SE411463B - Forfarande for framstellning av cellulosamassa medelst mikroorganismer - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 H0 73053944» _. ' 2 lignin, och enzymer, som nedbryter cellulosa och andra kolhydrater i veden. Nedbrytningen av ligninet är i och för sig önskvärd, men när dessa organismer utvecklar sig fritt i en flishög eller liknande ned- bryter de även cellulosan, vilket givetvis icke är önskvärt.

Huvudsyftet med föreliggande uppfinning är att påverka vitrötasvampar och andra mikroorganismer med förmåga att producera ligninnedbrytande organismer så, att de specifikt löser ut lignin ur ved och lämnar cellulosan och företrädesvis även andra kolhydrater väsentligen oangripna. Denna påverkan sker genom genetisk förändring av dessa svampar, så att deras förmåga att bilda cellulosanedbryt- ande enzymer (cellulas) nedsättes.

Generellt innebär uppfinningen, att cellulosa- och lignin- haltigt utgångsmaterial, såsom ved, behandlas med en organism, som har förmåga att bilda ligninnedbrytande enzymer, under sådana betingelser, att en väsentlig nedbrytning av ligninet utan väsentlig påverkan av cellulosan sker.

Uppfinningen består väsentligen i att behandla utgångs- materialet med en mutant av en organism, som av naturen bildar lignin- nedbrytande och cellulosanedbrytande enzymer, varvid denna mutant har nedsatt förmåga att bilda cellulosanedbrytande enzymer.

Framtagning av lämpliga mutanter kan ske genom behandling av sporer av vitrötasvampar, t.ex. Polyporus adustus eller Sporotrichum pulverulentum Novobranova (vilken i litteraturen beskrivits under namnet Chrysosporium lignorum Nilsson), med mutationsframkallande medel på i och för sig känt sätt, t.ex. genom bestrålning med ultra- violett ljus. De behandlade sporerna underkastas sedan en sorterings- process enligt i och för sig kända principer för utsortering av mutanter med nedsatt förmåga att bilda cellulonsanedbrytande enzymer (cellulas). Exempelvis kan de behandlade sporerna spridas på cellu- losaplattor, varvid man tillsätter ämnen, som påverkar svampen att växa i koloniform. Om en kolonis cellulosanedbrytande förmåga är opåverkad av mutationsbehandlingen, visar sig detta genom att en klarningszon bildas runt kolonien, där cellulosan har brutits ned.

Om ingen sådan zon bildas, tas detta som indikation på att inga cellulosanedbrytande enzymer bildas, d.v.s. i ifrågavarande koloni är en cellulasnegativ mutant. Dessa kolonier utväljes för fortsatt odling för framtagning av den önskade organismen, som användes vid den senare behandlingen av det cellulosahaltiga utgångsmaterialet.

Organismer, som kan användas för utveckling av dylika mutanter, är framför allt Polyporus och Sporotrichum pulverulentum (Chrysosporium lignorum) samt vidare Peniophora gigantea, Trametes 10 15 20 25 30 35 H0 730539lv4 cinnabarina, Polyporus hirsutus, Pycnoporus sanguineus, Polyporus versicolor, Polyporus zonatus, Phlebia radiata.

För utförande av mutationsbehandlingen är det, som ovan berörts, nödvändigt att svampen kan fås att växa i koloniform på agarplattor för att önskade stammar skall kunna skiljas från andra stammar. Betingelser, under vilka koloniväxt av ifrågavarande svampar ernås, kan fastställas av fackmannen genom försök eller hämtas ur litteraturen, när det gäller förut kända mikroorganismer. Exempelvis bildar Polyporus adustus kolonier vid pH 3,2, medan tillsats av Gypscphila-saponin gynnar koloniväxt vid Sporotrichum pulverulentum.

Andra ämnen, som ger koloniväxt vid olika vitrötasvampar, är amygdalin, salicin, triterpenglykosider (aescin, avenascin, primulasyra, NHQ-glycyrrhizinat, quillajasaponín), steroidglykosider (spirostanol- glysid, spirosolanolglykosid, solanidanolglykosid).

I Även svampar, som ej bildar sponer i laboratoriet, kan muteras genom fragmentering och bestrålning av mycel. Som exempel på sådana svampar kan nämnas Phellinus isabellinus, Trametes pini, Asterodon ferruginosus, Pholiota nmtabilis, Polyporus abietinus, Polyporus rutilans, Stercum gausapatum, Stereum hírsutum.

Nedan beskrives närmare framtagning av icke cellulasals- mutanter av Polyporus adustus. av Polyporus adustus bestrålades med ultraviolett trande Sporer ljus genom att en 20 ml vattensuspension (106 sporer) placerades i en 9 cm petriskål och bestrålades under 5 min med en 30 W kvick- silverlampa, vars emissionsenergi var till ca 65 % vid 25H nm. Petri- skålen var placerad 150 cm från lampan, varvid lampans intensitet på detta avstånd var 83 uW/cmz. 3 - 6 % av sporerna överlevde behand- lingen.

Hutanter utvaldes genom att en 1 ml suspension av muterade sporer, innehållande 150 överlevande sporer, infördes i en petri- skål innehållande 20 ml agarmedium med närsalter (ingen kolkälla).

Mediets pH inställdes på 3,2 med saltsyra. Omedelbart efter inoku- leringen sattes 8 ml flytande agarmedium (pH 3,2) till varje platta.

Mediet innehöll 1 % Walseth-cellulosa, 0,05 % glykos och närsalter.

Under dessa betingelser bildar Polyporus adustus täta kolonier.

Efter två veckor utvaldes de kolonier, som icke hade bildat en klar zon (antydande nedbrytning av cellulosan) ochlitsattes för ytterligare sållning genom odling i provrör på cellulosamedium. Om svampen icke hade orsakat klarning av mediet efter 1 månad, betraktades den som en cellulaslös mutant och tillvaratogs. 10 15 2D 25 30 35 730539lv-4 u På så sätt framtogs 15 cellularlösa. mutanter bland 4 kolonier från petriskâlarna. Dessa mutanter undersöktes när- 9 X 10 mare på förmåga att nedbryta andra i ved ingående polymerer, d.v.s. xylan, zglukomannan, pektin och lignin. De undersöktes också på för- måga att nedbryta laminarin. För mätning av polysackaridnedbryt- ningen odlades stammarna i provrör på ett fast medium, som innehöll en av polysackariderna. Efter två veckor mättes djupet (i mm) av den klara zonen. Ligninnedbrytningen mättes genom att stammarna odlades i petriskålar med ligninagar. Efter 1 månad bestämdes mängden förbrukat lignin (i %). Följande resultat erhölls.

Tabell I Nedbrytning av cellulosa, glukomannan, xylan, pektin och lignin av naturlig Polyporus adustus och av cellularlösa mutanter.

Substrat Stam cellulosa xylan glukomannan laminarin pektin lignin naturlig 12 24 18 28 21 38 % cel-3 0 0 0 28 21 35 % Gel-u o o' o 29 16 as % cel-5 0 0 0 26 21 43 % cel-6 0 0 0 28 21 52 % cel-7 0 12 O 30 ' 23 43 % cel-21 0 0 0 28 23 36 % cel-22 0 0 0 28 27 38 96 cel~25 0 0 0 27 23 H2 % cel-27 0 5 D 33 23 30 % cel-28 0 1H 0 29 21 43 % Cel-30 0 12 0 29 23 1I-2 Qi cel-101 0 0 0 28 22 38 % cel-102 0 0 0 28 21 _ 6 % ce1-1os u o o än 21 - cel-108 0 0 0 28 22 30 % Resultaten visar, att det är möjligt att framställa mutanter, vilka har väsentligen samma förmåga att nedbryta lignin som den naturliga stammen, men har väsentligt nedsatt förmåga att nedbryta cellulosa och andra polysackarider och därför kan an- vändas för dclignificring av ved och andra cellulosa- och lignin- 10 15 20 25 30 35 H0 7305394-4 haltiga utgångsmaterial utan väsentlig inverkan på cellulosan. På liknande sätt kan mutanter med samma egenskaper framtagas av andra vitrötasvampar, såsom Sporotrichum pulverulentum.

Behandlingen med mikroorganismen enligt uppfinningen kan ske genom att utgångsmaterialet, t.ex. ved i form av flis, ympas med en uppslamning av sporer av ifrågavarande organism i ett medium, Som innehåller fln*mikroorganismens utveckling erforderliga närings- ämnen och i förekommande fall tillsatsämnen eller inhibitorer för reglering av mikroorganismens verksamhet. Exempelvis kan en flisstack besprutas med en sådan uppslamning. Materialet får därefter ligga under erforderlig tid för att väsentlig nedbrytning av ligninet utan 'väsentlig påverkan av cellulosan skall äga rum. Denna tid kan bero- ende på mikroorganismens art och de yttre betingelserna, t.ex. lufttemperaturen vid lagring av stacken utomhus, varirera från exempel- vis en vecka till en månad eller några månader. Eventuellt kan mate- rialet värmas åtminstone under de inledande skedena av organismens utveckling för att påskynda behandlingen, men i regel upprätthåller organismen själv en lämplig temperatur, t.ex. 30 - 50°C, exempelvis i en flisstack. Eventuellt kan det också vara lämpligt att sörja för omblandning och/eller luftning.av materialet för att säkerställa en jämn nedbrytning av hela satsen.

Med "väsentlig nedbrytning av ligninet" avses att åt- minstone ca 20 %, företrädesvis ca 50 %, helst ca 75 % av utgångs- materialets lignininnehåll bör vara nedbrutet. Vad cellulosainnehållet beträffar, bör högst 25 % därav, helst högst 10 % därav vara nedbrutet för att ett ekonomiskt tillfredsställande massautbyte skall erhållas.

Det kan även vara önskvärt att före ympningen med den önska- de mikroorganismen behandla utgångsmaterialet så, att eventuellt när- varande icke önskvärda cellulosanedbrytande organismer förstörs.

Det efter behandlingen av vedflis med míkroorganismen erhållna materialet är till sin beskaffenhet jämförligt med halv- kemisk massa. Det kan underkastas fortsatt uppslutning med kemiska - metoder, såsom sulfat-, sulfit- eller syrgaskokning, varvid givetvis koktiden för samma slutliga utbyte blir kortare än vid kokning av vedflis, för framställning av massa med i huvudsak samma egenskaper som vanlig kemisk massa och användbar för samma ändamål. Det kan också efter mekanisk defibrering användas såsom sådantför de ändamålför vilka man vanligen använder halvkemisk massa eller slipmassa. Även om förfarandet enligt uppfinningen l första hand syftar till att framställa en produkt, som är användbar som pappers- 10 15 20 730539l+4æ massa och liknande, kan det även få användning i andra sammanhang.

Sålunda kan kreatursfoder framställas genom behandling av utgångs- material, t.ex. halm, bagass, som har för stor halt lígnin för att utgöra ett lämpligt foder, med mikroorganismer enligt uppfinningen för minskning av lígninandelen.

Uppfinningen belyses av nedanstående utföríngsexempel.

Exempel 1 Till en 100 ml Erlenmeyerkolv med 10 g vermíkulit (skamol) sattes 20 ml av en 2 % maltextraktlösning. Björkklotsar (20 X 20 X 10 mm) lades i eller ovanpå vermikulitlagret. Därefter autoklaverades kolven och ympades med en mycelsuspension av den cellulasnegativaa mutanten Cel 6 (tabell I) av Polyporus adustu ¿ Kolven inkuberades i rumstemperatur under den tid som anges i tabell II.

Behandlingen utfördes på sanma sätt som i exempel 1, men kolvarna ympades med mutanten Cel HH av Sporotrichum pulverulentum íghrysoporium ligngrgm). Cel UH är en cellulaslös mutant av Sporotriohum, vilken framtogs på i princip samma sätt som ovan be- skrivs i samband med framtagning av cellulaslösa mutanter av Polyporus adustus.

I varje exempel utfördes bestämningar av halterna lignin, cellulosa och xylan på prov av utgángsmaterialet före behandlingen med svampen. Efter den i tabell II angivna inkubationstiden skildes det kvarvarande fasta vedmaterialet från vätskan och motsvarande bestämningar gjordes, varpå förlusten av lignin, cellulosa och xylan beräknades i viktprucenL av den ursprungliga mängden. 730539114: Nr m om m om Mhmwm 1: fiwo wcmvdë E5PGmH5Qw>HD@ Efisofiüvofiomm N ß ß Z w 3 vfiwmm w 15 Pampas mfiwmdvm mdàomäfiüm F v. w. nä. w Éwmv Pmøflhßm vmflfimmm wmsafiwm nwvmsfihmw Uwwmcoflv |:mfl>X lmwofidflflwø nüwflwwfl |Pxfi> |mA5¥GH mmflmUw> Ewfifimwäo Hwmäwxm HH HfiwAmH 10 20 25 30 '7305394-4 Resultaten i tabell II visar, att de använda svamp- arna förmår att selektivt nedbryta lignin i ved med endast ringa påverkan av cellulosa och xylan. - 6 hade i stort sett samma beskaffenhet som halvkemisk massa framställd av flis.

Det kvarvarande vedmateríalet i exemplen 1 Exempel 3 Försök utfördes på samma sätt som i exempel 1 under användning av en cellulaslös mutant av Peniophora gigantea (cel 50) framtälld genom ultraviolettbestrålning av sporer. Följande resultat erhölls.

Tid (mån) Total viktminskning (få) Lignin- Cellulosa- förlust (%) förlust (%) 1 8,4 35,3 0 2 13,9 51,8 0 3 17,7 58,7 0 4 23,9 68,1 0 Exempel 4 Försök utfördes på samma sätt som i exempel 1 med en oellulaslös mutant av Phlebia radiata (cel 26) framställd genom ultraviolettbestrålning av sporer. Följande resultat erhölls.

Vedslag Tid Total viktminskning Ligninförlust Cellulosaförlust mån % % % Björk - 1 7,3 25,4 0 _" 2 14,4 49,2 2,5 " 2 14,9 51,6 0 Gran 1 5,9 17,2 “ _2 10,7 12,8 3,1 " 4 17,5 38,0 1,2 Tall 1 3,5 11,8 1,8 " 2 8,2 24,0 2,7 " 4 14,3 37,3 " 2 10,3 29,4 1,3 730539l|~4 De i det föregående omtalade på artificiell väg fram- ställda cellulaslösa mutanterna finns tillgängliga på Skogshögskolan.

Claims (4)

73053944; 10 PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av cellulosamassa ur ett lignin- och cellulosahaltigt utgångsmaterial, särskilt ved, varvid utgångsmaterialet behandlas med en organism, som har förmåga att bilda ligninnedbrytande och cellulosanedbrytan- de enzymer, ïk ä n n e t e c k n a t av att behandlingen utföres med en på konstlad väg framställd mutant av en vitrötesvamp, vars förmåga att bilda cellulosanedbrytande enzymer reducerats.

2. - Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n ei- t e c k n a t av att utgångsmateríalet behandlas med en stam av Polyporus adustus eller Chrysosporium lignorum, som har er- hållits genom ultraviolettbestrålning av sporer och utväljande av därvid bildande mutanter, som visar nedsatt förmåga att nedbryta cellulosa. I _

3. Förfarande enligt något av aptentkraven 1 - 3, k ä n n e t e c k n a t av att behandlingen utförs så, att 20 - 75 %.av utgångsmaterialets lignin och mindre än 25 % av ut- gångsmaterialets cellulosa nedbryts.

4. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 4, k ä n n e t e c k n a t av att den erhållna produkten underkastas behandling på mekanisk eller kemisk väg för frigöring av fibrerna. i ANFÖRDA PUBLIKATIONER: Sverige 309 153 (D21C 1/00) US 1 633 S94 (162-100), 2 960 444 (195-8), 3 617 436 (162-72)