NO309391B1 - Tre-penetrerende beknedbrytende soppstamme, fremstilling derav, massetre og soppblanding - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører tre-penetrerende beknedbrytende soppstammer med særlig ønskelige egenskaper, deres fremstilling og deres anvendelse for å redusere bekinnholdet i massetretyper, samt massetre og soppblanding.

I EP 387187 beskrives brukes av visse tre-penetrerende sopper for å redusere bekinnholdet i massetretyper. Slike sopper hører til klassene Ascomycetes og Deuteromycetes og kan selekteres fra en bred varietet av slekter klassifisert i underklassen Ophiostomatales såvel som de ufullstendige tilstander assosiert med denne underklasse. Eksempler på slike Ophiostomatales-slekter inkluderer uten begrensning Ceratocystis, Ceratocystiopsis, Graphium, Leptographium, Ophiostoma, Phislocephala og Sporothrix som definert med henvisning til de generiske data angitt' i Harrington T.C., "New combinations in Ophiostoma or Ceratocystis Species with Leptographium anamorphs", Mycotaxon, 1987, 28: 39-43 og i "Leptographium Species, Their Distributions, Hosts and Insect Vectors", Harrington T.C. & Cobb F.W., 1988, sidene 1-39, APS Press, St. Paul, Minnesota, såvel som Rhinocladiella

og Hyalodendron som definert med henvisning til Hawksworth et al., Ainsworth og Bisby's Dictionary of Fungi, 1983, 7. utgave, Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England. Andre eksempler på slekter (ikke klassifisert som Ophiostomatales) hvori penetrerende sopper finnes på en begrenset species basis inkluderer Alternaria, Cadophora, Chloridium, Diplidia, Dactylella, Fusarium, Hormodendron, Hormonema, Phialophora, Sphaeropsis, Trichosporium, Codinaea og Valsa som definert med henvisning til Hawksworth et al.

(supra). Foretrukne sopper finnes i slektene Chloridium, Dactylella, Phialophora og Valsa såvel som i slektene klassifisert som Ophiostomatales eller de ufullstendige tilstander assosiert med Ophiostomatales, idet de sistnevnte slekter spesielt foretrekkes. Mer foretrukket finnes soppene i slektene Ceratocystis, Ceratocystiopsis, Graphium, Leptographium og Ophtiostoma, idet den sistnevnte foretrekkes mest.

De indikerte soppklasser omfatter mange såkalte flekksopper, og særlig de dypfargende penetrerende flekksopper som har den ulempe at de farger eller flekker trevirket, typisk en mørkegrå eller svartblå eller svart farging. Slik mørk-farging kan resultere i behovet for å øke blekegraden av masse oppnådd fra det behandlede massetre, og dette er uønsket.

Native sopper som er "falmet" eller mindre fargede stammer er blitt isolert i et forsøk på å undertrykke den ovennevnte uønskede virkning. Det ble imidlertid funnet at slike "falmede" isolater generelt mangler relativ vekstevne eller virulens på ikke-sterilisert tre som er nødvendig for den påtenkte anvendelse. Følgelig ville de lysere sopper kreve høyere doser og/eller lengre behandlingstider for å oppnå

de samme resultater med å redusere bekinnholdet i massetretyper enn det som kunne forventes med de mørkerevoksende arter. Det er i litteraturen indikert at melaninproduksjon kan være assosiert med den mørkfargende evne i soppene og deres virulens eller evne til konkurrerende vekst i de ikke-sterile omgivelser som foreligger i høstede treformer anvendt som råmaterialer innen masseindustrien.

Det er nå funnet at nye sopper med særlig ønskede egenskaper kan isoleres ved hjelp av en forbedret fremgangsmåte for ascusspore-isolasjon og seleksjon med henblikk på deres egenskaper til å redusere bekinnholdet i massetretyper under konkurrerende vekstbetingelser.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en tre-penetrerende beknedbrytende soppstamme, som er kjennetegnet ved at den omfatter en isolert ascusspore eller en tre-penetrerende beknedbrytende soppstamme som kan oppnås fra en ascusspore av klassen Ascomycotina eller Deuteromycotina og som har en eller begge egenskapene med enten

1) ikke sterkere påvirkning av lysheten av et sterilisert tresubstrat etter 21 døgns vekst enn soppstammen C-1D5 (0. piliferum) med aksesjonsnr. NRRL 18677 mens den gror mer virulent enn foreldresoppen på det samme, men ikke-sterile tresubstrat som bestemt over en vekstperiode på 10 døgn,

eller

2) frembringelse av et høyere lyshetsnivå på et sterilisert tresubstrat enn soppstammen C-l (0. piliferum) med aksesjonsnr. NRRL 18691 etter 21 døgns vekst mens den vokser hovedsakelig ikke mindre virulent enn foreldresoppen på det samme, men ikke-sterile tresubstrat som bestemt over en vekstperiode på 10 døgn.

En slik ny soppstamme kan være:

a) en isolert ascusspore av en kultur av en eller flere sopper av klassene Ascomycotina eller Deuteromycotina, b) en biologisk ren kultur av soppen som kan oppnås fra den nevnte ascusspore, c) et inokulat omfattende sporer og/eller mycelia separert fra en kultur i samsvar med b) ovenfor, d) en biologisk ren kultur av en derivatsopp av soppen som kan oppnås fra den nevnte ascusspore, idet derivatet har minst den beknedbrytende, tre-lysgjørende virkning og ikke-sterile tre-konkurrerende vekstevne for soppen som kan oppnås fra den nevnte ascusspore, og e) et inokulat omfattende sporer og/eller mycelia separert fra en kultur i samsvar med d) ovenfor.

"Derivat" i denne sammenheng betyr en hvilken som helst sopp som kan oppnås fra ascussporen eller dens avkom ved parring, mutasjon og andre kjente metoder som frembringer stamme-variasjon, inklusive parring med andre homokaryote eller heterokaryote sopper og selvparret eller selvbefruktende typer.

De foretrukne sopper i samsvar med oppfinnelsen hører til arten Ophiostoma piliferum, hvorav forskjellige stammer er blitt deponert hos Northern Regional Research Center (NRRL) i Peoria, Illinois, USA og som ble tildelt de følgende aksesj onsnumre:

Den ekte blåflekksopp TAB 2 8 er en mer foretrukket standard for vekstvirulens og kan anvendes for parring, f.eks. med det lyse (lysegrå) isolat C-1D5 som allerede har meget god vekstvirulens. Det mørkeblå eller hovedsakelig sorte isolat TAB 51 er en av stammene som anvendes for parring med "falmete" isolater lik det lyse (hovedsakelig hvite) isolat C-1D84.

Særlig foretrukne ascussporesopper tilveiebrakt ved oppfinnelsen er dem som viser minst omtrent den samme vekstvirulens som TAB 28 på et ikke-sterilt substrat, men som gror hovedsakelig hvitt på det steriliserte substrat, f.eks. et substrat av Southern yellow-furu. Slike sopper inkluderer den ovennevnte WZ58 som kan oppnås fra utgangsstammen TAB 51 og den hvite ascussporestamme C-1D84. C-1D84-stammen ble i sin tur oppnådd fra utgangsstammen C-l, et

falmet (mørkegrått) isolat av 0. piliferum samlet fra et massetre i delstaten Virginia, USA.

Oppfinnelsen inkluderer videre hvilken som helst biologisk ren kultur eller inokulat av en homokaryot sopp av klassen av Ascomycotina eller Deuteromycotina med minst vekstvirulen-sen på et ikke-sterilt tresubstrat og som mindre påvirker lysheten av det samme, men steriliserte substrat enn soppen med NRRL aksesjonsnr. 18691. Mer foretrukket er slike sopper med bedre egenskaper i dette henseende enn soppen med NRRL aksesjonsnr. 18677 eller 18678 og mest foretrukket er slike sopp som har bedre egenskaper enn soppen med NRRL aksesjonsnr. 18755.

En passende produktform av soppene i samsvar med oppfinnelsen oppnås ved tørking i fluidisert sjikt av en blanding av et sporeholdig fermenteringskonsentrat, resuspendert i vann, og en inert fast bærer som ikke skadelig påvirker stabiliteten av sporene, f.eks. en leire som kaolin.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av en soppstamme i samsvar med oppfinnelsen som er kjennetegnet ved isolasjon av ascussporer av en kultur av en eller flere tre-penetrerende, beknedbrytende foreldresopper av klassen av Ascomycotina eller Deuteromycotina og seleksjon av en eller flere homokaryote sopper oppnådd fra disse ascussporer med minst en av egenskapene for soppstammen i samsvar med oppfinnelsen.

En utførelsesform av ovennevnte fremgangsmåte omfatter seleksjon av det ytterligere kriterium med vekst på et sterilisert tresubstrat for å redusere bekinnholdet av substratet med minst 20% etter ikke mer enn 21 døgns vekst.

Oppfinnelsen vedrører videre en anvendelse av et inokulat oppnådd fra isolerte sopper i samsvar med oppfinnelsen for

å redusere bekinnholdet av massetretyper, idet inokulatet tilføres til et massetresubstrat eller første trinns mekanisk masse og opprettholdelse av det inokulerte massetre eller masse under betingelser som tillater vekst av soppen.

Foretrukket anvendes det ved en slik metode en sopp som er kjennetegnet ved å redusere bekinnholdet av det steriliserte substrat med minst 25 % etter høyst 21 dagers vekst uten å nedsette lysheten av substratet med mer enn 10 % sammenlignet med en ubehandlet kontroll.

Oppfinnelsen vedrører videre et massetre, som er kjennetegnet ved at det er behandlet med en tre-penetrerende, beknedbrytende sopp av klassen Ascomycotina eller Deuteromycotina i samsvar med oppfinnelsen.

Oppfinnelsen vedrører også en soppblanding, som er kjennetegnet ved at den omfatter et sporeholdig fermenteringskonsentrat av en sopp i samsvar med oppfinnelsen og en inert fast bærer som ikke skadelig påvirker stabiliteten av sporene.

De homokaryote sopper i samsvar med oppfinnelsen eller en heterokaryot stamme avledet derfra er meget effektive for bekreduksjon, særlig på ikke-sterile substrater, etter ikke mer enn 14 dagers vekst ved inokulasjonsnivåer som ikke overstiger 10<10> CFU (kolonidannede enheter) pr kg substrater som f.eks. raffinerte massetretyper og kan endog være effektive etter ikke mer enn 10 dagers vekst ved slikt inokulasj onsnivå.

I oppfinnelsens sammenheng kan ascussporene isoleres fra

en kultur av en hvilken som helst soppart med minst ett

mørkt eller blåflekk-medlem eller representant, inkluderende falmete, gråfargede medlemmer eller varianter av slike arter, uansett om slike ascussporer skriver seg fra selvbefruktende artsmedlemmer eller ved parring av artsmedlemmer. Hvis f.eks. to sopper parres, betyr dette at den ene eller andre av dem parrer seg. Hvis multiple parrende typer som involverer mer enn to parrende typer kan kombinere, betyr det hvilke som helst av de parrete sopper. De fleste sopper involverer bare to parrende typer. Følgelig, hvis to eller flere foreldre er involvert i fremstilling av ascussporen kan en hvilken som helst av foreldrene vises til for å bestemme om screeningskriteriene tilfredsstilles, betinget av at den samme forelder alltid vises til for alle kriterier ved hver

bedømmelse av angjeldende ascusspore. Alle foreldre vil vanlig være individuelt vist til i en serie av bedømmelser av hver av foreldrene separat for hver ascusspore.

Angjeldende sopper, inkluderende de blå (mørke) flekksopp-arter (inkluderende deres falmete medlemmer) er generelt antatt å være heterokaryote, dvs. at de inneholder flere kjerner som hver inneholder det fulle komplement av gener nødvendig for å fullstendiggjøre livssyklusen for soppen. Ved å tillate slike sopper å sporulere under visse betingelser, som f.eks. en fast kultur, f.eks. på en agarplate, etterfulgt av å isolere sporer inneholdende enkle kjerner (ascussporer) og dyrke ascussporene som separate kolonier (slik at det utvikles homokaryote stammer) oppnås kandidater for screening. De isolerte stammer blir så underkastet screening for ønskede egenskaper. Når en foreldersopp ikke er selvbefruktende, kan den parres med en passende eller forlikelig parringspartner av den samme art for å tilveiebringe ascussporer, som vel kjent på området. Alle mulige variasjoner i prosedyrer for oppnåelse av ascussporer kan anvendes. Slike grunnleggende prosedyrer for slik ascus-sporeseleksjon vil være vel kjent selv om det tilveiebringes en forbedret ascussporeisolasjons-prosedyre heri i forbindelse med slike sopper. Sopper som inngår i prosedyren som foreldre kan underkastes forhåndsscreening for ønskede egenskaper.

Homokaryote isolater, som i tilfellet med sopper som vokser som homokaryotiske sådanne, såvel som heterokaryoter, kan parres ved hjelp av kjent teknikk for å frembringe ascus-sporekulturer. Hvilke som helst resulterende homokaryote sopper kan parres med et ytterligere medlem av arten, inkluderende dens foreldersopp, for å tilveiebringe ascussporer for seleksjon, betinget av at passende parrende typer er indikert. Parringen av slike ascussporeisolater kan være med et ytterligere ascussporeisolat eller med en villtype. Det er følgelig innenfor oppfinnelsens ramme å anvende den eller de initialt oppnådde ascussporer for å oppnå andre ascussporer med ønskede forbedrete egenskaper og å fortsette slik utvikling av nye ascussporer ved parring etter ønske.

Prosedyren kan utøves med sopper av alle farger, fra hvite til sorte, uansett om individuelle stammer eller varianter er selvbefruktende eller ikke, som kan bestemmes ved hjelp av kjente metoder. Det foretrekkes generelt initialt å anvende parringsprosedyren når en ekte mørk eller blåflekk (ufalmet) stamme skal undersøkes, idet det er ønskelig at en partner er den ekte blåflekksopp og den annen et lysere medlem. Før parringen kan den grunnleggende prosedyre anvendes om ønsket med selvbefruktende stammer for å oppnå ascussporeselekterte isolater for parringen. Deretter kan resulterende isolater også underkastes parringer forutsatt at det has passende parrende typer.

Når et lyst eller hvitt voksende ascussporeisolat skal parres videre, foretrekkes det å parre det med en stamme som er mørkere og mer virulent enn den lysere ascussporestamme.

Følgelig inkluderer oppfinnelsen ikke bare individuelle ascussporeisolater og deres resulterende sopper, men også alle de ytterligere derivater som kan oppnås derfra, særlig dem som innebærer i det minste nivået med ønskede egenskaper fra foreldreascussporen. En endelig selektert ascussporesopp kan parres til å tilveiebringe en heterokaryot sopp for bruk ved beknedbryting, men dette foretrekkes ikke ettersom mange heterokaryoter er funnet å ha tendens til å være ustabile med hensyn til en eller flere ønskede egenskaper under gjentatt vekst eller vekst i stor skala. Ascussporen kan også muteres for å tilveiebringe andre ønskelige derivater, inkluderende kunstig induserte mutasjoner, og dem som i det minste hovedsakelig omfatter de ønskede forbedrede egenskaper av foreldreascussporen er også inkludert i oppfinnelsen. Oppfinnelsen inkluderer derfor a) ascussporer, b) mutanter av ascussporer og c) avkom av a) og b).

Prosedyrer for utvikling, generell separering, dispergering og individuell isolasjon av ascussporer og veksten og isolasjon av sopper som de utvikler er vel kjent. En representativ litteraturreferanse er f.eks. Upadhyay, H.P.

(1981), "A Monograph of Ceratocystis and Ceratocystiopsis"; University of Georgia Press, Athen, sidene 28-29. En publikasjon med spesifikk referanse til ascussporer av Ophistoma er Brasier, CM. og J.N. Gibbs (1976) , "Inheritance of Pathogenicity and Cultural Characters in Ceratocystis ulmi: Hybridization of Aggressive and Non-Aggressive Strains", Ann. Appl. Biol. 83, 31-37. Generelt blir foreldresoppen (soppene) dyrket til det trinn hvor ascussporeutviklingen er tilstrekkelig fullstendig og ascussporene tilstrekkelig frigitt fra den fungale masse eller utsondret til at ascussporene som en masse eller kolleksjon kan generelt separeres eller isoleres, f.eks. ved å ta opp alle eller en eller flere porsjoner av det viskøse, hydrofobe ascussporeholdige material ved toppen av peritheium med en steril disseksjonsnål og overføring til et spesialisert sporesuspensjonsmedium som f.eks. pinen som vil oppløse det hydrofobe material og frigi sporene inn i suspensjonsmediet. Mediet (eller porsjoner derav) inneholdende ascussporene blir så fortynnet og den fortynnede dispersjon utbredt på plater inneholdende et passende vekstmedium for utvikling av en fungal fastfasevekst på en måte som tillater at ascussporene kan utvikles eller vokse til separate eller individuelle soppkolonier som kan tas opp eller isoleres for ytterligere vekst i individuelle kulturer, f.eks. flytende kultur, til å tilveiebringe inokulat for bedømmelse av den sopp som produseres eller utvikles fra de individuelle ascussporer.

I den foreliggende oppfinnelses sammenheng ble det funnet

at meget høye og passende tall for levedyktige ascussporer av angjeldende beknedbrytende sopper kan oppnås ved å ta opp eller dispergere ascussporene i deres hydrofobe bærer som isolert fra den fungale kultur i en ikke-giftig olje som effektivt oppløser det hydrofobe material til å frigi sporene i oljen og som kan forbrukes (som et næringsstoff eller karbonkilde) av soppen, foretrukket en vegetabilsk olje som maisolje, og deretter behandle den ascussporeholdige olje

med et ikke-giftig (overfor soppen eller dens sporer) olje-dispergerende middel som kan være en hvilken som helst av de mange kjente typer for dispergering av slike oljer,

f.eks. detergenter slik som det velkjente Triton X100. Utbredingen eller utplatingen av den dispergeringsmiddel-holdige olje resulterer i et stort antall separate, levedyktige ascussporeholdige smådråper av den nevnte olje og ytterligere blir oljen forbrukt og fjernet fra platene ettersom soppen vokser og etterlater separate fungale kolonier som lett kan isoleres og dyrkes videre for bedømmelse.

Seleksjonen av homokaryotiske sopper i samsvar med kriteriene i oppfinnelsens sammenheng gjøres som følger: Substratene oppnås fra nyhugget tømmer eller stokker lagret ved romtemperatur i 7 døgn umiddelbart etter hugsten og omdannes til treflis som med en gang underkastes evaluering (eller lagring i en kort periode ved 5°C). Treflis som etter disse 7 døgn viser noe annet enn isolert eller meget liten synlig vekst av native sopper som blåflekksopp, papulaspora og trichoderma kastes. Slike substrater selekteres til å være fri for kvister. Individuelle prøveporsjoner med lik vektmessig størrelse og som veier 200-400 g hver tas fra samlingen. Prøver som steriliseres oppvarmes i en autoklav ved 120 °C i 45 min. Inokulasjon av substratet foretas på en måte egnet for å kontakte så mange individuelle trestykker som rimelig mulig, selv om initialt bare 10-30 % av flisene faktisk bringes til kontakt. Treflissubstratene anbringes i klare plastposer med god størrelse og flisene i posen får hvile utbredt på en plan overflate. Inokulatet påføres med en øye-dråpepipette ved å anbringe ikke mer enn 1 dråpe på individuelle flis. Posen forsegles så og flisene blandes/- ristes grundig i 10 sek. for å fordele inokulatet til andre flis. Posen blir så om nødvendig innstrammet og ytterligere lukket omkring flisene for å ha god kontakt blant flisene i en hauglignende ansamling. Alle inokulerte substrater lagres i mørke og blir så bedømt idet lagringen foretas ved romtemperatur unntagen i de tilfeller som indikert i det foregående. For oppnåelse av de beste sopper på en lokal eller regional basis er det foretrukket å isolere eller avlede foreldresoppene fra hugget eller dødt tømmer eller andre massetreformer av samme slag tre under hensyntagen til den ascussporeavledede sopp som vil anvendes ved praktisk bruk, eller på annen måte gjennomføre bedømmelsen på substrater av den bruksmålrettede tresslagtype hvorpå foreldresoppen ble oppnådd eller avledet. Hvis treslag-kilden for foreldresoppen er ukjent vil det blir foretatt en forutgående bedømmelse på sterile og ikke-sterile treflis fra flere forskjellige treslag og varieteter som foreldre-sopparten fra litteraturen er kjent å infisere, og bedømmelsen vil bli gjennomført på treslaget eller varietet under hensyntagen til hvilke av foreldresoppene som viser den kraftigste vekst. Ascussporeavledede sopper som tilfredsstiller kriteriene som angitt i det foregående med hensyn til hvilke som helst referanseforeldre eller hvilke som helst av de mange for tiden kjente kilder for massetretyper, eller på et tilsiktet substrattreslag, vil være nye og nyttige i oppfinnelsens sammenheng. Kriteriene tilfredsstilles best av ascussporesoppen når substratet er det samme treslag og varietet som den hvorfra foreldresoppen kan ha blitt isolert på regional basis. For Ophiostoma og andre typiske blåflekksopper som infiserer bartrevirke kan en bedømmelse på US Southern yellow-furu anvendes.

Bedømmelsen med hensyn til kriteriet med bekreduksjon bestemmes i samsvar med standard TAPPI Procedure T204 OS-76 med metylenklorid og gjennomføres på sterilt substrat for å eliminere innvirkningen av andre organismer som naturlig infiserer ikke-sterile substrater. Generelt vil det være ønskelig med en bekreduksjon på minst 20 % i løpet av 21 døgn for de mer egnede kandidater. Reduksjoner på minst 2 5 %, særlig minst 3 0 %, vil generelt indikere de foretrukne kandidater. Hvis kriteriene tilfredsstilles ved 21 døgn

vil gjentagelse av bedømmelsene og oppnåelse av nivået på minst 20 %, 25 % eller 30 % bekreduksjon i løpet av 14 døgn vanligvis indikere de mer foretrukne kandidater.

En foretrukket gruppe av ascussporer for seleksjon eller initial seleksjon, særlig når en foreldersopp har middels til mørk grå farge, og kriteriene tilfredsstilles, vil være slike som frembringer en ascussporesopp som vil redusere bekinnholdet i substratet med minst 25 % i løpet av ikke mer enn 21 døgn uten å nedsettes lyshetsnivået av det steriliserte substrat med mer enn 10 % sammenlignet med en ubehandlet, sterilisert kontroll.

Substratlysheten bestemmes på et standardisert material

som sagflis med bestemt størrelse og måles med en lyshets-måler som f.eks. et Photovolt Reflection måleinstrument. Bedømmelsen vedrørende lysheten gjennomføres ønskelig for screeningformål på sterile substrater for på nytt å eliminere innvirkningen av organismer som naturlig infiserer ikke-sterile substrater og oppnå en mer absolutt bedømmelse av fargeinnvirkningen av kandidaten. Disse bedømmelser vil også bli gjennomført etter vekst i 21 døgn. Når en forbedring i lysheten er kriteriet, blir en forbedring på minst omtrent 5 % etterstrebet for å redusere feil og tilveiebringe statistisk sikkerhet. Graden av forbedring som oppnås kan ellers variere betraktelig. Hvis en sopp med middels til mørk farge er involvert som en foreldersopp, kan forbedringer på omtrent minst 10 %, 15 %, 20 %, 25 % eller endog mer realiseres. Hvis lysere foreldresopp er involvert kan lavere størrelsesordener for forbedring realiseres, som i tilfellet når man søker å forbedre et tidligere ascussporeisolat selektert for lyshet. Selvfølgelig kan ingen lyshetsforbedring oppnås i det hele tatt og kriteriene tilfredsstilles når seleksjon skal gjøres på basis av vekstvirulens.

Vekstvirulensbestemmelser i samsvar med kriterier 1) og 2) vil bli gjennomført på et ikke-sterilt substrat og foretatt 10 døgn etter inokulasjon for å avspeile de ønskede sopp som tilveiebringes ved oppfinnelsen. Slike bestemmelser foretas som beskrevet i det neste avsnitt, på basis av den prosentandel av substrater eller treflis som viser vekst av kandidaten sammenlignet med vekst av referanseforeldre. Slike bestemmelser kan foretas på en prosentvis basis og når en forbedring i virulens er det kriterium som skal tilfredsstilles, tilstrebes en forbedring på minst omtrent 10 %-enheter (dvs. 80 % til 90%) vanligvis for å redusere feil og tilveiebringe statistisk sikkerhet. Hvis bestemmelsen skal foretas på basis av virulens og både referanseforeldresoppen og kandidatsoppen viser 80 % eller bedre vekst blir bedømmelses/kriteriumdosen på 10<10> CFU redusert inntil referanseforeldresoppveksten er mindre enn 70 %, f.eks.

35-65 %.

Vekst eller virulens av en sopp måles for sammenligning blant sopper og alle mulige betingelser, med mindre annet er angitt, vil på nytt bli gjort så identiske som mulig for sammenligningen. Vekst eller virulens bestemmes ved hjelp av en forholdsvis enkel visuell observasjonsprotokoll gjennom-ført på en konsekvent basis og gjennomført umiddelbart ved slutten av den 10 døgns testperioden. Protokollen er basert på fargekategorier av vekst som kan iakttas eller fastslås på hver individuell treflis eller substrat med det blotte øye ved normal leseavstand. En fargekategori, typisk den lyseste, vil representere vekstfargen av ascussporekandidaten eller den lyseste vekstkandidat hvis flere skal sammenlignes med hverandre. Kategorier av hvitt (w.), grått (g.) og sort (b.) anvendes såvel som de fem kategorier av hvitt (w.) lysegrått (l.g.), middels grått (g.), mørkegrått (d.g.) og sort (b.) avhengig stort sett av fargen av ascussporekandidaten som skal sammenlignes med sin referanse-foreldersopp eller antallet av slike kandidater. Den femdelte fargeoppdelingskategori foretrekkes ettersom alle kandidater vanlig kan henføres til en av de fem fargekategorier. Antallet av flis som iakttas til å ha fargeveksten av ascussporekandidaten legges sammen i hovedsakelig fire kategorier som anvendt i de i det følgende rapporterte bedømmelser, dvs. at et enkelt plusstegn (+) benyttes når omtrent 25 % av flisene viser vekst av den spesielle ascussporekandidat, to plusstegn (++) når omtrent 50 % viser vekst, tre plusstegn (+++) når omtrent 75 % viser vekst og fire plusstegn (++++) når omtrent 100 % viser vekst. Hvis en prosentandel innenfor omtrent 5 % enheter av en mellomliggende prosentandel, f.eks. er 58 % innenfor 5 % enheter av 62,5 %, tilføyes et plusstegn etter en skråstrek og den lavere angivelse, som f.eks. (++/+) eller (++/+++). På analog måte blir en mellomliggende bedømmelse under den første nivåbedømmelse indikert med (+/-). En lignende totalbedømmelse vil bli foretatt for den eller de foreldresopper som refereres. For å oppnå mer nøyaktige bedømmelser i forhold til de kriterier som er beskrevet heri, vil om nødvendig en faktisk prosentandel bli bestemt og prosent-andelene sammenlignet. En feilmargin vil imidlertid bli tillatt for menneskelig feil, den større vanskelighetsgrad med fastslåelse av lysere vekst og den vesentlige oppnåelse av oppfinnelsens formål. En slik margin er 10 % andeler, slik at en ascussporekandidat som er funnet voksende på f.eks. 78 % av treflisene vil bli betraktet med samme vekstevne eller virulens som en foreldersopp som gir en prosentandel på 88 %. Ikke-sterile, behandlede flis vil vanlig vise vekst i andre områder av flisen av andre organismer, vanlig svartfargende sopp, og slik bakgrunns-vekstfarging kan angis separat. Slik bakgrunnsvekst endrer ikke den bedømmelse som foretas, men vil indikere nærvær av sopp som naturlig har infisert massetreet.

En seleksjon i samsvar med kriterier 1) og 2) kan det gis avkall på i visse tilfeller hvor visse ascussporesopper eller deres derivater, ønskelig også et homokaryote derivat, tilfredsstiller visse særlig foretrukne egenskaper som avspeiler lyshet og virulens på ikke-sterilt substrat. Spesielt tilveiebringes ønskelige nye sopper ved den foreliggende oppfinnelse når bekreduksjonskriterier tilfredsstilles på steriliserte (og ikke-steriliserte) substrater etter 21 døgn som beskrevet i det foregående, og et ikke-sterilt kontrollsubstrat etter 14 døgn er tilstrekkelig påvirket av native organismer til at dets lyshet er redusert med minst 10 %, spesielt minst 20 %, sammenlignet med en sterilisert ubehandlet kontroll, men den ascussporeavledede sopp resulterer likevel i et lyshetsnivå ved slutten av den 14 døgnsperioden på det ikke-sterile substrat som er minst like så høy som lyshetsnivået for den ubehandlede, ikke-sterile kontroll. Slike sopper er indikert å være nye i forhold til tidligere kjente sopper. En særlig ønskelig klasse av slike sopper er dem som faktisk øker lysheten, f.eks. med minst omtrent 5 % eller mer, sammenlignet med den ubehandlede ikke-sterile kontroll. Foretrukne underklasser av slike sopper er dem som bevirker enten et slik ønsket resultat på minst ett treslag eller varietet i doser mindre enn IO<10> CFU/Kg, særlig doser som ikke overstiger IO<9>, og spesielt doser som ikke overstiger IO<8> CFU/Kg.

Soppene i samsvar med oppfinnelsen kan anvendes for å redusere bekinnholdet i massetre og første trinns mekanisk masse som beskrevet i EP 387187. Betegnelsen "massetre"

som anvendt heri betyr en hvilken som helst høstet (nedhugd) form av et trematerial anvendt ved fremstilling av papir, papp eller annet celluloseprodukt som viskose, men før masse-fremstilling, og inkluderer slike former som tømmer, stokker, treflis, sagflis og lignende. Betegnelsen "raffinert massetre" betyr et massetre som resulterer fra utøvelse av mekaniske og/eller skjærkrefter på hele massetreformer slik som stokker for oppnåelse av et flertall små stykker med høyt overflateareal, som f.eks. treflis og sagflis, som kan innføres i en massefremstillingsprosess. Betegnelsen "første trinns mekanisk masse" betyr en masse, isolert fra en mekanisk massefremstillingsprosess, som inneholder 60 % eller mer av lignininnholdet i substratet før massefremstillingen.

I prinsippet tilføres et inokulat av minst en av soppene

til substratet eller substratene og det eller de inokulerte substrater opprettholdes ved en veksttemperatur for soppen, f.eks. 2-43°C, foretrukket 7-34°C, i en tid tilstrekkelig til å nedbryte bekinnholdet i substratet, f.eks. 7-14 døgn. Raffinerte massetretyper blir generelt akkumulert, f.eks. i en haug, etter inokulasjon som ønskelig vil være represen-tativt fordelt i hele akkumulasjonen. Slik akkumulasjon kan være i form av en typisk treflishaug eller i en beholder eller innesluttet rom som f.eks. en silo, en jernbanevogn, skip eller lignende slik at bekreduksjonen kan foregå under

transport. Tømmer, stokker og lignende kan behandles på mange måter for å indusere vekst i en hovedandel eller mer av slikt substrat, f.eks. kan tømmer eller stokker splittes i lengderetningen og inokulatet tilføres i spalten, eller også kan de avkuttede ender inokuleres. Første trinns mekanisk masse er et sterilisert substrat og oppfinnelsen kan utøves generelt for både steriliserte og ikke-sterile substrater. Spesielle og ønskede fordeler oppnås imidlertid selvfølgelig når oppfinnelsen anvendes med ikke-sterile massetretyper, inkluderende ikke-sterile raffinerte massetretyper. Dosering som tilføres ved utøvelse av den foreliggende oppfinnelse vil ikke overstige IO<10> CFU/Kg substrat med raffinerte massetretyper, og foretrukket ikke overstige IO<9> CFU/Kg idet lavere doseringer kan anvendes med mer foretrukne utførelsesformer.

Ved den foreliggende oppfinnelse er det ikke bare mulig å oppnå sopper som vokser hurtig ved effektive inokulasjons-nivåer på ikke-sterilt tre, mens negative lyshetsvirkninger i forhold til den beknedbrytende foreldresopp reduseres, men det er i samsvar med et foretrukket formål og en utførelses-form at lysheten av tresubstratet ikke bare kan bli minimalt påvirket eller hovedsakelig upåvirket i forhold til ubehandlede, ikke-sterile kontroller (representerende en typisk kommersiell treflishaug), men kan også økes i sammenligning med en slik kontroll. Slike spesielt foretrukne sopper og deres bruk på ikke-sterile substrater, inklusive slike som kan bli moderat eller endog mer naturlig infisert med fargende eller flekkende sopper, tillegges stor betydning og brukbarhet ettersom bek ikke bare kan reduseres med derav følgende omkostningsbesparelser og forbedrede papir/produkt-styrkeegenskaper, men lysheten av det behandlede substrat kan endog økes i forhold til ubehandlet massetre som normalt innføres i en massefremstillingsprosess. Mens slike lyshetsfordeler kan skyldes i en mindre grad en lys eller hovedsakelig hvit rest som er tilbake fra mycelia av spesielt foretrukne sopper, kan slike fordeler indikeres stort sett å være tilveiebrakt ved evnen av den foretrukne sopp til å vokse inn i eller utelukke andre fargende sopper eller organismer i lokaliteter hvor slike andre organismer ellers ville gro under behandlingsperioden, f.eks. 14 døgn. ' Ikke-sterilt massetre behandlet med slike spesielt foretrukne sopper er også ansett som nytt ettersom det er indikert at slike substrater behandlet med andre meget lysvoksende eller "falmete" sopp har den reduserte virulens eller konkurrerende vekst (i forhold til deres egen fargevirkning) som det.er erfart, selv når de inokuleres ved forholdsvis høye doser, vil virke stort sett på lokaliteter hvor de native fargende sopper eller andre organismer ikke vil spre seg og er utilstrekkelig konkurrerende til å utelukke tilstrekkelig av veksten av de naturlige fargende sopper for positivt å påvirke lysheten. Slike nye massetretyper og de sopper som frembragte dem kan defineres i forhold til naturlig infiser-ing med fargende sopper eller organismer når en ikke-steril kontrollprøve (ubehandlet) fremviser tilstrekkelig infeksjon til at dens lyshet reduseres med minst ti prosent (10 %) ved romtemperatur i forhold til sterile, ubehandlede prøver over behandlingsperioden, mens de nye soppbehandlede substrater har et lyshetsnivå i det minste lik eller større enn lyshetsnivået av den nevnte ikke-sterile ubehandlede massetre-kontroll etter behandlingsperioden, f.eks. 14 døgn. Disse fungale behandlingssubstrater med forbedret lyshet i sammenligning med den ikke-sterile, ubehandlede kontrollprøve vil være spesielt ønskede produkter for videre behandling, særlig ved fremstilling av mekaniske masseprodukter.

Oppfinnelsen illustreres videre ved hjelp av de etterfølgende eksempler sopper som hører til den foretrukne art 0. piliferum som indikert i tabellen med angitte NRRL aksesjonsnumre anvendes henholdsvis produseres.

Eksempel 1

Isolasjon av ascussporer

Sopp C-l (0. piliferum NRRL 18691) dyrkes på sterilt tre i 2-4 uker for å tillate fremstilling av parathecier. Deretter ble ascussporedråper tatt opp med en steril disseksjonsnål og overført til 400 /il maisolje. Prøven ble vortex-behandlet til å danne en ensartet sporesuspensjon. Denne suspensjon ble undersøkt i et hemocytometer-tellekammer under et mikroskop og funnet å inneholde lxlO<6> celler/ml, hvorav 90-95% var enkle ascussporer. De resterende 5-10 % av soppen besto av hyfefragmenter og sammenklumpede ascussporer.

Ascussporene ble fortynnet 100 ganger i steril maisolje og deretter ble det foretatt to separate ytterligere fortynninger, 10 ganger og 100 ganger i steril 10 % Triton X100 for sammenligning med hverandre. 100 /il delprøver av de to fortynninger ble utplatet på gjær-maltågar for å oppnå utplatingsdensiteter på 100 og 10 sporer pr. plate. Triton X100 ble anvendt for å dispergere maisoljen og forhindre reagglomerering av oljedråpene på overflaten av agaren. Triton X100 er ikke-giftig for denne sopp i flytende kultur, men på grunn av at det ikke var kjent hvorledes innfanging av sporer i olje/detergentmiceller ville påvirke deres spiring, ble et sett av fortynninger uten detergent foretatt og utplatet for sammenligning.

Soppen fjernet oljen fra platene mens den vokste. På de plater hvor sporene var utplatet uten detergent fløt kolonier på toppen av oljen og hadde tendens til sammenklumping. I nærvær av olje/detergent forble koloniene separate og ganske kompakte, men oppnåelse av opptagbar størrelse foregikk mer sakte. Oljekolonier var store nok til å ta opp i løpet av 4 døgn mens olje/detergentkolonier var klare i løpet av 7 døgn.

Der var ingen giftighet eller forhindring av spiring iakttatt under olje/detergentmetoden. Den lavere levedyktighet iakttatt i fravær av detergent kan bevirkes ved aggregasjon av kolonier eller spirende sporer på oljeoverflaten, se den etterfølgende tabell.

Kolonier pr plate

Når de individuelle kolonier var store nok til fornyet utstryking ble alle kolonier fra de platene med lavere fortynning, uansett størrelse eller farging, overført til frisk gjær-maltagar for lagring og testing for produksjon av perithecier (homokaryon-status).

Eksempel 2

Screening for homokaryoner og foreløpig seleksjon

C-l ascussporeisolater ble underkastet screening for å eliminere så mange heterokaryoner som mulig og å bestemme effektiviteten av olje/detergentisolasjonen som en metode for frembringelse av homokaryoner. Produksjon av modne perithecier inneholdende ascussporer krever to komplementære parringstyper som homokaryote stammer ikke kan besitte; heterokaryote stammer kan besitte begge faktorer (dvs. være selvbefruktende). Selv om en homokaryon kan frembringe et umodent perithecium, benevnt et protoperithecium, kan bare et heterokaryon frembringe et modent perithecium. Således kan heterokaryote stammer detekteres ut fra perithecium-produksjonen, men fravær av peritheciedannelsen viser ikke at en stamme er homokaryot.

Screening ble gjennomført ved utstryking av hvert isolat på treflisagar og overvåking av perithecium-produksjonen over en 2 mnd periode.

Bare 9 av 105 C-l isolater som ble underkastet screening produserte perithecier og ble kastet. Den etterfølgende tabell gir en numerisk klassifisering av de resterende C-l isolater som ikke frembringer perithecier og forutsettes å være homokaryote. Isolatene ble gruppert i henhold til fargen av veksten på treflisagar.

Numerisk klassifisering av C-l isolater

De 96 antatte homokaryoner oppnådd fra C-l viste god dekning på treflisagar. Alle de lysere C-l isolater (og andre) ble foreløpig underkasteet screening for veksthastighet på ikke-sterile og sterile treflis for å selektere de mer virulente av disse isolater for videre undersøkelse.

Eksempel 3

Vekstscreening av mer virulente kandidater fra lys gruppe

Hver av de mer virulente kandidatsopper ble dyrket i gjær-maltmedium ved romtemperatur, 2 00 omdr. pr min. i 72 timer (72 timer ble valgt på grunn av sakte veksthastighet av noen stammer). Celler ble høstet ved sentrifugering og resuspendert i sterilt vann til en levedyktig CFU-konsentrasjon på omtrent 10xl0<8>/ml.

100 g prøver av sterile (autoklavbehandlede) og ikke-sterile

(mindre enn 1 uke gamle flis lagret ved 5°C før bruken)

Southern yellow-furuflis ble inokulert i duplikat med 1 ml fungal suspensjon.

De inokulerte flis ble lagret ved romtemperatur i mørke. Vekst ble overvåket over tid i en periode på 10 døgn.

I den etterfølgende tabell er det kun rapportert bedømmelse av de fem bedre voksende isolater i den lyse fargegruppe. Forkortelsene har følgende betydninger: Vekst av C-l lyse isolater

De ovenstående homokaryonisolater indikerte et virulensområde hvor i det minste C-1D5 og C-1D84 indikerte tilfredsstillelse av de angitte kriterier.

Eksempel 4

Bekreduksjon og lyshetsvirkninger

Sopp ble dyrket i gjær-maltmedium ved romtemperatur,

200 omdr. pr min i 72 timer. Celler (omtrent 95 % blastosporer/5 % mycelia) ble høstet ved sentrifugering og resuspendert i sterilt vann til en omtrent levedyktig CFU

på lxl0<8>/ml. Fem replikat 100 g poser av flis av steril Southern yellow-furu ble inokulert med 1,0 ml fungal suspensjon. De inokulerte og kontrollposene ble inkubert ved romtemperatur i mørke i tre uker. Fire replikater fra hvert sett på fem ble analysert for bekinnhold. Den femte

ble målt med hensyn til lyshet. Resultatene er gitt i følgende tabell.

Farge av vekst % Ekstrakt-

Alle de ovenfor testede stammer viste betydelig bekreduksjon. Graden av lyshetstap avhang på fargene av vekst av soppen på treet. De to lyse testede stammer C-1D5 og C-1D84 viste betraktelig bedre lyshet enn foreldre C-l soppen. C-1D84 var ønskelig indikert til å ha bedre lyshet enn den ubehandlede kontroll.

Et antall "falmede" ascossporeisolater ble testet for vekst under feltbetingelser (ikke-sterile treflis).

Fungale stammer ble inokulert med en hånd-holdt dusj sprøyte på ikke-sterile treflis fremstilt fra to dager gamle stokker til å danne 10 tonns hauger. De ikke-sterile flis ble oppnådd fra et område hvori en nativ O. piliferum blåflekksopp var blitt tolerert og ble selektert på basis av å være naturlig infisert med slik blåflekksopp. Haugene ble inkubert ute under vanlige betingelser i to uker. Haugene ble så tatt fra hverandre og mengden av soppvekst ble bestemt.

Den etterfølgende tabell oppsummerer resultatene av dette feltforsøk som sammenligner "falmede" stammer inokulert med en hånd-holdt dusj sprøyte.

Den tilførte dose uttrykkes som kolonidannende enheter (CFU) pr kg treflis. Bakgrunnsvekst er en indikasjon på vekst av sort/mørkfargede sopper som allerede er til stede i treet (eller av inokulat i tilfellet av den sorte stamme TAB28).

I tillegg ble C-1D5 inokulert med en dusj sprøyte i produksjonslinjen på flis fremstilt fra tre uker gamle stokker og resultatene av veksten på 10 tonns hauger er gitt i det følgende (som også indikerer en undertrykkelse av bakgrunnsvekst av soppen).

Både C-1D5 og C-1D84 viste svært god vekst på de ikke-sterile flis og også et dose/responsforhold.

De ovenstående resultater indikerer i tillegg til den gode bekreduksjon og hovedsakelig fravær av negativ lyshets-påvirkning, at de selekterte isolater C-1D84 og C-1D5 vokste meget godt under de sterkt konkurrerende betingelser som kan påtreffes i en treflishaug eller andre massetreformer, og frembringer spesielt deres ønskede virkning ved inokulatdoser som nærmer seg den samme størrelsesorden som den meget effektive TAB28. Ikke bare blir disse formål oppnådd ved hjelp av disse to arter, men resultatene indikerer den ytterligere og meget viktige fordel i potensialet av slike sopper til delvis å overvinne eller fortrenge de formørkende innvirkninger av sopper som naturlig infiserer slike massetretyper, slik at dette resulterer i massetre som er hovedsakelig endog lysere enn en kontroll eller konvensjonelt håndtert massetre, slik at det potensielt tillates endog en reduksjon i etterfølgende behandlinger anvendt for å øke lysheten og som spesielt og som eksempel utøves i forbindelse med mekaniske masser.

Eksempel 5

Fremstilling av WZ19, WZ24 og WZ58

Den hvitvoksende ascussporesopp C-1D84 og en sortvoksende villtype av 0. piliferum sopp TAB51 ble parret sammen ved utstryking av kulturer av hver fra gjær-maltagarplater over det samme areal av treflisagarplate med etterfølgende inkubasjon av den utstrøkne dyrkingsplate i fire uker på benk etter forsegling av platen med parafilm. Ascussporer fra parringen ble isolert og gjenvunnet ved hjelp av prosedyren beskrevet i det foregående(olje/detergent-isolasjon) og deretter ble omtrent 93 isolater dyrket opp

og midlertidig bedømt med hensyn til farge og vekstvirulens. Tre av kandidatene, nemlig WZ19, WZ24 og WZ58 ble selektert for ytterligere bedømmelse på basis av deres hvite farge og utmerkede vekstegenskaper (alle tre fremviste en vekstvirulens lignende TAB2 8 som i seg selv er overlegen overfor TAB51 med hensyn til vekstvirulens). TAB51 fremviser den mørkeblå eller hovedsakelig sorte farge av de typiske

blåflekksopper når de dyrkes på et tresubstrat, f.eks. sterilisert eller ikke-steril Southern yellow-furu.

De tre kandidater ble så dyrket opp for frembringelse av inokulat og bedømt for vekst som beskrevet i det foregående under avsnittet "Vekstscreening av mer virulente kandidater fra lys gruppe", sammen med andre for sammenligning, idet resultatene med Southern yellow-furu ikke-sterile treflis er gjengitt i det følgende.

De tre kandidater ble så bedømt for bekreduksjon og lyshetsvirkninger i henhold til metoden tidligere beskrevet under avsnittet "Bekreduksjon og lyshetsvirkninger", med unntagelse av at de behandlede substrater ble inkubert i bare to uker. Resultatene på Southern yellow-furu sterile treflis er rapportert i det følgende.

Eksempel 6

Vekst på ikke-steril treflis under feltbetingelser

Fungale stammer ble inokulert med en hånd-holdt dusj sprøyte på ikke-steril Southern yellow-furu treflis fremstilt fra en blanding av 40 % lagrede stokker (2-3 mnd gamle) og 60 % friskt tre (omtrent 3 uker gamle) og lagret i 10 tonns flis-hauger. Flis ble inokulert i en dose på 2X10<11> CFU/tonn (omtrent 9,09xl0<7> CFU/Kg) ettersom de ble kastet av fra et front-ende nyttelast-kjøretøy ut på varmeplattformer i flisgården. Varmeplattformer besto av 50 cm høye slagglokk-vegger som bar en rammekonstruksjon med 5 x 10 cm planker. Kraftig hønsenetting ble stiftet på de 5x10 cm plankene til å gi understøttelse for treflisene. En termostatstyrt varme-innretning med kunstig lufttrekk ble anbragt under hver oppvarmingsplattform og innstilt til å opprettholde luft-temperaturen ved 24°C. Haugene ble inkubert under disse betingelser i 10 døgn. Haugene ble så tatt fra hverandre for bedømmelse. Gjennomsnittsmengden av fungal vekst i det indre av haugen ble bestemt. Prøver ble tatt fra midten av haugene og analysert på bekinnhold og lyshet. Resultatene er angitt i det følgende.

Den stamme som fremviste den beste totale veksthastighet, WZ58, reduserte også beknivåer til den laveste verdi. Bakgrunnsvekst indikerer veksten av sorte/mørkfargede sopper allerede til stede på treet.

Eksempel 7

Fermentering og sammensetning

Celler (blastosporer) av WZ58 ble dyrket ved 25°C (10 liter volum av medium i en 2 0 liters Chemap fermenter) i media inneholdende 200 g pr 1 maltekstrakt og 20 g pr 1 gjær-ekstrakt inntil celledensiteten var 3xl0<9> celler/ml. Fermenteringsmedia (ca 36-48 timer) ble luftet med 2 volum luft pr volum medium pr minutt (oksygennivåer nær metning, dvs. ikke begrensende ved noe tidspunkt under gjæringen).

Biomassen som var dyrket i fermenteren ble høstet ved sentrifugering og de pelletiserte celler blandet med leire i et forhold på 1 del våt biomasse (omtrent 20 % faststoff) til 2 deler tørr kaolinleire. Fuktighetsinnholdet i biomasse:leireblandingen er fra 25-30 %. Den flytedyktige blanding føres inn i en Aeromatics tørke med fluidisert sjikt og underkastes tørking under vanlige temperaturbetingelser til et endelig fuktighetsinnhold på 5-10 %. Utløps-luftemperaturer opprettholdes under 35°C. Tørketid er fra 20-40 min. Tørket material fra det fluidiserte sjikt bibeholder sin levedyktighet og evne til å vokse på ikke-sterile treflis og reduserer beknivåer etter forlenget lagring ved -15°C.

Eksempel 8

Fermentering og sammensetning

Celler (blastosporer) av WZ58 ble dyrket ved 25°C (10 liters volum av medium i en 20 liters Chemap fermenter) i media inneholdende 200 g pr 1 maltekstrakt og 20 g pr 1 gjær-ekstrakt inntil celledensiteten var 3xl0<9> celler/ml. Fermenteringsmediet (ca 36-48 timer) ble luftet med 2 volum luft pr volum medium pr min. (oksygennivåer nær metning, dvs. ikke begrensende ved noe tidspunkt under gjæringen).

Biomassen som vokste i fermenteren ble høstet ved sentrifugering til en celleslurry med et 5 % faststoff-innhold. Slurrien ble tilført (sprøytet) horisontalt på en Aeromatics tørke med fluidisert sjikt og brakt i kontakt med oppløftet kaolinleire under vanlige temperaturbetingelser til et endelig fuktighetsinnhold på 2-10 %. Vektforholdet mellom slurry og leire er 1:1. Utløpslufttemperatur opprettholdes under 35°C. Tørketid er fra 20-40 min. Det resulterende forstøvningsgranulerte produkt bibeholder levedyktighet og evne til å vokse på ikke-sterile treflis og reduserer beknivåer etter forlenget lagring ved -15°C.

Eksempel 9

Bekreduksjon i treflis fra forskjellige treslag

Treflisene ble behandlet i henhold til følgende standarder: TremålingTAPPI T 257 cm 85

SagfliskalibreringTAPPI T 264 cm 88

BekekstraksjonTAPPI T 2 04 os 78

Claims (10)

1. Tre-penetrerende beknedbrytende soppstamme, karakterisert ved at den omfatter en isolert ascusspore eller en tre-penetrerende beknedbrytende soppstamme som kan oppnås fra en ascusspore av klassen Ascomycotina eller Deuteromycotina og som har en eller begge egenskapene med enten

1) ikke sterkere påvirkning av lysheten av et sterilisert tresubstrat etter 21 døgns vekst enn soppstammen C-1D5 (0. piliferum) med aksesjonsnr. NRRL 18677 mens den gror mer virulent enn foreldresoppen på det samme, men ikke-sterile tresubstrat som bestemt over en vekstperiode på 10 døgn, eller

2) frembringelse av et høyere lyshetsnivå på et sterilisert tresubstrat enn soppstammen C-l (O. piliferum) med aksesjonsnr. NRRL 18691 etter 21 døgns vekst mens den vokser hovedsakelig ikke mindre virulent enn foreldresoppen på det samme, men ikke-sterile tresubstrat som bestemt over en vekstperiode på 10 døgn.

2. Soppstamme som angitt i krav 1, karakterisert ved at den er en sopp av slekten Ceratocystis, Ceratocystiopsis, Graphium, Leptographium eller Ophiostoma.

3. Soppstamme som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at den er selektert fra gruppen bestående av: a) en isolert ascusspore av en kultur av en eller flere sopper av klassene Ascomycotina eller Deuteromycotina, b) en biologisk ren kultur av soppen som kan oppnås fra den nevnte ascusspore, c) et inokulat omfattende sporer og/eller mycelia separert fra en kultur i samsvar med b) ovenfor, d) en biologisk ren kultur av en derivatsopp av soppen som kan oppnås fra den nevnte ascusspore, idet derivatet har minst den beknedbrytende, tre-lysgjørende virkning og ikke-sterile tre-konkurrerende vekstevne for soppen som kan oppnås fra den nevnte ascusspore, og e) et inokulat omfattende sporer og/eller mycelia separert fra en kultur i samsvar med d) ovenfor.

4. Soppstamme som angitt i krav 1, karakterisert ved at den har NRRL aksesjonsnr. 18755 eller et inokulat oppnådd fra en kultur av en slik soppstamme.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av en soppstamme som angitt i ett eller flere av kravene 1-4, karakterisert ved isolasjon av ascussporer av en kultur av en eller flere tre-penetrerende, beknedbrytende foreldresopper av klassen av Ascomycotina eller Deuteromycotina og seleksjon av en eller flere homokaryote sopper oppnådd fra disse ascussporer med minst en av egenskapene nevnt i krav 1.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved dispergering av ascussporene av en foreldresopp i en ikke-giftig, naturlig olje som kan forbrukes av soppen frembragt av ascussporene med etterfølgende behandling av den ascussporeholdige olje med et ikke-giftig dispergeringsmiddel for oljen for oppnåelse av separate ascussporeholdige dråper av den nevnte ol j e.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 5 eller 6, karakterisert ved seleksjon av det ytterligere kriterium med vekst på et sterilisert tresubstrat for å redusere bekinnholdet av substratet med minst 2 0% etter ikke mer enn 21 døgns vekst.

8. Anvendelse av et inokulat oppnådd fra isolerte sopper som angitt i ett eller flere av kravene 1-4 for å redusere bekinnholdet av massetretyper, idet inokulatet tilføres til et massetresubstrat eller første trinns mekanisk masse og opprettholdelse av det inokulerte massetre eller masse under betingelser som tillater vekst av soppen.

9. Massetre, karakterisert ved at det er behandlet med en tre-penetrerende, beknedbrytende sopp av klassen Ascomycotina eller Deuteromycotina som angitt i ett eller flere av kravene 1 - 4.

10. Soppblanding, karakterisert ved at den omfatter et sporeholdig fermenteringskonsentrat av en sopp som angitt i ett eller flere av kravene 1 - 4 og en inert fast bærer som ikke skadelig påvirker stabiliteten av sporene.