JPH06510423A - 非インシュリン依存性糖尿病の診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 非インシユリン依存性糖尿病の診断法 この発明は、糖尿病またはその遺伝的素質の診断法に関する。

タイプ２の糖尿病（非インシユリン依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭ）患者は過去数十 年間に急激に増加している。このため、この種の糖尿病を早期に診断するか、ま たはその遺伝的素質を、この病気の実際の発作よりもできるだけ早期に確実に発 見できる実施容易な方策は重大な関心事となっている。

この発明の課題は、患者にこの病気の遺伝的素質があるかどうかを出来るだけ迅 速かつ正確に診断できる方法を提供することである。

本発明によれば、この課題は、患者の細胞、特に骨格筋細胞中にＢ型のヒトイン シュリン−レセプター（ＨＩＲ−Ｂ）が存在するかどうかを調べることを特徴と する、非インシユリン依存性糖尿病またはその遺伝的素質の診断法によって解決 された。

本発明による診断法は、細胞中に含まれる両方のタイプのヒトインシュリンレセ プター（ＨＩＲ−ＡおよびＨＩＲ−Ｂ）の存在に関して、糖尿病患者と健康人と の間には、極めて特異的な差異が認められる、という驚くべき知見に基づくもの である。

この２種のレセプターは比較的古くから知られており、これらに関する研究は、 例えば、モスタフらの報文［ＥＭＢＯジャーナル、第９巻、第８号、第２４０９ 頁〜第２４１３頁（１９９０年）］および該保父に引用されている先行文献［特 に、エビナら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、第８４ 巻、第７０４頁〜第７０８頁（１９８７年）：ウルリッヒら、ネイチャー、第３ １３巻、第７５６頁〜第７６１頁（１９８５年）：セイノ（Ｓｅｔｎｏ、　Ｓ、 　）およびベル（Ｂｅｌｌ、Ｆ、１．　）、Ｂｉ−ｏｃｈｅｉ、　Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、第１５９巻、第３１２頁〜第３１６頁（１ ９８９年）、ヤルデン（Ｙａｒｄｅｎ、　Ｙ、　）およびウルリッヒ（Ｕｌｌｒ ｉｃｈ、　Ａ、　）、Ａｎｎｕ。

Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、第５７巻、箪４４３頁〜第４７８頁（１９８８ 年）コに記載されている。これらの研究によって次のことが判明した。即ち、２ 種のレセプター（ＡおよびＢ）が存在し、両者はジスルフィド架橋によって結合 した同じα−亜単位とβ−亜単位から構成されているが、Ｂ型のレセプターのα −亜単位がＣ−末端領域に１２個のアミノ酸から成るインサートを有するという 点で相違する。インシュリンレセプターに関しては、ひとつの遺伝子のみが同定 されたので、２種の異なる形態ＡとＢの発生に際しては、転写後機構が問題にな るものと考えられていた。さらに、Ｂ型の１２個のアミノ酸から成るインサート は分離されたエキランによってコード化され、両方のレセプターは、転写−次産 物の別のスプライソングによって発生することも確認されている。さらにまた、 ＨＩ　Ｒ−ＡとＨＩＲ−ＢのＲＮＡの存在は量的にも質的にも組織によって左右 されることも判明している。なお、両方のレセプターはインシュリンに対して異 なる結合特性を示すことも知られている。

本発明は、ＮＵ）ＤＭ−患者またはＮＩＤＤＭの遺伝的素質を有する者の組繊細 胞、特に骨格筋細胞中には、ヒトインシュリン−レセプターのＡ型とＢ型がほぼ 等量存在するという特異性がみこれるが、健康人の対応する細胞中にはＡ型のレ セプターのみが含まれるという知見に基づくものである。この種の細胞は、前述 の引用文献に記載されているようなユニの別異の細胞、即ち、健康人の場合でも 両方のタイプのレセプターが存在するような細胞とは異なる。例えば、ヒトの血 液細胞の場合、組繊細胞とは異なり、糖尿病を煩らっていない者とＮＩＤＤＭ− 患者との間には差異は認められない。即ち、両者の場合、Ａ型のレセプターのみ が存在し、Ｂ型のレセプターの存在は確認されていない。

本発明方法においては、組繊細胞中に存在する両方のタイプのレセプターの区別 を可能にする全ての方法が原理的には利用し得る。組繊細胞は既知の方法、特に バイオプシーによって患者から採取される。

この発明の好ましい態様においては、骨格筋細胞中にＢ型のレセプターが存在す るか否かの検査を、特異的なオリゴヌクレオチドを用いておこなう。該細胞のＲ ＮＡから得られるｃＤＮＡのＨＩ　Ｒ−ＡおよびＨＩＲ−Ｂに対するＰＣＲ−増 幅反応において該オリゴヌクレオチドを使用する場合、コード化するＤＮＡが増 幅される。この態様においては、骨格筋組織から既知の方法によってＲＮＡを調 製し、次いで該ＲＮＡから既知の方法によってｃＤＮＡを合成する。

この場合、ＲＮＡは特別に開発された方法によって調製することができ、最少量 の組織（２０〜４０ｍｇ）から十分な量のｍＲＮＡを得ることができる（後述す る実施例１の（ｂ）項参照）。

このようにして得られるＡ　ＲＮＡはｃＤＮＡの合成に用いる。ｃＤＮＡは好ま しいことには、ヒトインシュリン−レセプターＡ　ｃＤＮＡ−シーケンスのヌク レオチド２８５８〜２８７９の相補性ストランドシーケンスと対応するオリゴヌ クレオチドと特異的に結合する［番号付けはウルリッヒらの方法にょる：ネイチ ャー、第３１３巻、第７５６頁〜第７６１頁（１９８５年）参照コ。ｃＤＮＡの 最初のストランドの合成は、例えば、サムブルーフらの方法によっておこなわれ る［Ｃ８Ｈラボラトリ−プレス、第２版（１９８９年）参照］。

ｃＤＮＡはさらに精製することなく、多数回、例えば約４０回のポリメラーゼ連 鎖反応サイクルに付す。プライマーとしてはオリゴヌクレオチドを用いるのが好 ましく、該オリゴヌクレオチドは、レセプターＢの場合に挿入される３６個のヌ クレオチドに対する挿入部位に隣接する。オリゴヌクレオチドは、最初のオリゴ ヌクレオチドおよび２番目のオリゴヌクレオチドが挿入部位に位置するシーケン スの上流および下流と混成するように選択される。この場合、最初のオリゴヌク レオチドのシーケンスはＲＮＡ（ＵではなくてＴ）のシーケンスと等しく、２番 目のオリゴヌクレオチドは相補性ストランドのシーケンスと等しくなる。本発明 の好ましい態様においては、最初のオリゴヌクレオチドはヒトインシュリン−レ セプターＡ　ｃＤＮＡのヌクレオチド２１３６〜２２５７と対応し、２番目のオ リゴヌクレオチドはヌクレオチド２３２７〜２３４８の相補性シーケンスと対応 する。反応はモスタフらの方法［ＥＭＢＯジャーナル、第９巻、第２４０９頁〜 第２４１３頁（１９９０年）参照コに従っておこなうことができ、好適なオリゴ ヌクレオチドを用いる場合には、１１２個（ＨＩＲ−Ａ）または１４８個（ＨＩ Ｒ−Ｂ）の塩基対を有する特異的なフラグメントが得られる。

両方のレセプター変異体が存在する場合、ＰＣＲ反応において２種の増幅生成物 が得られるが、Ａ型のｍＲＮＡのみが存在する場合には、１種の増幅生成物のみ が得られる。

ＨＩＲ−Ａに関する増幅生成物の存在は、検査においては肯定的なコントロール として利用することができ、また、ＨＩＲ−Ａに対するＨＩＲ−Ｂの相対量はこ れによって評価できる。ＨＩＲ−Ａに比べてＨＩＲ−Ｂが相当量存在する場合に は、非イン／ニリン依存性糖尿病またはその遺伝的素質の存在の可能性がでてく る。

本発明によれば、組織から単離されるＲＮＡおよび該ＲＮＡから得られるｃＤＮ ＡのＰＣＲ反応を迅速におこなう簡単な方法によって、ＮＩＤＤＭまたはその素 質の存在を示す組織中でのＨＩＲ−Ｂ　ＲＮＡの形成の可否を確認することがで き、また、患者にＮＩＤＤＭおよびその特別な素質の存在を否定することになる ＨＩＲ−Ａ　ＲＮＡのみの存在の可否も確定することができる。

本発明の別の対象は、組繊細胞のＲＮＡからのｃＤＮＡの合成およびＰＣＲ反応 においてブライマーシーケンスとして好適に使用できるオリゴヌクレオチドであ る。

本発明を添付図に基づき、以下の実施例によって説明する。

図１は、健康人と非イン／ニリン依存性糖尿病患者の骨格筋組織由来のＰＣＲ生 成物であって、電気泳動法によって分離したものを示す。

図２は、図１の場合に対応する被験者の血液細胞に関する比較試験の結果を示す 。

実施例１ （ａ）組織試料 骨格筋試料し腓腹筋（Ｍｕｓｃｕｌｕｓ　ｇａｓｔｒｏｅｎａｅｍｉｕｓ）］は 、６０〜８０才の糖尿病患者（Ｎ＝１０）と非糖尿病患者（Ｎ＝６）から切開法 またはバイオプシーによって採取した。採取後の全試料は直ちに０．３ｇの小片 に切断した後、液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。これらの試料は以 下の方法による定性的検査によって評価した： （１）組織の顕微鏡検査、電子顕微鏡検査および組織化学的特性、（２）乳酸デ ヒドロゲナーゼＥＣ１，１，１，２７（ＬＤＨ）、ホスホフラクトキナーゼＥＣ ２，７，１，１１（ＰＦＫ）、ホスホクリセレートキナーゼＥＣ２，７２，３（ ＰＧＫ）およびホスホグルコムターゼＥＣ２，７，５，１（ＰＧＭ）の酵素活性 、および （３）筋肉組織の正常領域における非コラーゲンタンパク質（ＮＣＰ）の検査。

上記方法の実施法や形態的および酵素的検査法はオーバーマイヤー−ラスラーら の報文［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ！１．　、第１６４巻、第９４９７頁〜第９ ５０３頁］に記載されている。

血液試料（５ｍｌ）は、１２時間の断食期間後の朝、５人のＮＩＤＤＭ患者と５ 人の健康人から採取した。採取した血液は、凝固を防止するためにＥＤＴＡと混 合した後、直ちに液体窒素中で凍結させた。

（ｂ）ＲＮＡの調製 ポリトロンを有する凍結筋肉組織０，０２〜１ｇを緩衝液Ａ［０，５Ｍ　ＮａＣ ｌ！、１％ＳＤＳ、１０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）、１ｇＭ　ＥＤＴＡ 、２００μｇ／ｍｌプロティナーゼＫ］１＋１中に加え、均一化した後、３７℃ で１時間培養した。

オリゴ（ｄＴ）セルロース懸濁液（媒体：緩衝液Ａ）２０〜５０μｌを添加した 後、試料を３７℃で１時間振盪させた。オリゴ（ｄＴ）セルロースに結合したｍ ＲＮＡは卓上遠心分離機を用いる短時間の遠心分離処理に付すことによってペレ ット化させた後、ａ新液Ｂ［０，５Ｍ　ＮａＣ１，０，２％ＳＤＳ、１０ｍＭト ’ＪスーＨＣ１（ｐＨ７５）、１＋Ｍ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＰＭＳＦコを用いて ２回洗浄し、次イテ緩衝液Ｃ［０，５Ｍ　ＮａＣ１，１０ｃａＭトリスーＨＣＡ ’（ｐＨ７，５）、ｌ＋＊Ｍ　ＥＤＴＡ］を用いて１回洗浄した。得られたｍＲ ＮＡは水２０ｕｌを用いる洗浄処理に３回付すことによってオリゴ（ｄＴ）セル ロースから溶離させ、次いで６８℃での加温処理に５分間性した後、直ちに氷で 冷却させた。

血液からＲＮＡを単離するために、ウルリッヒらの方法［サイエンス、第１９６ 巻、第１３１３頁（１９７７年）参照コに従って、血液５ｍｌを２倍量のグアニ ジンチオンアネート溶液を用いて希釈し、均一化させた後、ＬｉＣＪを用いて沈 澱を生成させた。

（ｃ）ｃＤＮ、Ａ合成とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）完全ＲＮＡ５〜１０μ ｇをｃＤＮＡ合成に用いた。ｃＤＮＡは、ヒトインシュリンレセプターＡシーケ ンス［ウルリッヒら、ネイチャー、第３１３巻、第７５６頁〜第７６１頁（１９ ８５年）参照］のヌクレオチド２８５８〜２８７９を包含するオリゴヌクレオチ ドと特異的に結合する。第１ストランド−ｃＤＮＡ合或は、実質的にはサムブル ーフらの方法［Ｃ８Ｈラボラトリ−プレス、第２版（１９８９年）コに従って、 全容積が２０μｌの培養液［ＫＣＡ’５０ミリモル／１１トリス−ＨＣ／（ｐＨ ８，３）１０ミリモル／Ｌ　ＭｇＣｌ２４ミリモル／Ｉ、ｄＮＴＰｓｌミリモル ／ｌ。

ＢＳＡ（牛血清アルブミン）１０μｇ／ｍｌ、プライマー５０ピコモルおよびリ バーサー・トランスクリブターゼ５００ユニット含有コ中における３７℃で１時 間の培養処理によっておこなった。反応生成物はさらに精製することな（，４ｏ サイクルのＰＣＲ反応に付した。ＰＣＲ反応は、モスタフらの方法［ＥＭＢＯジ ャーナル、第９巻、第２４０９頁〜第２４１３頁（１９９０年）参照］に従って 、１２個のアミノ酸挿入部位に隣接するオリゴヌクレオチドを用いておこなった 。使用したオリゴヌクレオチドはヌクレオチド２１３６〜２２５７およびヒトイ ンシュリンレセブターシーケンスのヌクレオチド２３２７〜２３４８の相補性シ ーケンスを有しており（ウルリッヒの前記文献参照）、１１２個（ＨＩＲ−Ａ） および１４８個（ＨＩＲ−Ｂ）の塩基対を有する特異的なフラグメントを生成す る（図１および図２参照）。図１は、Ｎ［）ＤＭ患者と糖尿病を煩らっていない 者がら採取した筋肉試料から得られたＨＩＲ−、ＡシーケンスおよびＨＩＲ−Ｂ シーケンスのＰＣＲ分析の結果を示す。コントロール痕跡（Ｃ）は、クローニン グされたＨＩＲ−Ａ　−ｃＤ　Ｎ　ＡまたはＨＩＲ−Ｂ−ｃＤＮＡから得られた ＰＣＲフラグメントを含有する。ＨＩＲ−、ＡコントロールまたはＨＩＲ−Ｂコ ントロールと同じ高さまで移動しないフラグメントは、ＰＣＲ反応において非特 異性副生成物または個々のストランドからの副生成物が生成することを示す。図 ２は、ヒトの血液細胞中のＨＩＲ−ＡシーケンスおよびＨＩＲ−Ｂシーケンスの ＰＣＲ分析の結果を示す。コントロール痕跡（Ｃ）は、クローニングされたＨＩ Ｒ−Ａ−ｃＤＮＡおよびＨＩＲ−Ｂ−ｃＤＮＡから得られたＰＣＲフラグメント の混合物を含有する。両方の図における痕跡（Ｍ）はサイズマーカーを含有する 。この実施例から明らかなように、ＮＩＤＤＭ患者の場合には、骨格筋のＰＣＲ 分析によってＨＩＲ−Ｂの存在を証明することができ、これによって健康人との 間の差異を明らかにすることができる。血液細胞の場合には、このような識別は 不可能である。

Ｆｉｇ−２ 非糖尿病者　ＮＩＤＤＭ １’−−−−−−−−−−−−１ｃｌ’−−−−−−−−−−−−１Ｍ国際調査 報告　ＱｒＴｌｆ：Ｑ　Ｑ９／ｎｎＱ＋ＩＱ１ユ。１．１□−、、、、、ＰＣＴ ／ＥＰ　９２１００９４９フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、 ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＳ （７２）発明者　ウルリッヒ、アクセルドイツ連邦共和国デー−８０５３８ミユ ンヘン、工一ミールーリーデルーシュトラーセ８番

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．被験者の組織細胞、特に骨格筋細胞について、Ｂ型のヒトインシュリンレセ プター（ＨＩＲ−Ｂ）の存在を検査することを特徴とする、非インシュリン依存 性糖尿病またはその遺伝的素質の診断法。
2. ２．組織のＲＮＡから得られるｃＤＮＡのＨＩＲ−ＡおよびＨＩＲ−Ｂに対する ＰＣＲ増幅反応においてプライマーとして使用したときに、ＲＮＡの識別を可能 にする特異的オリゴヌクレオチドを用いて検査をおこなう請求項１記載の方法。
3. ３．組織のＲＮＡからｃＤＮＡを生成させるために、ヒトインシュリンレセプタ ーＡｃＤＮＡシーケンスのヌクレオチド２８５８〜２８７９に対して相補的なオ リゴヌクレオチドプライマーを使用する請求項２記載の方法。
4. ４．ヒトインシュリンレセプターＡをコード化するｃＤＮＡシーケンスのヌクレ オチド２３２７〜２３４８のシーケンスに対して相補的をオリゴヌクレオチドを 最初に使用し、次いで、Ａ型のヒトインシュリンレセプターをコード化するｃＤ ＮＡシーケンスのヌクレオチド２１３６〜２２５７のシーケンスに対応するオリ ゴヌクレオチドを使用する請求項２または３記載の方法。
5. ５．請求項１から４いずれかに記載の方法においてブセイマーとして使用し得る オリゴヌクレオチドであって、ヒトインシュリンレセプターＡｃＤＮＡシーケン スのヌクレオチド２３２７〜２３４８に対して相補的なシーケンスを包含するこ とを特徴とするオリゴヌクレオチド。
6. ６．請求項１から４いずれかに記載の方法においてプライマーとして使用し得る オリゴヌクレオチドであって、ヒトインシュリンレセプターＡｃＤＮＡシーケン スのヌクレオチド２１３６〜２２５７のシーケンスに対応するシーケンスを包含 することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
7. ７．組織細胞、特に骨格筋細胞のＲＮＡからｃＤＮＡを生成させるために使用し 得るオリゴヌクレオチドであって、ヒトインシュリンレセプターＡｃＤＮＡシー ケンスのヌクレオチド２８５８〜２８７９のシーケンスに対して相補的なシーケ ンスを包含することを特徴とするオリゴヌクレオチド。