FI112254B - Pihkan hajottaminen valkolahottajasienten avulla - Google Patents

Description

112254

PIHKAN HAJOTTAMINEN VALKOLAHOTTAJASIENTEN AVULLA

Keksintö koskee tiettyjen sienten käyttöä selluloosapitoisten tuotteiden valmistuksessa käytettävien materiaalien pihkapitoisuuden vähentämiseksi.

5 Puu on monimutkainen materiaali, joka koostuu selluloosasta, hemiselluloosasta, ligniinistä ja puu-uuteaineista tai hartsimaisista aineista joita tavallisesti kutsutaan "pihkaksi", "hartsiksi" tai "puuhartsiksi". Pihkan koostumusta on tutkittu laajas-10 ti ja selostettu kirjallisuudessa esim. julkaisussa Wood Extractives and Their Significance to Pulp and Paper Industry, kappale 10, "Wood Resins", D.B. Mutton; W.E. Hillis, Academic Press, N.Y. (1962).

Valmistettaessa tuotteita puumassasta, pihka 15 on ei-toivottua viskositeettinsa ja tahmeutensa vuoksi, se muodostaa sakkoja, jotka ovat hankalasti poistettavissa, aiheuttaen useita ja pitkähköjä seisokkeja siivouksen vuoksi, koska hartseilla on taipumus kerääntyä sakoiksi sihtilevyihin, suodattimiin ja eri 20 puolille paperin prosessointilaitteistoa. On yleisesti tunnettua, että pihka voi haalistaa massaa ja siitä • » · valmistettua paperia, jos sen annetaan kerääntyä liian '•'l* pitkän aikaa ennen puhdistamista. Muut haitat ovat 1 I ( >>J myös alalla tunnettuja esim. jätevirran saastuminen.

* 25 Julkaisussa US 3 486 969 on esitetty, että ·_· · tiettyjä sieniä voidaan siirrostaa puulastuihin ja .* : : niistä tehtyyn massaan vähentämään hartsipitoisuutta minimoiden kuitenkin puun muiden komponenttien hajoa-minen, erityisesti selluloosan ja hemiselluloosan ha-.···, 30 joaminen. Julkaisussa esitetyt sienet ovat kuitenkin kaikki homeita tai pintaa muodostavia sieniä, jotka puuta haalistaessaan, tuottavat pinta tai pinnallisia tahroja, jotka helposti liukuvat pois (katso J.S.

;v, Boyce, Forest Pathology 3.painos, (1961), McGraw-Hill ‘..1 35 Book Co, sivut 493-512, erityisesti sivut 496-497).

2 112254

Tietojemme mukaan tällaisilla sienillä ei ole saatu käytännössä menestystä.

Julkaisussa EP-A-0 387 187 A2 on kuvattu tiettyjen puuhun tunkeutuvien sienten, jotka on luoki-5 teltu Ascomycetes tai Deuteromycetes luokkiin, käyttöä puumassassa tai massassa pihkapitoisuuden vähentämiseksi. Samankaltaisia käyttökelpoisia puuhun tunkeutuvia sienijohdannaisia on esitetty myös julkaisussa EP 0 470 929 A2.

10 Julkaisussa FR 2 692 590 on kuvattu muita puuhun tunkeutuvan Ophiostoma piliferum-sienen kannan johdannaisia, joilla on hyvä pihkan hajotuskyky ja jotka ovat nopeakasvuisia kasvaessaan valkoisina tai värittöminä käsitellyissä substraateissa.

15 Tutkittaessa yleisesti sienten ja sienten erittämien entsyymien mahdollista käyttöä paperinvalmistuksessa, Basidiomycetes sienet, erityisesti valkolahottajasienet, ovat olleet kiinnostuksen kohde niiden ligniinin hajotuskyvyn ja ligniiniä hajottavien 20 entsyymien tuoton vuoksi. Eräs valkolahottajasieni, jonka erityisesti on katsottu soveltuvan tällaisiin sovellutuksiin, on Ceriporiopsis subvermispora, kuten * /· on kuvattu julkaisussa U.S. Letters Patent No.

:· 5,055,159. Näitä valkolahottajasieniä ei ole kuiten- ·· 25 kaan tunnettu niiden kyvystä poistaa pihkaa massasta.

a » . · j ·. Keksinnön tarkoitus on laajentaa niiden käyt- tökelpoisten sienten määrää, jotka hajottavat pihkaa • * · paperimassassa ja paperipuussa, ja erityisesti ei- ... steriileissä substraateissa.

• > t ·_ ·’ 30 Keksinnön toisena tarkoituksena on tuoda esiin pihkaa hajottavia sieniä, joilla on tai joiden •: ·- halutut ominaisuudet voidaan yhdistää, kuten värivai- kutukset, pihkanha j otuskyky, hyvä kasvu ei- steriileillä substraateilla, joustavat toimintalämpö- : ·’ 35 tilat, toimivuus eri puulajeissa ym.

·...· Esillä olevan keksinnön mukaisesti, on todet tu että valkolahottajasienet Schizophyllum commune, 3 112254

Trichaptum biforme ja Phanerochaete qigantea ovat erityisen tehokkaita puusubstraattien pihkapitoisuuden vähentäjiä, erityisesti ei-steriileissä puusubstraa-teissa olevan pihkan vähentäjiä.

5 Edellä esitetyn mukaisesti keksintö koskee menetelmää puun pihkapitoisuuden vähentämiseksi, erityisesti paperipuun, jossa menetelmässä paperipuuhun lisätään yksi tai useampi siirroste, joka koostuu yhdestä tai useammasta sienestä, jotka on valittu ryh-10 mästä, johon kuuluu Schizophyllum commune, Trichaptum biforme ja Phanerochaete giqantea , ja ylläpidetään ympäristöolosuhteita suotuisina edistämään sienten kasvua.

Termeillä "hartsi" tai "pihka" (joita käyte-15 tään vaihtovuoroisesti) tarkoitetaan puun hydrofobis ten aineiden monimutkaista seosta, joka tavallisimmin tunnetaan pihkana, joka liukenee neutraaleihin orgaanisiin liuottimiin kuten metyleenikloridiin, di-etyylieetteriin, bentsyylialkoholiin ja vastaaviin.

20 Näihin kuuluvat terpeenit, diterpeeni("hartsi")hapot, rasvahapot ja esterit, glyseridit ja vahat kuin myös alkoholit, hiilivedyt ja muut niihin liittyvät yhdis-: t: teet. Tätä keksintöä varten, standardi Tappi uutto- ·* analyysi, jossa käytetään metyleenikloridia, on riit- 25 tävä mättämään hartsien vähenemisen, mikä on tämän : ,·. keksinnön tarkoitus.

Hartsi tai pihka on merkittävä ainesosa sekä havupuissa kuten männyssä (southern pine), havupuissa ja seetripuissa, ja lehtipuissa kuten koivussa (Betu- : ·* 30 la) ja poppeleissa (Populus), ja se voi muodostaa jopa 4 p% tai enemmän syötöstä, joka on toimitettu mekaani- ....j seen tai kemialliseen massaprosessiin, tavallisesti .···, 1,5-4,0% useimmilla massanvalmistuksessa käytetyillä ’·' puilla. Havupuut sisältävät yleensä enemmän hartseja : .· 35 kuin lehtipuut, männyillä on korkein hartsipitoisuus • * » havupuiden joukossa. Lehtipuissa hartsi on pääasiassa sädeparenkyymisoluissa, jotka muodostavat suuren osan 4 112254 kuitufraktiosta massaa tehtäessä. Havupuilla hartsi on sekä sädeparenkyymisoluissa että hartsikanavissa.

Keksintöä voidaan käyttää vähentämään sellu-loosatuotteiden valmistuksessa käytettävän paperipuun 5 ja massan pihkapitoisuutta.

Termillä "paperipuu" tarkoitetaan tässä mitä tahansa kerättyä (kaadettua) puumateriaalia, jota käytetään paperinvalmistuksessa, pahvia tai muita sellu-loosatuotteita kuten viskoosia ennen massanvalmistus-10 ta, ja sisältäen myös puutavaran, tukit, puulastut, sahanpurun ja vastaavat. Termillä "hierretty paperi-puu" tarkoitetaan paperipuuta, joka saadaan, kun mekaanisia ja/tai leikkaavia voimia käytetään puuhun, esim tukkeihin, runsaasti suuremman pinta-alan omaavi-15 en pienten palojen saamiseksi , kuten lastujen tai sahanpurun saamiseksi, jotka soveltuvat käytettäväksi sellunvalmistusprosesseissa.

Keksintöä voidaan siten käyttää ainakin osittain vähentämään hierretyn paperipuun hartsipitoisuut-20 ta, saattamalla paperipuuhun ainakin yhden esitetyn sienen siirrostetta, saattamalla siirrostettu paperi-puu massaan ja ylläpitämällä akkumuloitua massaa olo- ·,. ,· suhteissa, jotka mahdollistavat tai edistävät sienten ·* kasvua massassa sellaisen ajan, joka on riittävä saa- ;· 25 maan aikaan hartsipitoisuuden laskun sienen vaikutuk- • sesta paperipuussa. Keksintö voidaan saattaa hiertä- ,* mättömään paperipuuhun, kuten kuorittuun tai kuorimat- * · tomaan puutavaraan, siirrostamalla puutavara, ja kuo- ,. rimattoman puutavaran ollessa kyseessä, siirrostamalla > * # 30 mieluiten ainakin osittain viilletty puutavara, ja yl-läpitämällä puutavara olosuhteissa, jotka mahdollista- *: · *; vat sienen kasvun puusubstraatin päällä ja sisällä riittävän pitkän ajan hartsikomponenttien vähenemisen aikaansaamiseksi.

• ·’ 35 Termillä "siirroste" tarkoitetaan tässä yh- * i teydessä mitä tahansa sienimateriaalia, joka on riittävän elinvoimainen saadakseen aikaan sienen kasvun, 5 112254 kun se on saatettu substraattiin. Tyypilliset sieni-siirrosteet ovat sieniviljelmiä tai valmisteita, jotka on saatu sieniviljelmistä, mieluummin biologisesti puhtaista viljelmistä. Useimpien sienten perusraken-5 neyksikkö on sienirihma tai "hyyfi". Aggregaatteina nämä rihmat muodostavat sienirungon, jota kutsutaan "myseeliksi". Tavallisesti sienet lisääntyvät suvuttomasti konidioiksi kutsuttujen itiöiden avulla, jotka vapautuvat myseelistä, tai sitten ne lisääntyvät sulo vullisesti basidiosporien tai klamydiosporien avulla. Keksinnössä voidaan siirrosteena käyttää kaikkia näitä muotoja ja sienen elementtejä, esimerkiksi myseeliä ja itiöitä. Siirroste voidaan tuottaa viljelemällä sientä millä tahansa perinteisellä menetelmällä. Haluttaessa 15 ja tarvittaessa kasvatusalustana voidaan käyttää kiinteää tai nestemäistä alustaa, edullisesti nestemäistä alustaa. Sienten viljelemistä olosuhteissa, jotka suosivat itiöiden muodostumista, on edullisinta milloin se on mahdollista ja tavallisesti edullisin siirroste 20 sisältää suuren määrän sieniviljelmän itiöitä.

Siirroste voi olla kiinteässä tai nestemäi-‘· sessä muodossa. Voidaan käyttää kokonaisia nestevil- jelmiä tai niiden osia, esimerkiksi myseelin ja itiöiden seosta. Kun viljelmästä on saatavissa runsaasti ··· 25 itiöitä, tuote voidaan lyofilisoida (kylmäkuivata) « i * » ; .·. kuivan siirrosteen saamiseksi, jossa itiöt muodostavat elinkykyisen osan, josta kehittyy sieni siirrostamisen * * · jälkeen. Siirrosteita, jotka ovat konsentraattien muo-,,, dossa laimennettavaksi vedellä applikaatiota varten, :t>“’ 30 säilytetään tavallisesti lämpötiloissa, jotka ylläpi- tävät halutun elinkykyisyyden. Nestemäiset muodot säi-*:·· lytetään tavallisesti pakastettuina, yleensä lämpöti- ,··, loissa -5°C - -80°C, vielä yleisemmin -10°C - -75°C.

Kuivat muodot varastoidaan samalla tavoin, vaikka lyo-: 35 filisoidut muodot, joissa itiöt ovat toimivana siir- rosteena, ovat usein stabiilimpia ja niitä voidaan varastoida korkeammissa lämpötiloissa kuin vastaavia 6 112254 nestemuotoja. Siirrostekoostumukset voivat sisältää muita ainesosia, kuten säilöntäaineita ja stabiloivia aineita tai inerttejä kantajia, joita käytetään tietyntyyppisissä kuivausprosesseissa.

5 Siirroste voidaan saattaa puusubstraattiin eri tavoin. Tavallisesti siirroste laitetaan systemaattisesti tai metodisesti. Siirroste jaetaan esimerkiksi hierretyn paperipuun massaan tietyin aikavälein tai puutavaran pinnalle, edullisesti säännöllisin vä-10 liajoin. Edullisemmin siirroste jaetaan homogeenisessa tai tasaisessa muodossa, esimerkiksi oleellisesti läpi koko hierretyn paperipuumassan. Ei kuitenkaan ole välttämätöntä, että jokainen yksittäinen puulastu, sa-hanpurunen tai vastaava siirrostetaan. Jopa niinkin 15 vähän kuin 10% tai vähemmän, mutta edullisesti ainakin noin 20 %, edullisemmin ainakin noin 50%, yksittäisistä palasista voidaan siirrostaa, koska ei-siirrostetut palaset joutuvat kosketuksiin siirrostettujen palasten kanssa. Kasvaessaan infektio leviää hyvin helposti.

20 Läpikotaisin suoritettu tai tasainen puulas- tumassan siirrostaminen tavallisesti näkyy siten, että sieni kasvaa läpi koko massan. Voi kuitenkin tapahtua, että osassa massasta, erityisesti hierretyn paperipuu-u* kasan ulommassa kerroksessa, on hyvin vähän kasvua **· 25 verrattuna muuhun massaan, tai siinä ei ole kasvua : lainkaan, vaikka se on siirrostettu.

• · · ·

Eräässä edullisessa sovellutuksessa siirroste suihkutetaan puulastujen tai sahanpurun päälle sitä .. . mukaa kun ne tulevat hiertämislaitteista, mutta ennen • · · • ;* 30 kasaamista. Esimerkiksi puuhakelaite on tavallisesti '···* varustettu kul jettimella, joka ottaa vastaan vasta :·· tehdyt puulastut ja siirtää ne kasoihin. Suihkutin, jossa on siirrostevalmistetta, voidaan helposti liittää kuljettimeen, edullisesti hakkurin yhteyteen, kun : ’ 35 lastut leijuvat esim. vapaasti pudoten tai poukkoil- ·...· Ien, tai kuljettimen päähän siten että lastut suihku tetaan juuri ennen kuljettimelta putoamista.

7 112254

Vaihtoehtoisesti siirroste voidaan saattaa puulastukasaan kasan kerääntymisen aikana enemmän tai vähemmän jatkuvalla suihkutuksella kerääntyvän kasan päälle.

5 Käsiteltäessä massaa tai hierrettyä paperi- puuta, käytettävä annos voi vaihdella riippuen useammasta eri tekijästä kuten käsiteltävästä puusta, puun iästä tai kunnosta, kasvuolosuhteista, halutusta käsittelyä j asta jne. Tavallisimmin tyydyttävät tulokset 10 saadaan käytettäessä siirrostetta, jossa on 0,5-10g myseeliä ( myseelin, josta vesi on poistettu, märkä-paino, ks Esimerkki 1) per 100 g massa tai paperipuuta, edullisesti 1-5 g myseeliä per 100 g käsiteltävää ainetta. Myseeli, ennen vedenpoistoa, voidaan valmis-15 taa kuten on kuvattu Esimerkissä 1 tai Esimerkissä A, edullisesti kuten esimerkissä A, ja se voi sisältää itiöitä. Pääasiassa tai ainoastaan itiöitä sisältävän siirrosteen annos voidaan määrittää rutiininomaisesti ja se voi vaihdella 106 - 1010 CFU (colony forming 20 units=pesäkkeitä muodostava yksikkö) per kg substraattia, tavallisemmin 107-109 CFU per kg. Siirrosteannos laitetaan tavallisesti vedellä laimennetun suihkutet-tavan koostumuksen muodossa, esimerkiksi koostumukseni* na, joka annostellaan tilavuutena 20-60 ml per kg sub- 25 straattia. Edullisesti sienet laitetaan vastakaadet-: ,·. tuun tai hierrettyyn paperipuuhun tai vastaleikattuun * i · ’ii·’ substraattiin jäädytettynä tai säilytettynä alhaisissa lämpötiloissa ennen käsittelyä tai substraatin sterilointia. Voi olla tarpeen käyttää annosrajojen korke- ♦ · · : ·' 30 ampaa pitoisuutta jotta vältettäisiin tai vähennetään *...· sellaisten sienten kasvua, jotka luonnollisesti ovat infektoineet puun ennen siirrostusta, kun käsiteltävä- .···, nä on ei-steriili paperipuu, jonka on annettu vanheta *·* ennen käsittelyä, esim. puulastut, jotka on tuotettu : .* 35 noin 5 päivää tai enemmän, ennen käsittelyä.

• · »

Toisessa sovellutuksessa lastut, jotka on aiemmin siirrostettu ja kasvatettu keksinnön mukaisesti, 8 112254 voidaan levittää tuoreisiin lastuihin saamaan aikaan tai lisäämään siirrostusta. Tällaisen siirrosteen ei oleteta olevan biologisesti puhdas. Se osoittaa kuitenkin, että aiemmasta siirrostuksesta ainakin 40%, 5 edullisesti 50% siirrosteesta on haluttua sientä.

Siirrostuksen jälkeen akkumuloitua massaa pidetään olosuhteissa, jotka mahdollistavat tai edistävät sienen kasvua oleellisesti läpi koko massan. Olettaen että keksintöä käytetään useimmissa tapauksissa 10 todennäköisesti ulkoilmassa ja massa on täten alttiina säänvaihteluille, minkä tahansa annettavien ihanteellisten olosuhteiden ylläpito koko käsittelyajanjakson ajan on yleensä liian vaikeaa ja käytännössä tarpeetonta. Yleensä on riittävää, että massaa ylläpidetään 15 lämpötilassa, joka mahdollistaa sienen kasvun ja vältetään korkeita lämpötiloja, joissa sieni voi kuolla. Vaikka keksinnön mukainen sieni kasvaa jonkin verran 0°C lämpötilassa tai sen alapuolella, on yleensä suotavaa käyttää ainakin 10°C lämpötilaa, edullisesti 10-20 40 °C, edullisesti 15-33 °C, edullisimmin 22-28 °C.

Leudoissa tai lämpimissä sääolosuhteissa ei ole tarpeen vaikuttaa ympäristön lämpötilaan ja siir- . *. rostettu massa voidaan jättää ulkoilmaan ilman eri- tyistä ylläpitoa. Kylmissä sääolosuhteissa voi olla ^ 25 toivottavaa varustaa siirrostettu massa keinoin yllä- “ ) pitää sopivaa lämpötilaa. Tämä voi olla esim. lämpöä • · * pidättävä peite asetettuna siirrostetun massan yli tai ’· * päälle, kuten esimerkiksi suuri muovipeite. Vaihtoeh toisesti alusta, jolle siirrostettu massa sijoitetaan • 30 voi olla varustettu lämmitysputkilla tai aukoilla, : : joista puhalletaan lämmintä ilmaa tai höyryä. Samalla -t’tj tavoin voidaan käyttää betoni-"iglua" tai muuta vas- ... taavaa rakennetta, jota voidaan lämmittää ja johon ·;** voidaan emittoida säteilylämpöä akkumuloidun paperi- | ' t 35 puumassan ylläpitämiseksi. Kun käytetään lämmitysmene- telmiä, on hyvä valvoa kosteusolosuhteita liiallisen kuivuuden välttämiseksi. Tämä huomioon ottaen, väli- 9 112254 neet lämmön tai höyryn johtamiseksi ovat sopivia. Kuitenkin akkumuloidussa massassa sienten kasvusta ja muusta mikrobiaalisesta tai luonnollisista vaikutuksista aiheutunut lämmönmuodostus saa aikaan sen, että 5 menetelmä toimii kylmissä olosuhteissa tyydyttävästi vähäisellä avulla tai ilman apua.

Siirrostetun hierretyn paperipuun käsittelyn pituus voi vaihdella huomattavasti riippuen lukuisista tekijöistä mukaanlukien haluttu hartsin poistoaste, 10 lämpötila ja kosteusolosuhteet, siirrostuksen määrä jne. Tyydyttävät tulokset saadaan yleensä ajanjaksolla 3-40 päivää, edullisesti 4-30 päivää. Edullisissa olosuhteissa hyvät tulokset, esim. pihkan vähentyminen noin 20% tai enemmän, voidaan saavuttaa 4-20 päivää 15 siirrostuksen jälkeen, tavallisemmin 5-15 päivässä.

Kiertämättömän paperipuun, esim. kaadetun puutavaran käsittely on tavallisesti hieman pitempi kuin hierretyn paperipuun ja voi olla jopa 2 kuukautta. Massan ja paperipuun käsittelyn kesto keksinnön 20 mukaisilla sienillä tulisi yleensä olla sellainen, et tä saadaan aikaan haluttu pihkan vähentyminen välttäen kuitenkin liian pitkää aikaa, mikä voi vaikuttaa sub- « \ straatin tai substraattien selluloosakomponenttiin.

Annokset hiertämättömälle paperipuulle voivat olla sa-25 mankaltaisia kuin hierretylle paperipuulle ja voivat ! olla 10-100% käytettävissä olevista pinnoista, taval lisemmin 15-50% käytettävissä olevista pinnoista.

’·' Keksinnön toteuttamisessa käytettävät sienet ovat aiemmin tunnettuja lajeja ja ne voidaan tuottaa : 30 tunnetuilla menetelmillä esim. eristämällä puista, : ί joilla ne luonnossa kasvavat. Kun eri kantojen välillä voidaan olettaa olevan runsaasti vaihtelua eri teki- • * » t » • · ... jöistä riippuen, kuten puusta, josta sienet eriste- I · *;· tään, riippuen, keksinnön mukaisesti käytettävä sieni j ’ : 35 kasvoi huomattavan hyvin sekä steriloimattomalla Sout- hern yellow-männyllä ja haapapuulla ja sen voidaan olettaa kasvavan hyvin myös puulajeissa, joista sellu- 10 112254 loosatuotteita tavallisesti tehdään. Keksinnössä käytettävän sienen luonnossa esiintyviä isolaatteja voidaan voidaan käsitellä kannan valinnan eri keinoin, lisäämällä ja mutatoimalla, ilman että niiden lajiomi-5 naisuudet katoavat. Edullisimmat isolaatit on talletettu Northern Regional Research Centeriin (NRRL), kuten seuraavassa yksityiskohtaisesti esitetään, mutta on ilmeistä, että niitä voidaan modifioida ja edulliset sienet eivät koostu vain näitä isolaateista vaan 10 myös muista isolaateista ja modifioiduista muodoista, joilla oleellisesti on ainakin hartsia hajottava ominaisuus ja kasvuominaisuus ei-steriloidussa Southern Yellow-männyssä ja haapapuusssa kuten talletetuilla kannoilla. Menetelmä tällaisten muiden isolaattien ja 15 modifikaatioiden saamiseksi on esitetty julkaisussa EP 0 470 929 (sisällytetään tällä viittauksella). Keksinnössä käytettävät sienet kasvavat valkoisina tai värittöminä paperipuussa ja massassa. Koska niitä voidaan käyttää pääasiallisesti ja täydellisesti dominoi-20 maan muita tummempina kasvavia sieniä, jotka tavallisesti infektoivat ei-steriloituja substraatteja, kek-;.· sinnönmukaisia sieniä voidaan käyttää sellaisen tuotti teen valmistamiseksi, joka tarvitsee vähemmän val- :· kaisua lopullisen paperituotteen saamiseksi.

·;. 2 5 TALLETUKSET

Seuraavat tässä viitatut sienet on talletettu

Budapestin sopimuksen mukaisesti Northern Regional Re- * t t seardch Centeriin (NRRL) Peoria, Illinois, USA, joille talletuksille on saatu seuraavat talletusnumerot.

LV 30 ’...* Sieni Talletusnumero Talletuspäivä

Schizophyllum commune NRRL 21056 16.3.1993

Trichaptum biforme NRRL 21055 16.3.1993 • *

Phanerochaete NRRL 21054 6.3.1993 : .* gigantea > « » 11 112254

Kaikki edellä esitetyt talletetut sienet on saatu kaadetusta puutavarasta luonnollisista isolaa-teista Minnesotassa USAssa, muuta ne voidaan saada lukuisilta muilta maapallon alueilta. S.Commune ja 5 T.biforme eristettiin lehtipuutavarasta ja P. qiqantea eristettiin punamännystä. Huomautetaan, että Trichap-tum biformea on aiemmin kutsuttu myös nimillä Polypo-rus parqamenus ja Hirschioporus parqamenus, katso julkaisu Gilbertson et ai., North American Polypores, Voi 10 2, Fungiflore, Oslo, Norja 1987, sivut 770-772 ja Ot- jen et ai., "Selective Delignification of Birch Wood (Betula papyrifera) by Hirschioporus pargamenus in the Field and Laboratory", Holzforschung 40 (1986), 183- 189. Myöskin Phanerochaete gigantea on aiemmin tunnet-15 tu nimellä Peniophora gigantea, katso julkaisu

Burdshall, H.H.Jr., "A Contribution to the Taxonomy of the Genus Phanerochaete", Mycological Memoir, No 10, J.Cramer publishers, Braunschweig, Germany (1985)

Kokeet on tehty edellä mainituilla tallete-20 tuilla kannoilla siten että kokeissa mainitut lajit edustavat tiettyä kantaa.

‘ .· Yleiset menetelmät: Viljelmät ja siirrostus ·, ,·’ Erilaisia määrityksiä on tehty paperi- puusubstraateilla pihkan vähenemisen ja kasvun määrit-• · 25 tämiseksi. Havupuun ominaisuuksien arvioimiseksi käy- j.. tettiin steriilejä ja ei-steriilejä Southern Yellow- , männyn puulastuja. Puulastuja varastoitiin 5°C lämpö tilassa ennen määritystä. Kukin koe tehtiin saman puu-.. : lajin substraatilla ja puulastunäytteillä, jotka saa- 30 tiin samasta puulastulähteestä. Kussakin kokeessa yk- ‘•.7 sittäinen puulastuannos ensin punnittiin, jonka jäl- ·:·*· keen puulastunäytteet steriloitiin kuumentamalla auto- 7“. klaavissa 121°C lämpötilassa 20 minuuttia ja annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan ennen testin aloittamista.

• ·* 35 Puulastut, joita oli tarkoitus käyttää ei- sterilisoidussa muodossa, jätettiin käsittelemättä ja niiden annettiin olla luonnollisessa tilassaan. Yksit- 12 112254 täiset näyteannokset valmistettiin laittamalla punnitut määrät puulastuja yksittäisiin läpinäkuviin muovipusseihin; pussit olivat kooltaan sellaiset, että ne saatettiin sulkea (vaikkakaan ei hermeettisesti sul-5 jettavia). Läpinäkyvien pussien käyttö mahdollisti puulastujen kasvun visuaalisen tarkastelun, ja edelleen valon pääsyn tutkittaviin puulastuihin.

Kasvatusalusta valmistettiin seuraavista aineista (määrät ovat g/1 valmistettua nestemäistä kas-10 vatusalustaa): 10 g glukoosia 10 g mallasuutetta 2 g peptonia 2 g hiivauutetta 15 2 g KH2P04

1 g asparagiinia 1 g MgSC>4 7H2O

jotka lisättiin peräkkäisessä järjestyksessä 20 yhteen litraan deionisoitua vettä ja sen jälkeen auto-klavoitiin 121°C lämpötilassa 20 minuuttia ja annet- » ,· tiin jäähtyä huoneenlämpöön ja tätä liuosta kutsutaan tästä eteenpäin YNPD-kasvatusalustaksi. Myöhemmin 1 mg -· tiamiinia lisättiin muihin ainesosiin, jonka jälkeen 25 YNPD alusta oli valmista käytettäväksi.

Käyttäen edellä esitetyn mukaisesti valmis-tettua YNPD-kasvatusalustaa, kukin sieni valmistettiin ’ seuraavissa yleisissä olosuhteissa: (a) tietyllä sieninäytteellä siirrostettiin 30 steriili petrimalja, joka sisälsi edellä esitetyn mu- kaisesti valmistettua YNPD-kasvatusalustaa ja maljat peitettiin; (b) siirrostettua YNPD kasvatusalustaa pidettiin huoneenlämmössä (noin 20°C) kunnes visuaalisesti • *,· 35 oli todettavissa, että siirrostettu sieni oli kasvanut :t>>: hyvin myseelimattoina YNPD-kasvatusalustassa (noin 5 päivää); 13 112254 (c) kun hyvä kasvu oli todettu, myseelimatot poistettiin käsin (käyttäen kumikäsineitä) petrimal-joilta, puristettiin kuivaksi käsin, kunnes vettä ei enää tippunut, ja puristetut matot punnittiin 5 "märkäpainon" määrittämiseksi. Puristettu ja vedettömäksi tehty matto laitettiin puhtaaseen laboratorio dekantterilasiin, jossa matto homogenisoitiin lisätyn 5-10 ml: n tislatun veden kanssa pipetoitavan lietteen muodostamiseksi, joka voitiin siirtää dekantterilasis-10 ta ja käyttää substraatin siirrostamiseen; ja (d) dekantterilasin sisältö laitettiin mitta-lasiin pipetoitavan lietteen tilavuuden määrittämiseksi ja kun se oli määritetty, sisältö laitettiin dekantterilasiin, josta se käytettiin näytteiden siir- 15 rostamiseen.

Puulastujen siirrostus tehtiin injektoimalla pipetin sisältö, jossa oli märkäpainoltaan 2-5 g my-seelimattoa kutakin 100 g puulastuja kohti, jonka jälkeen pussin avoin suu taitettiin ja pussin sisältöä 20 sekoitettiin ja puristeltiin, jotta maksimimäärä las tuja joutui kosketuksiin siirrosteen kanssa. Taitettu pussin suu niitattiin kiinni kahdesta kohdasta. Kaikki .*··. siirrostetut puulastunäytteet laitettiin sen jälkeen laboratoriopöydälle huoneenlämpöön kunkin testin mu-25 kaiseksi ajanjaksoksi. Kukin testi tehtiin 2-5 näyt- teellä; tässä esitetyt sienten kasvun tulokset ovat ·;; · keskiarvoja näistä eri tuloksista.

* Substraattien pihkapitoisuuden arviointi teh tiin standardimenetelmän TAPPI T204 OS-76 mukaisesti, I 30 joka antaa tulokset milligrammoina pihkaa substraatti- grammaa kohden uutettuna "DCM:lla", joka on metyleeni-[ . kloridi. TAPPI-menetelmän mukaisesti käytettäessä sub- ,,, straattina puulastuja, käsiteltävät lastut pienenne- tään karsintaterillä noin 1 cm pituuteen, kuivataan : · : 35 sen jälkeen yön yli 60°C lämpötilassa ja jauhetaan sen jälkeen sahanpuruksi käyttäen Thomas-Wiley Intermediate Mill-konetta 10 mesh seulalla (10 mitta metal- 14 112254 liseula) ja kuivataan uudelleen yön yli 60° C lämpötilassa. Kolme grammaa kuivattua sahanpurua yhdistetään 30 ml DCM ja saatua seosta sekoitetaan yön yli (noin 15 tuntia) huoneenlämmössä (noin 20°C). Neste pipetoi-5 daan seoksesta, suodatetaan orgaanisen suotimen läpi, jonka huokoskoko on 0,45 pm ja sen jälkeen nesteen annetaan haihtua huoneenlämmössä yön yli taaratussa maljassa. Maljassa olevaa jäännettä kuumennetaan kier-toilmauunisa 60° C lämpötilassa 30 minuutin ajan jäl-10 jelle jääneen DCM poistamiseksi, jonka jälkeen maljan annetaan jäähtyä huoneenlämpöön ja punnitaan uudelleen; jäljelle jääneen tähteen, viz. jäljelle jääneen pihkan, määrä määritetään ja esitetään mg-yksiköissä (mg) ja korreloidaan alkuperäisen näytteen määrään, 15 jolloin määrä esitetään mg pihkaa per g puulastusubst-raattia tai vaihtoehtoisesti prosentteina DCM-uutteita läsnä puulastunäytteessä, joka tulos muunnetaan prosenteiksi pihkaa substraatissa (% uutteita). Pihkan määritykset voidaan tehdä sekä steriileillä ja ei-20 steriileillä substraateilla. Määritykset steriileillä substraateilla eliminoivat tavallisesti muiden luon- t nossa substraatin infektoivien organismien vaikutuk-sen. Määritystä steriilillä substraatilla pidetään h yleensä objektiivisempana mittana arvioitaessa sienten 25 pihkan vähentämistä tietyssä substraatissa. Tehtäessä . ^ määritys joko steriilissä tai ei-steriilissä substraa- tissa, pihkan vähentymistä yleensä arvioidaan suhtees- * sa ei-käsiteltyyn vertailunäytteeseen, joka on steri loitu (sekä steriloidulla että substraattitestillä) ja ; 30 pidetty jäädytettynä testiajanjakson ajan (ei- steriloidun substraatin määritys) . Yleensä on haluttua saada aikaan 20% pihkan vähentyminen suhteessa vertai-... lunäytteeseen ei enemmässä kuin 21 päivässä siirros- *; tuksen jälkeen, edullisesti ei enemmässä kuin 14 päi- * 35 vässä. Erityisen hyvät tulokset on saatu silloin, kun : : pihka on vähentynyt 25% ei enemmässä kuin 21 päivässä, 15 112254 ja erityisesti, kun tämä tulos on saatu ei enemmässä kuin 14 päivässä.

Kasvun arviointi

Sienten kasvun määritykset tehtiin niin yh-5 denmukaisesti kuin mahdollista ja tavalla, joka on niin identtinen kuin mahdollista kaikille lukuisten testien määritettäville näytteille , joiden kasvua arvioitiin. Määritys tehtiin käyttäen yksinkertaista visuaalista tarkastelua, menetelmällä jota käytettiin 10 yhdenmukaisesti ja jokaisen määritysajanjakson aikana (jolloin välimääritys tehtiin testin aikana) ja kunkin testin päättyessä. Menetelmä perustuu mahdollisen sie-nikasvun värikategorioihin, jotka voidaan havaita ja varmistaa kustakin yksittäisestä puulastusta tai sub-15 straatista ilman apuvälineitä normaalilla lukuetäisyy-dellä. Kun substraatti on steriloitu, voidaan havaita vain yksi värikategoria, keksinnön mukaisen mikro-organismin väri, ja menetelmään kuuluu niiden puulas-tujen, joissa on havaittavissa mahdollisesti käytettä-20 vän sienen nähtävissä oleva kasvu , määrän tai prosentuaalisen osuuden määritys. Kun kasvunmääritys tehdään ei-steriileillä substraateilla, voidaan havaita eri-: laisia värejä keksinnön mukaisten tai siirrostettujen *· ja substraattia luonnossa infektoivien sienten välil- j. 25 lä. Siirrostettu ehdokas, tavallisimmin vaaleinta vä riä, tunnistetaan ja määrä ja prosenttiosuus niistä puulastuista, joissa on havaittavissa kyseisen sienen kasvua, määritetään. Seuraavassa esitetyt tulokset on esitetty niiden puulastujen prosentteina, jotka osoit-‘ ·’ 30 tavat halutun sienen kasvua kussakin tapauksessa. Kä- sitellyissä, ei-steriileissä puulastuissa saattaa esiintyä muiden organismien kasvua lastun muussa osas-,···, sa, kuten mustaksi värjääviä sieniä, ja tällaiset '·* taustana kasvavat sienet voidaan erikseen määrittää : *.* 35 samalla tavoin. Tällainen taustakasvu ei mitätöi muu- ten hyvin kasvanutta siirrostettua sientä, mutta ha- 16 112254 luttuja sieniä ovat ne, jotka parhaiten estävät tai dominoivat taustaorganismien kasvua.

ESIMERKKI 1 5 Kasvu steriilillä tai ei-steriilillä Southern

Yellow-männyllä

Sienten kasvun määritys Southern Yellow-männyllä tehtiin sekä steriilillä ja ei-steriilillä puulastunäytteillä, jotka puulastut olivat noin 5 päi-10 vää vanhoja. Kukin näyte sisälsi 100 g edellä esitetyn mukaisesti valmistettuja puulastuja. Kustakin sienestä tehtiin siirroste edellä esitetyn mukaisesti, ja 5 g myseelimattoa (märkäpaino) käytettiin lOOg puulastuja siirrostukseen edellä esitetyn mukaisesti. Pussit va-15 rastoitiin huoneenlämmössä 12 päivän ajan. Kasvun arviointi tehtiin toisena, viidentenä ja kahdentenatoista päivänä siirrostuksen jälkeen. Kasvun arviointi steriilillä ja ei-steriilillä Southern-männyllä on esitetty taulukoissa 1 ja 2. Ei-steriilillä substraa-20 tiliä (Taulukko 2) oli havaittavissa vähäinen tausta-kasvu muutamissa puulastuissa 12 päivän jälkeen, hieman taustakasvua ollessa havaittavissa muuten valkoi-sinä kasvavissa testisienissä.

·· 2 5 Taulukko 1 ,·. Sienten kasvu steriilillä Southern Yellow- .·;·# männyllä_

Laji 2 päivää 5 päivää 12 päivää ·. .__kasvu__kasvu__kasvu_

Shizophyllum 100% 100% 100% ·;’* commune____ ’!*: Trichaptum 100% 100% 100% ;" : biforme__________ 30 17 112254

Taulukko 2

Sienten kasvu ei-steriilillä Southern Yellow- männyllä

Laji 2 päivää 5 päivää 12 päivää __kasvu__kasvu__kasvu

Schizophyllum 100% 100% 100% _commune____

Trichaptum 100% 100% 100% biforme___ 5 ESIMERKKI 2

Kasvu steriilillä tai ei-steriilillä haapa- puulla

Sienilajien kasvun arviointi haapapuussa teh-10 tiin sekä vanhalla steriilillä ja vanhalla ei- steriilillä puulastunäytteellä. Kukin näyte sisälsi 100 g puulastuja, jotka oli valmistettu kuten edellä on kuvattu. Kunkin sienen siirroste valmistettiin kuten edellä on kuvattu, ja 3 g myseelimattoa (märkäpai-15 no) käytettiin 100 g puulastujen siirrostamiseen. Pus- ,· seja varastoitiin huoneenlämmössä 12 päivän ajan. Kas- : vun arviointi tehtiin toisena, viidentenä ja kahdente- ;· natoista päivänä näytteiden siirrostuksen jälkeen.

Taulukoissa 3 ja 4 on esitetty tulokset steriilillä ja 20 ei-steriilillä haapa-puulla. Ei-steriilillä substraa tilla (taulukko 4) oli havaittavissa vähäinen tausta- > · kasvu muutamissa puulastuissa 12 päivän jälkeen.

Taulukko 3 : ·' _Sienten kasvu steriilillä haapa-puulla_

Laji 2 päivää 5 päivää 12 päivää •: · * ·__kasvu__kasvu__kasvu

Schizophyllum 75% 100% 100% _commune____

Trichaptum 100% 100% 100% biforme____ 18 112254

Taulukko 4

Sienten kasvu ei-steriilillä haapa-puulla

Laji 2 päivää 5 päivää 12 päivää __kasvu__kasvu__kasvu_

Schizophyllum 75% 75% 100% commune____

Trichaptum 65% 75% 85% biforme_____ 5 ESIMERKKI 3

Esimerkkien 1 ja 2 mukaisesti, sienen Phane-rochaete gigantea kasvua arvioitiin sekä ei- steriilillä Southern Yellow männyllä että ei- steriilillä haapa-puulla, paitsi että siirrosteen mää-10 rä kussakin kokeessa oli alhainen annos märkäpainol-taan 2 g myseeliä 500 g puulastuja kohti ja määritystä jatkettiin yli 27 päivän ajan, välimäärityksen tapahtuessa 14 päivän jälkeen. Taustakasvua ei ollut havaittavissa 14 päivän eikä 27 päivän jälkeen. Tulokset 15 on esitetty taulukossa 5.

** Taulukko 5 ί Sieni Kasvu männyllä Kasvu haavalla I*__14 pv 27 pv 14 pv 27 pv i Phanerochaete gigantea 95% 100% 90% 100% ESIMERKKI 4 20 Pihkan poisto lehtipuutavarasta (haapa)

Sienikantoj en pihkanpoiston tehokkuutta ja * > muita ominaisuuksia määritettiin. Myös kontrollinäyt- teitä arvioitiin vertailun aikaansaamiseksi. Kontrol-linäytteet olivat ei-siirrostettu kontrollinäyte, jota :V, 25 pidettiin jäädytettynä (-20°C) koko testin ajan ja ei- ,···. siirrostettu kontrollinäyte, jota pidettiin huoneen lämmössä. Ympäröivän lämpötilan kontrollia pidettiin 19 112254 indikaattorina ei-steriilissä puulastunäytteissä olevien taustamikro-organismien vaikutuksesta pihkan vähenemiseen. Kaikki määritykset tehtiin 400 g näytteistä ei-steriiliä haapapuulastuja, 14 päivän kasvun jäl-5 keen siirrostuksesta, jolloin jokaisesta testistä tehtiin kolme rinnakkaisnäytettä ja tuloksista otettiin keskiarvo (puulastuja oli vanhennettu 5 päivää ennen siirrostusta). Vertailuna kokeet tehtiin myös kaupallisesti saatavilla olevalle tuotteelle Ophistoma pili-10 ferum, rekisteröity tavaramerkki CARTAPIPr97.

Kussakin kokeessa määritettiin uutettava DCM määrä julkaisussa TAPPI Procedure T204 OS-76 esitetyn menetelmän mukaisesti. Klason ligniinin analyysi tehtiin valikoiduilla haapapuulastunäytteillä indikaatto-15 rin saamiseksi ligniinin hajoamiselle näytelastuissa; viiden perusmonosakkaridin kvantitatiivinen määritys (glukaani, mannaani, arabinaani, ksylaani ja galaktaa-ni) tehtiin absoluuttisesti puun hiilihydraattikoos-tumuksen määrittämiseksi. Klason ligniinin analyysi 20 tehtiin yleensä julkaisussa TAPPI T249 cm-85 "Carbohydrate composition of extractive-free wood and good pulp by gas-liquid chromatography" (1984; TAPPI) ; esitetyn menetelmän mukaisesti. Klason ligniinin ana- j. lyysi TAPPI T249 cm-85 menetelmän mukaan on seuraavan- 25 lainen: näytteet hydrolysoidaan rikkihapolla käyttäen kaksivaihetekniikkaa; osa hydrolysaatista neutraloidaan ja näytteessä olevat sokerit pelkistetään natri-umborohydraatilla alditoleiksi, jotka sen jälkeen ase-tyloidaan etikka-anhydridillä ja pyridiinillä ja aldi- » · : 1 30 toliasetaatit liuotetaan sen jälkeen metyleeniklori- diin ja injektoidaan kaasukromatografiin. Edelleen va-likoiduilla haapapuulastunäytteille tehtiin hiilihyd-

I I

raattianalyysi selluloosan ja hemiselluloosan hajoami- • · ‘1’ sen arvioimiseksi. Taulukossa 6 on esitetty tutkittu- ; 35 jen näytteiden tulokset, %:na DCM uutteita ja %:na

* I I

Klason ligniiniä ja taulukossa 7 on esitetty valikoitujen näytteiden hiilihydraattianalyysi.

20 112254

Taulukko 6-Siirrosteen määrä, %DCM uutteet ja %Klason ligniini

Sieni myseelin % % märkäpaino/ DCM uute Klason __400g puuta___ligniini ei-siirrostettu 0 1,92 j äädytetty kontrolli____ ei-siirrostettu 0 1,61 18,0 taustakontroll i____

Ophiostoma pi- 4xl08 CFUa> 1,37 liferum CARTAPIPr97____ S . commune__21 g__1,33__17, 9 T.biforme 22 g 1,29 18,1 5 a) CFU on pesäkkeitä muodostava yksikkö, joka perustuu ainoastaan O.piliferumin itiöiden laskuun (tuote sisältää vain itiöitä).

• *

Taulukko 7 - Hiilihydraattianalyysi f 10 _^_==^==_==^_^===_==^ • Näyte arabi- ksylaani mannaani galak- glukaani » · __naani__taani__ : tausta- 0,33 18,0 1,3 0,4 45,1 kontrolli______ T.biforme 0,13 17,9__1^4__0^5__43, 9 S. commune 0,23 18,4 1,2 0,5 45,3 • 1=^=^==^^^=^== ' ^^=^=^=t^===^=^^^^= »

Kuten voidaan havaita Klason ligniinin testituloksista, keksinnön mukaiset sienikannat eivät ha-välttävästi vaikuttaneet puulastunäytteiden ligniini-\ 15 pitoisuuteen. Yllättävästi, keksinnön mukaiset sieni- kannat saivat aikaan huomattavan pihkan vähenemisen 112254 21 näytteissä ottaen huomioon että CARTAPIPr97 pidetään tehokkaana pihkan hajottajana.

Kuten taulukon 7 tuloksista on havaittavissa, keksinnön mukaisilla sienillä käsiteltyjen haapapuu-5 lastujen hiilihydraattimäärissä ei tapahtunut laskua verrattuna taustakontrollin näytteeseen. Täten pihkan vähentämiskäsittelyjen seurauksena ei ole osoitettu tapahtuvan selluloosan tai hemiselluloosan vähenemistä .

10 ESIMERKKI A

Sienten kasvuominaisuudet nestemäisissä ravi s telukasvatuksissa

Schizophyllum communea ja Trichaptum biformea kasvatettiin erikseen nestemäisissä ravistelukasva-15 tusastioissa käyttäen 50 ml mallas/hiivauute-alustaa, joka oli valmistettu liuottamalla 20g mallasuutetta ja 2g hiivauutetta 1 1 tislattua vettä. Alusta siirros-tettiin pienellä määrällä myseeliä, joka kasvoi aktiivisesti mallas/hiivauuteagar-alustalla. Astiaa ravis-20 teltiin 200 rpm 23-25 °C lämpötilassa 5 päivää ja Imi steriiliä näytettä kustakin kasvatuksesta poistettiin ;.· mikroskooppista analyysiä varten. Kummassakin viljel- : mässä oli tiheä kasvusto myseelipalloja ja viljelmä- ;· massan todettiin sisältävän noin 40-50% blastosporeja *· 25 (noin 40% T .biformella ja 50-60% S. communella) . Kum paakin tuotetta voidaan käyttää siirrosteena tai pro-*t sessoida eri tavoin erilaisten siirrostemuotojen saa miseksi, esim. homogenisoimalla ja jäädyttämällä myöhempää käyttöä varten. Oleellisesti viljelmän itiöihin 30 perustuvat siirrosteet voidaan valmistaa myös pakkas-kuivauksella.

t »

Claims (13)

112254

1. Menetelmä paperipuun pihkapitoisuuden laskemiseksi, tunnettu siitä, että paperipuuhun lisätään yksi tai useampi siirroste, joka koostuu yhdes- 5 tä tai useammasta sienestä, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluu Schizophyllum commune, Trichaptum biforme ja Phanerochaete gigantea, ja että ylläpidetään sienen kasvua edistäviä olosuhteita, ja mainitulla sienellä on ainakin kyky vähentää pihkapitoisuutta ja kasvaa 10 ei-steriloiduilla Southern Yellow-männyllä ja haapa-puulla, kuten kannoilla NRRL No 21056, NRRL No 21055 ja/tai NRRL No 21054.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siirrostetta on riittävä 15 määrä saamaan aikaan sienen kasvu siirrosteesta vähentämään paperipuun pihkapitoisuutta, ylläpidettäessä siirrostettua paperipuuta olosuhteissa, jotka mahdollistavat sienen kasvun siirrosteesta aikana, joka on riittävä saamaan aikaan paperipuun pihkapitoisuuden 20 vähenemisen siirrostetun sienen kasvun avulla.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siirroste koostuu Phanerochaete gigantea: sta.

,, 4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen j* 25 menetelmä, tunnettu siitä, että siirroste, joka ; muodostuu yksinomaan tai valtaosaltaan rihmastosta, » » · 0.5-10 g rihmastoa per 100 g paperipuuta, ja siirroste, joka muodostuu yksinomaan tai valtaosaltaan iti-öistä, 106-1010 CFU per 1 kg paperipuuta, lisätään ja 30 ylläpidetään 10-40 °C lämpötilassa 3-40 vuorokautta.

» *; 5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siirroste, joka muodostuu yksinomaan tai valtaosaltaan rihmastosta, 1-5 g rihmastoa per 100 g paperipuuta, ja siirroste, jo- • · ‘..I 35 ka muodostuu yksinomaan tai valtaosaltaan itiöistä, » » • · 23 112 2 5 4 107-109 CFU per 1 kg paperipuuta, lisätään ja ylläpidetään 22-28 °C lämpötilassa 4-20 vuorokautta.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ei-steriloitu pa- 5 peripuu siirrostetaan sen pihkapitoisuuden vähentämi seksi .

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että paperipuu käsittää puutavaran, tukit tai puulastut, ylläpidettäessä 10 puulastuja 22-28 °C lämpötilassa 4-30 vuorokautta.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että paperipuu koostuu puulastuista, ja siirroste lisätään suihkuttamalla puulastuja siirrosteella ennen puulastujen kasaamista 15 massaan.

9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siirroste on saatu biologisesti puhtaasta sieniviljelmästä.

10. Schizophyllum communen, Trichaptum bifor- 20 men ja/tai Phanerochaete gigantean käyttö paperipuun käsittelyssä pihkapitoisuuden vähentämiseksi.

11. Schizophyllum commune-lajin eristetty : kanta, jolla on kaikki NRRL No 21056 karakterisoivat ··· ominaisuudet.

12. Trichaptum bif orme-laj in eristetty kanta, jolla on kaikki NRRL No 21055 karakterisoivat ominai-suudet.

13. Phanerochaete gigantea-lajin eristetty kanta, jolla on kaikki NRRL No 21054 karakterisoivat • 1' 3 0 ominaisuudet. » · • · « • · • · I I t > · · • · 112254