SE460363B - Foerfarande foer frambringande av cellulasloesa stammar av vitroetesvampar - Google Patents

Description

47:» 10 15 20 2st 30 35 CD (N O\ ' 04 2 karakteriseras av produkten och frigörande av basidiosporer medan den asexuella formen kan innebära produktion av asexuella sporer (oidier, conidier, chlamydosporer och arthrosporer) som kan spridas och förbli in situ. Den sexuella formen innebär givetvis en långt större genetisk variation inom populationen än den asexuella formen.

Det har emellertid nu befunnits, att de på detta sätt fram- tagna cellulaslösa mutanterna av Sporotrichum pulverulentum ty- värr även har en (jämfört med vildstammen) väsentligt nedsatt förmåga att bryta ner lignin. I varje fall har det inte varit möjligt att på detta sätt få fram mutanter, som bryter ned lignin (eller delignifierar ved) i tillräcklig utsträckning för att vara användbara för tekniska ändamål. Detta synes sammanhänga bl.a. med att dessa mutanter är inte bara cellulaslösa, utan även xylanaslösa. På grund därav bildas inget eller mycket litet socker, vilket svampen behöver för att genom oxidation kunna producera H2 2, som oundgängligen erfordras för ligninnedbryt- ningen.

Föreliggande uppfinning syftar till att undanröja nack- delarna med den kända tekniken genom framtagning av stammar av Sporotrichum pulverulentum (= det asexuella stadiet av Phanero- chaete chrysosporium), vilka utmärker sig inte bara för väsent- ligt nedsatt eller t.o.m. eliminerad produktion av cellulaser, utan framför allt för bevarad eller t.o.m. ökad förmåga att ned- bryta lignin. Utgångsstammen, Sporotrichum pulverulentum finns allmänt tillgänglig och kan beställas från bl.a. American Type Cultur Collection, ATCC-nr 32 629.

Till grund för uppfinningen ligger upptäckten att Sporotri- chum pulverulentum har en fullständig sexualcykel (den bildar basidier och basidiesporer, tillhör alltså Basidiomyceter).

Denna upptäckt i kombination med bl.a. utveckling av metod för rutinmässig produktion av basidiosporer, utveckling av metod för rutinmässig test av hög ligninnedbrytningsförmåga, metod för ut- sortering av självfertila stammar, metod för test av korsnings- barheten har möjliggjort användning av klassiska genetiska meto- der, d.v.s. korsning av utvalda homokaryota stammar, för fram- ställning av organismer med önskade egenskaper, d.v.s hög lignin- nedbrytningsförmåga i kombination med cellulaslöshet. 4/ (n 10 15 20 25 30 35 460 363 3 Uppfinningen avser således ett förfarande för framtagning av mikroorganismstammar, som lämpar si; för delignifiering av ved och andra lignocellulosahaltige material, genom att homokaryota stammar av Phanerochaete chrysosporium K-3 (Sporotrichum pulverultentum) med hög ligninnedbrytningsförmåga korsas med cellulaslösa matanter (erhållna t.ex. genom bestrålningned ultraviolett ljus av konidiesporer från homokaryot mycel), såsom närmare anges i kravet 1. Dessa korsningar utföres med många gene- rationer av svampen, varvid allt bättre ligninnedbryt- ning erhålles samtidigt som egenskapen cellulaslöshet bi- behålles.

Uppfinningen avser likaledes ett förfarande för ut- vinning av cellulosa ur ett cellulosa och lignin innehållande material genom behandling av en lignin nedbrytande organism, vilket utmärkas av att man utför behandling med en på ovan angivet sätt erhållen stam av Sporotrichum pulverulentum vilken är cellulaslös, men harhög ligninnedbrytningsförmåga.

Uppfinningen kan särskilt tillämpas för utvinning av cellulosa (massa) ur ved, halm, bagass och andra lignocellulosahaltiga material genom delignifiering av veden medelst den enligt uppfinningen avsedda organismen. Härvid utsätts ved, lämpligen i finfördelad form, t.ex. såsom flis, för mikroorganismen under för denna utveckling lämpliga be- tingelser till dess att önskad mängd av ligninet har ned- brutits vilket beroende på omständigheterna kan variera från exempelvis så lågt som 1 % och upp till nära 100 % av ligninet, medan cellulosan kvarlämnas väsentligen opå- verkad, varefter cellulosan kan utvinnas. Beträffande behandlingsbetingelserna kan hänvisas till den ovannämnda amerikanska patentskriften 3 962 033.

En annan viktig tillämpning av den enligt upp- finningen framställda mikroorganismen ligger i dess använd- ning för nedbrytning av halm, bagass och andra ligno- cellulosahaltiga material i syfte att omvandla denna till en som djurfoder mera lämplig produkt. Även vedflis (t.ex. asp eller poppel) kan också delignifieras på detta sätt för att användas som djurfoder. 460 365 10 15 20 DS 30 35 u I det följande beskrives närmare framtagningen av en cellulaslös stam av Sporotrichum pulverulentum (Phanerochaete chrysosporium K-3). Utvecklingen bygger på upptäckten, att fruktkroppsbildning och produktion av basidiosporer före- kom hos den använda stammen och att svampen således var en basidiomycet med full sexualcykel. Det visade sig, att fruktkroppar av Sporotrichum pulverulentum producerade basidier med 2 - 8 sterigmata, varvid antalet 4 dominerade. I den här _beskrivna undersökningen användes basidiosporer från basidier med fyra sterigmata i korsningsexperimenten. Av en av dessa stammar, betecknad Phanerochaete chrysosporium K-3 erhölls genom selektion och korsning av homokaryotiska basidiosporkulturer nya stammar enligt ett förfarande, som åskådliggöres av figur 1. Dessa stammar betecknas vad be- träffar de cellulaslösa 3113, 13132-85, 13132-118, 85118 vad beträffar de cellulaspcsitiva K~3, 31, 132, 13132. Den cellulaslösa (Cel_) stammen 3113 erhölls genom ultravio- lettbestrâlning av stam 31. Kulturerna vidmakthölls på granflis (Picea abíes). 1. Selektion av ensporiga stammar av S. pulverulentum Som ovan nämnts, hade det konstaterats, att frukt- kroppar av Sporotrichum pulverulentum producerade basidier med 2 - 8 sterigmata. Detta visade sig komplicera kors- ningarna och tolkningen av resultaten vid korsning av valda homokaryotiska stammar. Det observerades, att när valda homokaryotíska mycel, härrörande från basidiosporer av basidier med 2 - 8 sterigmata korsades på björkvedsmjölagar- medium mycket få av stammarna alstrade basidiosporer. I I experiment där cellulaspositiva (Cel+) homokaryoter här- rörande från basidiosporer av basidier med endast U sterig- mata korsades med cellulaslösa (Cel_) stammar här- rörande från stammar med varierande antal sterigmata, var i endast 1 på 85 från P1 valda homokaryoter Cel . Efter a D flera misslyckande korsnings- och selektionsförsök be- slöt man att använda endast basidiosporer från basidier med fyra sterigmata i korsningsförsöken. Eftersom groning av enkla konidiosporer resulterade i heterokaryoter, var 10 15 20 25 30 460 63 (21 5 det möjligt att välja enporiga konidiosporkulturer av §. pulver- ulentum för produktion av basidier med endast fyra sterigmata.

Enkla groende konidiosporer av S. pulverulentum isolerades efter 16 timmars tillväxt på Petriplattor innehållande 5 ml 3 % maltextrakt och 2 % agar och inkuberades vid 39°C. Isoleringen övervakades mikroskopiskt för att säkerställa, att kolonierna uppstod ur enskilda konidiosporer. När konidiosporer från dessa kolonier överfördes till fruktkroppsinducerande medium exempelvis ett björkmjölsmedium, visade alla de granskade stammarna den för Phanerochaete karakteristiska heterokaryotiska fenotypen och fruktkroppsbildningen. 20 sådana stammar användes i försök för bestämning av utvecklingen av 14CO2 från 14 C-ringmärkt syntetiskt lignin (som mått på ligninnedbrytningsförmâgan). En stam (K-3) 14 Cz satta korsningsförsök. som visade hög -utveckling i dessa försök valdes för fort- 2. Isolering av cellulaslösa stammar Den homokaryotiska stammen 31 valdes för mutationsexperi- ment. Genom UV-behandling av konidiosporer av denna stam och urval av cellulaslösa mutanter på i och för sig känt sätt er- hölls flera cellulaslösa stammar, och en av dessa, Cel--stammen 3113, användes vid fortsatta korsningar med Cel+- och Cel_- stammar för att erhålla Cel_-heterokaryoter, som visade hög 14 C02-utveckling från 14C-ringmärkt lignin. 3. Korsningsförsök Enporiga kulturer av basidiosporer användes för undersök- ning av 1igninnedbrytningsförmågans ärftlighet. Homokaryotiska 14C-ringmärkt föräldrar med ökad förmåga att frigöra 14CO2 ur lignin, jämfört med K-3, parades och utvaldes för homokarytisk avkomma. 4. Nedbrytning av lignin i ved De cellulaslösa stammarna 3113, 13132-85, 13132-118 och 85 118 tillsammans med P. chrysosporium K-3 undersöktes i vednedbrytningsförsök, där skivor (2 X 20 X 50 mm) av gran (Picea abies) och björk (Betula verrucosa) användes. 460 563 IJ* 6 Viktförlusterna och i synnerhet ligninförlusterna jämfördes mellan Cel--mutanterna och stammen K-3. Resultatet visade, att K-3, som nedbryter oellulosan, orsakade en högre vikt- förlust än Cel_-mutanterna. Emellertid var den av mutan- terna orsakade ligninförlusten högre än den av K-J orsakade. m

Claims (7)

10 15 20 25 30 1 g 460 saa PATENTKRÅV

1. Förfarande för framtagning av cellulaslösa stammar, som samtidigt har hög förmåga att nedbryta lignin, k ä n n e- t e c k n a t av att man utgående från vitrötesvampen Sporotrichum pulverulentum (= det asexuella stadiet av Phanerochaete chrysosporium) med full sexualcykel på i och för sig känt sätt frambringar en cellulaslös mutant därav och korsar denna med en naturlig homokaryot stam ax samma svamp, vilken har hög lignínnedbrytningsförmåga, och att därefter i avkomman sådana stammar utväljs, som har hög ligninnedbrytningsFörmåga i kombination med cellulaslöshet.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e- t e c k n a t chrysoaporium.

3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, av att koraningarna utföres i flera gene- av att vitrötesvampen är Phanerochaete k ä n n e- t e c k n a t rationer.

4. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att den cellulaslösa mutanten erhålles genom behandling av antingen konidiesporer från ett homokaryot mycel eller basidiesporer av en naturlig stam av vitrötesvampen med ultraviolett strålning eller andra mutagena medel.

5. Förfarande för delignifiering av lignin och cellu- av att losa innehållande material, k ä n n e t e c k n a t materialet utsättes för inverkan av en enligt patentkravet 1 frambringad stam av vitrötesvamp.

6. Förfarande enligt patentkravet 5, av att det behandlade materialet utgöres av k ä n n e- t e c k n a t ved.

7. Förfarande enligt patentkravet 5, att det behandlade materialet utgöres k ä n n e- t e c k n a t av av halm, bagass eller andra lignocellulosahaltiga jord- bruksavfall.