FI115221B - Pihkan poisto hakkeesta - Google Patents

Description

115221

Pihkan poisto hakkeesta lisillä olevan keksinnön kohteena on patenttivaatimuksen I johdannon mukainen menetelmä pihkan poistamiseksi hakkeista ja patenttivaatimuksen 11 johdannon mukainen 5 mikro-organismiviljelmä tai - siirros.

Puun uuteaineet, “pihka“, vaikeuttavat monin tavoin massan ja paperinvalmistusta. Osa puun uuteaineista muodostaa saostumia, jotka voivat aiheuttaa paperirainan katkeamista ja vaikeuttaa paperikoneen ajettavuutta. Uuteaineet voivat aiheuttaa edelleen ongelmia pape-10 rin päällystyksessä ja painatuksessa, pakkausmateriaalien haju- ja makuhaittoja sekä ongelmia jäteveden käsittelyssä. Mekaanisessa massanvalmistuksessa uuteaineet säilyvät määrältään ja rakenteeltaan lähes muuttumattomina, kun taas kemiallisessa massan valmistuksessa eli keitossa osa uuteaineista poistuu, mutta uuteaineet lisäävät kemikaalien kulutusta.

15

Puun uuteainepitoisuus ja -koostumus vaihtelee puulajin ja myös kasvuolosuhteiden mukaan. Puun kuivapainosta uuteaineiden pitoisuus on yleensä alle 10 %, mutta se voi olla jopa 40%. Yleisimmät uuteaineryhmät ovat triglyseridi-, hartsihappo-, steroli-ja steryyli-esteriryhmät, mutta uuteaineisiin kuuluu myös fenolisia yhdisteitä, kuten flavonoideja ja 20 lignaaneja. Kasvuolosuhteet vaikuttavat eri puulajeilla uuteaineiden määrään ja puun eri . osissa (esimerkiksi sydänpuu ja pintapuu) uuteainepitoisuus on erilainen.

I II · : i i i ,,,,; Puun uuteaineista triglyseridit ovat helpoiten hajotettavissa olevia ja ne aiheuttavat eniten . ·, : ongelmia mekaanisessa massanvalmistuksessa. Sterolit ja steryyliesterit ovat vaikeammin \ : 25 hajotettavia, vaikka niiden määrä puussa on vähäisempi. Nämä yhdisteet aiheuttavat ongel- ." \ mia kemiallisessa massanvalmistuksessa. Hartsihappoja on mnsaasti varsinkin havupuiden uuteaineissa. Ne hajoavat hitaasti ja voivat tehdä jäteveden toksiseksi.

i * I * r 1 « »

Aiemmin uuteaineiden annettiin hajota puun omien mikrobien toimesta haitattomalle » i · . · · ·, 30 tasolle, mutta pihkan poisto tällä tavoin varastointiaikaa pidentämällä, lisää haitallisia > I > ,..; muutoksia puuraaka-aineessa. Suuren puumäärän pitkäaikainen varastointi aiheuttaa lisäkustannuksia sekä huonontuneena massanlaatuna että korkeimpina varastokustannuk-‘: sinä. Teollisuuden kannalta sopiva varastointiaika olisi noin kaksi viikkoa. Jotta uutepitoi- suus puussa alenisi, puutavaraa on varastoitava vähintään 10 viikkoa.

Π 5221 2 I’ihkaongelmaan on yritelty etsiä ratkaisua iiuteaineita hajottavista mikrobeista. Kaupallisesti on saatavissa tuote Cartapip™ (nyk. nimeltään Albinex™). Se on sinistäjäsieni Ophiostoma piliferumm vaaleaksi kehitetty muunnos. Se hajottaa hyvin triglyseridejä, 5 mutta huonommin muita uuteaineita. Cartapip™ -tuotteen on raportoitu alentavan männyn uute-aineiden kokonaismäärää kahdessa viikossa n. 20% kontrolliin verrattuna ja toimivan myös mm. haapahakkeessa (Breuil et ai., 1998). Sen sijaan suomalaisen kuusen ja koivun uuteaineiden hajottamiseen se ei sovellu yhtä hyvin.

10 Uuteaineiden hajottajina on tutkittu erityyppisiä puussa kasvavia sieniä: etenkin sinistäjä-sieniä (esim. Ophiostoma - ja Ceratocystis -suvut) ja valkolahosieniä (esim. Ceriporiopsis subvermispora) (Martinez-Inigo et ai. 1999, Dorado et ai. 2000 a, b). Myös homeista ja bakteereista on etsitty tehokkaita uuteaineiden hajottajia.

15 Etelä-Λίrikassa on biopulppaustutkimusten yhteydessä testattu mänty-ja eukalyptusvil- jelmiltä eristettyjen valkolahosienikantojen lipolyyttistä aktiivisuutta (de Kokeret ai. 2000). Männyn ja eukalyptuksen ohella haavan uuteaineiden hajoamista erityyppisten sienten toimesta on tutkittu (Farrell et ai. 1998, White-McDougall et ai. 1998). Näissä tutkimuksissa kokeet on tehty kasvattamalla sientä hakkeessa. Hakkeen käsittelystä poik- 20 keava menetelmä on kokonaisten puurunkojen käsittely Phlebiopsis gigantea -sienellä.

• » • · · : Menetelmä on kehitetty varsinaisesti sinistäjäsieni en biologiseen kontrolliin, mutta myös ’ ‘ uuteaineet hajoavat, joskin käsittelyaika on hakkeeseen verrattuna pitkä (Behrendt &

Blanchette 1997). Laboratoriokokeissa on todettu useilla sienillä uuteaineiden kokonais- • · · j määrästä hajoavan jopa 70%, mutta vertailu on vaikeaa, koska laboratoriokokeissa on t » | *; t ’ ‘ 25 käytetty vaihtelevia olosuhteita ja usein melko pitkiä käsittelyaikoja.

• · • · • * · , Sinistäjäsienten etuna on se, että ne eivät hajota puun rakennepolymeereja, eivätkä siten "!! vähennä saantoa. Haittana on se, että ne tuottavat tummaa pigmenttiä. Valkolahosienet ’ ^ ‘ hajottavat ligniiniä ja voivat olla hyödyksi massanvalmistuksessa, joten niiden käyttö uute- I ♦ ‘ · · * 30 aineiden poistossa voisi olla edullista.

• · II · : Sinistäjäsienet hajottavat eri uuteaineryhmistä tehokkaimmin triglyseridejä, steryylieste- * · reitä ja vahoja. Steryyliesterien hajotessa sterolien määrä vastaavasti nousee, koska vapautuvat sterolit eivät hajoa edelleen. Rasvahapot hajoavat myös, mutta aluksi vapaiden 115221 3 rasvahappojen osuus kasvaa triglyseridien hajotessa (lireuil et ai. 1998, Martinez-lnigo et ai. 1999). Valkolahosienet puolestaan hajottavat myös steroleja ja hartsihappoja (Martinez-lnigo et ai. 1999).

5 Kuusen uuteaineiden mikrobiologisesta hajoamisesta on julkaistu vain vähän tutkimuksia, ja vain laboratoriokokeita on raportoitu. Fiseheret ai. (1994) käyttivät sekä kuusta että mäntyä tutkiessaan kolmen sienen (Ceriporiopsis subvermispom, Phanerochaete chrysosporium ja Ophiostoma piliferum (Cartapip™) uuteaineiden hajotuskykyä. Riippumatta puulajista tai sienestä kahden viikon käsittelyssä laiteaineista hajosi 25 - 30%.

10

Puun tai hakkeen käsittelyä sienillä on ehdotettu mm. seuraavissa patenttijulkaisuissa: WO 9842914 A1, WC) 9946444 A1, WO 9713025 A1, WC) 9802612 A1, WC) 97/13025, US 5,055,159, US 5,476,789, US 5,620,564, US 5,460, 697 ja EP 689 625 B1.

15 JP 3220388 ja JP 3213591-patenttijulkaisuissa on ehdotettu hakkeen käsittelemistä mikro-organismeilla lisäämättä ravinteita ligniinin toimiessa ainoana hiilenlähteenä.

Massan ja puun käsittelyyn on ehdotettu käytettäväksi bakteereita kansainvälisessä patenttijulkaisussa WO 9636765 AI ja US-patentissa US 5,711,945.

20 :: Myös entsyymejä, kuten Resinase® (Novozymes A/S), on ehdotettu käytettäväksi pihka- ’ · ongelmien vähentämiseen. Resinase® -tuotteen ongelma on se, että hydrolysoi vain ' 1 triglyseridejä, eikä vaikuta puun muihin uuteaineisiin. Hydrolyysituotteet, rasvahapot ja ’. ’: glyseroli, on poistettava entsyymikäsittelyn jälkeen massasta.

:1v: 25 i t < ‘··· ’ Vaikka pihka-aineiden vähentämiseen hakkeesta on pyritty erilaisilla menetelmillä, joissa hakkeeseen on lisätty mikro-organismeja, tyydyttävää menetelmää ei ole vielä tähän *;;; mennessä kehitetty. Mikro-organismien lisäämisen on havaittu aiheuttavan väri haittoja ja * 1 ‘! 1 vähentävän massan vaaleutta. Lisäksi ligninolyyttiset sienet voivat aiheuttaa saannon f i « *... 1 30 menetyksiä ja tuottamiensa hemisellulaasien ja sellulaasien ansiosta massan lujuus voi » * 1 kärsiä.

t t · » » » t · · 115221 4 lisillä olevan keksinnön tarkoituksena on poistaa tunnettuun tekniikkaan liittyvät epäkohdat ja saada aikaan aivan uudenlainen ratkaisu hakkeen pihkaongelmien ratkaisemiseksi.

5 Keksintö perustuu siihen yllättävään havaintoon, että hakkeiden uuteaineita saadaan vähennettyä lisäämällä hakkeisiin pelkästään typpeä. Mikro-organismeja voidaan lisätä typpilisäyksen lisäksi, mutta pelkästään typpilisäyksellä on havaittu saatavan huomattava vähennys uuteaineiden määrään.

10 Tiedossa on ollut jo aiemmin, että sienten kasvua rajoittavana tekijänä puumateriaalissa on usein typpi (Breuil et ai. 1998), jota sienet kykenevät käyttämään epäorgaanisena ammo-niumtyppenä tai orgaanisessa muodossa aminohappoina. Koska puussa on hyvin paljon erilaisia mikro-organismeja, on yllättävää, että typen lisääminen parantaa juuri niiden mikro-organismien aktiivisuutta, jotka kykenevät hajottamaan uuteaineita ja että mikro-15 organismien aktiivisuus lisääntyy juuri tähän suuntaan.

Esillä oleva keksintö koskee siten menetelmää, jossa pihka-aineiden määrää hakkeessa vähennetään lisäämällä hakkeeseen typpeä. Menetelmän mukaan hakkeeseen lisätään typpeä vähintään 0,07 g N/tuoretta hakekiloa kohti ja olosuhteet hakkeessa, kuten kosteus, 20 lämpötila ja ilmastus saatetaan sopiviksi mikro-organismien kasvulle.

Täsmällisemmin sanottuna esillä oleva keksintö koskee patenttivaatimuksen 1 tunnus-‘; : merkkiosassa esitettyä menetelmää.

•, ’ : 25 Typen lisäksi hakkeeseen voidaan lisätä muitakin ravinteita, kuten hiililähde. Hiililähde voi ‘’ olla esimerkiksi tärkkelys tai jokin vastaava ei-helppokäyttöinen hiililähde. Helppokäyt töisen hiililähteen, kuten glukoosin lisääminen ei sen sijaan edistä uuteaineiden hajoamista.

t I t ’ ·; · ’ Ravinteiden lisäksi hake voidaan siirrostaa sellaisella mikro-organismiviljelmällä, jonka * * t : 30 tiedetään kykenevän hajottamaan puun uuteaineita. Edullisesti tällainen mikro-organismi- ’ “ · viljelmä on sieni, kuten sinistäjäsieni tai valkolahottajasieni, edullisimmin sieni on lignino- : ’ * *: lyyttinen. Tämän keksinnön yhteydessä havaittiin, että erityisen hyviä tuloksia saadaan •: * : kannalla C (eli kanta PP/1998/C), joka kuuluu sinistäjäsieniin. Kanta on talletettu Buda pestin sopimuksen mukaisesti Budapestin sopimuksen mukaiseen mikro-organismi- 115221

S

kokoelmaan DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschcrodcr Weg lb, D-38124 Braunschweig 21. marraskuilla 2002 numerolla DSM 15309.

5 Keksintö koskee siten myös patenttivaatimuksen 11 mukaista mikro-organismiviljelmää tai - siirrosta, joka sisältää kannan DSM 15309 mikro-organismeja.

Pelkän typen lisääminen on teknisesti varsin yksinkertaista. Typpi lisätään edullisesti epäorgaanisessa muodossa, edullisimmin ammoniumtyppenä, esimerkiksi ammoniumsuolana , 10 kuten ammoniumsulfaattina, ammoniumnitraattina tai ammoniumkloridina.

Pelkällä typen lisäyksellä on tässä keksinnössä havaittu saatavan poistettua puun uute-aineista 20 - 40 %. Kun typen lisäksi hake siirrostetaan mikro-organismilla, joka kykenee hajottamaan puun uuteaincita, puun uuteaineista saadaan hajotettua 10-30 % käytetyistä 15 ravinteista riippuen.

Typpilisäys nopeuttaa mikrobien kasvuunlähtöä, saattaa tuottaa monipuolisemman mikro-bikasvuston ja sitä kautta tehostaa uuteaineiden hajotusta. Pelkkää typpilisäystä käytettäessä ei tarvita erillistä siirroksen tuotto-, kuljetus-ja levitysjärjestelmää. Merkittävä etu 20 on myös se, että typen lisäyksellä hakkeen uuteaineiden poistoon liittyvää käsittelyaikaa •,; | voidaan lyhentää, jolloin hakkeessa luonnostaan esiintyvät tai siirroksena lisätyt mikro- '' : organismit ehtivät tuottaa vähemmän väriaineita kuin jos käytettäisiin pelkästään mikro- '· '· organismisiirrosta.

’· ", 25 Keksintöä ryhdytään seuraavassa lähemmin tarkastelemaan yksityiskohtaisen selityksen ja ‘ · · · ’ muutaman sovellutusesimerkin avulla.

;; · Kuvio 1 esittää kantojen A, B ja C eri siirrosten vaikutusta tuoreen hakkeen uuteaineisiin.

•; ‘ Kuvio 2 esittää kantojen A ja C siirrosten vaikutusta tuoreen hakkeen uuteaineisiin * * 30 Kuvio 3 esittää tuoreen ja höyrytetyn hakkeen uuteaineita uuteaineryhmittäin

Kuvio 4 esittää siemkantojen FDA - aktiivisuutta tuoreessa ja höyrytetyssä hakkeessa : ; Kuvio 5 esittää uuteaineiden hajoamista kahden viikon sienikäsittelyssä. Hakkeen ί, ‘.: uuteainepitoisuus 14,1 mg/ g 115221 (>

Kuvio 6 esittää uuteaineiden hajoamista kahden viikon sienikäsittelyssä. Höyrytetyn hakkeen uuteainepitoisuus I6,7 mg/g

Kuvio 7 esittää lämpötilaa kompostoreissa ja ulkoilmassa.

Kuvio 8 esittää lämpötilaa saaveissa ja hakkeen käsittelyhuoneessa 5 Kuvio 9 esittää uuteaineiden hajoamista kompostoreissa Kuvio 10 esittää uuteaineiden hajoamista saaveissa Kuvio 11 esittää uuteaineiden hajoamista piloltikokecssa 2

Kuvio 12 esittää uuteaineiden hajoamista höyrytetyssä hakkeessa kannalla C, pilotti 1 Kuvio 13 esittää uuteaineiden hajoamisia höyrytetyssä hakkeessa kannalla C, pilotti 2 10 Kuvio 14 esittää pilottikokeissa käytettyjen hakkeiden uuteainekoostumusta Kuvio 15 esittää uuteaineiden hajotusta kannalla C eri lämpötiloissa

Esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää puun uuteaineiden poistamiseksi on sovellettu hakkeeseen siitä syystä, että mekaanista ja kemiallista massaa valmistettaessa käyte-15 tään normaalisti puuhaketta.

Puun “uuteaineita” kutsutaan tässä hakemuksessa myös “pihkaksi” tai “pihka-aineiksi”. Yleisimmät uuteaineryhmät ovat triglyseridi-, hartsihappo-, steroli-ja steryyli-esteri-ryhmät, mutta uuteaineisiin kuuluu myös fenolisia yhdisteitä, kuten flavonoideja ja lignaa-20 neja. Esillä olevassa keksinnössä uuteaineet on määritetty puusta Tappi standardin T 204 om-88 mukaisella menetelmällä asetoniin liukenevana fraktiona.

Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän mukaan hakkeeseen lisätään typpeä vähin-; ’ j tään 0,07 g N/ kg tuoretta haketta ja hakkeen olosuhteet saatetaan sopiviksi mikro-orga- y/ 25 nismien kasvulle.

. , Typpi voidaan lisätä orgaanisena typpenä tai epäorgaanisena typpenä, mutta edullista se on [!!.* lisätä epäorgaanisena typpenä, edullisinta ammoniummuodossa. Typpi voidaan lisätä esi- *·’ merkiksi ammoniumsulfaattina, ammoniumnitraattina tai ammoniumkloridina. Typpeä 30 lisätään vähintään 0,07 g N/kg tuoretta haketta, edullisesti vähintään 0,10 gN/kg tuoretta *;* haketta. Lisäys on sopivasti välillä 0,07 - 0,3 g N/ kg, edullisesti välillä 0,10 - 0,23 g N/kg *...' tuoretta haketta, edullisemmin 0,13- 0,20 g N/kg tuoretta haketta (0,13 g N vastaa 0,5 g » » * ammoniumkloridina). Yli 0,3 g N/kg voidaan lisätä, mutta jos typpimäärä ylittää hakkeessa 115221 7 kasvavien mikrobien taipeen, se on taloudellisesti kannattamatonta ja ylimäärä voi esimerkiksi jätevesien kautta kuormittaa prosessia ja ympäristöä.

Typpi voidaan lisätä typen suolana kuivana tai nestemuodossa. Edullisinta typpilisäys on 5 tehdä nesteenä, joka voidaan lisätä hakkeeseen kaatamalla, suihkuttamalla jne. Haketta voidaan typen lisäämisen yhteydessä sekoittaa, niin että typpilisäys tulee tasaisesti hakemassaan. Typpi voidaan lisätä myös esimerkiksi haketuksen yhteydessä, millä voidaan varmistaa, että typpi jakautuu hakkeeseen tasaisesti.

10 Hakkeen mikro-organismien kasvulle sopivilla olosuhteilla tarkoitetaan olosuhteita, joissa mikro-organismien kasvuun vaikuttavat tekijät, kuten lämpötila, kosteus ja ilmastus on saatettu mahdollisimman edullisiksi. Hakkeen lämpötila pyritään pitämään käsittelyn ajan 5 - 40 °C:ssa, edullisesti 10-40 °C:ssa, edullisemmin 15- 30 °C:ssa, edullisimmin 20- 30 °C:ssa. Hyvin alhaisissa lämpötiloissa mikro-organismit eivät kasva eivätkä kykene 15 hajottamaan uuteaineita, hyvin korkeissa lämpötiloissa niiden kasvu estyy myös. Jos halutaan edistää mesotlilisten sienten kasvua, edullisimpia ovat lämpötilat välillä 22- 30 °C. Yli 35 °C:een lämpötilat alkavat olla liian korkeita mesofiileille. Lämmenneissä hakekasoissa esiintyy termofiilisiä mikrobeja, sieniä ja bakteereita, joiden optimilämpötila on 45 - 50 °C, mutta esillä olevan keksinnön mukaan edullisinta uuteaineiden hajoamisen 20 kannalta on pitää olosuhteet sopivina mesofiilisten mikro-organismien kasvulle.

* Hakkeen kosteus pyritään pitämään noin 40 - 80 %:n välillä, edullisesti 50 - 70 %:n välillä. Edullisin hakkeen kosteus mikrobitoiminnalle on noin 60 %.

; 25 Mikro-organismiviljelmällä, joka kykenee vähentämään pihka-aineiden määrää hakkeessa, ... ‘ tarkoitetaan mikro-organismiviljelmää, joka kykenee hajottamaan hakkeen uuteaineista vähintään 10 %, edullisesti vähintään 20 % kontrolliin verrattuna. Mikro-organismi-• * *: viljelmä voi olla jokin sieni, kuten sinistäjäsieni tai valkolahottaja. Mikro-organismi voi •; ·' olla home tai bakteeri. Edullisesti mikro-organismi on sellainen, ettei sillä ole huomattavaa '.., · 30 sellulaasi- tai hemisellulaasiaktiivisuutta, mikä johtaisi massan saannon pienenemiseen.

* ' Mikro-organismiviljelmä voi olla esimerkiksi kaupallinen tuote, kuten Cartapip™. Tässä : ' : keksinnössä havaittiin, että erityisen edullinen puun uuteaineita hajottava mikro-organismi

': * '1 on mesofiilinen sinistäjäsieni, jota edustaa kanta C, joka on talletettu numerolla DSM

15309.

S

115221

Mikro-organismiviljelmä siirrostetaan hakkeeseen myseelijauheena, suspensiona, tai nesteenä. Neste voi olla vesiliuos, puskuriliuos tai siirrostus voidaan tehdä kasvatusliu-oksen mukana, jota mahdollisesti on laimennettu vedellä tai puskuriliuoksella. Siirros 5 voidaan tehdä yhdessä typpilisäyksen ja muiden ravinnelisäystcn kanssa. Lisäys voidaan tehdä kaatamalla, suihkuttamalla, sivelemällä tai käsittelemällä jollakin muulla tavoin hakkeen pinta. Siirros sisältää edullisesti 10's - 10K, edullisesti 10(l - 107 mikro-organis-misolua tai -itiötä (pesäkkeitä muodostavaa yksikköä)/g tuoretta haketta. Edullista on sekoittaa haketta siirroksen lisäämisen yhteydessä. Haketta sekoitettaessa myös hapen 10 saanti hakekasassa paranee. Hakekasan ilmastusta voidaan parantaa myös kasvatuksen aikana johtamalla ilmaa hakepatjan läpi. Hakekasa voidaan varustaa esimerkiksi ilmastointiputkin ja tai reiällisin levyin. Siirrostus voidaan tehdä myös haketuksen yhteydessä, vastaavalla tavoin kuin typen (ja mahdollisesti muiden ravinteiden) lisääminen. Haketta voidaan tällöin sekoittaa esimerkiksi ruuvikuljettimella.

15

Mikro-organismiviljelmä voidaan säilyttää siirrostamista varten esimerkiksi kylmäkuivattuna tai nestemäisenä, jolloin se voi olla esimerkiksi konsentroitu sienirihmastosuspensio tai itiösuspensio ja siihen on voitu lisätä esimerkiksi stabilointiaineita ja/tai säilöntäaineita. Mikro-organismiviljelmä voi olla myös esimerkiksi jauhemuodossa.

20 ”· j Koska tämän keksinnön mukaan huomattava osa, 30 - 40 %, puun uuteaineista saadaan hajoamaan pelkän typen avulla (ilman typpi 1 isäystä noin 10%), haketta ei ole välttämä- , , töntä siirrostaa ollenkaan puun uuteaineita hajottavilla mikro-organismeilla. Tämä luon- : nollisesti yksinkertaistaa huomattavasti hakkeen esikäsittelyä ja alentaa kustannuksia.

_!.. * 25 Siirroksen säilyttämiseen, käsittelyyn ja levittämiseen ei tarvitse käyttää aikaa eikä tiloja » » eikä siitä aiheudu kustannuksia.

• * • » · • · · I i « * . · · ·, Hakkeen käsittelyaika eli aika typen, mahdollisten muiden ravinteiden ja mikro-organis-

• I

* ♦ » • , mien lisäämisestä hakkeen jatkokäsittelyihin voi vaihdella 4 päivästä 8 viikkoon, edulli- 30 sesti aika on 1 - 4 viikkoa, edullisimmin 1 - 2 viikkoa.

" · · · ’ Käsiteltävä hake voi olla mitä tahansa mekaaniseen tai kemialliseen massan valmistukseen '* * käytettävää haketta, havupuuta, kuten mäntyä tai kuusta tai lehtipuuta kuten, haapaa, 115221 <) koivua, leppää tai eukalyptusta, akaasiaa tai poppelia. Jos käsittelyssä käytetään kantaa (', käsittely sopii hyvin kuusihakkeelle.

Tämän keksinnön yhteydessä todettiin, että höyrytys parantaa mikro-organismisiirroksen 5 kasvua hakkeessa. Koska höyrytys kuitenkin tuhoaa olennaisen osan varsinkin puun pinnalla luonnostaan olevista mikrobeista, höyrytystä ei kannata käyttää, ellei haketta siirrosteta. Jos hake siirrostetaan, sopiva höyrytys on 100 °C 2- 20 min, edullisesti 3-10 min, edullisimmin 3-5 min.

10 Esimerkki 1

Kuusihakkeella tehtiin kaksi koetta, joista toisessa testattiin sinistäjäsienikantojen A, B ja C stabiilisuutta uuteaineiden hajotuksen suhteen. On todettu, että uuteaineiden hajotuksessa on suuria kantakohtaisia eroja, täysin tehottomasta erinomaiseen hajotukseen 15 (Farrell et ai.1998). Koska haluttiin varmistua siitä, että kanta C on stabiili uuteaineiden hajotuksen suhteen, kannasta tehtiin useita eri siirroksia, joita verrattiin keskenään. Toisessa kokeessa seurattiin uuteaineiden hajotuksen lisäksi sienten kasvukykyä tuoreessa ja höyrytetyssä hakkeessa. Kokeen perusteella valittiin pilottikokeessa käytettävä sieni.

20 Kasvatuksissa käytettiin tuoreena pakastettua seulottua kuusihaketta (pintapuuta). Haketta : käytettiin sellaisenaan (tuore hake) sekä höyrytettynä. Höyrytysajaksi valittiin 2 minuuttia.

Kokeilemalla eri aikoja todettiin, ettei mikrobiaktiivisuus vähene (FDA:n eli fluores-keiinidiasetaatin hajoamisena mitattuna) sanottavasti, jos höyrytysaikaa pidennetään ‘ · ‘ viiteen minuuttiin. Hake höyrytettiin pienissä erissä (100 g) ja kun siinä oli alkujaan ‘^: 25 alhainen mikrobitaso, kaksi minuuttia todettiin riittäväksi.

Hakkeessa kasvatettiin kolmea sinistäjäsienikantaa (kannat A, B ja C). Vertailusienenä oli Ίϋ Cartapip™ (Albinex™), Ophiostoma piliferum -sienen vaalea muunnos. Siirrokset kasva- ’·’ tettiin mallasliemessä. Kantoja A, BjaC siirrostettiin 106solua /g haketta (tuorepaino) ja »ti ’ ’ ·' ’ 30 Cartapip™ -tuotteesta valmistettiin käyttöohjeen mukaan vastaava siirros.

(MM k » : ·1 Kasvatukset tehtiin 250 ml kartiopulloissa, joissa oli 30 g haketta (tuorepaino)/pullo. Kas- vatuslämpötila oli 28 °C, hakkeen kosteus kokeen alussa n. 60%. Pulloja ilmastettiin 3 ΙΟ 115221 kertaa viikossa sienilisiiodatctiilla paineilmalla. Hakkeen käsittelyajat olivat 4, 7, l() ja 14 päivää, stabiilisuuskokecssa 7 ja 14 päivää. Rinnakkaispullqja oli kolme.

Kasvatuksen päätyttyä hakkeesta määritettiin uuteaineiden kokonaismäärä uuttamalla 5 asetonilla (TAPPI standardi T 204 om-88). Asetoniuutteesta määritettiin uuteaineryhmät kaasukromatografisesti (Örsä & Holmbom 1994). Jälkimmäisessä kokeessa tehtiin myös FDA-määrityksiä aktiivisen biomassan seuraamiseksi (FDA- lluoreskeiinidiasetaatti, josta entsymaattisesti vapautuu värillistä yhdistettä, jonka määrä on suhteessa mikrobiaktii-visuuteen) (Boyle & Kropp 1992). Sienten kasvua seurattiin myös mikroskopoiden sekä 10 tarkkailtiin mahdollisia värinmuutoksia.

Siirrosten väliset erot olivat melko pieniä sekä kokonaishajotuksen että eri uuteaineryh-mien hajotuksen suhteen, samaa luokkaa kuin rinnakkaisten välillä. Kuviossa 1 on esitetty kantojen A, B ja C kahden eri siirroksen kokonaisuuteaineiden hajotus ja kuviossa 2 15 uuteaineryhmittäin (kannat Aja C) kahden viikon kasvatuksessa tuoreessa hakkeessa. Kokonaisuuteaineista hajosi siirrostamattomassa kontrollissa runsaat 20% . Cartapip™ hajotti n. 40%,ja kanta C yli 40%, kannat Aja B n. 35%. Yksittäisistä uuteaineryhmistä vähenivät selvästi triglyseridit ja steryyliesterit, sterolien määrä puolestaan nousi.

20 Tuoreesta ja höyrytetystä siirrostamattomasta hakkeesta tehtiin asetoniuutto ja määri- '.i tettiin eri uuteaineryhmät. Höyrytetyssä hakkeessa oli uuteaineiden kokonaismäärä suurempi kuin tuoreessa. Uuteaineryhmistä triglyseridejä oli höyrytetyssä hakkeessa moninkertaisesti tuoreeseen verrattuna (kuvio 3). Koska triglyseridit ovat niitä yhdisteitä, • joiden varassa tuoretta puuta kolonisoivat sienet kasvavat (Breuil et. ai. 1998), triglyseri- ’ * 25 dien huomattava lisäys parantaa ko. sienten kasvuolosuhteita tuoreeseen hakkeeseen verrattuna.

’'!! Kokeessa seurattiin eri sienten kasvua ja uuteaineiden hajotusta tuoreessa ja höyrytetyssä • ‘ hakkeessa. FDA -mittausten perusteella kaikki sienet kasvoivat paremmin höyrytetyssä

*·'* 30 hakkeessa (kuvio 4), mutta Cartapip™-tuotteella ja kannalla C höyrytyksen vaikutus FDA

-aktiivisuuteen oli paljon pienempi kuin muilla. Höyryttämättömässä hakkeessa mikrobi-• ·' taso pysyi alhaisena sekä siirrostamattomissa kontrolleissa että siirrostetuissa pulloissa.

Höyryttämättömässä hakkeessa siirroskantojen niukka kasvu ei johtunut heikosta kilpailukyvystä, koska hakkeen mikrobiaktiivisuus oli hyvin alhainen. Koska höyrytys selvästi 115221 11 edisti kaikkien sienikantojen kasvua, voi kyse olla ravinteiden saatavuuden paranemisesta. Triglyscridit ovat helppokäyttöisiä hiilenlähteilä, ja jos ne höyrytetyssä hakkeessa ovat helpommin mikrobien saatavilla, höyrytys parantaa kasvuolosuhteita. Höyrytyksessä voi myös poistua tuoreessa hakkeessa mahdollisesti olevia ja höyrytyksessä haihtuvia inhi-5 hoivia yhdisteitä. Eri uuteaineryhmistä vapaita rasvahappoja ja hartsihappoja on höyrytetyssä hakkeessa vähemmän kuin tuoreessa. Mahdollisesti höyrytys vaikutti puun rakenteeseen siten, että siirroskantojen kasvu helpottui.

Uuteaineista määritettiin kokonaismäärä 7 ja 14 päivän kasvatuksissa (taulukko 1). Korkea 10 FDA-aktiivisuus (kuvio 4) ei aina korreloinut uuteaineiden hajoamiseen, sillä sekäCarta-pip™ että kanta C kasvoivat FDA -aktiivisuuden perusteella heikommin kuin muut höyrytetyssä hakkeessa, mutta hajottivat uuteaineista viikossa n. 30% enemmän siirrostamat-tomaan kontrolliin verrattuna. Myös kannat Aja B hajottivat uuteaineita tehokkaasti, ja näillä kannoilla myös FDA -aktiivisuus oli selvästi noussut höyrytetyssä hakkeessa. Tuo-15 reessä hakkeessa kaikkien kantojen FDA-aktiivisuus oli alhainen, eikä uuteaineista ollut viikossa hajonnut enempää kuin siirrostamattomassa kontrollissa (17%), kannalla B jopa vähemmän. Cartapip™ -käsittelyltä edellytetään, että ainakin 20% uuteaineista hajoaa alle kolmessa viikossa steriiliin kontrolliin verrattuna (Farrell et ai. 1999). Tähän selvästi päästiin ainakin kannoilla A, B ja C.

20 • · • » · ··· · Tuoreessa hakkeessa siirroskannoista oli tehokkain kanta C, joka hajotti uuteaineista kahdessa viikossa 40%. Referenssisienituote Cartapip™ hajotti 35% ja vanhennetussa * · , . kontrollissa (ei sientä) uuteaineista hajosi 27%. Höyrytetyssä hakkeessa kanta C oli • · · • · * ! ! selvästi referenssisientä tehokkaampi. Koska höyrytetyssä hakkeessa uuteaineita, varsin- * · · * « · 25 kin helposti hajoavia triglyseridejä, oli selvästi enemmän kuin tuoreessa hakkeessa, • · uuteaineista myös hajosi suurempi osuus kuin tuoreessa hakkeessa. Sienet hajottivat : ,·. kokonaisuuteaineista 40 - 50%, ja korkeammasta lähtötasosta huolimatta lopputaso oli • · · , · * *, jopa alempi kuin tuoreessa hakkeessa.

t · · » • · ... 30 Taulukko 1. Uuteaineiden hajoaminen kuusihakkeessa. Kasvatusaika 7 ja 14d.

< t I

» » p - — - - .1 . —.1 I ----- ----- " I

yy Tuore hake, uuteaineet mg/g__Höyrytetty hake, uuteaineet mg/g */>· Sieni pd Il4d Sieni fTd Il4d 0-kontrolli 14,1 14,1 _ 0-kontrolli ~16,7 16,7

Ei sientä 11,6_10,3__Ei sientä |14,6 15,6_ 115221 12

Cartapip |11,2 Ϊ9^2 Γ ICartapip 10,4 [9^4

Kanta A ΤΠβ Ϊ09 Kanta A ΪΤΪ Ö2

Kanta Β 12,7 9,5 Kanta Β 10,3 8,8

Kanta C 10,9_M__Kanta C 9,7_8,1_ “ Πί sieniä" vanhennettu kontrolli, Cartapip referenssisieni (muunneltu Ophinsttmu pilifcnmi)

Tuoreen hakkeen vapaista rasvahapoista kanta C hajotti kahdessa viikossa 76%, Carta-5 pip™ 71% ja vanhennetussa kontrollissa hajosi 57%. Hartsihappojen hajotuksessa kanta C, Cartapip™ ja kontrolli olivat samaa tasoa (yli 30%). Steryyliestereistä Cartapip™ hajotti eniten (76%), kannat Λ, B ja C yli 70%, mutta kontrollissakin hajotus oli lähes yhtä hyvä. Triglyseridit hajosivat kaikilla sekä siirroskannoilla että kontrollissa hyvin. Analysoitujen uuteaineiden yhteismäärästä (11,6 mg/g puun kuiva-ainetta) vanhennetussa 10 kontrollissa hajosi kahdessa viikossa 53%, paras sieni 1. kanta C hajotti 57% (kuvio 5). Höyrytetyssä hakkeessa kanta C oli Cartapip™-tuotetta tehokkaampi steryyliesterien ja vapaiden rasvahappojen hajotuksessa. Tuoreessa hakkeessa ero tasoittui, koska uuteaineiden hajoaminen hakkeen omien mikrobien toimesta oli tehokasta. Hartsihappojen hajotus näyttää johtuneen suureksi osaksi luontaisten mikrobien aktiivisuudesta, koska höyryte-15 tyssä hakkeessa hajotus oli selvästi heikompaa kuin tuoreessa hakkeessa (kuvio 6). Testatuista sienistä pilottikokeisiin valittiin kanta C, koska se kasvaa hyvin tuoreessa hakkeessa eikä hakkeen lämpökäsittely ole tarpeen, se hajottaa kokonaisuuteaineista kahdessa viikossa 10-20 % enemmän kuin ns. vanhennetussa kontrollissa, kanta hajottaa tehokkaasti kuusen uuteaineita ja sienisiirrosten tuotto käsiteltäville hake-erille on j 20 hiivamaisen kasvutavan ansiosta suhteellisen helppoa.

. . Esimerkki 2 . · · · t Laboratoriokokeiden perusteella valitulla sinistäjäsienikannalla C, tehtiin pilottikokeet 25 kahdella eri kuusihakkeella. Molemmissa oli mukana Cartapip™ referenssikantana.

.:. Kokeissa käsiteltiin n. 150 ja 25 kilon hake-eriä.

* i t . L t Pilottikokeeseen 1 käytettiin keväällä (huhtikuussa) haketettua ja tuoreena pakastettua ,,,,; kuusen pintapuuta. Toinen erä haketettiin syksyllä (lokakuussa) toista pilottikoetta varten, 30 ja se käytettiin tuoreena. Laboratoriokokeita varten hake seulottiin, mutta pilottikokeissa ' ’, käytettiin seulomatonta haketta. Hake käytettiin joko sellaisenaan (“tuore hake“) tai höyrytettynä.

115221 13

Pilottikokect tehtiin 450 I kompostoreissa ulkona (pilotti 1, siinostamaton ja kannalla (' siirrostettu tuore hake) ja sisätilassa 80 I kannellisissa muovisaaveissa, joihin porattiin reikiä ilmanvaihdon helpottamiseksi (pilotti 1 ja 2). Saavikokeissa oli tuore siirrostamaton 5 hake, kannalla C ja Cartapip™-tuotteella siirrostettu tuore hake sekä höyrytetty, kannalla C siirrostettu hake. Pilottikokeita varten höyrykäsittely tehtiin autoklaavissa: hake lämmitettiin 100 C’:een ja jäähdytettiin välittömästi 80 C°:een. Koko käsittelyn kesto oli n. 20 minuuttia.

10 Kannan C siirros kasvatettiin mallasliemessä ravistelijassa 2 - 3 d. Cartapip ™ (nyk. nimellä Albinex™)-siirros tehtiin valmistajan ohjeen mukaan. Kantaa C sekä Cartapip™ siirrostettiin 106solua/g haketta (tuorepaino).

Kompostoreissa käsiteltiin n. 150 kg haketta/kompostori ja saaveissa n. 25 kg/saavi.

15 Hakkeen kosteus säädettiin siirrostaessa n. 60%:iin tuorepainosta. Kannalla C siirrostetun kompostorin lämpötilaa seurattiin jatkuvasti, samoin ulkoilman lämpötilaa. Sisätilassa olevista saaveista mitattiin lämpötila päivittäin. Saaveista ja kompostoreista otettiin näytteet uuteaineita varten 7d kuluttua ja kokeen lopussa 16 d kuluttua.

20 Kokonaisuuteaineet määritettiin Tappi standardin (T 204 om-88) mukaan, mutta uuttoliu-:.: : oksena oli asetoni. Uuteaineaineryhmät määritettiin Örsän ja Holmbomin (1994) mukaan.

Ensimmäisessä kokeessa hake otettiin sulamaan kaksi päivää ennen kokeen alkamista, ' ί mutta sulaminen oli isohkoissa säkeissä ennakoitua hitaampaa, ja hake oli vielä siirrostet- 25 taessa viileää. Kompostoreissa lämpötila ei noussut kokeen aikana yli 20 asteen, mutta pysyi ulkoilmaa lämpimämpänä ilman viiletessä kokeen toisella viikolla (kuvio 7). Saaveissa lämpötila oli sama kuin huoneen lämpötila, paitsi höyrytetyn hakkeen osalta, joka ‘;;; oli kokeen alussa höyrytyksen takia muita lämpimämpää. Saavit oli sijoitettu laitetilaan, '! ‘ jonka lämpötila laski kokeen puolivälissä selvästi (kuvio 8).

:···: 30

Asetoniliukoisista uuteaineista hajosi vanhennettuun kontrolliin verrattuna alle 10% ja '.· kannan C ja Cartapip™-tuotteen väliset erot olivat varsin pienet (taulukko 2). Muutokset ' ' : uuteaineryhmittäin on esitetty kuvioissa 9 ja 10. Kompostoreissa alhainen lämpötila vaikutti hajotustulokseen. Saavikasvatuksissa lämpötila puolestaan oli kokeen I4 1 1 5221 alkupuolella varsin korkea, ja uuteaineista hajosi vanhennetussa kontrollissakin yli 30%. Kanta C oli vähän tehokkaampi kuin referenssi kanta Cartapip™ uuteaineryhmittäin verrattuna.

5 Taulukko 2. Asetoniliukoisct uuleaineet mg/g (% liajonmit) pilottikokeessa l._

Kompostorit _ lnkubointiaika_ _Od 7d 16d

Kontrolli"__17/)__13,5 (21)__14,7 (14)_

Kanta C___12,5 (26)__13,2(22)_

Saavit _lnkubointiaika_ _ Od 1 7d 16d

Kontrolli"__[7,0__12,3 (28)__11,2(34)__

Cartapip___11,9 (30) _______10,2 (40)

Kanta C__11,0(35) " " 10.6(36)_

Kanta C + höyrytys 17,6__11,8 (33)__10,6 (36)_ " vanhennettu kontrolli (luonnollinen kasvusto) 10

Kokeessa 2 käytettiin tuoretta (pakastamatonta) haketta ja koe tehtiin saaveissa sisätilassa. Koejärjestely oli sama kuin kokeessa 1. Lämpötila oli koko kokeen ajan n. 20°C. Selvä kasvu oli todettavissa viidentenä päivänä kokeen alusta. Asetoniliukoisten uuteaineiden 15 hajoaminen on esitetty taulukossa 2 ja muutokset uuteaineryhmittäin kuviossa 11.

Taulukko 3. Asetoniliukoiset uuteaineet mg/g (% hajonnut) pilottikokeessa 2.

5 Käsittely lnkubointiaika ! "Öd p7d [Tid ’ ! Kontrolli3 23/7 17,4 (27) 18,2 (23) I Cartapip 24/Ϊ 15,3(35) ·] KantaC 15,7 (34) 13,4(43)

Kanta C + 16^6 17/7 13,1 (21) .:. höyrytys ; ‘: 3 vanhennettu kontrolli (luonnollinen kasvusto) ,,,,: 20 Hakkeiden uuteainepitoisuudessa oli iso ero: kokeessa 1 17,0 mg/g ja kokeessa 2 23,7 mg/g. Kokeessa 1 käytettiin keväällä haketettua puuta ja kokeessa 2 syksyllä haketettua puuta, molemmat pintapuuta. Hakkeiden uuteainekoostumus ryhmittäin on esitetty kuvi- 115221 15 ossa 14. Kirjallisuustietojen mukaan tuoreen kuusen nscloniuutcpitoisuus on n. 2,2 % (Fcngel & Wegener, 1989).

Kokonaisuutcaineiilen hajotuksessa siirroskantojen osuus verrattuna vanhennettuun 5 kontrolliin oli suurempi kuin kokeessa I, osin koska hajotus kontrollissa oli tehottomampaa.

Kannan C hajotusta voidaan pitää varsin hyvänä: 20% vanhennettuun kontrolliin verrattuna (yli 40% kokonaisuuteaineista) ja hartsihapol ja steryyliesterit vähenivät selvästi. Kanta C 10 oli kaikkien analysoitujen uuteaineryhmien hajotuksessa tehokkaampi kuin Cartapip™.

Kanta C kasvoi höyrytetyssä hakkeessa erittäin hyvin, mutta uuteaineiden hajoamista höyrytys ei edistänyt. Runsaalla siirroksella päästiin samaan tulokseen kuin edistämällä siirroskannan kilpailukykyä hakkeen lämpökäsittelyllä. Kannan C vaikutus höyrytetyn 15 hakkeen uuleaineisiin on esitetty uuteaineryhmittäin kuvioissa 12 ja 13.

Esimerkki 3

Ravinnekokeet tehtiin 250 ml kartiopulloissa, 30 - 50 g haketta (tuorepaino)/pullo. Hak-20 keen kosteus säädettiin kasvatusten alussa n. 60 %:iin tuorepainosta. Ravinnekokeissa käytettiin tuoretta haketta ja erilaisia ravinteita yhdessä kannan C kanssa ja ilman. Kasva-tuslämpötila oli kokeesta riippuen joko huoneenlämpö (20 - 22 °C) tai 28 °C ja kasvatus-aika 7 tai 14 d. Lämpötilakokeessa käytettiin höyrytettyä haketta eri lämpötiloissa (22,28, ; 32 ja 37°C). Kasvatuspulloja ilmastettiin kolme kertaa viikossa steriilillä paineilmalla.

25

Ravinnekokeessa 1 hakkeeseen lisättiin tavallisia mikrobiologisia kasvatusliuoksia kuten . . TSB(=Trypticase Soy Broth) ja ME(=Malt Extract), joista edellistä käytettiin 4 ml/30 g > 1 · haketta ja jälkimmäistä 0,2 ml/30 g haketta. Kasvatuslämpötila oli 28°C ja kokeen kesto 14 t d. Tuoreen hakkeen uuteainepitoisuus oli 17,6 mg/g. Kontrollihakkeessa uuteaineista • » · i · 30 hajosi pilottikokeessa ja ravinnekokeessa lähes yhtä suuri osuus (23 ja 26%), ravinne- ';' kokeessa TSB-lisäyksellä hajosi 41 %. Mallasuutelisäyksellä saatiin muutaman prosentin ' .. ‘ parannus kontrollihakkeeseen verrattuna. Siirroskannalla C saatiin edelleen muutaman ’ 1 ’: prosentin parannus verrattuna pelkkään ravinnelisäykseen. Tuloksista nähdään, että ravinteilla oli selvä vaikutus asetoniliukoisten uuteaineiden hajoamiseen (taulukko 4).

115221 K)

Taulukko 4. Tavallisten mikrobiologisten kasvatusliuosten vaikutus laiteaineiden hajoamiseen. Tuoreen hakkeen uuteainepitoisuus I7,6mg/g.

Ravinnelisäys Uuteainect mg/g Uuteaineista hajonnut %

Vesi 13,0 26 ~ME ΓΠ8 33 TSB KU 41 ME + kanta C KU 39 TSB + kanta C ~9A "47 ' : " 5

Ravinnekokeessa 2 (taulukko 5) hakkeeseen lisättiin yksittäisiä ravinteita ja niiden yhdistelmiä. Kasvatus tehtiin huoneen lämpötilassa, mutta muuten samoin kuin koe 1.

Tuoreen hakkeen uuteainepitoisuus oli 14,0 mg/g. Sekä siirrostamattomassa että siir-rostetussa hakkeessa tehokkain hajotus saatiin lisäämällä ammoniumtyppeä tai runsas-10 ravinteista kasvatusalustaa (THG), joka otettiin mukaan positiivisena kontrollina. Kannan C osuus hajotuksesta oli samaa luokkaa kuin kokeessa 1, alle 10 %. Glukoosin vaikutuksesta uuteaineiden hajotus lähes estyi siirrostetussa hakkeessa. Tärkkelyksellä puolestaan saatiin selvä positiivinen vaikutus sekä yksin että yhdessä ammoniumtypen kanssa lisättynä.

!.·: » » · t * . Taulukko 5. Yksittäiset ravinteet ja niiden yhdistelmät. Tuoreen hakkeen uuteainepitoisuus /t . 14,0 mg/g.

* * · · ./ Siirrostamaton Siirrostettu (kanta C)

Ravinnelisäys

Uuteaineet Uuteaineet mg/g hajonnut % mg/g hajonnut % "Vesi Ϊ23 12 lp 14 Tärkkelys 1% Tp 19 %Γ 35

Glukoosi 1% lp Ϊ6 lp 2 ’ Ammomumtyppi (N) 8,6 39 8,1 42 Tärkkelys+N lp 21 p 39 115221 17 I liivauule 0.02% ΓΪΤ,3 ΓΪ9 8,7 ΓΤχ Tärkk. ι N i hiivauute 9,7 31 9,0 36 THG ^ P ^ "36 p " ™44

Typen (N)määrä 0,13g/kg tuoretta haketta; THG, tryptoni-hiivauute-glukoosi -alusta

Kokeessa 3 tutkittiin uuteaineiden hajotusta viikon kasvatuksessa (28°C).

5 Ravinnelisäyksenä käytettiin tavallisimpia mikrobien yleiskasvatusalustoja, joita annosteltiin 4 ml/50 g haketta. Runsasravinteisin lisäys tuotti jälleen tehokkaimman hajotuksen. Siirrostetussa hakkeessa laimean NB -lisäyksen (1/4 NB) vaikutus oli selvempi kuin siirrostamattomassa hakkeessa. Siirroksen koko ei vaikuttanut hajotustulokseen (taulukko 6).

10

Taulukko 6. Ravinteiden vaikutus lyhytaikaisessa hakkeen käsittelyssä.

Siirrostamaton Siirrostettu (C)

Lisäys Uuteaineet Uuteaineet mg/g Hajonnut % mg/g Hajonnut %

Vesi LM) 7 Ϊ23 12 ME+hiivauute 0.01% Ϊ7/7 16 ΪΤ,6 17 ·· ; ~m lp 29 p 34 ] 1/4 NB LL4 19~ ‘ %9 29 NB + iso siirros 9,3 34 "pd 12^8 9 ip 22 • » NB, nutrient broth; PD, potato dextrose; iso siirros, 5-kertainen solumäärä tavanomaiseen 15 siirrokseen verrattuna.

» * » · * * · • »

Tulokset osoittivat selvästi, että siirroksen ravinteet vaikuttavat uuteaineiden hajoamiseen.

' [ *. Typpilisäys mahdollistaa sellaistenkin mikrobien kasvun, jotka eivät ole sopeutuneet puun 4 a niukkatyppiseen ympäristöön. Tärkkelyksen vaikutus kannalla C siirrostetussa hakkeessa ‘ \ 20 (ravinnekoe 2) oli hyvin selvä. Tärkkelys on puuta kolonisoivien mikrobien tärkeä hiilen- lähde. Typen vaikutus uuteaineiden hajoamiseen näkyi kannalla C siirrostetussa hakkeessa selvästi pienemmillä typpiannoksilla kuin siirrostamattomassa hakkeessa, ja erot eri 115221 18 lisäysten välillä olivat varsin pienet. Runsasravinteisilla ja typekkäillä lisäyksillä (kasvatusalustat TSB, TUG, NB) hakkeen oma mikrobisto hajotti uuteaineita tehokkaasti ja kannalla C saatiin vain muutamien prosenttien parannus. Kannan C vaikutus oli selvempi silloin, kun hakkeeseen lisättiin niukemmin typpeä (laimea kasvatusalusta (1/4 NB, 5 hiivauule). Glukoosilla oli hyvin vähän vaikutusta ja kannalla (' uuteaineiden hajotus näytti lähes estyneen glukoosin vaikutuksesta. Kontrollia pienempi uuteaineiden hajotus voi johtua siitä, että suuren siirroksenkin takia kilpailukykyinen kanta C ei käytä uuteaineita hiilcnlähtccnään kun glukoosia on poikkeuksellisesti käytettävissä. Puussa kuitenkin lipidit ovat edullisempi energian lähde kuin liukoiset sokerit, joita puussa on paljon vähemmän H) (Fleet ym. 1999). On todettu, että Cartapip™ tuottaa jo hyvin nuorissa viljelmissä solunul-koisia lipolyyttisiä entsyymejä, kun kasvualustassa on typenlählecnä hiivauutetta ja hiilenlählecnä oliiviöljyä. Peptoniglukoosialustalla entsyymien tuotto käynnistyy selvästi myöhemmin (George ym. 1999).

15 Liuosviljclmissä on tutkittu erilaisten hiilen-ja typenlähteiden vaikutusta Ophiostoma piceue -sinistäjäsienen rihmaston väriin: mm. tärkkelyksellä ja ammoniumkloridilla on tuotettu valkoista rihmastoa, useilla muilla hiili-typpi -yhdistelmillä eriasteisia ruskeita ja harmaita, jopa mustia (Eagen ym. 1999). Kokeessa 2 tärkkelys-ammoniumkloridi -lisäyksellä hake pysyi vaaleana, mutta mainittavaa tummumista ei havaittu muissakaan ko.

20 kokeen hakkeissa riippumatta siitä oliko ne siirrostettu vai ei. Rihmaston tummumiseen vaikuttaa mm. mikrobien välinen kilpailu (Yang, 1999).

Asetoniliukoisten uuteaineiden määrä väheni kahden viikon aikana 20 - 30 % kontrolliin ; Ί verrattuna pelkästään lisäämällä hakkeeseen ravinteita. Siirroskannoilta edellytetään n.

• · ;>t: 25 20% parannusta uuteaineiden hajoamiseen. Siirroskanta C lisäsi hajotusta alle 10%, kun ravinteita lisättiin runsaasti. Kannalla C saatiin suurempi lisäys silloin, kun ravinteita lisät- . . tiin niukemmin. Hakkeen oma mikrobisto voi olla monipuolisempi uuteaineiden hajotuksi. ‘ sessa kuin siirroskanta, mutta samalla rakennepolymeerien hajoamisen riski kasvaa.

» • · * I · ‘ 30 Kannan C kasvua seurattiin lämpötila-alueella 20 - 37°C. Kokeessa käytettiin höyrytettyä haketta. Kokonaisuuteaineiden hajotus eri lämpötiloissa on esitetty kuviossa 15. Kannalla ·...· C on tyypillinen mesofnlinen kasvualue.

* * · 115221 ΙΟ

Kirjallisuusviitteet:

Behrendt, C.J. & Blanehettte, R.A. 1997. Biological processing of pine logs for pulp and paper production with Phlehiopsis gigantea.Appi environ Microbiol. 63(5): 1995-2000.

5 Boyle, C.D. & Kropp, B.R. 1992. Development and comparison of methods for measuring growth of filamentous fungi on wood. Can. J. Microbiol. 38: 1053-1060.

Breuil, C., Iverson, S. & Gao, Y. 1998. fungal treatment of wood chips to removeextractives, p. 541-565. Environmentally Friendly Technologies for the Pulp and Paper Industry. Young, R.A. & Akhtar, M„ eds. John Wiley& Sons, New York.

10 Dorado, J., Claassen, F.W., van Beek, T.A., Lenon, G., Wijnberg, J. & Sierra-Alvarez, R. 2000a. Elimination of softwood extractives by white rot fungi. J. Biotechnol. 80: 231-240. Dorado, J., Claassen, F.W., Lenon, G., van Beek, T.A., Wijnberg, J. & Sierra-Alvarez, R. 2000b. Degradation and detoxification of softwood extractives by sapstain fungi. Bioresource Technology 71: 13-20.

15 Eagen, R., Brisson, A. & Breuil, C. 1999. The sap-stain fungus Ophiostomapiceae synthesizes different types of melanin in different growth media. Can. J. Microbiol. 43: 592-595.

Farrell, R.L., Hata ; K. & Wall, M.B. 1998. Solving pitch problems in pulp and paper processes by the use of enzymes or fungi, p. 197-212. Advances in Biochemical 20 Engineering Biotechnology, vol. Biotechnology in pulp and Paper Industry. Eriksson, K.-; E. L., Ed. Springer, Berlin.

:*'i Farrell, R.L., Hadar, Y., Wendler, A. & Zimmermann, W. 1999. US Patent 5,998,197.

Dec.7, 1999. (Fungi for pitch reduction and their preparation.) ,'·· Fengel, D. &Wegener, G. 1989. Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions. Berlin, de '•j 25 Gruyter.p. 182. ISBN3 11-012059-3.

,· Fischer, K., Akhtar, M., Blancette, R. A., Bumes, T.A., Messner, K. & Kirk, T.K. 1994.

Reduction of resin content in wood chips during experimental biological processes.

. : Holzforschung 48: 285-290.

' · · · ’ Fleet, C., Breuil, C. & Uzunovic, A. 2001. Nutrient consumption and pigmentation of deep 30 and surface colonizing sapstain fungi in Pinus contorta. Holzforschung 55: 340-346.

George, E., Tamerler, C., Martinez, A., Martinez, M.J. & Keshavarz, T. 1999. Influence of i' * ‘: growth medium composition on the lipolytic enzyme activity of Ophiostoma piliferum ' " i (Cartapip™). J. Chem. Technol. Biotechnol. 74: 137-140.

115221 20 dc Koker.T.II., Zhao, J., Allsop, S.F. & Jansc, BJ.il. 2000. Isolation and enzymic characterisation of South African white-rot fungi. Mycol. Res. 104: 820-824.

Hatakka, A., Mettälä, A., Elimen, J. & Maijala, P. 2000. Evaluation of fungi lor bio-Kraft pulping of softwood. Proceedings of the 2000 TAPPI Pulping Conference, Boston, ΜΛ, 5 USA, November 5-9, 2000. 6 p. (CD-ROM)

Martinez-lnigo, M.J., lmmerzeel, P., Gutierrez, A., del Rio, J.C. & Sierra-Alvarez, R. 1999. Biodegradabilityof extraetives in sapwood and heartwood from Scots pine by sapstain and white rot fungi. Holzforschung 53: 247-252.

White-McDougall, W.J., Blanchette, R.A. & Farrell, R.L. 1998. Biological control of blue 10 stain fungi on Populus tremuloides using selected Ophiostoma isolates. Holzforschung 52: 234-240.

Yang, D-Q. 1999. Staining ability of various sapstain fungi on agar plates and on wood wafers. Forest Prod. J. 49(11-12): 78-90.

Örsä, F. & Holmbom, B. 1994. A convenient method for the determination of wood 15 extractives in papermaking process waters and effluents. J. Pulp Paper Sci. 20: J361-366.

» > » i ‘ ¥

I Ϊ I

t »

Claims (11)

115221

1. Menetelmä puun uuteaineiden määriin vähentämiseksi puuhakkeessa, tunnel 1 n siitä, että 5. hakkeeseen lisätään typpeä vähintään 0,07 g N/kg tuoretta haketta (tuorepaino) ja olosuhteet hakkeessa tehdään sopiviksi puuhakkeessa luonnostaan esiintyvien mikro-organismien kasvulle, - hakkeen käsittelyä jatketaan 4 päivästä 8 viikkoon.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hake siirrostetaan mikro-organismiviljelmällä, joka kykenee vähentämään puun uute-aineiden määrää hakkeessa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hake siirrostetaan 15 mikro-organismiviljelmällä tai -siirroksella, joka sisältää kannan DSM 15309 mikro- organismeja.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hakkeeseen ei lisätä mikro-organismiviljelmää tai -siirrosta. 20

· 5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hakkeen kosteus, lämpötila ja ilmastus saatetaan sopiviksi mikro-organismien kasvulle.

': 6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ‘: 25 hakkeen lämpötila pyritään pitämään käsittelyn ajan 5-40 °C:ssa, edullisesti 10-40 °C:ssa, edullisimmin 20-30 °C:ssa.

·;;/ 7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että > · hakkeen käsittelyä jatketaan viikosta neljään viikkoon, edullisesti viikosta kahteen * * 30 viikkoon.

8. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että :‘ · hakkeen kosteus pidetään noin 40 - 80 %:n välillä, edullisesti 50 - 70 %:n välillä.

9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että typen lisäksi hakkeeseen lisätään sopiva hiilenlähde, kuten tärkkelys.

10. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 5 typpi lisätään ammoniummuodossa, kuten ammoniumsulfaattina, ammoniumnitraattina tai ammoniumkloridina.

11. Mikro-organismiviljelmä tai -siirros, tunnettu siitä, että se sisältää kannan DSM 15309 mikro-organismeja. 10 * · · I I f i I 115221