NO327084B1 - Fremgangsmate for isolering av mRNA eller cDNA-prober, samt anvendelse derav for fremstilling av et standard diagnostisk gentranskripsjonsmonster og probetestsett og anvendelse av fremgangsmaten for diagnostisering eller identifisering av en sykdom. - Google Patents
Fremgangsmate for isolering av mRNA eller cDNA-prober, samt anvendelse derav for fremstilling av et standard diagnostisk gentranskripsjonsmonster og probetestsett og anvendelse av fremgangsmaten for diagnostisering eller identifisering av en sykdom. Download PDFInfo
- Publication number
- NO327084B1 NO327084B1 NO20040371A NO20040371A NO327084B1 NO 327084 B1 NO327084 B1 NO 327084B1 NO 20040371 A NO20040371 A NO 20040371A NO 20040371 A NO20040371 A NO 20040371A NO 327084 B1 NO327084 B1 NO 327084B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- disease
- cdna
- mrna
- probes
- organism
- Prior art date
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 185
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 145
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 126
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 72
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 48
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 title claims description 111
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims description 71
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 37
- 238000013518 transcription Methods 0.000 title claims description 30
- 230000035897 transcription Effects 0.000 title claims description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 40
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 33
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 33
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 24
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 22
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 19
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 18
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 238000011835 investigation Methods 0.000 claims description 9
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 claims 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 claims 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 23
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 28
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 22
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 22
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 19
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 18
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 13
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 9
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 9
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 241000218657 Picea Species 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 235000008124 Picea excelsa Nutrition 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001253192 Pythium dimorphum Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 4
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 206010039966 Senile dementia Diseases 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- -1 radiation Substances 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- VVLFAAMTGMGYBS-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[[4-(ethylamino)-3-methylphenyl]-(4-ethylimino-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)methyl]-3-sulfobenzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(C=1C(=CC(=CC=1)S([O-])(=O)=O)S(O)(=O)=O)=C1C=C(C)C(=NCC)C=C1 VVLFAAMTGMGYBS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- HYOAGWAIGJXNQH-UHFFFAOYSA-N 1-bromo-1-chloropropane Chemical compound CCC(Cl)Br HYOAGWAIGJXNQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 208000030814 Eating disease Diseases 0.000 description 1
- 208000019454 Feeding and Eating disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 208000001640 Fibromyalgia Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029333 Neurosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 208000035755 Psychosomatic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000028017 Psychotic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000684075 Rhizoctonia sp. Species 0.000 description 1
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 235000014632 disordered eating Nutrition 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000015238 neurotic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012633 nuclear imaging Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002572 performance enhancing substance Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 201000009032 substance abuse Diseases 0.000 description 1
- 231100000736 substance abuse Toxicity 0.000 description 1
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012285 ultrasound imaging Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Det beskrives en fremgangsmåte for fremstilling av et gentranskripsjonsmønster-probetestsett for fremstilling av et mønster som er karakteristisk for en sykdom eller tilstand eller stadium derav i en eukaryot organisme, kjennetegnet ved at den omfatter i det minste følgende trinn; a) isolering av mRNA fra normalt vev, celler eller kroppsvæskeprøver som har blitt isolert fra en eller flere normale eukaryote organismer; b) isolering av mRNA fra korresponderende sykt vev, celler eller kroppsvæskeprøver som har blitt isolert fra en eller flere organismer av trinn a) som har sykdommen eller tilstanden av interesse, eller stadiet derav, hvor nevnte vev, celler eller kroppsvæske oppnås fra en del av nevnte organisme som er fjerntliggende fra område av nevnte sykdom; c) separering av mRNA av trinnene a) og b) som eventuelt kan bli revers transkribert til cDNA; d) selektering av to eller flere mRNA eller cDNA-arter som er til stede ved forskjellige nivåer i de normale og sykdomsbefengte prøvene; e) isolering av mRNA eller cDNA-artene identifisert i trinn d); f) valgfri revers transkribering av mRNA i trinn d) eller e) til cDNA, med mindre dette tidligere har blitt utført i trinn c); og g) immobilisering av mRNA eller cDNA-prober av trinnene e) eller f) på en eller flere faste underlag.
Description
Den foreliggende oppfinnelsen vedrører fremgangsmåte for isolering av mRNA eller cDNA-prober, samt anvendelse derav for fremstilling av et standard diagnostisk gentranskripsjonsmønster og probetestsett og anvendelse av fremgangsmåten for diagnostisering eller identifisering av en sykdom.
Det er utallige eksempler på diagnostiske fremgangsmåter som inkluderer fysisk-, anatomisk- og atferdsundersøkelse og/eller biokjemiske-, elektriske-, eller elektromagnetiske studier og/eller tester.
Disse diagnostiske fremgangsmåtene er godt utviklet og er ofte effektive for å identifisere mange patologiske tilstander. De er basert på nye utviklinger og forskning så vel som på observasjonene, erfaringen og empirisk data samlet av helsepersonell som har interessert seg for sykdommer hos mennesker, andre dyr og planter i minst 6000 år.
Aldri før har arsenalet av diagnostiske verktøy vært større enn nå, men til tross for dette er feil diagnose av lidelser og andre tilstander fortsatt en trivialitet.
Nye sykdommer og tilstander er funnet som kan være relatert til miljøforandringer eller mutasjoner eller andre forandringer i både de aktive agensene eller organismene så vel som i organismen som blir eksponert. I tillegg har ikke et antall gamle og nye ulovlige substanser, som er anvendt i idrett og av stoffmisbrukere, egnede diagnostiske tester for deres tilstedeværelse.
Mange tilstander er ikke lette å identifisere med de tilgjengelige fremgangsmåtene og/eller den endelige identifiseringen av en sykdom eller tilstand kan bli gjort for sent for tilstrekkelig korrigerende behandling.
På grunn av den omfattende tiden som ofte er nødvendig for en fullstendig diagnostisk prosedyre, blir ofte ukorrekt antibiotikabehandling startet for tidlig før en endelig diagnose er stilt. Denne medisinske praksisen kan forverre den alvorlige utviklingen av bakteriestammer som er resistente mot antibiotika.
Således, selv om et stort antall av differensielle diagnostiske fremgangsmåter har blitt utviklet, er det fortsatt et betydelig antall av nært beslektede tilstander, eller kombinasjoner av tilstander, som vanskeliggjør rask, sikker og trygg identifisering til en lav kostnad.
Videre er et antall diagnostiske fremgangsmåter avhengig av injeksjon av fremmede væsker eller annen form for overføring av diagnostiske hjelpemidler på eller inn i organismen som er til observasjon, eller som behøver biopsier. Fjerningen av vevsprøve fra deler av organismene som ofte ikke er lett tilgjengelige kan også ha en ugunstig effekt på selve identifiserings- og helbredelsesprosessen.
Det er kjent at bestemte sykdommer resulterer i forhøyet ekspresjon av forskjellige gener som i noen tilfeller kan forklare patogenesen til sykdommen eller tilstanden av interesse. Screening for tilstedeværelsen av et bestemt transkript, som en indikasjon på tilstedeværelsen av sykdom, har således blitt beskrevet (se for eksempel Enderlin et al., FEBS Letters, (1997), 412, s. 629-632). Fremgangsmåter for å kvantifisere nivåene av forskjellige transkripter ved å binde til cDNA avledet fra genbiblioteker, eller ved å sekvensere og elektronisk sammenligne med andre biblioteker, har for eksempel blitt beskrevet i Schena et al., (1996), PNAS USA, 93, s. 10614-10619; Schena et al., (1995), Science, 270, s. 467-470, Heller et al., (1997), PNAS USA, 94, s. 2150-2155 og internasjonal patentsøknad nr. WO95/20681.
Imidlertid har ikke en rask og enkel fremgangsmåte blitt beskrevet som anvender det karakteristiske genekspresjonsmønsteret i løpet av sykdom eller andre tilstander eller stadier derav som et verktøy for diagnose og/eller prognose, spesielt en fremgangsmåte som ikke krever noe kunnskap om sykdomskarakteristikaene, genene involvert eller deres sekvenser.
Det har nå overraskende blitt funnet at en enkel fremgangsmåte for diagnose av en sykdom eller tilstand eller stadium derav kan bli utført ved fremstillingen av en karakteristisk gentranskripsjonsmønsterstandard eller et fingeravtrykk (standard diagnostisk probemønster) for sykdommen/tilstanden, etterfulgt av sammenligning av transkripsjonsmønsteret til en pasient eller organisme, som blir studert, med dette mønsteret. Standarden blir fremstilt ved identifiseringen av et antall spesifikke og informative prober som fungerer som et sett med markører for sykdommen eller tilstanden eller stadiet derav som skal bli identifisert. Disse probene blir bundet til et fast underlag og deretter hybridisert til mRNA, eventuelt revers transkribert og/eller amplifisert. Mengden av nukleinsyremateriale som binder til de forskjellige probene blir vurdert og danner til sammen transkripsjonsmønsterstandarden til sykdommen eller tilstanden eller stadiet derav.
Dermed, for å identifisere sykdommer, illebefinnende eller andre tilstander forårsaket av andre organismer, toksiner, stress, aldring, miljøforandringer, osv., i mennesker, dyr, planter og alle andre levende eukaryote og prokaryote organismer, kan et sett med standard probemønstre av transkriptmengden for ett eller flere informative gener i forhold til en standard bli utviklet, der hvert slikt standard probemønster er karakteristisk for en lidelse eller tilstand og/eller stadium av en slik lidelse. Disse standard probemønstrene blir deretter sammenlignet med et mønster av transkripsjonsnivåer, ved anvendelse av de samme probene, fremstilt fra en nylig fremskaffet prøve av vev eller kroppsvæske samlet fra en pasient som skal bli diagnostisert, der slike mønstre er spesifikke for den nåværende tilstanden til pasienten.
Vanligvis er reaksjonen til infeksjoner, toksiner, eller forringelser ledsaget av forandringer i aktivitetsnivået i flere eller mange gener. Til sammen er disse aktivitetsnivåene, som enten kan være forholdsvis høyere eller lavere, spesifikke for typen av tilstand som møtes. Den normale aktiviteten og den forandrede aktiviteten kan, til en stor grad, bli målt med mengden av spesifikt transkript eller mRNA som er til stede. Derfor kan standardiserte analyseprober bli designet som har aktivitetsmønstre som er karakteristisk for hver tilstand eller kombinasjon av tilstander som skal identifiseres eller diagnostiseres. Disse standardiserte probene kan bli anvendt til å sammenligne det standardiserte probemønsteret med transkripsjonsmønstre fra prøver av vev eller kroppsvæsker fremstilt på en tilsvarende måte og tilveiebragt fra en levende pasient eller organismen som skal studeres.
For å gjøre oppfinnelsen praktisk anvendelig må to typer av diagnostiske prober, som hovedsakelig er utviklet på lignende måte, være tilgjengelig for sammenligning. 1. Et standard diagnostisk probemønster (SDPP) som er karakteristisk for den mistenkte lidelsen, utviklet fra en eller flere organismer som har den aktuelle tilstanden eller sykdommen eller stadiet derav, og 2. et pasient-spesifikt probemønster (PSPP) som er utviklet fra en nylig tilveiebragt prøve av vev eller kroppsvæske fra en organisme som skal studeres.
For å anvende oppfinnelsen til en spesifikk tilstand, må mønsteret til et SDPP, som er karakteristisk for den mistenkte lidelsen eller stadium derav, ha blitt utviklet på forhånd. I tillegg må en nylig, godt bevart prøve av vev eller kroppsvæske fra pasienten være tilgjengelig for å utvikle PSPP, for sammenligning med en eller flere forskjellige SDPP'er for det mistenkte antallet lidelser og deres ulike stadier.
For å designe og utvikle mønsteret til SDPP'ene, som er karakteristisk for en lidelse, kan kjente fremgangsmåter for isolering av mRNA, konstruksjon og amplifisering av cDNA og seleksjon ved differensiell hybridisering og differensielt uttrykk bli anvendt.
Selekterte, informative mRNA- og cDNA-prober fra en eller flere pasienter, som endelig har blitt diagnostisert med lidelsen av interesse, blir isolert og amplifisert. Disse SDPP'ene vil sammen bli anvendt for å sammenligne om PSPP'et ligner SDPP'et. Mange slike karakteristiske SDPP'er kan bli utviklet for å representere forskjellige stadier av den samme lidelsen.
Mønsteret til slike standardprober for et stort antall lidelser og forskjellige stadier av slike lidelser kan bli lagret i databaser og bli gjort tilgjengelig for laboratorier etter anmodning.
Derfor, sett fra et aspekt, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for isolering av mRNA eller cDNA-prober som er spesifikke for en sykdom eller tilstand eller stadium derav i en eukaryot organisme,
kjennetegnet ved at den omfatter i det minste følgende trinn:
a) isolering av mRNA fra blodprøver som har blitt isolert fra en eller flere normale eukaryote organismer, b) isolering av mRNA fra en blodprøve fra en organisme som har sykdommen eller tilstanden av interesse, eller stadiet derav, hvor nevnte blod oppnås fra
en del av nevnte organisme som er fjerntliggende fra område av nevnte
sykdom,
c) separering av mRNA av trinnene a) og b) som eventuelt kan bli revers transkribert til cDNA, d) selektering av to eller flere mRNA eller cDNA-arter som er til stede ved forskjellige nivåer i de normale og sykdomsbefengte prøvene,
e) isolering av mRNA eller cDNA-artene identifisert i trinn d) og
f) valgfri revers transkribering av mRNA i trinn d) eller e) til cDNA, med mindre dette tidligere har blitt utført i trinn c).
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av fremgangsmåten ifølge krav 1 for fremstilling av et gentranskripsjonsmønster-probetestsett for fremstilling av et mønster som er karakteristisk for en sykdom eller tilstand eller stadium derav i en eukaryot organisme, kjennetegnet ved at nevnte mRNA eller cDNA prober isolert ifølge krav 1 er båret på ett eller flere faste underlag.
Oppfinnelsen vedrører videre i et annet aspekt anvendelse av krav 2, kjennetegnet ved at mRNA eller cDNA fra trinnene e) eller f) er amplifisert før immobilisering på nevnte faste underlag.
I et ytterligere aspekt vedrører oppfinnelsen anvendelse av fremgangsmåten ifølge krav 1 eller 4 til 9 for fremstilling av et standard diagnostisk gentranskripsjonsmønster som er karakteristisk for en sykdom eller tilstand eller stadium derav i en eukaryot organisme, kjennetegnet ved at den omfatter i det minste følgende trinn: a) isolering av mRNA fra blod som har blitt isolert fra en eller flere av nevnte organismer som har sykdommen eller tilstanden eller stadiet derav, som
eventuelt kan revers transkriberes til cDNA, hvor nevnte blod oppnås fra en
del av organismen som er fjerntliggende fra sykdomsområdet,
b) fremstilling av et gentranskripsjonsmønster-probetestsett i henhold til et hvilket som helst av kravene 2 til 9, hvor nevnte prober på nevnte sett er
spesifikke for nevnte sykdom eller tilstand eller stadium derav i blodet av
organismen som er til undersøkelse,
c) hybridisering av mRNA eller cDNA fra trinn a) til settet fremstilt i trinn b), og d) bedømmelse av mengde av mRNA eller cDNA som hybridiserer til hver
probe på nevnte faste underlag for å fremstille et karakteristisk mønster som
reflekterer genekspresjon i prøven med sykdommen, tilstanden eller stadiet derav av en eller flere selekterte gener tilsvarende probene.
Det er videre beskrevet anvendelse av fremgangsmåten ifølge krav 1 eller 4 til 9 for fremstilling av et pasientspesifikt gentranskripsjonsmønster fra en eukaryot organisme,
kjennetegnet ved at den omfatter i det minste følgende trinn :
a) isolering av mRNA fra blod som har blitt isolert fra nevnte organisme, som eventuelt kan revers transkriberes til cDNA, hvor nevnte blod oppnås fra en
del av organismen som er fjerntliggende fra sykdomsom rådet,
b) fremstille et gentranskripsjonsmønster-probetestsett i henhold til et hvilket som helst av kravene 2 til 9, hvor nevnte prober på nevnte sett er spesifikke
for en sykdom eller tilstand eller stadium derav i blodet av organismen som er til undersøkelse, c) hybridisering av mRNA eller cDNA fra trinn a) til settet fremstilt i trinn b), og d) bedømmelse av mengde av mRNA eller cDNA som hybridiserer til hver av
de nevnte prober på nevnte faste underlag for å fremstille et karakteristisk mønster
som reflekterer genekspresjon av en eller flere valgte gener som tilsvarer probene.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre i et ytterligere aspekt anvendelse av fremgangsmåten ifølge krav 1 eller 4 til 9 for diagnostisering eller identifisering av en sykdom eller tilstand eller stadium derav i en eukaryot organisme, kjennetegnet ved at den omfatter i det minste følgende trinn : a) isolering av mRNA fra blod som har blitt isolert fra nevnte organisme, som eventuelt er revers transkribert til cDNA, hvor nevnte blod oppnås fra en del
av nevnte organisme som er fjerntliggende fra området for nevnte sykdom,
b) fremstilling av et gentranskripsjonsmønster-probetestsett i henhold til et hvilket som helst av kravene 2 til 9, hvor nevnte prober på nevnte testsett er
spesifikke for nevnte sykdom eller tilstand eller stadium derav i blodet av en
organisme som er til undersøkelse,
c) hybridisering av mRNA eller cDNA fra trinn a) til settet fremstilt i trinn b),
d) bedømming av mengde av mRNA eller cDNA som hybridiserer til hver av de nevnte prober på nevnte faste underlag for å fremstille et karakteristisk
mønster som reflekterer genekspresjon av en eller flere selekterte gener
tilsvarende probene, og
e) sammenligning av nevnte mønster med et standard diagnostisk mønster fremstilt i henhold til anvendelsen i et hvilket som helst av kravene 10,12 og 13
ved bruk av blodprøver fra en eller flere organismer som tilsvarer organismen til undersøkelse som har sykdommen eller tilstanden eller stadiet derav under undersøkelse for på bestemme graden av korrelasjon indikativ for nærvær av nevnte sykdom eller tilstand eller stadium derav i organismen som er til undersøkelse.
Slik det er brukt heri kan sykdommen eller tilstanden være enhver tilstand, lidelse, sykdom eller reaksjon som fører til den relative økningen eller reduksjonen i aktiviteten til informative gener i enhver eller alle eukaryote eller prokaryote organismer, uavhengig om disse forandringene har blitt forårsaket ved innflytelse av bakterier, virus, prioner, parasitter, sopp, stråling, naturlige eller kunstige toksiner, droger eller allergener, inkludert mentale tilstander som skyldes stress, nevrose, psykose eller forringelse på grunn av organismens aldring, og tilstander eller sykdommer med ukjent årsak.
Slike sykdommer inkluderer de som resulterer i metabolske eller fysiologiske forandringer, som feberassosierte sykdommer som influensa eller malaria. Andre sykdommer som kan bli detektert inkluderer for eksempel gul feber, seksuelt overførte sykdommer som gonoré, fibromyalgi, candida-relatert kompleks, kreft (for eksempel i mage, lunge, bryst, prostatakjertel, tarm, hud, osv.), Alzheimers sykdom, sykdom forårsaket av retrovirus som HIV, senil demens, multippel sklerose og Creutzfeldt-Jacob sykdom, for å nevne noen få.
Oppfinnelsen kan også bli anvendt til å identifisere pasienter med psykiatriske eller psykosomatiske sykdommer som schizofreni og spise-forstyrrelser. Spesielt viktig er anvendelsen av denne fremgangsmåten for å detektere sykdommer, eller stadier derav, som ikke er enkle å detektere ved hjelp av kjente diagnostiske fremgangsmåter, slik som HIV som generelt ikke er detekterbar ved anvendelse av kjente teknikker 1 til 4 måneder etter infeksjon. Tilstander som kan bli identifisert inkluderer for eksempel drogemisbruk, slik som anvendelsen av narkotika, alkohol, steroider eller prestasjonsforbedrende droger. Den diagnostiske fremgangsmåten kan bli anvendt alene som et alternativ til andre diagnostiske teknikker eller i tillegg til slike teknikker. Fremgangsmåter i den foreliggende oppfinnelsen kan for eksempel bli anvendt som et alternativ eller ekstra diagnostisk mål for diagnose ved å anvende bildeteknikker, slik som "Magnetisk Resonans Imaging" (MRI), ultralydbilde, nukleær bildeteknikk eller røntgenstråle-bildeteknikk, for eksempel i identifiseringen og/eller diagnose av tumorer.
"Stadier" derav henviser til forskjellige stadier av sykdommen eller tilstanden som kan eller ikke kan vise bestemte fysiologiske eller metabolske forandringer, men som har forandringer på gennivået som kan bli detektert som forandret genekspresjon. Man bør være klar over at ekspresjonen av forskjellige transkripter kan variere i løpet av utviklingen av en sykdom eller tilstand. Derfor kan ikke forandret ekspresjon ved forskjellige stadier bli lagt fram for bestemte transkripter sammenlignet med "normale" prøver. Derimot er informative prober valgt fra de transkriptene som viser forandret ekspresjon ved ett eller flere stadier gjennom sykdomsforløpet og, som sammen med informasjon som er relatert til nivået av andre transkripter, kan bli anvendt til å tilveiebringe et karakteristisk mønster som
er indikativt for et spesielt stadium av sykdommen. Slike informative prober kan bli identifisert ved å sammenligne transkriptene fra normale prøver med transkripter fra sykelige prøver fra ett eller flere stadier av sykdommen eller tilstanden, eller ved å sammenligne forskjellige stadier av sykdommen eller tilstanden med hverandre, i henhold til fremgangsmåten beskrevet over.
Slik det er anvendt heri kan den prokaryote eller eukaryote organismen være enhver eukaryot organisme, slik som mennesker, andre pattedyr og dyr, fugler, insekter, fisk og planter, og enhver prokaryot organisme, slik som en bakterie.
Slik det er anvendt heri kan "vevet" være et vev som er tilveiebragt under kirurgi, for eksempel med biopsi, eller på andre måter. "Celler" inkluderer celler som er isolert fra vev eller kroppsvæsker eller kroppsavfall eller, i tilfellet med prokaryote organismer, selve organismen. "Kroppsvæsker" inkluderer urin, blod og sæd, osv. Man bør derimot være klar over at fremgangsmåten for å fremstille det standard transkripsjonsmønsteret og fremgangsmåten for diagnose i oppfinnelsen også er anvendelig på levende deler av eukaryote organismer, slik som cellelinjer og organkulturer og eksplantater.
"Normal" slik det er anvendt heri henviser til organismer eller prøver som er anvendt i sammenligningsøyemed. Fortrinnsvis er disse "normale" på den måten at de ikke viser noen antydning til, eller antas å ha, noen sykdom eller tilstand som vil affisere genekspresjon, spesielt med hensyn på sykdommen der de skal anvendes som standard. Man bør imidlertid være klar over at forskjellige stadier av en sykdom eller tilstand kan bli sammenlignet, og i slike tilfeller korresponderer den "normale" prøven til det tidligere stadiet av sykdommen eller tilstanden. "Sykelige" prøver og organismer inkluderer prøver og organismer som lider av en lidelse eller bestemt tilstand og er de som er kjent for å ha, eller som viser, sykdommen eller tilstanden eller stadiet derav ved undersøkelse.
"Komplementære tråder" er anvendt på den konvensjonelle måten for å henvise til DNA-tråder som er komplementære ved hver base til cDNA-templatet som de er avledet fra. "cDNA", slik det er henvist til heri, inkluderer førstetråd-cDNA produsert ved revers transkripsjon av RNA og komplementære tråder til førstetråd-cDNA'et, nemlig andretråd-cDNA.
"Forskjellige nivåer" av nukleinsyreartene henviser til kvantitative eller kvalitative ulikheter som antyder differensiell ekspresjon. En "probe" kan være ett
eller flere nukleinsyremolekyler som kan være like eller forskjellige (dvs. en blanding), men som under ett er uttrykt differensielt i de normale- og sykelige prøvene. Når ulike stadier av sykdommen/tilstanden blir undersøkt skal differensiell ekspresjon av transkriptene som korresponderer til probene enten bli vist relativt til en ikke-sykelig prøve eller relativt til et forskjellig stadium av sykdommen/tilstanden. Generelt er slike prober cDNA som er revers transkribert fra mRNA, eller dets komplementære tråder, selv om mRNA'et i seg selv også kan bli anvendt. Dette kan for eksempel bli oppnådd ved anvendelse av et DNA-f ragment som et templat for proben ved innsetning i en vektor bak en T3 eller lignende promoter. Man bør imidlertid være klar over at dette nukleinsyrematerialet kan bli modifisert uten å affisere utførelsen av oppfinnelsen, gitt at hybridisering til nukleinsyremolekylprøver fortsatt er mulig. Nukleinsyremolekylene som er henvist til heri, slik som mRNA og cDNA, inkluderer således molekyler som er modifiserte (f.eks. metylerte) eller som inkluderer modifiserte eller unaturlige baser som kan bli anvendt i fremstillingen av cDNA'et eller i løpet av amplifisering. Lignende betraktninger gjelder for ethvert nukleinsyremolekyl som er beskrevet heri. Derfor kan for eksempel transkriptene, som er til stede i prøvene, være i form av RNA eller forandret til modifiserte utgaver av RNA, og/eller til modifiserte eller ikke-modifiserte utgaver av DNA, og/eller i form av primere, antistoffer eller andre molekyler som gjenkjenner og binder til målprober, spesielt ved spesifikk hybridisering til målprobene.
"Vurdering", slik det er anvendt heri, henviser til både kvantitativ og kvalitativ vurdering som kan bli bestemt i absolutte eller relative termer. Det karakteristiske "mønsteret" som dannes med denne fremgangsmåten henviser til informasjon som for eksempel kan være fremstilt i tabell- eller grafisk form og viser informasjon om signalet som er assosiert med to eller flere prober.
Slik det er anvendt heri henviser "korresponderende" vev osv. fortrinnsvis til det samme vevet, cellene eller væsken, men inkluderer også vev, celler eller
væske som ligner tilstrekkelig for hensikten med å fremstille standarden. Når det er anvendt med hensyn på gener "som korresponderer" til probene, refererer dette til gener som er beslektet med sekvensen (som kan være komplementær) til probene selv om probene kan reflektere forskjellige ekspresjons-spleiseprodukter. Derfor kan to separate prober bli utviklet for en enkel sykdom som er transkribert fra det samme genet, men som reflekterer forskjellige spleisebegivenheter. Imidlertid er
anvendelsen av prober, som reflekterer forandret genekspresjon av to eller flere tydelig atskilte gener, foretrukket.
Denne oppfinnelsen relateres også til den assosierte fremgangsmåten for design og utvikling av diagnostiske prober for anvendelse i de relative målingene som er nødvendig for å stille spesifikk diagnose eller til å identifisere relevante tilstander.
Det beskrives en rask og nøyaktig fremgangsmåte for diagnosen av en hvilken som helst sykdom eller tilstand som fører til forandringer i aktiviteten til gener i et mønster som er spesifikt for enhver spesiell tilstand hos organismen som er til observasjon.
Evnen til å designe diagnostiske standardprober for identifiseringen av tradisjonelle tilstander, som for nærværende er vanskelig å identifisere, så vel som evnen til å raskt tilpasse designet til å fremstille nye prober for identifiseringen av nye tilstander som kan forekomme, så snart de er identifisert, vil derfor være av stor verdi.
Fra de aller første stadiene av sykdommer forårsaket av infeksjoner, toksiske substanser, aldring eller andre tilstander som forandrer livskvaliteten til levende eukaryote organismer, responderer hele organismen til den forandrede tilstanden. Responsen skjer i hele organismen, selv om bare en liten del av organismen ser ut til å være affisert. Responsen varer til tilstanden er helbredet eller til død inntreffer i den affiserte organismen.
Fordelene med oppfinnelsen er av både primær og sekundær natur. Prøver av vev eller kroppsvæsker kan bli tilveiebragt fra deler av organismen som ikke er affisert av tilstanden som er til observasjon. En prøve vil være tilstrekkelig for en fullstendig identifisering og kan dermed resultere i store reduksjoner i pris, tid og besværlighet ved å unngå sykehusinnleggelse i løpet av den normale omfattende rekken av diagnostiske tester som blir utført på mennesker og andre dyrepasienter.
Ingen fremmede substanser trenger å bli introdusert på eller i organismen som er til observasjon for å hjelpe til i identifiseringen av tilstanden, således vil oppfinnelsen redusere risikoen av anafylaktiske reaksjoner til slike induserte, diagnostiske substanser.
Oppfinnelsen har potensialet til å detektere de fleste sykdommer og syndromer av somatisk, psykosomatisk og mental karakter, så vel som å detektere forringelse på grunn av organismens aldring. I tillegg kan fremgangsmåten bli anvendt til å detektere organismens reaksjoner til toksiske substanser, stråling, pesticider, antibiotika, droger, allergener og kombinasjoner av flere slike tilstander.
Oppfinnelsen vil videre gjøre det mulig å detektere sykdommer eller uønskede tilstander i en organisme på veldig tidlige stadier, allerede flere år før andre subjektive eller objektive symptomer kan bli tydelige.
Selv i tilfeller der pasienten dør av en hittil ikke identifisert tilstand og dødsårsaken ikke er bestemt før en forensisk undersøkelse har blitt utført post mortem, vil prinsippet være av verdi. Hvis det, i et forsøk på å diagnostisere pasienten før død, hadde vært utviklet en serie med pasient-spesifikke probemønstre, kan disse probene bli anvendt til å designe nye standard probemønstre som kan anvendes til å diagnostisere senere forekomster av lignende tilstander.
De analytiske instrumentene og utstyret som er nødvendig for anvendelse av den foreliggende oppfinnelsen er lett tilgjengelig i laboratorier som er involvert i standard biokjemisk og bioteknologisk arbeide.
For å begynne fremstillingen av gentranskripsjonsmønster-probetestsettet blir mRNA ekstrahert fra vevene, cellene eller kroppsvæsken i henhold til kjente fremgangsmåter (se for eksempel Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) fra et normalt individ eller organisme.
mRNA blir også ekstrahert, fortrinnsvis fra den samme kroppsdelen til et korresponderende individ eller organisme som har sykdommen eller tilstanden som det standard diagnostiske mønsteret skal lages for. På grunn av vanskelighetene med å arbeide med RNA, blir RNA'et fortrinnsvis revers transkribert på dette stadiet for å danne førstetråd-cDNA, selv om dette kan bli utført etter separering og identifisering av transkripter av interesse hvis cDNA-prober skal bli generert. Kloning av cDNA'et eller seleksjon fra, eller anvendelse av, et cDNA-bibliotek er imidlertid ikke nødvendig i denne eller andre fremgangsmåter i oppfinnelsen.
Fortrinnsvis blir de komplementære trådene til førstetråd-cDNA'ene syntetisert, dvs. andretråd-cDNA'er, men dette vil være avhengig av hvilke tråder som er tenkt å bli anvendt som probene og naturen til nukleinsyremolekylene i prøven som skal bli analysert med probe i løpet av diagnosefremgangsmåten. Andretråd-cDNA'ene blir fortrinnsvis anvendt til å undersøke cDNA-tråder, som har blitt produsert ved revers transkripsjon av prøve-mRNA'et, med prober.
Fortrinnsvis blir cDNA-trådene amplifisert med kjente amplifiserings-teknikker, slik som polymerasekjedereaksjonen (PCR) ved anvendelse av egnede primere. Alternativt kan cDNA-trådene bli klonet med en vektor, anvendt til å transformere en bakterie som E.coli som deretter kan bli dyrket for å multiplisere nukleinsyremolekylene. Når sekvensen til cDNA'ene er ukjente, kan primere bli dirigert til regioner av nukleinsyremolekylene som har blitt introdusert. Således kan for eksempel, som beskrevet i Eksemplene heri, adaptere bli ligert til cDNA-molekylene og primere dirigert til disse delene for å amplifisere cDNA-molekylene. Alternativt, i tilfellet med eukaryote prøver, kan man benytte seg av polyA-halen og kapsen på RNA'et for å fremstille egnede primere.
Separering av den normale- og sykelige mRNA- eller cDNA-prøven blir utført separat på hver prøve med ikke-sekvensbaserte separeringssteknikker, som er enhver egnet fremgangsmåte som gjør det mulig å skille mellom transkripter eller deres korresponderende cDNA'er uten å involvere anvendelsen av sekvensinformasjon til spesielle transkripter for å skille mellom de forskjellige transkriptene/cDNA'ene. Dette utelukker imidlertid ikke muligheten for å anvende prober som for eksempel er merket for å produsere signaler på transkriptene dersom probene er dirigert til sekvenser som er felles for alle eller de fleste av transkriptene, som ikke er anvendt med den hensikt å skille mellom transkripter. Derfor kan mRNA eller cDNA passende bli separert ved elektroforetisk separering på en agarose- eller polyakrylamidgel eller en lignende gel som egner seg for separeringen av nukleinsyremolekylene. Alternativt kan produktene bli separert med gasskromatografi eller HPLC eller lignende fremgangsmåter.
(Sekvensbaserte separeringssteknikker, som er ekskludert, inkluderer for eksempel festing med prober rettet mot forskjellige sekvenser ved hybridisering eller sekvenseringen av dem selv).
Slike fremgangsmåter har fordelen av at prober, som skal anvendes i fremgangsmåtene i oppfinnelsen, blir identifisert og valgt fra hele populasjonen av transkripter eller cDNA, siden ingen seleksjon blir gjort på grunnlag av deres sekvens før separeringen, f.eks. med hybridisering til immobiliserte nukleinsyrer fra kontrollprøver. Således blir ikke identifiseringen av transkriptene dratt mot seleksjonen av bestemte transkripter fra en mindre gruppe av alle transkripter.
For å muliggjøre sammenligning mellom prøvene, bør separering av transkriptene/cDNA'ene bli utført på de normale- og sykelige prøvene så samtidig som mulig, f.eks. kjøringer rett etter hverandre eller på den samme gelen.
For å identifisere de forskjellige transkriptene eller cDNA er det nødvendig å identifisere et signal som korresponderer til hvert transkript/cDNA. Dette kan passende bli oppnådd ved anvendelsen av en radioaktiv- eller annen merking som kan bli inkorporert i løpet av cDNA-produksjon eller i løpet av amplifisering.
Egnede merkegrupper er de som direkte eller indirekte muliggjør deteksjon eller måling av tilstedeværelsen av transkriptene/cDNA. Slike merkegrupper innbefatter for eksempel radio-merkegrupper, kjemiske merkegrupper, for eksempel kromoforer eller fluoroforer (f.eks. farger slik som fluorescein og rhodamin), eller reagenser med høy elektrontetthet slik som ferritin, hemocyanin eller kolloidalt gull. Alternativt kan merkegruppen være et enzym, for eksempel peroksidase eller alkalisk fosfatase, der tilstedeværelsen av enzymet blir synliggjort med dets interaksjon med en egnet forbindelse, for eksempel et substrat. Merkegruppen kan også være del av et signalpar der det andre medlemmet av paret er funnet på, eller tett i nærheten til, målproben som transkriptet/cDNA'et binder seg til, for eksempel kan en fluorescerende forbindelse og et undertrykt fluorescerende substrat bli anvendt. En merkegruppe kan også bli tilveiebragt på et annet molekyl, slik som et antistoff, som gjenkjenner en peptidgruppe som er festet til transkriptene/cDNA'ene, for eksempel festet til et underlag som er anvendt i forbindelse med syntese eller amplifisering.
Et signal kan bli oppnådd ved introduksjonen av en merkegruppe før, i løpet av eller etter separeringstrinnet. Derfor kan for eksempel en gel som transkriptene har blitt separert på bli undersøkt med merkede polyT-oligonukleotider, eller cDNA kan bli undersøkt med merkede polyA-oligonukleotider eller undersøkt med merkede oligonukleotider dirigert til en sekvens som er introdusert med ligering og/eller amplifisering. Alternativt kan tilstedeværelsen av transkripter bli identifisert med andre fysiske egenskaper, slik som deres absorpsjon, dersom fremgangsmåter som gasskromatografi eller HPLC blir benyttet for separering.
Avhengig av fremgangsmåten som blir anvendt for separering kan signaler for forskjellige transkripter eller deres cDNA overlappe og ikke bli fullstendig bestemt. Mens prober som inneholder en blanding av transkripter eller deres cDNA (gitt at blandingen som en helhet viser differensiell ekspresjon i normale- og sykelige prøver) kan bli produsert, kan blandingen av transkripter/cDNA eventuelt bli ekstrahert og utsatt for gjentatte eller alternative separeringssteknikker for å isolere en mindre populasjon av transkripter/cDNA'er som viser den forandrede ekspresjonen.
Nukleinsyrearter som viser differensiell ekspresjon i normale- versus sykelige prøver, eller i minst ett stadium av nevnte sykdom, er identifisert. Dette krever sammenligning av signalene produsert av de normale- og sykelige prøvene. Transkripter/cDNA'er av interesse er de som er uttrykt differensielt i de forskjellige prøvene som er vist med forskjellige signalmengder. Dette kan korrespondere til en utgave som er tilstedeværende i den sykelige prøven og ikke i den normale prøven eller vice versa. På denne måten blir både genekspresjon som er skrudd på og genekspresjon som er skrudd av reflektert. Dette gir betydelige fordeler i forhold til tidligere fremgangsmåter i faget der forandret genekspresjon blir identifisert relativt til normale prøver (der cDNA fra normale biblioteker blir anvendt som hybridiseringstemplatet som prøve-mRNA binder seg til og den relative forskjellen mellom "normale" og "sykelige" prøver blir målt). Fremgangsmåten i oppfinnelsen kan dermed identifisere gener som ikke er uttrykt konstitutivt eller som kun er uttrykt ved svært lave nivåer i normale prøver, men er aktivert i sykdommen/tilstanden av interesse, eller i hvert fall ett stadium derav.
Transkripter/cDNA som reflekterer en variasjon i graden av ekspresjon kan bli anvendt, men det er fordelaktig å anvende de artene som reflekterer tydelige forskjeller, f.eks. fravær eller tilstedeværelse av et transkript/cDNA.
Når de først er identifisert blir mRNA- eller cDNA-artene (som kan være en blanding av molekyler som har forskjellige sekvenser) isolert. For å fremstille et standard diagnostisk mønster kan to eller flere arter (prober) som reflekterer forandret genekspresjon i minst ett stadium av nevnte sykdom eller tilstand bli isolert. Mens kun to prober i noen tilfeller kan være tilstrekkelig til å produsere et standard diagnostisk mønster for en bestemt tilstand eller sykdom eller stadium derav, bør man være klar over at en økning av antallet prober vil forebygge muligheten for feildiagnose ved sammenligning med andre sykdommer som tilsvarende kan forandre ekspresjonen av de bestemte genene av interesse. Således er fortrinnsvis mellom 2 og 1000 probearter valgt for isolering, spesielt foretrukket mellom 10 og 500, spesielt foretrukket mellom 50 og 100, for eksempel 70 probearter. Disse probene reflekterer gener som har forandret ekspresjon i sykdommene eller tilstandene av interesse, eller bestemte stadier derav blir betraktet som "informative" for den bestemte sykdommen i organismen som undersøkes og kun de probene som har denne informative egenskapen blir valgt.
Isolering kan være ved seleksjon av egnede fraksjoner hvis separering for eksempel ble utført på en kolonne, eller ved fysisk fjerning fra separerings-matriksen, for eksempel utkutting av gelbiter inneholdende nukleinsyreartene av interesse. Nukleinsyremolekylene som er deri blir deretter isolert og renset om nødvendig for de senere trinnene, fortrinnsvis ved amplifisering.
I tilfeller der selve transkriptene har blitt separert og isolert, kan disse deretter bli omdannet til cDNA, fortrinnsvis ved amplifisering.
mRNA- eller cDNA-probeartene, som er produsert i henhold til fremgangsmåten over blir deretter hver immobilisert på et fast underlag for å produsere sykdommens eller tilstandens probetestsett eller gentranskripsjons-mønster (eller fingeravtrykk)-testsett. Utallige faste underlag som er egnet som immobiliserende grupper for nukleinsyremolekyler er velkjente i faget og utførlig beskrevet i litteraturen og generell tale, der det faste underlaget kan være ethvert av de velkjente underlagene eller matriksene som for tiden i stor grad blir anvendt eller foreslått for immobilisering, separering osv. i kjemiske- eller biokjemiske
prosedyrer. De immobiliserende enhetene kan derfor for eksempel være i form av partikler, lag, geler, filtre, membraner, mikrofiberstrimler, rør eller plater, fibre eller kapillærer, for eksempel lagd av et polymerisk materiale, som f.eks. agarose, cellulose, alginat, teflon, lateks eller polystyren. Bestemte materialer, f.eks. kuler, er generelt foretrukket. Den immobiliserende enheten kan passende innbefatte magnetiske partikler, slik som superparamagnetiske partikler.
Festing av nukleinsyremolekylene til det faste underlaget kan bli utført direkte eller indirekte. Hvis for eksempel et filter blir anvendt kan festing bli utført med UV-indusert kryssbinding. Alternativt kan festing bli utført indirekte ved anvendelse av en festegruppe som bæres på nukleinsyremolekylene og/eller fast underlag. Derfor kan for eksempel affinitetsbindingspartnere bli anvendt, slik som avidin, streptavidin eller biotin, DNA eller DNA-bindende protein (f.eks. enten lac I-repressorproteinet eller lac-operatorsekvensen som det binder til), antistoffer (som kan være mono- eller polyklonale), antistoffragmenter eller epitopene eller haptenene til antistoffer. I disse tilfellene er en partner av bindingsparet festet til
(eller er en naturlig del av) det faste underlaget og den andre partneren er festet til (eller er en naturlig del av) nukleinsyremolekylene.
Festing av egnede funksjonelle grupper til det faste underlaget kan bli utført med fremgangsmåter som er velkjent i faget, som for eksempel inkluderer festing ved hjelp av hydroksyl-, karboksyl-, aldehyd- eller aminogrupper som kan bli tilveiebragt ved å behandle det faste underlaget for å tilveiebringe egnede overflatebelegg. Festing av egnede funksjonelle grupper til nukleinsyremolekylene i oppfinnelsen kan bli utført ved ligering eller bli introdusert i løpet av syntese eller amplifisering, for eksempel ved å anvende primere som har en egnet gruppe, slik som biotin, eller en bestemt sekvens for festing.
De individuelle probene danner moduler av testsettet og kan være tilstedeværende på ett eller flere faste underlag. Det faste underlaget til de forskjellige modulene er passende assosiert fysisk selv om signalene til hver probe må kunne bli bestemt separat. Derfor kan for eksempel plater med mange brønner bli anvendt som det faste underlaget med forskjellige prober i de forskjellige brønnene, eller regioner med et fast underlag kan innbefatte de forskjellige modulene, for eksempel kan de forskjellige mRNA- eller cDNA-probene bli bundet til et filter på atskilte steder.
Således, betraktet fra et videre aspekt, er det beskrevet anvendeles av fremgangsmåten ifølge krav 1 for fremstiling av et gentranskripsjonsmønster-probetestsett for diagnostisering, identifisering eller fremstilling av et standard diagnostisk gentranskripsjonsmønster til en sykdom eller tilstand eller stadium derav i en eukaryot- eller prokaryot organisme innbefattende følgende: a) ett eller flere faste underlag som bærer to eller flere probearter ifølge oppfinnelsen som korresponderer til transkripter som reflekterer genekspresjon av ett eller flere valgte gener som er karakteristiske i tilstanden eller sykdommen eller stadiet derav i organismen som undersøkes.
Testsettet kan eventuelt også inneholde informasjon som er relatert til signalene generert av normale- eller sykelige prøver, standardisert materiale, f.eks. mRNA eller cDNA fra normale- og/eller sykelige prøver for sammenligningsøyemed, merkegrupper for inkorporering i cDNA, adaptere for å introdusere nukleinsyresekvenser for amplifiseringsøyemed, primere for amplifisering og/eller egnede enzymer, buffere og løsninger.
Anvendelsen av slike testsett for å fremstille et standard diagnostisk gentranskripsjonsmønster utgjør et videre aspekt i oppfinnelsen.
For å produsere det standard diagnostiske gentranskripsjonsmønsteret eller fingeravtrykket til en bestemt sykdom eller tilstand eller stadium derav, blir probetestsettet produsert eller anvendt til å probeanalysere mRNA eller cDNA fra en sykelig prøve for å gi et signal for hybridisering til hver bestemte probeart som er bundet til det faste underlaget, dvs. testsettmodulene. Et standard kontrollgen-transkripsjonsmønster kan om ønsket bli fremstilt ved anvendelse av mRNA fra en normal prøve. Således blir total mRNA, isolert på samme måten som beskrevet over, eller dets cDNA (avhengig av komplementariteten til probearten på probe-testsettmodulen) til en sykelig prøve (som korresponderer til sykdommen som probene er rettet mot) (eventuelt også en normal prøve) hybridisert under passende betingelser til probearten på probetestsettmodulene. Når begge prøvene er analysert med prober, kan dette bli utført rett etter hverandre på de samme probetestsettmodulene, med samtidig hybridisering til modulene til et korresponderende probetestsett.
For å oppnå en indikasjon på antallet transkripter/cDNA-molekyler som blir bundet til probetestsettmodulene, blir signalet, som produseres når transkriptene hybridiserer, detektert (f.eks. ved deteksjon av dobbelttrådede nukleinsyremolekyler eller deteksjon av antallet molekyler som blir bundet, etter fjerning av ubundne molekyler f.eks. ved vasking). I det siste tilfellet er fortrinnsvis merkede mRNA/cDNA-molekyler anvendt som prøven, for eksempel ved å inkorporere radiomerkede baser i løpet av revers transkripsjon, fremstillingen av komplementære cDNA-tråder eller amplifisering. Mengden av signal blir deretter vurdert for hver probetestsettmodul. Vurderingen kan være kvantitativ eller kvalitativ og kan være basert på binding av en enkelt transkripsjonsart til hver probe, en kombinasjon av transkripter, eller representative utgaver av transkriptene slik som cDNA eller modifiserte nukleinsyremolekyler som beskrevet over. Man bør være klar over at kvantitative resultater vil tilveiebringe ytterligere informasjon for transkripsjonsfingeravtrykket til sykdommen som er kompilert. Disse dataene kan bli presentert som absolutte verdier eller kan bli bestemt relativt til et bestemt standard- eller probemodulresultat. Verdien til signalet fra den normale prøven kan bli subtrahert fra signalet til den sykelige prøven, der den foregående er bestemt, selv om foretrukkede resultater fra testprøver blir sammenlignet med ikke-standardiserte sykdomsfingeravtrykk som er produsert.
Videre bør man være klar over at det standard diagnostiske gentranskripsjonsmønsteret kan bli fremstilt ved å anvende resultatene fra en eller flere sykelige- og/eller normale prøver for å identifisere prober for probetestsettet, og en eller flere sykelige prøver (og normale prøver dersom anvendt) kan bli anvendt for å utføre hybridiseringstrinnet for å oppnå det standard diagnostiske gentranskripsjonsmønsteret.
Anvendelsen av slike testsett og standard diagnostiske gentranskripsjons-mønstre kan følgelig anvendes for å identifisere eller diagnostisere en bestemt sykdom eller tilstand eller stadium derav i en bestemt organisme.
Når først et standard diagnostisk fingeravtrykk eller mønster har blitt bestemt for en bestemt sykdom eller tilstand ved anvendelse av den valgte probearten, kan denne informasjonen bli anvendt til å identifisere tilstedeværelsen, fraværet eller omfanget av sykdommen eller tilstanden i en annen organisme eller individ.
Graden av korrelasjon som er nødvendig for å bekrefte tilstedeværelsen, fraværet eller omfanget av en sykdom eller tilstand tar nødvendigvis i betraktning variasjonen av verdier som oppnås fra normale- og sykelige prøver. Selv om dette kan bli fastsatt ved å tilveiebringe standardavvik for flere representative prøver som binder til probene for å utvikle standarden, bør man være klar over at enkle prøver kan være tilstrekkelig for å generere standardmønsteret for å identifisere en sykdom hvis testprøven viser nær nok korrelasjon med standarden.
Den diagnostiske fremgangsmåten kan bli anvendt til å identifisere,
kvantifisere eller diagnostisere en sykdom, tilstand, eller lidelse eller dens stadium eller progresjon, for eksempel kreft i mennesker og bovint spongiform encefalopati i kveg. Den kan også bli anvendt til å monitorere tilstanden/forfatningen til planter, for eksempel å monitorere effektene av forurensning, eller i tilfellet med prokaryote organismer, å monitorere tilstanden deres i løpet av prosesser som fermentasjon eller kloakkbearbeiding.
På grunn av effektene som visse eksogene faktorer eller sykdommer utøver på alle deler av kroppen, dvs. at effektene på genekspresjon ikke er begrenset til områdene med tydelig sykdom, kan derfor kroppsdeler fjerntliggende fra interesseområdet, f.eks. en tumor, bli analysert. Således kan prøver bli tilveiebragt for testing på en enkel måte, slik som for eksempel en kroppsvæske som blod. Siden prøver kan komme fra ulike deler av kroppen som kan ha litt forskjeller i deres transkripsjonsprodukter, bør prøver som anvendes til å fremstille standard-og testprøvene fortrinnsvis bli matchet. Tre forskjellige prøver, som kan bli avledet fra forskjellige kilder, angår diagnosefremgangsmåtene i oppfinnelsen. Dette er prøvene som anvendes til å fremstille probene, den sykelige prøven som anvendes til å fremstille det standard diagnosemønsteret og testprøven. Fortrinnsvis er alle prøvene avledet fra sammenlignbare kilder, men spesielt fordelaktig er i det minste den sykelige prøven som anvendes til å fremstille standardmønsteret og testprøven avledet fra en korresponderende kilde.
De følgende eksemplene er gitt for å illustrere der de refererte Figurene er som følger: Figur 1 viser et standard diagnostisk genekspresjonsmønster i grafisk form for en sykdom i Arabidopsis; og Figur 2 viser bindingsgraden av cDNA som er isolert fra Picea abies utfordret med forskjellige typer stress til 7 ulike prober.
Eksempel 1: Diagnose av Alzheimers sykdom
En blodprøve blir tatt av en pasient som mistenkes for å lide av lidelsen. Prøven blir umiddelbart lagt ned i flytende nitrogen for å hindre degradering av mRNA'et i prøven.
Prøven blir overført for analyse, mRNA'et blir omdannet til cDNA, amplifisert med PCR (polymerasekjedereaksjon) og merket med egnede radioaktive nukleotider.
Det merkede cDNA'et blir hybridisert til flere diagnostiske DNA-prober som er immobilisert på et filter.
De radioaktive signalene fra PSPP-filteret blir kvantifisert ved å anvende en "Instant Imager" og den relative signalverdien fra hver av de forskjellige probene blir bestemt.
De relative verdiene fra de forskjellige probene vil til sammen danne et mønster PSPP'et som er spesifikt for pasientens lidelse.
Dette spesifikke mønsteret for pasienten blir sammenlignet med de SDPP'ene som er karakteristiske for Alzheimers sykdom i forskjellige stadier. Hvis mønstrene til SDPP'et og PSPP'et er sammenfallende, er lidelsen og dens stadium diagnostisert med stor sikkerhet.
Dersom mønstrene ikke er sammenfallende kan lidelsen bli utelukket og det samme PSPP'et kan bli sammenlignet manuelt eller automatisk med et hvilket som helst tilgjengelig SDPP til en match er funnet.
Eksempel 2: Diagnose av senil demens
Den pasient-spesifikke prøven blir høstet, bevart, mRNA'et blir omdannet til cDNA, amplifisert og merket ved anvendelse av den samme fremgangsmåten som er beskrevet i Eksempel 1.
Den sammenlignbare hybridiseringen blir utført med et annet sett av SDPP'er som har blitt utviklet for å skille mellom forskjellige typer og stadier av senil demens.
Eksempel 3: Bredt helsestatusspektrum
Den pasient-spesifikke prøven blir høstet, bevart, mRNA'et blir omdannet til cDNA, amplifisert og merket ved anvendelse av den samme fremgangsmåten som er beskrevet i Eksempel 1.
Primere, for å detektere et sett med transkripter, blir anvendt til merking.
De merkede prøvene blir separert med gelelektroforese og alle DNA-fragmentene blir detektert og kvantifisert.
Det resulterende mønsteret som er spesifikt for pasient-PSPP'et blir deretter sammenlignet med SDPP'er fra en rekke forskjellige sykdommer. For hver feil-matching som oppstår kan den assosierte lidelsen bli utelukket.
Eksempel 4: Diagnose av en sykdom/tilstand i Arabidopsis
Diagnosen kan bli inndelt i to trinn:
- Utvikling av et reproduserbart ekspresjonsmønster (fingeravtrykk) som er typisk for sykdommen/tilstanden som skal diagnostiseres. - Anvende den utviklede fremgangsmåten til en prøve fra en ikke-diagnostisert pasient eller organisme og sammenligne ekspresjonsmønsteret med mønstre utviklet for sykdommen/tilstanden.
4.1 Utvikling av et reproduserbart ekspresjonsmønster som er typisk for sykdommen/tilstanden som skal bli diagnostisert.
4.1.1 Ekstraksjon av total RNA fra blader til Arabidopsis
Prøver med 15 g blader hver fra planter med en diagnostisert sykdom og fra friske planter blir samlet og umiddelbart frosset i flytende nitrogen. Hver prøve blir delt i to delmengder.
Bladene fra en av de to delmengdene fra hver av prøvene blir knust med en morter og støter i flytende nitrogen til et fint pulver. Den andre delmengden fra hver prøve blir lagret ved -70 °C.
De knuste bladene blir umiddelbart overført til et 500 ml beger med 150 ml knusingsbuffer (0,18 M Tris-HCI, pH 8,2, 0,09 M LiCI, 4,5 mM EDTA, 1 % (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS) pluss 50 ml TLE-ekvilibrert fenol (TLE = 0,2 M Tris-HCI, pH 8,2, 0,1 M LiCI, 5 mM EDTA)).
Blandingen blir homogenisert med en polytron i 2 minutter ved moderat hastighet (innstilling 5-6). 50 ml kloroform blir tilsatt og blandet inn i homogenatet ved å anvende polytronen. Blandingen blir helt over i en sentrifugeflaske og varmet 1 20 minutter ved 50°C. Dette blir deretter sentrifugert i 20 minutter ved 17 700xg, 4°C.
Etter sentrifugering blir så mye som mulig av det vandige sjiktet fjernet uten å forstyrre interfasen og denne fasen blir blandet i en ny sentrifugeflaske med 50 ml TLE-ekvilibrert fenol ved risting. 50 ml kloroform blir deretter tilsatt og flasken blir ristet kraftig og deretter sentrifugert ved 17 700xg, 15 minutter, 4 °C.
Etter sentrifugering blir den vandige fasen fjernet og ekstrahert på nytt med TLE-ekvilibrert fenol helt til ingen interfase oppnås. Den vandige fasen blir ekstrahert en gang med kloroform.
Den vandige fasen blir overført til en ren sentrifugeflaske og 8 M LiCI blir tilsatt for å gi en endelig konsentrasjon på 2 M LiCI. RNA blir presipitert natten over ved 4 °C.
Dette blir deretter sentrifugert i 20 minutter ved 15 300xg, 4 °C. Pelleten blir vasket med noen få ml av 2 M LiCI. Pelleten blir resuspendert i 5 ml vann og overført til et sentrifugerør. 8 M LiCI blir tilsatt for å gi en endelig konsentrasjon på 2 M LiCI og RNA'et blir presipitert i 3 timer ved 4 °C. RNA'et blir pelletert med sentrifugering i 20 minutter ved 12 100xg, 4 °C. Pelleten blir vasket med 2 M LiCI og resuspendert i 2 ml vann. 200 ul av 3 M Na-acetat og 5,5 ml av 100 % etanol blir tilsatt og RNA'et presipitert ved -20 °C natten over.
RNA'et blir pelletert i 15 minutter ved 17 700xg, 4 °C. Pelleten blir tørket og resuspendert i 1 ml vann.
RNA-konsentrasjonen blir beregnet og renheten vurdert i en 1:100 fortynning av stamløsningen ved å anvende absorbansen ved 260 nm, 280 nm, 230 nm og 320 nm. pH blir justert med konsentrert Na2HP04 til 1 mM før avlesing.
Ca. 1 ug av hver prøve blir separert på en agarosegel for å bestemme omfanget av detekterbar DNA-kontaminasjon og RNA-degradering. Prøvene blir lagret ved -70 °C.
4.1.2 Førstetråd cDNA-syntese
mRNA blir isolert fra 4 ug total RNA ved å anvende paramagnetiske kuler (DYNAL A.S., Oslo, Norge) i henhold til produsentens instruksjoner.
20 ul vann blir satt til hver prøve og mRNA'et blir eluert fra kulene ved 65 °C i 2 minutter. Supernatanten blir samlet i et nytt rør og elueringen gjentas. De to eluatene blir slått sammen. 1 ul oligo dT(i2-i8) (500 ng), 5 ul (fra u1 ug total RNA) mRNA og vann til 12 ul blir blandet sammen. Blandingen blir varmet til 70 °C i 10 minutter, avkjølt umiddelbart på is og sentrifugert kort for å fjerne den kondenserte løsningen fra rørveggene. 4 ul førstetråd-buffer (250 mM Tris-HCI, pH 8,3, 375 mM KCI og 15 mM MgCI2), 2 ul av 0,1 mM ditiotreitol og 1 ul dNTP-blanding (10 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP) blir tilsatt. Dette blir blandet forsiktig og inkubert i 2 minutter ved 37 °C. 1 ul (200 U) revers transkriptase, dvs. Superscript, blir tilsatt og inkubert i 1 time ved 37 °C. Rørene blir deretter plassert på is.
4.1.3 Andretråd (komplementær) cDNA-syntese
91,8 ul vann, 32 ul andretråd-buffer (100 mM Tris-HCI, pH 7,5, 500 mM KCI, 25 mM MgCI2, 0,25 mg/ml bovint serumalbumin og 500 mM (NH4)2S04, 3 ul dNTP-blanding, 6 ul av 0,1 M ditiotreitol, 2 ul E. coli DNA-ligase (10 U/uJ), 4 ul E. coli DNA-polymerase (10 U/ul) og 0,7 ul E. coli RNase H (1 U/ul) blir satt til prøvene. Dette
blir inkubert i 2 timer ved 16 °C og deretter blir 2 ul av T4 DNA-polymerase (10 U) /ug tilsatt. Dette blir inkubert i ytterligere 5 minutter ved 16 °C.
Dette blir deretter ekstrahert en gang med 1 volum av vann- mettet fenol og deretter en gang med 0,5 volum av fenol og 0,5 volum av kloroform:isoamylalkohol (39:1). 3 M av Na-acetat, pH 5,2, blir satt til for å gi en endelig konsentrasjon på 0,3 M og blandet forsiktig. 2,5 volum av 96 % etanol (-20 °C) blir tilsatt og blandingen blir sentrifugert ved 10 OOOxg, 4 °C i 30 minutter.
Supernatanten blir kastet og 100 ul av 75 % etanol (-20 °C) blir satt til pelleten. Denne blandingen blir sentrifugert ved 10 OOOxg, ved 4 °C i 5 minutter. Supernatanten blir kastet og pelleten blir holdt ved romtemperatur til den er tørr. Deretter blir pelleten resuspendert i 15 ul vann.
4.1.4 Adapterhybridisering
5 pmol/ul av hver av de to Taql-adapterne og de to Asel-adapterne blir blandet på forhånd.
Blandingen blir varmet i 2 minutter ved 70 °C og avkjølt sakte til 30 °C.
4.1.5 Ligering av adaptere til cDNA'et
De to prøvene med cDNA (fremstilt i henhold til trinn 4.1.3 over) blir kuttet med Taql og Asel. 15 ul av prøven blir blandet med 3 ul buffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,9,10 mM MgCI2, 50 mM NaCI, 1 mM ditiotreitol), 0,3 ul bovint serumalbumin (10 mg/ml), 1 ul Asel (10 U) og 1 ul Taql" (10 U). Blandingen blir inkubert ved 37 °C i minst 2 timer.
Kondensatet blir spunnet ned og inkubert ved 65 °C i minst 1,5 time. 1 ul Asel-adapter (5 pmol), 1 ul Taql-adapter (50 pmol), 4 ul ligasebuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,8,10 mM MgCI2,10 mM ditiotreitol og 25 ug/ml bovint serumalbumin), 3 ul vann og 1 ul av T4 DNA-ligase (1 U) blir tilsatt. Dette blir inkubert ved 37 °C i 3 timer. Blandingen blir deretter fortynnet til 500 ul med TE, 8,0 (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA).
4.1.6 Preamplifisering
5 ul prøver fra det tidligere trinnet blir hver blandet med 2,5 ul amplifiseringsbuffer (0,1 M Tris-HCI, pH 8,3, 0,5 M KCI, 15 mM MgCI2 og 0,1 %
(w/v) gelatin), 1 ul (5 ng) Asel-preamplifiseringsprimer, 1 ul (30 ng) Taql-preamplifiseringsprimer, 1 ul dNTP-blanding, 13,5 ul vann og 1 ul (1 U) Taql DNA-polymerase.
Asel-preamplifiseringsprimer: CTCGTAGACTGCGTACCTAAT Taql-preamplifiseringsprimer: GACGATGAGTCCTGACCGA
En temperatursyklus på 94 °C i 30 sekunder, 56 °C i 30 sekunder og 72 °C i I minutt blir kjørt i 25 sykluser.
4.1.7 Amplifisering
5 ul av prøvene fra preamplifiseringstrinnet blir hver blandet med 1 ul Asel-primer (5 ng), 1 ul Taql-primer (30 ng), 0,2 ul Taq-polymerase (1 U), 4 ul amplifiseringsbuffer, 0,4 ul dNTP-blanding og 8,4 ul vann. Primerne blir merket på endene med y^P-ATP.
Asel-amplifiseringsprimer: GACTGCGTACCTAATNN
Taql-amplifiseringsprimer: GATGAGTCCTGACCGANN
(N betegner enhver av de fire deoksynukleotidene)
En temperatursyklus blir kjørt med 0,7 °C senkning i det første trinnet i de II første syklusene med start ved 65 °C i 30 sekunder, 72 °C i 1 minutt og 94 °C i 30 sekunder. Etter de innledende 11 syklusene fortsetter syklusene i ytterligere 23 sykluser ved 65 °C i 30 sekunder, 72 °C i 1 minutt og 94 °C i 30 sekunder. Prøvene blir lagret ved 4 °C.
4.1.8 Differensiert uttrykk
En 6 % sekvenseringstype polyakrylamidgel blir støpt og sekvenseringsgelutstyret oppført. Gelen blir kjørt på forhånd til den har oppnådd 55 °C. 5 ul av hver prøve blir blandet med 5 ul sekvenseringsprøvefarge (95 % Formamid, 20 mM EDTA, 0,05 % Bromfenolblå og 0,05 % Xylencyanol FF). Prøvene blir varmet ved 75° - 80 °C i 2 minutter og umiddelbart overført til gelen. Prøvene blir plassert nær hverandre på gelen.
Gelen blir kjørt ved 55 °C helt til båndet med Xylencyanol FF har blitt eluert bort. Gelen blir tørket og en røntgenfilm blir plassert på toppen av gelen. Filmen blir eksponert natten over i mørke. Både filmen og den tørre gelen blir merket for å muliggjøre en nøyaktig passform for senere prosedyrer. Filmen blir fremkalt.
4.1.9 Selektere differensiert uttrykte cDNA-kloner som prober
Mønsteret mellom de to prøvene (normal og sykelig) blir sammenlignet og prøver blir valgt som tydelig er tilstedeværende i en av prøvene, men ikke i den andre. Filmen blir plassert nøyaktig på den tørkede gelen. Gelskiven som korresponderer med et valgt fragment (som representerer et transkript) på filmen blir skåret ut og samlet i et rør ved tilsetningen av 2 ul vann til et rør og 0,5 ul vann til hvert valgte gelfragment innenfor skjærelinjene og anvendelse av en skalpell til å skrape opp fragmentet og overføre fragmentet til røret. Mellom ett og ti fragmenter fra hver reaksjon med en spesifikk primer kan bli samlet på denne måten. Siden begge nukleotidene som er merket N på hver av amplifiseringsprimerne kan være en av fire mulige nukleotider er det 4<4> eller 256 mulige kombinasjoner som kan anvendes i amplifiseringen. Siden ett til ti fragmenter kan bli plukket fra enhver individuell amplifisering ved å kun anvende en enkel primer, kan totalt mellom 256 og 2560 fragmenter bli plukket fra en prøve ved anvendelse av alle ombyttinger av amplifiseringsprimeren.
En temperatursyklus blir kjørt som tidligere ved anvendelse av de umerkede amplifiseringsprimerne bortsett fra at konsentrasjonen av primerne er økt til 1 uM og dNTP-blandingen til 200 uM og 40 sykluser blir utført. 30 ng av de amplifiserte fragmentene (probene) blir lagt på et Hybond N filter ved å anvende et dotplott-instrument. Minst to kopier av filteret blir produsert. DNA'et blir festet til filteret ved UV-kryssbinding.
4.1.10 Hybridisering av testprøve-cDNA til filter med probe-cDNA
Den andre delmengden av blader fra plantene med den diagnostiserte sykdommen og de friske plantene blir anvendt til å isolere RNA som tidligere beskrevet. Førstetråd-cDNA blir fremstilt som tidligere beskrevet med det unntaket at 5 ul av [<32>P]adCTP (spesifikk aktivitet = 10 mCi/ml) blir tilsatt i stedet for 5 ul vann for å danne det merkede prøve-DNA'et. Filteret blir prehybridisert i en løsning av 4,8 x SSC (4,2 % (w/v) NaCI, 2,1 % (w/v) Na-citrat, pH 7,0), 1 x Denhardt (0,02 % (w/v) Ficoll 400, 0,02 % (w/v) polyvinylpyrrolidon 40, 0,02 % (w/v) bovint serumalbumin, fraksjon V), 50 % (w/v) Formatted, 0,2 M Tris-HCI, pH 7,6, 5 %
(w/v) dekstransulfat, 0,1 % Na-dodecylsulfat ved 42 °C i minst 2 timer i en hybridiseringsovn. Det merkede prøve-DNA'et blir kokt i 3 minutter og umiddelbart satt til prehybridiseringsløsningen. Denne blir inkubert ved 42 °C i hybridiserings-ovnen i minst 6 timer eller natten over.
Filteret blir deretter vasket 2 x i 2 x SSC, 0,1 % SDS, 50 °C, 10 minutter, deretter vasket 2 x i 1 x SSC, 0,1 % SDS, 50 °C, 15 minutter, deretter vasket 2 x i 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, 50 °C, 30 minutter. Filmen blir eksponert i en Instant Imager.
4.1.11 Fremstilling av standarden
Ett av signalene (som resulterer fra binding av en prøve til en av probene som er hybridisert til filteret) blir betraktet som standarden. Forholdet for alle de andre signalene på filteret blir bestemt relativt til dette standardsignalet.
Forholdene til de korresponderende signalene mellom plantene med sykdommen og de uten den samme sykdommen blir sammenlignet.
Resultater
Resultatene er vist i Figur 1 for 9 selekterte cDNA'er. P1 har blitt anvendt som standarden. "Frisk" henviser til prøven fra de friske plantene og "Lidelse" henviser til prøven fra plantene med den aktuelle sykdommen.
4.2 Anvendelse av den utviklede fremgangsmåten på en ikke-diagnostisert plante
En bladprøve på 2 g blir samlet fra planten som undersøkes og umiddelbart frosset i to delmengder på 1 g hver. RNA blir ekstrahert som tidligere beskrevet fra en av delmengdene.
Førstetråd-cDNA blir syntetisert som tidligere beskrevet og merket ved å inkludere [32P]adCTP i syntesen.
Den merkede prøven blir hybridisert til et filter som har de selekterte cDNA-probene, vasket og signalene detektert på en Instant Imager som tidligere beskrevet.
Mønsteret til relative signaler fra de forskjellige probene på filteret blir sammenlignet med mønstrene fra de friske plantene og plantene med sykdommen, og en diagnose for tilstedeværelsen eller fraværet av denne sykdommen i den nye planten blir stilt.
Eksempel 5: Diagnose av en sykdom/tilstand i mennesker
Diagnosen kan bli inndelt i to trinn:
- Utvikling av et reproduserbart ekspresjonsmønster (fingeravtrykk) som er typisk for sykdommen/tilstanden som skal diagnostiseres. - Anvende den utviklede fremgangsmåten til en prøve fra en pasient og sammenligne ekspresjonsmønsteret til mønstre utviklet for sykdommen/tilstanden.
5.1 Utvikling av et reproduserbart ekspresjonsmønster som er typisk for sykdommen/tilstanden som skal diagnostiseres.
5.1.1 Ekstraksjon av total RNA fra blod
10 ml blod blir tatt fra en pasient som har blitt diagnostisert med sykdommen av interesse og fra en pasient uten denne sykdommen, men ellers så lik som mulig med hensyn på alder, kjønn og andre faktorer som kan påvirke resultatet. Hver prøve blir delt i to delmengder som umiddelbart blir frosset i flytende nitrogen.
Ved å anvende en delmengde av hver prøve blir delmengdene, etter tining, sentrifugert ved 10 OOOxg i 5 minutter for å pelletere cellene. Pelletene blir resuspendert i 1 ml av løsning A (4 M Guanidintiocyanat, 25 mM Na-citrat, pH 7,0, 0,5 % (w/v) N-laurylsarkosin, 0,1 M av 2-merkaptetanol) og lysatet gjennomløper en pipette 7-10 ganger. 0,1 ml av 2 M Na-Acetat, pH 4, blir tilsatt og blandet godt ved inversjon. 1 ml vann-mettet fenol blir tilsatt og blandet godt. 0,2 ml av 49:1 kloroform/bromklorpropan blir tilsatt og blandet godt og inkubert i 15 minutter ved 0 °C til 4 °C. Denne blandingen blir sentrifugert i 20 minutter ved 10 OOOxg og den øvre vandige fasen blir overført til et rent rør.
RNA'et blir presipitert ved tilsetning av 1 ml (1 volum) 100 % isopropanol og prøvene blir inkubert i 30 minutter ved 20 °C, etterfulgt av sentrifugering i 10 minutter ved 10 OOOxg, 4 °C.
RNA-pelleten blir løst i 0,3 ml av løsning A. RNA'et blir deretter presipitert med 0,3 ml (1 volum) av 100 % isopropanol ved -20 °C i 30 minutter. Dette blir sentrifugert i 10 minutter ved 10 OOOxg, 4 °C, og supernatanten blir kastet. RNA-pelleten blir resuspendert i 75 % etanol, vortekset, og inkubert i 10-15 minutter ved romtemperatur. Dette blir sentrifugert i 5 minutter ved 10 OOOxg, 4 °C, og supernatanten blir kastet. Pelleten blir tørket ved romtemperatur, ca. 10-15 minutter. Pelleten blir resuspendert i 100 ul vann og inkubert i 10 til 15 minutter ved 55° til 60 °C.
RNA-konsentrasjonen blir beregnet og renheten vurdert i en 1:100 fortynning av stamløsningen ved anvendelse av absorbansen ved 260 nm, 280 nm, 230 nm og 320 nm. pH blir justert med konsentrert Na2HP04 til 1 mM før avlesing.
Ca. 1 jig fra hver prøve blir separert på en agarosegel for å bestemme graden av detekterbar DNA-kontaminasjon og RNA-degradering. Prøvene blir lagret ved -70 °C.
5.1.2 Førstetråd cDNA-syntese for seleksjon av differensiert uttrykte cDNA-kloner som prober
Disse trinnene blir utført som beskrevet i avsnittene 4.1.2 til 4.1.9 over.
5.1.3 Hybridisering av testprøve-cDNA til filter med probe-cDNA
Den andre delmengden av blod fra de normale- og sykelige pasientene blir anvendt til å isolere RNA, fremstille merket førstetråd-cDNA, utføre hybridisering til filteret som har probene festet til seg og eksponere filmen som beskrevet i avsnitt 4.1.10.
5.1.4 Fremstilling av standarden
Resultatene er standardisert i forhold til et enkelt signal som beskrevet i 4.1.11 over.
Forholdene av de korresponderende signalene mellom pasienten med sykdommen og pasienten uten den samme sykdommen blir sammenlignet.
Resultater
Lignende resultater som de som er illustrert i Figur 1 blir tilveiebragt.
5.2 Anvendelse av den utviklede fremgangsmåten på en ikke-diagnostisert pasient.
En blodprøve på 2 ml blir tatt fra pasienten og umiddelbart frosset i to delmengder på 1 ml hver. RNA blir ekstrahert som tidligere beskrevet fra en av delmengdene etter tining.
Førstetråd-cDNA blir syntetisert som tidligere beskrevet og merket ved å inkludere [32P]<xdCTP i syntesen.
Den merkede prøven blir hybridisert til et filter som har de selekterte cDNA-probene, vasket og signalene detektert på en Instant Imager som tidligere beskrevet.
Mønsteret til relative signaler fra de forskjellige probene på filteret blir sammenlignet med mønstrene fra den friske pasienten og pasienten med sykdommen, og en diagnose for tilstedeværelsen eller fraværet av denne sykdommen i den nye pasienten blir stilt.
Eksempel 6: Forskjellig relativt ekspresjonsmønster til 7 selekterte prober som er funnet i røtter til norsk gran ( Picea abies) som er utfordret med ulike former for stress
Fremgangsmåter
1. Sju forskjellige informative cDNA-prober ble festet til en nylonmembran. Flesteparten av klonene ble isolert fra et subtrahert cDNA-bibliotek av norske granrøtter infisert med sopp-patogenet Pythium dimorphum (i henhold til fremgangsmåten som er beskrevet i Eksempel 4), mens andre ble isolert med lignende fremgangsmåter fra norsk gran utfordret med andre former for stress. Det subtraherte biblioteket ble fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i Lonneborg et al. (1995), PCR Meth. Applic, 4, Utgivere David Bentley, Richard Gibbs, Eric Green, Richard Myers, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, s. S168-S177. Det var kjent at alle disse klonene ble indusert av
minst en form for stress.
2. Norsk gran ble dyrket i 2 måneder i et vekstkammer med en dag/natt syklus på 12 timer/12 timer lysintensitet på 500 umol x m'2 x sek"<1>, vannet med optimal
næring en gang hver dag. Plantene ble deretter enten utfordret med næringen som tidligere (kontroll), maltosemedia, 24 mg (ferskvekt) Pythium dimorphum, eller 24 mg (ferskvekt) Rhizoctonia sp. Plantene ble utfordret i 4 og 8 dager.
Etter utfordringen ble røttene og øvre del umiddelbart frosset.
3. De gjenværende trinnene 4 til 10 ble hovedsakelig utført som beskrevet i
Eksempel 4.
4. RNA ble ekstrahert fra røttene og de øvre delene og sjekket for kvalitet og utbytte. 5. Førstetråd- og andretråd-cDNA ble syntetisert ved å anvende en polyT-primer og en primer basert på tilstedeværelsen av en 5' cap. På denne måten ble bare full-lengde kloner syntetisert for å unngå risikoen med påvirket syntese på
grunn av multiple primerbindingsseter.
6. Alt cDNA ble amplifisert ved anvendelse av PCR-fremgangsmåten og ved å anvende det samme settet med primere.
7. cDNA'ene ble merket ved å anvende polyT-primeren.
8. Filtre, som hver hadde de 7 probene festet til seg, ble prehybridisert ved 65 °C i 6 timer og de merkede cDNA-prøvene ble satt til ett filter hver og de
immobiliserte filtrene fikk hybridisere natten over ved 65 °C.
9. Filtrene ble vasket for å fjerne enhver ikke-spesifikt hybridisert merkegruppe. 10. De radioaktive signalene til de individuelle probene på hvert filter ble telt ved å anvende en Instant Imager og de relative signalene ble beregnet.
Resultater
Mønsteret som ble dannet for filtrene med røtter fra kontroll (dag 4), maltose (dag 4 og 8), Pythium dimorphum (dag 4 og 8), Rhizotonia sp. (dag 4), og barnåler fra kontroll (dag 4) og Pythium dimorphum (dag 4) er presentert i Figur 2. To uavhengige duplikater ble utført for maltose på dag 4 og indikerte reproduserbarheten av eksperimentet.
Resultatene viser at hver av disse utfordringene danner tydelige mønstre ved anvendelse av dette settet med prober. Det kan også bli observert at stress induserer plantene systemisk og muliggjør anvendelsen av forskjellige deler av plantene for testen. Videre kan også den differensielle ekspresjonen av bestemte transkripter på forskjellige stadier av stresset bli observert.
Claims (19)
1. Fremgangsmåte for isolering av mRNA eller cDNA-prober som er spesifikke for en sykdom eller tilstand eller stadium derav i en eukaryot organisme, karakterisert ved at den omfatter i det minste følgende trinn: a) isolering av mRNA fra blodprøver som har blitt isolert fra en eller flere normale eukaryote organismer, b) isolering av mRNA fra en blodprøve fra en organisme som har sykdommen eller tilstanden av interesse, eller stadiet derav, hvor nevnte blod oppnås fra en del av nevnte organisme som er fjerntliggende fra område av nevnte sykdom, c) separering av mRNA av trinnene a) og b) som eventuelt kan bli revers transkribert til cDNA, d) selektering av to eller flere mRNA eller cDNA-arter som er til stede ved forskjellige nivåer i de normale og sykdomsbefengte prøvene, e) isolering av mRNA eller cDNA-artene identifisert i trinn d) og f) valgfri revers transkribering av mRNA i trinn d) eller e) til cDNA, med mindre dette tidligere har blitt utført i trinn c).
2. Anvendelse av fremgangsmåten ifølge krav 1 for fremstilling av et gentranskripsjonsmønster-probetestsett for fremstilling av et mønster som er karakteristisk for en sykdom eller tilstand eller stadium derav i en eukaryot organisme, karakterisert ved at nevnte mRNA eller cDNA prober isolert ifølge krav 1 er båret på ett eller flere faste underlag.
3. Anvendelse av krav 2, karakterisert ved a t mRNA eller cDNA fra trinnene e) eller f) er amplifisert før immobilisering på nevnte faste underlag.
4. Fremgangsmåte eller anvendelse som krevet i et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at mRNA fra trinnene a) og b) er revers transkribert til cDNA.
5. Fremgangsmåte eller anvendelse som krevet i et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at nevnte cDNA er amplifisert.
6. Fremgangsmåte eller anvendelse som krevet i krav 4 eller 5, karakterisert ved at nevnte cDNA fremstilt fra mRNA fra trinnene a) og b) inkorporerer en markør.
7. Fremgangsmåte eller anvendelse som krevet i et hvilket som helst av kravene 1 til 6, karakterisert ved at mellom 50 og 100 mRNA eller cDNA-prober er isolert.
8. Fremgangsmåte eller anvendelse som krevet i et hvilket som helst av kravene 1 til 6, karakterisert ved at mellom 10 og 500 mRNA eller cDNA-prober er isolert.
9. Fremgangsmåte eller anvendelse som krevet i et hvilket som helst av kravene 1 til 8, karakterisert ved at nevnte separeringsteknikk er gelelektroforese.
10. Anvendelse av fremgangsmåten ifølge krav 1 eller 4 til 9 for fremstilling av et standard diagnostisk gentranskripsjonsmønster som er karakteristisk for en sykdom eller tilstand eller stadium derav i en eukaryot organisme, karakteris ert ved at den omfatter i det minste følgende trinn : a) isolering av mRNA fra blod som har blitt isolert fra en eller flere av nevnte organismer som har sykdommen eller tilstanden eller stadiet derav, som eventuelt kan revers transkriberes til cDNA, hvor nevnte blod oppnås fra en del av organismen som er fjerntliggende fra sykdomsom rådet, b) fremstilling av et gentranskripsjonsmønster-probetestsett i henhold til et hvilket som helst av kravene 2 til 9, hvor nevnte prober på nevnte sett er spesifikke for nevnte sykdom eller tilstand eller stadium derav i blodet av organismen som er til undersøkelse, c) hybridisering av mRNA eller cDNA fra trinn a) til settet fremstilt i trinn b), og d) bedømmelse av mengde av mRNA eller cDNA som hybridiserer til hver probe på nevnte faste underlag for å fremstille et karakteristisk mønster som reflekterer genekspresjon i prøven med sykdommen, tilstanden eller stadiet derav av en eller flere selekterte gener tilsvarende probene.
11. Anvendelse av fremgangsmåten ifølge krav 1 eller 4 til 9 for fremstilling av et pasientspesifikt gentranskripsjonsmønster fra en eukaryot organisme, karakterisert ved at den omfatter i det minste følgende trinn : a) isolering av mRNA fra blod som har blitt isolert fra nevnte organisme, som eventuelt kan revers transkriberes til cDNA, hvor nevnte blod oppnås fra en del av organismen som er fjerntliggende fra sykdomsområdet, b) fremstille et gentranskripsjonsmønster-probetestsett i henhold til et hvilket som helst av kravene 2 til 9, hvor nevnte prober på nevnte sett er spesifikke for en sykdom eller tilstand eller stadium derav i blodet av organismen som er til undersøkelse, c) hybridisering av mRNA eller cDNA fra trinn a) til settet fremstilt i trinn b), og d) bedømmelse av mengde av mRNA eller cDNA som hybridiserer til hver av de nevnte prober på nevnte faste underlag for å fremstille et karakteristisk mønster som reflekterer genekspresjon av en eller flere valgte gener som tilsvarer probene.
12. Anvendelse som krevet i krav 10 eller krav 11,karakterisert ved a t nevnte mRNA av trinn b) er revers transkribert til cDNA og valgfritt inkorporerer en markør.
13. Anvendelse som krevet i krav 12, karakterisert ved at nevnte cDNA er amplifisert.
14. Anvendelse av fremgangsmåten ifølge krav 1 eller 4 til 9 for diagnostisering eller identifisering av en sykdom eller tilstand eller stadium derav i en eukaryot organisme, karakterisert ved at den omfatter i det minste følgende trinn: a) isolering av mRNA fra blod som har blitt isolert fra nevnte organisme, som eventuelt er revers transkribert til cDNA, hvor nevnte blod oppnås fra en del av nevnte organisme som er fjerntliggende fra området for nevnte sykdom, b) fremstilling av et gentranskripsjonsmønster-probetestsett i henhold til et hvilket som helst av kravene 2 til 9, hvor nevnte prober på nevnte testsett er spesifikke for nevnte sykdom eller tilstand eller stadium derav i blodet av en organisme som er til undersøkelse, c) hybridisering av mRNA eller cDNA fra trinn a) til settet fremstilt i trinn b), d) bedømming av mengde av mRNA eller cDNA som hybridiserer til hver av de nevnte prober på nevnte faste underlag for å fremstille et karakteristisk mønster som reflekterer genekspresjon av en eller flere selekterte gener tilsvarende probene, og e) sammenligning av nevnte mønster med et standard diagnostisk mønster fremstilt i henhold til anvendelsen i et hvilket som helst av kravene 10,12 og 13 ved bruk av blodprøver fra en eller flere organismer som tilsvarer organismen til undersøkelse som har sykdommen eller tilstanden eller stadiet derav under undersøkelse for på bestemme graden av korrelasjon indikativ for nærvær av nevnte sykdom eller tilstand eller stadium derav i organismen som er til undersøkelse.
15. Fremgangsmåte eller anvendelse som krevet i et hvilket som helst av kravene 1 til 14, karakterisert ved at nevnte organisme er menneske.
16. Fremgangsmåte eller anvendelse som krevet i et hvilket som helst av kravene 1 til 15, karakterisert ved at nevnte faste underlag er et filter.
17. Fremgangsmåte eller anvendelse som krevet i et hvilket som helst av kravene 1 til 16, karakterisert ved at nevnte sykdom er kreft.
18. Fremgangsmåte eller anvendelse som krevet i et hvilket som helst av kravene 1 til 17, karakterisert ved at nevnte sykdom er mage, lunge, bryst, prostatakjertel, tarm eller hudkreft.
19. Fremgangsmåte eller anvendelse som krevet i et hvilket som helst av kravene 1 til 16, karakterisert ved at nevnte sykdom er Alzheimers sykdom.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NO20040371A NO327084B1 (no) | 1997-04-30 | 2004-01-27 | Fremgangsmate for isolering av mRNA eller cDNA-prober, samt anvendelse derav for fremstilling av et standard diagnostisk gentranskripsjonsmonster og probetestsett og anvendelse av fremgangsmaten for diagnostisering eller identifisering av en sykdom. |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NO972006A NO972006D0 (no) | 1997-04-30 | 1997-04-30 | Ny metode for diagnose av sykdommer |
PCT/GB1998/001261 WO1998049342A1 (en) | 1997-04-30 | 1998-04-30 | Method of preparing a standard diagnostic gene transcript pattern |
NO20040371A NO327084B1 (no) | 1997-04-30 | 2004-01-27 | Fremgangsmate for isolering av mRNA eller cDNA-prober, samt anvendelse derav for fremstilling av et standard diagnostisk gentranskripsjonsmonster og probetestsett og anvendelse av fremgangsmaten for diagnostisering eller identifisering av en sykdom. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20040371L NO20040371L (no) | 1999-12-14 |
NO327084B1 true NO327084B1 (no) | 2009-04-20 |
Family
ID=19900683
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO972006A NO972006D0 (no) | 1997-04-30 | 1997-04-30 | Ny metode for diagnose av sykdommer |
NO20040371A NO327084B1 (no) | 1997-04-30 | 2004-01-27 | Fremgangsmate for isolering av mRNA eller cDNA-prober, samt anvendelse derav for fremstilling av et standard diagnostisk gentranskripsjonsmonster og probetestsett og anvendelse av fremgangsmaten for diagnostisering eller identifisering av en sykdom. |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO972006A NO972006D0 (no) | 1997-04-30 | 1997-04-30 | Ny metode for diagnose av sykdommer |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US6720138B2 (no) |
EP (3) | EP2050825A1 (no) |
JP (1) | JP4163758B2 (no) |
AT (2) | ATE286143T1 (no) |
AU (1) | AU7222698A (no) |
CY (1) | CY1108716T1 (no) |
DE (2) | DE69840154D1 (no) |
DK (2) | DK1323728T3 (no) |
ES (2) | ES2316693T3 (no) |
HK (2) | HK1026003A1 (no) |
NO (2) | NO972006D0 (no) |
PT (2) | PT979308E (no) |
WO (1) | WO1998049342A1 (no) |
Families Citing this family (75)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NO972006D0 (no) * | 1997-04-30 | 1997-04-30 | Forskningsparken I Aas As | Ny metode for diagnose av sykdommer |
US7473528B2 (en) | 1999-01-06 | 2009-01-06 | Genenews Inc. | Method for the detection of Chagas disease related gene transcripts in blood |
US20050003394A1 (en) * | 1999-01-06 | 2005-01-06 | Chondrogene Limited | Method for the detection of rheumatoid arthritis related gene transcripts in blood |
CA2359816C (en) | 1999-01-06 | 2010-08-03 | Genenews Inc. | Method for the detection of gene transcripts in blood and uses thereof |
US20070031841A1 (en) * | 2001-02-28 | 2007-02-08 | Choong-Chin Liew | Method for the detection of gene transcripts in blood and uses thereof |
US20050123938A1 (en) * | 1999-01-06 | 2005-06-09 | Chondrogene Limited | Method for the detection of osteoarthritis related gene transcripts in blood |
US20040248169A1 (en) * | 1999-01-06 | 2004-12-09 | Chondrogene Limited | Method for the detection of obesity related gene transcripts in blood |
US20040241726A1 (en) * | 1999-01-06 | 2004-12-02 | Chondrogene Limited | Method for the detection of allergies related gene transcripts in blood |
US20040248170A1 (en) * | 1999-01-06 | 2004-12-09 | Chondrogene Limited | Method for the detection of hyperlipidemia related gene transcripts in blood |
US20060134635A1 (en) * | 2001-02-28 | 2006-06-22 | Chondrogene Limited | Method for the detection of coronary artery disease related gene transcripts in blood |
US20040265868A1 (en) * | 1999-01-06 | 2004-12-30 | Chondrogene Limited | Method for the detection of depression related gene transcripts in blood |
US20040241728A1 (en) * | 1999-01-06 | 2004-12-02 | Chondrogene Limited | Method for the detection of lung disease related gene transcripts in blood |
US6365376B1 (en) * | 1999-02-19 | 2002-04-02 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Genes and enzymes for the production of adipic acid intermediates |
US7005256B1 (en) | 1999-03-10 | 2006-02-28 | Cold Spring Harbor Laboratory | Gene chip technology for determining memory genes |
AU782926B2 (en) * | 1999-03-10 | 2005-09-08 | Cold Spring Harbor Laboratory | Gene chip technology for determining memory genes |
JP2003504007A (ja) * | 1999-05-19 | 2003-02-04 | マイトコー | 神経変性性疾患における脳の特異的な領域での異なる遺伝子発現 |
PT1410011E (pt) | 2001-06-18 | 2011-07-25 | Rosetta Inpharmatics Llc | Diagnóstico e prognóstico de pacientes com cancro da mama |
US20050064446A1 (en) * | 2001-11-01 | 2005-03-24 | Minerva Biotechnologies Corporation | Detection of binding species with colloidal and non-colloidal structures |
GB0227238D0 (en) * | 2002-11-21 | 2002-12-31 | Diagenic As | Product and method |
US7790867B2 (en) | 2002-12-05 | 2010-09-07 | Rosetta Genomics Inc. | Vaccinia virus-related nucleic acids and microRNA |
FR2853907B1 (fr) * | 2003-04-18 | 2007-08-03 | Commissariat Energie Atomique | Procede de preparation de fragments d'adn par fragmentation selective d'acides nucleiques et ses applications |
US7888497B2 (en) * | 2003-08-13 | 2011-02-15 | Rosetta Genomics Ltd. | Bioinformatically detectable group of novel regulatory oligonucleotides and uses thereof |
WO2005076939A2 (en) * | 2004-02-09 | 2005-08-25 | University Of Kentucky Research Foundation | Assay and method for diagnosing and treating alzheimer’s disease |
US7593483B2 (en) * | 2004-05-07 | 2009-09-22 | Broadcom Corporation | Nonlinear mapping in digital-to-analog and analog-to-digital converters |
IL179285A (en) | 2004-05-14 | 2011-04-28 | Rosetta Genomics Ltd | Micrornas and uses thereof |
US7687616B1 (en) | 2004-05-14 | 2010-03-30 | Rosetta Genomics Ltd | Small molecules modulating activity of micro RNA oligonucleotides and micro RNA targets and uses thereof |
US7795419B2 (en) * | 2004-05-26 | 2010-09-14 | Rosetta Genomics Ltd. | Viral and viral associated miRNAs and uses thereof |
EP2471922A1 (en) | 2004-05-28 | 2012-07-04 | Asuragen, Inc. | Methods and compositions involving microRNA |
GB0412301D0 (en) * | 2004-06-02 | 2004-07-07 | Diagenic As | Product and method |
US7867703B2 (en) * | 2004-08-26 | 2011-01-11 | Agilent Technologies, Inc. | Element defined sequence complexity reduction |
US7713693B1 (en) | 2004-09-01 | 2010-05-11 | University Of Louisiana At Monroe | Human cancer cell specific gene transcript |
US8173611B2 (en) | 2004-11-12 | 2012-05-08 | Asuragen Inc. | Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules |
WO2008073922A2 (en) * | 2006-12-08 | 2008-06-19 | Asuragen, Inc. | Functions and targets of let-7 micro rnas |
JP5265923B2 (ja) * | 2005-02-07 | 2013-08-14 | ジーンニュース インコーポレーテッド | 軽度の変形性関節症のバイオマーカーおよびその使用 |
US20070082350A1 (en) * | 2005-02-09 | 2007-04-12 | Philip Landfield | Assay and method for diagnosing and treating alzheimer's disease |
WO2007100913A2 (en) * | 2006-02-28 | 2007-09-07 | The Regents Of The University Of California | Genes differentially expressed in bipolar disorder and/or schizophrenia |
CA2663962A1 (en) * | 2006-09-19 | 2008-03-27 | Asuragen, Inc. | Mir-15, mir-26, mir-31,mir-145, mir-147, mir-188, mir-215, mir-216, mir-331, mmu-mir-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
EP2115138A2 (en) | 2006-09-19 | 2009-11-11 | Asuragen, Inc. | Micrornas differentially expressed in pancreatic diseases and uses thereof |
US20090029868A1 (en) * | 2006-10-31 | 2009-01-29 | Applera Corporation | Expression signature in peripheral blood for detection of aortic aneurysm |
AU2007333107A1 (en) * | 2006-12-08 | 2008-06-19 | Asuragen, Inc. | miR-21 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
AU2007333106A1 (en) * | 2006-12-08 | 2008-06-19 | Asuragen, Inc. | miR-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
US20090092974A1 (en) * | 2006-12-08 | 2009-04-09 | Asuragen, Inc. | Micrornas differentially expressed in leukemia and uses thereof |
CA2671270A1 (en) * | 2006-12-29 | 2008-07-17 | Asuragen, Inc. | Mir-16 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
US20090232893A1 (en) * | 2007-05-22 | 2009-09-17 | Bader Andreas G | miR-143 REGULATED GENES AND PATHWAYS AS TARGETS FOR THERAPEUTIC INTERVENTION |
JP2010529966A (ja) * | 2007-06-08 | 2010-09-02 | アシュラジェン インコーポレイテッド | 治療的介入の標的としてmiR−34によって調節される遺伝子および経路 |
US8361714B2 (en) | 2007-09-14 | 2013-01-29 | Asuragen, Inc. | Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof |
US20090186015A1 (en) * | 2007-10-18 | 2009-07-23 | Latham Gary J | Micrornas differentially expressed in lung diseases and uses thereof |
WO2009070805A2 (en) * | 2007-12-01 | 2009-06-04 | Asuragen, Inc. | Mir-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
WO2009086156A2 (en) * | 2007-12-21 | 2009-07-09 | Asuragen, Inc. | Mir-10 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
US20090263803A1 (en) * | 2008-02-08 | 2009-10-22 | Sylvie Beaudenon | Mirnas differentially expressed in lymph nodes from cancer patients |
US20090253780A1 (en) * | 2008-03-26 | 2009-10-08 | Fumitaka Takeshita | COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO miR-16 AND THERAPY OF PROSTATE CANCER |
WO2009126726A1 (en) * | 2008-04-08 | 2009-10-15 | Asuragen, Inc | Methods and compositions for diagnosing and modulating human papillomavirus (hpv) |
WO2009137807A2 (en) | 2008-05-08 | 2009-11-12 | Asuragen, Inc. | Compositions and methods related to mirna modulation of neovascularization or angiogenesis |
US20110172501A1 (en) * | 2008-08-27 | 2011-07-14 | Irina Antonijevic | System and methods for measuring biomarker profiles |
WO2010056737A2 (en) * | 2008-11-11 | 2010-05-20 | Mirna Therapeutics, Inc. | Methods and compositions involving mirnas in cancer stem cells |
GB201000688D0 (en) | 2010-01-15 | 2010-03-03 | Diagenic Asa | Product and method |
WO2011108930A1 (en) | 2010-03-04 | 2011-09-09 | Interna Technologies Bv | A MiRNA MOLECULE DEFINED BY ITS SOURCE AND ITS DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USES IN DISEASES OR CONDITIONS ASSOCIATED WITH EMT |
NZ605420A (en) | 2010-07-06 | 2015-02-27 | Interna Technologies Bv | Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma, or in diseases or conditions associated with activated braf pathway |
US10150999B2 (en) | 2010-11-17 | 2018-12-11 | Interpace Diagnostics, Llc | miRNAs as biomarkers for distinguishing benign from malignant thyroid neoplasms |
EP2474617A1 (en) | 2011-01-11 | 2012-07-11 | InteRNA Technologies BV | Mir for treating neo-angiogenesis |
CA2826043A1 (en) | 2011-02-03 | 2012-08-09 | Mirna Therapeutics, Inc. | Synthetic mimics of mir-124 |
US20140057295A1 (en) | 2011-02-28 | 2014-02-27 | Barbara J. Stegmann | Anti-mullerian hormone changes in pregnancy and prediction of adverse pregnancy outcomes and gender |
US9746458B2 (en) * | 2011-04-27 | 2017-08-29 | Loma Linda University Medical Center | Dynactin subunit p62 biomarker for neurological conditions |
WO2013040251A2 (en) | 2011-09-13 | 2013-03-21 | Asurgen, Inc. | Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease |
US20130157884A1 (en) | 2011-10-26 | 2013-06-20 | Asuragen, Inc. | Methods and compositions involving mirna expression levels for distinguishing pancreatic cysts |
EP2771487A1 (en) | 2011-10-27 | 2014-09-03 | Asuragen, INC. | Mirnas as diagnostic biomarkers to distinguish benign from malignant thyroid tumors |
WO2013064702A2 (en) | 2011-11-03 | 2013-05-10 | Diagenic Asa | Probes for diagnosis and monitoring of neurodegenerative disease |
WO2014007623A1 (en) | 2012-07-03 | 2014-01-09 | Interna Technologies B.V. | Diagnostic portfolio and its uses |
US20140100124A1 (en) | 2012-10-04 | 2014-04-10 | Asuragen, Inc. | Diagnostic mirnas for differential diagnosis of incidental pancreatic cystic lesions |
WO2014144666A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | The University Of Chicago | Methods and compositions related to t-cell activity |
CA2907377A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Baylor Research Institute | Tissue and blood-based mirna biomarkers for the diagnosis, prognosis and metastasis-predictive potential in colorectal cancer |
EP3366785A3 (en) | 2013-03-15 | 2018-09-19 | Baylor Research Institute | Ulcerative colitis (uc)-associated colorectal neoplasia markers |
WO2019086603A1 (en) | 2017-11-03 | 2019-05-09 | Interna Technologies B.V. | Mirna molecule, equivalent, antagomir, or source thereof for treating and/or diagnosing a condition and/or a disease associated with neuronal deficiency or for neuronal (re)generation |
EP3952849A4 (en) | 2019-04-12 | 2023-03-01 | The Regents Of The University Of California | COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING MUSCLE MASS AND OXIDATIVE METABOLISM |
WO2024028794A1 (en) | 2022-08-02 | 2024-02-08 | Temple Therapeutics BV | Methods for treating endometrial and ovarian hyperproliferative disorders |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995020681A1 (en) * | 1994-01-27 | 1995-08-03 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Comparative gene transcript analysis |
Family Cites Families (46)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4981783A (en) | 1986-04-16 | 1991-01-01 | Montefiore Medical Center | Method for detecting pathological conditions |
US5871928A (en) | 1989-06-07 | 1999-02-16 | Fodor; Stephen P. A. | Methods for nucleic acid analysis |
US5925525A (en) | 1989-06-07 | 1999-07-20 | Affymetrix, Inc. | Method of identifying nucleotide differences |
US6040138A (en) | 1995-09-15 | 2000-03-21 | Affymetrix, Inc. | Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays |
US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
JP2802125B2 (ja) | 1989-06-23 | 1998-09-24 | キヤノン株式会社 | 核酸の検出方法 |
US5614192A (en) * | 1989-07-19 | 1997-03-25 | Connective Therapeutics, Inc. | T cell receptor peptides as therapeutics for immune-related disease |
US5474796A (en) * | 1991-09-04 | 1995-12-12 | Protogene Laboratories, Inc. | Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface |
DE69214243T2 (de) * | 1991-09-23 | 1997-02-06 | Pfizer | Verfahren für die Detektion von spezifische mRNS und DNS in Zellen |
GB2260811B (en) | 1991-10-23 | 1995-07-05 | Yorkshire Cancer Research Camp | Detection of malignant tumours |
WO1993018143A1 (en) | 1992-03-04 | 1993-09-16 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | Dna encoding taurine and gaba transporters and uses thereof |
PT667920E (pt) * | 1992-10-29 | 2003-06-30 | Univ Jefferson | Metodos de deteccao de micrometasteses do cancro da prostata |
US5633137A (en) | 1992-12-01 | 1997-05-27 | The University Of South Florida | Method for measuring specific gene expression: transcriptional activity per gene dose |
US5677125A (en) | 1994-01-14 | 1997-10-14 | Vanderbilt University | Method of detection and diagnosis of pre-invasive cancer |
WO1997027317A1 (en) | 1996-01-23 | 1997-07-31 | Affymetrix, Inc. | Nucleic acid analysis techniques |
US5830645A (en) * | 1994-12-09 | 1998-11-03 | The Regents Of The University Of California | Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays |
US5545531A (en) | 1995-06-07 | 1996-08-13 | Affymax Technologies N.V. | Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays |
US6156502A (en) | 1995-12-21 | 2000-12-05 | Beattie; Kenneth Loren | Arbitrary sequence oligonucleotide fingerprinting |
WO1997029212A1 (en) | 1996-02-08 | 1997-08-14 | Affymetrix, Inc. | Chip-based speciation and phenotypic characterization of microorganisms |
AU4327697A (en) | 1996-08-20 | 1998-03-06 | Motorola, Inc. | Method and apparatus for detecting predetermined molecular structures in a sample |
WO1998024935A1 (en) * | 1996-12-06 | 1998-06-11 | Urocor, Inc. | Diagnosis of disease state using mrna profiles |
US6235474B1 (en) | 1996-12-30 | 2001-05-22 | The Johns Hopkins University | Methods and kits for diagnosing and determination of the predisposition for diseases |
US6190857B1 (en) | 1997-03-24 | 2001-02-20 | Urocor, Inc. | Diagnosis of disease state using MRNA profiles in peripheral leukocytes |
NO972006D0 (no) * | 1997-04-30 | 1997-04-30 | Forskningsparken I Aas As | Ny metode for diagnose av sykdommer |
US5994076A (en) | 1997-05-21 | 1999-11-30 | Clontech Laboratories, Inc. | Methods of assaying differential expression |
WO1999006831A2 (en) | 1997-07-29 | 1999-02-11 | Dorssers Lambert C J | Breast cancer resistance genes, methods for their detection and uses thereof |
US6607879B1 (en) * | 1998-02-09 | 2003-08-19 | Incyte Corporation | Compositions for the detection of blood cell and immunological response gene expression |
ATE347102T1 (de) | 1998-02-25 | 2006-12-15 | Us Health | Zellulare anordnungen für schnelle molekulare profilidentifizierung |
US6004755A (en) | 1998-04-07 | 1999-12-21 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Quantitative microarray hybridizaton assays |
JP2002524091A (ja) | 1998-08-21 | 2002-08-06 | ナックスコー・インコーポレイテッド | 架橋可能な固定化核酸を用いるアッセイ |
US6593084B2 (en) | 1998-10-13 | 2003-07-15 | Robert E. Bird | Carcinogen assay |
EP1121471A1 (en) | 1998-10-13 | 2001-08-08 | Clontech Laboratories, Inc. | Nucleic acid arrays |
WO2000024940A1 (en) | 1998-10-28 | 2000-05-04 | Vysis, Inc. | Cellular arrays and methods of detecting and using genetic disorder markers |
WO2000026412A1 (en) | 1998-11-02 | 2000-05-11 | Kenneth Loren Beattie | Nucleic acid analysis using sequence-targeted tandem hybridization |
US20050042630A1 (en) * | 1999-01-06 | 2005-02-24 | Chondrogene Limited | Method for the detection of asthma related gene transcripts in blood |
US7473528B2 (en) * | 1999-01-06 | 2009-01-06 | Genenews Inc. | Method for the detection of Chagas disease related gene transcripts in blood |
US20040265868A1 (en) * | 1999-01-06 | 2004-12-30 | Chondrogene Limited | Method for the detection of depression related gene transcripts in blood |
CA2359816C (en) * | 1999-01-06 | 2010-08-03 | Genenews Inc. | Method for the detection of gene transcripts in blood and uses thereof |
US20040241728A1 (en) * | 1999-01-06 | 2004-12-02 | Chondrogene Limited | Method for the detection of lung disease related gene transcripts in blood |
US20040241726A1 (en) * | 1999-01-06 | 2004-12-02 | Chondrogene Limited | Method for the detection of allergies related gene transcripts in blood |
US20040241727A1 (en) * | 1999-01-06 | 2004-12-02 | Chondrogene Limited | Method for the detection of schizophrenia related gene transcripts in blood |
US20040265869A1 (en) * | 1999-01-06 | 2004-12-30 | Chondrogene Limited | Method for the detection of type II diabetes related gene transcripts in blood |
US20040248169A1 (en) * | 1999-01-06 | 2004-12-09 | Chondrogene Limited | Method for the detection of obesity related gene transcripts in blood |
US20040248170A1 (en) * | 1999-01-06 | 2004-12-09 | Chondrogene Limited | Method for the detection of hyperlipidemia related gene transcripts in blood |
US20050003394A1 (en) * | 1999-01-06 | 2005-01-06 | Chondrogene Limited | Method for the detection of rheumatoid arthritis related gene transcripts in blood |
US20020169560A1 (en) * | 2001-05-12 | 2002-11-14 | X-Mine | Analysis mechanism for genetic data |
-
1997
- 1997-04-30 NO NO972006A patent/NO972006D0/no unknown
-
1998
- 1998-04-30 EP EP08015742A patent/EP2050825A1/en not_active Withdrawn
- 1998-04-30 DE DE69840154T patent/DE69840154D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-30 EP EP98919350A patent/EP0979308B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-30 JP JP54675698A patent/JP4163758B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-30 AU AU72226/98A patent/AU7222698A/en not_active Abandoned
- 1998-04-30 ES ES03075068T patent/ES2316693T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-30 WO PCT/GB1998/001261 patent/WO1998049342A1/en active IP Right Grant
- 1998-04-30 DE DE69828392T patent/DE69828392T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-30 ES ES98919350T patent/ES2230688T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-30 AT AT98919350T patent/ATE286143T1/de active
- 1998-04-30 DK DK03075068T patent/DK1323728T3/da active
- 1998-04-30 DK DK98919350T patent/DK0979308T3/da active
- 1998-04-30 PT PT98919350T patent/PT979308E/pt unknown
- 1998-04-30 EP EP03075068A patent/EP1323728B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-30 PT PT03075068T patent/PT1323728E/pt unknown
- 1998-04-30 AT AT03075068T patent/ATE412003T1/de active
-
1999
- 1999-10-29 US US09/429,003 patent/US6720138B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-08-16 HK HK0105132A patent/HK1026003A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-12-05 US US10/727,576 patent/US20040121390A1/en not_active Abandoned
- 2003-12-31 HK HK03109502.9A patent/HK1057217A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-01-27 NO NO20040371A patent/NO327084B1/no not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-06-10 US US11/149,370 patent/US20050227286A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-01-21 CY CY20091100076T patent/CY1108716T1/el unknown
-
2013
- 2013-07-01 US US13/932,615 patent/US20130337446A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995020681A1 (en) * | 1994-01-27 | 1995-08-03 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Comparative gene transcript analysis |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
HELLER et al., Discovery and analysis of inflammatory disease-related genes usin cDNA microarrays, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Mars 1997, vol 94, s 2150-2155. * |
SCHENA et al., Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray, Science, oktober 1995, vol 270, no 5235, s 467-470. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PT1323728E (pt) | 2009-01-23 |
PT979308E (pt) | 2005-03-31 |
DK1323728T3 (da) | 2009-03-02 |
JP2001526534A (ja) | 2001-12-18 |
CY1108716T1 (el) | 2014-04-09 |
US20040121390A1 (en) | 2004-06-24 |
ES2316693T3 (es) | 2009-04-16 |
WO1998049342A1 (en) | 1998-11-05 |
EP1323728A3 (en) | 2004-02-04 |
DE69828392T2 (de) | 2005-12-01 |
DK0979308T3 (da) | 2005-04-18 |
US20130337446A1 (en) | 2013-12-19 |
ATE286143T1 (de) | 2005-01-15 |
AU7222698A (en) | 1998-11-24 |
HK1057217A1 (en) | 2004-03-19 |
US6720138B2 (en) | 2004-04-13 |
DE69828392D1 (de) | 2005-02-03 |
EP1323728A2 (en) | 2003-07-02 |
EP0979308B1 (en) | 2004-12-29 |
NO20040371L (no) | 1999-12-14 |
NO972006D0 (no) | 1997-04-30 |
HK1026003A1 (en) | 2000-12-01 |
EP0979308A1 (en) | 2000-02-16 |
ATE412003T1 (de) | 2008-11-15 |
US20050227286A1 (en) | 2005-10-13 |
ES2230688T3 (es) | 2005-05-01 |
JP4163758B2 (ja) | 2008-10-08 |
US20020022222A1 (en) | 2002-02-21 |
DE69840154D1 (de) | 2008-12-04 |
EP1323728B1 (en) | 2008-10-22 |
EP2050825A1 (en) | 2009-04-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO327084B1 (no) | Fremgangsmate for isolering av mRNA eller cDNA-prober, samt anvendelse derav for fremstilling av et standard diagnostisk gentranskripsjonsmonster og probetestsett og anvendelse av fremgangsmaten for diagnostisering eller identifisering av en sykdom. | |
EP3490616B1 (en) | Highly-multiplexed fluorescent imaging | |
JP5060945B2 (ja) | 癌診断のためのオリゴヌクレオチド | |
JP5002105B2 (ja) | 内因性のmRNAタンパク質(mRNP)複合体の単離および特徴付けの方法 | |
US20030186237A1 (en) | Methods and compositions of amplifying RNA | |
KR20150123788A (ko) | 바이오마커의 검출 및 취득을 위한 방법 및 디바이스 | |
JP2001078768A (ja) | 遺伝子発現の測定法 | |
Phillips et al. | Single-cell RT–PCR as a tool to study gene expression in central and peripheral autonomic neurones | |
JP2007523643A (ja) | イヌの骨関節炎と関連する遺伝子並びに関連する方法及び組成物 | |
NO317247B1 (no) | Fremgangsmate for fremstilling av et standard diagnostisk gentranskripsjonsmonster | |
JP7394441B2 (ja) | 脳腫瘍を検査する方法 | |
Shiue | Identification of candidate genes for drug discovery by differential display | |
JP2001505417A (ja) | 生物の成長に必須の遺伝子の同定方法 | |
JP4344165B2 (ja) | ケロイドの診断方法 | |
EP2057288A2 (en) | Method of prognosis | |
RU2004136990A (ru) | Дифференциальные картины экспрессии генов, которые предсказывают хемочувствительность и хеморезистентность к доцетакселу | |
US20120004122A1 (en) | Diagnostic Marker for Migraine and Use Thereof | |
WO2004040301A1 (ja) | 2型糖尿病の診断方法 | |
Trullas et al. | Method for the sub-classification of patients suffering from parkinson disease | |
CN114134229A (zh) | 结直肠癌和/或肠息肉诊断标志物、试剂盒、方法及应用 | |
CN110331206A (zh) | 辅助诊断肺腺癌的基因标志物及其用途 | |
WO2007011016A1 (ja) | 転写開始部位を含む1本鎖遺伝子タグ群の製造方法 | |
JP2010252683A (ja) | 物質が有する神経栄養性能力の検定方法 | |
AU2002252101A1 (en) | Methods and compositions of amplifying RNA | |
JP2003125776A (ja) | 花粉症関連遺伝子、419 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |