NO325633B1 - Fremgangsmate for fremstilling av en biologisk aktiv, rekombinant, human, koaguleringsfaktor VIII i et celledyrkningsmedium som tillater ekspresjon og sekresjon av polypeptidet - Google Patents
Fremgangsmate for fremstilling av en biologisk aktiv, rekombinant, human, koaguleringsfaktor VIII i et celledyrkningsmedium som tillater ekspresjon og sekresjon av polypeptidet Download PDFInfo
- Publication number
- NO325633B1 NO325633B1 NO20065027A NO20065027A NO325633B1 NO 325633 B1 NO325633 B1 NO 325633B1 NO 20065027 A NO20065027 A NO 20065027A NO 20065027 A NO20065027 A NO 20065027A NO 325633 B1 NO325633 B1 NO 325633B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- factor viii
- cell culture
- culture medium
- metal
- proteases
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 32
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title claims description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 7
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 title abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 title 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 44
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims abstract description 38
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 35
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 29
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 25
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 claims description 13
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 claims description 13
- 108010025139 recombinant factor VIII SQ Proteins 0.000 claims description 8
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 7
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 claims description 7
- ZPHBZEQOLSRPAK-UHFFFAOYSA-N Phosphoramidon Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O ZPHBZEQOLSRPAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 6
- ZPHBZEQOLSRPAK-XLCYBJAPSA-N phosphoramidon Chemical compound N([C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)P(O)(=O)O[C@@H]1O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O ZPHBZEQOLSRPAK-XLCYBJAPSA-N 0.000 claims description 6
- 108010072906 phosphoramidon Proteins 0.000 claims description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 4
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 4
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 4
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 5
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 abstract description 4
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 abstract description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 17
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 16
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 13
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- YSOKXDUFQIWMQV-UHFFFAOYSA-N Chymostatin C Natural products CCCCC(NC(=O)CNC(=O)NC(Cc1ccccc1)C(=O)O)C(=O)NC(Cc2ccccc2)(C=O)C3CCNC(=N3)N YSOKXDUFQIWMQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 8
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 8
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 7
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- OLVPQBGMUGIKIW-UHFFFAOYSA-N Chymostatin Natural products C=1C=CC=CC=1CC(C=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(C1NC(N)=NCC1)NC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OLVPQBGMUGIKIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 4
- -1 Cu<2+> Chemical class 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 4
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 4
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 4
- MRXDGVXSWIXTQL-HYHFHBMOSA-N (2s)-2-[[(1s)-1-(2-amino-1,4,5,6-tetrahydropyrimidin-6-yl)-2-[[(2s)-4-methyl-1-oxo-1-[[(2s)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]pentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]carbamoylamino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound C([C@H](NC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C=O)C1NC(N)=NCC1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MRXDGVXSWIXTQL-HYHFHBMOSA-N 0.000 description 3
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 3
- 108090000227 Chymases Proteins 0.000 description 3
- 102000003858 Chymases Human genes 0.000 description 3
- BEUQWPLRPXILQA-UHFFFAOYSA-N Chymostatin B Natural products CCCC(NC(=O)CNC(=O)NC(Cc1ccccc1)C(=O)O)C(=O)NC(Cc2ccccc2)(C=O)C3CCNC(=N3)N BEUQWPLRPXILQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 3
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 3
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 3
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 3
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 108010086192 chymostatin Proteins 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 3
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 2
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 2
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 2
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical compound C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000003728 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000029 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Proteins 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Thiophene Chemical compound C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000006615 aromatic heterocyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 2
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 description 2
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,3-dimethyl-7-nitro-4h-isoquinolin-1-one Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C=C2C(=O)N(O)C(C)(C)CC2=C1 NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 3',6'-dihydroxy-2',4',5',7'-tetraiodo-3h-spiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3-one Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- 102000003676 Glucocorticoid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 1
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108090000131 Metalloendopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003843 Metalloendopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 description 1
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 102000015433 Prostaglandin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010050183 Prostaglandin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100033571 Tissue-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108050006955 Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000157 blood function Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940031098 ethanolamine Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 108091008479 interferon binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 1
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 1
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012622 synthetic inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229930192474 thiophene Natural products 0.000 description 1
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for reduksjon av den skadelige innvirkning av visse proteaser på rekombinant, humant protein og polypeptidmolekyler, ved tilsetning av en inhibitor av metall- avhengige proteaser eller chymotrypsiner til celledyrkningsmediet.
Description
Oppfinnelsens område
Den foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av en biologisk aktiv, rekombinant, human, koaguleringsfaktor VIII i et celledyrkningsmedium som tillater ekspresjon og sekresjon av polypeptidet.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Proteolytiske enzymer er innblandet i alle kropps-funksjoner, og for det meste i forbindelse med dem som har naturlige regulatoriske gjenparter, dvs. proteaseinhibitorer. The International Commission on Enzymes har etablert en syste-matisk klassifikasjon og nomenklatur for proteolytiske enzymer: 1) serinproteaser, 2) cysteinproteaser, 3) aspartin-proteaser, 4) metallproteaser, alle klassifisert ut fra en viktig gruppe i deres aktive senter, og til slutt 5) en subklasse av proteaser med katalytisk mekanisme som foreløpig er ukjent (Borivoj Keil, "Specificity of Proteolysis", Springer-Verlag NY, 1992, 336 sider. Intensjonen ved denne klassifisering er ikke funksjonell, heller ikke forbundet med den biologiske kilde til enzymet det dreier seg om. Problemet med klassifikasjon av proteolytiske enzymer, ofte avkortede proteaser, er beskrevet i introduksjonskapitlet: "The Classification of enzymes in Enzyme Nomenclature (1200) og er utført ut fra reaksjonene de katalyserer. Denne regel er vanskelig å anvende for endopeptidaser. Den generelle reaksjon katalysert av denne store gruppe av enzymer er i det vesentlige alltid den samme: kløyving av en peptidbinding. Et protein kan imidlertid ikke antas å være et substrat ut fra vanlige begreper: dette inneholder hundrevis av potensielle substrater, et sett av kvalitativt forskjellige peptid-bindingstyper med varierende antall til stede. Videre varierer tilgjengeligheten av disse bindinger ut fra den generelle konformasjon til polypeptidkjeden. Av denne grunn gjør Enzyme Nomenclature et unntak for endopeptidaser fra denne regel: istedenfor klassifisering ifølge den katalyserte reaksjon klassifiseres endopeptidaser ut fra type aktivt sete. På denne måte finnes enzymer med fullstendig forskjellig spesifisitet (som trypsin, chymotrypsin og prolylpeptidase) i samme gruppe". Som videre vist i samme referanse er substrat- og inhibitorspesifisitet mye mer komplisert enn en enkelt relasjon til fem enzymklasser. Uansett anvendes denne klassifikasjon omfattende i litteraturen, for eksempel når ulike virkninger av proteolyse beskrives.
I serinproteaser er en serinrest essensiell for aktiviteten, dvs. kløyvingsfunksjonen. Spesifisiteten til ulike serinproteaser bygger på trekkene ved hulrommene som passer inn i strukturene til tilsvarende substrater. En dyp kløft sørger for spesifisiteten chymotrypsin har for aromatiske og andre massive hydrofobe sidekjeder (se L. Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman og Co., San Francisco, CA, USA, 1981, s. 157-166) .
Mange proteaser trenger jordalkalimetaller eller metaller (i det følgende kun kalt metaller) for å ha aktivitet. De metall-avhengige proteaser er enten antatt å være metall-aktiverte proteaser (der metallioner må tilsettes for å oppnå aktivitet) eller metallproteaser (som inneholder metaller som en integrert del av strukturen til disse). Ved-rørende den første gruppe skjer aktivering og stabilisering av enzymer med metaller hos flere proteaseklasser, slik som serin- og cysteinproteaser.
Viktigheten av en metallprotease i dyrkede endotel-celler med hensyn til sekrering av en viss metabolitt er vist av R. Ikegawa et al i Biochem. Biophys. Res. Comm. 171(2), s. 669-675 (1990) . Dette ble vist ved suppresjonseffekten av denne sekresjon forårsaket av tilsetningen av en metallprotease spesifikk inhibitor. Det var imidlertid tydelig at enzymet ble avgrenset til det intracellulære rom, ettersom ingen virkning av inhibitoren ble erholdt i et cellefritt kondisjonert medium.
Virkningen av proteaser er imidlertid mye oftere nevnt i sammenheng med potensiell risiko for degradering av proteinet i vev.
Virkningen av proteaser i kulturer av CHO-celler er studert av M Satoh et al, In Vitro Cell Dev Biol 26, 1101-1104
(1990). Ulike inhibitorer ble anvendt for å klassifisere den proteolytiske aktivitet til stede. Det ble konkludert ut fra mangel på hemming ved tilsetning av fosforamidon, at prote-asene ikke tilhørte metallproteasene, i det minste ikke de generelt kjente, for å inhiberes av dette stoff. Virkningen av de tilsatte andre inhibitorer viste at den ekstracellulære proteolytiske aktivitet kom fra cysteinproteaser.
Et annet studie beskriver proteolytiske profiler for hhv. BHK-celler og hybridomkulturer ( R B Kratje et al, J Biotechnol. 32, 107-125 (1994). Ingen aktivitet av metallproteaser ble funnet hos noen av disse celletyper. Aktivitet tilsvarende flere serinproteaser ble imidlertid identifisert. Det ble også beskrevet at nærværet av proteaser ikke bare var avhengig av anvendte celletyper, men også dyrkningsbetingel-sene og alderen til kulturen.
Fra de ovenfor beskrevne artikler er det klart at en stabil sekresjon av polypeptider i cellekulturer kan svekkes ved hjelp av ulike proteolytiske enzymer. For en effektiv kontroll av disse degraderende krefter er det behov for fler-sidige verktøy. Ved en slik kontroll ville homogeniteten til målproteinet vært bedre bevart. Dessuten ville protein-additiver eller stoffer produsert endogent av cellene, som er mottakelige for proteolytisk angrep, vært beskyttet. Alt i alt ville en høyere ytelse og konsistens ved fremgangsmåten tatt under ett, oppnås.
Tokunaga et al, Yeast, vol. 9 (1993), s. 379-387 omfatter chymostatinsensiti<y> proteaseaktivitet i celledyrkningsmediet til Schizoaaccharomyces pombe som kløyver a-amylase sekrert inn i dyrkningsmediet. Tokunaga et al beskriver kun a-amylase fra mus. Videre er Schizoaaccharomyces pombe en delende gjær og a-amylase er et enzym, og da særlig et karbohydratdegraderende enzym.
EP-A2-319944 til "Zymogenetics" omfatter koekspre-sjon i eukaryote celler av et ønsket protein, f.eks. t-PA, faktor VII eller faktor IX, og et protein som prosesserer eller stabiliserer det ønskede protein, f.eks. en protease-inhibitor. I dette tilfelle produseres derfor proteaseinhibitoren in situ. Dette nødvendiggjør introduksjonen av en første DNA-sekvens som koder for det ønskede protein og minst én ytterligere DNA-sekvens som koder for det stabiliserte protein.
WO-A-9002175 til Novo-Nordisk beskriver en fremgangsmåte for å produsere polypeptider ved dyrking av eukaryote celler i nærvær av ulike proteaseinhibitorer. Spesifikke eksempler omfatter faktor VIII som polypeptidet, men proteaseinhibitorene er alle rettet mot serin- og cysteinproteaser.
I EP-A-306968.til Chemo-Sero-Therapeutic Res. Inst. og Teijin er det anvendt aprotinin i et celledyrkningsmedium for produksjon av et delesjonsderivat av faktor VIII. Eks-presjonsnivået etter tilsetning av 100 til 10000 KIU/ml ble fastslått å være to til tre ganger høyere enn kontrollen uten tilsetning av aprotinin.
Problemene i forbindelse med metall-avhengige proteaser og chymotrypsiner med hensyn til produksjonen av ulike proteiner er mye dårligere undersøkt enn rollen til cystein- og serinproteaser, særlig i litteratur som dekker pattedyrcellekulturer. Særlig har problemer med metall-avhengige proteaser og chymotrypsiner aldri blitt adressert tidligere i forbindelse med faktor VIII.
Ulike løsninger er foreslått for å redusere degra-deringen fra proteaser av proteiner og polypeptider, f.eks. plasmaavledede, så vel som rekombinante faktor VIII-molekyler. Disse oppløsninger har vært rettet mot å redusere innflytelsen av serin- og cysteinproteaser generelt. Serin- og cysteinproteaser er antatt å være de mest skadelige i blodplasma så vel som i cellekulturer. Således beskriver WO-A-9310143 til Johnson et al en fremgangsmåte for gjenvinning av et renset og stabilisert protein ved at en biologisk prøve inneholdende faktor VIII bringes i kontakt med minst ett proteaseinhibe-rende eller proteasefjernende middel. Fremgangsmåten er særlig rettet mot hemming eller fjerning av trombin, ettersom faktor VIII er antatt å være meget sensitiv for mindre mengder av denne serinprotease som er naturlig til stede i blodplasma. Proteaseinhibitorene omfatter, f.eks. benzamidin, antitrombin III, heparin og hirudin. Virkningen av fremgangsmåten er kun vist for plasmaavledet faktor VIII.
Målsetningen med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en løsning på problemene i forbindelse med
proteaser generelt og da særlig metall-avhengige proteaser og chymotrypsiner i celledyrkningsmedier anvendt for fremstilling av rekombinante proteiner og polypeptider, særlig faktor VIII.
Oppsummering av oppfinnelsen
Proteaser ser generelt ut til å redusere aktiviteten til proteiner og polypeptider ved degradering av molekylet. Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av en biologisk aktiv, rekombinant, human, koaguleringsfaktor VIII i et celledyrkningsmedium som tillater ekspresjon og sekresjon av polypeptidet, kjennetegnet ved at en inhibitor av metall-avhengige proteaser utvalgt fra gruppen bestående av peptider eller peptidanaloger funksjonalisert med fosforamidater, tilsettes celledyrkningsmediet.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
En målsetning med foreliggende oppfinnelse er å redusere innflytelsen av metall-avhengige proteaser og chymotrypsiner ved dyrking av vertsceller for produksjon av rekombinante polypeptider.
En annen målsetning med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe effektive dyrkningsbetingelser, for å lette og i det vesentlige bevare aktiviteten til de rekombinante polypeptider.
En ytterligere målsetning med oppfinnelsen er å øke halveringstiden til de proteininneholdende tilsetningsstoffer tilsatt celledyrkningsmediet og andre proteiner produsert av cellene og sekrert inn i dyrkningsmediet.
De ovennevnte målsetninger er imøtegått av foreliggende oppfinnelse som omfatter en fremgangsgmåte for produksjon av et biologisk, aktivt, rekombinant, humant polypeptid i et celledyrkningsmedium som tillater ekspresjon og sekresjon av polypeptidet, hvori en inhibitor av metall-avhengige proteaser eller chymotrypsiner, eller en kombinasjon derav, tilsettes celledyrkningsmediet.
Foreliggende oppfinnelse omfatter således en fremgangsmåte for fremstilling av en biologisk aktiv, rekombinant, human, koaguleringsfaktor VIII i et celledyrkningsmedium som tillater ekspresjon og sekresjon av polypeptidet, kjennetegnet ved at en inhibitor av metall-avhengige proteaser utvalgt fra gruppen bestående av peptider eller peptidanaloger funksjonalisert med fosforamidater, tilsettes celledyrkningsmediet .
Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har funnet
at visse proteaseinhibitorer har en overraskende positiv virkning på aktiviteten til polypeptider under dyrkning av vertsceller som uttrykker rekombinante polypeptider. Nærværet av disse inhibitorer fører til høyere produktivitet. På denne måte kan utbyttet av polypeptid med i det vesentlige bevart aktivitet og/eller homogenitet økes betydelig.
Inhibitorene av metall-avhengige proteaser og chymotrypsiner er egnede forbindelser som inneholder en hydrofob rest. Chymotrypsinene avviker fra andre serinproteaser på grunn av nærvær av en dyp kløft i det aktive sete. Denne dype kløft sørger for substratspesifisiteten til chymotrypsiner. Av denne grunn er den hydrofobe rest en aromatisk, heterosyklisk aromatisk eller en annen omfangsrik sidegruppe. Heterosykliske aromatiske sidegrupper omfatter aromatiske forbindelser i hvilke et element annet enn karbon er til stede i den aromatiske ring. Eksempler er pyridin, pyrrol, furan og tiofen. Videre omfatter begrepet hydrofobisk omfangsrik sidegruppe ifølge oppfinnelsen forskjellige andre ikke-polare ringstrukturer, slik som monosykloalkaner, f.eks. sykloheksan, disykloalkaner og polysykloalkaner, eller substituerte derivater av enhver av disse strukturer.
De metallavhengige proteaser er enten ansett for å være metallaktiverte proteaser (der metallioner må tilsettes for å få aktivitet) eller metallprotease (som inneholder metaller som en integrert del av strukturen til disse). Når det gjelder den første gruppe skjer ofte aktivering og stabilisering av enzymer med metaller i flere proteaseklasser, slik som serin- og cysteinproteaser. For eksempel innen området av blodfunksjoner, særlig koagulering, fibrinolyse og komplementaktivering, er en gruppe av vitamin K-avhengige kalsiumbindingsdomener vanlige (se Låszlo Patthy in Methods in Enzymology, 222, s. 10-21 (1993). Når det gjelder de siste metallproteaser kan en oversikt over pattedyrmetallendo-peptidaser, som er en viktig undergruppe av denne protease-klasse finnes i Bond et al, Int. J. Biochem., 17, nr. 5, s. 565-574 (1985). Forfatterne konkluderer med at Zn<2+> ser ut til å være det viktige metall for alle de karakteriserte patte-dyrmetallproteaser. I en nyere oversikt (D.A. Auld, Methods in .Enzymology, 248, s. 229-242 (1995)) er dette ion fortsatt . antatt å være det aktive ion hos de aller fleste metallproteaser. Dette utelukker ikke at andre metaller, slik som Cu<2+>, Fe<2+>, Fe3, Mn2+, Co<2+> og Cd<2+> også har en funksjonell rolle (Auld, se ovenfor) . Et enzym som er avhengig av Zn<2+> og også Ca<2+> er således beskrevet i Butler et al, Biochem. J., 241, s. 229-235 (1987) .
I foreliggende oppfinnelse kan inhibitorene av metall-avhengige proteaser være forbindelser som er strukturelt forbundet til det naturlige substrat til proteasen og inneholder en elektronegativ rest. Slike forbindelser er vanligvis peptider, peptidanaloger eller andre forbindelser som har en lignende del av det naturlige substrat, fortrinnsvis utvalgt fra gruppen bestående av fosforamidater, hydroksamater og karboksylater. Mekanismen for inhibering av metallproteaser med peptider eller peptidanaloger satt i funksjon med for eksempel fosforamidater, hydroksamater eller karbonyl-grupper er ikke helt klart. I litteraturen er imidlertid effekten av disse antatt å skyldes en chelaterende funksjon (se særlig s. 221-222 i Birkedal-Hansen et al, Critical Review in Oral Biology and Medicine, 4(2), s. 197-250 (1993)).
Strukturelt beslektede forbindelser kan være naturlige som for fosforamidon, eller syntetiske. Utformingen av slike syntetiske inhibitorer er beskrevet i Bond et al (se ovenfor). Ett eksempel beskrevet av N. Nishino og J.C. Powers i Biochemistry, 17 (14), p. 2846-2850 (1978), er syntesen av spesifikke inhibitorer for sinkmetallendopeptidasetermolysin. I dette tilfelle var spesifisiteten til inhibitorpeptid-analogen oppnådd ved å innføre en hydrofob aminosyre, bestemt for interaksjon med en tilsvarende lomme i det aktive sete til enzymet, i tillegg til "a hydroxamic acid"-rest, for interaksjon med sinkatomet. En beskrivelse av dette fenomen er gitt i B. Rogues et al i Methods in Enzymology, 248, s. 263-283, spesielt s. 268-269 og 272 (1995). Ytterligere eksempler på hydroksamater er beskrevet i WO 90/05719.
Fosforamidasene egnet for anvendelse ifølge oppfinnelsen kan være naturlige eller syntetiske. Fosforamidon er et naturlig fosforamidat, fortrinnsvis anvendt ifølge oppfinnelsen. Fosforamidon hemmer virkningen av termolysin, en metallendopeptidase. Strukturen til dette fosforamidat er N-
(a-L-rhamnopyransy1oksyhydroksyfos finy1)-L-1eucy1-L-1ryptofan) forkortet til Rha-P-Leu-Trp.
P-leucin-tryptofanresten til stede i fosforamidon er et vanlig trekk ved flere fosforamidater. Data fra ulike kilder indikerer at denne rest består av den aktive gruppe, f.eks. i fosforamidon. Det er derfor ved den foreliggende oppfinnelse særlig anvendt forbindelser inneholdende P-leucin-tryptof anresten .
Konsentrasjonen av inhibitoren av metall-avhengige proteaser kan være i området fra ca. 5 nM opp til ca, 5 mM, vanligvis i området fra 0,5 uM opp til 2 mM og fortrinnsvis i området fra 1 uM opp til 1 mM.
Chymotrypsiner er serinproteaser. I oppfinnelsen omfatter chymotrypsiner og chymotrypsinlignende proteaser. Chymotrypsinlignende proteaser omfatter her proteaser med en funksjon og/eller kjemisk struktur som ligner den til chymotrypsiner. I det følgende er chymotrypsin anvendt for å angi chymotrypsiner i tillegg til chymotrypsinlignende proteaser. En forbindelse mellom chymotrypsiner og en metallprotease er vist i Borivoj Keil, "Specificity of Proteolysis" (se ovenfor) , Tabell 11, s. 36-39. Ved en klassifisering ut fra de foretrukne aminosyresekvenser i kløvingssetet er chymotrypsin satt i gruppe med andre proteaser som kløyver i LYL (leucin, tyrosin, leucin). Blant andre enzymer i denne gruppe er en kollagenase, et enzym som vanligvis er referert til som en metallprotease.
Inhibitoren av chymotrypsiner kan være naturlig eller syntetisk, og strukturelt relatert til det naturlige substrat for proteasen. Inhibitoren av chymotrypsiner inneholder vanligvis en hydrofob rest. Funksjonaliteten til en hydrofob rest er en egenskap som deles med de spesifikke inhibitorer for sinkmetallendopeptidasetermolysin nevnt i et tidligere avsnitt. Inhibitoren av chymotrypsiner er som oftest utvalgt fra de naturlige forbindelser chymostatin A, chymostatin B eller chymostatin C eller enhver blanding derav. Vanligvis er chymostatin i en blanding inneholdende alle tre chymostatiner, chymostatin A utgjør hoveddelen. Alle chymostatiner inneholder en rest av den uvanlige aminosyre a-(2-iminoheksahydro-4(S)-pyrimidyl)-S-glysin. Strukturen til disse naturlige forbindelser er N-[(S)-l-karboksy-2-fenyletyl]-karbamoyl-a-N-[2-iminoheksahydro-4(S)-pyrimidyl]-S-glysyl-L-leucyl-fenylalaninal (Chymostatin A), N-[(S)-l-karboksy-2-fenyletyl]-karbamoyl-a-N-[2-iminoheksahydro-4(S)-pyrimidyl] -S-glysyl-L-valyl-fenylalaninal (Chymostatin B), og N-[(S)-1-karboksy-2-fenyl-etyl]-karbamoyl-a-N-[2-iminoheksahydro-4(S) - pyrimidyl] -S-glysyl-L-isoleucyl-fenylalaninal (Chymostatin C) .
Konsentrasjonen av forbindelsen som hemmer chymotrypsiner kan være i området fra ca. 0,001 ug/l opp til ca. 100 mg/l, vanligvis i området fra 0,01 ug/l opp til 25 mg/l, og fortrinnsvis i området fra 0,1 ug/l opp til 100 ug/l. De ovenfor gitte tall er lik en konsentrasjon av forbindelsen som hemmer chymotrypsiner i et område fra ca. 1,67 pM opp til ca. uM, vanligvis i området fra 16,7 pM opp til 41,7 uM og fortrinnsvis i området fra 167 pM opp til 167 nM.
Vertscellene for anvendelse kan være prokaryote eller eukaryote, fortrinnsvis eukaryote celler. Vertcellene for anvendelse ifølge oppfinnelsen kan være pattedyr-, bakterie-, sopp- eller-insektceller. Cellene er vanligvis pattedyrceller eller insektceller, fortrinnsvis pattedyrceller. Insektcellen kan være SF-9 eller SF-21-celler. Pattedyrceller kan være kinesisk hamsterovarie (CHO)-celler, babyhamsternyre (BHK)-celler, COS-celler eller hybridomceller, fortrinnsvis CHO-celler.
Celledyrkningsmediet kan inneholde serum. Vanligvis er imidlertid celledyrkningsmediet et medium med lite serum,
og fortrinnsvis et serumfritt medium. Celledyrkningsmediet kan dessuten inneholde én eller flere tilsatte proteiner, slik som humant serumalbumin (HSA), bovint serumalbumin (BSA), insulin, vekstfaktorer, IGF-1, IGF-2, veksthormon, neurotrofiner,
leptin, transferrin og von Willebrand-faktor (vWf). Dersom proteiner tilsettes celledyrkningsmediet, produseres fortrinnsvis slike proteiner ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker. Fortrinnsvis er celledyrkningsmediet et protein-fritt medium, dvs. fritt for tilsatte proteininneholdende forbindelser. Dette gjør produksjon av et polypeptid med en meget høy spesifikk aktivitet mulig. På denne måte vil mediet være godt definert og risikoen for introduksjon av foruren-sende stoffer, slik som mykoplasma, bakteriofager, virus og toksiner vil nesten være utelukket. I tillegg vil nedstrøms-rensing av de produserte polypeptidmolekyler være ønsket.
Celledyrkningsmediet kan være basert på et fullstendig medium, eller et næringsbasalt medium supplert med flere bestanddeler. Eksempler på egnede fullstendige media er ulike ASF-media markedsført av Ajinomoto fra Japan, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Eagle's Minimum Essential Medium, Ham's Medium F-12 og RPMI-1640 Medium. Ulike kombina-sjoner av DMEM og Ham's F-12, begge markedsført av GIBCO fra Renfrewshire i Skottland, er også egnet fullstendig medium for anvendelse ifølge oppfinnelsen. Et supplert basalt medium kan fremstilles ved tilsetning av komponenter av det næringsbasale medium ifølge vanlige prosedyrer for fremstilling av celledyrkningsmedium .
Supplementer tilsatt til celledyrkningsmediet er ikke kritisk for foreliggende oppfinnelse og kan kombineres av fagfolk på området som er egnet for den ønskede celle. Eksempler på tilsetningsstoffer som kan anvendes omfatter insulin, transferrin, askorbinsyre, etanolamin, glutamin og natriumselenitt.
Proteaseinhibitoren kan tilsettes celledyrkningsmediet én gang, flere ganger eller kontinuerlig under dyrk-ningsperioden. Inhibitorene tilsettes til celledyrkningsmediet ved bytte av medium. Proteaseinhibitoren kan være en blanding av en inhibitor av metallavhengige proteaser og en inhibitor av chymotrypsiner. Proteaseinhibitoren kan også være en kombinasjon av en inhibitor av metallavhengige proteaser og en inhibitor av chymotrypsiner, tilsatt i skjønnsmessig rekkefølge.
Polypeptider refererer seg til proteiner og oligo-peptider med minst 20 aminosyrer i kjeden. Antallet aminosyrer i polypeptidet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse ligger vanligvis i området fra 30 opp til 4500 aminosyrer og fortrinnsvis i området fra 40 opp til 3000 aminosyrer. Polypeptider som kan fremstilles, omfatter polypeptider med koagulerende, antikoagulerende og fibrinolytiske aktiviteter, membranbundne og kjernereseptorer og metabolismeregulerende humurale faktorer (hormoner). Spesifikke eksempler på polypeptider som kan fremstilles, er faktor VIII, faktor V, faktor VII, faktor IX, tPA, prostaglandinreseptorer, glukokortikoid-reseptorer, peroksisomproliferatoraktiverte reseptorer (PPAR), faktorer som fremmer vekst og celleoverlevelse, interleukin, interferon og IGF-bindende proteiner (IGFBP). Polypeptidene kan være fullengde, dvs. frekvensen til aminosyrene er identiske med tilsvarende sekvens funnet generelt hos pattedyr og særlig hos mennesker. Polypeptidene kan også være dele-sjonsderivater av fullengdepolypeptider, der én eller flere aminosyrer mangler. I foreliggende oppfinnelse er polypeptidet fortrinnsvis faktor VIII.
I foreliggende oppfinnelse kan faktor VIII fremstilt ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi være fullengdefaktor VIII eller fortrinnsvis et delesjonsderivat av fullengdefaktor VIII med koagulerende aktivitet. Med delesjonsderivat er det her ment koaguleringsfaktor VIII hvorved hele eller deler av B-domenet mangler, mens den koagulerende aktivitet er bevart. De gjenværende domener er vanligvis bundet av en aminosyre-linker. Eksempler på ulike linkerkonstruksjoner er gitt i P. Lind et al, Eur. J. Biochem., vol. 232 (1995), s. 19-27. Strukturen og biokjemien til rekombinant faktor VIII-produkter generelt er beskrevet av Kaufman i Trends in Biotechnology, 9, s. 353-359 (1991) og Hematology, 63, s. 155-65 (1991).
Fullengdefaktor VIII til stede i humant plasma har en molekylmasse på ca. 300 kDa. Faktor VIII-konsentrater avledet fra slik plasma inneholder flere fragmenterte fullaktive faktor VIII-former som beskrevet av Andersson et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83, s. 2979-83 (mai 1986). Den minste aktive form har en molekylvekt på ca. 170 kDa og består av to kjeder på ca. 90 kDa og ca. 80 kDa holdt sammen ved hjelp av metallion(er). Det refereres her til EP-A-0197901 (Pharmacia AB). Den biologisk aktive faktor VIII fremstilt, har derfor helst en molekylvekt i området fra ca. 170 kDa opp til ca. 300 kDa.
Pharmacia AB fra Stockholm, Sverige, har utviklet et rekombinant faktor Vlll-produkt som tilsvarer plasma faktor VIII-formen på ca. 170 kDa i terapeutiske faktor VIII-konsentrater. Det avkortede rekombinante faktor Vlll-molekyl ble kalt r-VIII SQ og er produsert av kinesisk .hamsterovarie (CHO)-celler i en celledyrkningsprosess i serumfritt medium. Strukturen og biokjemien til r-VIII SQ er beskrevet i WO-A-9109122 (Pharmacia AB). I foreliggende oppfinnelse er mer spesifikt, delesjonsderivatet faktor VIII SQ (r-VIII SQ).
Den rekombinante faktor VIII fremstilt i et celledyrkningsmedium ifølge foreliggende fremgangsmåte kan anvendes for fremstilling av et medikament for administrering til en pasient med symptomer på hemofili A. Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for behandling av hemofili A ved administrering av en terapeutisk effektiv mengde av rekombinant faktor VIII som er produsert i celledyrkningsmedium ifølge foreliggende fremgangsmåte.
pH i celledyrkingsmediet ligger helst i området fra ca. 6 til ca. 8. Osmolaliteten i celledyrkningsmediet ligger vanligvis i området fra ca. 280 opp til ca. 400 millimol.
Celledyrkningsteknikken være suspensjonskultur, monolagerkultur, slik som rullekolbe, mikrobærere eller hule fibre, fortrinnsvis suspensjonskulturteknikk.
Fremstillingsmåten ifølge foreliggende fremgangsmåte kan være kontinuerlig eller satsvis.
De følgende eksempler er tilveiebrakt kun for å illustrere og må ikke på noen måte betraktes som begrensning av rammen til foreliggende oppfinnelse som er definert av de vedlagte krav.
Prosentangivelsene og delene er per vekt, med mindre annet er angitt.
FORSØK
Fremstilling av rekombinant faktor VIII
Fremstillingen av rekombinant faktor VIII SQ (r-VIII SQ) ble i det vesentlige utført som beskrevet i patent WO-A-9109122 til Pharmacia & Upjohn, Eksempler 1-3. En DHFR-manglende CHO-cellelinje (DG44) ble elektroporert med en ekspresjonsvektor inneholdende r-VIII SQ-genet og en ekspresjonsvektor inneholdende dihydrofolatreduktasegenet. Etter seleksjon i selektivt medium ble overlevende kolonier ampli-fisert ved vekst i gradvis økende mengder av metotreksat. Supernatant fra de resulterende kolonier ble individuelt screenet med hensyn til faktor Vlll-aktivitet. En produksjons-klon ble valgt og denne ble deretter tilvent til serumfri suspensjonsvekst i et definert medium.
Materiale
Chymostatinet anvendt i forsøkene inneholdt chymostatin A, chymostatin B og chymostatin C, chymostatin A utgjør hoveddelen. Proteaseinhibitorene hadde alle analytisk renhet og var erholdt fra Sigma i St. Louis, USA.
Analytiske fremgangsmåter
Aktiviteten til koaguleringsfaktor VIII ble analy-sert ved hjelp av en kromogen substratanalyse (Coatest Factor VIII, Chromogenix AB, Molndal, Sverige. Aktivert faktor X (Xa) genereres via den indre reaksjonsvei hvor faktor VIII virker som kofaktor. Faktor Xa bestemmes så ved anvendelse av et syntetisk kromogent substrat, S-2222 i nærvær av en trombin inhibitor 1-2581 for å forebygge hydrolyse av substratet ved hjelp av trombin. Reaksjonen stoppes med syre og VIII:C, som er proporsjonal med frigjøring av pNA (para-nitroanilin), bestemmes fotometrisk ved 450 nm mot en kontroll. Enheten av faktor VIII:C uttrykkes i internasjonale enheter (IU) som angitt av International Concentrate Standard (IS) dannet av
WHO.
Cellelevedyktigheten ble bestemt ved flere anled-ninger som angitt i Tabellene I-IV for å bekrefte at de tilsatte inhibitorer ikke hadde.noen negativ virkning på celle-overlevelsen gjennom hele produksjonsperioden. Analysene ble gjort etter farging av cellene med Erythrosin B i et Biirker-kammer eller ved hjelp av "flow"-cytometri. Andelen av levende celler ble beregnet i forhold til det totale antall celler
(<%>) <.>
Eksempel 1
Foreliggende eksempel er ment å vise effektiviteten av foreliggende oppfinnelse sammenlignet med ulike andre proteaseinhibitorer.
CHO-celler ble dyrket under vekstbetingelser i ristekolber i et fullstendig medium, slik som ASF eller en blanding av DMEM og Ham's Medium F-12. Innledningsvis var temperaturen 37 °C og celleinnholdet var 0,7 x IO<6> celler/ml i celledyrkningsmediet. Dag 0 var definert som dagen for påbegynnelse av produksjon. Temperaturen ble senket til 34 °C. Ved dag 3 ble dyrkningsmediet byttet ut med et ferskt medium inneholdende 0,5 mM smørsyre, og celleinnholdet ble justert til ca. 3 x IO<6> celler/ml i celledyrkningsmediet. Ved dag 4 ble en suspensjon av céllene i produksjon fordelt til poly-propylenrør for kontinuerlig dyrkning og proteaseinhibitorer ble tilført. På dag 5 ble mediet byttet ut og proteaseinhibitorer tilsatt. Utbytting av medium ble utført på dag 6, dag 7, dag 10 (akkumulert verdi etter 72 timer). På dag 11 ble for-søkene stoppet. Westernblotanalyser viste at kvaliteten på den produserte faktor var i det vesentlige upåvirket. Levedyktig-heten var generelt høy. Den laveste verdi, 90 % erholdt for kontrollen og aprotinin, men hensyn til produksjon, var dag 11.
Resultatene er gitt i de følgende tabeller.
Som det kommer frem av Tabell I øker nærværet av proteaseinhibitorer ifølge oppfinnelsen dramatisk muligheten for å bevare faktor VIII:C. Som det kommer frem fra Tabell II, har tilstedeværelsen av ulike andre proteaseinhibitorer en meget liten eller endatil negativ virkning på faktor VIII:C. Fra Tabell III kommer det frem at den økte produksjon av faktor VIII vist i Tabell I ikke skyldes en økt eller redusert cellelevedyktighet. Fra Tabell IV kommer det videre frem at mangel på virkning på produksjon av Faktor VIII vist i Tabell II, ikke er en virkning som motvirker en redusert cellelevedyktighet.
Claims (11)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av en biologisk aktiv, rekombinant, human, koaguleringsfaktor VIII i et celledyrkningsmedium som tillater ekspresjon og sekresjon av polypeptidet,
karakterisert ved at en inhibitor av metall-avhengige proteaser utvalgt fra gruppen bestående av peptider eller peptidanaloger funksjonalisert med fosforamidater, tilsettes celledyrkningsmediet.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den metall-avhengige protease er en metalloprotease.
3. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at metallionet krevet for aktivitet av den metall-avhengige protease utvelges fra gruppen bestående av Zn<2+>, Cu<2>+, Fe<2>+,. Fe<3>+, Mn<2>+, Co<2>+ og Cd<2+.>
4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 3, karakterisert ved at inhibitoren av metall-avhengige proteaser er fosforamidon som inneholder en P-leucin-tryptofanrest.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at konsentrasjonen av inhibitoren av metall-avhengige proteaser er mellom 1 uM og 1 mM.
6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 5, karakterisert ved at cellen er en pattedyr-, bakterie- eller insektcelle.
7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 6, karakterisert vedat cellen er en pattedyrcelle.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at pattedyrcellen er utvalgt fra gruppen bestående av kinesisk hamsterovarie (CHO)-celler, babyhamsternyre (BHK)-celler, COS-celler og hybridomceller.
9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 8, karakterisert ved at celledyrkningsmediet er et serumfritt medium.
10. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 9, karakterisert ved at den rekombinante koaguleringsfaktor VIII er et delesjonsderivat av fullengdefaktor VIII der B-domene er fjernet med bevart koagulerende aktivitet.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at delesjonsderivatet av faktor VIII der B-domene er fjernet er rekombinant faktor VIII SQ (r-VIII SQ).
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9601855A SE9601855D0 (sv) | 1996-05-14 | 1996-05-14 | Process for producing a protein |
| US1887496P | 1996-05-29 | 1996-05-29 | |
| PCT/SE1997/000783 WO1997043436A1 (en) | 1996-05-14 | 1997-05-13 | A process for producing a recombinant polypeptide involving the addition of an inhibitor of metal-dependent proteases or chymotrypsins to the cell culture medium |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20065027L NO20065027L (no) | 1999-01-14 |
| NO325633B1 true NO325633B1 (no) | 2008-06-30 |
Family
ID=26662616
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19985297A NO325358B1 (no) | 1996-05-14 | 1998-11-13 | Fremgangsmate for fremstilling av en biologisk aktiv, rekombinant human blodkoaguleringsfaktor VIII i et celledyrkningsmedium som tillater ekspresjon og sekresjon av polypeptidet. |
| NO20065027A NO325633B1 (no) | 1996-05-14 | 2006-11-02 | Fremgangsmate for fremstilling av en biologisk aktiv, rekombinant, human, koaguleringsfaktor VIII i et celledyrkningsmedium som tillater ekspresjon og sekresjon av polypeptidet |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19985297A NO325358B1 (no) | 1996-05-14 | 1998-11-13 | Fremgangsmate for fremstilling av en biologisk aktiv, rekombinant human blodkoaguleringsfaktor VIII i et celledyrkningsmedium som tillater ekspresjon og sekresjon av polypeptidet. |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5851800A (no) |
| EP (1) | EP0934424B1 (no) |
| JP (2) | JP2000509994A (no) |
| AT (2) | ATE321141T1 (no) |
| AU (1) | AU716245B2 (no) |
| CA (1) | CA2253287C (no) |
| DE (2) | DE69736391T2 (no) |
| DK (1) | DK0934424T3 (no) |
| ES (2) | ES2260524T3 (no) |
| NO (2) | NO325358B1 (no) |
| NZ (1) | NZ332751A (no) |
| PT (2) | PT1318198E (no) |
| WO (1) | WO1997043436A1 (no) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6475725B1 (en) | 1997-06-20 | 2002-11-05 | Baxter Aktiengesellschaft | Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same |
| DK2193809T3 (en) | 1999-02-22 | 2015-05-26 | Univ Connecticut | The albumin-free Factor VIII formulation |
| AT409379B (de) * | 1999-06-02 | 2002-07-25 | Baxter Ag | Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen |
| EP1200561B1 (de) * | 1999-08-05 | 2006-06-14 | Baxter Aktiengesellschaft | Rekombinanter stabiler zellklon, seine herstellung und verwendung |
| WO2001052891A1 (fr) * | 2000-01-20 | 2001-07-26 | Nippon Organon K. K. | Inhibiteurs d'invasion plasmodiale dans des erythrocytes |
| AU2003249990B2 (en) * | 2002-07-09 | 2007-06-28 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Animal protein free media for cultivation of cells |
| BR0316882A (pt) * | 2002-12-23 | 2005-10-25 | Bristol Myers Squibb Co | Melhora na qualidade de produtos em processos de cultura de células de mamìferos para a produção de proteìnas |
| CN101857851A (zh) * | 2002-12-23 | 2010-10-13 | 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 | 用于蛋白质生产的哺乳动物细胞培养方法 |
| US20040265964A1 (en) * | 2003-04-25 | 2004-12-30 | Martin Allen | Inducers of recombinant protein expression |
| US7255288B2 (en) * | 2004-03-08 | 2007-08-14 | Wan Shan Chan | Aroma therapy for fountain |
| US20060094104A1 (en) | 2004-10-29 | 2006-05-04 | Leopold Grillberger | Animal protein-free media for cultivation of cells |
| EP1707634A1 (en) | 2005-03-29 | 2006-10-04 | Octapharma AG | Method for isolation of recombinantly produced proteins |
| PT1974014T (pt) | 2006-01-04 | 2017-05-26 | Baxalta Inc | Meios de cultura celulares livres de oligopeptídeos |
| EP2126106B1 (en) * | 2007-02-23 | 2017-09-06 | Sk Chemicals Co., Ltd. | Process for producing and purifying factor viii and its derivatives |
| EP1988101A1 (en) | 2007-05-04 | 2008-11-05 | Novo Nordisk A/S | Improvement of factor VIII polypeptide titers in cell cultures |
| WO2008135498A2 (en) * | 2007-05-04 | 2008-11-13 | Novo Nordisk A/S | Prevention of protein degradation in mammalian cell cultures |
| MX339060B (es) | 2008-11-07 | 2016-05-09 | Baxter Int | Formulaciones del factor viii. |
| US9540426B2 (en) | 2009-10-06 | 2017-01-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Mammalian cell culture processes for protein production |
| WO2012045769A1 (en) | 2010-10-05 | 2012-04-12 | Novo Nordisk Health Care Ag | Process for protein production |
| WO2014062535A1 (en) | 2012-10-15 | 2014-04-24 | Bristol-Myers Squibb Company | Mammalian cell culture processes for protein production |
| RU2741345C2 (ru) | 2015-10-28 | 2021-01-25 | Юхан Корпорейшн | Белки с двойной функцией и содержащая их фармацевтическая композиция |
| SI3368554T1 (sl) | 2015-10-28 | 2020-10-30 | Yuhan Corporation | Dolgo-delujoči FGF21 fuzijski proteini in farmacevtski sestavek, ki obsega le-te |
| AU2017358289A1 (en) | 2016-11-10 | 2019-06-20 | Yuhan Corporation | Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis, hepatic fibrosis, and hepatic cirrhosis comprising fusion proteins |
| JP7191850B2 (ja) | 2017-04-21 | 2022-12-19 | ユーハン・コーポレイション | デュアル機能タンパク質およびその誘導体を生産するための方法 |
Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5149787A (en) * | 1984-05-22 | 1992-09-22 | The Blood Center Research Foundation | Method for maintaining intact, non-degraded factor VIII/von-Willebrand factor during blood processing |
| SE8501050D0 (sv) * | 1985-03-05 | 1985-03-05 | Kabivitrum Ab | Biologically active fragments of human antihemophilic factor and method for preparation thereof |
| US5279939A (en) * | 1986-08-18 | 1994-01-18 | Smithkline Beecham Corporation | Protein protease inhibitors from streptomyces |
| US4891356A (en) * | 1987-07-15 | 1990-01-02 | Brigham & Women's Hospital | Proteinase inhibitors for treatment of gastrointestinal ulcer disease |
| JPH0387173A (ja) * | 1987-09-10 | 1991-04-11 | Teijin Ltd | ヒト活性化天然型ファクター８ｃの製造方法及びそれに用いる形質転換体 |
| CA1340740C (en) * | 1987-12-08 | 1999-09-14 | Eileen R. Mulvihill | Co-expression in eukaryotic cells |
| JP2769170B2 (ja) * | 1987-12-08 | 1998-06-25 | ザイモジェネティクス，インコーポレイティド | 真核細肪中での同時発現 |
| WO1990002175A1 (en) * | 1988-08-16 | 1990-03-08 | Novo Nordisk A/S | A method of producing polypeptides by culturing eukaryotic cells in the presence of protease inhibitors |
| DK457788D0 (da) * | 1988-08-16 | 1988-08-16 | Nordisk Gentofte | Fremgangsmaade til fremstilling af et oensket polypeptid |
| GB8827305D0 (en) * | 1988-11-23 | 1988-12-29 | British Bio Technology | Compounds |
| DK105489D0 (da) * | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
| SE465222C5 (sv) * | 1989-12-15 | 1998-02-10 | Pharmacia & Upjohn Ab | Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning |
| ES2180529T3 (es) * | 1990-02-26 | 2003-02-16 | Univ Leland Stanford Junior | Identificacion y expresion de secuencias de adn de un receptor de esteroides de insectos. |
| US5189178A (en) * | 1990-11-21 | 1993-02-23 | Galardy Richard E | Matrix metalloprotease inhibitors |
| US5304603A (en) * | 1991-06-18 | 1994-04-19 | The Population Council | Leydig cell stimulator |
| US5661034A (en) * | 1991-07-18 | 1997-08-26 | Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha | Serum-free medium for tissue culture containing tissue inhibitor of metalloproteinases and method for growing cells using the medium |
| WO1993006217A1 (en) * | 1991-09-19 | 1993-04-01 | Genentech, Inc. | EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES |
| CA2078721A1 (en) * | 1991-09-24 | 1993-03-25 | Hiroshi Yonemura | Process for preparing human coagulation factor viii protein complex |
| US5278289A (en) * | 1991-11-12 | 1994-01-11 | Johnson Alan J | Antihemophilic factor stabilization |
| US5296471A (en) * | 1992-12-22 | 1994-03-22 | Glycomed Incorporated | Method for controlling o-desulfation of heparin and compositions produced thereby |
| WO1995005477A1 (en) * | 1993-08-12 | 1995-02-23 | University Of Maryland | Thermostable alkaline metalloprotease produced by a hyphomonas, and preparation thereof |
| US5631159A (en) * | 1993-09-22 | 1997-05-20 | Creative Biomolecules, Inc. | Lipid-modified serum free media |
| US5543396A (en) * | 1994-04-28 | 1996-08-06 | Georgia Tech Research Corp. | Proline phosphonate derivatives |
-
1997
- 1997-05-07 US US08/852,783 patent/US5851800A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-13 DE DE69736391T patent/DE69736391T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-13 AU AU29197/97A patent/AU716245B2/en not_active Ceased
- 1997-05-13 ES ES03000391T patent/ES2260524T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-13 AT AT03000391T patent/ATE321141T1/de active
- 1997-05-13 DK DK97923382T patent/DK0934424T3/da active
- 1997-05-13 WO PCT/SE1997/000783 patent/WO1997043436A1/en active IP Right Grant
- 1997-05-13 EP EP97923382A patent/EP0934424B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-13 PT PT03000391T patent/PT1318198E/pt unknown
- 1997-05-13 JP JP09540800A patent/JP2000509994A/ja active Pending
- 1997-05-13 PT PT97923382T patent/PT934424E/pt unknown
- 1997-05-13 DE DE69735510T patent/DE69735510T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-13 ES ES97923382T patent/ES2270460T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-13 AT AT97923382T patent/ATE334223T1/de active
- 1997-05-13 CA CA002253287A patent/CA2253287C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-13 NZ NZ332751A patent/NZ332751A/en not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-11-13 NO NO19985297A patent/NO325358B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-11-02 NO NO20065027A patent/NO325633B1/no not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-01-07 JP JP2009001597A patent/JP4896999B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4896999B2 (ja) | 2012-03-14 |
| NO20065027L (no) | 1999-01-14 |
| DK0934424T3 (da) | 2006-11-20 |
| CA2253287A1 (en) | 1997-11-20 |
| AU2919797A (en) | 1997-12-05 |
| DE69735510D1 (de) | 2006-05-11 |
| NO985297D0 (no) | 1998-11-13 |
| DE69736391D1 (de) | 2006-09-07 |
| ES2270460T3 (es) | 2007-04-01 |
| NZ332751A (en) | 2000-06-23 |
| WO1997043436A1 (en) | 1997-11-20 |
| PT1318198E (pt) | 2006-08-31 |
| US5851800A (en) | 1998-12-22 |
| DE69735510T2 (de) | 2006-08-24 |
| ATE334223T1 (de) | 2006-08-15 |
| ES2260524T3 (es) | 2006-11-01 |
| JP2009148271A (ja) | 2009-07-09 |
| ATE321141T1 (de) | 2006-04-15 |
| EP0934424B1 (en) | 2006-07-26 |
| CA2253287C (en) | 2008-02-19 |
| PT934424E (pt) | 2006-12-29 |
| JP2000509994A (ja) | 2000-08-08 |
| EP0934424A1 (en) | 1999-08-11 |
| NO325358B1 (no) | 2008-04-07 |
| DE69736391T2 (de) | 2007-08-16 |
| NO985297L (no) | 1999-01-14 |
| AU716245B2 (en) | 2000-02-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO325633B1 (no) | Fremgangsmate for fremstilling av en biologisk aktiv, rekombinant, human, koaguleringsfaktor VIII i et celledyrkningsmedium som tillater ekspresjon og sekresjon av polypeptidet | |
| EP2459702B1 (en) | Cell culture medium for adamts protein expression | |
| AU691692B2 (en) | Process for purifying factor VIII | |
| IL124123A (en) | Preparation of recombinant factor VIII, recombinant factor VIII produced according to the method and substrate for cell culture for use in the method | |
| NO328022B1 (no) | Faktor XΔ-analog, rekombinant DNA som koder for denne, celler inneholdende slikt DNA samt preparat, anvendelse av preparatet og fremgangsmate for fremstilling av slike preparater inneholdende XΔ-analogene | |
| Birktoft et al. | [8] Glutamyl endopeptidases | |
| EP1238065B1 (en) | Factor x analog with an improved ability to be actived | |
| KR100983878B1 (ko) | 유전자 재조합 기술에 의한 인간 트롬빈 제조 방법 | |
| CA1308377C (en) | Complex of polyethyleneglycol and tissue plasminogen activator | |
| EP1318198B1 (en) | Process for producing a recombinant polypeptide involving the addition of an inhibitor of chymotrypsins to the cell culture medium | |
| Mols et al. | Origin of rice protein hydrolysates added to protein-free media alters secretion and extracellular proteolysis of recombinant interferon-γ as well as CHO-320 cell growth | |
| US10947521B2 (en) | Process for producing recombinant trypsin | |
| JP4374945B2 (ja) | 新規なセリンプロテアーゼ | |
| US10301611B2 (en) | Process for refolding recombinant chymotrypsin | |
| Fischer et al. | Interaction of proteinases and their inhibitors from yeast activation of carboxypeptidase y | |
| AU2017261523A1 (en) | Cell culture medium for adamts protein expression | |
| Muranova et al. | Anti-adhesive property of the plasmin/plasminogen system: the use of plasmin (ogen) for cell detachment and disaggregation in cell culture technique | |
| CN114686519A (zh) | 一种制备丝氨酸蛋白酶的方法 | |
| EA041947B1 (ru) | Способ получения рекомбинантного высокомолекулярного vwf в культуре клеток |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |