NO317247B1

NO317247B1 - Fremgangsmate for fremstilling av et standard diagnostisk gentranskripsjonsmonster

Info

Publication number: NO317247B1
Application number: NO19995296A
Authority: NO
Inventors: Anders Lonneborg; Praveen Sharma
Original assignee: Diagenic As
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1999-10-29
Publication date: 2004-09-27
Also published as: NO995296D0; NO995296L

Description

Den foreliggende oppfinnelsen relateres til fremgangsmåte for isolering av mRNA eller cDNA-prober og anvendelse derav for fremstilling av et diagnostisk gentranskripsjonsmønster og probetestsett, samt anvendelse av fremgangs<i>måten for å diagnostisere eller identifisere en sykdom eller tilstand.

Det er utallige eksempler på diagnostiske fremgangsmåter som inkluderer fysisk-, anatomisk- og atferdsundersøkelse og/eller biokjemiske-, elektriske-, eller elektromagnetiske studier og/eller tester.

Disse diagnostiske fremgangsmåtene er godt utviklet og er ofte effektive for å identifisere mange patologiske tilstander. De er basert på nye utviklinger og forskning så vel som på observasjonene, erfaringen og empiriske data samlet av helsepersonell som har interessert seg for sykdommer hos mennesker, andre dyr og planter i minst 6000 år.

Aldri før har arsenalet av diagnostiske verktøy vært større enn nå, men til tross for dette er feil diagnose av lidelser og andre tilstander fortsatt vanlig.

Nye sykdommer og tilstander er funnet som kan,være relatert til miljøforandringer eller mutasjoner eller andre forandringer i både de aktive agensene eller organismene så vel som i organismen som blir eksponert. I tillegg har ikke et antall gamle og nye ulovlige substanser, som er anvendt i idrett og av stoffmisbrukere, egnede diagnostiske tester for deres tilstedeværelse.

Mange tilstander er ikke lette å identifisere med de tilgjengelige fremgangsmåtene og/eller den endelige identifiseringen av en sykdom eller tilstand kan bli gjort for sent for tilstrekkelig korrigerende behandling.

På grunn av den omfattende tiden som ofte er nødvendig for en fullstendig diagnostisk prosedyre, blir ofte ukorrekt antibiotikabehandling startet for tidlig før en endelig diagnose er stilt. Denne medisinske praksisen kan forverre den alvorlige utviklingen av bakteriestammer som er restistente mot antibiotika. Således, selv om et stort antall av differensielle diagnostiske fremgangsmåter har blitt utviklet, er det fortsatt et betydelig antall av nært beslektede tilstander, eller kombinasjoner av tilstander, som vanskeliggjør rask, sikker og trygg identifisering til en lav kostnad.

Videre er et antall diagnostiske fremgangsmåter avhengig av injeksjon av fremmede væsker eller annen form for overføring av diagnostiske hjelpemidler på eller inn i organismen som er til observasjon, eller som behøver biopsien Fjerningen av vevsprøve fra deler av organismene som ofte ikke er lett tilgjengelige kan også ha en ugunstig effekt på selve identifiserings- og helbredelsesprosessen.

Det er kjent at bestemte sykdommer resulterer i forhøyet ekspresjon av forskjellige gener som i noen tilfeller kan forklare patogenesen til sykdommen eller tilstanden av interesse. Screening for tilstedeværelsen av et bestemt transkript, som en indikasjon på tilstedeværelsen av sykdom, har således blitt beskrevet (se for eksempel Enderlin et al., FEBS Letters, (1997), 412, s. 629-632). Fremgangsmåter for å kvantifisere nivåene av forskjellige transkripter ved å binde til cDNA avledet fra genbiblioteker, eller ved å sekvensere og elektronisk sammenligne med andre biblioteker, har for eksempel blitt beskrevet i Schena et al., (1996), PNAS USA, 93, s. 10614-10619; Schena et al., (1995), Science, 270, s. 467-470, Heller et al.,

(1997), PNAS USA, 94, s. 2150-2155 og internasjonal patentsøknad nr. WO95/20681.

Imidlertid har ikke en rask og enkel fremgangsmåte blitt beskrevet som anvender det karakteristiske genekspresjonsmønsteret i løpet av sykdom eller andre tilstander eller stadier derav som et verktøy for diagnose og/eller prognose, spesielt en fremgangsmåte som ikke krever noe kunnskap om sykdomskarakteristikaene, genene involvert eller deres sekvenser.

Det har nå overraskende blitt funnet at en enkel fremgangsmåte for diagnose av en sykdom eller tilstand eller stadium derav kan bli utført ved fremstillingen av en karakteristisk gentranskripsjonsmønsterstandard eller et fingeravtrykk (standard diagnostisk probemønster) for sykdommen/tilstanden, etterfulgt av sammenligning av transkripsjonsmønsteret til en pasient eller organisme, som blir studert, med dette mønsteret. Standarden blir fremstilt ved identifiseringen av et antall spesifikke og informative prober som fungerer som et sett med markører for sykdommen eller tilstanden eller stadiet derav som skal bli identifisert. Disse probene blir bundet til et fast underlag og deretter hybridisert til mRNA, eventuelt revers transkribert og/eller amplifisert. Mengden av nukleinsyremateriale som binder til de forskjellige probene blir vurdert og danner til sammen transkripsjonsmønsterstandarden til sykdommen eller tilstanden eller stadiet derav.

Dermed, for å identifisere sykdommer, illebefinnende eller andre tilstander forårsaket av andre organismer, toksiner, stress, aldring, miljøforandringer, osv., i mennesker, dyr, planter og alle andre levende eukaryote og prokaryote organismer, kan et sett med standard probemønstre av transkriptmengden for ett eller flere informative gener i forhold til en standard bli utviklet, der hvert slikt

i

standard probemønster er karakteristisk for en lidelse eller tilstand og/eller stadium av en slik lidelse. Disse standard probemønstrene blir deretter sammenlignet med et mønster av transkripsjonsnivåer, ved anvendelse av de samme probene, fremstilt fra en nylig fremskaffet prøve av vev eller kroppsvæske samlet fra en pasient som skal bli diagnostisert, der slike mønstre er spesifikke for den nåværende tilstanden til pasienten.

Vanligvis er reaksjonen til infeksjoner, toksiner, eller forringelser ledsaget av forandringer i aktivitetsnivået i flere eller mange gener. Til sammen er disse aktivitetsnivåene, som enten kan være forholdsvis høyere eller lavere, spesifikke for typen av tilstand som møtes. Den normale aktiviteten og den forandrede aktiviteten kan, til en stor grad, bli målt med mengden av spesifikt transkript eller mRNA som er til stede. Derfor kan standardiserte analyseprober bli designet som har aktivitetsmønstre som er karakteristisk for hver tilstand eller kombinasjon av tilstander som skal identifiseres eller diagnostiseres. Disse standardiserte probene kan bli anvendt til å sammenligne det standardiserte probemønsteret med transkripsjonsmønstre fra prøver av vev eller kroppsvæsker fremstilt på en tilsvarende måte og tilveiebragt fra en levende pasient eller organismen som skal studeres.

For å gjøre oppfinnelsen praktisk anvendelig må to typer av diagnostiske prober, som hovedsakelig er utviklet på lignende måte, være tilgjengelig for sammenligning. 1. Et standard diagnostisk probemønster (SDPP) som er karakteristisk for den mistenkte lidelsen, utviklet fra en eller flere organismer som har den aktuelle tilstanden eller sykdommen eller stadiet derav.

og

2. Et pasient-spesifikt probemønster (PSPP) som er utviklet fra en nylig tilveiebragt prøve av vev eller kroppsvæske fra en organisme som skal studeres.

For å anvende oppfinnelsen til en spesifikk tilstand, må mønsteret til et SDPP, som er karakteristisk for den mistenkte lidelsen eller stadium derav, ha blitt utviklet på forhånd. I tillegg må en nylig, godt bevart prøve av vev eller kroppsvæske fra pasienten være tilgjengelig for å utvikle PSPP, for sammenligning med en eller flere forskjellige SDPPer for det mistenkte antallet lidelser og deres ulike stadier.

For å designe og utvikle mønsteret til SDPP'ene, som er karakteristisk for en lidelse, kan kjente fremgangsmåter for isolering av mRNA, konstruksjon og amplifisering av cDNA og seleksjon ved differensiell hybridisering og differensielt uttrykk bli anvendt.

Selekterte, informative mRNA- og cDNA-prober fra en eller flere pasienter, som endelig har blitt diagnostisert med lidelsen av interesse, blir isolert og amplifisert. Disse SDPP'ene vil sammen bli anvendt for å sammenligne om PSPP'et ligner SDPP'et. Mange slike karakteristiske SDPP'er kan bli utviklet for å representere forskjellige stadier av den samme lidelsen.

Mønsteret til slike standardprober for et stort antall lidelser og forskjellige stadier av slike lidelser kan bli lagret i databaser og bli gjort tilgjengelig for laboratorier etter anmodning.

Derfor, sett fra et aspekt, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for isolering av mRNA eller cDNA prober spesifikke for en sykdom eller tilstand eller stadium derav i en eukaryot organisme, kjennetegnet ved at den i det minste innbefatter de følgende trinnene: a) isolere mRNA fra normalvev, celler eller kroppsvæskeprøver fra én eller flere normale eukaryote organismer; b) isolere mRNA fra det korresponderende syke vevet, cellene eller kropps-væskeprøver som har blitt isolert fra én eller flere organismer i trinn a) som har sykdommen eller tilstanden av interesse eller et stadium derav, hvor nevnte vev, celler eller kroppsvæske oppnås fra en del av nevnte organisme fjerntliggende fra området av nevnte sykdom; c) separere mRNA'et fra trinnene a) og b), som eventuelt kan bli revers transkribert til cDNA med en ikke-sekvensbasert separeringsfremgangsmåte; d) selektere to eller flere mRNA- eller cDNA-arter som er til stede ved forskjellige nivåer i de normale- og sykelige prøvene;

e) isolere mRNA- eller cDNA-artene som ble identifisert i trinn d); og

f) eventuelt revers transkribere mRNA'et fra trinn d) eller e) til cDNA, hvis ikke

dette tidligere har blitt utført i trinn c).

Slik det er brukt heri kan sykdommen eller tilstanden være enhver tilstand, lidelse, sykdom eller reaksjon som fører til den relative økningen eller reduksjonen i aktiviteten til informative gener i enhver eller alle eukaryote eller prokaryote organismer, uavhengig om disse forandringene har blitt forårsaket ved innflytelse av bakterier, virus, prioner, parasitter, sopp, stråling, naturlige eller kunstige toksiner, droger eller allergener, inkludert mentale tilstander som skyldes stress, nevrose, psykose eller forringelse på grunn av organismens aldring, og tilstander eller sykdommer med ukjent årsak.

Slike sykdommer inkluderer de som resulterer i metabolske eller fysiologiske forandringer, som feberassosierte sykdommer som influensa eller malaria. Andre sykdommer som kan bli detektert inkluderer for eksempel gul feber, seksuelt overførte sykdommer som gonoré, fibromyalgi, candida-relatert kompleks, kreft (for eksempel i mage, lunge, bryst, prostatakjertel, tarm, hud, osv.), Alzheimers sykdom, sykdom forårsaket av retrovirus som HIV, senil demens, multippel sklerose og Creutzfeldt-Jacob sykdom, for å nevne noen få.

Oppfinnelsen kan også bli anvendt til å identifisere pasienter med psykiatriske eller psykosomatiske sykdommer som schizofreni og spiseforstyrrelser. Spesielt viktig er anvendelsen av denne fremgangsmåten for å detektere sykdommer, eller stadier derav, som ikke er enkle å detektere ved hjelp av kjente diagnostiske fremgangsmåter, slik som HIV som generelt ikke er detekterbar ved anvendelse av kjente teknikker 1 til 4 måneder etter infeksjon. Tilstander som kan bli identifisert inkluderer for eksempel drogemisbruk, slik som anvendelsen av narkotika, alkohol, steroider eller prestasjonsforbedrende droger. Den diagnostiske fremgangsmåten kan bli anvendt alene som et alternativ til andre diagnostiske teknikker eller i tillegg til slike teknikker. Fremgangsmåter i den foreliggende oppfinnelsen kan for eksempel bli anvendt som et alternativ eller ekstra diagnostisk mål for diagnose ved å anvende bildeteknikker, slik som "Magnetisk Resonans Imaging" (MRI), ultralydbilde, nukleær bildeteknikk eller røntgenstråle-bildeteknikk, for eksempel i identifiseringen og/eller diagnose av tumorer.

"Stadier" derav henviser til forskjellige stadier av sykdommen eller tilstanden som kan eller ikke kan vise bestemte fysiologiske eller metabolske forandringer, men som har forandringer på gennivået som kan bli detektert som forandret genekspresjon. Man bør være klar over at ekspresjonen av forskjellige transkripter kan variere i løpet av utviklingen av en sykdom eller tilstand. Derfor kan ikke forandret ekspresjon ved forskjellige stadier bli lagt fram for bestemte transkripter sammenlignet med "normale" prøver. Derimot er informative prober valgt fra de transkriptene som viser forandret ekspresjon ved ett eller flere stadier gjennom sykdomsforløpet og, som sammen med informasjon som er relatert til nivået av andre transkripter, kan bli anvendt til å tilveiebringe et karakteristisk mønster som er indikativt for et spesielt stadium av sykdommen. Slike informative prober kan bli identifisert ved å sammenligne transkriptene fra normale prøver med transkripter fra sykelige prøver fra ett eller flere stadier av sykdommen eller tilstanden, eller ved å sammenligne forskjellige stadier av sykdommen eller tilstanden med hverandre, i henhold til fremgangsmåten beskrevet over.

r

Slik det er anvendt heri, kan den eukaryote organismen være enhver eukaryot organisme, slik som mennesker, andre pattedyr og dyr, fugler, insekter, fisk og planter.

Slik det er anvendt heri kan "vevet" være et vev som er tilveiebragt under kirurgi, for eksempel med biopsi, eller på andre måter. "Celler" inkluderer celler som er isolert fra vev eller kroppsvæsker eller kroppsavfall. "Kroppsvæsker" inkluderer urin, blod og sæd, osv. Man bør derimot være klar over at anvendelse av fremgangsmåten for å fremstille det standard transkripsjonsmønsteret og anvendelse av fremgangsmåten for diagnose i oppfinnelsen også er anvendelig på levende deler av eukaryote organismer, slik som cellelinjer og organkulturer og eksplantater.

"Normal" slik det er anvendt heri henviser til organismer eller prøver som er anvendt i sammenligningsøyemed. Fortrinnsvis er disse "normale" på den måten at de ikke viser noen antydning til, eller antas å ha, noen sykdom eller tilstand som vil affisere genekspresjon, spesielt med hensyn på sykdommen der de skal anvendes som standard. Man bør imidlertid være klar over at forskjellige stadier av en sykdom eller tilstand kan bli sammenlignet, og i slike tilfeller korresponderer den "normale" prøven til det tidligere stadiet av sykdommen eller tilstanden. "Sykelige" prøver og organismer inkluderer prøver og organismer som lider av en lidelse eller bestemt tilstand og er de som er kjent for å ha, eller som viser, sykdommen eller tilstanden eller stadiet derav ved undersøkelse.

"Komplementære tråder" er anvendt på den konvensjonelle måten for å henvise til DNA-tråder som er komplementære ved hver base til cDNA-templatet som de er avledet fra. "cDNA", slik det er henvist til heri, inkluderer førstetråd-cDNA produsert ved revers transkripsjon av RNA og komplementære tråder til førstetråd-cDNA'et, nemlig andretråd-cDNA.

"Forskjellige nivåer" av nukleinsyreartene henviser til kvantitative eller kvalitative ulikheter som antyder differensiell ekspresjon. En "probe" kan være ett eller flere nukleinsyremolekyler som kan være like eller forskjellige (dvs. en blanding), men som under ett er uttrykt differensiert i de normale- og sykelige prøvene. Når ulike

stadier av sykdommen/tilstanden blir undersøkt skal differensiell ekspresjon av transkriptene som korresponderer til probene enten bli vist relativt til en ikke-sykelig prøve eller relativt til et forskjellig stadium av sykdommen/tilstanden. Generelt er slike prober cDNA som er revers transkribert fra mRNA, eller dets komplementære tråder, selv om mRNA'et i seg selv også kan bli anvendt. Dette kan for eksempel bli oppnådd ved anvendelse av et DNA-fragment som et templat for proben ved innsetning i en vektor bak en T3 eller lignende promoter. Man bør imidlertid være klar over at dette nukleinsyrematerialet kan bli modifisert uten å affisere utførelsen av oppfinnelsen, gitt at hybridisering til

nukleinsyremolekylprøver fortsatt er mulig. Nukleinsyremolekylene som er henvist til heri, slik som mRNA og cDNA, inkluderer således molekyler som er modifiserte (f.eks. metylerte) eller som inkluderer modifiserte eller unaturlige baser som kan bli anvendt i fremstillingen av cDNA'et eller i løpet av amplifisering. Lignende betraktninger gjelder for ethvert nukleinsyremolekyl som er beskrevet heri. Derfor kan for eksempel transkriptene, som er til stede i prøvene, være i form av RNA eller forandret til modifiserte utgaver av RNA, og/eller til modifiserte eller ikke-modifiserte utgaver av DNA, og/eller i form av primere, antistoffer eller andre molekyler som gjenkjenner og binder tii målprober, spesielt ved spesifikk hybridisering til målprobene.

"Vurdering", slik det er anvendt heri, henviser til både kvantitativ og kvalitativ vurdering som kan bli bestemt i absolutte eller relative termer. Det karakteristiske "mønsteret" som dannes med denne fremgangsmåten henviser til informasjon som for eksempel kan være fremstilt i tabell- eller grafisk form og viser informasjon om signalet som er assosiert med to eller flere prober.

Slik det er anvendt heri henviser "korresponderende" vev osv. fortrinnsvis til det samme vevet, cellene eller væsken, men inkluderer også vev, celler eller væske som ligner tilstrekkelig for hensikten med å fremstille standarden. Når det er anvendt med hensyn på gener "som korresponderer" til probene, refererer dette til gener som er beslektet med sekvensen (som kan være komplementær) til probene selv om probene kan reflektere forskjellige ekspresjons-spleiseprodukter. Derfor kan to separate prober bli utviklet for en enkel sykdom som er transkribert fra det samme genet, men som reflekterer forskjellige spleisebegivenheter. Imidlertid er anvendelsen av prober, som reflekterer forandret genekspresjon av to eller flere tydelig atskilte gener, foretrukket.

Denne oppfinnelsen relateres til både et diagnostisk prinsipp og en fremgangsmåte for å identifisere sykdommer, illebefinnende og syndromer i enhver eukaryot organisme, så vel som den assosierte fremgangsmåten for design og utvikling av diagnostiske prober for anvendelse i de relative målingene som er nødvendig for å stille spesifikk diagnose eller til å identifisere relevante tilstander.

Oppfinnelsen er en rask og nøyaktig anvendelse av fremgangsmåten for diagnostisering eller identifisering av en hvilken som helst sykdom eller tilstand som fører til forandringer i aktiviteten til gener i et mønster som er spesifikt for enhver spesiell tilstand hos organismen som er til observasjon.

Evnen til å designe diagnostiske standardprober for identifiseringen av tradisjonelle tilstander, som for nærværende er vanskelig å identifisere, så vel som evnen til å raskt tilpasse designet til å fremstille nye prober for identifiseringen av nye tilstander som kan forekomme, så snart de er identifisert, vil derfor være av stor verdi.

Fra de aller første stadiene av sykdommer forårsaket av infeksjoner, toksiske substanser, aldring eller andre tilstander som forandrer livskvaliteten til levende

eukaryote organismer, responderer hele organismen til den forandrede tilstanden. Responsen skjer i hele organismen, selv om bare en liten del av organismen ser ut til å være affisert. Responsen varer til tilstanden er helbredet eller til død inntreffer i den affiserte organismen.

Fordelene med oppfinnelsen er av både primær og sekundær natur. Prøver av vev eller kroppsvæsker kan bli tilveiebragt fra deler av organismen som ikke er affisert av tilstanden som er til observasjon. En prøve vil være tilstrekkelig for en fullstendig identifisering og kan dermed resultere i store reduksjoner i pris, tid og besværlighet ved å unngå sykehusinnleggelse i løpet av den normale omfattende rekken av diagnostiske tester som blir utført på mennesker og andre dyrepasienter.

Ingen fremmede substanser trenger å bli introdusert på eller i organismen som er til observasjon for å hjelpe til i identifiseringen av tilstanden, således vil oppfinnelsen redusere risikoen av anafylaktiske reaksjoner til slike induserte, diagnostiske substanser.

Oppfinnelsen har potensialet til å detektere de fleste sykdommer og syndromer av somatisk, psykosomatisk og mental karakter, så vel som å detektere forringelse på grunn av organismens aldring. I tillegg kan fremgangsmåten bli anvendt til å detektere organismens reaksjoner til toksiske substanser, stråling, pesticider, antibiotika, droger, allergener og kombinasjoner av flere slike tilstander.

Oppfinnelsen vil videre gjøre det mulig å detektere sykdommer eller uønskede tilstander i en organisme på veldig tidlige stadier, allerede flere år før andre subjektive eller objektive symptomer kan bli tydelige.

Selv i tilfeller der pasienten dør av en hittil ikke identifisert tilstand og dødsårsaken ikke er bestemt før en forensisk undersøkelse har blitt utført post mortem, vil prinsippet være av verdi. Hvis det, i et forsøk på å diagnostisere pasienten før død, hadde vært utviklet en serie med pasient-spesifikke probemønstre, kan disse probene bli anvendt til å designe nye standard probemønstre som kan anvendes til å diagnostisere senere forekomster av lignende tilstander.

De analytiske instrumentene og utstyret som er nødvendig for anvendelse av den foreliggende oppfinnelsen er lett tilgjengelig i laboratorier som er involvert i standard biokjemisk og bioteknologisk arbeide.

For å begynne fremstillingen av gentranskripsjonsmønster-probetestsettet blir mRNA ekstrahert fra vevene, cellene eller kroppsvæsken i henhold til kjente fremgangsmåter (se for eksempel Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) fra et normalt individ eller organisme.

mRNA blir også ekstrahert, fortrinnsvis fra den samme kroppsdelen til et korresponderende individ eller organisme som har sykdommen eller tilstanden som det standard diagnostiske mønsteret skal lages for. På grunn av vanskelighetene med å arbeide med RNA, blir RNA'et fortrinnsvis revers transkribert på dette stadiet for å danne førstetråd-cDNA, selv om dette kan bli utført etter separering og identifisering av transkripter av interesse hvis cDNA-prober skal bli generert. Kloning av cDNA'et eller seleksjon fra, eller anvendelse av, et cDNA-bibliotek er imidlertid ikke nødvendig i denne eller andre fremgangsmåter i oppfinnelsen.

Fortrinnsvis blir de komplementære trådene til førstetråd-cDNA'ene syntetisert,

dvs. andretråd-cDNA'er, men dette vil være avhengig av hvilke tråder som er tenkt å bli anvendt som probene og naturen til nukleinsyremolekylene i prøven som skal bli analysert med probe i løpet av diagnosefremgangsmåten. Andretråd-cDNA'ene blir fortrinnsvis anvendt til å undersøke cDNA-tråder, som har blitt produsert ved revers transkripsjon av prøve-mRNA'et, med prober.

Fortrinnsvis blir cDNA-trådene amplifisert med kjente amplifiseringsteknikker, slik som polymerasekjedereaksjonen (PCR) ved anvendelse av egnede primere. Alternativt kan cDNA-trådene bli klonet med en vektor, anvendt til å transformere en bakterie som E.coli som deretter kan bli dyrket for å multiplisere nukleinsyremolekylene. Når sekvensen til cDNA'ene er ukjente, kan primere bli dirigert til regioner av nukleinsyremolekylene som har blitt introdusert. Således kan for eksempel, som beskrevet i Eksemplene heri, adaptere bli ligert til cDNA-molekylene og primere dirigert til disse delene for å amplifisere cDNA-molekylene. Alternativt, i tilfellet med eukaryote prøver, kan man benytte seg av polyA-halen og kapsen på RNA'et for å fremstille egnede primere.

Separering av den normale- og sykelige mRNA- eller cDNA-prøven blir utført separat på hver prøve med ikke-sekvensbaserte separeringssteknrkker, som er enhver egnet fremgangsmåte som gjør det mulig å skille mellom transkripter eller deres korresponderende cDNA'er uten å involvere anvendelsen av sekvens-informasjon til spesielle transkripter for å skille mellom de forskjellige transkriptene/cDNA'ene. Dette utelukker imidlertid ikke muligheten for å anvende prober som for eksempel er merket for å produsere signaler på transkriptene dersom probene er dirigert til sekvenser som er felles for alle eller de fleste av transkriptene, som ikke er anvendt med den hensikt å skille mellom transkripter. Derfor kan mRNA eller cDNA passende bli separert ved elektroforetisk separering på en agarose- eller polyakrylamidgel eller en lignende gel som egner seg for separeringen av nukleinsyremolekylene. Alternativt kan produktene bli separert med gasskromatografi eller HPLC eller lignende fremgangsmåter. (Sekvensbaserte separeringssteknikker, som er ekskludert, inkluderer for eksempel festing med prober rettet mot forskjellige sekvenser ved hybridisering eller sekvenser-ingen av dem selv).

Slike fremgangsmåter har fordelen av at prober, som skal anvendes i fremgangsmåtene i oppfinnelsen, blir identifisert og valgt fra hele populasjonen av transkripter eller cDNA, siden ingen seleksjon blir gjort på grunnlag av deres sekvens før separeringen, f.eks. med hybridisering til immobiliserte nukleinsyrer fra kontrollprøver. Således blir ikke identifiseringen av transkriptene dratt mot seleksjonen av bestemte transkripter fra en mindre gruppe av alle transkripter.

For å muliggjøre sammenligning mellom prøvene, bør separering av transkriptene/cDNA'ene bli utført på de normale- og sykelige prøvene så samtidig som mulig, f.eks. kjøringer rett etter hverandre eller på den samme gelen.

For å identifisere de forskjellige transkriptene eller cDNA er det nødvendig å identifisere et signal som korresponderer til hvert transkript/cDNA. Dette kan passende bli oppnådd ved anvendelsen av en radioaktiv- eller annen merking som kan bli inkorporert i løpet av cDNA-produksjon eller i løpet av amplifisering.

Egnede merkegrupper er de som direkte eller indirekte muliggjør deteksjon eller måling av tilstedeværelsen av transkriptene/cDNA. Slike merkegrupper innbefatter for eksempel radio-merkegrupper, kjemiske merkegrupper, for eksempel kromoforer eller fluoroforer (f.eks. farger slik som fluorescein og rhodamin), eller reagenser med høy elektrontetthet slik som ferritin, hemocyanin eller kolloidalt gull. Alternativt kan merkegruppen være et enzym, for eksempel peroksidase eller alkalisk fosfatase, der tilstedeværelsen av enzymet blir synliggjort med dets interaksjon med en egnet forbindelse, for eksempel et substrat. Merkegruppen kan også være del av et signalpar der det andre medlemmet av paret er funnet på,

eller tett i nærheten til, målproben som transkriptet/cDNA'et binder seg til, for eksempel kan en fluorescerende forbindelse og et undertrykt fluorescerende substrat bli anvendt. En merkegruppe kan også bli tilveiebragt på et annet molekyl, slik som et antistoff, som gjenkjenner en peptidgruppe som er festet til transkriptene/cDNA'ene, for eksempel festet til et underlag som er anvendt i forbindelse med syntese eller amplifisering.

Et signal kan bli oppnådd ved introduksjonen av en merkegruppe før, i løpet av

eller etter separeringstrinnet. Derfor kan for eksempel en gel som transkriptene har blitt separert på bli undersøkt med merkede polyT-oligonukleotider, eller cDNA kan bli undersøkt med merkede polyA-oligonukleotider eller undersøkt med merkede oligonukleotider dirigert til en sekvens som er introdusert med ligering og/eller amplifisering. Alternativt kan tilstedeværelsen av transkripter bli identifisert med andre fysiske egenskaper, slik som deres absorpsjon, dersom fremgangsmåter som gasskromatografi eller HPLC blir benyttet for separering.

Avhengig av fremgangsmåten som blir anvendt for separering kan signaler for forskjellige transkripter eller deres cDNA overlappe og ikke bli fullstendig bestemt. Mens prober som inneholder en blanding av transkripter eller deres cDNA (gitt at blandingen som en helhet viser differensiell ekspresjon i normale- og sykelige prøver) kan bli produsert, kan blandingen av transkripter/cDNA eventuelt bli ekstrahert og utsatt for gjentatte eller alternative separeringssteknikker for å isolere en mindre populasjon av transkripter/cDNA'er som viser den forandrede ekspresjonen.

Nukleinsyrearter som viser differensiell ekspresjon i normale- versus sykelige prøver, eller i minst ett stadium av nevnte sykdom, er identifisert. Dette krever sammenligning av signalene produsert av de normale- og sykelige prøvene. Transkripter/cDNA'er av interesse er de som er uttrykt differensiert i de forskjellige prøvene som er vist med forskjellige signalmengder. Dette kan korrespondere til en utgave som er tilstedeværende i den sykelige prøven og ikke i den normale prøven eller vice versa. På denne måten blir både genekspresjon som er skrudd på og genekspresjon som er skrudd av reflektert. Dette gir betydelige fordeler i forhold til tidligere fremgangsmåter i faget der forandret genekspresjon blir identifisert relativt til normale prøver (der cDNA fra normale biblioteker blir anvendt som hybridiseringstemplatet som prøve-mRNA binder seg til og den relative forskjellen mellom "normale" og "sykelige" prøver blir målt). Fremgangsmåten i oppfinnelsen kan dermed identifisere gener som ikke er uttrykt konstitutivt eller som kun er uttrykt ved svært lave nivåer i normale prøver, men er aktivert i sykdommen/tilstanden av interesse, eller i hvert fall ett stadium derav.

Transkripter/cDNA som reflekterer en variasjon i graden av ekspresjon kan bli anvendt, men det er fordelaktig å anvende de artene som reflekterer tydelige forskjeller, f.eks. fravær eller tilstedeværelse av et transkript/cDNA.

Når de først er identifisert blir mRNA- eller cDNA-artene (som kan være en blanding av molekyler som har forskjellige sekvenser) isolert. For å fremstille et standard diagnostisk mønster kan to eller flere arter (prober) som reflekterer forandret genekspresjon i minst ett stadium av nevnte sykdom eller tilstand bli isolert. Mens kun to prober i noen tilfeller kan være tilstrekkelig til å produsere et standard diagnostisk mønster for en bestemt tilstand eller sykdom eller stadium derav, bør man være klar over at en økning av antallet prober vil forebygge muligheten for feildiagnose ved sammenligning med andre sykdommer som tilsvarende kan forandre ekspresjonen av de bestemte genene av interesse. Således er fortrinnsvis mellom 2 og 1000 probearter valgt for isolering, spesielt foretrukket mellom 10 og 500, spesielt foretrukket mellom 50 og 100, for eksempel 70 probearter. Disse probene reflekterer gener som har forandret ekspresjon i sykdommene eller tilstandene av interesse, eller bestemte stadier derav blir betraktet som "informative" for den bestemte sykdommen i organismen som undersøkes og kun de probene som har denne informative egenskapen blir valgt.

Isolering kan være ved seleksjon av egnede fraksjoner hvis separering for eksempel ble utført på en kolonne, eller ved fysisk fjerning fra separerings-matriksen, for eksempel utkutting av gelbiter inneholdende nukleinsyreartene av interesse. Nukleinsyremolekylene som er deri blir deretter isolert og renset om nødvendig for de senere trinnene, fortrinnsvis ved amplifisering.

I tilfeller der selve transkriptene har blitt separert og isolert, kan disse deretter bli omdannet til cDNA, fortrinnsvis ved amplifisering.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsens første aspekt kan i et annet aspekt av oppfinnelsen anvendes for fremstilling av et gentranskripsjonsmønster-probetestsett for å diagnostisere eller identifisere nevnte sykdom, eller tilstand, eller stadium derav i en eukaryot organisme hvor nevnte mRNA eller cDNA prober isolert ifølge krav 1 immobiliseres på ett eller flere faste underlag.

mRNA- eller cDNA-probeartene, som er produsert i henhold til fremgangsmåten over, blir deretter hver immobilisert på et fast underlag for å produsere sykdommens eller tilstandens probetestsett eller gentranskripsjonsmønster (eller fingeravtrykk)-testsett. Utallige faste underlag som er egnet som immobiliserende grupper for nukleinsyremolekyler er velkjente i faget og utførlig beskrevet i litteraturen og generell tale, der det faste underlaget kan være ethvert av de velkjente underlagene eller matriksene som for tiden i stor grad blir anvendt eller foreslått for immobilisering, separering osv. i kjemiske- eller biokjemiske prosedyrer. De immobiliserende enhetene kan derfor for eksempel være i form av partikler, lag, geler, filtre, membraner, mikrofiberstrimler, rør eller plater, fibre eller kapillærer, for eksempel lagd av et polymerisk materiale, som f.eks. agarose, cellulose, alginat, teflon, lateks eller po lys ty ren. Bestemte materialer, f.eks. kuler, er generelt foretrukket. Den immobiliserende enheten kan passende innbefatte magnetiske partikler, slik som superparamagnetiske partikler.

Festing av nukleinsyremolekylene til det faste underlaget kan bli utført direkte eller indirekte. Hvis for eksempel et filter blir anvendt kan festing bli utført med UV-indusert kryssbinding. Alternativt kan festing bli utført indirekte ved anvendelse av en festegruppe som bæres på nukleinsyremolekylene og/eller fast underlag. Derfor kan for eksempel affinitetsbindingspartnere bli anvendt, slik som avidin, streptavidin eller biotin, DNA eller DNA-bindende protein (f.eks. enten lac I-repressorproteinet eller lac-operatorsekvensen som det binder til), antistoffer (som kan være mono- eller polyklonale), antistoffragmenter eller epitopene eller haptenene til antistoffer. I disse tilfellene er en partner av bindingsparet festet til

(eller er en naturlig del av) det faste underlaget og den andre partneren er festet til (eller er en naturlig del av) nukleinsyremolekylene.

Festing av egnede funksjonelle grupper til det faste underlaget kan bli utført med fremgangsmåter som er velkjent i faget, som for eksempel inkluderer festing ved hjelp av hydroksyl-, karboksyl-, aldehyd- eller aminogrupper som kan bli tilveiebragt ved å behandle det faste underlaget for å tilveiebringe egnede overflatebelegg. Festing av egnede funksjonelle grupper til nukleinsyremolekylene i oppfinnelsen kan bli utført ved ligering eller bli introdusert i løpet av syntese eller amplifisering, for eksempel ved å anvende primere som har en egnet gruppe, slik som biotin, eller en bestemt sekvens for festing.

De individuelle probene danner moduler av testsettet og kan være tilstedeværende på ett eller flere faste underlag. Det faste underlaget til de forskjellige modulene er passende assosiert fysisk selv om signalene til hver probe må kunne bli bestemt separat. Derfor kan for eksempel plater med mange brønner bli anvendt som det faste underlaget med forskjellige prober i de forskjellige brønnene, eller regioner med et fast underlag kan innbefatte de forskjellige modulene, for eksempel kan de

. forskjellige mRNA- eller cDNA-probene bli bundet til et filter på atskilte steder.

I et foretrukket aspekt tilveiebringer derfor den foreliggende oppfinnelsen anvendelse av en fremgangsmåte i et hvilket som helst av kravene 1 eller 4-9, for å fremstille et standard diagnostisk gentranskripsjonsmønster som er karakteristisk for en sykdom eller tilstand eller stadium derav, i en eukaryot organisme, hvor den i det minste innbefatter de følgende trinnene: a) isolere mRNA fra vev, celler eller kroppsvæske som har blitt isolert fra én eller flere nevnte organismer som har sykdommen eller tilstanden eller stadium derav, som eventuelt kan bli revers transkribert til cDNA, hvor nevnte vev, celler eller kroppsvæske oppnås fra en del av nevnte organisme fjerntliggende fra området av nevnte sykdom;

b) fremstille et gentranskripsjonsmønster-probetestsett ved mobilisering av mRNA eller cDNA prober isolert i henhold til krav 1 eller 4-9, til ett eller flere

faste underlag, hvor nevnte prober på nevnte testsett er spesifikke for nevnte sykdom eller tilstand eller stadium derav i vev, celler eller kropps-

væske av en organisme som korresponderer til vev, celler eller kroppsvæske av en organisme som undersøkes; og c) hybridisere mRNA'et eller cDNA'et fra trinn a) til testsettet fremstilt i trinn b); og d) vurdere mengden av mRNA eller cDNA som hybridiserer til hver av de nevnte probene på nevnte faste underlag for å produsere et karakteristisk

mønster som reflekterer genekspresjon i prøven med sykdommen, tilstanden eller stadium derav til ett eller flere selekterte gener som korresponderer til probene.

Det beskrives således et gentranskripsjonsmønster-probetestsett for diagnostisering, identifisering eller fremstilling av et standard diagnostisk gentranskripsjonsmønster til en sykdom eller tilstand eller stadium derav i en eukaryot organisme innbefattende følgende: a) ett eller flere faste underlag som bærer to eller flere probearter ifølge oppfinnelsen som korresponderer til transkripter som reflekterer genekspresjon av ett eller flere valgte gener som er karakteristiske i tilstanden eller sykdommen eller stadiet derav i organismen som undersøkes.

Testsettet kan eventuelt også inneholde informasjon som er relatert til signalene generert av normale- eller sykelige prøver, standardisert materiale, f.eks. mRNA eller cDNA fra normale- og/eller sykelige prøver for sammenligningsøyemed, merkegrupper for inkorporering i cDNA, adaptere for å introdusere nukleinsyresekvenser for amplifiseringsøyemed, primere for amplifisering og/eller egnede enzymer, buffere og løsninger.

I ytterligere et annet aspekt, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en anvendelse av fremgangsmåten i et hvilket som helst av kravene 1 eller 4-9, for å fremstille et pasientspesifikt gentranskripsjonsmønster fra en eukaryot organisme, kjennetegnet ved at den omfatter i det minste følgende trinn: a) isolere mRNA fra vev, celler eller kroppsvæske som har blitt isolert fra nevnte organisme, som eventuelt kan bli revers transkribert til cDNA, hvor nevnte vev, celler eller kroppsvæske oppnås fra en del av organismen

fjerntliggende fra området av nevnte sykdom, og

b) fremstille et gentranskripsjonsmønster-probetestsett ved immobilisering av mRNA eller cDNA prober isolert i henhold til krav 1 eller 4-9, på ett eller

flere faste underlag hvor nevnte prober på nevnte testsett er spesifikke for nevnte sykdom, tilstand eller stadium derav i vevet, cellene eller kroppsvæsken av organismen som korresponderer med vevet, cellene eller

kroppsvæsken til organismen som undersøkes,

c) hybridisere mRNA'et eller cDNA'et fra trinn a) til et testsett fremstilt i trinn b); og d) vurdere mengden mRNA eller cDNA som hybridiserer til hver av de nevnte prober på nevnte faste underlag for å produsere et karakteristisk mønster

som reflekterer genekspresjon av én eller flere selekterte gener som korresponderer til probene.

For å produsere det standard diagnostiske gentranskripsjonsmønsteret eller fingeravtrykket til en bestemt sykdom eller tilstand eller stadium derav, blir probetestsettet produsert over anvendt til å probeanalysere mRNA eller cDNA fra en sykelig prøve for å gi et signal for hybridisering til hver bestemte probeart som er bundet til det faste underlaget, dvs. testsettmodulene. Et standard kontrollgentranskripsjonsmønster kan om ønsket bli fremstilt ved anvendelse av mRNA fra en normal prøve. Således blir total mRNA, isolert på samme måten som beskrevet over, eller dets cDNA (avhengig av komplementariteten til probearten på probetestsettmodulen) til en sykelig prøve (som korresponderer til sykdommen som probene er rettet mot) (eventuelt også en normal prøve) hybridisert under passende betingelser til probearten på probetestsettmodulene. Når begge prøvene er analysert med prober, dette kan bli utført rett etter hverandre på de samme probetestsettmodulene, med samtidig hybridisering til modulene til et korresponderende probetestsett.

For å oppnå en indikasjon på antallet transkripter/cDNA-molekyler som blir bundet til probetestsettmodulene, blir signalet, som produseres når transkriptene hybridiserer, detektert (f.eks. ved deteksjon av dobbelttrådede nukleinsyremolekyler eller deteksjon av antallet molekyler som blir bundet, etter fjerning av ubundne molekyler f.eks. ved vasking). I det siste tilfellet er fortrinnsvis merkede mRNA/cDNA-molekyler anvendt som prøven, for eksempel ved å inkorporere radiomerkede baser i løpet av revers transkripsjon, fremstillingen av komplementære cDNA-tråder eller amplifisering. Mengden av signal blir deretter vurdert for hver probetestsettmodul. Vurderingen kan være kvantitativ eller kvalitativ og kan være basert på binding av en enkelt transkripsjonsart til hver probe, en kombinasjon av transkripter, eller representative utgaver av transkriptene slik som cDNA eller modifiserte nukleinsyremolekyler som beskrevet over. Man bør være klar over at kvantitative resultater vil tilveiebringe ytterligere informasjon for transkripsjonsfingeravtrykket til sykdommen som er kompilert. Disse dataene kan bli presentert som absolutte verdier eller kan bli bestemt relativt til et bestemt standard- eller probemodulresultat. Verdien til signalet fra den normale prøven kan bli subtrahert fra signalet til den sykelige prøven, der den foregående er bestemt, selv om foretrukkede resultater fra testprøver blir sammenlignet med ikke-standardiserte sykdomsfingeravtrykk som er produsert.

Videre bør man være klar over at det standard diagnostiske gentranskripsjons-mønsteret kan bli fremstilt ved å anvende resultatene fra en eller flere sykelige-og/eller normale prøver for å identifisere prober for probetestsettet, og en eller flere sykelige prøver (og normale prøver dersom anvendt) kan bli anvendt for å utføre hybridiseringstrinnet for å oppnå det standard diagnostiske gentranskripsjons-mønsteret.

Når først et standard diagnostisk fingeravtrykk eller mønster har blitt bestemt for en bestemt sykdom eller tilstand ved anvendelse av den valgte probearten, kan denne informasjonen bli anvendt til å identifisere tilstedeværelsen, fraværet eller omfanget av sykdommen eller tilstanden i en annen organisme eller individ.

Derfor, betraktet fra et ytterligere aspekt, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en anvendelse av fremgangsmåten i hvilket som helst av kravene 1 eller 4-9, for å diagnostisere eller identifisere en sykdom eller tilstand eller stadium derav, i en eukaryot organisme, kjennetegnet ved at den innbefatter i det minste følgende trinn:

a) isolere mRNA fra vev, celler eller kroppsvæske som har blitt isolert fra nevnte organisme, som eventuelt kan bli revers transkribert til cDNA, hvor nevnte vev, celler eller kroppsvæske oppnås fra en del av nevnte organisme fjerntliggende fra området av nevnte sykdom; b) fremstille et gentranskripsjonsmønster-probetestsett ved immobilisering av mRNA eller cDNA prober isolert i henhold til krav 1 eller 4-9, til ett eller flere faste underlag hvor nevnte prober på nevnte testsett er spesifikke for nevnte sykdom eller tilstand eller stadium derav i vevet, cellene eller kroppsvæsken av en organisme som korresponderer til vevet, cellene eller kroppsvæsken til organismen som undersøkes; c) hybridisere mRNA'et eller cDNA'et fra trinn a) til et testsett fremstilt i trinn b); d) vurdere mengden av mRNA eller cDNA som hybridiserer tii hver av de nevnte probene på nevnte faste underlag for å produsere et karakteristisk

mønster som reflekterer genekspresjon av ett eller flere selekterte gener

som korresponderer til probene; og

e) sammenligne nevnte mønster til et standard diagnostisk mønster som er fremstilt i henhold til ethvert av kravene 10,12 eller 13, ved anvendelse av

korresponderende prøver fra én eller flere organismer som korresponderer til organismen som undersøkes som har nevnte sykdom eller tilstand eller stadium derav som undersøkes for å bestemme graden av korrelasjon som er indikativ for tilstedeværelsen av nevnte sykdom eller tilstand eller stadium derav i organismen som undersøkes.

Graden av korrelasjon som er nødvendig for å bekrefte tilstedeværelsen, fraværet eller omfanget av en sykdom eller tilstand tar nødvendigvis i betraktning variasjonen av verdier som oppnås fra normale- og sykelige prøver. Selv om dette kan bli fastsatt ved å tilveiebringe standardavvik for flere representative prøver som binder til probene for å utvikle standarden, bør man være klar over at enkle prøver kan være tilstrekkelig for å generere standardmønsteret for å identifisere en sykdom hvis testprøven viser nær nok korrelasjon med standarden.

Den diagnostiske fremgangsmåten kan bli anvendt til å identifisere, kvantifisere eller diagnostisere en sykdom, tilstand, eller lidelse eller dens stadium eller progresjon, for eksempel kreft i mennesker og bovint spongiform encefalopati i kveg. Fremgangsmåtene i oppfinnelsen kan også bli anvendt til å monitorere tilstanden/forfatningen til planter, for eksempel å monitorere effektene av forurensning.

På grunn av effektene som visse eksogene faktorer eller sykdommer utøver på alle deler av kroppen, dvs. at effektene på genekspresjon ikke er begrenset til områdene med tydelig sykdom, kan derfor kroppsdeler fjerntliggende fra interesseområdet, f.eks. en tumor, bli analysert. Således kan prøver bli tilveiebragt for testing på en enkel måte, slik som for eksempel en kroppsvæske som blod. Siden prøver kan komme fra ulike deler av kroppen som kan ha litt forskjeller i deres transkripsjonsprodukter, bør prøver som anvendes til å fremstille standard-og testprøvene fortrinnsvis bli matchet. Tre forskjellige prøver, som kan bli avledet fra forskjellige kilder, angår diagnosefremgangsmåtene i oppfinnelsen. Dette er prøvene som anvendes til å fremstille probene, den sykelige prøven som anvendes til å fremstille det standard diagnosemønsteret og testprøven. Fortrinnsvis er alle prøvene avledet fra sammenlignbare kilder, men spesielt fordelaktig er i det minste den sykelige prøven som anvendes til å fremstille standardmønsteret og testprøven avledet fra en korresponderende kilde.

De følgende eksemplene er bare gitt for å illustrere der de refererte Figurene er som følger: Figur 1 viser et standard diagnostisk genekspresjonsmønster i grafisk form for en sykdom i Arabidopsis; og Figur 2 viser bindingsgraden av cDNA som er isolert fra Picea abies utfordret med forskjellige typer stress til 7 ulike prober.

Eksempel 1: Diagnose av Alzheimers sykdom

En blodprøve blir tatt av en pasient som mistenkes for å lide av sykdommen. Prøven blir umiddelbart lagt ned i flytende nitrogen for å hindre degradering av mRNA'et i prøven.

Prøven blir overført for analyse, mRNA'et blir omdannet til cDNA, amplifisert med PCR (polymerasekjedereaksjon) og merket med egnede radioaktive nukleotider. Det merkede cDNA'et blir hybridisert til flere diagnostiske DNA-prober som er immobilisert på et filter.

De radioaktive signalene fra PSPP-filteret blir kvantifisert ved å anvende en "Instant Imager" og den relative signalverdien fra hver av de forskjellige probene blir bestemt.

De relative verdiene fra de forskjellige probene vil til sammen danne et mønster PSPPet som er spesifikt for pasientens lidelse.

Dette spesifikke mønsteret for pasienten blir sammenlignet med de SDPPene som er karakteristiske for Alzheimers sykdom i forskjellige stadier. Hvis mønstrene til SDPP'et og PSPP'et er sammenfallende, er lidelsen og dens stadium diagnostisert med stor sikkerhet.

Dersom mønstrene ikke er sammenfallende kan lidelsen bli utelukket og det samme PSPP'et kan bli sammenlignet manuelt eller automatisk med et hvilket som helst tilgjengelig SDPP til en match er funnet.

Eksempel 2: Diagnose av senil demens

Den pasient-spesifikke prøven blir høstet, bevart, mRNA'et blir omdannet til cDNA, amplifisert og merket ved anvendelse av den samme fremgangsmåten som er beskrevet i Eksempel 1.

Den sammenlignbare hybridiseringen blir utført med et annet sett av SDPPer som har blitt utviklet for å skille mellom forskjellige typer og stadier av senil demens.

Eksempel 3: Bredt helsestatusspektrum

Primere, for å detektere et sett med transkripter, blir anvendt til merking.

De merkede prøvene blir separert med gelelektroforese og alle DNA-fragmentene blir detektert og kvantifisert.

Det resulterende mønsteret som er spesifikt for pasient-PSPP'et blir deretter sammenlignet med SDPPer fra en rekke forskjellige sykdommer. For hver feil-matching som oppstår kan den assosierte lidelsen bli utelukket.

Eksempel 4: Diagnose av en sykdom/tilstand i Arabidopsis

Diagnosen kan bli inndelt i to trinn:

- Utvikling av et reproduserbart ekspresjonsmønster (fingeravtrykk) som er typisk for sykdommen/tilstanden som skal diagnostiseres. - Anvende den utviklede fremgangsmåten til en prøve fra en ikke-diagnostisert pasient eller organisme og sammenligne ekspresjonsmønsteret med mønstre utviklet for sykdommen/tilstanden.

4.1 Utvikling av et reproduserbart ekspresjonsmønster som er typisk for sykdommen/tilstanden som skal bli diagnostisert.

4.1.1 Ekstraksjon av total RNA fra blader til Arabidopsis

Prøver med 15 g blader hver fra planter med en diagnostisert sykdom og fra friske planter blir samlet og umiddelbart frosset i flytende nitrogen. Hver prøve blir delt i to delmengder.

Bladene fra en av de to delmengdene fra hver av prøvene blir knust med en morter og støter i flytende nitrogen til et fint pulver. Den andre delmengden fra hver prøve blir lagret ved -70 °C.

De knuste bladene blir umiddelbart overført til et 500 ml beger med 150 ml knusingsbuffer (0,18 M Tris-HCI, pH 8,2, 0,09 M LiCI, 4,5 mM EDTA, 1 % (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS) pluss 50 ml TLE-ekvilibrert fenol (TLE = 0,2 M Tris-HCI, pH 8,2, 0,1 M LiCI, 5 mM EDTA)).

Blandingen blir homogenisert med en polytron i 2 minutter ved moderat hastighet (innstilling 5-6). 50 ml kloroform blir tilsatt og blandet inn i homogenatet ved å anvende polytronen. Blandingen blir helt over i en sentrifugeflaske og varmet i 20 minutter ved 50°C. Dette blir deretter sentrifugert i 20 minutter ved 17 700xg, 4 °C.

Etter sentrifugering blir så mye som mulig av det vandige sjiktet fjernet uten å forstyrre interfasen og denne fasen blir blandet i en ny sentrifugeflaske med 50 ml TLE-ekvilibrert fenol ved risting. 50 ml kloroform blir deretter tilsatt og flasken blir ristet kraftig og deretter sentrifugert ved 17 700xg, 15 minutter, 4 °C.

Etter sentrifugering blir den vandige fasen fjernet og ekstrahert på nytt med TLE-ekvilibrert fenol helt til ingen interfase oppnås. Den vandige fasen blir ekstrahert en gang med kloroform.

Den vandige fasen blir overført til en ren sentrifugeflaske og 8 M LiCI blir tilsatt for å gi en endelig konsentrasjon på 2 M LiCI. RNA blir presipitert natten over ved 4

°C.

Dette blir deretter sentrifugert i 20 minutter ved 15 300xg, 4 °C. Pelleten blir vasket med noen få ml av 2 M LiCI. Pelleten blir resuspendert i 5 ml vann og overført til et sentrifugerør. 8 M LiCI blir tilsatt for å gi en endelig konsentrasjon på 2 M LiCI og RNA'et blir presipitert i 3 timer ved 4 °C. RNA'et blir pelletert med sentrifugering i 20 minutter ved 12 100xg, 4 °C. Pelleten blir vasket med 2 M LiCI og resuspendert i 2 ml vann. 200 uJ av 3 M Na-acetat og 5,5 ml av 100 % etanol blir tilsatt og RNA'et presipitert ved -20 °C natten over.

RNA'et blir pelletert i 15 minutter ved 17 700xg, 4 °C. Pelleten blir tørket og resuspendert i 1 ml vann.

RNA-konsentrasjonen blir beregnet og renheten vurdert i en 1:100 fortynning av stamløsningen ved å anvende absorbansen ved 260 nm, 280 nm, 230 nm og 320 nm. pH blir justert med konsentrert Na2HPC>4 til 1 før avlesing.

Ca. 1 (ag av hver prøve blir separert på en agarosegel for å bestemme omfanget av detekterbar DNA-kontaminasjon og RNA-degradering. Prøvene blir lagret ved - 70 °C.

4.1.2 Førstetråd cDNA-syntese

mRNA blir isolert fra 4 ug total RNA ved å anvende paramagnetiske kuler (DYNAL A.S., Oslo, Norge) i henhold til produsentens instruksjoner.

20 (al vann blir satt til hver prøve og mRNA'et blir eluert fra kulene ved 65 °C i 2 minutter. Supernatanten blir samlet i et nytt rør og elueringen gjentas. De to eluatene blir slått sammen. 1 ul oligo dT<i2-i8) (500 ng), 5 ul (fra >1 ug total RNA) mRNA og vann til 12 ul blir blandet sammen. Blandingen blir varmet til 70 °C i 10 minutter, avkjølt umiddelbart på is og sentrifugert kort for å fjerne den kondenserte løsningen fra rørveggene. 4 ul førstetråd-buffer (250 mM Tris-HCI, pH 8,3, 375 mM KCI og 15 mM MgCI2), 2 ul av 0,1 mM ditiotreitol og 1 ul dNTP-blanding (10 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP) blir tilsatt. Dette blir blandet forsiktig og inkubert i 2 minutter ved 37 °C. 1 ul (200 U) revers transkriptase, dvs. Superscript, blir tilsatt og inkubert i 1 time ved 37 °C. Rørene blir deretter plassert på is.

4.1.3 Andretråd (komplementær) cDNA-syntese

91,8 ul vann, 32 ul andretråd-buffer (100 mM Tris-HCI, pH 7,5, 500 mM KCI, 25 mM MgCI2, 0,25 mg/ml bovint serumalbumin og 500 mM (NH4)2S04, 3 ul dNTP-blanding, 6 ul av 0,1 M ditiotreitol, 2 ul E. coli DNA-ligase (10 U/ul), 4 fal E. coli DNA-polymerase (10 U/ul) og 0,7 ul E. coli RNase H (1 U/ul) blir satt til prøvene. Dette

blir inkubert i 2 timer ved 16 °C og deretter blir 2 ul av T4 DNA-polymerase (10 U) /(ag tilsatt. Dette blir inkubert i ytterligere 5 minutter ved 16 °C.

Dette blir deretter ekstrahert en gang med 1 volum av vann- mettet fenol og deretter en gang med 0,5 volum av fenol og 0,5 volum av kloroform:isoamylalkohol (39:1). 3 M av Na-acetat, pH 5,2, blir satt til for å gi en endelig konsentrasjon på 0,3 M og blandet forsiktig. 2,5 volum av 96 % etanol (-20 °C) blir tilsatt og blandingen blir sentrifugert ved 10 000xg, 4 °C i 30 minutter.

Supernatanten blir kastet og 100 ul av 75 % etanol (-20 °C) blir satt til pelleten. Denne blandingen blir sentrifugert ved 10 OOOxg, ved 4 °C i 5 minutter. Supernatanten blir kastet og pelleten blir holdt ved romtemperatur til den er tørr. Deretter blir pelleten resuspendert i 15 ul vann.

4.1.4 Adapterhybridisering

5 pmol/ul av hver av de to Taql-adapterne og de to Asel-adapterne blir blandet på forhånd.

Taql-adapter 1: GACGATGAGTCCGAC

Taql-adapter 2: CGGTCAGGACTCAT

Asel-adapter 1: CTCGTAGACTGCGTACC

Asel-adapter 2: TAGGTACGCAGTC

Blandingen blir varmet i 2 minutter ved 70 °C og avkjølt sakte til 30 °C.

4.1.5 Ligering av adaptere til cDNA'et

De to prøvene med cDNA (fremstilt i henhold til trinn 4.1.3 over) blir kuttet med Taql og Asel. 15 fal av prøven blir blandet med 3 ul buffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,9, 10 mM MgCI2, 50 mM NaCI, 1 mM ditiotreitol), 0,3 ul bovint serumalbumin (10 mg/ml), 1 ul Asel (10 U) og 1 ul Taqla (10 U). Blandingen blir inkubert ved 37 °C i minst 2 timer.

Kondensatet blir spunnet ned og inkubert ved 65 °C i minst 1,5 time. 1 ul Asel-adapter (5 pmol), 1 ul Taql-adapter (50 pmol), 4 ul ligasebuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,8,10 mM MgCfe, 10 mM ditiotreitol og 25 ug/ml bovint serumalbumin), 3 ul vann og 1 ul av T4 DNA-ligase (1 U) blir tilsatt. Dette blir inkubert ved 37 °C i 3 timer. Blandingen blir deretter fortynnet til 500 ul med TE, 8,0 (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA).

4.1.6 Preamplifisering

5 ul prøver fra det tidligere trinnet blir hver blandet med 2,5 ul amplifiseringsbuffer (0,1 M Tris-HCI, pH 8,3, 0,5 M KCI, 15 mM MgCI2 og 0,1 % (w/v) gelatin), 1 ul (5 ng) Asel-preamplifiseringsprimer, 1 ul (30 ng) Taql-preamplifiseringsprimer, 1 ul dNTP-blanding, 13,5 ul vann og 1 ul (1 U) Taql DNA-polymerase.

Asel-preamplifiseringsprimer: CTCGTAGACTGCGTACCTAAT Taql-preamplifiseringsprimer: GACGATGAGTCCTGACCGA

En temperatursyklus på 94 °C i 30 sekunder, 56 °C i 30 sekunder og 72 °C i 1 minutt blir kjørt i 25 sykluser.

4.1.7 Amplifisering

5 ul av prøvene fra preamplifiseringstrinnet blir hver blandet med 1 ul Asel-primer (5 ng), 1 ul Taql-primer (30 ng), 0,2 ul Taq-polymerase (1 U), 4 ul amplifiseringsbuffer, 0,4 ul dNTP-blanding og 8,4 ul vann. Primerne blir merket på endene med y32P-ATP.

Asel-amplifiseringsprimer: GACTGCGTACCTAATNN

Taql-amplifiseringsprimer: GATGAGTCCTGACCGANN

(N betegner enhver av de fire deoksynukleotidene)

En temperatursyklus blir kjørt med 0,7 °C senkning i det første trinnet i de 11 første syklusene med start ved 65 °C i 30 sekunder, 72 °C i 1 minutt og 94 °C i 30 sekunder. Etter de innledende 11 syklusene fortsetter syklusene i ytterligere 23 sykluser ved 65 °C i 30 sekunder, 72 °C i 1 minutt og 94 °C i 30 sekunder. Prøvene blir lagret ved 4 °C.

4.1.8 Differensielt uttrykk

En 6 % sekvenseringstype polyakrylamidgel blir støpt og sekvenseringsgelutstyret oppført. Gelen blir kjørt på forhånd til den har oppnådd 55 °C. 5 ul av hver prøve blir blandet med 5 ul sekvenseringsprøvefarge (95 % Formamid, 20 mM EDTA, 0,05 % Bromfenolblå og 0,05 % Xylencyanol FF). Prøvene blir varmet ved 75° - 80 °C i 2 minutter og umiddelbart overført til gelen. Prøvene blir plassert nær hverandre på gelen.

Gelen blir kjørt ved 55 °C helt til båndet med Xylencyanol FF har blitt eluert bort. Gelen blir tørket og en røntgenfilm blir plassert på toppen av gelen. Filmen blir eksponert natten over i mørke. Både filmen og den tørre gelen blir merket for å muliggjøre en nøyaktig passform for senere prosedyrer. Filmen blir fremkalt.

4.1.9 Selektere differensielt uttrykte cDNA-kloner som prober

Mønsteret mellom de to prøvene (normal og sykelig) blir sammenlignet og prøver blir valgt som tydelig er tilstedeværende i en av prøvene, men ikke i den andre. Filmen blir plassert nøyaktig på den tørkede gelen. Gelskiven som korresponderer til et valgt fragment (som representerer et transkript) på filmen blir skåret ut og samlet i et rør ved tilsetningen av 2 ul vann til et rør og 0,5 ul vann til hvert valgte gelfragment innenfor skjærelinjene og anvendelse av en skalpell til å skrape opp fragmentet og overføre fragmentet til røret. Mellom ett og ti fragmenter fra hver reaksjon med en spesifikk primer kan bli samlet på denne måten. Siden begge nukleotidene som er merket N på hver av amplifiseringsprimerne kan være en av fire mulige nukleotider er det 44 eller 256 mulige kombinasjoner som kan anvendes i amplifiseringen. Siden ett til ti fragmenter kan bli plukket fra enhver individuell amplifisering ved å kun anvende en enkel primer, kan totalt mellom 256 og 2560 fragmenter bli plukket fra en prøve ved anvendelse av alle ombyttinger av amplifiseringsprimeren.

En temperatursyklus blir kjørt som tidligere ved anvendelse av de umerkede amplifiseringsprimerne bortsett fra at konsentrasjonen av primerne er økt til 1 uM og dNTP-blandingen til 200 uM og 40 sykluser blir utført. 30 ng av de amplifiserte fragmentene (probene) blir lagt på et Hybond N filter ved å anvende et dotplott-instrument. Minst to kopier av filteret blir produsert. DNA'et blir festet til filteret ved UV-kryssbinding.

4.1.10 Hybridisering av testprøve-cDNA til filter med probe-cDNA

Den andre delmengden av blader fra plantene med den diagnostiserte sykdommen og de friske plantene blir anvendt til å isolere RNA som tidligere beskrevet. Førstetråd-cDNA blir fremstilt som tidligere beskrevet med det unntaket at 5 ul av [^PjadCTP (spesifikk aktivitet = 10 mCi/ml) blir tilsatt i stedet for 5 ul vann for å danne det merkede prøve-DNA'et. Filteret blir prehybridisert i en løsning av 4,8 x SSC (4,2 % (w/v) NaCI, 2,1 % (w/v) Na-citrat, pH 7,0), 1 x Denhardt (0,02 % (w/v) Ficoll 400, 0,02 % (w/v) polyvinylpyrrolidon 40, 0,02 % (w/v) bovint serumalbumin, fraksjon V), 50 % (w/v) Formatted, 0,2 M Tris-HCI, pH 7,6, 5 %

(w/v) dekstransulfat, 0,1 % Na-dodecylsulfat ved 42 °C i minst 2 timer i en hybridiseringsovn. Det merkede prøve-DNA'et blir kokt i 3 minutter og umiddelbart satt til prehybridiseringsløsningen. Denne blir inkubert ved 42 °C i hybridiseringsovnen i minst 6 timer eller natten over.

Filteret blir deretter vasket 2 x i 2 x SSC, 0,1 % SDS, 50 °C, 10 minutter, deretter vasket 2 x i 1 x SSC, 0,1 % SDS, 50 °C, 15 minutter, deretter vasket 2 x i 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, 50 °C, 30 minutter. Filmen blir eksponert i en Instant Imager.

4.1.11 Fremstilling av standarden

Ett av signalene (som resulterer fra binding av en prøve til en av probene som er hybridisert til filteret) blir betraktet som standarden. Forholdet for alle de andre signalene på filteret blir bestemt relativt til dette standardsignalet.

Forholdene til de korresponderende signalene mellom plantene med sykdommen og de uten den samme sykdommen blir sammenlignet.

Resultater

Resultatene er vist i Figur 1 for 9 selekterte cDNA'er. P1 har blitt anvendt som standarden. "Frisk" henviser til prøven fra de friske plantene og "Lidelse" henviser til prøven fra plantene med den aktuelle sykdommen.

4.2 Anvendelse av den utviklede fremgangsmåten på en ikke-diagnostisert plante

En bladprøve på 2 g blir samlet fra planten som undersøkes og umiddelbart frosset i to delmengder på 1 g hver. RNA blir ekstrahert som tidligere beskrevet fra en av delmengdene.

Førstetråd-cDNA blir syntetisert som tidligere beskrevet og merket ved å inkludere [<32>P]ctdCTP i syntesen.

Den merkede prøven blir hybridisert til et filter som har de selekterte cDNA-probene, vasket og signalene detektert på en Instant Imager som tidligere beskrevet.

Mønsteret til relative signaler fra de forskjellige probene på filteret blir sammenlignet med mønstrene fra de friske plantene og plantene med sykdommen, og en diagnose for tilstedeværelsen eller fraværet av denne sykdommen i den nye planten blir stilt.

Eksempel 5: Diagnose av en sykdom/tilstand i mennesker

Diagnosen kan bli inndelt i to trinn:

- Utvikling av et reproduserbart ekspresjonsmønster (fingeravtrykk) som er typisk for sykdommen/tilstanden som skal diagnostiseres. - Anvende den utviklede fremgangsmåten til en prøve fra en pasient og sammenligne ekspresjonsmønsteret til mønstre utviklet for sykdommen/tilstanden.

5.1 Utvikling av et reproduserbart ekspresjonsmønster som er typisk for sykdommen/tilstanden som skal diagnostiseres.

5.1.1 Ekstraksjon av total RNA fra blod

10 ml blod blir tatt fra en pasient som har blitt diagnostisert med sykdommen av interesse og fra en pasient uten denne sykdommen, men ellers så lik som mulig med hensyn på alder, kjønn og andre faktorer som kan påvirke resultatet. Hver prøve blir delt i to delmengder som umiddelbart blir frosset i flytende nitrogen.

Ved å anvende en delmengde av hver prøve blir delmengdene, etter tining, sentrifugert ved 10 OOOxg i 5 minutter for å pelletere cellene. Pelletene blir resuspendert i 1 ml av løsning A (4 M Guanidintiocyanat, 25 mM Na-citrat, pH 7,0, 0,5 % (w/v) N-laurylsarkosin, 0,1 M av 2-merkaptetanol) og lysatet gjennomløper en pipette 7-10 ganger. 0,1 ml av 2 M Na-Acetat, pH 4, blir tilsatt og blandet godt ved inversjon. 1 ml vann-mettet fenol blir tilsatt og blandet godt. 0,2 ml av 49:1 kloroform/bromklorpropan blir tilsatt og blandet godt og inkubert i 15 minutter ved 0 "C til 4 °C. Denne blandingen blir sentrifugert i 20 minutter ved 10 OOOxg og den øvre vandige fasen blir overført til et rent rør.

RNA'et blir presipitert ved tilsetning av 1 ml (1 volum) 100 % isopropanol og prøvene blir inkubert i 30 minutter ved 20 °C, etterfulgt av sentrifugering i 10 minutter ved 10 OOOxg, 4 °C.

RNA-peileten blir løst i 0,3 ml av løsning A. RNA'et blir deretter presipitert med 0,3 ml (1 volum) av 100 % isopropanol ved -20 °C i 30 minutter. Dette blir sentrifugert i 10 minutter ved 10 OOOxg, 4 °C, og supernatanten blir kastet. RNA-pelleten blir resuspendert i 75 % etanol, vortekset, og inkubert i 10-15 minutter ved romtemperatur. Dette blir sentrifugert i 5 minutter ved 10 OOOxg, 4 °C, og supernatanten blir kastet. Pelleten blir tørket ved romtemperatur, ca. 10-15 minutter. Pelleten blir resuspendert i 100 fal vann og inkubert i 10 til 15 minutter ved 55° til 60 °C.

RNA-konsentrasjonen blir beregnet og renheten vurdert i en 1:100 fortynning av stamløsningen ved anvendelse av absorbansen ved 260 nm, 280 nm, 230 nm og 320 nm. pH blir justert med konsentrert Na2HP04 til 1 mM før avlesing.

Ca. 1 ug fra hver prøve blir separert på en agarosegel for å bestemme graden av detekterbar DNA-kontaminasjon og RNA-degradering. Prøvene blir lagret ved -70

°C.

5.1.2 Førstetråd cDNA-syntese for seleksjon av differensielt uttrykte cDNA-kloner som prober

De samme trinnene blir utført som beskrevet i avsnittene 4.1.2 til 4.1.9 over.

5.1.3 Hybridisering av testprøve-cDNA til filter med probe-cDNA

Den andre delmengden av blod fra de normale- og sykelige pasientene blir anvendt til å isolere RNA, fremstille merket førstetråd-cDNA, utføre hybridisering til filteret som har probene festet til seg og eksponere filmen som beskrevet i avsnitt 4.1.10.

5.1.4 Fremstilling av standarden

Resultatene er standardisert i forhold til et enkelt signal som beskrevet i 4.1.11 over.

Forholdene av de korresponderende signalene mellom pasienten med sykdommen og pasienten uten den samme sykdommen blir sammenlignet.

Resultater

Lignende resultater som de som er illustrert i Figur 1 blir tilveiebragt.

5.2 Anvendelse av den utviklede fremgangsmåten på en ikke-diagnostisert pasient.

En blodprøve på 2 ml blir tatt fra pasienten og umiddelbart frosset i to delmengder på 1 ml hver. RNA blir ekstrahert som tidligere beskrevet fra en av delmengdene etter tining.

Førstetråd-cDNA blir syntetisert som tidligere beskrevet og merket ved å inkludere t<32>P]adCTP i syntesen.

Mønsteret til relative signaler fra de forskjellige probene på filteret blir sammenlignet med mønstrene fra den friske pasienten og pasienten med sykdommen, og en diagnose for tilstedeværelsen eller fraværet av denne sykdommen i den nye pasienten blir stilt.

Eksempel 6: Forskjellig relativt ekspresjonsmønster til 7 selekterte prober som er funnet i røtter til norsk gran ( Picea abies) som er utfordret med ulike former for stress

Fremgangsmåter

1. Sju forskjellige informative cDNA-prober ble festet til en nylonmembran. Flesteparten av klonene ble isolert fra et subtrahert cDNA-bibliotek av norske granrøtter infisert med sopp-patogenet Pythium dimorphum (i henhold til fremgangsmåten som er beskrevet i Eksempel 4), mens andre ble isolert med lignende fremgangsmåter fra norsk gran utfordret med andre former for stress. Det subtraherte biblioteket ble fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i Lonneborg et al. (1995), PCR Meth. Applic, 4, Utgivere David Bentley, Richard Gibbs, Eric Green, Richard Myers, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, s. S168-S177. Det var kjent at alle disse klonene ble indusert av

minst en form for stress.

2. Norsk gran ble dyrket i 2 måneder i et vekstkammer med en dag/natt syklus på 12 timer/12 timer lysintensitet på 500 umol x m"<2> x sek"<1>, vannet med optimal

næring en gang hver dag. Plantene ble deretter enten utfordret med næringen som tidligere (kontroll), maltosemedia, 24 mg (ferskvekt) Pythium dimorphum, eller 24 mg (ferskvekt) Rhizoctonia sp. Plantene ble utfordret i 4 og 8 dager.

Etter utfordringen ble røttene og øvre del umiddelbart frosset.

3. De gjenværende trinnene 4 til 10 ble hovedsakelig utført som beskrevet i

Eksempel 4.

4. RNA ble ekstrahert fra røttene og de øvre delene og sjekket for kvalitet og utbytte. 5. Førstetråd- og andretråd-cDNA ble syntetisert ved å anvende en polyT-primer og en primer basert på tilstedeværelsen av en 5' cap. På denne måten ble bare full-lengde kloner syntetisert for å unngå risikoen med påvirket syntese på

grunn av multiple primerbindingsseter.

6. Alt cDNA ble amplifisert ved anvendelse av PCR-fremgangsmåten og ved å anvende det samme settet med primere.

7. cDNA'ene ble merket ved å anvende polyT-primeren.

8. Filtre, som hver hadde de 7 probene festet til seg, ble prehybridisert ved 65 °C i 6 timer og de merkede cDNA-prøvene ble satt til ett filter hver og de

immobiliserte filtrene fikk hybridisere natten over ved 65 °C.

9. Filtrene bie vasket for å fjerne enhver ikke-spesifikt hybridisert merkegruppe. 10. De radioaktive signalene til de individuelle probene på hvert filter ble telt ved å anvende en Instant Imager og de relative signalene ble beregnet.

Resultater

Mønsteret som ble dannet for filtrene med røtter fra kontroll (dag 4), maltose (dag 4 og 8), Pythium dimorphum (dag 4 og 8), Rhizotonia sp. (dag 4),.og barnåler fra kontroll (dag 4) og Pythium dimorphum (dag 4) er presentert i Figur 2. To uavhengige duplikater ble utført for maltose på dag 4 og indikerte reproduserbarheten av eksperimentet.

Resultatene viser at hver av disse utfordringene danner tydelige mønstre ved anvendelse av dette settet med prober. Det kan også bli observert at stress induserer plantene systemisk og muliggjør anvendelsen av forskjellige deler av plantene for testen. Videre kan også den differensielle ekspresjonen av bestemte transkripter på forskjellige stadier av stresset bli observert.

Claims

1. Fremgangsmåte for isolering av mRNA eller cDNA prober spesifikke for en sykdom eller tilstand eller stadium derav i en eukaryot organisme, karakterisert ved at den i det minste innbefatter de følgende trinnene: a) isolere mRNA fra normalvev, celler eller kroppsvæskeprøver fra én eller flere normale eukaryote organismer; b) isolere mRNA fra det korresponderende syke vevet, cellene eller kropps-væskeprøver som har blitt isolert fra én eller flere organismer i trinn a) som har sykdommen eller tilstanden av interesse eller et stadium derav, hvor nevnte vev, celler eller kroppsvæske oppnås fra en del av nevnte organisme fjerntliggende fra området av nevnte sykdom; c) separere mRNA'et fra trinnene a) og b), som eventuelt kan bli revers transkribert til cDNA med en ikke-sekvensbasert separeringsfremgangsmåte; d) selektere to eller flere mRNA- eller cDNA-arter som er til stede ved forskjellige nivåer i de normale- og sykelige prøvene; e) isolere mRNA- eller cDNA-artene som ble identifisert i trinn d); og f) eventuelt revers transkribere mRNA'et fra trinn d) eller e) til cDNA, hvis ikke dette tidligere har blitt utført i trinn c).

2. Anvendelse av fremgangsmåten i krav 1, for fremstilling av et gentranskripsjonsmønster-probetestsett for å diagnostisere eller identifisere nevnte sykdom, eller tilstand, eller stadium derav i en eukaryot organisme hvor nevnte mRNA eller cDNA prober isolert ifølge krav 1 immobiliseres på ett eller flere faste underlag.

3. Anvendelse som er krevd i krav 2, hvor mRNA'et eller cDNA'et fra trinn e) eller trinn f) blir amplifisert før immobilisering.

4. Fremgangsmåte eller anvendelse som er krevd i ethvert av kravene 1 til 3, hvor mRNA'et fra trinnene a) og b) blir revers transkribert til cDNA.

5. Fremgangsmåte eller anvendelse som er krevd i ethvert av kravene 1 til 4, hvor nevnte cDNA blir amplifisert.

6. Fremgangsmåte eller anvendelse som er krevd i krav 4 eller 5, hvor nevnte cDNA som er produsert fra mRNA'et fra trinnene a) og b) inkorporerer en merkegruppe.

7. Fremgangsmåte eller anvendelse som er krevd i ethvert av kravene 1 til 6, hvor mellom 50 og 100 mRNA- eller cDNA-prober er isolert.

8. Fremgangsmåte eller anvendelse som er krevd i ethvert av kravene 1 til 6, hvor mellom 10 og 500 mRNA- eller cDNA-prober er isolert.

9. Fremgangsmåte eller anvendelse som er krevd i ethvert av kravene 1 til 8, hvor nevnte separeringsfremgangsmåte er gelelektroforese.

10. Anvendelse av fremgangsmåte i et hvilket som helst av kravene 1 eller 4-9, for å fremstille et standard diagnostisk gentranskripsjonsmønster som er karakteristisk for en sykdom eller tilstand eller stadium derav, i en eukaryot organisme, hvor den i det minste innbefatter de følgende trinnene: a) isolere mRNA fra vev, celler eller kroppsvæske som har blitt isolert fra én eller flere nevnte organismer som har sykdommen eller tilstanden eller stadium derav, som eventuelt kan bli revers transkribert til cDNA, hvor nevnte vev, celler eller kroppsvæske oppnås fra en del av nevnte organisme fjerntliggende fra området av nevnte sykdom; b) fremstille et gentranskripsjonsmønster-probetestsett ved mobilisering av mRNA eller cDNA prober isolert i henhold til krav 1 eller 4-9, til ett eller flere faste underlag, hvor nevnte prober på nevnte testsett er spesifikke for nevnte sykdom eller tilstand eller stadium derav i vev, celler eller kroppsvæske av en organisme som korresponderer til vev, celler eller kroppsvæske av en organisme som undersøkes; og c) hybridisere mRNA'et eller cDNA'et fra trinn a) til testsettet fremstilt i trinn b); og d) vurdere mengden av mRNA eller cDNA som hybridiserer til hver av de nevnte probene på nevnte faste underlag for å produsere et karakteristisk mønster som reflekterer genekspresjon i prøven med sykdommen, tilstanden eller stadium derav til ett eller flere selekterte gener som korresponderer til probene.

11. Anvendelse av fremgangsmåten i hvilket som helst av kravene 1 eller 4-9, for å fremstille et pasientspesifikt gentranskripsjonsmønster fra en eukaryot organisme, karakterisert ved at den omfatter i det minste følgende trinn: a) isolere mRNA fra vev, celler eller kroppsvæske som har blitt isolert fra nevnte organisme, som eventuelt kan bli revers transkribert til cDNA, hvor nevnte vev, celler eller kroppsvæske oppnås fra en del av organismen fjerntliggende fra området av nevnte sykdom, og b) fremstille et gentranskripsjonsmønster-probetestsett ved immobilisering av mRNA eller cDNA prober isolert i henhold til krav 1 eller 4-9, på ett eller flere faste underlag hvor nevnte prober på nevnte testsett er spesifikke for nevnte sykdom, tilstand eller stadium derav i vevet, cellene eller kroppsvæsken av organismen som korresponderer med vevet, cellene eller kroppsvæsken til organismen som undersøkes, c) hybridisere mRNA'et eller cDNA'et fra trinn a) til et testsett fremstilt i trinn b); og d) vurdere mengden mRNA eller cDNA som hybridiserer til hver av de nevnte prober på nevnte faste underlag for å produsere et karakteristisk mønster som reflekterer genekspresjon av én eller flere selekterte gener som korresponderer til probene.

12. Anvendelse som er krevd i krav 10 eller 11, hvor nevnte mRNA fra trinn b) blir revers transkribert til cDNA og eventuelt inkorporerer en merkegruppe.

13. Anvendelse som er krevd i krav 12, hvor nevnte cDNA blir amplifisert.

14. Anvendelse av fremgangsmåten i hvilket som helst av kravene 1 eller 4-9, for å diagnostisere eller identifisere en sykdom eller tilstand eller stadium derav, i en eukaryot organisme, karakterisert ved at den innbefatter i det minste følgende trinn: a) isolere mRNA fra vev, celler eller kroppsvæske som har blitt isolert fra nevnte organisme, som eventuelt kan bli revers transkribert til cDNA, hvor nevnte vev, celler eller kroppsvæske oppnås fra en del av nevnte organisme fjerntliggende fra området av nevnte sykdom; b) fremstille et gentranskripsjonsmønster-probetestsett ved immobilisering av mRNA eller cDNA prober isolert i henhold til krav 1 eller 4-9, til ett eller flere faste underlag hvor nevnte prober på nevnte testsett er spesifikke for nevnte sykdom eller tilstand eller stadium derav i vevet, cellene eller kroppsvæsken av en organisme som korresponderer til vevet, cellene eller kroppsvæsken til organismen som undersøkes; c) hybridisere mRNA'et eller cDNA'et fra trinn a) til et testsett fremstilt i trinn b); d) vurdere mengden av mRNA eller cDNA som hybridiserer til hver av de nevnte probene på nevnte faste underlag for å produsere et karakteristisk mønster som reflekterer genekspresjon av ett eller flere selekterte gener som korresponderer til probene; og e) sammenligne nevnte mønster til et standard diagnostisk mønster som er fremstilt i henhold til ethvert av kravene 10,12 eller 13, ved anvendelse av korresponderende prøver fra én eller flere organismer som korresponderer til organismen som undersøkes som har nevnte sykdom eller tilstand eller stadium derav som undersøkes for å bestemme graden av korrelasjon som er indikativ for tilstedeværelsen av nevnte sykdom eller tilstand eller stadium derav i organismen som undersøkes.

15. Fremgangsmåte eller anvendelse som er krevd i ethvert av kravene 1-14, hvor nevnte organisme er menneske.

16. Anvendelse som er krevd i ethvert av kravene 2 til 15, hvor nevnte faste underlag er et filter.

17. Fremgangsmåte eller anvendelse som er krevd i ethvert av kravene 1 til 16, hvor at nevnte sykdom er kreft.

18. Fremgangsmåte eller anvendelse som krevd i ethvert av kravene 1 til 16, hvor nevnte sykdom er mage, lunge, bryst, prostatakjertel, tarm eller hudkreft.

19. Fremgangsmåte eller anvendelse som krevd i ethvert av kravene 1 til 16, hvor nevnte sykdom er Alzheimers sykdom.

20. Fremgangsmåte eller anvendelse som krevd i ethvert av kravene 1 til 19, hvor nevnte celler er isolert fra vev, kroppsvæske eller kroppsavfall fra nevnte eukaryote organisme.

21. Fremgangsmåte eller anvendelse som krevd i krav 20, hvor nevnte kroppsvæske er blod.

22. Fremgangsmåte eller anvendelse som krevd i krav 20, hvor nevnte celler ikke er fra området av sykdom.