PT934424E

PT934424E - Processo para produzir um polipeptido recombinante envolvendo a adição de um inibidor de proteases dependentes de metais ou ou quimotripsinas ao meio de cultura de células

Info

Publication number: PT934424E
Application number: PT97923382T
Authority: PT
Inventors: Lars Adamson; Johan Dixelius; Kristina Lima Lie; Erik Walum
Original assignee: Biovitrum Ab
Priority date: 1996-05-14
Filing date: 1997-05-13
Publication date: 2006-12-29
Also published as: JP4896999B2; NO20065027L; DK0934424T3; CA2253287A1; AU2919797A; DE69735510D1; NO985297D0; DE69736391D1; ES2270460T3; NZ332751A; WO1997043436A1; PT1318198E; US5851800A; DE69735510T2; ATE334223T1; ES2260524T3; JP2009148271A; NO325633B1; ATE321141T1; EP0934424B1

Description

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DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA PRODUZIR UM POLIPÉPTIDO RECOMBINANTE ENVOLVENDO A ADIÇÃO DE UM INIBIDOR DE PROTEASES DEPENDENTES DE METAIS OU QUIMOTRIPSINAS AO MEIO DE CULTURA DE CÉLULAS"

ÁREA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um processo para produzir proteínas e polipéptidos humanos recombinantes e a um meio de cultura de células para utilização nessa produção. Mais particularmente, a invenção refere-se à cultura de células num meio de cultura de células contendo um inibidor de proteases dependentes de metais.

CONTEXTO DA INVENÇÃO

As enzimas proteolíticas estão envolvidas em todas as funções corporais e a maior parte delas tem correspondentes reguladores naturais, isto é, inibidores de proteases. A Comissão Internacional sobre Enzimas estabeleceu uma classificação e nomenclatura sistemáticas para enzimas proteolíticas: 1) serina-proteinases, 2) cisteína- proteinases, 3) proteinases aspárticas, 4) metaloproteinases, todas classificadas de acordo com um grupo essencial presente no seu centro activo, e por fim 5) uma subclasse de proteinases com mecanismo catalítico ainda desconhecido (Borijov Keil, "Specificity of Proteolysis" Springer-Verlag, N.I., 1992, 336 páginas). A intenção desta classificação não é funcional nem está relacionada com a fonte biológica da enzima em questão. 0 problema da classificação de enzimas proteolíticas, frequentemente abreviado para proteases, está descrito no capítulo de introdução: "A Classificação de enzimas na Nomenclatura de Enzimas (1200) é feita de acordo com as reacções que 2 catalisam. Esta regra dificilmente pode ser aplicada a endopeptidases. A reacção global catalisada por este grande grupo de enzimas é essencialmente sempre a mesma: clivagem de uma ligação peptídica. Todavia, uma proteina não pode ser considerada como substrato no sentido clássico do termo: contém centenas de substratos potenciais, um conjunto de tipos de ligações peptídicas qualitativamente diferentes com representação quantitativa variável. Além disso, a disponibilidade destas ligações varia de acordo com a conformação global da cadeia polipeptidica. Em consequência, a Nomenclatura de Enzimas abre uma excepção na sua regra para as endopeptidases: em vez de classificação de acordo com a reacção catalisada, as endopeptidases são classificadas pelo tipo do seu sitio activo. Deste modo, enzimas com especificidades completamente diferentes (como tripsina, quimotripsina e prolil-peptidase) pertencem ao mesmo grupo". Como ilustrado suplementarmente na mesma referência, a especificidade para substratos e de inibidores é um assunto muito mais complicado do que uma simples relação com cinco classes de enzimas. Ainda assim, esta classificação é amplamente utilizada na literatura, por exemplo, quando se querem descrever vários efeitos da proteólise.

Nas serina-proteases, uma fracção serina é essencial para a actividade, isto é, a função de clivagem. A especificidade de diferentes serina-proteases baseia-se nas caracteristicas das cavidades que se ajustam às estruturas dos substratos correspondentes. Uma fenda profunda é responsável pela especificidade da quimotripsina para cadeias laterais aromáticas e outras cadeias laterais hidrófobas volumosas (ver L. Stryer, "Biochemistry" W.H. 3

Freeman and Co., San Francisco, CA, E.U.A., 1981, páginas 157-166).

Muitas proteases necessitam de metais alcalino-terrosos ou de metais (no que se segue designados apenas metais) para terem actividade. As proteases dependentes de metais são consideradas quer como proteases activadas por metais (às quais devem ser adicionados iões metálicos para terem actividade) quer como metaloproteases (que contêm metais como parte integrante da sua estrutura) . No que se refere ao primeiro grupo, a activação e estabilização de enzimas por metais ocorre frequentemente em várias classes de proteases, como serina- e cisteina-proteases. A importância de uma metaloprotease em células endoteliais cultivadas para a secreção de um certo metabolito foi demonstrada por R. Ikegawa et al. em Biochem. Biophys. Res. Comm. 171(2), páginas 669-675 (1990). Isto foi revelado pelo efeito supressor sobre esta secreção reconhecido pela adição do inibidor especifico de metaloproteases fosforamidon. No entanto, foi evidente que a enzima estava confinada ao espaço intracelular, pois não se obteve nenhum efeito do inibidor num meio condicionado sem células. O efeito de proteases é mencionado muito mais vezes no contexto do risco potencial de degradação da proteína em questão. O efeito de proteases em culturas de células CHO foi estudado por M. Satoh et al., In Vitro Cell Dev. Biol. 26, 1101-1104 (1990). Foram utilizados vários inibidores para classificar a actividade proteolítica presente. Foi 4 concluído, da ausência de inibição pela adição de fosforamidon, que as proteases não pertenciam às metaloproteases, pelo menos não àquelas que geralmente se sabe serem inibidas por este agente. 0 efeito dos outros inibidores adicionados revelou que a actividade proteolítica extracelular surgiu de cisteína-proteases.

Outro estudo descreve os perfis proteolíticos para células BHK e culturas de hibridoma, respectivamente (R. B. Kratje et al.r J. Biotechnol. _32, 107-125 (1994)). Não se encontrou actividade de metaloproteases com nenhum destes tipos de células. Contudo, foi identificada actividade correspondente a várias serina-proteases. Também foi revelado que a presença de proteases dependia não só do tipo de células utilizado, mas também das condições da cultura e da idade da cultura. A partir dos artigos mencionados acima é evidente que uma secreção estável de polipéptidos em culturas de células pode ser enfraquecida por uma variedade de enzimas proteoliticas. Para um controlo eficiente destas forças de degradação são necessárias ferramentas versáteis. Através desse controlo seria melhor retida a homogeneidade da proteína alvo. Além disso, seriam protegidos aditivos de proteínas ou substâncias produzidas endogenamente pelas células, susceptíveis de sofrerem ataque proteolítico. No conjunto, obter-se-ia um desempenho e consistência mais elevados do processo como um todo.

Tokunaga et ai., Yeast, volume 9 (1993), páginas 379-387, refere-se à actividade de proteases sensível à quimostatina no meio de cultura de células de Schizosaccharomyces pombe, que digere α-amilase segregada 5 para o meio de cultura. Tokunaga et ai. revelam apenas a-amilase de ratinho. Suplementarmente, Schizosaccharomyces pombe é uma levedura de fissão e a α-amilase é uma enzima, mais particularmente uma enzima que degrada hidratos de carbono. A patente EP-A2-319944, atribuída à Zymogenetics, refere-se à co-expressão em células eucarióticas de uma proteína desejada, por exemplo, t-PA, factor VII ou factor IX, e de uma proteína que processa ou estabiliza a proteína desejada, por exemplo, um inibidor de proteases. Em consequência, neste caso o inibidor de proteases é produzido in situ. Isto requer a introdução de uma primeira sequência de DNA que codifica a proteína desejada e de pelo menos uma sequência de DNA adicional que codifica a proteína estabilizadora. A patente WO-A-9002175, atribuída à Novo-Nordisk, revela um método para produzir polipéptidos por cultura de células eucarióticas na presença de vários inibidores de proteases. Exemplos específicos incluem factor VIII como polipéptido, mas todos os inibidores de proteases são dirigidos para serina- e cisteína-proteases.

Na patente EP-A-306 968, atribuída à Chemo-Sero-Therapeutic Res. Inst. e Teijin, utiliza-se aprotinina num meio de cultura de células para produzir um derivado de deleção do factor VIII. Foi afirmado que o nível de expressão após a adição de 100 até 10 000 KlU/m é duas até três vezes mais elevado do que o controlo sem adição de aprotinina. 6

Os problemas encontrados com proteases dependentes de metais na produção de várias proteínas têm sido muito menos estudados do que o papel de cisteína- e serina-proteases, especialmente na literatura que aborda culturas de células de mamíferos. Mais particularmente, o problema específico de proteases dependentes de metais nunca foi abordado anteriormente em relação com o factor VIII.

Foram sugeridas várias soluções para reduzir a degradação por proteases de proteínas e polipéptidos, por exemplo, moléculas de factor VIII derivado do plasma bem como recombinante. Estas soluções foram dirigidas para a redução da influência de serina- e cisteína-proteases em geral. As serina- e cisteína-proteases são consideradas as mais prejudiciais em plasma humano, bem como em culturas de células. Assim, a patente WO-A-9310143, atribuída a Johnson et al.f revela um método para recuperar uma proteína purificada e estabilizada por contacto de uma amostra biológica contendo factor VIII com pelo menos um agente de inibição de proteases ou remoção de proteases. 0 método é particularmente dirigido à inibição ou remoção de trombina, uma vez que é afirmado que o factor VIII é muito sensível a quantidades muito pequenas desta serina-protease naturalmente presente em plasma sanguíneo. Os inibidores de proteases incluem, por exemplo, benzamidina, antitrombina III, heparina e hirudina. 0 efeito do método só é mostrado para factor VIII derivado do plasma. 0 objectivo da presente invenção consiste em fornecer uma solução para os problemas encontrados com proteases em geral, e mais particularmente com proteases dependentes de metais, em meios de cultura de células utilizados para 7 produzir proteínas e polipéptidos recombinantes, especialmente factor VIII.

RESUMO DA INVENÇÃO

As proteases tendem geralmente a reduzir a actividade de proteínas e polipéptidos por degradação da molécula. A presente invenção refere-se a um processo para reduzir a influência prejudicial de certas proteases sobre moléculas de proteínas e polipéptidos recombinantes, por adição ao meio de cultura de células de um inibidor de proteases dependentes de metais. A presença do inibidor de proteases específicas da presente invenção permite um período de colheita prolongado e rendimento consideravelmente maior com actividade essencialmente retida da proteína e polipéptido. A invenção também se refere a um meio de cultura de células para cultivar células que expressam e segregam um polipéptido recombinante biologicamente activo contendo um inibidor de proteases dependentes de metais. A invenção refere-se suplementarmente à utilização de factor VIII recombinante, que foi produzido num meio de cultura de células de acordo com o presente processo, para o fabrico de um medicamento destinado a administração a um paciente com os sintomas de hemofilia A. A invenção também se refere a um método de tratamento de hemofilia A por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de factor VIII recombinante que foi produzido num meio de cultura de células de acordo com o presente processo.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Um objectivo da presente invenção consiste em reduzir a influência de proteases dependentes de metais quando se cultivam células-hospedeiro para produzir polipéptidos recombinantes. 8

Outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar condições de cultura eficientes, desse modo retendo essencialmente a actividade dos polipéptidos recombinantes.

Um objectivo suplementar da presente invenção consiste em aumentar o tempo de semi-vida dos suplementos proteináceos adicionados ao meio de cultura de células e de outras proteínas produzidas pelas células e segregadas para o meio de cultura.

Os objectivos acima são atingidos pela presente invenção, que se refere a um processo para produzir um polipéptido humano recombinante biologicamente activo num meio de cultura de células que permite a expressão e secreção desse polipéptido, em que um inibidor de proteases dependentes de metais é adicionado ao meio de cultura de células. A presente invenção refere-se suplementarmente a um meio de cultura de células para cultivar células que expressam e segregam um polipéptido humano recombinante biologicamente activo, em que o meio de cultura de células contém um inibidor de proteases dependentes de metais. A presente invenção também se refere a um método para cultivar células que expressam um polipéptido humano recombinante num meio de cultura de células, em que o meio de cultura de células contém um inibidor de proteases dependentes de metais. A presente invenção refere-se suplementarmente a um método para produzir um polipéptido humano recombinante, por cultura de células que expressam o polipéptido humano recombinante num meio de cultura de 9 células contendo um inibidor de proteases dependentes de metais e recuperação do polipéptido.

Os inventores da presente invenção descobriram que certos inibidores de proteases têm um impacto surpreendentemente positivo na actividade de polipéptidos durante a cultura de células-hospedeiro que expressam polipéptidos recombinantes. A presença destes inibidores resulta em produtividade mais elevada. Deste modo pode aumentar-se consideravelmente o rendimento do polipéptido com actividade e/ou homogeneidade essencialmente retidas.

Os inibidores de proteases dependentes de metais são, adequadamente, compostos contendo uma fracção hidrófoba. Adequadamente, a fracção hidrófoba é um grupo lateral aromático, aromático heterocíclico ou outro grupo lateral volumoso. Os grupos laterais aromáticos heterociclicos referem-se a compostos aromáticos nos quais está presente no anel aromático um elemento diferente de carbono. Exemplos são piridina, pirrolo, furano e tiofeno. Suplementarmente, na presente invenção, o termo grupo lateral volumoso hidrófobo refere-se a várias outras estruturas em anel não polares, como monocicloalcanos, por exemplo, ciclo-hexano, dicicloalcanos e policicloalcanos, ou derivados substituídos de quaisquer destas estruturas.

As proteases dependentes de metais são consideradas quer como proteases activadas por metais (às quais se devem adicionar iões metálicos para terem actividade) quer como metaloproteases (que contêm metais como parte integrante da sua estrutura). Relativamente ao primeiro grupo, a activação e estabilização de enzimas por metais ocorre muitas vezes em várias classes de proteases, como serina- e 10 cisteína-proteases. Por exemplo, na área das funções sanguíneas, especialmente coagulação, fibrinólise e activação do complemento, é comum um grupo de domínios ligantes de cálcio dependentes da vitamina K (ver, por exemplo, László Patthy em Methods in Enzymology, 222, páginas 10-21 (1993)). No que se refere às últimas metaloproteases, pode encontrar-se uma revisão de metaloendopeptidases de mamífero, que é um subgrupo importante desta classe de proteases, em Bond et al., Int. J. Biochem., 11_, n° 5, páginas 565-574 (1985). Estes autores concluem que o Zn2+ parece ser o metal essencial de todas as metaloproteases de mamífero caracterizadas. Num artigo de revisão mais recente (D. A. Auld, Methods in Enzymology, 248, páginas 229-242 (1995)), este ião ainda é considerado o ião activo de uma maioria esmagadora das metaloproteases. Isto não exclui um papel estrutural e funcional também de outros metais, como Cu2+, Fe2+, Fe3+, Mn2+, Co2+ e Cd2+ (Auld, ver acima) . Assim, uma enzima dependente de Zn2+ bem como de Ca2+ é descrita em Butler et al., Biochem. J., 241, páginas 229-235 (1987).

Na presente invenção, os inibidores de proteases dependentes de metais podem ser compostos estruturalmente relacionados com o substrato natural da protease e contendo uma fracção electronegativa. Esses compostos são, adequadamente, péptidos, análogos de péptidos ou outros compostos que imitam uma parte do substrato natural, preferivelmente seleccionados do grupo que consiste em fosforamidatos, hidroxamatos e carboxilatos. O mecanismo da inibição de metaloproteases por péptidos ou análogos de péptidos funcionalizados, por exemplo, com fosforamidatos, hidroxamatos ou grupos carbonilo ainda não é completamente claro. No entanto, na literatura, o seu efeito é 11 considerado como sendo devido a uma função quelante (ver especialmente páginas 221-222 de Birkeclal-Hansen et al., Criticai Review in Oral Biology and Medicine, 4_(2), páginas 197-250 (1993)).

Compostos estruturalmente relacionados podem ser naturais, como no caso do fosforamidon, ou sintéticos. A concepção desses inibidores sintéticos é revista em Bond et al. (ver acima). Um exemplo, descrito por N. Nishino e J. C. Powers em Biochemistry, 1T_ (14), páginas 2846-2850 (1978), é a síntese de inibidores específicos para a metaloendopeptidase de zinco termolisina. Neste caso, obteve-se a especificidade do análogo peptídico inibidor incluindo um aminoácido hidrófobo, destinado para interagir com uma bolsa correspondente no sítio activo da enzima, bem como um resíduo de ácido hidroxâmico, para interagir com o átomo de zinco. Uma ilustração deste fenómeno é apresentada em B. Roques et al. em Methods in Enzymology, 248, páginas 263-283, especialmente páginas 268-269 e 272 (1995). Outros exemplos de hidroxamatos são revelados em WO 90/05719.

Os fosforamidatos adequados para utilização na presente invenção podem ser naturais ou sintéticos. O fosforamidon é um fosforamidato natural preferivelmente utilizado na presente invenção. O fosforamidon inibe a acção da termolisina, uma metaloendopeptidase. A estrutura deste fosforamidato é N-(α-L-ramnopiranosiloxi-hidroxifosfinil)-L-leucil-L-triptofano, abreviadamente Rha-P-Leu-Trp. O resíduo P-Leucina-Triptofano presente no fosforamidon é uma característica comum de vários fosforamidatos. Dados de várias fontes indicam que este resíduo constitui o grupo activo, por exemplo, do fosforamidon. Em consequência, na 12 presente invenção utilizam-se adequadamente compostos contendo o resíduo P-Leucina-Triptofano. A concentração do inibidor de proteases dependentes de metais pode situar-se na gama desde cerca de 5 nM até cerca de 5 mM, adequadamente na gama desde 0,5 μΜ até 2 mM e preferivelmente na gama desde 1 μΜ até 1 mM.

As células-hospedeiro a serem utilizadas na presente invenção podem ser procarióticas ou eucarióticas, adequadamente células eucarióticas. As células-hospedeiro a serem utilizadas na presente invenção podem ser células de mamífero, bacterianas, fúngicas ou de insecto. As células são adequadamente células de mamífero ou células de insecto, preferivelmente células de mamífero. As células de insecto podem ser células SF-9 ou SF-21. As células de mamífero podem ser células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), células de Rim de Hamster Bebé (BHK), células COS ou células de hibridoma, preferivelmente células CHO. O meio de cultura de células pode conter soro. No entanto e adequadamente, o meio de cultura de células é um meio com baixo teor de soro e, preferivelmente, um meio sem soro. O meio de cultura de células pode conter suplementarmente uma ou mais proteínas adicionadas, como albumina do soro humano (HSA), albumina do soro bovino (BSA), insulina, factores de crescimento, IGF-1, IGF-2, hormona de crescimento, neurotrofinas, leptina, transferrina e o factor de von Willebrand (vWf) . Se forem adicionadas proteínas ao meio de cultura de células na presente invenção, essas proteínas são preferivelmente produzidas por técnicas de DNA recombinante. Preferivelmente, o meio de cultura de células é um meio sem 13 proteínas, isto é, sem substâncias proteináceas adicionadas. Isto possibilita a produção de um polipéptido com uma actividade específica muito elevada. Deste modo, o meio será bem definido e o risco de se introduzirem contaminantes, como micoplasma, bacteriófagos, vírus e toxinas, será quase extinguido. Adicionalmente, a purificação a jusante das moléculas do polipéptido produzidas será facilitada. 0 meio de cultura de células pode basear-se num meio completo, ou num meio basal de nutrientes suplementado com alguns componentes. Exemplos de meios completos adequados são vários meios ASF comercializados pela Ajinomoto do Japão, Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), Meio Essencial Mínimo de Eagle, Meio de Ham F-12 e Meio RPMI-1640. Várias combinações de DMEM e de Ham F-12, ambos comercializados pela GIBCO de Renfrewshire na Escócia, também são meios completos adequados para utilização na presente invenção. Pode preparar-se um meio basal suplementado adicionando componentes ao meio basal de nutrientes de acordo com procedimentos comuns para preparar meios de cultura de células.

Os suplementos adicionados ao meio de cultura de células não são críticos para a presente invenção e podem ser combinações dos conhecidos na área que são adequados para as células em questão. Exemplos de suplementos que podem ser utilizados incluem insulina, transferrina, ácido ascórbico, etanolamina, glutamina e selenito de sódio. O inibidor de proteases pode ser adicionado ao meio de cultura de células uma vez, várias vezes ou continuamente durante o período de cultura. Os inibidores da presente 14 invenção são adequadamente adicionados ao meio de cultura de células na altura da muda do meio. 0 inibidor de proteases pode ser uma mistura de um inibidor de proteases dependentes de metais e um inibidor de quimotripsinas. 0 inibidor de proteases também pode ser uma combinação de um inibidor de proteases dependentes de metais e um inibidor de quimotripsinas, adicionados em sequência arbitrária.

Na presente invenção, polipéptidos referem-se a proteínas e oligopéptidos com pelo menos 20 aminoácidos na cadeia. O número de aminoácidos do polipéptido produzido de acordo com a presente invenção situa-se adequadamente na gama desde 30 até 4 500 aminoácidos e preferivelmente na gama desde 40 até 3 000 aminoácidos. Os polipéptidos que podem ser produzidos de acordo com a presente invenção incluem polipéptidos exibindo actividades coagulantes, anti-coagulantes e fibrinolíticas, receptores ligados a membranas e nucleares e factores humorais reguladores do metabolismo (hormonas). Exemplos específicos de polipéptidos que podem ser produzidos de acordo com o presente processo são factor VIII, factor V, factor VII, factor IX, tPA, receptores da prostaglandina, receptores de glucocorticóides, receptores activados de proliferadores de peroxissomas (PPARs), factores promotores do crescimento e da sobrevivência celular, interleuquinas, interferões e proteínas ligantes de IGF (IGFBP) . Os polipéptidos podem ser completos, isto é, a sequência de aminoácidos é idêntica à sequência correspondente encontrada em mamíferos em geral, e em seres humanos em particular. Os polipéptidos também podem ser derivados de deleção dos polipéptidos completos, nos quais falta um ou mais aminoácidos. Na presente invenção, o polipéptido é preferivelmente factor VIII . 15

Na presente invenção, o factor VIII produzido por técnicas de DNA recombinante pode ser o factor VIII completo ou, preferivelmente, um derivado de deleção do factor VIII completo com actividade coagulante. Por derivado de deleção quer-se aqui significar factor VIII de coagulação ao qual falta a totalidade ou parte do domínio B mantendo-se a actividade coagulante. Os domínios restantes são adequadamente ligados por um agente de ligação de aminoácidos. Exemplos de várias construções de ligação são apresentados em P. Lind et al., Eur. J. Biochem., volume 232 (1995), páginas 19-27. A estrutura e bioquímica de produtos do factor VIII recombinante em geral foram descritas por Kaufman em Trends in Biotechnology, 9_, páginas 353-359 (1991) e Hematology, j53, páginas 155-65 (1991). 0 factor VIII completo presente no plasma humano tem uma massa molecular de cerca de 300 kDa. Concentrados de factor VIII derivados desse plasma contêm várias formas de factor VIII completamente activo fragmentado, como descrito por Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83, páginas 2979-83 (Maio 1986) . A forma activa mais pequena tem uma massa molecular de cerca de 170 kDa e consiste em duas cadeias de cerca de 90 kDa e cerca de 80 kDa mantidas em conjunto por ião(iões) metálico(s). Refere-se aqui EP-A-0 197 901 (Pharmacia AB) . Em consequência, factor VIII biologicamente activo produzido de acordo com a presente invenção tem, adequadamente, uma massa molecular situada na gama desde cerca de 170 kDa até cerca de 300 kDa. A Pharmacia AB de Estocolmo, Suécia, desenvolveu um produto de factor VIII recombinante que corresponde à forma do factor VIII do plasma de cerca de 170 kDa em 16 concentrados de factor VIII terapêuticos. A molécula de factor VIII recombinante truncada é denominada r-VIII SQ e é produzida por células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) num processo de cultura de células em meio sem soro. A estrutura e bioquímica do r-VIII SQ foram descritas em W0-A-9109122 (Pharmacia AB). Mais preferivelmente, na presente invenção o derivado de deleção é factor VIII recombinante SQ (r-VIII SQ). 0 factor VIII recombinante produzido num meio de cultura de células de acordo com o presente processo pode ser utilizado para o fabrico de um medicamento destinado a administração a um paciente com os sintomas de hemofilia A. A invenção também se refere a um método de tratamento de hemofilia A por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de factor VIII recombinante que foi produzido num meio de cultura de células de acordo com o presente processo. 0 pH do meio de cultura de células situa-se adequadamente na gama desde cerca de 6 até cerca de 8. A osmolalidade do meio de cultura de células situa-se adequadamente na gama desde cerca de 280 até cerca de 400 miliOsmoles. A técnica de cultura de células pode ser cultura em suspensão, cultura em monocamadas, como num frasco rotativo, micro-transportadores ou fibra oca, preferivelmente a técnica de cultura em suspensão. O modo de operação do presente processo pode ser contínuo ou descontínuo. 17

Fornecem-se os Exemplos seguintes apenas para fins ilustrativos, não devendo ser considerados, de modo nenhum, limitadores do âmbito da presente invenção, que é definida pelas reivindicações em anexo.

As percentagens e partes são por peso, a menos que afirmado em contrário.

EXPERIMENTAL

Preparação de factor VIII recombinante A produção de factor VIII recombinante SQ (r-VIII SQ) foi efectuada essencialmente como descrito na patente WO-A-9109122, atribuída à Pharmacia & Upjohn, Exemplos 1 até 3. Uma linha de células CHO deficiente em DHFR (DG44) foi submetida a electroporação com um vector de expressão contendo o gene r-VIII SQ e um vector de expressão contendo o gene da di-hidrofolato redutase. Após selecção em meios selectivos, as colónias sobreviventes foram amplificadas por crescimento em quantidades crescentes em passos de metotrexato. Os sobrenadantes das colónias resultantes foram rastreados individualmente quanto à actividade de factor VIII. Escolheu-se um clone de produção, que foi subsequentemente adaptado a crescimento em suspensão sem soro num meio definido.

Material A quimostatina utilizada nas experiências continha quimostatina A, quimostatina B e quimostatina C, em que a quimostatina A constituiu a porção maioritária. Todos os inibidores de proteases tinham qualidade analítica e foram adquiridos à Sigma em St. Louis, E.U.A. 18 Métodos Analíticos

Avaliou-se a actividade do factor VIII de coagulação por um ensaio de substrato cromogénico (Factor VIII Coatest, Chromogenix AB, Mõlndal, Suécia). 0 factor X activado (Xa) é gerado através da via intrínseca onde o factor VIII actua como co-factor. Em seguida determina-se o factor Xa utilizando um substrato cromogénico sintético, S-2222, na presença de um inibidor de trombina, 1-2581, para prevenir a hidrólise do substrato pela trombina. A reacção é terminada com ácido e determina-se ο VIII:C, que é proporcional à libertação de pNA (para-nitroanilina), fotometricamente a 450 nm contra um ensaio em branco com reagente. A unidade do factor VIII:C é expressa em unidades internacionais (IU), como definido pelo presente Padrão Internacional de Concentrações (IS) estabelecido pela OMS.

Determinou-se a viabilidade celular em várias ocasiões, como revelado nas Tabelas I-IV, para verificar que os inibidores adicionados não exerceram nenhum efeito negativo sobre a sobrevivência celular ao longo de todo o período de produção. As análises foram feitas depois de corar as células com Eritrosina B numa câmara de Burker ou por citometria de fluxo. Calculou-se a porção de células viáveis relativamente ao número total de células (%).

Exemplo 1

Este exemplo destina-se a ilustrar a eficiência da presente invenção em comparação com vários outros inibidores de proteases.

Cultivaram-se células CHO em condições de crescimento em balões rotativos num meio de cultura completo, como ASF ou uma mistura de DMEM e Meio de Harr F-12. Inicialmente, a 19 temperatura foi 37 °C e o teor de células foi cerca de 0,7 x 106 células/ml de meio de cultura de células. O dia 0 foi definido como o dia em que começou a produção. Diminuiu-se a temperatura para 34 °C. No dia 3, o meio de cultura foi substituído por um meio fresco incluindo 0,5 mM de ácido butírico, e o teor de células foi ajustado para cerca de 3 x 106 células/ml de meio de cultura de células. No dia 4, uma suspensão das células em produção foi transferida em alíquotas para tubos de polipropileno, para cultura contínua, e adicionaram-se os inibidores de proteases. No dia 5, o meio foi substituído e os inibidores de proteases foram adicionados. A substituição do meio foi efectuada no dia 6, dia 7, dia 10 (valor acumulado após 72 horas) . No dia 11 terminaram-se as experiências. A análise de Coloração "Western" revelou que a qualidade do factor produzido não foi essencialmente afectada. A viabilidade foi geralmente elevada. 0 valor mais baixo foi 90%, obtido para o controlo e aprotinina no dia 11 de produção.

Os resultados estão apresentados nas Tabelas seguintes. 20

TABELA I

Factor VIII:C em meio de cultura de células contendo inibidores de proteases de acordo com a invenção

Tvist.e iiiíM liiil llllll llllll WMMMM: ^ÊÊÈM: llllll:!! .........»1........ .JL Dia 10, lllllíl .......li».....llj..... mim Má H, w/ai Bi» 11, % Àcwí" iada lU/rol lillllj Aonulado 111111111 1 Coistwle 2,§3 li n li ............................ «41* 125 li 47,1 li 2 foiimm-hn, 0.0LRtá «3 188 111 152 345 1 !|| 15,1 65,6 139 5 fSÍÍOÍMKidOR, 6,12 2(19 10,2 141 39,0 .................................. 17,1 ............................... 724 154 4 !!B WÊ$ÊÊ$MÊÊÊÊè ftet) 5.48 182 .......12,5....... 124 13,7 138 15,7 126 674 143 5 (lltitMÍSÍilU.lil^ttÃÍ llll itii m 148 1.5 m 66.6 141" 21

TABELA II

Factor VIII:C em meio de cultura de células contendo inibidores de proteases não de acordo com a invenção

Teste Inibidor, concentração Dia 6, IU/ml Dra 6, % Dia 7, IU/ml Dra 7, 0. 0 Dia 10, IU/ml Dia 10, 0. 0 Dia 11, IU/ml Dra 11, 0. 0 Acumu lador IU/ml Acumu lador, 0. 0 1 Controlo 2,93 100 7,2 100 24,5 100 12,5 100 47,1 100 2 Aprotinina, 0,3 μΜ 3,83 131 8,52 118 24,5 100 15,5 124 52,3 111 3 Aprotrnrna, 3,0 μΜ 3,96 135 8,42 117 24,1 98 13,8 110 50,3 107 4 Cloroqurna, 0,625 μΜ 4,19 143 9,39 130 26,5 108 11,4 91 51,5 109 5 Cloroquina, 6,25 μΜ 3,75 128 7,19 100 25,5 104 9,41 75 45,9 97 6 L-Histidina, 0,52 mM 3,17 108 6,22 86 23,1 94 11,5 92 43,9 93 7 L-Histidina, 5,2 mM 2,17 74 4,64 64 8,16 33 3,37 27 18,3 39 22 TABELA III Viabilidade celular em meio de cultura de células contendo inibidores de proteases de acordo com a invenção

Teste Inibidor, concentração Dia 6, 0. 0 Dia 7, O. 0 Dia 10, 0. "6 Dia 11, % 1 Controlo 97,4 97,5 91,4 90, 7 2 Fosforamidon, 0,015 mM 98, 6 96,5 89,1 94, 7 3 Fosforamidon, 0,15 mM 98,8 96,7 91,3 93, 1 4 comparativo Quimostatina, 1,04 nM (0,625 pg/l) 98,3 98,0 94, 9 93, 6 5 comparativo Quimostatina 10,4 nM (6,25 pg/l) 95, 3 95, 6 91, 6 94, 0 TABELA IV Viabilidade celular em meio de cultura de células contendo inibidores de proteases não de acordo com a invenção

Teste Inibidor, concentração Dia 6, Dia 7, Dia 10, $. Dia 11, O, 0 1 Controlo 97,4 97,5 91,4 90, 7 2 Aprotinina, 0,3 μΜ 97,7 98,4 93,8 89, 4 3 Aprotinina, 3,0 μΜ 97,8 98,1 94,1 90,1 4 Cloroquina, 0,625 μΜ 98,0 95,3 90,1 92, 5 5 Cloroquina, 6,25 μΜ 96,9 98,2 94,5 90,3 6 L-Histidina, 0,52 mM 98,0 98,0 92,5 92,8 7 L-Histidina, 5,2 mM 99,1 97,8 95,4 95, 4

Como é evidente da Tabela I, a presença de inibidores de proteases de acordo com a presente invenção aumenta dramaticamente a possibilidade de reter factor VIII:C. Como é evidente da Tabela II, a presença de vários outros inibidores de proteases tem um efeito muito pequeno ou 23 mesmo negativo sobre o factor VIII:C. Da Tabela III é evidente que a produção acrescida de factor VIII ilustrada na Tabela I não pode ser atribuída a uma viabilidade celular aumentada ou decrescida. Suplementarmente, da Tabela IV é evidente que a ausência de efeito sobre a produção de factor VIII ilustrada na Tabela II não é um efeito contrário a uma viabilidade celular decrescida.

Lisboa, 23 de Outubro de 2006

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para produzir um factor VIII de coagulação humano recombinante biologicamente activo num meio de cultura de células que permite a expressão e secreção do referido polipéptido, caracterizado por se adicionar ao meio de cultura de células, durante o período de cultura, um inibidor de proteases dependentes de metais seleccionado do grupo que consiste em péptidos ou análogos peptídicos funcionalizados com fosforamidatos, em que as células cultivadas expressam e segregam um factor VIII de coagulação humano recombinante biologicamente activo.

2. Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a protease dependente de metais ser uma metaloprotease.

3. Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 2, caracterizado por o ião metálico necessário para a actividade da protease dependente de metais ser seleccionado do grupo que consiste em Zn2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Mn2+, Co2+ e Cd2+.

4. Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 3, caracterizado por o inibidor de proteases dependentes de metais ser fosforamidon contendo um resíduo de P-Leucina-Triptofano.

5. Processo de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por a concentração do inibidor de proteases dependentes de metais se situar entre 1 μΜ e 1 mM. 2

6. Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 5, caracterizado por a célula ser uma célula de mamífero.

7. Processo de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por a célula de mamífero ser seleccionada do grupo que consiste em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), células de Rim de Hamster Bebé (BHK), células COS e células de hibridoma.

8. Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 7, caracterizado por o meio de cultura de células ser um meio sem soro.

9. Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 8, caracterizado por o factor VIII de coagulação recombinante ser um derivado deletado no domínio B do factor VIII completo com actividade coagulante retida.

10. Processo de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por o derivado deletado no domínio B do factor VIII ser factor VIII recombinante SQ (r-VIII SQ). Lisboa, 23 de Outubro de 2006