DE69121338T2

DE69121338T2 - Pilze zur Verminderung des Pechgehaltes, ihre Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE69121338T2
Application number: DE69121338T
Authority: DE
Inventors: Roberta Lee Farrell; Yitzhak Hadar; Philip A Wendler; Wendy Zimmerman
Original assignee: Clariant Finance BVI Ltd
Current assignee: Clariant Finance BVI Ltd
Priority date: 1990-07-31
Filing date: 1991-07-26
Publication date: 1997-03-06
Anticipated expiration: 2011-07-27
Also published as: EP0470929A2; MY129967A; ATE141352T1; ES2091898T3; NZ239162A; PT98500B; NO309391B1; US5998197A; KR0182314B1; FI913620A0; EP0470929A3; NO912936L; PT98500A; FI913620A; AU646678B2; CA2047900A1; AU8140191A; KR920002766A; NO912936D0; EP0470929B1

Description

Die Erfindung betrifft neue Pilze mit besonders erwünschten Eigenschaften, ihre Herstellung und ihre Verwendung zur Reduktion des Harzgehaltes in Holz für Papierbrei
In der EP-A-387187 wird die Verwendung von gewissen holzdurchdringenden Pilzen zur Reduktion des Harzgehaltes in Holz für Papierbrei beschrieben. Solche Pilze gehören zur Klasse der Ascomyceten und Deuteromyceten und können aus einer grossen Vielfalt von Gattungen, welche in der Unterabteilung Ophiostomatales als auch in den imperfekten, dieser Unterabteilung zugeordneten Erscheinungsformen eingeteilt sind, ausgewählt werden. Beispiele solcher Ophiostomatales Gattungen umfassen ohne Einschränkung Ceratocystis, Ceratocystiopsis, Graphium, Leptographium, Ophiostoma, Phislocephala und Sporothrix, wie sie unter Bezugnahme auf Gattungsbegriffe definiert sind, die in Harrington T. C. , New combinations in Ophiostoma or Ceratocystis species with Leptographium anamorphs, Mycotaxon, 1987, 28: 39-43 und in Leptographium Species, Their Distributions, Hosts and Insect Vectors, Harrington T. C. & Cobb F. W. 1988, Seiten 1-39, APS Press, St. Paul, Minnesota dargestellt werden als auch Rhinocladiella und Hyalodendron, wie sie unter Bezugnahme auf Hawksworth et al. Ainsworth and Bisby's Pilzverzeichnis, 1983, 7te Ausgabe, Commonwealth mycological institute, Kew, Surrey, England definiert sind. Andere Beispiele von Gattungen (welche nicht als Ophiostomatales eingeteilt sind), worin durchdringende Pilze als einzelne Spezies gefunden werden, umfassen Alternaria, Cadophora, Chloridium, Diplidia, Dactylella, Fusarium, Hormodendron, Hormonema, Phialophora, Sphaeropsis, Trichosporium, Codinaea und Valsa, wie sie unter Bezugnahme auf Hawksworth, et al. (oben) definiert werden. Bevorzugte Pilze werden in den Gattungen Chloridium, Dactylella, Phialophara und Valsa als auch in den Gattungen gefunden, welche als Ophiostomatales oder als die imperfekten Erscheinungsformen klassiert werden, die den Ophiostomatalen zugeordnet sind, die letzteren Gattungen sind besonders bevorzugt. Insbesondere werden die Pilze in den Gattungen Ceratocystis, Ceratocystiopsis, Graphium, Leptographium und Ophiostoma gefunden, dieses letztere wird besonders bevorzugt.
Die angegebenen Pilzklassen umfassen viele sogenannte verschmutzende Pilze, und insbesondere die tief verschmutzenden oder durchdringenden Pilze, welche den Nachteil besitzen, das Holz zu färben oder zu verschmutzen, typischerweise mit einer dunkelgrauen oder dunkelblauen oder schwarzen Verschmutzung. Solch eine dunkle Verschmutzung kann es notwendig machen, den Zellstoff, welcher aus den behandelten Holz für Papierbrei erhalten wurde, stärker zu bleichen, was unerwünscht ist.
In Acta Forestalia Fennica, Band 158, 1977, Helsinki, beschreibt A.-M. Hallaksela "Microbial Flora Isolated From Norway Spruce Stumps" beschreibt die Gewinnung von leicht gefärbtem Holz,verursacht durch den Wuchs von Deuteromycotina Pilzen oder Bakterien.
GB-A-1 189 604 beschreibt ein Verfahren zur Zersetzung des Harzes, welches sich in Holzschnitzeln befindet, durch Pilze, welche auf der Oberfläche des Holzes wachsen, eher als durch holzdurchdringende Pilze.
Natürlich vorkommende Pilze, welche "verblasst" sind oder weniger gefärbte Stämme wurden mit der Absicht isoliert, den oben erwähnten nachteiligen Effekt zu unterdrücken. Es wurde jedoch gefunden, dass es solchen "verblassten" Isolaten im allgemeinen an einer relativen Wachstumsfähigkeit oder Virulenz auf nicht-sterilisiertem Holz fehlt, was für die beabsichtigte Verwendung notwendig ist. Folglich würden die helleren Pilze höhere Dosen und/oder längere Behandlungszeiten benötigen, um dieselben Resultate bei der Reduktion des Harzgehaltes von Holz für Papierbrei zu ergeben als mit den dunkler wachsenden Spezies erwartet werden kann. In der Literatur wurde angeführt, dass die Melanin Produktion mit der dunkel verschmutzenden Fähigkeit der Pilze und mit ihrer Virulenz oder Fähigkeit zum konkurrierenden Wachstum im nicht-sterilen Umfeld verbunden ist, welches in den geernteten Holzformen vorhanden ist, die als Rohmaterial in der Zellstoffindustrie verwendet werden.
Es wurde nunmehr gefunden, dass neue Pilze mit besonders erwünschten Eigenschaften, mittels einer verbesserten Methode der Ascosporenisolierung und Auswahl im Hinblick auf ihre Fähigkeiten, den Harzgehalt von Holz für Papierbrei unter kompetitiven Wachstumsbedingungen zu senken, isoliert werden können.
Die Erfindung betrifft einen holzdurchdringenden, harzabbauenden Pilzstamm, bestehend aus einer isolierten Ascospore oder einem holzdurchringenden, harzabbauendem Pilzstamm, erhältlich von einer Ascospore der Klassen Ascomycotina oder Deuteromycotina, der eine oder beide der folgenden Characteristika aufweist:
1) nach 21 Tagen Wachstum beeinträchtigt er den Weissgrad eines sterilisierten Holzsubstrats nicht stärker als der Pilzstamm C-1 D5 (O. piliferum) mit der Zugangsnummer NRRL 18677, wächst jedoch stärker als der Ausgangspilz auf dem gleichen, jedoch nicht sterilen Holzsubstrat während einer Wachstumszeit von 10 Tagen;
2) nach 21 Tagen Wachstum produziert er auf einem sterilisierten Holzsubstrat einen höheren Weissgrad als der Pilzstamm C-1 (O. piliferum) mit der Zugangsnummer NRRL 18691, wächst jedoch nicht weniger als der Ausgangspilz auf dem gleichen, jedoch nicht sterilen Holzsubstrat während einer Wachstumszeit von 10 Tagen.
Solch ein neuer Pilzstamm kann:
a) eine isolierte Ascospore aus einer Kultur eines oder mehrerer Pilze der Klassen Ascomycotina oder Deuteromycotina;
b) eine biologisch reine Kultur des aus dieser Ascospore erhältlichen Pilzes;
c) ein Inoculum mit Sporen und/oder Mycelien, die aus einer Kultur gemäss b) abgetrennt sind;
d) eine biologisch reine Kultur eines Pilzabkömmlings des Pilzes, welcher aus jener Ascospore erhältlich ist, dieses Pilzderivat besitzt zumindest den harzabbauenden, holzaufhellenden Effekt und die kompetitive Wuchskapazität auf nicht-sterilem Holz des aus der genannten Ascospore erhältlichen Pilzes; und
e) ein Inoculum mit Sporen und/oder Mycelien, die aus einer Kultur gemäss d) abgetrennt sind.
"Abkömmling" bedeutet in diesem Zusammenhang jeder Pilz, welcher aus der Ascospore oder ihrer Nachkommenschaft durch Paarung, Mutation und andere bekannte Techniken erhältlich ist, welche Stammesveränderungen, inbegriffen Paarungen mit anderen homokaryotischen oder heterokaryotischen Pilzen, sowie Eigenpaarungen oder selbstbefruchtende Typen, erzeugt.
Die bevorzugten Pilze gemäss der Erfindung gehören zur Spezies Ophiostoma piliferum, wovon verschiedene Stämme beim Northern Regional Research Center (NRRL) in Peoria, Illinois, U.S.A. hinterlegt und denen die folgenden Zugangsnummern zugeordnet wurden:
Der richtig blauverschmutzender Pilz TAB 28 ist ein stärker bevorzugter Standard für die Wachstumsvirulenz und kann für die Paarung verwendet werden, beispielsweise mit dem hellen (hellgrauen) Isolat C-1 D5, welches bereits eine sehr gute Wachstumsvirulenz besitzt.
Das dunkelblaue oder im wesentlichen schwarze Isolat TAB 51 ist einer der Stämme, welcher für die Paarung mit den "verblassten" Isolaten, wie dem hellen (im wesentlichen weissen) Isolat C-1D84 verwendet wird.
Besonders bevorzugte, erfindungsgemässe Ascosporenpilze sind diejenigen, welche zumindest dieselbe Wachstumsvirulenz wie TAB 28 auf einem nicht-sterilen Substrat aufweisen, die jedoch im wesentlichen weiss auf dem sterilisierten Substrat, beispielsweise dem Substrat der südlichen Gelbkiefer (Southern yellow pine), wachsen. Solche Pilze umfassen den oben genannten WZ58, welcher aus dem Ausgangsstamm TAB51 und dem weissen Ascosporenstamm C-1D84 erhalten wurde. Der Stamm C-1D84 seinerseits wurde aus dem Ausgangsstamm C-1, einem verblassten (dunkelgrauen) Isolat des O. piliferum, erhalten, welcher aus einem Holz für Papierbrei im Staat Virginia, U.S.A. stammt.
Die Erfindung umfasst ferner jede biologisch reine Kultur oder Inoculum eines homokaryotischen Pilzes aus der Klasse der Ascomycotina oder Deuteromycotina, welche zumindest Wachstumsvirulenz auf einem nicht-sterilen Holzsubstrat besitzen und den Weissgrad desselben, jedoch sterilisierten, Substrats weniger beeinflussen als der Pilz mit der NRRL Zugangsnummer 18691. Stärker bevorzugt sind solche Pilze, welche diesbezüglich bessere Eigenschaften besitzen als die Pilze mit den NRRL Zugangsnummern 18671 oder 18678 und am meisten bevorzugt sind diejenigen Pilze, welche bessere Eigenschaften besitzen als der Pilz mit der NRRL Zugangsnummer 18755.
Eine geeignete Darzeichnungsform der erfindungsgemässen Pilze, wie sie im Anspruch 10 beschrieben wird, wird durch Fliessbetttrocknung eines Gemisches eines Sporen-enthaltenden Fermentationskonzentrats, welches in Wasser resuspendiert wurde, und eines inerten festen Trägers, welcher die Stabilität der Sporen nicht beeinträchtigt, beispielsweise Ton, wie Kaolin, erhalten.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung solcher Ascosporen oder deren Abkömmlinge durch Isolierung von Ascosporen aus einer Kultur von einem oder mehreren holzdurchdringenden, harzabbauenden Ausgangsstämmen der Klasse der Ascomycotina oder Deuteromycotina und Selektion eines oder mehrerer homokaryotischer Pilzen, die von diesen Ascosporen stammen, mittels der Kriterien, dass sie zumindest eine der oben erwähnten Charakteristika besitzen und vorzugsweise ebenfalls auf einem sterilisierten Holzsubstrat wachsen, um den Harzgehalt des Substrats um zumindest 20% nach nicht mehr als 21 Tagen des Wachstums zu senken.
Die Erfindung betrifft ferner eine Methode zur Reduktion des Harzgehaltes von Holz für Papierbrei durch Applikation eines Inoculums, welches aus homokaryotischen Pilzen gemäss der Erfindung oder den Nachkommen oder einer Mutante solcher Pilze erhalten wurde, auf ein Holz für Papierbrei oder einen Holzstoff der ersten Stufe und Beibehalten des inokulierten Holzschliffes oder Holzstoffes unter Bedingungen, welche das Wachstum des Pilzes erlauben. Vorzugsweise wird in solch einem Verfahren ein Pilz verwendet, welcher durch Reduktion des Harzgehaltes des sterilisierten Substrats um zumindest 25% nach einem Wachstum von nicht mehr als 21 Tagen gekennzeichnet ist, ohne den Weissgrad des Substrats um mehr als 10%, verglichen mit der unbehandelten Kontrolle, zu vermindern.
Die erfindungsgemässen homokaryotischen Pilze oder ein hiervon abstammender heterokaryotischer Stamm sind bei der Harzreduktion sehr wirksam, insbesondere auf nicht-sterilen Substraten, nach nicht mehr als 14 Tage Wachstum bei einem Inoculationsniveau unter 10¹&sup0; CFU (colony forming units = Kolonienbildende Einheiten) per kg der Substrate, wie raffiniertes Holz für Papierbrei und können sogar nach nicht mehr als 10 Tagen Wachstum auf solch einem Inoculationsniveau wirksam sein.
Erfindungsgemäss können die Ascosporen aus einer Kultur jeder Pilzspezies isoliert werden, welche zumindest einen dunkel- oder blauverschmutztenden Angehörigen oder Vertreter besitzt, inbegriffen verblasste, graugefärbte Angehörigen oder Varianten solcher Spezies, unabhängig davon ob solche Ascosporen aus selbst-fruchtbaren Speziesangehörigen oder durch Paarung von Speziesangehörigen entstehen. Falls zwei Pilze gepaart werden, bedeutet dies beispielsweise, dass jeder der beiden gepaart werden kann. Falls mehrfache Paarungstypen, welche mehr als zwei Paarungstypen enthalten, kombiniert werden, so bedeutet dies irgendeinen der gepaarten Pilze. Die meisten Pilze umfassen nur zwei Paarungstypen. Folglich, wenn zwei oder mehr Stammpilze bei der Produktion der Ascospore betroffen sind, so kann jeder Stammpilz zwecks Feststellung ob die Auswahlkriterien erfüllt sind herangezogen werden, vorausgesetzt derselbe Stammpilz wird bezüglich aller Kriterien bei jeder Evaluierung der fraglichen Ascospore immer herangezogen. Alle Stammpilze werden in einer Reihe von Evaluierungen jeweils einzeln für jeden Stammpilz getrennt für jede Ascospore herangezogen.
Die fraglichen Pilze, inbegriffen die blau (dunkel) verschmutztenden Pilzspezies (inbegriffen deren verblasste Angehörigen) werden im allgemeinen als heterokaryotisch angesehen, dies bedeutet, sie enthalten mehrfache Kerne, wobei jeder das volle Komplement von Genen enthält, welche notwendig sind, um den Lebenszyklus des Pilzes zu vervollständigen. Kandidaten für das Screening werden dadurch gewonnen, dass man dem Pilz gestattet unter bestimmten Bedingungen, wie festen Kulturen, beispielsweise auf Agar Platten, Sporen zu bilden, gefolgt von der Isolierung der Sporen, welche einzelne Kerne (Ascosporen) besitzen und wachsen lassen der Ascosporen als getrennte Kolonien (so Bildung von homokaryotischen Stämmen). Die isolierten Stämme werden danach duf die gewünschten Wirkungen getestet. Falls ein Stammpilz nicht selbst-fruchtbar ist, muss er mit einem geeigneten oder verträglichen Paarungspartner derselben Spezies gepaart werden, um Ascosporen zu ergeben, wie aus dem Stand der Technik bekannt ist. Alle möglichen Varianten von Verfahren zur Gewinnung von Ascosporen können verwendet werden. Solche grundlegenden Verfahren für eine solche Ascosporenauswahl sind wohlbekannt, obwohl wir hier ein verbessertes Ascosporenisolierungsverfahren im Zusammenhang mit solchen Pilzen anbieten. Pilze, welche als Stammpilze in das Verfahren einbezogen werden, können im Hinblick auf die erwünschten Eigenschaften vorgetestet werden.
Homokaryotische Isolate, wie im Fall von Pilzen, welche sowohl als Homokaryoten als auch als Heterokaryoten wachsen, können mit Hilfe von bekannten Methoden gepaart werden, um Ascosporenkulturen zu bilden. Jeder entstandene homokaryotische Pilz kann mit einem anderen Angehörigen derselben Spezies, inbegriffen seinem Stammpilz, gepaart werden, um Ascosporen zur Auswahl zu bilden, vorausgesetzt, dass geeignete Paarungstypen angegeben sind. Die Paarung solcher Ascosporenisolate kann mit einem anderen Ascosporenisolat oder mit einem wilden Typus stattfinden. Folglich ist es innerhalb des Bereiches der Erfindung die ursprünglich erhaltenen Ascospore(n) zu verwenden, um andere Ascosporen mit erwünschten verbesserten Eigenschaften zu erhalten, und solch eine Schaffung von neuen Ascosporen durch Paarung, falls erwünscht, fortzusetzen.
Das Verfahren kann bei allen Pilzen mit allen Farben, von weiss bis schwarz, angewendet werden, ob einzelne Stämme oder Varianten selbst-fruchtbar sind oder nicht, wie mit Hilfe von bekannten Methoden festgestellt werden kann. Es ist im allgemeinen bevorzugt zuerst den Paarungsvorgang durchzuführen, falls ein echt dunkel oder blau verschmutztender (nicht verblasster) Stamm untersucht werden soll, erwünschterweise mit einem Partner, welcher der echt blau verschmutztende ist und einem anderen, der ein hellerer Angehöriger ist. Vor der Paarung kann, falls erwünscht, das Basisverfahren mit selbst-fruchtbaren Stämmen verwendet werden, um ausgewählte Ascosporenisolate für die Paarung zu erhalten. Danach können die erhaltenen Isolate ebenfalls der Paarung unterworfen werden, abhängig davon, dass man geeignete Paarungstypen besitzt.
Falls ein hell oder weiss wachsendes Ascosporenisolat weiter gepaart werden soll, ist es bevorzugt es mit einem Stamm zu paaren, welcher dunkler und virulenter ist als der hellere Ascosporenstamm.
Folglich umfasst die Erfindung nicht nur individuelle Ascosporenisolate und ihre daraus resultierenden Pilze sondern auch alle daraus erhältlichen zusätzlichen Abkömmlinge, insbesondere diejenigen, welche zumindest das Niveau der erwünschten Eigenschaften der Stammascospore haben. Ein schliesslich ausgewählter Ascosporenpilz kann gepaart werden, um einen heterokaryotischen Pilz zur Verwendung beim Harzabbau zu ergeben, dies ist jedoch nicht bevorzugt, nachdem viele heterokaryotische Pilze gefunden wurden, welche die Neigung zur Instabilität einer oder mehrer der erwünschten Eigenschaften während des wiederholten Wachsens oder des Wachsens in grossem Massstab besitzen. Die Ascospore kann ebenfalls mutiert werden, um andere erwünschte Abkömmlinge zu ergeben, inbegriffen vom Menschen veranlasste Mutationen und solche, welche zumindest im wesentlichen die erwünschten verbesserten Eigenschaften der Stammascospore verwirklichen, werden ebenfalls von der Erfindung umfasst. Die Erfindung umfasst daher a) Ascosporen, b) Mutanten von Ascosporen und c) Nachkommen von a) und b).
Verfahren für die Fortpflanzung, allgemeine Trennung, Verbreitung und individuelle Isolierung von Ascosporen und das Wachstum und die Isolierung von Pilzen, welche sie erzeugen, sind wohlbekannt. Eine representative Literaturreferenz ist beispielsweise Upadhyay, H.P. (1981), A Monograph of Ceratocystis and Ceratocystiopsis; University of Georgia Press, Athens, Seiten 28-29. Eine Publikation mit spezifischen Hinweisen auf Ascosporen von Ophiostoma ist Brasier, C.M. und J.N. Gibbs (1976), Inheritance of Pathogenicity and Cultural Characters in Ceratocystis ulmi: Hybridization of Aggressive and Non-Aggressive Strains; Ann. Appl. Biol. 83, 31-37. Im allgemeinen wird der Stammpilz (oder die Pilze) bis zu einer Stufe kultiviert, wo die Ascosporenentwicklung genügend vollständig ist und die Ascosporen aus der Pilzmasse genügend freigesetzt oder abgesondert sind, sodass die Ascosporen im allgemeinen als Masse oder Sammlung abgetrennt oder gewonnen werden können, beispielsweise durch Pflücken von allen oder einer oder mehreren Portionen des viskosen, hydrophoben Ascosporen enthaltenden Materials im oberen Teil des Perithecium mit einer sterilen Zerlegungsnadel und Überführung auf ein spezialisiertes Suspensionsmedium für Sporen, wie Pinen, welches das hydrophobe Material auflöst und die Sporen in das Suspensionsmedium freisetzt. Das Medium (oder Teile hiervon), welches die Ascosporen enthält, wird danach verdünnt und die Verdünnung auf Platten ausgebreitet, welche ein geeignetes Wachstumsmedium für die Entwicklung eines Pilzwuchses auf fester Phase in einer Weise enthalten, welche den Ascosporen erlaubt, sich in diskreten oder individuellen Pilzkolonien zu entwickeln oder zu wachsen, welche für weiteres Wachstum in individuellen Kulturen, beispielsweise flüssigen Kulturen, gepflückt oder isoliert werden können, um ein Inoculum für die Evaluierung des von individuellen Ascosporen hergestellten oder gezeugten Pilzes zu ergeben.
Als ein Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass eine sehr hohe und geeignete Anzahl von lebensfähigen Ascosporen der angegebenen harzabbauenden Pilze erhalten werden kann, indem man die Ascosporen, wie man sie aus der Pilzkultur gewonnen hat, in ihrem hydrophoben Träger, einem nicht-toxischen Öl, welches das hydrophobe Material wirksam auflöst, aufnimmt oder verteilt, um die Sporen in dem Öl, vorzugsweise einem pflanzlichen Öl wie Maisöl, welches vom Pilz (als Nahrungs- oder Kohlenstoffquelle) konsumiert werden kann, freizusetzen und danach das Ascosporen enthaltende Öl mit einem (für den Pilz und seine Sporen) nicht-toxischen Öldispersionsmittel, welches aus einem der vielen bekannten Typen für die Dispersion solcher Öle, beispielsweise Detergenzien, wie dem wohlbekannten Triton X100, bestehen kann, behandelt. Die Ausbreitung oder das Auftragen des mit dem Dispersionsmittel versetzten Öls führt zu einer grossen Zahl von diskreten, lebensfähigen Ascosporen enthaltenden Tröpfchen dieses Öls und zusätzlich wird das Öl mit dem Wachsen des Pilzes verbraucht und von den Platten entfernt, wobei diskrete Pilzkolonien zurückbleiben, welche sogleich wiedergewonnen und zur Evaluierung weiter kultiviert werden können.
Die Auswahl von homokaryotischen Pilzen gemäss den Kriterien der vorliegenden Erfindung wird wie folgt durchgeführt:
Die Substrate erhält man aus frisch gefälltem Holz oder Baumstämmen, welche unmittelbar nach der Fällung während sieben (7) Tagen bei Raumtemperatur gelagrt und danach zu Holzspänen verarbeitet wurden, die sofort einer Evaluierung unterworfen (oder während kurzer Zeit bei 5ºC gelagert) werden. Holzspäne, welche nach sieben Tagen etwas anderes zeigen als isolierten oder nur wenig sichtbaren Wuchs von Naturpilzen wie blaue Verschmutzung papulaspora und trichoderma, werden zurückgewiesen. Solche Substrate werden ausgewählt, die frei sind von Astknorren. Individuelle Muster gleicher Grösse (Gewicht), die 200-400 Gramm erreichen, werden aus der Kollektion genommen. Die zu sterilisierenden Muster werden in einem Autoklaven bei 120ºC während 45 Minuten erhitzt. Die Inoculierung des Substrats wird so durchgeführt, dass so viele einzelne Holzteile als vernünftigerweise möglich kontaktiert, selbst wenn anfänglich nur 10-30% der Späne tatsächlich kontaktiert werden können. Die Holzspansubstrate werden in einen durchsichtigen Plastiksack von angemessener Grösse gegeben und die Späne werden in dem Sack ruhen gelassen und auf einer ebenen Fläche verteilt. Das Inoculum wird mit einem Augentropfer aufgetragen, wobei man nicht mehr als einen Tropfen auf die einzelnen Späne aufträgt. Der Sack wird danach dicht verschlossen und die Späne während 10 Sekunden innig durchgemischt/durchgeschüttelt, um das Inoculum auf die anderen Späne zu verteilen. Der Sack wird danach zugezogen oder um die Späne herum falls notwendig noch weiter verschlossen, damit zwischen den Spänen in einer stapelähnlichen Ansammlung guter Kontakt besteht. Alle inokulierten Substrate werden in der Dunkelheit aufbewahrt und danach evaluiert, die Aufbewahrung erfolgt bei Raumtemperatur mit Ausnahme der oben angeführten Fälle. Um die besten Pilze auf lokaler oder regionaler Grundlage zu erhalten, wird der Stammpilz bevorzugt von gefälltem oder totem Nutzholz oder anderen Formen von Holz für Papierbrei derselben Holzspezies isoliert oder deriviert, auf welche der vom Ascosporen abstammende Pilz bei der praktischen Anwendung verwendet wird, oder andererseits die Evaluierung auf Substraten des für die Verwendung anvisierten Holzspeziestypus durchgeführt, auf dem der Stammpilz erhalten oder von dem er hergeleitet wurde. Falls die Herkunft der Holzspezies des Stammpilzes unbekannt ist, wird eine vorausgehende Evaluierung auf sterilen und nicht-sterilen Holzspänen von verschiedenen unterschiedlichen Holzspezies und Sorten durchgeführt, von denen aus der Literatur bekannt ist, dass sie mit dem Stammpilz infiziert werden können und es wird eine Evaluierung auf derjenigen Holzspezies oder Sorte durchgeführt, auf der der Stammpilz den kräftigsten Wuchs aufweist. Die von Ascosporen abgeleiteten Pilze, welche die oben angeführten Kriterien unter Bezugnahme auf jeden erwähnten Stammpilz auf jeder der vielen bekannten Holzschliffquellen oder auf einer als Substrat anvisierten Holzspezies erfüllen, sind neu und nützlich im Zusammenhang mit der Erfindung. Die Kriterien werden durch den Ascosporenpilz am besten erfüllt, wenn das Substrat dieselbe Holspezies und Sorte ist, aus der der Stammpilz regional isoliert werden konnte. Für Ophiostoma und andere typische blaue Verschmutzungen, welche Kiefernweichholz befallen, kann eine Evaluierung auf der U.S. südlichen Gelbkiefer (southern yellow pine) erfolgen.
Die Evaluierung bezüglich der Kriterien der Harzreduktion erfolgt gemäss der Standard TAPPI Prozedur T204 OS-76 mit Methylenchlorid und wird auf sterilem Substrat durchgeführt, um den Einfluss anderer Organismen, welche natürliche nicht-sterile Substrate befallen, auszuschliessen. Im allgemeinen ist eine Harzreduktion von mindestens 20% in 21 Tagen für die geeignetesten Kandidaten erwünscht. Reduktionen von mindestens 25%, insbesondere von mindestens 30%, werden im allgemeinen die bevorzugten Kandidaten anzeigen. Falls die Kriterien in 21 Tagen erfüllt sind, wird ein Wiederholen der Beurteilungen und das Erreichen eines Niveaus von mindestens 20%, 25% oder 30% Harzreduktion in 14 Tagen üblicherweise die besonders bevorzugten Kandidaten anzeigen.
Eine bevorzugte Gruppe von Ascosporen für die Auswahl oder Ausgangsauswahl, besonders wenn ein Stammpilz mittel bis dunkelgrau ist und die Kriterien erfüllt werden, wird diejenige sein, welche einen Ascosporenpilz erzeugt, der den Harzgehalt des Substrats um mindestens 25% in nicht mehr als 21 Tagen reduziert, ohne den Weissgrad des sterilisierten Substrats um mehr als 10 Prozent, im Vergleich zu einer nicht behandelten, sterilisierten Kontrolle, herabzusetzen.
Der Weissgrad des Substrats wird auf standardisiertem Material, wie Sägespänen mit bestimmter Grösse festgestellt und mit einem Weissgradmesser, wie einem Photovolt Reflektometer, gemessen. Die Evaluierung betreffend den Weissgrad wird erwünschterweise für Testzwecke auf sterilen Substraten durchgeführt, wieder um den Einfluss von Organismen, welche natürlicherweise nicht-sterile Substrate infizieren, auszuschliessen und eine bessere absolute Bewertung des Farbeinflusses des Kandidaten zu erhalten. Diese Evaluierungen werden ebenfalls nach einem Wachstum von 21 Tagen durchgeführt. Falls eine Verbesserung des Weissgrades das Kriterium ist, wird eine Verbesserung von mindestens ca. 5% angestrebt, um Fehler zu reduzieren und statistische Zuverlässigkeit zu gewährleisten. Der Grad der im übrigen erhaltenen Verbesserung kann wesentlich schwanken. Falls ein Pilz von mittlerer bis dunkler Farbe als Stammpilz eingesetzt wird, können Verbesserungen in der Grössenordnung von mindestens 10%, 15%, 20%, 25% oder auch mehr erreicht werden. Falls hellere Stammpilze eingesetzt werden, können geringere Verbesserungen erzielt werden, was auch der Fall wäre, wenn man das vorhergehend für den Weissgrad ausgewählte Ascosporenisolat zu verbessern möchte würde. Gewiss können keine Verbesserungen des Weissgrades realisiert und die Kriterien erfüllt werden, wenn die Selektion auf der Grundlage der Wachstumsvirulenz erfolgen soll.
Die Bestimmungen der Wachstumsvirulenz gemäss den Kriterien 1) und 2) werden auf einem nicht-sterilen Substrat durchgeführt und erfolgen 10 Tage nach der Inoculierung, um den von der Erfindung bereitgestellten, erwünschten Pilz darzustellen. Solche Bestimmungen werden wie in nächsten Abschnitt dargestellt wird, auf Basis der Prozentanteile des Substrats oder der Holzspäne durchgeführt, welche das Wachstum des Kandidaten verglichen mit dem Wuchs des herangezogenen Stammpilzes zeigen. Solche Bestimmungen können auf der Grundlage von Prozentzahlen durchgeführt werden und, falls eine Verbesserung der Virulenz das Kriterium ist, welches erfüllt werden soll, so wird eine Verbesserung von mindestens 10 Prozentpunkten (d.i. 80% auf 90%) üblicherweise angestrebt, um den Irrtum zu reduzieren und statistische Zuverlässigkeit zu gewährleisten. Falls die Bestimmung auf der Grundlage der Virulenz erfolgen soll und sowohl der herangezogene Stammpilz als auch der Pilzkandidat ein 80%iges oder besseres Wachstum zeigen, werden die Evaluierungs/Kriterien Dosis von 10¹&sup0; CFU reduziert bis der Wuchs des herangezogenen Stammpilzes weniger als 70% , beispielsweise 35-65%, beträgt.
Wachstum oder Virulenz eines Pilzes werden zum Vergleich zwischen den Pilzen gemessen und, sofern nichts anders angegeben wird, werden alle möglichen Bedingungen zum Vergleich wieder so identisch wie möglich gemacht. Wachstum und Virulenz werden mittels eines relativ einfachen Beobachtungsprotokolls, welches konsequent angewendet wird, bestimmt und unmittelbar am Ende der Testperiode von 10 Tagen durchgeführt. Das Protokoll beruht auf Farbkategorien des Wachstums, welches an jedem einzelnen Holzspan oder Substrat mit unbewehrtem Auge in normaler Leseentfernung beobachtet oder ermittelt werden kann. Eine Farbkategorie, typischerweise die hellste, wird die Wuchsfarbe des Ascosporenkandidaten oder des am hellsten wachsenden Kandidaten darstellen, falls mehrere miteinander verglichen werden sollen. Kategorien von weiss (w), grau (g) und schwarz (b) als auch die fünf Kategorien von weiss (w), hellgrau (l.g.), mittelgrau (g), dunkelgrau (d.g.) und schwarz (b) können verwendet werden , hauptsächlich abhängig von der Farbe des Ascosporenkandidaten, welcher mit seinem herangezogenen Stammpilz verglichen werden soll oder von der Zahl solcher Kandidaten. Die Beurteilungskategorie mit fünf Farben wird bevorzugt, nachdem alle Kandidaten üblicherweise einer der fünf zugeordnet werden können. Die Zahl der Späne, bei denen beobachtet werden kann, dass sie das Farbwachstum des Ascosporenkandidaten besitzen, wird im wesentlichen in vier Kategorien zusammengefasst, wie sie in den nachfolgend berichteten Evaluierungen verwendet werden, nämlich ein einfaches plus (+) wird zugewiesen, falls ca. 25% der Späne das Wachstum des bestimmten Ascosporenkandidaten aufweisen, zwei plus (++), falls ca. 50% ein Wachstum aufweisen, drei plus (+++), falls ca. 75% ein Wachstum aufweisen und vier plus (++++), falls ca. 100% ein Wachstum aufweisen. Falls ein Prozentanteil innerhalb von ca. 5 Prozentpunkten eines Zwischenprozentanteils besteht, beispielsweise ist 58% innerhalb von 5 Prozentpunkten von 62.5% , wird ein plus nach einem Schrägstrich und einer niedrigeren Bewertung hinzugefügt, beispielsweise durch (++/+) oder durch (++/+++). In analoger Weise wird eine Zwischenbeurteilung unter der ersten Niveaubeurteilung durch (+/-) angezeigt. Eine ähnliche Summierung wird für die zu herangezogenen Stammpilze durchgeführt. Für die Zwecke einer genaueren Beurteilung, bezogen auf die hier beschriebenen Kriterien, wird, falls notwendig, ein tatsächlicher Prozentanteil bestimmt und die Prozentanteile verglichen. Es wird jedoch ein Fehlerspielraum für menschliche Irrtümer, für die grössere Schwierigkeit zur Feststellung eines helleren Wuchses und für das wirkliche Erreichen der Ziele der Erfindung eingeräumt. Solch ein Spielraum beträgt 10 Prozentpunkte, so dass ein Ascosporenkandidat, von dem gefunden wurde, dass er annähernd zu 78% auf Holzspänen wächst, mit dem gleichen Wachstumsvermögen oder von gleicher Virulenz wie der Stammpilz eingestuft wird, welcher einen Prozentanteil von 88% besitzt. Nicht-sterile, behandelte Späne werden üblicherweise ein Wachstum von anderen Organismen in einem anderen Bereich des Spans aufweisen, im allgemeinen schwarz färbende Pilze, und solch eine Hintergrundwachstumsfärbung kann getrennt festgehalten werden. Solch ein Hintergrundwachstum ändert nicht die gemachte Evaluierung, es zeigt jedoch die Anwesenheit von Pilzen, welche den Holzschliff auf natürlichem Wege befallen haben.
Auf eine Auswahl gemäss den Kriterien 1) und 2) kann in bestimmten Fällen verzichtet werden, wo bestimmte Ascosporenpilze oder deren Abkömmlinge, erwünschterweise ebenfalls ein homokaryotischer Abkömmlinge, gewisse besonders bevorzugte Charakteristika erfüllen, welche Weissgrad und Virulenz auf nicht-steriles Substrat wiedergeben. Im besonderen erhält man erwünschte neue Pilze durch die vorliegende Erfindung, wenn die Kriterien einer Harzreduktion auf sterilisierten (und nicht-sterilisierten Substraten) nach 21 Tagen, wie oben beschrieben, erfüllt werden und ein nicht-steriles Substrat als Kontrolle nach 14 Tagen durch natürliche Organismen genügend beeinflusst ist, dass ihr Weissgrad um mindestens 10% , insbesondere um mindestens 20%, verglichen mit einer sterilisierten, unbehandelten Kontrolle reduziert ist, dennoch ergibt der von Ascosporen abgeleitete Pilz am Ende dieser 14 tägigen Periode auf nicht-sterilem Substrat ein Weissgradniveau, welches zumindest so gross ist wie das Weissgradniveau der unbehandelten, nicht-sterilen Kontrolle. Solche Pilze werden im Vergleich zu den Pilzen des Standes der Technik als neu bezeichnet. Eine besonders erwünschte Klasse solcher Pilze ist diejenige, welche den Weissgrad tatsächlich steigern, beispielsweise um zumindest ca. 5% und mehr, verglichen mit der unbehandelten, nicht-sterilen Kontrolle. Bevorzugte Unterklassen solcher Pilze sind diejenigen, welche diese erwünschten Resultate auf zumindest einer Holzspezies oder Variante bei Dosen von weniger als 10¹&sup0; CFU/kg erreichen, besonders bei Dosen, welche 10&sup9; nicht überschreiten, und insbesondere Dosen, welche 10&sup8; nicht überschreiten.
Die Pilze gemäss der Erfindung können verwendet werden, um den Harzgehalt von für Papierbrei und Holzsubstrat der ersten mechanischen Stufe, wie in EP-A-387 187 beschrieben wird, zu reduzieren. Der Ausdruck "Holz für Papierbrei", wie er hier verwendet wird, bedeutet jede geerntete (gefällte) Form von Baummaterial, welches bei der Herstellung von Papier, Pappe oder anderen Zelluloseprodukten, wie Viskose, jedoch vor dem Holzaufschluss verwendet wird, und umfasst solche Formen wie Baumstämme, Holzklötze, Holzspäne, Sägemehl und ähnliches. Der Ausdruck "veredeltes Holz für Papierbrei" bedeutet ein Holz für Papierbrei, welches aus der Anwendung von mechanischen und/oder Schärkräften auf die groben Formen von Holz für Papierbrei, wie Holzklötzen, resultiert, um eine Vielzahl von grossen Oberflächenbereichen, kleinen Stücken, wie Holzspänen und Sägespänen zu erhalten, welche in den Kochprozess eingeführt werden können. Der Ausdruck "Holzsubstrat der mechanischen Stufe" bedeutet einen Zellstoff, welcher im Anschluss an ein mechanisches Aufschlussverfahren isoliert wird, wobei das Substrat vor dem Holzaufschluss einen Ligningehalt von 60% und mehr besitzt.
Grundsätzlich wird ein Inoculum von mindestens einem der Pilze auf dem(n) Substrat(en) aufgetragen und der(ie) inoculierte(n) Substrate auf einer Wuchstemperatur des Pilzes von, beispielsweise 2-34ºC, vorzugsweise 7-34ºC, während einer Zeit, die ausreicht um den Harzgehalt des Substrats zu reduzieren, beispielsweise 7-14 Tagen, gehalten. Veredeltes Holz für Papierbrei wird im allgemeinen nach der Inoculierung, beispielsweise in einem Haufen gestapelt, welcher erwünschterweise repräsentativ überall in der Anhäufung verteilt ist. Solch eine Anhäufung kann die Form eines typischen Holzspanstapels annehmen oder sich in einem Behälter oder einem geschlossenen Raum, wie einem Silo, einem Eisenbahnwagon, Schiff oder ähnlichem befinden, um eine Reduktion des Harzgehaltes während des Transports möglich zu machen. Baumstämme, Holzklötze und ähnliche können auf verschiedene Arten bearbeitet werden, um ein Wachstum im grössten Teil oder mehr dieses Substrats, hervorzurufen, beispielsweise können Baumstämme oder Holzklötze der Länge nach eingekerbt und das Inoculum in die Kerbe eingetragen werden, oder es können sogar die Schnittenden inoculiert werden. Ein Holzsubstrat der ersten mechanischen Stufe ist ein sterilisiertes Substrat und die Erfindung kann im allgemeinen sowohl auf sterilisierten als auch auf nicht-sterilen Substraten durchgeführt werden. Besondere und erwünschte Vorteile können jedoch tatsächlich erzielt werden, wenn die Erfindung mit nicht-sterilem Holz für Papierbrei, inbegriffen nicht-sterilem veredelten Holz für Papierbrei, verwirklicht wird. Die in der Praxis der vorliegenden Erfindung angewendeten Dosierungen sollen 10¹&sup0; CFU/kg des Substrats mit veredeltem Holz für Papierbrei nicht übersteigen und sie übersteigen vorzugsweise nicht 10&sup9; CFU/kg, und niedrigere Dosen können verwendet werden bei stärker bevorzugten Ausführungsformen.
Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung ist es nicht nur möglich Pilze zu erhalten, welche in wirksamen Inoculationsbereichen auf nicht-sterilem Holz rasch wachsen, unter Reduktion der negativen Weissgradeffekte im Vergleich mit den ursprünglichen, harzreduzierenden Stammpilze,wobei es jedoch in Übereinstimmung mit besonders bevorzugten Zielen und Anwendungsformen angezeigt ist, dass der Weissgrad des Holzsubstrats nicht nur wenig oder im Vergleich mit den unbehandelten, nicht-sterilen Kontrollen (welche aus einem typischen kommerziellen Holzspanstapel bestehen), überhaupt nicht beeinflusst werden kann sondern auch im Vergleich zu solch einer Kontrolle sogar gesteigert werden kann. Solche besonders bevorzugten Pilze und ihre Verwendung auf nicht-sterilen Substraten, inbegriffen denjenigen, welche mässig oder sogar stärker natürlicherweise mit färbenden und verschmutzenden Pilzen infiziert sind, werden mit grossem Interesse betrachtet, wobei nicht nur Harz reduziert und damit verbunden eine Kostenersparnis und verbesserte Stärkeeigenschaften von Papier/Produkt sondern auch der Weissgrad des behandelten Substrats verstärkt wird im Vergleich zu unbehandeltem Holz für Papierbrei, wie er normalerweise in den Kochprozess eingeführt wird. Während solch ein Weissgradeffekt in einem geringeren Ausmass auf einen hellen oder im wesentlichen weissen Rückstand, welcher vom Mycel von besonders bevorzugten Pilzen zurückbleibt, zurückgeführt werden kann, wird solch ein Vorteil im weiteren Ausmass durch die Fähigkeit des bevorzugten Pilzes bestimmt, an Orten zu wachsen oder andere färbende Pilze und Organismen von diesen Orten auszuschliessen, wo ansonsten solche anderen Organismen während der Behandlungsperiode von, beispielsweise, 14 Tagen wachsen würden. Nicht-steriles Holz für Papierbrei, welches mit solchen besonders bevorzugten Pilzen behandelt wird, kann ebenfalls als neu angesehen werden, nachdem sich herausstellt, dass solche Substrate, welche mit anderen sehr hell wachsenden oder verblassten Pilzen behandelt werden, die, nach unserer Erfahrung, sogar wenn sie in relativ hohen Dosen inoculiert sind, eine reduzierte Virulenz oder ein kompetitives Wachstum (bezogen auf ihren eigenen, färbenden Effekt) besitzen, in weitem Umfang an Orten wirksam werden, wo die nativen, färbenden Pilze oder andere Organismen sich nicht ausbreiten und ungenügend kompetitiv sind, um genügend vom Wuchs der natürlich färbenden Pilze auszuschliessen und zu einer positiven Einwirkung auf den Weissgrad zu gelangen. Solch neues Holz für Holzbrei und die Pilze, welche sie produzieren, können unter Bezugnahme auf natürliche Infektion mit färbenden Pilzen oder Organismen definiert werden, wenn ein nicht-steriles (unbehandeltes) Kontrollmuster eine genügende Infektion aufweist, dass sein Weissgrad während der Behandlungsperiode bei Raumtemperatur um mindestens zehn Prozent (10%) im Vergleich zu sterilen, unbehandelten Mustern reduziert wird, während die mit dem neuen Pilz behandelten Substrate ein Weissgradniveau besitzen, welches gleich oder grösser ist als das Weissgradniveau der angeführten nicht-sterilen und unbehandelten Holzsubstratkontrolle nach der Behandlungsperiode von, beispielsweise, 14 Tagen. Diese mit Pilz behandelten Substrate, welche einen im Vergleich zu nicht-sterilen, unbehandelten Kontrollmustern verbesserten Weissgrad besitzen, werden besonders erwünschte Produkte für weitere Verarbeitung sein, insbesondere bei der Herstellung von mechanischen Zellstoffprodukten.
Die Erfindung wird ferner durch die nachfolgenden Beispiele dargestellt, worin Pilze, welche zu der bevorzugten Spezies O. piliferum gehören, wie in der Tabelle mit den NRRL Zugangsnummern angegeben, verwendet beziehungsweise hergestellt werden.

Beispiel 1

Isolierung von Ascosporen

Man lässt den Pilz C-1 (O. piliferum NRRL 18691) zur Herstellung von Perithecia während 2-4 Wochen auf sterilem Holz wachsen. Danach werden die Ascosporentropfen mit einer sterilen Zerlegungsnadel aufgenommen und auf 400 µl Maisöl übergeführt. Das Muster wurde stark verwirbelt, um eine einheitliche Sporensuspension zu bilden. Diese Suspension wurde unter einem Mikroskop in einer Hemocytometer Zählkammer untersucht und es wurde gefunden, dass sie 1x10&sup6; Zellen/ml enthält, von denen 90-95% einzelne Ascosporen sind. Die verbleibenden 5-10% der Pilze bestanden aus hyphalen Fragmenten und verklumpten Ascosporen.
Die Ascosporen wurden 100fach in sterilem Maisöl verdünnt, danach wurden zwei separate zusätzliche Verdünnungen, 10 und 100fach in sterilem 10%igem Triton X100 für den gegenseitigen Vergleich bereitet. 100 l Aliquoten der beiden Verdünnungen wurden auf Platten mit Hefe-Malz-Agar verteilt, um Plattendichten von 100 und 10 Sporen pro Platte zu erhalten. Triton X100 wurde verwendet, um das Maisöl zu dispergieren und ein erneutes Zusammenfliessen der Öltröpfchen auf der Oberfläche des Agars zu verhindern. Triton X100 ist gegenüber diesem Pilz in flüssiger Kultur nicht toxisch, nachdem es jedoch nicht bekannt war wie der Einschluss von Sporen in Öl/Detergenz Micellien ihre Keimung beeinflussen würden, wurde eine Reihe von Verdünnungen ohne Detergenz bereitet und zum Vergleich auf Platten verteilt.
Der Pilz entfernte das Öl von den Platten so wie er wuchs. Auf denjenigen Platten, wo Sporen ohne Detergenzien ausgebreitett waren, schwammen die Kolonien auf der Oberfläche des Öls und neigten zur Klumpenbildung. In Anwesenheit von Öl/Detergenz, blieben die Kolonien getrennt und ziemlich kompakt, erreichten jedoch langsamer eine entnehmbare Grösse. Die Ölkolonien waren in 4 Tagen gross genug, um entnommen zu werden, während Öl/Detergenz Kolonien erst in 7 Tagen bereit waren.
Es wurde keine Toxizität oder Verhütung der Keimung mit der Öl/Detergenz Methode beobachtet. Die geringere Lebensfähigkeit, die bei Abwesenheit von Detergenz beobachtet wurde, kann durch Aggregation von Kolonien oder keimenden Sporen auf der Oberfläche des Öls hervorgerufen sein, siehe untere Tabelle.
Falls die Kolonien gross genug waren, um wieder aufgestrichen zu werden, wurden alle Kolonien von den unteren Verdünnungsplatten, ohne Rücksicht auf die Grösse oder Färbung, zur Lagerung und Untersuchung auf Perithecia Produktion auf frischen Hefe-Malz- Agar übertragen (Homokaryon Status).

Beispiel 2

Screening auf Homokaryonen und vorbereitende Auswahl

Die C-1 Ascosporenisolate wurden untersucht, um so viel als möglich Heterokaryone zu entfernen und die Wirksamkeit der Öl/Detergenz Isolierung als eine Methode zur Herstellung von Homokaryonen festzustellen. Die Herstellung von, reife Perithecia enthaltenden, Ascosporen erfordert zwei komplementäre Paarungstypen die homokaryotische Stämme nicht besitzen können; heterokaryotische Stämme können beide Faktoren besitzen (d.i. selbst-befruchtend sein). Ob zwar ein Homokaryon ein unreifes Perithecium bilden kann, welches Protoperithecium genannt wird, kann nur ein Heterokaryon ein reifes Perithecium bilden. Somit können heterokaryotische Stämme auf Grund ihrer Peritheciumbildung erkannt werden, die Abwesenheit einer Peritheciabildung beweist aber nicht, dass der Stamm homokaryotisch ist.
Das Screening wurde so durchgeführt, dass man jedes Isolat auf Holzspanagar aufstrich und die Peritheciumbildung während 2 Monaten überwachte. Nur 9 von 105 getesteten C-1 Isolaten bildeten Perithecia und wurden verworfen. Die nachfolgende Tabelle zeigt eine zahlenmässige Übersicht der verbleibenden C-1 Isolate, welche keine Perithecia bilden und von denen angenommen wird, dass sie homokaryotisch sind. Die Isolate wurden entsprechend der Wuchsfärbung auf Holzspanagar gruppiert. ZahlenmässigeAufschlüsselung von C-1 Isolaten
Die 96 von C-1 erhaltenen, vermutlichen Homokaryonen, zeigten eine gute Besiedlung auf Holzspanagar. Alle helleren C-1 Isolaten (und anderen) wurden zunächst auf Wachstumsraten auf nichtsterilen und sterilen Holzspänen getestet, um die stärker virulenten dieser Isolate für weitere Untersuchungen auszuwählen.

Beispiel 3

Wachstumsuntersuchung von stärker virulenten hellen Gruppenkandidaten

Jeder der stärker virulenten Pilzkandidaten wurde in einem Hefe Malz Medium bei Raumtemperatur, 200 Upm während 72 Stunden, gezüchtet (72 Stunden wurden wegen der langsamen Wachstumsrate einiger Stämme gewählt). Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet und in sterilem Wsser zu einer lebensfähigen CFU Konzentration von ca. 1x10&sup8;/ml resuspendiert.
100 g Muster von sterilen (durch Aufenthalt im Autoklaven) und nicht-sterilen (weniger als 1 Woche alte Späne, welche vor der Verwendung bei 5ºC gelagert wurden) Spänen der südlichen Gelbkiefer wurden im Doppel mit 1 ml Pilzsuspension inoculiert.
Die inoculierten Späne wurden bei Raumtemperatur in der Dunkelheit gelagert. Das Wachstum wurde während einer Periode von 10 Tagen überwacht.
In der nachfolgenden Tabelle wird nur über die Entwicklung der fünf besser wachsenden Isolate in der hellgefärbten Gruppe berichtet. Die Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:
w. = weiss +/- = unterhalb 25% Wachstum
g. = (mittleres) grau + = 25% Wachstum
l.g. = hellgrau ++ = 50% Wachstum
d.g. = dunkelgrau +++ = 75% Wachstum
b. = schwarz ++++ = 100% Wachstum Wachstum von hellen C-1 Isolaten Frische Späne Sterile Späne
Die obigen Homokaryoten Isolate zeigten einen Virulenzbereich, wobei mindestens C-1D5 und C-1D84 anzeigten die Kriterien zu erfüllen.

Beispiel 4

Harzreduktion und Weissgradwirkung

Pilze wurden in einem Hefe Malz Medium bei Raumtemperatur, 200 Upm während 72 Stunden, gezüchtet. Zellen (ungefähr 95% Blastosporen/5% Mycel) wurden durch Zentrifugieren geerntet und in sterilem Wasser bis zu ungefähr einem lebensfähigen CFU von 1x10&sup8;/ml resuspendiert. Fünf Wiederholungen in Säcken mit 100 g Holzspänen einer südlichen Gelbkiefer wurde mit 1.0 ml einer Pilzsuspension inoculiert. Die inoculierten und die Kontrollsäcke wurden bei Raumtemperatur während 3 Wochen in der Dunkelheit inkubiert. Vier Wiederholungen jedes Satzes von fünf wurden auf Harzanteile analysiert. Der fünfte wurde auf Weissgrad untersucht. Resultate sind in der untenstehenden Tabelle enthalten.
Alle oben untersuchten Stämme zeigten eine wesentliche Reduktion des Harzanteils. Der Grad des Weissgradverlustes hängt von der Wachstumsfarbe des Pilzes auf dem Holz ab. Die beiden untersuchten hellen Stämme C-1D5 und C-1D84 zeigten einen wesentlich besseren Weissgrad als der C-1 Stammpilz. Der C-1D84 zeigte erwünschterweise, dass er einen besseren Weissgrad besitzt als die unbehandelte Kontrolle.
Eine Anzahl von verblassten Ascosporenisolaten wurde auf Wachstum unter Feldbedingungen (nicht-sterile Holzspäne) untersucht.
Pilzstämme wurden mit einem tragbaren Zerstäuber auf nicht-sterilen Holzspänen, welche aus 2 Tage alten Holzklötzen hergestellt wurden, inoculiert, um Stapel von 10 Tonnen zu bilden. Die nicht-sterilen Späne wurden aus einem Bereich erhalten, worin eine blaue Verschmutzung eines natürlichen O. piliferum toleriert wurde und auf der Grundlage ausgewählt, dass sie natürlicherweise von solch einer blauen Verschmutzung befallen waren. Die Stapel wurden aussen unter Umgebungsbedingungen, während zwei Wochen inkubiert. Die Stapel wurden dann auseinandergenommen und es wurde die Menge des Pilzwuchses aufgezeichnet.
Die untere Tabelle fasst die Resultate dieses Feldversuches zusammen, worin verblasste Stämme, die mit einem tragbaren Zerstäuber inoculiert wurden, verglichen werden.
Die verwendete Dosis ist als kolonienbildende Einheit (CFU) pro kg Holzspäne ausgedrückt.
Hintergrundwachstum weist auf das Wachstum von bereits im Holz anwesenden schwarz/- dunkel gefärbten Pilzen (oder des Inoculums im Falle des schwarzen Stammes TAB28) hin.
Zusätzlich wurde C-1D5 mit einem Inline-Sprüher auf Spänen, welche aus 3 Wochen alten Holzklötzen hergestellt wurden, inoculiert und die Resultate des Wachstums auf Stapeln von 10 Tonnen sind unten angegeben (welches ebenfalls eine Unterdrückung eines Hintergrundwuchses durch den Pilz anzeigt).
Sowohl C-1D5 als auch C-1D84 zeigten ein sehr gutes Wachstum auf nicht-sterilen Spänen und ebenfalls eine Dosis/Wirkungs Beziehung.
Die obigen Resultate geben zusätzlich zu der guten Harzreduktion und im wesentlichen der Abwesenheit von negativem Einfluss auf den Weissgrad an, dass die ausgewählten Isolate C- 1D84 und C-1D5 sehr gut wachsen unter den sehr stark kompetitiven Bedingungen, welche in einem Stapel von Holzspänen oder anderem Holz für Papierbrei angetroffen werden können, und dass sie im besonderen ihre erwünschte Wirkung bei Inoculumdosen, welche der gleichen Grössenordnung wie der hochwirksame TAB28 nahe kommen, entfalten. Nicht nur werden diese beiden Ziele durch diese beiden Spezies erreicht, die Resultate zeigen auch den zusätzlichen und ganz wesentlichen Vorteil im Potential solcher Pilze an, den Abdunkelungseinfluss des Pilzes, welcher natürlicherweise solches Holz für Papierbrei befällt, teilweise zu überwinden oder zu verschieben, wobei man zu einem Holz für Papierbrei gelangt, welches im wesentlichen sogar heller ist als eine Kontrolle oder ein konventionell behandeltes Holz für Papierbrei, somit also potentiell sogar eine Reduktion in den nachfolgenden Behandlungen erlaubt, welche durchgeführt werden, um den Weissgrad, wie es insbesondere, beispielsweise bei mechanischem Papierbrei durchgeführt wird, zu steigern.

Beispiel 5

Herstellung von WZ19, WZ24 und WZ58

Der weiss wachsende Ascosporenpilz C-1D84 und ein schwarz wachsender wilder Pilz TAB51 vom Typus O. piliferum wurden gepaart durch Aufstreichen von Kulturen eines jeden von ihnen auf Hefe-Malz-Agar Platten über den gleichen Bereich einer Holzspan Agar Platte und durch anschliessendes Inkubieren der aufgestrichenen Kulturplatte während vier (4) Wochen auf der Bank, nachdem man die Platte mit Parafilm versiegelt hatte. Die Ascosporen der Paarung wurden isoliert und mittels des oben beschriebenen Verfahrens (Öl/Detergenz Isolierung) wiedergewonnen und danach wurden annähernd 93 Isolate zum Wachsen gebracht und bezüglich Farbe und Wachstumsvirulenz vorläufig evaluiert. Drei (3) der Kandidaten, darunter WZ19, WZ24 und WZ58 wurden für die weitere Evaluierung auf der Grundlage ihrer weissen Farbe und ausgezeichneter Wachstumscharakteristika ausgewählt (alle drei zeigten eine dem TAB28 ähnliche Wachstumsvirulenz, welche selbst der Wachstumsvirulenz von TAB51 überlegen ist). TAB51 zeigt die dunkelblaue oder im wesentlichen schwarze Farbe des typischen blauverschmutztenden Pilzes, falls er auf einem Holzsubstrat, beispielsweise sterilisierter oder nicht-sterilisierter südlicher Gelbkiefer, wachsen gelassen wird.
Die drei Kandidaten wurden, um ein Inoculum zu bilden, wachsen gelassen und sie wurden zum Vergleich zusammen mit anderen evaluiert, wie oben unter dem Titel Wachstumsscreening von stärker virulenten Kandidaten in hellen Gruppen, beschrieben wird, die Resultate auf Holzspänen der südlichen Gelbkiefer werden unten dargestellt.
Die drei Kandidaten wurden dann bezüglich der Harzreduktion und der Weissgradwirkungen gemäss der Methode, welche vorhergehend unter dem Titel Harzreduktion und Weissgradeffekte beschrieben wurde, evaluiert mit der Ausnahme, dass die behandelten Substrate nur während zwei Wochen inkubiert wurden. Die Resultate auf sterilen Holzspänen der südlichen Gelbkiefer sind nachfolgend dargestellt:

Beispiel 6

Wachstum auf nicht-sterilen Holzspänen unter Feldbedingungen

Pilzstämme wurden mit einem tragbaren Zerstäuber auf nicht-sterilen Holzspänen der südlichen Gelbkiefer, welche aus einem Gemisch von 40% luftgetrockneten Holzklötzen (2-3 Monate alt) und 60% frischem Holz (annähernd 3 Wochen alt) bereitet wurden, inoculiert und in Spanstapeln von 10 Tonnen gelagert. Späne wurden mit einer Dosis von 2x10¹¹ CFU/Tonne (ungefähr 9.09x10&sup7; CFU/kg) inoculiert, wenn sie vom Frontende eines Nutzlastladers auf Heizplattformen im Spanhof abgeladen wurden. Die Heizplattformen bestanden aus 2 Fuss grossen Schlackenblockwänden,welche einen Rahmen unterstützten,der aus 2x4 Schalungen aufgebaut war. Schwerer Hühnerdraht wurde auf den 2x4 Schalungen gestapelt, um Unterstützung für die Holzspäne zu geben. Ein thermostatisch kontrollierter Umwälzlufterhitzer wurde unter jeder Heizplattform angebracht und so eingestellt, dass die Temperatur bei 24ºC gehalten wurde. Die Stapel wurden unter diesen Bedingungen während 10 Tagen inkubiert. Die Stapel wurden danach für die Evaluierung auseinandergenommen. Der Durchschnittsanteil des Pilzwuchses im ganzen Inneren des Stapels wurde registriert. Vom Zentrum der Stapeln wurden Proben entnommen und auf Harzgehalt und Weissgrad analysiert. Die Resultate sind unten angegeben.
Der Stamm, welcher die beste Gesamtwachstumsrate aufwies, WZ58, reduzierte auch die Harzanteile auf die niedrigsten Werte. Hintergrundwachstum weist auf das Wachstum von schwarz/dunkel gefärbten Pilzen hin, welche sich bereits im Holz befinden.

Beispiel 7

Fermentierung und Formulierung

Man liess Zellen (Blastospore) von WZ-58 bei 25ºC wachsen, (10 Litervolumen des Mediums in einem 20 Liter Chemap Fermenter) in einem Medium enthaltend 200 g pro Liter Malzextrakt und 20 g pro Liter Hefeextrakt bis zu einer Zelldichte von 3 x 10&sup9; Zellen/ml. Die Fermentationsmedien (ca. 36-48 Stunden) wurden mit 2 Volumeneinheiten Luft pro Volumeneinheit Medium pro Minute belüftet (Sauerstoffanteile in der Nähe der Sättigung, d.i. nicht beschränkt an irgendeiner Stelle während der Fermentierung).
Die Biomasse, welche im Fermenter gewachsen war, wurde durch Zentrifugieren geerntet und die gekörnten Zellen mit Lehm in einem Verhältnis von 1 Teil feuchter Biomasse (annähernd 20% Feststoffe) zu 2 Teilen trockenem Kaolinlehm vermischt. Der Feuchtigkeitsgehalt der gemischten Biomasse: Lehm beträgt von 25-30%. Das fliessfähige Gemisch wird auf einen Aeromatics Fliessbettrockner geladen und einer Trocknung bei Umgebungstemperatur bis zu einem Endfeuchtigkeitsgehalt von 5-10% getrocknet. Die Auslasslufttemperatur wird unter 35ºC gehalten. Die Trocknungszeit beträgt von 20-40 Minuten. Das fliessbettgetrocknete Material behält nach verlängerter Lagerung bei -15ºC die Lebensfähigkeit und die Fähigkeit, auf nicht-sterilen Holzspänen zu wachsen und den Harzanteil zu reduzieren. Tabelle: Stabilität von bei -15ºC gelagerter, fliessbettgetrockneter Biomasse.

Beispiel 8

Fermentierung und Formulierung

Man liess Zellen (Blastospore) von WZ-58 bei 25ºC wachsen (10 Litervolumen des Mediums in einem 20 Liter Chemap Fermenter) in einem Medium enthaltend 200 g pro Liter Malzextrakt und 20 g pro Liter Hefeextrakt bis zu einer Zelldichte von 3 x 10&sup9; Zellen/ml. Die Fermentationsmedien (ca. 36-48 Stunden) wurden mit 2 Volumeneinheiten Luft pro Volumeneinheit Medium pro Minute belüftet (Sauerstoffanteile in der Nähe der Sättigung, d.i. nicht beschränkt an irgendeiner Stelle während der Fermentierung).
Die Biomasse, welche im Fermenter gewachsen war, wurde durch Zentrifugieren zu einer Zellaufschlämmung mit einem Feststoffanteil von 5% geerntet. Die Aufschlämmung wird horizontal in einen Aeromatics Fliessbettrockner eingebracht (eingespritzt) und mit regeneriertem Kaolinlehm bei Umgebungstemperatur bis zu einem Endfeuchtigkeitsgehalt von 2-10% in Kontakt gebracht. Das Gewichtsverhältnis der Aufschlämmung zum Lehm beträgt 1:1. Die Auslasslufttemperatur wird unter 35ºC gehalten. Die Trocknungszeit beträgt von 20- 40 Minuten. Das erhaltene spritzgranulierte Produkt behält nach Verlängerter Lagerung bei -15ºC die Lebensfähigkeit und die Fähigkeit auf nicht-sterilen Holzspänen zu wachsen und den Harzanteil nach verlängerter Lagerung bei -15ºC zu reduzieren.

Beispiel 9

Harzreduktion in Holzspänen von verschiedenen Holzspezies

Die Holzspäne wurden gemäss folgenden Standards behandelt:
Holzschleifen TAPPI T 257 cm 85
Sägemehlkalibrierung TAPPI T 264 cm 88
Harzextraktion TAPPI T 204 os 78 Tabelle: Harzreduktion durch C-1D5

Claims

1. Ein holzdurchdringender, harzabbauender Pilzstamm, bestehend aus einer isolierten Ascospore oder ein holzdurchringender, harzabbauender Pilzstamm, erhältlich von einer Ascospore der Klassen Ascomycotina oder Deuteromycotina, der eine oder beide der folgenden Characteristika aufweist:

1) nach 21 Tagen Wachstum beeinträchtigt er den Weissgrad eines sterilisierten Holzsubstrats nicht stärker als der Pilzstamm C-1 D5 (O. piliferum) mit der Zugangsnummer NRRL 18677, wächst jedoch stärker als der Ausgangspilz auf dem gleichen, jedoch nicht sterilen Holzsubstrat während einer Wachstumszeit von 10 Tagen;

2) nach 21 Tagen Wachstum produziert er auf einem sterilisierten Holzsubstrat einen höheren Weissgrad als der Pilzstamm C-1 (O. piliferum) mit der Zugangsnummer NRRL 18691, wächst jedoch nicht weniger als der Ausgangspilz auf dem gleichen, jedoch nicht sterilen Holzsubstrat während einer Wachstumszeit von 10 Tagen.

2. Ein Pilzstamm gemäss Anspruch 1, welcher ein Pilz dern Genus Ceratocystis, Ceratocystiopsis, Graphium, Leptographium oder Ophiostoma ist.

3. Ein Pilzstamm gemäss Anspruch 1 oder 2, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe

a) einer isolierten Ascospore einer Kultur von einem oder mehreren Pilzen der Klassen Ascomycotina oder Deuteromycotina,

b) einer biologisch reinen Kultur des aus dieser Ascospore erhältlichen Pilzes,

c) eines Inokulums bestehend aus Sporen und/oder Mycel, die aus einer Kultur gemäss b) isoliert wurden,

d) einer biologisch reinen Kultur eines abgeleiteten Pilzes des von dieser Ascospore erhältlichen Pilzes, wobei dieser abgeleitete Pilz zumindest den harzabbauenden, holzaufhellenden Effekt und die kompetitive Wachstumsfähigkeit auf nicht-sterilem Holz des aus dieser Ascospore erhältlichen Pilzes aufweist,

e) eines Inokulums bestehend aus Sporen und/oder Mycel, die aus einer Kultur gemäss d) isoliert wurden.

4. Ein Pilzstamm gemäss Anspruch 1 mit der Zugangsnummer NRRL 18755 oder ein Inokulum, erhalten aus einer Kultur eines solchen Pilzstammes.

5. Ein Verfahren zur Herstellung eines Pilzstammes wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bestehend aus der Isolierung von Ascosporen aus einer Kultur von einem oder mehreren holzdurchdringenden, harzabbauenden Ausgangstämmen der Klassen Ascomycotina oder Deuteromycotina und der Selektion eines oder mehreren homokaryotischen Pilzen, die von diesen Ascosporen stammen und zumindest eine der in Anspruch 1 erwähnten Charakteristika aufweisen.

6. Ein Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Ascosporen eines Ausgangspilzes in einem nicht-toxischen, natürlichen Oel dispergiert, das vom Pilz aus diesen Ascosporen verbraucht werden kann, und dann das Ascosporen enthaltende Oel mit einem nicht-toxischen Dispergiermittel für das Oel behandelt, um einzelne Ascosporen enthaltende Tröpfchen dieses Oels zu erhalten.

7. Ein Verfahren gemäss Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als weiteres Kriterium der Selektion das Wachstum auf sterilisiertem Holzsubstrat mit Reduktion des Harzgehaltes des Substrats um mindestens 20 % nach höchstens 21 Tagen Wachstum nimmt.

8. Ein Verfahren zur Reduktion des Harzgehaltes von Holz für Papierbrei durch Applikation eines Inokulums von isolierten Pilzen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 auf ein Holzsubstrat für Papierbrei oder auf einen in der ersten Stufe erhaltenen, mechanisch hergestellten Papierbrei und Beibehalten von Bedingungen, die das Wachstum des Pilzes auf dem inokulierten Holz oder Papierbrei erlauben.

9. Holz für Papierbrei, das mit einem holzdurchdringenden, harzabbauenden Pilz der Klassen Ascomycotina oder Deuteromycotina gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 behandelt wurde.

10. Eine Pilzzubereitung bestehend aus einem Sporen enthaltenden Fermentationskonzentrat eines Pilzes gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 und einem inerten festen Träger, der die Stabilität der Sporen nicht beeinträchtigt.