirusy MMLV, retrowirusy VSV-G i adenowirusy prowadzą do ekspresji w tętnicach z kołnierzami. Skuteczność przenoszenia genu była najwyższa dla adenowirusów, a pseudotypowe retrowirusy VSV-G także dawały względnie wysoką skuteczność transfekcji. Dotychczas przydatność pozbawionych replikacji retrowirusów VSV-G w tętniczym przenoszeniu genu nie była znana. Zaobserwowano ekspresję w pewnych komórkach śródbłonka transfekowanych adenowirusem tętnic. W związku z tym, że zachodziła penetracja z przydanki do błony wewnętrznej, te wyniki stwarzają ogólną możliwość wpływania na działanie śródbłonka w chorobach u ludzi przez pozaświatłowe przenoszenie genu z użyciem genów innych niż VEGF. Może to także być przydatne do ekspresji w przydance i zewnętrznej mięśniówce dyfundujących lub wydzielanych produktów genowych, które następnie działają w dowolnym miejscu w ściance tętnicy. Korzystnie, takie

189 744 dostarczanie powoduje leczenie rozrostu błony wewnętrznej naczyń, określone powyżej, chociaż może także pozwalać osiągać aedalkowe lub inne cele lecznicze.

Korzystnie, środki lecznicze będą w postaci kwasu nukleinowego kodującego farmaceutycznie aktywny pelizgztyd lub białko. Korzystniej, ten kwas nukleinowy będzie zawarty w genstjugcie, jak zdefiniowano powyżej. Szczególnie ker2ostfie kwas nukleinowy lub konstrugt będzie się dostarczać do tętnicy za pomocą wektora, jak zdefiniowano powyżej, np. wirusowego lub fiewinusowego wektora, jak zdefiniowano powyżej.

Tak więc, zezatętnicze przenoszenie genu można stosować w celu dostarczania ζοΙ^ιοłu genetycznego do ścianek naczyń gnwionośfoch, korzystnie tętnic. Na podstawie przykładów można stwierdzić, że zmiany w mięśniówkowych komórkach mięśni gładkich, a nawet w śróZOłonku można osiągnąć od strony przydankowi, co umożliwia rozwój nowych sposobów leczenia chorób naczyń krwionośnych, np. tętnic.

Poniższe przykłady ilustrują wynalazek. Użyto w nich następujących skrótów

BSA 3 albumma ΒυϊΖ^ιο^

DMEM 3 i^cr^^y^evg^^i J^^jzI3 w 3 Dulbecoo

FCS 3 piodosva surowca c^^ę^i^a

HUVEC 3 komórkϊ έΓόύΜοιΊία żyfy pzpkowet

IgG - immunoglobulina G kinaza MAP - aktywowana miiogenem kinaza białkowa mAb - przeciwciało mn2gklenaine

PBS - sjwZwór sok bufora wagy fosfoeanem

PGI2 - prostacyklina cPLA₂ - cytozolowa fesfelizaza A₂

PIGF - czynnik wzrostowy łożyska

SDS PAGE - elektroforeza na żelu zWl4krylazidowyz z dodecolesiarczafem sodu

VEGF - czynnif wzra2jewo Sr0dnłdaka g03fon'^ vWF - czynnik von Wil tezrandk

VSMC - kom órki mięśzi ęśndkiehkaczyO

Przykład i

Wpływ szenoficznggo względem komórki ^ΖΟΡ^ζ (EC) przenoszenia genu VEGF na pogrubianie Ołony wewnętrznej zbadano z użyciem silikonowego kołnierza umieszczonego wokół tętnicy szyjnej, który działał jako środek poweeujzcy rozrost komórek mięśni gładkich Ołony wewnętrznej i jako zbiornik genu i wektora. Model zachowywał integralność CC i pozwalał na bezpośrednie pozananzoniewe przenoszenie genu Oez jakiejkolwiek manipulacji wewnątrznaczyniowej.

Przykład Ln

Przenoszenie genu: Pogrubienie błony wewnętrznej wywołano w szyjnej tętnicy 32 białych królików nowozelandzkich przez wprowadzenie obojętnego silikoneweee kołnierza wokół tętnic pod ogólnym znieczuleniem (Booth i in., Atherosclerosis (1989) 76:257-268). Przenoszenia genu degefane 5 dni po umieszczeniu kołnierza, przez ostrożne otwarcie kołnierza pod znieczuleniem i wprowadzenie 500 μΐ kompleksów plazmid/lipesom do kołnierza (to jest na przydomkową powierzchnię tętnicy). Nie eegefowafo żadnych wewnątrznaczyniowych manipulacji w żadnym etapie Oadań.

Kompleksy plαzmid/liposem: 25 μg plazmidu zCMV5-VCGF-164 (zawierającego mysi cDNA VCGF (Breier i in., Develozment (1992) 114:521-32; nukleetodo 1-583) sgempleksowono z 25 μl lizofegtono (BRL) z rozcieńczeniem do 500 (tl roztworem Ringera. Kompleksy trzymano w temperaturze pokojowej co najmniej 15 minut przed przenoszeniem genu. Określono przedtem, że przy stężeniu użytym w tym badaniu kompleksy plazmid/lipefektyna nie były toksyczne dla aertalnych CC królika in vitro. Kontrolne tętnice transfekowano podobnym kompleksem plazmid/lipesom, zawierającym cDNA plazmidu ekspresji UcZ z E. coli (Kalnins i in., supra) (nugleotydo 1-31OO). Plazmidy użyte do Oadań wydzielono z hodowli E. coli (DH5a) z zastosowaniem kolumny Qiagen Mega i oczyszczono z zastosowaniem trzech ekstrakcji fenel/chlenoferm i jednego strącania etanolem (red. Ausubel i in., Current Protocols in Molecular Biology. New York, NY: Greene PuOlishife Associates i John Wiley & Sons (1991)

189 744

4.2.3-4.2.4), rozcieńczono do 1 gg/ą1 i na podstawie analizy stwierdzono, że są wolne od jakiegokolwiek mikrobiologicznego lub endatoksynowega zanieczyszczenia (próba Limulus, poziom wykrywania 0,2 ng). Zwierzęta uśmiercono po 3 (n=8), 7 (n=12) i 14 (n=12) dniach po operacji przenoszenia genu; tętnice ostrożnie usunięto i podzielono na trzy równe części: bliższą część utrwalono przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie/EBS na 15 minut i osadzono w związku OCT (Miles Scientific) (Yla-Herttuala i in.: J. Clfn. Ieaest. (1995) 95: 26922698). Środkową część utrwalano jak wyżej przez 4 godziny, płukano w 15% sacharozie przez 48 godzin i osadzono w parafinie. Najdalszą część bezpośrednio osadzono w związku OCT i zamrożono w ciekłym azocie. W czterech tętnicach dalsze części zastosowano do wydzielania mRNA i RT-PCR (patrz poniżej). 10 przypadkowo wybranych odcinków ze środkowej części użyto do określenia stosunku grubości błona wewnętrzna/mięśniówka (Yla-Herttuala i in.: Arterfosclerosfs (1986) 6; 230-236) przez dwu niezależnych obserwatorów bez znajomości pochodzenia próbek. Średnie wartości z dwu niezależnych pomiarów użyto do wyliczenia wyników (średnia + odchylenie standardowe). Różnice w stosunku grubości błona wewnętrzna/mięśniówka pomiędzy grupami zanalizowano metodą analizy wariancji, następnie zmodyfikowanym testem t (* p<0,05).

RT-PCR: Najdalsze części transfekowanych VEGF (n=2) i lacZ (n=2) tętnic, zebrane 7 dni po przenoszeniu genu, użyto do wydzielenia mRNA (MiFro-FastTrack, Invitrogen) i transkrybawana odwrotnie do pierwszej nici cDNA z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy AMLV (5U/reakcję, Boehringer) z zastosowaniem przypadkowych starterów heksamerowych (zestaw cyklicznych cDNA, Invitrogen) jak opisano (Hiltunen i in.: Circulation (1995) 92:3297-3303). Przeprowadzono 35 cykli PCR z polimerazą Taq (Boehringer) i starterami specyficznymi dla transfekowanego konstruktu pCMV5-VEGF-164 (5'-starter: SEQ ID NO.: 9; 3'-starter: SEQ ID NO.: 10; parametry cyklu PCR: 1 minuta 90°C, 1 minuta 60°C, 1 minuta 72°C, poza ostatnim cyklem, którego czas wynosił 5 minut). Zamplifikowany fragment o spodziewanej długości (547 nukleotydów) stwierdzono w tętnicach transfekowanych VEGf. Markery wielkości DNA (drabinka 1 kb, BRL) były widoczne na obu stronach żelu.

Wykonano mikrografie, pokazujące charakterystykę szyjnych tętnic królika 7 dni po przenoszeniu genu VEGF lub lacZ. Zabarwianie immunologiczne transfekowanych tętnic wykazało: kontrolna tętnica transfekowana plazmidev/liposamem lacZ (komórki mięśni gładkich specyficzne wobec MAb HHF-35, rozcieńczenie 1:500, Enzo Diagnostics) wykazał typowe pogrubienie błony wewnętrznej; tętnica transfekowana plazmidem/liposomem VEGF (komórki mięśni gładkich specyficzne wobec MAb HHF-35) wykazały tylko ograniczone pogrubienie błony wewnętrznej; śródbłonek występował we wszystkich badanych segmentach naczyniowych (seryjny przekrój do A, specyficzne wobec EC MAb CD31, rozcieńczenie 1:50, DAKO); Nie stwierdzono dowodów zapalenia w tętnicach transfekowanych VEGF i lacZ (specyficznych wobec makrofagów MAb RAM-11, rozcieńczenie 1:500, DKO); Tworzenie nowych naczyń w przydance tętnic transfekowanych VEGF stwierdzono 14 dni po przenoszeniu genu (zabarwianie hematoksyliną-eozyną).

Układu awidyna-biotyna z peroksydazą chrzanową (Vector Elite, Vector Labs) użyto do zabarwień immunologicznych (Yla-Herttuala i in., PNAS (1990) 87: 6959-6963). Kontrole dla zabarwień immunologicznych obejmowały inkubacje z niezwiązanymi odpowiadającymi klasom i gatunkom immunoglobulinami i inkubacje, gdzie pominięto pierwotne przeciwciała. In situ hybrydyzacje prowadzono stosując antysensowną rybosondę VEGF (583 nukleotydy) zsyntetyzowaną z plazmidu pBluescript SK (Stratagene) jak opisano (Yla-Herttuala i in. (1990), supra). W skrócie przekroje osadzone w parafinie potraktowano wstępnie proteinazą K, acetylowana i hybrydyzowana z użyciem 35-S-UTP-znakawanyFh rybosoną (DuPont, NEN) (6x10 cpm/ml) w temperaturze 52°C przez 16 godzin. Końcowe przemywanie po hybrydyzacji prowadzono z zastosowaniem 0,1x SSC w temperaturze 60°C przez 30 minut. Użyto autoradiografii do wykrywania sygnału (Eastman-Kodak NAB-2). Kontrolne hybrydyzacje z niehybrydyzującą sensowną rybosondą (Yla-Herttuala i in. (1990), supra) dały negatywne wyniki. Przekroje zabarwiono kontrastowo hematoksyliną.

Przykład 1.2

Przenoszenie genu prowadzono jak opisano w przykładzie 1.1. L-NAME (70 mg/kg/dziennie) podano królikom w wodzie do picia, rozpoczynając na jeden dzień przed

189 744 przenoszeniem genu VEGF (n=5) lub lacZ (n=5). Zwierzęta uśmiercono 7 dni po przenoszeniu genu i analizowano względem stosunku grubości błony wewnętrznej/mięsniówki i histologii, jak opisano powyżej (Yla-Herttuala i in., Arieriosclerosis (1986) 6: 230-236; Yla-Herttuala i in. (1990) supra). Różnica w pogrubieniu błony zanikła.

Przykład 1.3

Zlewające się hodowle HUVEC przemyto dwukrotnie wolną od surowicy pożywką i inkubowano z tą pożywką w obecności rekombinacyjnego ludzkiego VEGF w stężeniach wskazanych dla 15 minut, lub z 10 ng/ml VEGF przez wskazany czas. W pewnych eksperymentach komórki traktowano przez godzinę 100 μΜ L-NAME i następnie potraktowano w obecności lub bez 10 ng/ml VEGF przez 10 minut. Pożywkę usunięto i komórki szybko lizowano w temperaturze 4°C poprzez dodanie 10 mM Tris/HCl (pH 7,6), 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 30 mM pirofosforanu sodu, 50 mM NaF, 0,1 mM Na3 VO4, 1 mM PMSF i 1% Tritonu Χ-100 (bufor lizy). Lizaty sklarowano przez odwirowanie przy 15000 x g przez 10 minut i prowadzono immunostrącanie przez inkubowanie sklarowanych lizatów z antyfosfotyrozyną PY20 mAb przez 2 godziny w temperaturze 40°C. Produkty immunostrącania zebrano przez inkubację lizatów przez kolejną 1 godzinę z białkiem A-agarozą. Produkty immunostrącania przemyto 3 x buforem lizy i białka ekstrahowano następnie 2x SDS-PAGE buforem próbek. Po SDS-PAGE immunostrącone białka przeniesiono na membrany i następnie poddano hybrydyzacji z mAb PY20. Okazało się, że VEGF indukuje fosforylację głównego białka 205 kD odpowiadającego receptorowi VEGF (główne tyrozynowe fosforylowane białka przy 100, 125, 145, 190 i 205). L-NAME usuwa odpowiedź na VEGF.

Rekombinacyjny VEGF dodawano w stężeniu 25 ng/ml na okres do 2 godzin (wytwarzanie azotynu wzrosło od poziomu w błonie wewnętrznej około 16 μMί, i pozostało na poziomie 1,8-2 μM) lub przy wskazanych stężeniach 0, 2,5, 25 ng/ml przez 10 minut. Wpływ wstępnego traktowania L-NAME (100 μM) (1 godzina) na odpowiedź VEGF zmierzono po dodaniu 25 ng/ml VEGF na 10 minut. Wytwarzanie azotynu zmierzno z zastosowaniem metody wykrywania kapilarnego (Leone i in., w Methods in Nitric Oxide Research, wyd. Feelisch i Stanler, John Wiley & Sons, New York (1996) 499-508). Poziom wzrósł do 19 i 2,1 μM w obecności VEGF; zmniejszył się do kontrolnego poziomu (17 μM) po dodaniu L-NAME.

Wyniki: Stwierdzono, że, w porównaniu z tętnicami transdukowanymi lacZ, przenoszenie genu VEGF znacząco zredukowało pogrubienie błony wewnętrznej w tydzień po operacji (stosunek błona wewnętrzna/mięśniówka 0,3 wobec 1,1, <0,05). Wpływ zmniejszył się po dwu tygodniach, co jest prawdopodobnie spowodowane faktem, że pośredniczone przez plazmid/liposom przenoszenie genu zwykle indukuje tylko tymczasową ekspresję transfekowanego genu z maksymalną ekspresją białka pomiędzy 2-3 dniami po przenoszeniu genu (Nabel i in., Ann. Rev. Physiol. (1994) 56: 741-761).

Immunohistochemiczna analiza tętnic wykazała, że pogrubienie błony wewnętrznej było prawie wyłącznie złożone z komórek mięśni gładkich. Warstwa śródbłonka była obecna we wszystkich zbadanych segmentach. Nie wykryto szkodliwych efektów lub zapalenia w transfekowanych tętnicach.

Ekspresję transfekowanego VEGF potwierdzono metodą RT-PCR z zastosowaniem starterów specyficznych dla transgenu i metodą hybrydyzacji in situ. Większość ekspresji VEGF i lacZ zachodziła w przydance i zewnętrznej mięśniówce w fibroblastach i komórkach mięśni gładkich. Przydankowe tworzenie nowych naczyń stwierdzono w trzech z transfekowanych VEGF tętnicach 14 dni po przenoszeniu genu. Nie wykryto tworzenia nowych naczyń w tętnicach transfekowanych lacZ.

Uorzednio wykazano, że przenoszenia genu lacZ-nlazmid/linosom z użyciem modelu x ·- ' χ χ x tr kołnierza prowadzi do lokalnego przenoszenia genu w 0,05% komórek tętniczych. Pomimo słabej skuteczności przenoszenia genu, wydzielana forma VEGF wytworzona wewnątrz kołnierza prowadzi do biologicznych efektów w lokalnym mikrośrodowisku tętnicy, na co wskazuje obecność nowych naczyń w trzech transfekowanych VEGF tętnicach 14 dni po przenoszeniu genu. Sądzi się, że podobnie jak przy ostrym niedotlenieniu, wydzielony VEGF dochodzi EC na drodze dyfuzji i wiąże się z receptorami VEGF na EC.

Przypuszczano, że hamujące wpływ VEGF na pogrubienie błony wewnętrznej było spowodowane bezpośrednio lub pośredno indukowanym przez VEGF czynnikiem pochodzą22

189 744 cym z EC lub aktywnością, która mogła z kolei hamować namnażanie komórek mięśni gładkich. W szczególności przypuszczano, że wpływ VEGF na pogrubienie błony wewnętrznej był pośredniczony poprzez drogę NO. Tę hipotezę testowano w podzbiorze nowozelandzkich białych królików (n=8) podając zwierzętom inhibitor syntazy NO L-NAME podczas eksperymentów przenoszenia genu. Stwierdzono, że L-NAME zniosło różnicę w pogrubieniu błony wewnętrznej pomiędzy tętnicami transfekowanymi VEGF i lacZ. Głównymi docelowymi komórkami dla VEGF w ściankach tętnicy są EC. Jedynym innym typem komórek zawierających receptory VEGF są monocyty, lecz jak można ocenić z immunocytochemii ze specyficznymi przeciwciałami, monocyty są nieobecne w szyjnych tętnicach z kołnierzem w tych warunkach.

Te wyniki (zdolność różnicowania pogrubienia błony wewnętrznej) były spójne z indukowanym przez VEGF hamowaniem pogrubiania błony wewnętrznej przez pobudzanie wytwarzania NO. Zbadano w związku z tym, czy VEGF może bezpośrednio stymulować wytwarzanie NO w hodowlach EC. VEGF indukowało fosforylowanie tyrozyny głównego białka 205 kDa odpowiadającego receptorowi VEGF w zakresie stężeń 1-25 ng/ml. Dodanie VEGF do hodowanych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC) powodowało zależny od czasu i stężenia wzrost wytwarzania NO, monitorowany pomiarem poziomu azotynu. Wpływ VEGF na wytwarzanie NO stwierdzony już w 30 s po dodaniu VEGF, osiągnął maksimum po 5 minutach i utrzymywał się przez 2 godziny. Połowę maksymalnego wpływu VEGF osiągnięto przy 5 ng/ml. Indukowane przez VEGF fosforylowanie i wytwarzanie NO całkowicie zniknęło w obecności 100 pm L-NAME. Tak więc możliwe jest, że przenoszenie genu VEGF pobudza wytwarzanie NO w EC w transfekowanych tętnicach i ogranicza namnażanie komórek mięśni gładkich co najmniej częściowo dzięki mechanizmowi z udziałem NO. Odkrycia te są zgodne z poprzednimi obserwacjami, że transfekcja tętnic cDNA syntazy śródbłonkowego NO zmniejsza pogrubienie błony wewnętrznej (Von der Leyon i in., PNAS (1995) 92:1137-1141).

Callow i in. (supra) i Asahara i in. (supra) stwierdzili, że podawanie białka VEGF stymulowało namnażanie EC w odsłoniętych tętnicach, lecz rzeczywiste mechanizmy związane z hamowaniem pogrubiania błony wewnętrznej nie zostały zbadane. W tętnicy szyjnej z kołnierzem pogrubienie błony wewnętrznej jest stymulowane w obecności anatomicznie nienaruszonego śródbłonka. Tak więc jest nieprawdopodobne, aby działanie hamujące tętniczego przenoszenia genu VEGF na pogrubienie błony wewnętrznej opisany tutaj było spowodowane stymulowanym przez VEGF odtwarzaniem śródbłonka. Zgodnie z tymi wynikami, VEGF może bezpośrednio indukować wytwarzanie NO w HUVEC tak, że jest to jedyny mechanizm, przez który VEGF może hamować pogrubianie błony wewnętrznej. VEGF może także stymulować wytwarzanie innych czynników, które mogą negatywnie regulować namnażanie komórek mięśni gładkich, w tym TGF-β lub prostacykliny.

Przykład 2

Stosując kompleksy plazmid/liposom do dostarczania genu, retrowirusy z wirusa mysiej białaczki Moloneya (MMLV), retrowirusy i adenowirusy zawierające białko-G wirusa pseudotypowego pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G) dostarczono do szyjnej tętnicy królika z zastosowaniem silastikowego kołnierza nałożonego na przydankę. Kołnierz stosuje się, gdyż 1) zapewnia zbiomik dostarczania genu; 2) nie przeprowadza się wewnątrzświatłowych manipulacji i śródbłonek pozostaje anatomicznie nienaruszony; oraz 3) zakładanie kołnierza indukuje namnażanie tętniczych komórek mięśni gładkich i polepsza wydajność retrowirusowego przenoszenia genu, gdy potrzebne jest namnażanie docelowej komórki.

Przenoszenie genu: Użyto nowozelandzkich białych królików (1,8-2,5 kg). Jako środek znieczulający zastosowano fentanylo-fluanizon (0,3 ml/kg)/midazolam (1 mg/kg) (Yla-Herttuala i in., J. Clin. Invest. (1995) 95:2692-2698). Nacięcie na środku szyi odsłoniło lewą szyjną tętnicę. Biologicznie obojętny 2 cm silastikowy kołnierz (MediGene Oy, Kuopio, Finlandia) położono wokół szyjnej tętnicy, tak aby dotykał przydanki łagodnie na każdym końcu (Booth i in., supra). Przenoszenie genu przeprowadzono 4-5 dni po operacji nakładania kołnierza. Dla potrzeb przenoszenia genu zwierzęta znieczulono. Kołnierz, który odsłonięto chirurgicznie, ostrożnie otwarto i napełniono 500 pl roztworu przenoszenia genu (patrz poniżej). Nacięcie zamknięto i tętnice zanalizowano później pod względem skuteczności przenoszenia genu.

189 744

Analiza histologiczna: Tętnice z kołnierzem ostrożnie usunięto i podzielono na trzy równe części: bliższą część utrwalono przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie/PBS (pH 7,4) na 15 minut, następnie osadzono w związku OCT (Miles Scientific, USA). Mięśniówkową trzecią część utrwalono przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie/PBS (pH 7,4) przez 4 godziny, płukano w 15% sacharozie (pH 7,4) przez 48 godzin i osadzono w parafinie. Najdalszą część osadzono w związku OCT i przetwarzano w zamrożonych odcinkach. Te przypadkowo wybrane przekroje zabarwiono środkiem X-gal wykrywającym aktywność β-galaktozydazy na 12 godzin i użyto do określenia skuteczności przenoszenia genu (Nabel i in., Science (1990) 249: 1285-1288; Yla-Herttuala i in., (1995) supra). Skuteczność przenoszenia genu obliczono jako procent komórek zawierających β-galaktozydazę w stosunku do łącznej liczby jąder w 20 przypadkowo wybranych pól 100X. Przypadkowo wybrane przekroje z każdej części tętnic z kołnierzem użyto do immunocytochemii i analizy typów komórek i/lub stosunków grubości błona wewnętrzna/mięśniówka (Booth i in., supra).

Typy komórek zidentyfikowano stosując następujące przeciwciała: komórki mięśni gładkich: HHF-35 mAb (rozcieńczenie 1:500, Enzo Diagnostics, USA), mAb α-aktyny (rozcieńczenie 1:1000; Sigma Chemical Co.); makrofagi: RAM-11 mAB (rozcieńczenie 1:1000; Dako, USA), anty-CD68 mAb (rozcieńczenie 1:250; Dako); komórki śródbłonka: anty-CD31 mAb (rozcieńczenie 1:50; Dako); leukocyty polimorfojądrowe: przeciw-CD45 mAb (rozcieńczenie 1:100; Dako); i przeciwkrólicze komórki T: MCa 805 mAb (rozcieńczenie 1:1000; Dako). Użyto układu awidyna-biotyna-peroksydaza chrzanowa do wykrywania sygnału (Vector laboratories) (Vla-Herttuala i in. (1995) supra). Po immunozabarwieniu przekroje tkanki zabarwiono kontrastowo hematoksyliną

Określenie indeksu namnażania: indeks namnażania w tętnicach z kołnierzem określono z zastosowaniem znakowania 5-bromo-2'-dezoksyurydyną (BrdU) (Soma i in., Artenoscler. Thromb. (1993) 13:571-578). W skrócie, nowozelandzkie białe króliki (n=12) otrzymały zastrzyk BrdU (40 mg/kg masy ciała) 3 godziny przed zabiciem. Tętnice szyjne utrwalano w 70% etanolu przez noc i osadzono w parafinie. Seryjne przekroje (20 przekrojów na zwierzę) zabarwiono w celu wykrycia BrdU z użyciem znakowanej FITC anty-mysiej IgG (Dako), następnie zabarwiono jądro jodkiem propydiowym. Wskaźnik znakowania obliczono jako procent jąder dodatnich względem BrdU. Przeciwstronną szyjną tętnicę operowano pozornie i użyto jako kontrolną.

Plazmidy/liposomy: plazmid ekspresji pCMV-e-galaktozydazy (lacZ) (Promega) skompleksowano z reagentem lipofektyną (BRL) w następujący sposób: 25 pg plazmidu powoli zmieszano z 25 pl lipofektyny z rozcieńczeniem do 500 pl roztworem Ringera. Nie zauważono osadów w roztworze plazmid/lipofektyna. Mieszaninę odstawiono w temperaturze pokojowej na co najmniej 15 minut i użyto do transferu genu w czasie dwu godzin. Preparaty plazmidowe sprawdzono pod względem nieobecności zanieczyszczenia lipopolisacharydami (próba Limulus, Sigma Chemical Co.).

Retrowirusy: W badaniach użyto retrowirusy pLZRNL MMLV zawierające LacZ (Yla-Herttuala i in., (1995) supra; Miyanohara i in., PNAS (1988) 85:6538-6542) lub pseudotypowe retrowirusy lacZ VsV-G (Yee i in., PNAS (1994) 91:9564-9568). W obydwu ekspresja lacZ jest napędzana 5' LTR. Pozbawione zdolności do replikacji amfotroficzne retrowirusy LZRNL opakowywano w komórki PA317 i użyto przy mianie 5x10⁵ cfu/ml w opisany sposób (Yla-Herttuala i in., (1995) supra). Pozbawione replikacji pseudotypowe retrowirusy VSV-G wytworzono w komórkach 293 GP z zastosowaniem przejściowej transfekcji (Yee i in.. supra). Pseudotypowe retrowirusy zatężono przez ultraodwirowanie i użyto przy mianie 111x10⁷ cfń/ml. Przed użyciem retrowirusowe preparaty sprawdzano nod względem nieobecności bakteriolo-- 2. X V 1 - ' ------X —G>- Ł ----- ~ gicznych zanieczyszczeń lub wirusów pomocników (Yee i in., supra).

Wektory adenowirusowe: W badaniach zastosowano pozbawione replikacji adenowirusy z delecją. E1 (Gosh-Choudhury i in., Gene (1986) 50: 161-171; Simari i in., J. Clin. Invest. (1996) 98: 225-235). Ukierunkowane na jądro cDNA β-galaktozydazy z promotorem β-aktyny i enhancerem CMV klonowano do regionu z wyciętym E1 adenowirusowego genomu z zastosowaniem homologicznej rekombinacji (Gosh-Choudhury i in., supra; Simari i in., supra). Pozbawione replikacji adenowirusy wytworzono w 293 komórkach i zatężono przez ultraodwirowanie. Miana 1x10⁹ pfu/ml użyto w eksperymentach przenoszenia genu. Adenowirusowe

189 744 preparaty zanalizowano pod względem nieobecności wirusów pomocników lub bakteriologicznych zanieczyszczeń (Gosh-Choudhury i in., supra).

Wyniki: Kołnierz przydankowy prowadzi do nowego rozrostu błony wewnętrznej naczyń 7-14 dni po operacji. Śródbłonek pozostał anatomicznie nienaruszony podczas badań. Znakowanie BrdU wskazało na szczytowy wskaźnik namnażania 23% w 3 dni po operacji. Nowa błona wewnętrzna była wyłącznie złożona z komórek mięśni gładkich. Kompleksy plazmid/liposom prowadziły do wykrywalnego przenoszenia genu do przydanki i zewnętrznej mięśniówki, z wydajnością mniejszą niż 0,01%. Nietransfekowane lub potraktowane liposomem tętnice z kołnierzem nie wykazały zabarwienia wskazującego na aktywność β-galaktozydazy.

Przydankowe retrowirusowe przenoszenia genu było mniej skuteczne bez kołnierza, prawdopodobnie z uwagi na to, że retrowirusowe przenoszenie genu zachodzi tylko w komórkach namnażających się. Skuteczność przenoszenia genu z pozbawionymi replikacji retrowirusami MMLV była niska (mniej niż 0,01%). Skuteczność przenoszenia genu z pseudotypowymi retrowirusami VSV-G wynosiła 0,1%. Przy zastosowaniu retrowirusów MMLV i VSV-G zaobserwowano zabarwienie β-galaktozydazy w przydance i zewnętrznej mięśniówce.

Pozbawione replikacji adenowirusy zapewniły skuteczne przenoszenie genu, na co wskazuje wykrycie zabarwienia β-galaktozydazy w przydance i zewnętrznej mięśniówce. Należy podkreślić, że zabarwienie zauważono także w pewnych komórkach śródbłonka i w pewnych komórkach błony wewnętrznej. Z uwagi na to, że konstrukt adenowirusa lacZ zawierał sygnał lokalizacji jądrowej dla β-galaktozydazy, intensywne zabarwienie X-gal stwierdzono w jądrach transfekowanych komórek. Skuteczność przenoszenia genu wynosiła około 10%, jak oceniono z łącznej liczby zabarwionych jąder w analizowanych przekrojach. Pewne komórki zapalne zauważono w tętnicach VSV-G transfekowanych retrowirusem i adenowirusem. Nie stwierdzono komórek zapalnych w tętnicach transfekowanych plazmidem/lipos- omem.

W tym przykładzie przeniesienie genu markera β-galaktozydazy (lacZ) do przydanki i zewnętrznej mięśniówki zaszło we wszystkich systemach przenoszenia genu. Adenowirusy przenosiły także gen β-galaktozvdazv do pewnych komórek śródbłonka. Po 5 dniach adenowirusowe wektory dały najwyższą skuteczność przenoszenia genu; do 10% komórek wykazywało aktywność β-galaktozydazy. Pseudotypowe retrowirusy VSV-G były także skuteczne w uzyskiwaniu przenoszenia genu w 0,1% komórek w przydance i zewnętrznej mięśniówce. Kompleksy plazmid/liposom i retrowirusy MMLV infekowały <0,01% komórek. Nie zauważono niekorzystnych reakcji tkankowych przy dowolnych układach przenoszenia genu.

Tak więc pozbawione replikacji adenowirusy, pseudotypowe retrowirusy VSV-G i kompleksy plazmid/liposom można stosować do przenoszenia genu do ścianek tętnicy z użyciem sposobu kołnierzowego. Działanie na mięśniówkowe komórki mięśni gładkich i nawet śródbłonek można uzyskać od strony przydankowej.

Przykład 3

W tym przykładzie badano pobudzanie PGE przez VEGF

Hodowla komórek: Komórki HUVEC otrzymano od Clonetics i hodowano w pożywce producenta, uzupełnionej 2% FBS, lub hodowano ze świeżych pępowin przez trawienie kolagenazą i hodowlę na 1 % powlekanych żelatyną, płytkach z pożywką 199 uzupełnioną 20% FCS i środkiem uzupełniającym dla wzrostu komórek śródbłonka (Wheeler-Jones i in., Biochem. J. (1996) 315:407-416). Dla celów doświadczalnych pierwotne kultury HUVEC zdyspergowano przez traktowanie 0,05% trypsyną/0,02% EDTA przez 5 minut w temperaturze 37°C i następnie umieszczono na 90 mm, 60 mm lub 35 mm plastikowych płytkach, lub na 24_-studzienkowych płytkach. Kultury trzymano w wilgotnej atmosferze 5% CO₂ i 90% powietrza w temperaturze 37°C i użyto po 6-8 dniach lub gdy komórki utworzyły zlaną monowarstwę.

Próba PGI2: Zlane kultury HUVEC w 24-studzienkowych płytkach przemyto dwukrotnie wolnym od surowicy M199 (pH 7,4) i wystawiono na działanie pożywki zawierającej VEGF. Zawartość PGI2 w supematantach komórki oceniono ilościowo w teście radioimmunologicznym 6-keto-PGFia, trwałego produktu rozkładu PGI2, jak opisano poprzednio (Wheeler-Jones i in., supra).

189 744

Uwalnianie kwasu craohidakawe'ga: Uwalnianie kwasu αrαchidokowego określono w sposób opisany w literaturze (Domin i Rozengurt, J. Biol.. Chem. (1993) 268:8927-8934.). Zlane kultury HUVEC inkubowano przez 24 godziny z kwasem [5,6,8,9,11,12,14,15-³H]arachidakowym (1 mCi/ml, 211 Ci/mmol). Komórki przemyto następnie dwukrotnie pożywką 199 i ikkubowαka w 1 ml tej pożywki uzupełnionej 0,3% BSA (zasadniczo wolnej od kwasów tłdsćozawych) i VEGF lub trombiną. Po traktowaniu pożywkę usunięto, odwirowano w mikrowirówce przy 16000 x g przez 5 minut i określono radioaktywność w suipematancie metodą zliczania w lioćkiku scyntylacyjnym.

Procedury hybrydyzacji Western: Traktowanie nieaktywnych kultur komórek czynnikami oraz lizę komórek wykonano w sposób opisany powyżej i w wynikach i legendzie figur. Po SDS-PAGE białka przeniesiono na membrany Immobilon (Millipore Inc.). Dla prób kinazy MAP membrany zablokowano z zastosowaniem 5% odtłuszczonego mleka w proszku w PBS, pH 7,2 i inkdbowaka przez 3-5 godzin w PBS/0,05% Tween-k0 zawierającym podane pierwotne przeciwciało (1 mg/ml). Przy hybrydyzacji z przeciwciałem względem cPLAj membrany blokowano przez 3 godziny w tBsT 50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 0,02% (v/w/v) Tween 20 pH 7,4 (TBST) zawierającym 0,2% (wagowo) I-block (Tropix), następnie inkubowako z pierwotną antysurowicą w TBST. Membrany przemyto następnie 6x (10 minut każdego przemywania) w TBST i inkubowcko przez godzinę w TBST zawierającym sprzężone z HRP drugorzędowe przeciwciało. Immdkorecktywe pasma wizualizowano metodą chemilumikesoencji z użyciem HRP sprzężonego z antymysim lub antykróliczym IgG i reagentem ECL™ zgodnie ze wskazówkami wytwórcy.

Próba z kinazą MAP: Komórki potraktowano czynnikami w podany sposób, przemyto szybko dwukrotnie zimnym PBS i natychmiast ekstrahowano przez dodanie 100 ml wrzącego 2x buforu próbek SDS-PAGE. Ekstrakty komórek zebrano przez zeskrobanie, ogrzewano w 95°C przez 10 minut i wprowadzono na 12,5% żele akrylamidowe SDS-PAGE. Po przeniesieniu na membrany ^mobilon białka hybrydyzowaka z przeciwciałem, które specyficznie rozpoznaje kinazy MAP p42 i p44 (Erk-1 i Erk-2) aktywowane przez fosforylowanie na Tyr204 (Payne i in., EMBOJ. (1991) 10:885-892).

Próba przesunięcia ruchliwości CPLA2: Zlane nieaktywne HUVEC na 60 mm płytkach przemyto dwukrotnie w wolnej od surowicy pożywce 199 (pH 7,4) i następnie wystawiono, na wskazany okres czasu, na działanie pożywki zawierającej czynniki, jak wymieniono w legendzie figur. Lizaty komórek wytworzono jak opisano uprzednio (Wheeler-Jones i in., supra). Białka oddzielono metodą SDS-PAGE (10% akrylamid) i po przeniesieniu na membrany hybrydyzowana z paliklokalką przeciwsdrowioą wobec CPLA2 (BarschHαdbold i in., J. Biol Chem. (1995) 270: 25885-25892; i Kramer i in., J. Biol. Chem. (1996) 271:27723-27729).

Próba wydzielania vWF: Wydzielanie vWF zmierzono metodą ELISA (Wheeler-Jones in., supra) w próbkach pożywki otrzymanych ze zlanych kultur HUVEC, które potraktowano czynnikami, w podany sposób. Płytki powleczono anty-vWF mAb CLBRAg35, przy czym dolna granica wykrywania dla próby wynosiła około 1,0 mU/ml.

Materiały: Zdominowany VEGF atrzymana z UBI lub z R & D Systems. Zrekombikawcky P1GF był darem profesora Wernera Risau i pochodził także z R & D Systems. Polikinalną przeoiwsurawicę CPLA2 otrzymano od dr Ruth Kramer (Eli Lilly, Indianapolis). Anty-vWF mAb CLBRAg35 był darem dr J. A. Van Mourik (Central Blood Laboratory, Amsterdam, Holandia). Przeciwciało do aktywowanej fosforowanej postaci p42/p44 kinazy MAP zakupiono z New England Biolabs inc. Kwas [5,6,8,9,Π,1k,14,15-³H]αrαohidonowy, reagenty ECL™ i sprzężona z HRP przeciwmysia IgG pochodziły z Amersham, W. Brytania. Kozią przeoiwkróliez^a sprzężoną z HRP IgG otrzymano z Pierce Inc. Wszystkie inne użyte reagenty były możliwie jak najwyższej czystości.

Wyniki: Zlane kultury HUVEC traktowano VEGF przez różne okresy czasu do godzin, po czym pożywkę usunięto i zbadano obecność 6-keto-PGFia trwałego metabolicznego produktu rozpadu PGI2. VEGF spowodował zależny od czasu wzrost wytwarzania PGI2, który był wykrywalny już po 15 minutach po dodaniu czynnika, wzrastał przez okres do 60 minut i utrzymywał się przez okres do 2 godzin. Kontrolne komórki wykazywały tylko mały wzrost wytwarzania PGI2 podczas badanego okresu. Pobudzanie przez VEGF wytwarzania PGI2 była także zależna od stężenia. Po 60 minutach inkubacji wzrost syntezy PGL· był

189 744 wykrywalny przy 5 ng/ml, w połowie maksymalny przy 10 ng/ml i osiągał maksimum przy 15 ng/ml. Odpowiednio stwierdzono, że .indukowana przez YEGF synteza PGI2 osiągnęła mały spadek przy 25 ng/ml.

Zbadano także, czy związany z VEGF czynnik P1GF, specyficzny ligand dla receptora Flt-1 VEGF, może wywołać syntezę PGI2 w HUVEC. W 5 niezależnych eksperymentach P1GF stymulował syntezę PGI2 znacząco słabiej niż VEGF. Odpowiedzi VEGF i P1GF porównano także z odpowiedziami trombiny, silnego induktora syntezy prostanoidu w komórkach śródbłonka i płytkach krwi. W kilku niezależnych eksperymentach, w których wpływy VEGF, P1GF i trombiny porównano bezpośrednio w równoległych hodowlach, średni wzrost

6-keto PGFia, uzyskany przy 60-minutowej inkubacji z 25 ng/ml VEGF, 60 ng/ml P1GF i 1 U/mltrombiny był odpowiednio 2,0-, 1,3- i 4,4-krotny wyższy od średniego kontrolnego poziomu bez pobudzania.

Gdyby pobudzanie VEGF syntezy PGI2 było pośredniczono przez aktywację izoformy PLA2, należałoby przewidywać, że VEGF spowoduje szybką mobilizację kwasu arachidonowego z komórek. Aby to zbadać, komórki HUVEC wstępnie inkubowano z radioznakawanyv kwasem arachidonowym przez 24 godziny, a następnie prowokowano za pomocą VEGF przez różne okresy czasu. VEGF spowodował wzrost ilości znacznika uwalnianego do pożywki wstępnie znakowanych komórek, który był zauważalny po 10 minutach i osiągnął maksimum po 30 minutach, po dodaniu czynnika. Jak zmierzono w równoległych hodowlach, przebieg czasowy dla stymulowanego przez VEGF uwalniania kwasu arachidonowego, był bardzo podobny do przebiegu dla trombiny. Zależność od stężenia dla stymulowanego przez VEGF uwalniania kwasu arachidonowego był bardzo podobny do otrzymanego dla wytwarzania PGI2, z połową maksimum przy 2,5-5 ng/ml i maksimum przy 10-20 ng/ml. Podobnie do względnych zdolności trombiny i VEGF do pobudzania wytwarzania PGI2, maksimum indukowanego przez YEGF uwalniania kwasu arachidonowego było zgodnie niższe niż uzyskane w przypadku trombiny. W czterech niezależnych eksperymentach VEGF i trombina powodują średni wzrost w uwalnianiu znakowanego kwasu arachidonowego odpowiednio 1,6- i 3,4-krotny powyżej podstawowego niestymulowanego poziomu. P1GF nie powodował wykrywalnego znaczącego wzrostu uwalniania kwasu arachiąanowega ze wstępnie znakowanych HUVEC.

Jednym możliwym mechanizmem szybkiego stymulowanego przez VEGF uwalniania kwasu arachidonowego jest bezpośrednie enzymatyczne uwalnianie kwasu arachidonowego katalizowane przez cytozolową postać PLA2. cPEA? może być aktywowane przez fosforylację zależną od kinazy MAP i podobnie, jak w przypadku fosforylacji i aktywacji innych enzymów, w tym kinazy MAP, konwersję cPLty do jego aktywowanej postaci można monitorować przez przesunięcie jego ruchliwości w żelach SDS-PAGE od postaci szybko- do wolnomigrującej. W związku z tym aktywację cPIla w odpowiedzi na VEGF określono metodą hybrydyzacji western ekstraktów HUVEC z użyciem specyficznego przeciwciała wobec GP.A2 (BarschHaubald i in., supra, oraz Kramer i in., supra). W kontrolnych ekstraktach niestymulowanych HUVEC, przeciwciało wobec CPLA2 rozpoznawało dwa różne pasma prawie równej intensywności i migrujące z Mr około 97000. Chociaż CPLA2 ma przewidywaną masę cząsteczkową 85 kDa, to białko opisano już jako migrujące na SDS-PAGE jako pasmo 97 kDa (BarschHaubald i in., supra, i Kramer i in., supra).

VEGF przy 25 ng/ml powodował znaczący wzrost immunareaktywności powoli migrującej postaci cPŁLA i równocześnie względny spadek dla szybciej migrującej postaci, który był wykrywalny po 2 minutach, osiągał maksimum po 15 minutach i trwał przez okres do 60 minut po dodaniu VEGF. W 5 niezależnych eksperymentach VEGF zgodnie powodował znaczny wzrost immunoreaktywności wolniej migrującej postaci CPEA2. Indukowany przez VEGF spadek elektroforetycznej mobilności CPLA2 był także zależny od stężenia, z zauważalnym wzrostem powoli migrującej postaci przy 2,5 ng/ml i maksimum wzrostu przy 5-10 ng/ml, najwyższym badanym stężeniu. Chociaż VEGF powodował pozorny spadek poziomu szybciej migrującej postaci CPLA2, ten związek był widoczny przy wszystkich stężeniach VEGF i zbadanych czasach traktowania. Trombina powodowała także zdecydowane przesunięcie w ruchliwości CPLA2 od szybciej do wolniej migrującej postaci, z których obie migrowały dokładnie wspólnie z wykrytymi w ekstraktach HUYEC potraktowanych YEGF. Bezpośrednie po189 744 równanie działania VEGF i trombiny w tym samym eksperymencie pokazało, że podobnie jak dla wyników otrzymanych dla syntezy PGI2 i uwalniania kwasu arachidonowego, trombina powodowała bardziej znaczący wzrost opóźnienia na żelu CPLA2 z praktycznie całkowitym zanikiem szybciej migrującej postaci enzymu. P1GF nie powodował wykrywalnego przesunięcia w ruchliwości immunoreaktywnego CPLA2 od szybciej do wolniej migrującej postaci.

Zbadano następnie, czy VEGF indukuje także wydzielanie vWF z komórek HUVEC. VEGF stymulował zależne od czasu i stężenie wytwarzanie vWF. vWF był wykrywalny w pożywce HUVEC nawet już w 30 minut po dodaniu 25 ng/ml VEGF do komórek i jego ilość zwiększała się z czasem, tak że osiągała poziom 2,5-krotny powyżej poziomu w kontrolnych komórkach po 3 godzinach. Zależność od stężenia wpływu VEGF była podobna do otrzymanej dla wytwarzania PGI2 z połową maksymalnej odpowiedzi przy około 10 ng/ml i maksimum efektu przy 25 ng/ml, najwyższym badanym stężeniu. Podobnie do wyników otrzymanych dla syntezy PGI2, wpływ VEGF był porównywalny, chociaż konsekwentnie słabszy, niż wpływ trombiny (fig. 12A). W przeciwieństwie do VEGF, P1GF nie powodował wykrywalnej pobudzanie wydzielania vWF przez HUVEC. Porównanie wpływów VEGF i P1GF na migrację HUVEC w komorach chemotaksji pokazało, że podczas gdy VEGF stymulował zależny od stężenia wpływ na chemotaksję, P1GF nie powodował wykrywalnego wzrostu w zakresie stężeń 5-60 ng/ml.

VEGF aktywuje kinazę p42/p44 MAP w HUVEC. W związku z tym, że uważa się, iż kinaza MAP jest związana z aktywacją CPLA2 przez inne czynniki, zwiększa to prawdopodobieństwo, że kaskada kinazy MAP może pośredniczyć w indukowanej przez VEGF syntezie PGI2 i aktywacji CPLA2. Zbadano zależność od stężenia dla stymulowanej przez VEGF aktywacji aktywności kinazy p42/p44 MAP w zlewających się HUVEC. Wystawienie komórek na działanie VEGF przez 15 minut spowodowało wykrywalny wzrost aktywności przy stężeniu wynoszącym zaledwie 0,5 ng/ml, połowę maksymalnego wzrostu pomiędzy 1 i 5 ng/ml, i maksimum efektu przy 10 ng/ml utrzymującego się aż do 50 ng/ml. W przeciwieństwie do zdecydowanego wpływu VEGF, P1GF w zakresie stężeń 1-60 ng/ml spowodował mały, o ile w ogóle wykrywalny wzrost aktywności kinazy MAP w HUVEC. Pobudzanie przez VEGF kinazy p42/p44 MAP zostało całkowicie zahamowane w wyniku prowadzonego przez 30 minut wstępnego traktowania za pomocą PD98059, selektywnego inhibitora kinazy kinazy MAP (Dudley i in., PNAS USA (1995) 92:7686-7689), kinaza treoninowej i tyrozynowej o podwójnej specyficzności, która w szczególności fosforyluje i aktywuje kinazę p42/p44 MAP Wpływ inhibitora był zależny od stężenia z ponad 50% hamowaniem przy 5 mM i zmniejszeniem aktywności kinazy MAP względem kontrolnego, niestymulowanego poziomu przy 10-20 mM.

Rolę kaskady kinazy MAP w indukowanej przez VEGF drodze mobilizacji kwasu arachidonowego zbadano początkowo przez zbadanie wpływu PD98059 na syntezę PGI2. Wstępne traktowanie HUVEC 30 mM PD98059 przez 30 minut całkowicie hamowało wytwarzanie PGI2 indukowane przez dalsze 60 minut inkubacji z 25 ng/ml VEGF lub 1 U/ml trombiny. Wpływ PD98059 na indukowaną przez VEGF syntezę PGI2 był zależny od stężenia, z połową maksymalnego efektu przy około 5 mM i maksimum efektu hamującego stymulowane wytwarzanie PGI2 przy 10 mM. Zauważono też, że PD98059 zmniejsza wytwarzanie PGI2 w komórkach potraktowanych VEGF do poziomu poniżej wartości mierzonych w kontrolnych komórkach, chociaż ten efekt był widoczny tylko przy stężeniu inhibitora większym niż 10 mM.

Zbadano następnie, czy PD98059 miał jakikolwiek wpływ na indukowany przez VEGF spadek elektroforetycznej mobilności CPLA2. Wstępne traktowanie PD98059 w stężeniu 25 mM całkowicie zablokowało stymulowany przez VEGF wzrost powoli migrującej postaci CPLA2. Podobnie, jak w przypadku wpływu PD98059 na syntezę PGI2, inhibitor nie tylko odwraca zależny od VEGF spadek mobilności żelowej CPLA2, lecz także zmniejsza immunoreaktywność wolniej migrującej postaci, a zwiększa szybciej migrującej postaci, w stosunku do wartości kontrolnych.

Selektywność wpływu PD98059 na indukowaną przez VEGF aktywację CPLA2 i syntezę PGI2 zbadano przez sprawdzenie, czy stymulowane przez VEGF wytwarzanie vWF było także podatne na hamowanie przez PD98059. W przeciwieństwie do wpływu PD98059 na aktywację CPLA2 i syntezę PGI2, wstępne traktowanie komórek HUVEC inhibitorem kinazy

189 744 kinazy MAP przy 25 mM nie zapobiegało ani znacząco nie zmniejszało wydzielania vWF powodowanego następnie przez dodawanie VEGF. PD98059 także nie miał wpływu na podstawowe lub stymulowane trombiną wydzielanie vWF.

Podsumowanie: VEGF stymulował zależny od czasu i stężenia wzrost syntezy PGI2, który był wykrywalny po 15 minutach, w połowie maksymalny przy 10 ng/ml i maksymalny przy 15 ng/ml po 60 minutach. W 10 niezależnych eksperymentach średnie maksimum stymulowanej VEGF syntezy PGI2 było 2-krotnie wyższe od poziomów podstawowych przy 25 ng/ml po 60 minutach. Związany z VEGF czynnik, czynnik wzrostowy łożyska (P1GF), indukował znacznie słabszy 1,3-krotny wzrost, a trombina (1 U/ml, 60 minut) indukowała średnie maksimum wzrostu 4,4-krotne powyżej poziomów kontrolnych. VEGF stymulował uwalnianie kwasu arachidonowego z HUVEC z podobną zależnością od stężenia jak dlasyntezy PGI2, lecz z szybszą kinetyką: połowa maksimum mobilizacji kwasu arachidonowego nastąpiła po 10 minutach i osiągnęła maksimum po 30 minutach. Pomiar aktywacji cytozolowej fosfolipazy A2 (cPI./Ą) z użyciem przesunięcia ruchliwości w SDS-PAGE jako wskaźnika aktywacji pokazał, że VEGF stymulował aktywność CPLA2 w sposób zależny od czasu i stężenia: wzrost powoli migrującej i aktywowanej postaci CPLA2 zachodził już po 2 minutach i był wykrywalny już przy 2,5 ng/ml, a osiągał maksimum po 15 minutach i przy 5 ng/ml. Podobnie jak w przypadku innych środków, które indukują syntezę PGI2, VEGF także powodował zdecydowany, zależny od czasu i stężenia, wzrost wydzielania czynnika von Willebranda (vWF) w HUVEC, wykrywalny już po 30 minutach, w połowie maksymalny przy 10 ng/ml i osiągał 2,5-krotność poziomów kontrolnych po 3 godzinach traktowania za pomocą 25 ng/ml VEGF. VEGF indukował szybką i przejściową aktywację kinazy p42/p44 MAP, która była wykrywalna już przy 1 ng/ml i osiągała maksimum przy 5-10 ng/ml. Natomiast P1GF wywierał niewielki wpływ na aktywność kinazy MAP. PD98059, selektywny inhibitor kinazy kinazy MAP, powodował całkowite zahamowanie stymulowanej przez VEGF aktywności kinazy MAP, syntezy PGI2 i opóźnienia na żelu CPI..A2, lecz nie miał wpływu na indukowane przez VEGF wydzielanie vWF. Te odkrycia stanowią pierwsze dowody na to, że VEGF może pobudzać syntezę PGI2 poprzez pośredniczone przez cPLA? uwalnianie kwasu arachidonowego. Te odkrycia także wskazują, że pobudzanie przez VEGF tej drogi biosyntezy może zachodzić, co najmniej w części, poprzez aktywację kinazy p42/p44 MAP.

Przedstawione wyniki wskazują, że VEGF pobudza zdecydowany, zależny od czasu i stężenia wzrost wytwarzania PGI2 w HUVEC. Wpływ VEGF był słabszy niż trombiny, chociaż odpowiedzi na dwa czynniki wahały się średnio o czynnik równy zaledwie 2,5. VEGF pobudza szybką mobilizację kwasu arachidonowego z ludzkich komórek śródbłonka oraz, jak można sądzić z próby opóźnienia na żelu, szybką aktywację CPLA2. Sposób użyty w celu określenia wpływu VEGF na mobilizację kwasu arachidonowego jest oparty na uwalnianiu znacznika ³H z komórek wcześniej znakowanych kwasem ³H-arachidonowym. W związku z tym, że badania uwalniania kwasu arachidonowego przeprowadzono z BSA obecną w pożywce, jest wysoce prawdopodobne, że głównym produktem uwalnianym z komórek HUYEC jest kwas ³H-arachidonowy. Zależności od stężeń dla indukowanego przez VEGF wytwarzania PGI2, uwalniania kwasu arachidonowego i aktywacji CPLA2 były podobne do siebie (wszystkie w zakresie 5-10 ng/ml). Te wyniki wskazują, że pobudzanie przez VEGF uwalniania kwasu arachidonowego i syntezy PGI2 są pośredmczonee przez receptory wysokiego powinowactwa względem tego czynnika w komórkach HUVEC.

Uwalnianie kwasu arachidonowego i przesunięcie ruchliwości CPLA2 zachodziły szybciej niż synteza PGI2, zgodnie z założeniem, że zwiększone wytwarzanie PGI2 jest bardzo prawdopodobne, co najmniej w części, bezpośrednią konsekwencją zwiększonej aktywności cPLA? i dalszego wzrostu dostępności wewnątrzkomórkowego kwasu arachidonowego, substratu konstytutywnego enzymu COX-1. Ponieważ VEGF, jak wiadomo, pobudza fosforylację fosfolipazy C-g tyrozynowej i metabolizm fosfoinozytydu, jest całkowicie możliwe, że inne mechanizmy, w tym kolejne działanie fosfolipazy C-g (i/lub fosfolipazy D) i lipaz diacylooraz monacylogliceryny, może także odgrywać rolę w indukowanej przez VEGF mobilizacji kwasu arachidonowego w syntezie PGI2.

Zbadano także, czy związany z VEGF czynnik, P1GF, specyficzny ligand dla Flt-1, może stymulować wytwarzanie PGI2. Wyniki sugerują, że P1GF może indukować syntezę PGI2, lecz

189 744 znacznie słabiej niż VEGF. Nie wykryto znaczącego wpływu P1GF na uwalnianie kwasu arachidonowego lub przesunięcie ruchliwości cPLA.2. Z uwagi na to, że P1GF wiąże się z wysokim powinowactwem tylko z receptorem Flt-1 VEGF, wyniki te są najbardziej zgodne z wnioskiem, że pobudzanie wytwarzania PGI2 przez VEGF w komórkach HUVEC jest mediowana głównie przez receptory KDR/Flk-1, lecz że Flt-1 może także przyczyniać się do pobudzania tej drogi. Jednakże żadna pośredniczona przez Flt-1 synteza PGI2 nie obejmie mechanizmu innego niż fosforylowanie cPFA?. Względnie niższą odpowiedź na P1GF można wyjaśnić na co najmniej 2 sposoby. Albo Flt-1 indukuje słabsze odpowiedzi, i/lub Flt-1 jest obecny w niższych stężeniach niż KDR/Flk-1.

Przedstawione wyniki wskazują, że VEGF wywołuje wydzielanie vWF w sposób zależny od czasu i stężenia. Zależność od stężenia wpływu VEGF na wydzielanie vWF zgadza się dokładnie z zależnością w odniesieniu do syntezy PGI2 i mobilizacji kwasu arachidonowego. W przeciwieństwie do względnie słabego wpływu P1GF na syntezę PGI2, P1GF nie stymulował wykrywalnego wzrostu uwalniania vWF przez komórki HUVEC.

Odkrycie, że VEGF powoduje szybkie przesunięcie w elektroforetycznej ruchliwości CPLA2, jest zgodne ze zwiększeniem fosforylacji, a zatem aktywacji, kinazy p42/p44 MAP. Wspiera to opisane odkrycie, że trombina, która jest znana z pobudzania fosforylacji i aktywacji CPLA2 w płytkach, powoduje podobne przesunięcie ruchliwości cPLA₇ w komórkach HUVEC. Przedstawione wyniki wskazują także, że VEGf aktywuje kinazę p42/p44 MAP i że hamowanie tej drogi selektywnym inhibitorem kinazy kinazy MaP, PD98059, blokuje wytwarzanie PGI2 i zwiększa opóźnienie żelowe CPLA2 indukowane przez VEGF. Wpływ PD98059 był co najmniej częściowo selektywny, gdyż nie stwierdzono wpływu na wydzielanie vWF pobudzane przez VEGF lub przez trombinę. W przeciwieństwie do tego uderzającego wpływu VEGF, P1GF nie zwiększał znacząco aktywności kinazy MAP. Oczywista niezdolność P1GF do pobudzania aktywności kinazy MAP jest ogólnie zgodna ze znacznie słabszym wpływem tego czynnika na wytwarzanie PGI2 w porównaniu z VEGF i z oczywistą niezdolnością tego czynnika do wywoływania opóźnienia na żelu cPLAj .

Próby z wytwarzaniem PGI2 w komórkach HUVEC wskazały na obecność znaczącego podstawowego poziomu syntezy. Co ciekawe, inhibitor kinazy kinazy MAP także uniemożliwił wytwarzanie PGI2 w kontrolnych, niestymulowanych komórkach. Zgodnie z pośredniczeniem wytwarzania PGI2 poprzez aktywację kaskady kinazy MAP, PD98059 także zmniejszał poziom powoli migrującej fosforylowanej postaci cPLAj poniżej poziomu kontrolnego i zwiększał poziom szybko migrującej, słabiej fosforylowanej postaci, powyżej poziomu kontrolnego. Próby aktywności kinazy MAP sugerują znaczący poziom podstawowej aktywności, którą także inhibitował PD98059. Te odkrycia sugerują, że aktywacja kinazy MAP może być odpowiedzialna nie tylko za zależną od VEGF i trombiny aktywację CPLA2, lecz że podstawowa aktywność kinazy MAP może także być konieczna do utrzymania konstytutywnej aktywności CPł^^₂ i wytwarzania PGI2.

Jest możliwe, że inne mechanizmy sygnalizacji mogą przyczyniać się do pobudzania VEGF syntezy PGI2 i uwalniania kwasu arachidonowego, w tym podniesienie wewnątrzkomórkowego poziomu [Ca²+].

VEGF był dotychczas uważany za czynnik angiogeniczny, który sprzyja wzrostowi i migracji komórek śródbłonka. Przedstawione odkrycia ujawniają dodatkową aktywność i mogą mieć ważne znaczenie przy regulacji działania śródbłonka i do zrozumienia działania VEGF, jak też leczenia i profilaktyce zaburzeń naczyń krwionośnych, takim jak zwężenie, nawrót zwężenia, miażdżyca tętnic i nadciśnienie.

189 744

Wykaz sekwencji (1) Informacja ogólna:

(i) Zgłaszający:

(A) Nazwa: EUROGENE LIMITED (B) Ulica: Marquis House, 67/68 Jermyn

Street (C) Miasto: Londyn (D) Stan: nie dotyczy (E) Kraj: Wielka Brytania (F) Kod pocztowy (ZIP): SW1Y 6NY (ii) Tytuł wynalazku:

Zastosowanie środka będącego białkiem VEGF oraz wszczep do stosowania leczniczego (iii) Liczba sekwencji: 10 (iv) Sposób odczytu komputerowego:

(A) Typ nośnika: dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1,0 wersja #1,30 (EPO) (v) Dane zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia: WO (nieznane) (2) Informacja o SEQ ID NO.: 1:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 441 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Fod23j ż^ciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA

189 744 (iii) Hipotetyczność: nie (iv) Nonsensowność: nie (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Położenie: 1...441 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO.: 1:

ATG Met 1

AAC TTT TGG CCG T<CT

TGG GTG

CAT His

TGG AGC rac GCC TTC

CTG Leu 15

CTC Lee

48

Asn Phe

L eu

Gee 5

Ger

Trp

Val

Trp 10

Ser

Leu

AAa

Leu

TAC

CTC

CAG

ATG

CCC

MG

TGG

TCC

CAG

GCT

GCA

CCC

AA^G

GCA

GAA

GGA

96

Tyr

Leu

Hla

G Hi

GAu

Lys

Tarp

Ser

Gln

Ala

Ala

Pro

MeU

Ala

Glu

Gly

20

22

30

GGA

GGG

AAG

ATG

CCA

CAC

GAA

GTG

GTG

MG

TTC

ATG

GGA

GAG

TAT

CCA

144

Gly

Gly

Gln

A sn

Ghs

Gis

Glu

Val

VaU

Lys

Pin e

Met

Asp

Vvl

Tyr

dn

35

40

45

CGC

AGC

ACG

GC G

CCA

CCA

ATC

ACC

CTG

GTG

CAC

ATC

TT^t:

CAG

GGG

192

Arg

Ser

Tyr

CCS

Hii

Paro

Ile

Glu

Thr

Leu

Val

Asp

Ilu

PPh

Gln

du

50

5 5

60

TAC

CCT

AAT

AGG

ATC

GAG

TAC

ATC

TTC

AAG

CCA

TCC

TGT

GTG

CCG

CTG

240

Tyr

Pro

Asp

G lu

Ile

Glu

iyr

I I^u?

Phu

Lys

Pro

Ser

Cys

Val

Pro

Leu

65

70

75

80

ATG

CGA

GCG

GGG

GCC

TGC

TGC

AAT

GAC

GAG

GGC

CTG

GAG

TGT

GTG

CCC

288

Met

Arg

cys

G Gu

Gly

Cys

Cys

Asn

Asp

Glu

Gly

Leu

Glu

CCS

Val

Paro

85

90

95

ACT

GAG

AM

CCG

AAC

ATC

ACC

ATG

CAG

ATT

ATG

CGG

ATC

GAU

CCT

CAC

306

Thr

Glu

Glu

S er

Asn

He

Thr

Met

Gln

ile

Met

Arg

Ile

Les

PC<3

His

100

105

112

CAA

GGC

AGG

ACG

ATA

CGA

GAG

AGC

TTC

CTA

CAG

CAC

AAC

AAA

TGT

3134

Gln

Gly

Gln

H Hs

Ul

Gly

Glu

Met

Sur

Phe

Leu

Gln

His

AAn

Lys

Cys

115

120

122

GAA

TGC

GAG

CAG

AAG

MA

GAT

AGA

GCA

AGA

CAA

GAA

JAAA

TTT

GAC

MG

432

Glu

Cys

Arg

P PO

LLs

Lys

Asp

Arg

Ala

Arg

Gln

Glu

Lys

cys

Asp

Les

100	13S	140
CCG AGG CGG			441
Pro Arg Arg
145

189 744 (2) Informacja e SEQ ID NO.: 2:

(i) Charakterystyka sekwencji·· (A) Długość: 147 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniewa (ii) Typ cząobcczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:: 2:

MbO Asn 1

Phe

Lee Leu Ser Trp Va1 His Trp

j^<—r

Leu a»a Lnu Leu 15

LLb

5

10

Tyr

Leu

His

His

Ala

Lys

Trp

br n

li n

Ala

Ala

Pro

Mn t

AZ a

Glu

Gly

20

25

33

Gly

Gly

Gln

Asn

His

His

Glu

Val

Val

Lys

hhb

MbO

Asp

Val

Tyr

Gln

35

40

45

Arg

Ser

Tyr

Cys

His

Pre

Ilb

Glu

Thr

Lbu

Val

Asp

Ilb

hhb

Gln

Glu

50

55

60

Tyr

rrn

Ss»

CU n

lb n

Cu n

Ty n

Ibn

hbn

Ts n

Pro

Ser

Cys

Val

Pro

Leu

65

70

47

88

MbO

Arg

Cya

Gly

Gly

Cys

Cys

sn n

ss n

Glu

Gly

Leu

GZ u

s»3

Val

Ppo

85

913

95

Thr

Glu

Glu

Ser

Asn

Ilb

Thr

bot

H n

He

bon

Arg

b

s»s

Pre

His

100

105

110

Gln

Gly

Gln

His

Ilb

Gly

Glu

MbO

Sbr

hhb

Lbu

Gln

His

Asn

Lys

Cys

115

120

Glu

Cys

Arg

Pre

Lys

Lys

Asp

Arg

Ala

Arg

Gln

Glu

Lys

Cys

Asp

Lys

130

135

HO

Pre Arg Arg

145 (2) Informacja e SEQ ID NO.: 3:

(i) Charakterystyka sekwenoji:

189 744 (A) Długość: 573 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczność: nie (iv) Nonsensoonośś: nie (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Położenie: 1...573 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO.: 3:

ATG AAC

TTT CTG Phe Leu 150

CTG tctt Leu Ser

TGG GTG CAT ATCG

AGC CTC GCC ITC

ccg Leu

CTC Leu

48

Het

Asn

Trp

Val 115

Kis

Trp

Ser

Leu

Ala 110

Leu

TAC

CTC

CAC

CAT

GCC

AAG

TGG

TCC

CAG

GCT

GCA

CCC

ATG

GCA

GGA,

GGA

96

Tyr

Leu

His

His

Ala

Lys

Trp

Ser

Gln

Ala

Ala

Pro

Met

Ala

Glu

Gly

165

170

175

GGA

GGG

CAG

AAT

(ATT

CAC

GAA

GTG

GTG

AAG

TTC

ATG

GAT

GTC

TAT

CAG

144

Gly

Gly

Gln

Asn

His

His

Glu

Val

Val

Lys

Phe

Met

Asp

Val

Tyr

Gln

180

185

190

195

CGC

AGC

TAC

TGC

CAT

CCA

ATC

GAG

ACC

CTG

GTG

GAC

ATC

ATTC

CAG

GAG

Arg

Ser

Tyr

Cys

K-Lis

Pro

Ile

Glu

Thr

Leu

Val

Asp

Ile

Phe

Gln

Glu

200

205

210

TAC

CCT

GAT

GAG

ATC

GAG

TAC

ATC

TTC

AAG

CCA

TCC

TGT

GTG

CCG

CGTG

240

Tyr

Pro

Asp

Glu

He

Glu

Ile

Phe

Lys

Pro

Ser

Cys

Val

Pro

Leu

215

220

225

ATG

CGA

TGC

GGG

TCC

TGC

AAT

GAC

GGTG

GGC

CTG

GAG

TGT

GTG

CCC

2B8

Met

Arg

Cys

Gly

Gly

Ccs'

Cys

Asn

Asp

du

Gly

Leu

Glu

CyS

Val

Pro

230

2231

240

ACT

CAG

GAG

TCC

AAC

ATC

ACC

ATG

CAG

ATT

ATG

CGG

ATC

GAAA

CCT

CCAC

336

Thr

Glu

Glu

Ser

Asn

Ile

Thr

Met

G! n

11 e

Met

Arg

Ile

Lys

Pro

His

245

250

255

189 744

CAA Gln 260	GGC CGG CCC ATA GGG GAG	ATG et C	AGC TTT: CCT CAG CAC MC MA TGT	3^^
Gly	Gln	His Ile	GLa gia 26S	Ssp Phh Lls 200	Gln	His	Asn	Lys Ccl 205
GAA	TGC	GAA	CAA AGA	AAA GAT	AGA	GCA GAA AM	AlA	AAC	CTG	TW GGG	433
Glu	Cys	Arc	Poc LsG	Lyy Asp	Arg	Ala Arr GGn	Glu	Lys	Pro	CCfs Gly
			280			285				290
CCT	TGC	CAA	AGC GGG	AGA MG	CAT	TTG TTT GTA	CM	GAT	CCG	CAG ACG	430
Pro	Cys	Sse	Glu Arg	Arr Lys	His	Leu Phh Val	Gln	Asp	Pro	Gln Thr
			295			300			330
TGT	AAA	TTA	CCA GCA	AAA AAC	ACA	GAC CCG GTA	TCC	MG	CCG	AGG CG	55i3
Cys	Lys	yy g	Src Lss	Lys ncT	r Cr	Asp Ssr Arg	Cys	Lys	Ala	Arg Gln
		310			315			320
CTT	GAG	TTA	AAC AAA	GTA CTA	TGC	AGA T<^T CAC	MG	CCG	AGG	CGG	573
Leu	Glu	Leu	Asn Glu	Arg Thr	Cys	Arg Ccl Asp	Lys	Pro	Arg	Arg
	325			330			335
(2) Informacja O 5EQ ID NO. :	4 :
	(i)	Charakterystyka	sekwencji:
		(A) Długość: 191 aminokwasów
		(B) Typ:	; aminokwas
		(D) Topologia:	liniowa
	(ii) Typ cząsteczki	: białko
	(xi) Opis sekwencji	: 5EQ ID NO.:	4 :
Met	Asn	Phe	Leu Leu	Ser TTp	Val	Ais Trp Ser		Ala	Leu	Leu Leu
1			5			10				11
Tyr	Leu	His	HHs Ala	Lys Trp	Ser	Gln AAg Ala	Pro	Met	Ala	G1c GLy
			20			25			30
Gly	Gly	Gln	Asn His	Hii Glu	Val	Val Lys Phe	Met	Asp	VaC	Tyr Gln
		35			40			45
Arg	Ser	Tyr	Cyy Cii	Aro Ile	Glu	TPc eua GcA	pcp	He	hec	Gnc Glu
	50			55			60
Tyr	Pro	ft5p	GGu TiG	GGu Tyr	Ile	Phe Lys Pro	Ser	Cys	vai	Pro Leu
65				70		75				80

189 744

Met

Arg Cys

Gly

Gly Cys 85

Cys

Asn Aen Glu Gl y Le u (31 u Cys Val Pro

90

95

Thr

Glu

Glu

See

Asn

IAs

Thr

Mle

Ghr

iet

ln n

le g

He

rg n

lro

Hie

100

105

m

Gln

Gly

Gln

His

Ile

Gly

Glu

Met

Se r

Phe

Le u

Gl n

Hi s

Asn

Lys

Cyn

115

120

125

Glu

Cys

Jsrg

Pro

Lls

Lls

Gas

nsr

nsl

Grg

Gln

Glu

Lyn

Pro

Cyn

Gly

130

135

140

Pro

Cys

Ser

Glu

Arg

Arg

yns

Hnn

eun

hee

lnG

Gln

Asp

Pro

Gln

Thr

145

150

1155

160

Cys

Lys

Ctys

Ser

Cys

Lys

Asn

Thn

Asp

Ses

Ar g

Cy s

Ly s

a1 a

.Arg

Gln

165

HO

115

Leu

Glu

Lete

A sn

Glu

GAr

Ghh

Gcs

Arg

Cyn

Anp

Lyn

Pro

Asg

Arg

180

115

110

(2) Informacja o SEQ ID NO.: 5:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 645 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczność: nie (iv) Nonsensowiośś: nie (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Położenie: 1...645

189 744 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO.: 5:

ATG AAC TTT

CTG CTG! TCC TGG!

GTG CAA TGG AGC

CTC Leu

GCC Gla

CGG Leu 205

TTG Leu

CCT LLe

48

Met

Asn Phe

Leu 195

Leu

Ser

Trp

Val

His 200

Trp

Sse

TAC

CTC CAC

CAT

GCC

AAG

TGG

TCC

CCG

GGG

AGG

ACC

ATC

GCA

GAA

GGA

99

Tyr

Leu His

His

Ala

Lys

Trp

Ser

GGn

Ala

AGa

Aro

Met

AGl

Glu

Gly

210

211

220

GGA

GGG CAG

AAT

cac:

CAC

GGA

GTG

GTC

AAG

TTC

ATG

GAT

GGT

TAI

CAC

114

Gly

Gly Gln

Asn

His

His

Glu

Val

Val

Lys

Phe

Met

Asp

Val

Tty^c

GGn

225

223

223

CGC

AGC TAC

TGC

CAT

C^G^iA

ATC

GG^G

ACC

CTG

GTC

mac

ATC

TTC

CAG

GAG

119

Arg

Ser Tyr

Cys

His

Pro

Ile

Glu

Thr

Leu

Val

Asp

He

Phe

Gln

GGu

240

245

225

225

TAC

CCT GAT

GAG

ATC

GAG

TAC

ATC

nrc

MAG

CCA

TCC

TGT

GTC

TTG

CGG

224

Tyr

Pro Asp

Glu

He

Glu

Tyr

Ile

Phe

Lys

Ppo

Ser

Cys

Val

Pro

Leu

260

265

270

ATG

CGA TGC

GGG

GGC

GTC3C

TGC

WAT

GAC

GAG

GGC

CTG

GAG

TGT

GTC

CICCG

2201

Met

Arg Cys

Gly

Gly

Cy s

Cys

Asn

Asp

Glu

Gly

Leu

Glu

Cys

Val

Pro

275

220

225

ACT

GAG GAG

TCC

AAC

ATC

ACC

ATG

CAG

ATT

ATC

CGC

ATC

AJAA

CTT

CGAC

336

Thr

Glu Glu

Ser

Asn

Ile

Thr

Met

Gln

Ile

Met

Arg

Ile

Lys

Pro

His

290

229

300

CAA

GGC CAG

CAC

ATA

GGA

GAG

ATG

AGC

TTC

CTA

GAtG

CAC

AAC

AAA

TGT

384

Gln

Gly Gln

His

Ile

Gly

Glu

Met

Ser

Phe

Leu

Gln

His

Asn

Lys

Cys

305

310

315

GAA

TGC AGA

CCA

AAG

GAAA

GAT

AGA

GCA

AGA

CA

GAA

AAA

AAA

TGA

GTT

432

Clu

Cys Arg

Pro

Lys

Lys

Asp

A^ig

Ala

Arg

Gln

Clu

Lys

Lsa

Ser

Val

320

325

330

335

CCA

GGA AAC

GCA

AAG

GGG

CAA

AAA

CGA

AAG

CGC

AAG

AGA

TGA

CCT

TAT

480

Arg

Gly Lys

Gly

Lys

G ly

Gln

Lys

Arg

Lys

Arj

Lys

Lys

SeA

A^a

T^r

340

345

300

AAG

TCC TGG

AGC

CTC

CCC

TCT

CGG

CCT

TOC

GCA

CAC

CGG

ACA

GAG

TAT

528

Lys

Ser Trp

Ser

Val

Pro

Cys

Gly

Pro

Cys

Ser

Glu

Aro

rrA

Lys

His

355

330

360

TTG

TTT GTA

CAA

GAT

CCG

CAG

ACG

GGG

GGA

TGA

TCA

TGC

MAA

AAT

ACG

576

189 744

Leu Phe	VaG dc 370	Asn ron Gln nhr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr
335	330
GAC TCG	CCT TGC	MG GCG AGn AAn	CTA SGC TSS AnG AAA TAS TCT Cne
Asp Sar	Arg Cys	Lys Ala Agn mn	Lu c G1 a Leu As n G1 u Arg Thr Cso
385		330	335
AGA TGT	GAC AAG	CCC AGG gga
Arg Cys	Asp Lys	Pro Arg AAg
400		445
(2) Informacja o SEQ ID NO	.: 6:
	(i) Charakterystyka sekwencji:
	(A) Długość: 215	aminokwasów

(B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa

	(ii) (xi)	Typ cząsteczki: Opis sekwencji:	białko	: 6:
seq	ID NO.
Het 1	Asn Phe	Leu Leu Sla Tgp Val 5	Hin	Tgp Seg 10	Leu SGa Leu Leu Leu 15
Tyr	Leu His	His Ala Lys Tgp Sla 20	GGi 25	SGa SGa	Pro Het Ala du Gly 30
Gly	Gly Gln 35	Asn His His du Vc1 44	Val	Lys hLc	MtC Asp Val lyr Gln 45
Arg	Sla Tyr 50	Cys His Pro He du 55	Thr	Leu Vn1	Asp I le Phe G ln Glu 60
Tyr 65	Pro Asp	Glu Ile Glu Tyr Ile 70	?he	Lys Pro 75	Ser Csc VnC Pro Leu 80
Het	Arg Cys	Gly GGy Ssc Ss a sic 85	Asp	du GSc 00	Luc Gln Cys Val Pro 95
Thr	Glu Glu	Ser Asi IGl Thg Het 100	Gln 105	IGl Het	Arg He Lss ono Sie 110
Gln	Gly dn 115	His Ile Gly du HeL 120	Ser	Phe Leu	dA His Asn Lls Cys H2

189 744

Glu

Cys

Arg

Ppo

Lys

Lys

Arg

Ala

Arg

GI n

Glu

Ly s

Ly s

Ser

Val

130

135

130

Arg

ggl

Lys

Gly

Lys

Gly

Gln

Lys

Arg

Lys

Arg

Ly s

Ly s

Se r

Arg

Tyr

135

150

115

160

Lys

Ser

Trp

ser

Val

Pro

Cys

GLy

Pro

Cys

Se r

GT u

Acg

.Arg

Las

His

165

1171

115

Leu

Phe

Val

Gln

Asp

Pro

Gln

The

Cys

Lys

Cys

Ser

Cys

Lys

Asn

Tlhir

180

185

190

Asp

Ser

Arg

CyS

Lys

Ala

Arg

Gnn

Leu

1Cu

Lca

Ae n

ue u

Aeg

Thr

Cys

195

20C

205

Arg

Cys

Asp

Lys

Pro

Arg

Arg

210

215

(2)

Informacja o

SEQ

! ID

NO.

. : 7

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 696 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) iipotetyczność: nie (iv) NNossensownoś: nii (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Położenie: 1...696

	(xi)	Opis eekwennji:	e EQ	I D	NCO	: 7
ATG	AAC TTT	TGA TGG CTT GGA TGA	ATT	GGA	GC A	TCT	CCG	TGA	CTG	CTC	45
Mes	Asn Phe	Llg Llg eoA Opt Vg e	is A	OpG	Log	Lla	Al A	Lil	Lal	Leu
		220		22)5					230

189 744

TAC CTC CAC CAT GCC AAG

TGG TCC Trp Ser

CCG GCT GCA CCC

ATG GCA dA Gd

96

Tyr

Leu

His

Hin Ala Lys 235

du 220

GAu Ala Pro

Met

Ala du 225

du

GGA

CGC

CAG

AAT

CAT

CAC

GJA\

G^<3

GCT

GAG

cttc

ATG

GAT

GTC

TAT

GCG

144

Gly

Gly

Gln

Ans

His

His

Glu

Val

Val

Lls

Phe

Met

Asp

Val

TTr

du

250

255

220

CGC

AGC

TAC

TGC

CAT

CCA

ATC

GAG

ACC

CCT

GTG

GAC

ATC

TCC

CCT

lgg

192

Arg

Ser

Tyr

Cyn

His

P ro

IIe

Glu

TTi-

Lye

Val

Asp

Ile

Phe

du

du

265

225

275

TAC

CCT

GAT

GAG

ATC

GAG

TAC

ATC

TTT

AAG

CCA

TCC

TGT

GTG

CCG

CTC

240

Tyr

Pro

Asp

Glu

Ile

G lu

Tyr

11 e

PPh

Lys

Gro

Ser

Cys

Val

Por

Gye

230

225

290

295

ATG

CCA

TGC

GGG

GGC

TGC

TGC

cggt

GAG

GGG

CCC

CTG

GAG

TGT

GAG

GCC

288

Met

Arg

Cys

Gly

Gly

Cys

Cys

Asn

Asp

du

G ly

Leu

Glu

Cys

Vaa

Loe

300

330

310

ACT

GAG

GAG

TCC

AAC

ATC

ACC

ATC

CGG

ATT

ctc

CGG

ATC

atac

CCT

CAC

336

Thr

Glu

Glu

Ser

Asn

n le

Thr

Met

dn

IIu

Met

Arg

Ile

Lys

PPr

Cii

315

320

325

CAA

GGC

CAG

CAC

ATA

gga

GAG

ATG

AGC

TTC

CTA

£CGG

CAC

AAC

TTA.

TTG

380

Gln

Gly

Gls

Hin

Ile

Gly

Glu

Met

een

Phe

Leu

Gln

His

Asn

Lyr

Ccs

330

335

340

CAA

TGC

AGA

CCA

AAG

AAA

GGT

AGA

GtCG

AGA

CAA

GAG

ATT

AAA

TCA

GGT

432

Glu

Cyn

Arg

Pro

Lys

Lys

Asp

Arg

Ala

Arg

Gln

Glu

Lys

Lys

See

Taa

345

350

3(55

CGA

GGA

AAG

GGA

AAG

GGG

CAA

AAG

CGA

TAG

CGC

TAJG

ATT

TCC

CGG

080

Arg Gly

Lyn

Gly

Lys

Gly

Gln

Lys

Arg

Lys

Arg

Lys

Lys

Sec

Arg

Tyr

360

366

330

375

AAG

TCC

TGG

ACC

GTG

TAC

GTT

GGT

GCC

CCC

TGC

TCT

CTA

ATG

CCC

T(Gl

525

Lys

Ser

Trp

Ser

Val

LTIT

Val

Gly

Al a

Arg

(Cys

Cys

Leu

M<^et

POO

TTp

350

335

390

AGC

CTC

CCT

GGC

CCC

GAT

CCC

TGT

GGG

CCT

TGC

TCA

GAG

ccgg

ATG

TTG

556

Ser

Leu

Pro

Gly

Prr

His

Pro

Cyn

Gly

Poo

Cys

Ser

Glu

Arg

Arg

Tyi

305

400

405

189 744

CAT His

TTl Lbu

TTT· GlA hbn acn 410

nAA GAT CCG CAG ACG TTT AAA TGT TCC TGC

AWA aac

624

ci n

Asp

Pro Gln Thr 415

Ccs Lys

Cys

Ser 420

Cys

Lys

Asn

ACA

GAC

TCl

ClT

TGC

AAl

GCG

AGG

CAG

CTT

GAG

TTA

wtc

GAA

CGT

ACT

672

Thy

Asp

bon

Arn

ts»

Lys

Ala

Arg

Gln

Leu

Glu

Leu

Asn

Glu

Arg

Thr

O2S

430

435

TlC

AGA

TlT

lAC

AAl

CCl

All

CGl

690

Cys

Arg

Cys

Asp

Lys

hye

Arg

Arg

440 445 (2) Informacja o SEQ ID NO.: 8:

(i) Cha—aktb—ystyka sbkwblcji:

(A) Długość: 232 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ ccąstbccki: białko (ci) Opis sbkwbncji: SEQ ID NO.: 8:

HbO Asn Phh Lm Leu Ser Trp Val His Trp Sbr Leu Ala Leu Leu Leu 15 10 15

Tyr Lbu His His Ala Lyn Trp Sqj— Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 22 30

Gly Gly Gln Ass Zis His Glu Val ViZ Lsn Phh Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45

Arg Sbr Tyr Cys His ren lbn Glu Thr Leu ViZ Asp inp PZe Gnn Glu 50 55 00

Tyr Pre Asp G1c ZIc Glu Tyr Ile Pbn Ts» Ppo Ser c^yn 'aan Pro Leu 05 70 77 80

MbO Aog Ts n Cl» Hy s»^s s»s Asn App cun Gle Leu Glu Cys VaC Pro 85 90 95

Thr GCu Glu Ser Asn lbn h—n Met dn Ibn MOZ Arg Ibn Lsn Pre His 100 115 ne

Gln lly GCn His IIb GIy llu MbO Sb— hhb Lbu lin His Asn Lys Cys 115 120 125

189 744

GGu

Cys

Arg

Pro

Lsn

Ly3

Asp

Arc

Ala

JA^g

Gln

Glu

Lys

Lys

Ser

Val

130

115

140

Arg

GGy

Lys

GGy

Lys

GGy

Gln

Lys

Arg

Lys

Arg

Lys

Lys

Ser

Arg

Tyr

145

10A

155

160

Lys

Ser

Trp

StA

VaG

Tyr

Val

GGy

Ala

Arg

Cys

Cys

Leu

Het

Pro

Trp

165

150

175

Seg

Leu

Pro

GGy

Pro

HSc

Pro

Csc

Gyy

Prc

Csc

Sec

Gic

Arc

Arg

Lss

180

185

190

His

Leu

Phe

VaG

Gln

Asp

Pro

Gln

Thr

Cyc

LS^S

Cys

Ser

Cas

Lys

Asn

195

200

205

Thr

Asp

Ser

Arg

Cys

Lys

Ala

Arg

Gln

Leu

Glu

Leu

Asn

Glu

Arg

Thr

210

225

220

Cys

Arg

Cys

Asp

Lys

Prc

Arc

Agg

005 200 (2) Informacja o EEA ID NO9:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 20 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) H^potetycznoBa: nie (iv) Nonstnsowność: nie (xi) Opis sekwencji: SEE ID NO.: 0:

TAAATAAATA AAATTTATAA (2) Informacja o SEE ID NO.: 10:

(i) CAhrrktoiysnokk cnLweLlji:

189 744 (A) Długość: 20 par zaoad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj oScSowoścS: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyconoćć: nie (iv) Nonoensowność: nie (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO.: 10:

TCCGTTTAAC TCAAGCTGCC

189 744

189 744

Fig.7 24 ^a 26

//77 'rrżi>25

Fig.8 ₃₇

189 744

189 744

Fig.1 Α-ρ-

Fig.3

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanieśsodka będąoego białldem VEGF mającym zdolność z«^Oifoiśu;ji in Ί tro i/lub in vivo komórek środbłonga albo kwasem nukleinowym kodującym to białko do wotwarzania leku do leczenia lub profilaktyki rozrostu błony wewnętrznej naczynia krwionośnego, którego środbłonek jest całkowicie lub w znacznej części nieuszkodzony·'.
2. 2. Zastosowantę według wietr/.l , znamlennetym. że ηηοζνηίειη krwiozośnymfest tymóea.
3. 3. Zastosowanie wedłogz aeire. l albo 2, znamienne aym, nn wytwarza wię lek do ię czenia lub profilaktyki zwężenia spowodowanego przez zabieg chirurgiczny lub związanego z nadciśnieniem w tętnicy płucnej.
4. 4. Zastosowań© wodług zws^. go znamion ne tym, żż żabie giem a^l^iiui^^mzr^)^^ jesc ongioplostoka, chirurgiczny zabieg wytworzenia wieńcowego przepływu omijającego, chirurgiczne zespolenie lub endarteregtomio.

   3. Zastosowanieweełof e ^Ιιζ. 1, zaanzienne tym, żż wytwarza się kk da leczekia iub profilaktyki zwężenia naczynia krwionośnego.

   3. Zastosowanże weełag gastge. 1, z^a^ienne tym, żż wytwarza wię lwO za s^c^^ni^ i lb profilaktyki nawrotu zwężenia naczynia krwionośnego.

   3. Zastosowame woHng zasire. g znamiezne tym, żż biaWo m a ęS.EQ JD

   NO.: 2, 4, 6 lub 8, albo jej aktywny fragment.

   3. Zastosowame weełαggastte. 1, zmarzienne tym, żż środkiem środ kwms nskleinoinu w połączeniu z wektorem wirusowym lub nigwirusowom.
5. 9. Zastosowame weełog z asire. g znurzzi en ne tym, żż aostarcza dog 0jn2okdo neeggiuo krwionośnego pacjenta w korpusie przystosowanym do szczelnego przylegania do naczynia, w którym to korpusie ten środek jest uljzomywafy wewnątrz tego korpusu lub jest związany z tym korpusem tak, że podczas stosowania ten środek styka się z przydankową powierzchnią naczynia.

   K). Wszcznp W ztosowania ineenifzegg pfzn2tosowjmy os unueszezenia w miensau IuZ w pobliżu miejsca rozrostu, które się leczy lub któremu się zapobiega, gdzie śródbłeneg jest całkowicie lub w znacznej części nieuszkodzony, znamienny tym, że zawiera środek zdefiniowany w zastrz. 1.

   Π. Wszcznp według ζο^ιζ. K),znaminnny tym, żż j eai nilżi1jgsn3nim lub wc^ml^rado·^ walnym wszczepem.

   Π. Wszczep wez^ zesirz. H) aUiz 11, znomien ny tym, że ma p o nać kołnieoza do umieszczania wokół naczynia krwionośnego w miejscu lub w pobliżu miejsca rozrostu, które się leczy lub któremu się zapobiega.

   F3. Wszcznp. według zastrZł 10 albr 1 1, 3narninnny tym, że sus newnętraną Sefętn2ę zasadniczo nieprzepuszczalną dla zawartego w nim środka.

   M. Wszcznp według zastre. gzan^^minsiny tym, żż ma newgętraną Scfęakę zasadfkco2 nieprzepuszczalną dla zawartego w nim środka.