ES2260524T3 - Procedimiento para la produccion de un polipeptido recombinante que involucra la adicion de un inhibidor de quimotripsina en el medio del cultivo celular. - Google Patents
Procedimiento para la produccion de un polipeptido recombinante que involucra la adicion de un inhibidor de quimotripsina en el medio del cultivo celular.Info
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Abstract
Un procedimiento para la producción de un derivado suprimido B dominante recombinante del factor VIII humano de cuerpo-entero con una actividad coagulante retenida, en un medio de cultivo celular y que permite la expresión y secreción de dicho polipéptido, en donde un inhibidor de quimotripsina que se compone de a-(2-iminohexahidro-4(S)-pirimidil)-S-glicina se adiciona al medio de cultivo celular durante el período de cultivo, y en donde la célula cultivada es una célula de mamífero.
Description
Procedimiento para la producción de un
polipéptido recombinante que involucra la adición de un inhibidor de
quimotripsina en el medio del cultivo celular.
La presente invención describe un proceso para
la producción de polipéptidos y proteínas recombinantes humanas, y
un medio de cultivo celular para utilizar en dicha producción. Más
particularmente, la invención relata el cultivo de células en un
medio de cultivo celular que contiene un inhibidor de
quimotripsina.
Las enzimas proteolíticas se involucran en todas
las funciones corporales, y la mayoría de ellas tiene homólogos
reguladores naturales, i.e. inhibidores de proteasa. La Comisión de
Enzimas tiene establecido una nomenclatura y clasificación
sistemática para enzimas proteolíticas: 1) proteinasas de serina, 2)
proteinasas de cisteina, 3) proteinasas aspárticas, 4)
metaloproteinasas, todas clasificadas de acuerdo con un grupo
esencial en su centro activo, y finalmente 5) una subclase de
proteinasas con mecanismo catalítico sin embargo desconocido
(Borivoj Keil, "Specificity of Proteolysis",
Springer-Verlag NY, 1992, 336 pages). La intención
de su clasificación no es funcional, ninguna relaciona el origen
biológico de la enzima con la descendencia. El problema de la
clasificación de las enzimas proteolíticas, frecuentemente
abreviadas como proteasas, es descrito en el capítulo de
introducción: "La Clasificación de enzimas en Nomenclatura de
Enzimas (1200) se hace de acuerdo con las reacciones que catalizan.
Esta regla dificilmente puede ser aplicada para endopeptidasas. El
conjunto de reacciones catalizadas por éste extenso grupo de
enzimas es esencialmente siempre el mismo: la división de un enlace
péptido. Una proteína, sin embargo, no puede ser considerada como un
sustrato en el término clásico: éste contiene cientos de sustratos
potenciales, un conjunto de enlaces péptidos diferentes
cualitativamente con diversas representaciones cuantitativamente.
Por otra parte, la disponibilidad de estos enlaces varía de acuerdo
con el conjunto de conformaciones de la cadena de polipéptidos. Por
consiguiente, la Nomenclatura de Enzimas hace una excepción de las
endopeptidasas a partir de su regla: en lugar de la clasificación de
acuerdo con la reacción de catalizador, las endopeptidasas son
clasificadas por el tipo de su sitio de actividad. De esta manera,
las enzimas con especificidad completamente diferente (como
tripsina, quimotripsina y peptidasa prolil) se encuentran en el
mismo grupo". Como se ilustra más adelante en la misma
referencia, el sustrato y el inhibidor de especificidad es mucho más
complicado que una relación simple para cinco clases de enzimas. No
obstante, esta clasificación es ampliamente utilizada en la
literatura por ejemplo cuando varios efectos de proteólisis deben
ser descritos.
En las proteasas de serina una fracción de
serina es esencial para la actividad, i.e. la función de división.
La especificidad de diferentes proteasas de serina se basa en la
fisonomía de la cavidad de adaptación de las estructuras de
sustratos correspondientes. Una grieta profunda justifica la
especificidad de quimotripsina para cadenas laterales aromáticas y
otras hidrofóbicas voluminosas (ver L. Stryer, Biochemistry, W.H.
Freeman and Co., San Fransisco, CA, USA, 1981, pp.
157-166).
Muchas proteasas necesitan metales
alcalinotérreos o metales (en lo siguiente solamente se indica
metales) para su actividad. Las proteasas
metal-dependientes son consideradas para ser
proteasas metal-activas (por lo cual iones metálicos
pueden ser adicionados para la actividad) o proteasas metalo (que
contienen metales como parte integral de su estructura).
Concerniente al primer grupo, la activación y la estabilización de
enzimas por metales frecuentemente ocurre en varias clases de
proteasas, tal como proteasas de serina y cisteina.
La importancia de una proteasa metalo en células
endoteliales cultivadas para la secreción de ciertos metabolitos ha
sido mostrada por R. Ikegawa et al in Biochem. Biophys. Res.
Comm. 171 (2), p. 669-675 (1990). Esto se descubrió
mediante el efecto de supresión sobre su secreción reconocida por la
adición de un inhibidor específico de proteasa metalo. Fue evidente,
sin embargo, que la enzima se confinó en el espacio intracelular,
dado que no se obtuvo el efecto inhibidor en un medio condicionado
de célula-libre.
El efecto de las proteasas se menciona con mucha
más frecuencia en el contexto del riesgo potencial de degradación de
la proteína en la publicación.
El efecto de las proteasas en cultivos de
células CHO ha sido estudiado por M Satoh et al, In
Vitro Cell Dev Biol 26, 1101-1104 (1990). Varios
inhibidores se utilizaron para la clasificación de la actividad
proteolítica presente. Se concluyó a partir de la ausencia de
inhibición por adición de fosforamidon, que las proteasas no
pertenecen a las proteasas metalo, al menos no aquellas generalmente
conocidas por ser inhibidas por éste agente. El efecto de los otros
inhibidores adicionados da a conocer que la actividad proteolítica
extracelular proviene de las proteasas de cisteina.
Otro estudio describe el perfil proteolítico
para las células BHK y los cultivos de hibridoma respectivamente (R
B Kratje et al, J Biotechnol. 32, 107-125
(1994)). No se encontró actividad de proteasas metalo con cualquiera
de estos tipos de células. Si embargo se identificó, la actividad
correspondiente a varias proteasas de serina. también se reveló, que
la presencia de proteasas dependió no solamente del tipo de células
empleadas sino también de las condiciones del cultivo y la edad del
cultivo.
A partir del ensayo antes mencionado, es
evidente que una secreción estable de polipéptidos en cultivos
celulares puede ser deteriorada por una variedad de enzimas
proteolíticas. Para un eficiente control de estas fuerzas de
degradación, se necesitaron herramientas versátiles. Por tal
control, la homogeneidad de la proteína blanco sería conservada
mejor. Además, los aditivos de las proteínas o las sustancias
producidas endógenamente por las células, susceptibles al ataque
proteolítico, serían protegidos. Todos juntos, un rendimiento más
alto y una consistencia del proceso en su totalidad serían
alcanzados.
Tokunaga et al, Yeast, vol. 9 (1993), p.
379-387 se relacionan con la actividad de la
proteasa quimostatina-sensible en el medio de
cultivo celular de Schizosaccharomyces pombe que digiere la
\alpha-amilasa secretada dentro del medio de
cultivo. Tokunaga et al, unicamente revelaron
\alpha-amylase de ratón. Adicionalmente,
Schizosaccharomyces pombe es una levadura de fisión y
\alpha-amylase es una enzima, más particularmente
una enzima de degradación de carbohidratos.
EP-A2-319944 to
Zymogenetics se relaciona con una co-expresión en
células eucariotas de una proteína deseada, por ejemplo
t-PA, factor VII o factor IX, y una proteína que
procesa o estabiliza la proteína deseada, por ejemplo un inhibidor
de proteasa. En este caso, por lo tanto, el inhibidor de la proteasa
se produce in-situ. Esto demanda la
introducción de una primera secuencia de ADN codificando la proteína
deseada, y al menos una secuencia adicional de ADN codificando la
proteína estabilizada.
WO-A-9002175 to
Novo-Nordisk revela un método para la producción de
polipéptidos mediante el cultivo de células eucariotas en la
presencia de varios inhibidores de proteasa. Ejemplos específicos
incluyen el factor VIII como el polipéptido, pero los inhibidores de
proteasa están todos orientados a las proteasas de serina y cisteina
en general y quimotripsinas, y no son mencionados los inhibidores
específicos de estas.
Satoh et al., Cytotechnology 13,
79-88 (1993), se refieren a la inhibición de
endopeptidasas en la producción de pro-urokinasa por
células CHO. Se considera que las endopeptidasas pertenecen a la
clase de proteasas de cisteina.
Allen et al., The Journal of Biological
Chemistry 270, 4797-4804 (1995), se refiere a la
adición de un cóctel de inhibidores, que contiene quimostatina, para
la célula lisato del cultivo de células-CHO
recombinantes que producen el activador hístico del
plasminógeno.
En EP-A-306 968
to Chemo-Sero-Therapeutic Res. Inst.
y el uso de Teijin se hace de aprotinina en un medio de cultivo
celular empleado para la producción de un derivado de deleción del
factor VIII. El nivel de expresión después de la adición de 100 a
10,000 KIU/ml se indicó por ser dos o tres veces más alto que el
control sin la adición de aprotinina.
Los problemas encontrados con las proteasas
metal-dependientes y la quimotripsina en la
producción de varias proteínas han sido mucho menos examinados que
el papel de las proteasas de cisteina y serina, especialmente en
literatura sobre cultivos celulares de mamíferos. Más
particularmente, el problema específico con las proteasas
metal-depentientes y la quimotripsina nunca ha sido
direccionado previamente en conexión con el factor VIII.
Varias soluciones han sido sugeridas para
reducir la degradación por proteasas de proteínas y polipéptidos,
por ejemplo plasma derivado así como moléculas del factor VIII
recombinante. Estas soluciones han sido conducidas para reducir la
influencia de las proteasas de serina y cisteina en general. Las
proteasas de cisteina y serina se consideran por ser unas de las más
perjudiciales en el plasma sanguíneo así como en los cultivos
celulares. De tal manera,
WO-A-9310143 to Johnson et al
revelaron un método para recuperar una proteína purificada y
estabilizada por el contacto de una muestra biológica que contiene
el factor VIII con al menos un agente inhibidor o eliminador de
proteasa. El método particularmente se dirige a inhibir o eliminar
la trombina, dado que el factor VIII es indicado por ser muy
sensible a mínimas cantidades de ésta proteasa de serina
naturalmente presente en el plasma sanguíneo. Los inhibidores de
proteasas incluyen, por ejemplo benzamidina, antitrombina III,
hirudina y heparina. El efecto del método se muestra únicamente para
plasma derivado del factor VIII.
El propósito de la presente invención es
proveer una solución a los problemas encontrados con las proteasa
en general, y más particularmente con la quimotripsina en medios de
cultivos celulares empleados para la producción de proteínas
recombinantes y polipéptides, especialmente el factor VIII.
Las proteasas generalmente tienden a reducir la
actividad de proteínas y polipéptidos por la degradación de la
molécula. La presente invención relata un proceso para la reducción
de la influencia perjudicial de ciertas proteasas en moléculas de
polipéptidos y proteínas recombinantes, por la adición de
quimo-tripsinas al medio de cultivo celular. La
presencia del inhibidor de proteasas específico de la presente
invención permite un período prolongado de cosecha y un rendimiento
considerablemente más alto con proteína retenida esencialmente y una
actividad del polipéptido. La invención también relata un medio de
cultivo celular para el cultivo de las células de expresión y
secreción de un polipéptido recombinante activo biológicamente. Más
adelante, la invención se refiere al uso del factor VIII
recombinante que ha sido producido en un medio de cultivo celular de
acuerdo con el presente proceso para la manufactura de un
medicamento para la administración a un paciente que tiene los
síntomas de hemofilia A. También, la invención relata un método para
el tratamiento de la hemofilia A, mediante la administración de una
cantidad efectiva terapéuticamente del factor VIII recombinate que
ha sido producido de acuerdo con el presente procedimiento.
Un objeto de la presente invención es reducir la
influencia de las quimotripsinas cuando se cultivan células huésped
para la producción de polipéptidos recombinantes.
Otro objeto de la presente invención es proveer
las condiciones eficientes de cultivo, por esta razón esencialmente
retiene la actividad de los polipéptidos recombinantes.
Un objeto adicional de la presente invención es
incrementar la vida-media de los suplementos
proteinaceos adicionados al medio de cultivo celular y otras
proteínas producidas por las células y secretados dentro del medio
de cultivo.
Los objetos citados anteriormente son
responsabilizados por la presente invención, la cual relata un
proceso para la producción de un polipéptido humano recombinante
activo en un medio de cultivo celular permitiendo la expresión y la
secreción de dicho polipéptido, en donde un inhibidor de
quimotripsina, se adiciona al medio de cultivo celular.
La presente invención además relata un medio de
cultivo celular para el cultivo de células que expresan y secretan
un poli-péptido humano recombiante activo
biológicamente, en donde el medio de cultivo celular contiene un
inhibidor de quimotripsina.
La presente invención también describe un método
del cultivo de células que expresan un polipéptido humano
recombinante en un medio de cultivo celular, en donde el medio de
cultivo celular contiene un inhibidor de quimotripsina. La presente
invención además relata un método de la producción de un polipéptido
humano recombinante, mediante el cultivo de células que expresan un
polipéptido mediante el cultivo de células que expresan un
polipéptido humano recombinante en un medio de cultivo que contiene
un inhibidor de quimotripsina, y la recuperación del
polipéptido.
Los inventores de la presente invención han
encontrado que ciertos inhibidores de proteasas tienen un impacto
positivo sorprendentemente sobre la actividad de los polipéptidos
durante el cultivo de células huésped que expresan polipéptidos
recombinantes. La presencia de estos inhibidores resulta en una
productividad más alta. De esta manera, la producción del
polipéptido con actividad retenida esencialmente y/o homogeneidad,
puede ser incrementada considerablemente.
Los inhibidores de quimotripsina son compuestos
apropiados que contienen una fracción hidrofóbica. La quimotripsina
difiere de las otras proteasas de serina por la presencia de un
hendidura profunda en un sitio activo. Esta hendidura profunda
justifica la especificidad del sustrato encontrada con la
quimotripsina. Por lo tanto, apropiadamente la fracción hidrofóbica
es un aromático, un aromático heterocíclico u otro grupo lateral
voluminoso. Los grupos laterales aromáticos heterocíclicos se
refieren a compuestos aromáticos en los que un elemento diferente al
carbono esta presente en el anillo aromático. Ejemplos son la
piridina, pirrol, furano y tiofeno. Adicionalmente, en la presente
invención, el término grupo lateral voluminoso hidrofóbico se
refiere a otras varias estructuras de anillo
no-polar tal como monocicloalcanos, por ejemplo,
ciclohexano, dicicloalcanos y policiclo-alcanos, o
derivados sustitutos de cualquiera de estas estructuras.
Las quimotripsinas son proteasas de serina. En
la presente invención, la quimotripsina relaciona la quimotripsina y
proteasas similares a la quimotripsina. Las proteasas
quimotripsinas-similares en ésta relaciona las
proteasas con una función y/o estructura química que se parece mucho
a la de la quimotripsina. En lo siguiente, la quimotripsina se
emplea para designar a la quimotripsina así como proteasas
quimotripsinas-similares. Una conexión entre la
quimotripsina y una proteasa metalo se revela en Borivoj Keil,
"Specificity of Proteolysis" (ver arriba), Tabell 11, p.
36-39. En una clasificación de acuerdo con las
secuencias preferidas de amino ácidos, en el sitio de división, la
quimotripsina se agrupa junto con otras proteasas que se dividen en
LYL (Leucina, Tirosina, Leucina). En medio de otras enzimas de este
grupo está una colagenasa, una enzima usualmente refiriéndose como a
una proteasa metalo.
El inhibidor de quimotripsina puede ser natural
o sintético, y estructuralmente relacionado con el sustrato natural
de la proteasa. El inhibidor de quimotripsina apropiado contiene una
fracción hidrofóbica. La funcionabilidad de una fracción
hidrofóbica es una propiedad compartida con los inhibidores
específicos para la metaloendopeptidasa de cinc, termolisin
mencionada en un párrafo previo. El inhibidor de quimotripsina es
apropiadamente seleccionado a partir de los compuestos naturales
quimostatina A, quimostatina B o quimostatina C, o cualquier mezcla
de estos. Comúnmente, la quimostatina es una mezcla que contiene las
tres quimostatinas, la principal porción la constituye la
quimostatina A. Todas las quimostatinas contienen un residuo del
único amino ácido
\alpha-(2-iminohexahiro-4(S)-pirimidil)-S-glicina.
La estructura de estos compuestos naturales son
N-[(S)-1-carboxi-2-feniletil]-carbamoil-\alpha-N-[2-iminohexa-hidro-4(S)-pirimidil]-S-glicil-L-leucil-fenilalaninal(quimostatina
A),
N-[(S)-1-carboxi-2-fenilethil]-carbamoil-\alpha-N-[2-iminohexahidro-4(S)-pirimidil]-S-glicil-L-valil-fenilalaninal
(quimostatina B), y
N-[(S)-1-carboxi-2-fenil-etil]-carbamoil-\alpha-N-[2-iminohexahidro-4(S)-pirimidil]-S-glicil-L-isoleucil-fenilalaninal
(quimostatina C).
La concentración del compuesto que inhibe la
quimotripsina puede estar en el rango desde aproximadamente 0.001
Pg/L hasta aproximadamente 100 mg/L, apropiadamente en el rango
desde 0.01 Pg/L hasta 25 mg/L, y preferiblemente en el rango desde
0.1 Pg/L hasta 100 Pg/L. Las cifras dadas anteriormente son iguales
a una concentración del compuesto que inhibe la quimotripsina en el
rango desde aproximadamente 1.67 pM hasta aproximadamente 167 PM,
convenientemente en el rango desde aproximadamente 16.7 pM hasta
41.7 PM, y preferiblemente en el rango desde 167 pM hasta 167
nM.
Las células huésped para emplear en la presente
invención pueden ser procariotas o eucariotas, apropiadamente
células eucariotas. Las células huésped para emplear en la presente
invención pueden ser células de mamífero, de bacterias, de hongos o
de insectos. Las células apropiadas son células de mamíferos o
células de insectos, preferiblemente células de mamífero. Las
células de insecto pueden ser células SF-9 o
SF-21. Las células de mamíferos pueden ser células
de Ovario de Hamster Chino (CHO), células de Riñón de Hamster de
Bebé (BHK), células COS o células de hibridoma, preferiblemente
células CHO.
El medio de cultivo celular puede contener
suero. En consecuencia, sin embargo, el medio de cultivo celular es
un medio bajo de suero y preferiblemente un medio libre de suero. El
medio de cultivo celular además puede contener una o más proteínas
adicionadas, tales como albúmina de suero humano (HSA), albúmina de
suero bovino (BSA), insulina, factores de crecimiento,
IGF-1, IGF-2, hormonas de
crecimiento, neurotrofinas, leptina, transferrina y el factor de von
Willebrand (vWf). Si las proteínas se adicionan al medio de cultivo
celular en la presente invención, tales proteínas preferiblemente
son producidas por técnicas de ADN recombinante. Preferiblemente el
medio de cultivo celular es un medio libre de proteína, i.e. libre
de sustancias proteínicas adicionadas. Esto hace posible la
producción de un polipéptido con una actividad específica muy alta.
De esta manera, el medio será bien definido y el riesgo de
introducir contaminantes tales como micoplasma, bacteriófagos, virus
y toxinas sera casi extinguido, Adicionalmente, la purificación en
dirección 3' hacia abajo de las moléculas de polipéptidos
producidos se facilitará.
El medio de cultivo celular puede basarse en un
medio completo, o un medio nutriente basal suplementado por un
número de componentes. Ejemplos apropiados de medios completos son
varios medios ASF comercializados por Ajinomoto of Japan, Dulbecco's
Modified Eagle Medium (DMEM), Eagle's Minimum Essential Medium,
Ham's Medium F-12 y RPMI-1640
Medium. Varias combinaciones de DMEM y Ham's F-12,
ambos comercializados por GIBCO de Renfrewshire en Scotland, también
son medios completos apropiados para emplear en la presente
invención. Un medio basal suplementado puede ser preparado mediante
la adición de componente al medio nutriente basal de acuerdo con
procedimientos estándar para la preparación de medios de cultivo
celular.
Suplementos adicionados al medio de cultivo
celular no son críticos para la presente invención y pueden ser
combinaciones de aquellos conocidos en el oficio los cuales son
apropiados para las células en la publicación. Ejemplos de
suplementos que pueden ser usados incluyen, transferrina, ácido
ascórbico, etanolamina, glutamina y selenita de sodio.
El inhibidor de proteasa puede ser adicionado al
medio de cultivo celular una vez, muchas veces o continuamente
durante el periodo de cultivo. los inhibidores de la presente
invención son convenientemente adicionados al medio de cultivo
celular en cambio del medio. El inhibidor de proteasa puede ser una
mezcla de un inhibidor de proteasas
metal-dependietes y un inhibidor de quimotripsina.
El inhibidor de proteasa también puede ser una combinación de
inhibidor de proteasas metal-dependientes y un
inhibidor de quimotripsina, adicionado en una secuencia
arbitraria.
En la presente invención, los polipéptidos se
refieren a proteínas y oligopéptidos con al menos 20 aminoácidos en
la cadena. El número de aminoácidos del polipéptido producido de
acuerdo con la presente invención, convenientemente consiste en el
rango desde 30 hasta 4,500 amino ácidos, y preferiblemente en el
rango desde 40 hasta 3,000 amino ácidos. Los polipéptidos que pueden
ser producidos de acuerdo con la presente invención incluyen
polipéptidos que exhiben coagulante, anticoagulante y actividades
fibrinolíticas, enlace de membranas y receptores nucleares y
factores humurales de regulación del metabolismo (hormonas).
Ejemplos específicos de polipéptidos que pueden ser producidos de
acuerdo con el proceso presente son el factor VIII, factor V, factor
VII, factor IX, tPA, receptores de prostaglandinas, receptores de
glucocorticoides, receptores activados del perixoma proliferador
(PPARs), factores que promueven el crecimiento y célula
superviviente, interleucina, interferón y proteinas de enlace IGF
(IGFBP). Los polipéptidos pueden ser de longitud completa, i.e. la
secuencia de aminoácidos es idéntica a la secuencia correspondiente
encontrada en mamíferos en general, y en seres humanos en
particular. Los polipéptidos también pueden ser derivados de
deleción de polipéptidos de cuerpo-entero, donde uno
o más aminoácidos se pierden. En la presente invención, el
polipéptido es preferiblemente el factor VIII.
En la presente invención, el factor VIII
producido por la técnica de ADN recombinante puede ser el factor
VIII de cuerpo-entero o preferiblemente por una
deleción derivada del factor VIII de cuerpo-entero
que tiene actividad coagulante. Por deleción derivativa se entiende
en ésta por, la coagulación del factor VIII en el que todo o parte
del B-dominante se pierde, mientras que la actividad
coagulante se mantiene. Los dominantes remanentes son apropiadamente
conectados por un ligador de amino ácido. Ejemplos de varias
construcciones ligadoras son dadas en P. Lind et al, Eur. J.
Biochem., vol. 232 (1995), pp. 19-27. La estructura
y bioquímica de los productos del factor VIII recombinante en
general han sido descritas por Kaufman in Trends in Biotechnology,
9, p. 353-359 (1991) y Hematology, 63,
p.155-65 (1991).
El factor VIII de cuerpo-entero
presente en plasma humano tiene una masa molecular de
aproximadamente 300 kDa. El Factor VIII concentrado derivado a
partir de tal plasma contiene muchas formas del factor VIII activo
completamente fragmentado como se describe por Andersson et
al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, p. 2979-83
(May 1986). La forma activa más pequeña tiene una masas molecular de
aproximadamente 170 kDa y consiste de dos cadenas de aproximadamente
90 kDa y aproximadamente 80 kDa mantenidas juntas por ión(s)
metálico(s). La referencia se hace aquí por
EP-A-0 197 901 (Pharmacia AB). El
factor VIII activo biológicamente producido de acuerdo con la
presente invención, por consiguiente, apropiadamente tiene una masa
molecular en el rango desde 170 kDa hasta 300 kDa.
Pharmacia AB of Stockholm, Sweden, ha
desarrollado un producto del factor VIII recombinante que
corresponde a la forma del factor VIII de plasma de aproximadamente
170 kDa en concentrados terapéuticos del factor VIII. La molécula
truncada del factor VIII recombinante se llama
r-VIII SQ y se produce mediante células de Ovarios
de Hamster Chino (CHO) en un proceso de cultivo celular en medio
libre de suero. La estructura y la bioquímica del
r-VIII SQ ha sido descrita en
WO-A-9109122 (Pharmacia AB). En la
presente invención, más preferiblemente la deleción derivativa es el
factor VIII SQ recombinante (r-VIII SQ).
El factor VIII recombinante producido en un
medio de cultivo celular de acuerdo con el presente proceso puede
ser empleado para la fabricación de un medicamento para la
administración a un paciente que tiene los síntomas de la hemofilia
A. También, la invención relata un método para el tratamiento de la
hemofilia A mediante la administración de una cantidad efectiva
terapéuticamente del factor VIII recombinante que ha sido producido
en un medio de cultivo celular de acuerdo con el presente
proceso.
El rango apropiado de pH del medio de cultivo
celular consiste desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 8. La
osmolalidad del medio de cultivo celular apropiado oscila entre
desde 280 hasta aproximadamente 400 miliosmoles.
La técnica de cultivo celular puede ser cultivo
en suspensión, cultivo en monocapa, tal como en frascos rotatorios,
microtransportadores o fibras huecas, preferiblemente la técnica de
cultivo en suspensión.
El modo de operación del presente proceso puede
ser continuo o discontinuo.
Los siguientes Ejemplos se dan únicamente con el
fin de ilustrar y no para ser interpretados de ninguna manera como
límite del alcance de la presente invención, lo que se define
mediante las reivindicaciones anexas.
Los porcentajes y componentes son por peso, a
menos que se indique de otra manera.
La producción del factor VIII SQ recombinante
(r-VIII SQ) se llevo a cabo esencialmente como se
describió en la patente WO-A-9109122
to Pharmacia & Upjohn, Ejemplos 1 a 3. Una línea celular CHO
deficiente de DHFR (DG44) se sometió a electroporación con un vector
de expresión que contiene el gen r-VIII SQ y un
vector de expresión que contiene el gen
dihidrofolato-reductasa. Continuando con la
selección sobre unos medios selectivos, las colonias supervivientes
fueron amplificadas a través del crecimiento en etapa por etapa
incrementando las cantidades de metotrexato. El sobrenadante a
partir de las colonias resultantes se examinó individualmente para
la actividad del factor VIII. Un clon de la producción se escogió y
posteriormente se adaptó al crecimiento en suspensión de
suero-libre en un medio definido.
La quimostatina empleada en los experimentos,
contiene quimostatina A, quimostatina B y quimostatina C, la
quimostatina A constituye la principal porción. Todos los
inhibidores de proteasas fueron grado analítico y obtenidos de Sigma
in St. Louis, USA.
La actividad de coagulación del factor VIII se
evaluó por un ensayo de sustrato cromogénico (Coatest Factor VIII,
Chromogenix AB, Mölndal, Sweden). El factor X activado (Xa) se
genera por medio de la vía intrínseca donde el factor VIII actúa
como co-factor. Luego el Factor Xa se determina por
el uso de un sustrato cromogénico sintético, S-2222
en la presencia de un inhibidor de trombina I-2581
para prevenir la hidrólisis del sustrato por la trombina. La
reacción se detiene con ácido, y el VIII:C, el cual es proporcional
a la liberación de pNA (para-nitroanilina), se
determina fotometricamente a 450 nm contra un blanco de reactivo. La
unidad del factor VIII:C se expresa en unidades internacionales
(IU) como se define por la presente Estándar Concentración
Internacional (IS) establecido por WHO.
La viabilidad celular se determinó en varias
ocasiones como se revela en las Tablas I-IV, con el
fin de verificar que los inhibidores adicionados no tienen efecto
negativo sobre la supervivencia celular a lo largo del período
completo de producción. Los análisis se hicieron después de teñir
las células con Eritrosina B en una cámara Bürker o por citometría
de flujo. La porción de células viables se calculó en relación con
el número total de células (%).
Este ejemplo tiene la intensión de ilustrar la
eficiencia de la presente invención con respecto a otros varios
inhibiodores de proteasas.
Las células CHO se cultivaron bajo condiciones
de crecimiento en viales giratorios en un medio de cultivo completo
tal como ASF o una mezcla de DMEM y Ham's Medium
F-12. Inicialmente, la temperatura fue de 37°C y el
contenido celular aproximadamente de 0.7 x10^{6} células/ml del
medio de cultivo celular. El día 0 se definió como el día de inicio
de la producción. La temperatura se redujo a 34°C. En el día 3, el
medio de cultivo se reemplazó por un medio fresco incluyendo 0.5 mM
de ácido butírico y el contenido celular se ajustó a aproximadamente
3 x 10^{6} células/ml del medio de cultivo celular. En el día 4,
una suspensión de las células en producción se dividió en alícuotas
en tubos de polipropileno para cultivos continuos y se adicionaron
inhibidores de proteasas. En el día 5 el medio se reemplazó y se
adicionaron inhibidores de proteasas. La reposición del medio se
llevo a cabo en el día 6, día 7, día10 (valores acumulados después
de 72 horas). En el día 11, se detienen los experimentos. El
análisis de Western Blot reveló que la calidad del factor producido
no fue afectado esencialmente. La viabilidad fue alta generalmente.
El valor más bajo, 90% obtenido para el control y la aprotonina, en
la producción del día 11.
Los resultados se dan en las siguientes
Tablas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Prueba | Inhibidor, | Día | Día | Día | Día | Día | Día | Día | Día | Acumulado | Acumulado |
| Concentración | 6, | 6, | 7, | 7, | 10, | 10, | 11, | 11, | IU/ml | % | |
| IU/ml | % | IU/ml | % | IU/ml | % | IU/ml | % | ||||
| 1 | Control | 2.93 | 100 | 7.2 | 100 | 24.5 | 100 | 12.5 | 100 | 47.1 | 100 |
| 4 | Quimostatina | 5.48 | 187 | 12.5 | 174 | 33.7 | 138 | 15.7 | 126 | 67.4 | 143 |
| 1.04 nM | |||||||||||
| (0.625 \mug/l) | |||||||||||
| 5 | Quimostatina | 6.80 | 232 | 10.6 | 148 | 38.5 | 157 | 10.7 | 86 | 66.6 | 141 |
| 1.04 nM | |||||||||||
| (6.25 \mug/l) |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Prueba | Inhibidor, | Día | Día | Día | Día | Día | Día | Día | Día | Acumulado | Acumulado |
| Concentración | 6, | 6, | 7, | 7, | 10, | 10, | 11, | 11, | IU/ml | % | |
| IU/ml | % | IU/ml | % | IU/ml | % | IU/ml | % | ||||
| 1 | Control | 2.93 | 100 | 7.2 | 100 | 24.5 | 100 | 12.5 | 100 | 47.1 | 100 |
| 2 | Aprotinina | 3.83 | 131 | 8.52 | 118 | 24.5 | 100 | 15.5 | 124 | 52.3 | 111 |
| 0.3 \muM | |||||||||||
| 3 | Aprotinina | 3.96 | 135 | 8.42 | 117 | 24.1 | 98 | 13.8 | 110 | 50.3 | 107 |
| 3.0 \muM | |||||||||||
| 4 | Cloroquinina | 4.19 | 143 | 9.39 | 130 | 26.5 | 108 | 11.4 | 91 | 51.5 | 109 |
| 0.625 \muM | |||||||||||
| 5 | Cloroquinina | 3.75 | 128 | 7.19 | 100 | 25.5 | 104 | 9.41 | 75 | 45.9 | 97 |
| 6.25 \muM | |||||||||||
| 6 | L-Histidina | 3.17 | 108 | 6.22 | 86 | 23.1 | 94 | 11.5 | 92 | 43.9 | 93 |
| 0.52 \muM | |||||||||||
| 7 | L-Histidina | 2.17 | 74 | 4.64 | 64 | 8.16 | 33 | 3.37 | 27 | 18.3 | 39 |
| 5.2 \muM |
| Prueba | Inhibidor, Concentración | Día 6, % | Día 7, % | Día 10, % | Día 11, % |
| 1 | Control | 97.4 | 97.5 | 91.4 | 90.7 |
| 4 | Quimostatina | 98.3 | 98.0 | 94.9 | 93.6 |
| 1.04 nM (0.625 \mug/l) | |||||
| 5 | Quimostatina | 95.3 | 95.9 | 91.6 | 94.0 |
| 1.04 nM (6.25 \mug/l) |
\vskip1.000000\baselineskip
| Prueba | Inhibidor, Concentración | Día 6, % | Día 7, % | Día 10, % | Día 11, % |
| 1 | Control | 97.4 | 97.5 | 91.4 | 90.7 |
| 2 | Aprotinina 0.3 \muM | 97.7 | 98.4 | 93.8 | 89.4 |
| 3 | Aprotinina 3.0 \muM | 97.8 | 98.1 | 94.1 | 90.1 |
| 4 | Cloroquinina 0.625 \muM | 98 | 95.3 | 90.1 | 92.5 |
| 5 | Cloroquinina 6.25 \muM | 96.9 | 98.2 | 94.5 | 90.3 |
| 6 | L-Histidina 0.52 \muM | 98.0 | 98.0 | 92.5 | 92.8 |
| 7 | L-Histidina 5.2 \muM | 99.1 | 97.8 | 95.4 | 95.4 |
Como es evidente en la Tabla I, la presencia de
los inhibidores de proteasas según la presente invención
dramáticamente aumenta la posibilidad de retener el factor VIII:C.
Al igual que es evidente en la tabla II, la presencia de otros
varios inhibidores de proteasas tiene un efecto muy pequeño o aún
negativo en el factor VIII:C. De la Tabla III es evidente que el
incremento de la producción del factor VIII ilustrado en la Tabla I,
no puede ser atribuido a una viabilidad celular creciente o
disminuida. Además, de la Tabla IV es evidente que la carencia del
efecto sobre la producción del factor VIII ilustrado en la Tabla II,
no es un efecto contrario a una reducción de la viabilidad
celular.
Claims (6)
1. Un procedimiento para la producción de un
derivado suprimido B dominante recombinante del factor VIII humano
de cuerpo-entero con una actividad coagulante
retenida, en un medio de cultivo celular y que permite la expresión
y secreción de dicho polipéptido, en donde un inhibidor de
quimotripsina que se compone de
\alpha-(2-iminohexahidro-4(S)-pirimidil)-S-glicina
se adiciona al medio de cultivo celular durante el período de
cultivo, y en donde la célula cultivada es una célula de
mamífero.
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde el inhibidor de la quimotripsina se
selecciona del grupo que consiste de quimostatina A, quimostatina
B, quimostatina C, y una mezcla de estas.
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 o 2, en donde la concentración del inhibidor de la
quimotripsina está entre 0.1 y 100 Pg/L.
4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en donde la célula de mamífero se
selecciona del grupo que consiste de células de Ovario de Hamster
Chino (CHO), células de Riñón de Hamster Bebé (BHK), células COS y
células de hibridoma.
5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en donde el medio de cultivo celular es
una medio libre de suero.
6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en donde el derivado suprimido
B-dominante del factor VIII es el factor VIII SQ
(r-VIII SQ) recombinante.
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