PT98500B

PT98500B - Processo para o tratamento de madeira para polpa de celulose com fungos especificados a fim de reduzir o seu teor de pez e obtencao desses fungos

Info

Publication number: PT98500B
Application number: PT98500A
Authority: PT
Inventors: Roberta Lee Farrell; Yitzhak Hadar; Philip A Wendler; Wendy Zimmerman
Original assignee: Clariant Finance Bvi Ltd
Priority date: 1990-07-31
Filing date: 1991-07-30
Publication date: 1999-01-29
Also published as: EP0470929A2; MY129967A; ATE141352T1; ES2091898T3; NZ239162A; NO309391B1; US5998197A; KR0182314B1; FI913620A0; EP0470929A3; NO912936L; PT98500A; FI913620A; AU646678B2; CA2047900A1; AU8140191A; KR920002766A; NO912936D0; EP0470929B1; US5476789A

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 98 500

REQUERENTE: SANDOZ, S.A., suiça, industrial, com sede em Basileia ⁵, Suiça

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA 0 TRATAMENTO DE MADEIRA PARA POLPA DE

CELULOSE COM FUNGOS ESPECÍFICOS A FIM DE REDUZIR 0 SEU TEOR DE PEZ E OBTENÇÃO DESSES FUNGOS

INVENTORES: ROBERTA LEE FARRELL, YITZHAK,HADARí PHILIP'A. WENDLER e WENDY ZIMMERMAN

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

nos Estados Unidos da América em 31 de Julho de 1990 sob o N^a 560,521 e em 19 de Fevereiro de 1991 sob o N^Q 657,581.

INPI. MOO 113 n F 16732

RESUMO

A requerente descobriu que ascósporos de fungos que penetram na madeira e degradam o seu teor de pez da classe dos Ascomycotina e Deuteromycotina, por exemplo, Ophiostomas podem ser seleccionados de modo a obter-se fungos que combinam as propriedades de bom desenvolvimento em substratos de madeira não esterilizados e efeitos minimizados ou melhorados sobre o brilho para utilização na redução do teor de pez de substratos de madeira, por exemplo, toros ou aparas de madeira. A invenção refere-se também a um novo processo aperfeiçoado para isolar esses ascósporos, que compreende a sua suspensão efectiva num óleo consumível pelo fungo, por exemplo, num óleo vegetal e, depois, o tratamento do óleo com um agente dispersante.

A invenção refera-se a novos fungos que possuem propriedades particularmente desejáveis, refere-se ainda â sua preparação e uso para redução do teor de pez na polpa de celulose.

Na Memória Descritiva da Patente Europeia EP 387187, descreve-se o uso de certos fungos que penetram na madeira na redução do teor de pez em polpa de celulose. Estes fungos pertencem à classe dos Ascomicetes e Deuteromicetes e podem ser seleccio nados de entre uma vasta variedade do género classificado na sub-classe dos Ofiostomales bem como de entre os estados imperfeitos associados a esta sub-classe. Exemplos do género Ofiostomales incluem mas não se limitam a Ceratocystis, Ceratocystiopsis, Graphium, Leptographium, Ophiostoma,

Phislocephala, e Sporothrix como definido com referência

aos conceitos genéricos estabelecidos por Harrington T.C.,New Combinations in Ophiostoma ou Ceratocystis species with Leptographium anamorphs, Mycotaxon, 1987, 28:39-43 e em Leptographium Species, Their Distributions, Host and Insects Vectors, Harrington T.C. & Cobb F.W.,1988, págs.1-39,APS press St.Paul, Minnesota, bem como Rhinocladiella e Hyalodendron como definido com referência a Hawksworth et al. Ainsworth and Bisby's Dictionary of Fungi, 1983, 7^â Edição, Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England. Outros exemplos do género (não classificados como Ophiostomales) em que fungos penetrantes são encontrados com base em espécies limitadas incluem Alternaria, Cadophora, Cloridium, Diplidia, Dactylella, Fusarium, Hormodendron, Hormonema, Phialophora, Sphaeropsis, Trichosporium, Codinaea e Valsa como definido com referência a Hawksworth et al. (supra). Os fungos preferidos encontram-se no gênero classificado como Chloridium, Dacty. lelLa, Phialophora e Valsa bem como no gênero classificado como Ophiostomatales ou os estados imperfeitos associados com Ophiostomatales, recaindo as preferências sobre este último género. De preferência, os fungos são encontrados nos gêneros Ceratocystis, Ceratocystiopsis, Graphium, Leptographium ^e Ophiostoma, sendo este último o preferido.

As classes fúngicas indicadas englobam muitos dos denominados fungos de mancha, e em particular mancha profunda ou de penetração de mancha que possuem a capacidade de reduzir a coloração ou mancha da madeira, tipicamente manchas cinzentas escuras, azul enegrecido ou negras. Tais manchas escuras podem originar a necessidade de aumentar o grau de branqueamen to da polpa de celulose obtida a partir de polpa de celulose de madeira o que é indesejável.

Os fungos nativos que estão desvanecidos ou de espécies

menos coloridas têm sido isolados numa tentativa de suprimir os efeitos indesejáveis acima mencionados. No entanto, descobriu-se que tais fungos desvanecidos isolam normalmente a lacuna de capacidade de crescimento relativa ou virulência em madeira não esterilizada que é necessária para o uso em vista. Consequentemente, os fungos mais claros requerem doses mais elevadas e/ou tempos de tratamento mais longos no sentido de obter o mesmo resultado de redução do teor de pez na polpa de celulose tal como se pode esperar com as espécies de crescimento mais escuras. A produção de melanina foi indicada na literatura como estando associada com a capacidade de mancha mais escura do fungo e com a sua virulência ou capacidade de crescimento competitivo em ambientes não estéreis que existem nas várias formas de madeira obtida usadas como matérias primas na indústria de celulose.

Descobriu-se agora que os novos fungos que possuem propriedades particularmente desejáveis podem ser isolados por meio de um processo aperfeiçoado para isolar ascosporus e para a selecção dos mesmos em atenção às suas propriedades de redução do teor de pez em polpa de celulose sob condições de crescimento competitivas.

A invenção refere-se a novas estirpes de fungos compreendendo ascosporus isolados ou estirpes que se podem obter a partir de um ascosporu pertencente à classe dos Ascomycotina ou Deuteromycotina e que se caracteriza por:

1) afectar o grau de brilho de um substracto de madeira esterilizada, depois de 21 dias de desenvolvimento, não mais do que um fungo referenciado de que provém, enquanto se desenvolve mais virulentamente do que o

Ci referido fungo de que provêm no mesmo substracto de madeira mas não esterilizado como se verifica ao longo dum intervalo de desenvolvimento de 10 dias, ou

2) originar um maior nível do grau de brilho num substracto de madeira esterilizada do que um fungo referenciado de que provém depois de 21 dias de desenvolvimento enquanto se desenvolve substancialmente não menos virulentamente que o fungo de que provém no mesmo substracto de madeira mas não esterilizado como se determina durante um período de desenvolvimento de 10 dias.

Fungo referenciado de que provém significa um qualquer de um ou mais fungos parente(s) envolvido(s) no processo de reprodução para obter o ascósporo.

Tal estirpe nova de fungos pode ser:

a) um ascósporo isolado duma cultura de um ou mais fungos das classes dos Ascomycotina ou dos Deuteromycotina;

b) uma cultura biologicamente pura do fungo que se pode obter a partir do referido ascósporo;

c) um inoculo que compreende esporos e/ou micêlios separados duma cultura de acordo com a alínea b) acima;

d) uma cultura biologicamente pura do fungo derivado do fungo que se pode obter a partir do citado ascósporo, tendo o referido fungo derivado pelo menos a capacidade de degradação do pez, o efeito de branqueamento da madeira e a capacidade de desenvolvimento competitivo em madeira não esterilizada do fungo que se pode obter a partir do mencionado ascósporo; e

e) um inoculo que compreende esporos e/ou micêlios separados de uma cultura de acordo com a alínea d), acima.

termo derivado neste contexto entende-se como qualquer fungo que se pode obter a partir do ascósporo ou do seu progenitor por reprodução, mutação e por meio de outras técnicas conhecidas que produzem variações de estirpes, incluindo o cruzamento com outros fungos homocariotas ou heterocar iotas e cruzando-os com eles mesmos ou com tipos hemafroditas.

Os fungos preferidos de acordo com a invenção pertencem à espécie Ophiostoma piliferum, estirpes diferentes que foram depositadas por Northern Regional Research Center (NRRL) em Peoria, Illinois, U.S.A., as quais estão depositadas

sob os seguintes números de acesso:
Fungo	N⁵ de Acesso	Data do Depós.
C-1D5 (0.piliferum)	NRRL 18677	17 Julho 1990
C-1D84 (0.piliferum)	NRRL 18678	17 Julho 1990
C-l (0.piliferum)	NRRL 18691	27 Julho 1990
TAB 28 (0.piliferum)	NRRL 18690	23 Julho 1990
TAB 51 (0.pi1iferum)	NRRL 18754	24 Jan. 1990
WZ58 (0.piliferum)	NRRL 18755	24 Jan. 1990
WZ19 (0.pi1iferum)	NRRL 18849	10 Julho 1991
WZ24 (0.piliferum)	NRRL 18850	10 Julho 1991
0 fungo azul verdadeiro	TAB 28 é o	padrão preferencial
para a virulência de desenvolvimento e	pode ser usado para

reprodução por exemplo, com o C-1D5 isolado brilhante (cinzento claro) que possui já uma muito boa virulência de crescimento. 0 TAB 51 azul escuro ou essencialmente negro Isolado é uma das estirpes usadas para reprodução com os fungos desvanecidos isolados tal como o C-1D84 brilhante (essencial mente branco) isolado.

ÍOs fungos asoósporos especialmente preferidos desenvolvidos

I · •jpela invenção são os que apresentam pelo menos a mesma ^virulência de desenvolvimento que o TAB 28 num substracto não esterilizado mas que se torna essencialmente branco num substracto esterilizado, por exemplo, um substracto de pinho Southern amarelo. Tais fungos incluem WZ58 acima (mencionado obtido a partir da estirpe de iniciação TAB 51 e da -estirpe ascósporo branca C-.ID84, A estirpe C-1D84 por sua vez jlf o i oh t i d a a p ar 11 r da estirpe inicial C-l, um isolado atenuado (cinzento escuro) do 0. pilif eruni colhido da polpa de madeira no Estado de Virgínia, E.U.A.

: A invenção inclui ainda qualquer cultura biologicamente Jpura ou um inocuium de um fungo honocariótíoo da classe dos Ascomycotina ou Deuteromycotina que tenha peio menos a mesma virulência de crescimento num substracto de madeira jnão esterilizado e que afecta menos o brilho do mesmo subsÍtracto mas esterilizado, que o fungo de Número de Acesso Í18691 do NRRL, Os fungos preferidos são aqueles que possuem ||melhores propriedades no que diz respeito ao objectivo jjdos fungos de Número de Acesso 18677 ou 18678 do NRRL e ijos mais preferidos são os fungos que possuem melhores propriedades do que os fungos de Número de Acesso 18755 do NRRL, !

Uma forma do produto adequado do fungo da invenção é obtido por secagem em leito fluidificado duma mistura de um concentrado de fermentação que compreende os esporos, ressuspenso em água, e uma substância veicular sólida inerte que não afecta de forma adversa a estabilidade dos esporos, por exemplo uma argila tal como o caolino.

A invenção refere-se tais ascósporos ou ainda ao processo de preparação de seus derivados compreendendo isolarí'

-se os ascósporos a partir duma cultura de um ou mais fungos progenitores que possuem a capacidade de penetrar na madeira e de degradar o pez da classe dos Ascomycotina e Deuteromycotina e a selecçâo de um ou mais fungos homocarióticos obtido a partir destes ascósporos pelo critério baseado no facto de possuir pelo menos uma das características acima mencionada e de preferência que se desenvolve também num substracto de madeira esterilizada para reduzir o teor de pez do substracto pelo menos em 25%, após um desenvolvimento em nao mais do que 21 dias sem diminuir o brilho do substrato em nao mais do que 10%.

A invenção desenvolve ainda um processo de redução do teor de pez em polpa de celulose por aplicação dum inoculo obtido a partir de fungos homocarióticos de acordo com a invenção, ou dum progenitor ou mutante de tal fungo, a um substracto de polpa de celulose ou a uma polpa mecânica do primeiro estádio mantendo a polpa de celulose ou polpa inoculada sob condições que permitam o crescimento dos fungos. De preferência, num tal processo usa-se um fungo que se caracteriza pelo facto de possuir capacidade de reduzir o teor de pez do substracto esterilizado em pelo menos 25%, após não mais do que 21 dias de desenvolvimento sem diminuir o brilho do substracto em mais de 10% em comparação com o controlo não tratado.

fungo homocariótico da invenção ou uma estirpe heterocarióti ca sua derivada são altamente efectivos na redução de pez, particularmente em substracto não esterilizados, após não mais do que 14 dias de crescimento a níveis de inoculação 10 que não excedem os 10 CFU (unidades de formação de colónia) por Kg de substracto tal como polpa de celulose refinada e podem mesmo ser efectivos após não mais do que 10 dias de desenvolvimento a tais níveis de inoculação.

De acordo com a invenção, os ascósporos podem ser isolados a partir duma cultura de qualquer espécies fúngica que possua pelo menos um membro ou representante de manchas azuis ou escuras, incluindo membros ou variantes de tais espécies de cor cinzenta pálida, se tais ascósporos nascerem de espécies que se membros de espécies.

autofertilizam ou por cruzamento de Se dois fungos forem cruzados, por exemplo, tal significa a prevalência de ambos os cruzamentos. Se tipos de cruzamentos múltiplos envolvendo mais do que dois cruzamentos podem combinar, então significa que qualquer fungo cruzado prevalece. A maioria dos fungos envolve apenas dois tipos de cruzamento. Logo, se dois ou mais progenitores são envolvidos na produção dos ascósporos, qualquer progenitor pode ser para propósitos de determinação se o critério de visu alização for atingido, fazendo com que o mesmo progenitor seja sempre referenciado para todos os critérios erft cada avaliação do ascósporo em questão. Todos os progenitores serão normalmen te individualmente referenciados numa série de avaliações de cada progenitor separadamente para cada ascósporo.

fungo em questão, inclui a espécie fúngica de mancha azul (escura) (incluindo os seus membros desvanecidos) são geralmente heterocarióticos presumidos, isto é, eles compreendem um núcleo múltiplo possuindo o complemento um deles completar cada para total de genes o ciclo de vida dos fungos. Ao permitir-se que tais fungos se desagreguem em esporos sob uma cultura sólida, por necessário seguidamente isolando os simples (ascósporos), e certas condições tal como exemplo, numa placa de agar, e esporos que possuem um núcleo permitindo-se o desenvolvimento dos ascósporos como colónias separadas (gerando assim estirpes homocarióticas), obtêm-se As estirpes isoladas são candidatos para então observadas visualização em termos de propriedades desejadas. Quando o fungo progenitor não se auto-f ertiliza, este deve ser cruzado com um parceiro de cruzamento compatível ou apropriado da mesma espécie, como é conhecido na técnica. Todas as variações das técnicas para obtenção das ascósporos podem ser usadas. Tais técnicas para tal selecção de ascósporos são bem conhecidas, no entanto nós desenvolvemos um processo aperfeiçoado para isolar ascósporos que aqui desvendamos em conjunto com tais fungos. Os fungos que entraram no processo da técnica como progenitores podem ser pré-observados em termos de propriedades desejadas.

Os isolados homocarióticos, como no caso dos fungos que se desenvolvem como homocarióticos, bem como os heterocaróticos, podem ser cruzados por meio de técnicas conhecidas para produzir culturas de ascósporos. Qualquer fungo homocarótico resultante pode ser cruzado com um outro membro das espécies, incluindo os seus fungos progenitores, para realizar a selecção de ascósporos sendo indicado para incrementar tipos de cruzamentos adequados. 0 cruzamento de tais ascósporos isolados pode ser realizado com outro ascósporo isolado ou com um tipo selvagem. Consequentemente, o uso de ascósporos obtidos inicialmente para obter outros ascósporos de propriedades desejadas aperfeiçoadas e para continuar tal reprodução de novos ascósporos por cruzamento como desejado encontra-se bem dentro do espírito da invenção.

A técnica pode ser aplicada a fungos de todas as cores, desde branco a negro, quer as estirpes individuais ou variantes sejam auto-reprodutoras, como pode ser determinado pelas técnicas conhecidas. Geralmente prefere-se usar inicialmente a técnica de cruzamento quando se pretende explorar

espécies (não desvanecidas) de mancha azul ou verdadeiramente escura, desejavelmente com um parceiro que apresenta uma mancha verdadeiramente azul com o outro sendo um membro mais brilhante. Antes do cruzamento, a técnica básica pode ser usada se desejado com as estirpes auto-reprodutoras seleccionadas de entre os isolados para o cruzamento. Posteriormente os isolados resultantes podem ser submetidos a cruzamentos, no sentido de se obter tipos de cruzamentos adequados .

Quando se pretende proceder a cruzamento de ascósporos isolados em desenvolvimento brancos ou brilhantes, é preferível cruzá-lo com uma estirpe que seja mais escura e mais virulenta do que a estirpe ascósporos mais brilhante.

Assim, incluem não apenas ascósporos isolados individuais e seus fungos resultantes mas inclui também todos os derivados individuais obtidos a partir dos anteriores, principalmente os que abrangem pelo menos as propriedades desejadas dos ascósporos progenitores. Um fungo ascósporo finalmente seleccionado deve ser cruzado para desenvolver um fungo heterocariótico para uso na degradação de pez, mas sobre tal facto não recaem as preferências pois descobriu-se que os heterocarióticos tendem a ser instáveis em uma ou mais das propriedades desejadas durante o desenvolvimento repetido ou durante o desenvolvimento em larga escala. 0 ascósporo pode também ser mutado no sentido de obter outros derivados desejáveis, incluindo mutações induzidas pelo homem, e estão também incluídos no âmbito da invenção os que apresentam pelo menos as propriedades aperfeiçoadas desejadas dos ascósporos progenitores. A invenção abrange, consequentemente, a) ascósporos, b) mutantes de ascósporos,

c) progenitores de a) e b).

São bem conhecidas as técnicas para produção, separação geral, para isolamento de ascósporos individuais e dispersos e para desenvolver e isolar os fungos por eles gerados. Um exemplo de literatura representativa é, por exemplo, Upadhyay, H.P.,(l98l), A Monograph of Ceratõcystis e Ceratocys tiopsis; University of Georgia Press, Athens, págs. 2829. Uma publicação com referência específica a ascósporos dos Qphiostoma é Brasier, C.M. e J.N.Gibbs (1976), Inheritance of Pathogenicity and Cultural Characters in Ceratõcystis ulmi: Hybridization of Agressive and Non-Agressive Strains; Ánn. Appl. Biol. 83, 31-37. Em geral, o fungo progenitor (ou fungos) e cultivado até ao estádio em que a geração de ascósporos é suficientemente completa e os ascósporos são suficientemente

libertados	a partir	da massa fúngica	ou	segregados	de forma
que os ascósporos	como	uma massa	ou	colheita	podem ser
geralmente	separados	ou	recuperados,	por	exemplo,	replicando

todas ou uma ou mais porções do material que contêm ascósporos hidrofóbicos viscosos no topo do peritêcio com uma agulha de dissecação esterilizada e transferindo-os para um meio de suspensão de esporos especializado tal como pineno que dissolverá o material hidrofóbico e isento de esporos dentro da suspensão meio. 0 meio (ou suas porções) que compreende os ascósporos ê então diluído e a diluição ê aspergida sobre placas que compreendem um meio de crescimento adequado para desenvolvimento duma fase sólida de desenvolvimento fúngico de forma que permita que os ascósporos se desenvolvam ou cresçam em colónias de fungos discretas ou individuais que podem ser repicadas ou isoladas para posterior desenvolvimento em culturas individuais, por exemplo, em cultura líquida, para providenciar um inoculo para avaliação dos fungos produzidos ou gerados a partir dos ascósporos individuais .

Como um aspecto da presente invenção, contagens adequadas e muito elevadas de ascósporos viáveis dos fungos com capacidade de degradação de pez podem ser obtidas removendo ou dispersando os ascósporos na sua substância veicular hidrofóbica como recuperada a partir da cultura tóxico que dissolve efectivamente para libertar os esporos dentro descobriu-se que fúngica num o material óleo não hidrofóbico do óleo que é consumível (como alimento ou fonte de carbono) pelos fungos, de preferência óleo vegetal tal como óleo de milho, e tratando depois o óleo que compreende os ascósporos com um agente de dispersão de óleo não tóxico (para os fungos ou para os seus esporos) que pode ser um dos vários agentes de dispersão bem conhecidos, tais como óleos, R por exemplo, detergentes tal como o bem conhecido Triton X100. A aspersão ou remoção da placa do agente de dispersão tratado com óleo resulta num grande número de gotas do referido óleo que compreendem ascósporos viáveis e discretose, adicionalmcnte, o óleo é consumido e removido das placas â medida que os fungos crescem, deixando colónias de fungos discretas que podem ser prontamente cultivadas para avaliação.

recuperadas posteriormente selecção de fungos homocarióticos de acordo com os critérios desta invenção é realizada como se segue.

Ds substractos são obtidos a partir de troncos recentemente cortados ou de toros armazenados à temperatura ambiente, durante 7 dias, imediatamente apôs o corte, e posteriormente transformados em ripas de madeira que são prontamente submetidas a avaliação (ou armazenadas por um breve período de tempo a 5°C). As ripas de madeira não apresentaram nada mais β

do que fungos naturais de desenvolvimento isolado ou muito pequeno tais como manchas azuis após os 7 dias de armazenamento. Foram rejeitados os papulaspora e trichoderma. Tais substractos foram seleccionados de forma a estarem isentos de nós. Lotes de amostras individuais de igual tamanho (peso) e pesando entre 200 a 400 gramas cada uma delas serem esterilizadas durante 45 minutos.

serão seleccionadas. As amostras para são aquecidas num autoclave a 120° C A inoculação do suhstracto será feito de maneira adequada para fazer contactar tanto mais pedaços individuais de madeira quanto razoável, mesmo apesar de, inicialmente, apenas 10 a 30% das ripas poderem actualmente entrar em contacto. Os substractos de ripas de madeira serão colocados em sacos de plástico transparentes com o tamanho adequado e as ripas no saco ficarão em repouso sujeitas a arejamento numa superfície plana. 0 inoculo será aplicado com um conta gotas colocando não mais do que uma gota em cada ripa individual. 0 saco ê então selado e as ripas são misturadas/agitadas durante 10 segundos para se distribuir o inoculo por outras ripas. 0 saco ê então apertado ou posteriormente fechado em torno das ripas, se necessário, no sentido de se obter um bom contacto entre as ripas como numa acumulação semelhante ao empilhamento das ripas. Todos os substractos inoculados serão armazenados no escuro e então avaliados, sendo o armazenamento feito à temperatura ambiente à excepção dos casos acima indicados. Para obter o melhor numa base regional ou local, é preferível isolar ou derivar o fungo progenitor a partir de um toro cortado ou morto ou a partir de outras formas de polpa de celulose das mesmas espécies de madeira na qual se vai usar o fungo derivado dum ascósporo na aplicação prática, ou conduzindo em substractos de espécies de madeira de uso alvo em que os progenitores foram obtidos

ou derivados. Se as espécies de madeira fonte dos fungos progenitores é desconhecida, será conduzida uma avaliação preliminar em ripas de madeira esterilizadas e não esterilizadas de várias espécies e variedades de madeira diferentes em que se conhecem as espécies fúngicas progenitoras a partir da literatura, e a avaliação será conduzida em espécies ou variedades de madeira a respeito das quais os fungos revelam o desenvolvimento mais vigoroso. Os fungos derivados de ascósporos que obedecem aos critérios acima mencionados relativos a qualquer dos progenitores referenciados em qualquer uma das várias fontes correntemente conhecidas de polpas de celulose, ou num substracto alvo de espécies de madeira, serão úteis de acordo com a invenção. 0 critério ê melhor atingido pelos fungos ascósporos quando o substracto pertence às mesmas variedades e espécies de madeira a partir da qual os fungos progenitores podem ser isolados numa base regional. Para os Ophiostoma e outras estirpes azuis típicas que infestam os pinheiros de madeira macia, pode ser usada uma avaliação em pinheiros tipo U.S. amarelo setentrional.

A avaliação referente ao critério de redução de pez é determinado de acordo com a Técnica padrão ΤΑΡΡΙ T204 OS-76 com cloreto de metileno e realizada em substractos esterilizados no sentido de eliminar a influência de outros organismos que infectam naturalmente os substractos não esterilizados.

20% em 21 adequados. pelo menos

Geralmente, uma redução de pez de pelo menos dias será desejável para os candidatos mais Reduções de pelo menos 25%, particularmente de

30%, indicará principalmente a candidatos preferidos. Se o critério fôr atingido em 21 dias, repetindo as avaliações e alcançando o nível de pelo menos 20%, 25% ou 30% de redução de pez em 14 dias indicarão os candidatos preferenciais

Um grupo preferido de ascósporos para selecção ou selecção inicial, particularmente quando um progenitor é cinzento escuro ou cinzento, e o critério é alcançado, será aquele que produz um fungo ascósporo que reduzirá o teor de pez no substracto em pelo menos 25% em não mais do que 21 dias sem diminuir o nível de brilho do substracto esterilizado em mais do que 10% em comparação com o substracto não tratado, controlo esterilizado.

brilho do substracto ê determinado sobre serradura semelhante a material padronizado de espessura determinada e medido com um metro de brilho tal como num metro Photovolt Reflection. A avaliação que diz respeito ao brilho é conduzida desejavelmente para propósitos da avaliação em substractos esterilizados para eliminar novamente a influência de organismos que infectam naturalmente substractos não esterilizados e obter um acesso mais absoluto da influência da cor do candidato. Estas avaliações serão também conduzidas após crescimento durante 21 dias. Quando um critério é o aperfeiçoamento do brilho, um aperfeiçoamento de pelo menos 5% ê normalmente ligeiro para reduzir o erro e garantir confiança estatística. 0 grau de aperfeiçoamento obtido, por outro lado, pode variar consideravelmente. Se um fungo de cor escura ou mediana está envolvido como progenitor, os aperfei-

çoamentos na ordem dos	10%, 15%,	20%, 25% ou	mesmo mais
podem	ser	obtidos. Se	estiverem	envolvidos	progenitores
mais	claros	, podem ser	obtidos	aperfeiçoamentos de ordem
mais	baixa,	como seria o	caso quando se procura	aperfeiçoar

um ascósporo prévio isolado e seleccionado para obtenção de brilho. Ê evidente, que nenhum aperfeiçoamento quanto à clareza da cor pode ser realizado totalmente e os critérios atingem-se quando se pretende seleccionar na base da virulência de crescimento.

/ I

ç. ·, 1,

- 17/A determinação da virulência de crescimento de acordo com os critérios l) e 2) será conduzida num substracto não-esterilizado e realizada 10 dias depois da inoculação para reflectir os fungos desejados desenvolvidos pela invenção. Tais determinações são realizadas segundo o processo descrito no parágrafo que se segue, na base de percentagem de substracto ou ripas que apresentam crescimento do candidato em comparação com o progenitor referenciado. Tais determinações podem ser feitas numa base de percentagem e, quando um critério for satisfeito é um aperfeiçoamento da virulência, um aperfeiçoamento de pelo menos cerca de 10 pontos de percentagem (isto é 80% a 90%) é normalmente suficiente para reduzir o erro e aceitar a confiança estatística. Se a determinação deve ser feita com base na virulência e tanto o progenitor referenciado como o fungo candidato apresentam 80% do crescimento ou mais, a dosagem avaliação/critério de 10 CFU ê reduzida até que o crescimento do progenitor referenciado seja inferior a 70%, por exemplo entre 35% e 65%.

crescimento ou virulência dum fungo para comparação entre fungos e todas as condições possíveis, a não ser que de outra forma se especifique, serão novamente levadas a cabo de forma tão idêntica quanto possível para comparação. 0 crescimento ou virulência ê determinado por meio dum protocolo de observação visual relativamente simples aplicado numa base consistente, e levado a cabo imediatamente ao fim do período teste de 10 dias. 0 protocolo baseia-se em categorias de corde crescimento que podem ser observadas ou certificadas em cada ripa de madeira ou substracto individual sem ajuda ocular a uma distância de leitura normal. Uma categoria de cor, tipicamente a mais brilhante, representará a cor de crescimento do ascósporo candidato ou o candida-

to de crescimento mais brilhante se se pretender comparar vári os ascósporos. As categorias branco (w.), cinzento (g.) e negro (b.) podem ser usadas bem como as cinco categorias de bran co (w.), cinzento brilhante (l.g.), cinzento mediano (g.), cin zento escuro (d.g.) e negro (b.) dependendo vastamente da cor do candidato ascósporo a. ser comparada com o seu fungo progeni. tor ou com outros candidatos. A categoria de taxa de cinco cores é preferível pois assim todos os candidatos podem ser assi nalados por uma das cinco. 0 número de ripas observadas que possuem cor de crescimento do ascósporo candidato é classifica do segundo quatro categorias tal como seusou nas avaliações abaixo registadas. Uma única cruz ( + ) é assinalada quando 25% das ripas apresentam o crescimento específico do candidato ascósporo, duas cruzes (++) quando cerca de 50% apresentam crescimento, três cruzes (+++) quando cerca de 75% apresentam cres cimento e quatro cruzes (++++) quando cerca de 100% revela crescimento. Se uma percentagem dentro de cerca de 5pontos per centuais de uma percentagem intermédia, por exemplo 58% está dentro dos 5 pontos percentuais de 62,5%, é adicionada uma cruz após a barra e a taxa inferior, por exemplo (++/+) ou (++/+++). De forma análoga uma taxa intermédia abaixo da taxa do primeiro nível é indicada por (+/-). Uma totalização similar é realizada para os progenitores a serem referenciados. Com o propósito de realizar avaliações mais precisas relativas ao critério aqui descrito, quando necessário, será determinada a percentagem actual e as percentagens comparadas. No entanto, será permitida uma margem de erro para o erro humano, a maior dificuldade de determinação dos crescimentos mais brilhantes e do alcance substancial dos objectivos da invenção. Tal margem ê de 10 pontos percentuais, de tal forma que um ascósporo candidato que apresente um crescimento de 78% em ripas de madeira será considerado de a

com igual capacidade de crescimento ou virulência que um fungo progenitor que apresenta uma percentagem de 88%. As ripas tratadas, não esterilizadas, apresentarão normalmente crescimento noutras áreas da ripa de outros organismos, comummente os fungos de cor negra, e tal coloração de atraso de crescimento pode ser registada separadamente. Tal atraso não altera a avaliação feita mas indica fungos que infestam naturalmente a polpa crescimento presença de de celulose.

Uma selecção de acordo com os critérios 1) e 2) pode ser dispensada em certos casos em que certos fungos de ascósporos ou seus derivados, desejavelmente também um derivado homocarió tico, apresenta certas caracteristicas particularmente preferidas reflectindo brilho e virulência em substractos não esterilizados. Em particular, são desenvolvidos novos fungos desejáveis por esta invenção quando o critério de redução de pez é atingido em substractos esterilizados (e não esterilizados) 21 dias depois, como se descreveu acima, um controlo do substracto não esterilizado 14 dias depois, é influenciado suficientemente pelos organismos nativos de forma que o seu brilho é reduzido em pelo menos 10%, especialmente em pelo menos 20%, em comparação com um controlo não tratado esterilizado, e ainda o fungo derivado de ascósporos resulta num nível inferior, ao fim de um período de 14 dias num substracto não esterilizado, que é pelo menos tão grande quanto o nível de brilho do controlo não tratado e não esterilizado. Tais fungos são indicados como novos em relação aos fungos até aqui conhecidos na técnica. Uma classe particularmente desejada de tais fungos é aquela que actualmente aumenta o brilho, por exemplo em pelo menos cerca de 5% ou mais, em comparaçao com $ : ....

' - 20“ controlo não esterilizado não tratado. As sub-classes preferidas de tais fungos são aquelas que atingem o resultado desejado em pelo menos uma espécie ou variedade de madeira a dosagens inferiores a 10 CFU/Kg, particularmente a dosagens que não excedam 10 , e especialmente a dosagens que não excedam 10θ .

Os fungos de acordo com a invenção podem ser usados para reduzir o teor de pez em polpa de celulose e em polpa mecânica do primeiro estádio como descrito na EP 387187. 0 termo polpa de celulose como aqui é usado significa qualquer forma colhida (cortada) duma árvore usada para fazer papel, cartão ou outro produto celulósico, mas antes da transformação em pasta, e inclui formas tais como toros, troncos, ripas, serradura e semelhantes. 0 termo polpa de celulose refinada significa uma polpa resultante da aplicação de forças mecânicas e/ou de corte ao conjunto de polpas de celulose tais como toros para obter ripas e serradura que são introduziveis num processo de produção de polpa. 0 termo polpa de celulose de primeiro estádio significa uma polpa, isolada a partir dum processo mecânico de preparação de polpa, que compreende 60% ou mais do teor de linina do substracto antes da preparação da polpa.

Basicamente, um inoculo de pelo menos um dos fungos é aplicado ao(s) substracto(s) e o(s) 'substracto(s) inoculado(s) é mantido à temperatura de desenvolvimento do fungo, por exemplo entre 2 a 43°C, de preferência entre 7°C a 34°C, duran te um tempo suficiente para degradar o teor de pez do substrac to, por exemplo durante 7 a 14 dias. As polpas de celulose refinadas são normalmente acumuladas, por exemplo em pilha, após inoculação o que será desejavelmente distribuída represen tativamente através de acumulação. Tal acumulação pode β

ser sob a forma de pilhas de madeira típicas ou num contentor silo, um atrelado, um redução de pez durante semelhantes podem ser

um	fungo	que	cresce	rapidamente a	níveis
eficientes	em	madeira	esterilizada,	enquanto
os	efeitos	de	brilho	negativos relativos aos

ou num espaço fechado tal como um navio ou semelhante para permitir a o transporte. Os troncos, toros e tratados de várias formas para induzir o crescimento duma maior porção ou de mais substracto, por exemplo troncos, ou toros podem ser riscados em comprimento e o inoculo pode ser aplicado nas estrias, ou podem mesmo inocular-se as extremidades. A polpa mecânica do primeiro estádio é um substracto esterilizado e a invenção pode ser aplicada a substractos quer esterilizados, quer não esterilizados. No entanto, os benefícios particulares e desejados são, evidentemente, para se realizar quando a invenção é usada em polpas de celulose não esterilizadas, incluindo polpas de celulose refinada não esterilizada. A dosagem aplicada na prática da presente 10 invenção não excederá 10 CFU/Kg do substracto com polpa refi9 nada, e de preferência não excede 10 CFU/Kg, e podem ser usadas dosagens mais baixas com as realizações de maior preferência.

A partir da presente invenção não é apenas possível obter de inoculação se reduzem progenitores, fungos que reduzem o teor de pez, mas a presente invenção está também indicada de acordo com um objectivo e realização preferida, de forma que o brilho do substracto de madeira não pode ser minimamente afectado ou substancialmente não afectado em relação aos controlos não tratados e não esterilizados (representando uma pilha de ripas de madeira típicas) mas possa ser mesmo aumentado em comparação com tais controlos Tal fungo particularmente preferido e seu uso em substractos não esterilizados, incluindo os que devem ser moderadamente infectados ou mesmo mais infectados naturalmente com fungos

de mancha ou de cor, são vistos com grande interesse pois não somente o teor de pez pode ser reduzido com salvaguarda de custos e papel/produto de resistência de substracto tratado polpa de celulose melhoria das propriedades mas também o brilho do pode ser mesmo aumentado em relação à não tratada como normalmente sucede no processo de transformação em pasta. Enquanto que tal benefício em termos de brilho pode ser devido em menor extensão ao resíduo branco ou substancialmente brilhante que resta dos micélios dos fungos particularmente preferidos, tal benefício é indicado como sendo largamente incrementado pela capacidade dos fungos preferidos crescerem dentro ou fora doutros organismos ou fungos de cor em locais onde tais outros organismos de outra forma cresceriam durante o período de tratamento, por exemplo 14 dias. Polpa de celulose não esterilizada tratada com os fungos particularmente preferidos é também considerado novo pois é indicado que tais substractos tratados com outros fungos desvanecidos ou de crescimento muito brilhante que possuem virulência ou crescimento competitivo reduzido (relativo ao seu próprio efeito de coloração), nós fizemos a experiência, mesmo quando inoculados a dosagens relativamente elevadas, actuarão largamente em locais onde os fungos de cor nativos ou outros organismos não se espalham e sao insuficientemente competitivos para excluir de forma suficiente o desenvolvimento de fungos de cor naturais o brilho. Tais polpas as produzem podem ser natural com o fungo para obter impacto positivo sobre de celulose novas e os fungos que definidos relativamente à infecçao ou organismo de cor quando uma amostra (não tratada) controlo não esterilizada exibe infecçao suficiente em que o seu brilho é reduzido em pelo menos 10% à temperatura ambiente em relação às amostras não tratadas esterilizadas durante o período de tratamento, em que os substractos tratados

- 13 com os novos fungos possuem um nível de brilho pelo menos igual ou superior ao nível de brilho dos referidos controlos de polpa de celulose não tratados e não esterilizados após o período de tratamento, por exemplo 14 dias. Tais substractos de tratamento fúngico que possuem brilho aperfeiçoado em comparação com os controlos não tratados e não esterilizados serão produtos especialmente desejados para posterior processamento especialmente na produção de produtos de polpa mecânica.

A invenção é posteriormente ilustrada pelos exemplos que se seguem em que os fungos que pertencem às espécies preferidas 0 .piliferum como indicados na Tabela com os N⁵s de Acesso do NRRL são usados resp. produzidos.

Exemplo 1

Isolamento de ascósporos

fungo C —1 (0.piliferum 18691 do NRRL) foi cultivado e desenvolveu-se em madeira esterilizada durante 2 a 4 semanas para permitir a produção de perithecia. Posteriormente foi repicado com gotas de ascósporos com uma agulha esterilizada de dissecação e transferido para 400 ul de óleo de milho. As amostras foram agitadas de forma vigorosa para formar uma suspensão de esporos uniforme. Esta suspensão foi examinada numa câmara de contagem hemocitómetro sob g

um microscópio e observou-se que compreendia 1x10 cêlulas/ml, das quais 90 a 95% eram ascósporos simples. Os restantes 5 a 10% dos fungos consistia em fragmentos de hifa e ascósporos acumulados.

Os ascósporos foram diluídos em óleo de milho esterilizado, ι

- 24 ·- A posteriormente foram feitas mais duas diluições adicionais e separadas, 10 e 100 vezes em Triton X100 a 10% para comparação uma com a outra. Alíquotas de 100 ul das duas diluições foram colocadas em Yeast Malt Agar para alcançar densidades de placa de 100 e 10 esporos por placa. Triton X100 foi usado para dispersar o óleo de milho e prevenir a re-agregação das gotículas de óleo na superfície do Agar.

é não-tóxico para estes fungos em cultura

Triton X100 líquida, mas porque não se sabe qual o enredo dos esporos em óleo/micélios detergente e como afecta a sua germinação, foram levadas a cabo um grupo de diluições isentas de detergente e colocadas em placas para comparação.

Os fungos foram removidos do óleo a partir das placas conforme se foram desenvolvendo. Nessas placas em que os esporos foram colocados sem detergente, as colónias flutuavam no topo do óleo e tendiam a cumular-se. Em presença do óleo/deter gente, as colónias mantiveram-se discretas e quase compactas, mas quando levaram mais tempo a alcançar o tamanho desejado para a repicagem. As colónias em óleo eram suficientemente grandes para a repicagem ao fim de 4 dias, enquanto que as colónias colocadas em óleo/detergente estavam prontas ao fim de 7 dias.

Não existia toxicidade ou prevenção de germinação observada usando o processo de óleo/detergente. A mais baixa viabilidade observada em ausência do detergente pode ter como causa a agregação de colónias ou germinação de esporos à superfície do óleo, ver Tabela a seguir.

Colónias por Placa

Processo óleo óleo/detergente

Diluição 10

29,25,14,22,17,29

103,102,105,104,

82,119

Diluição 10

2,9,3,1,2

10,5,10,12,8,

8,9,14,10,9

Quando as colónias individuais atingirem o tamanho para re-estriar, todas as colónias das placas de mais baixa, tendo em conta a cor ou tamanho, foram das para Yeast Malt Agar para armazenagem e teste de perithecia (estado homocarion).

% Viabilidade

23%

100% suficiente diluição transferide produção

Exemplo 2

Visualização para Homocariotas e Selecção Preliminar ascósporo C-l isolado foi visualizado no sentido de eliminar tantos heterocariotas quanto possível e para determinar a eficácia do isolamento óleo/detergente como um processo de produção de homocariotas. A produção de perithecia amadurecidas contendo ascósporos requere dois tipos de cruzamento complementares que as estirpes homocariotas não podem possuir; as estirpes heterocariotas podem possuir ambos os factores (isto é auto-reprodução). Apesar de um homocariota poder produzir um perithecium imaturo, denominado um protoperithecium, apenas um heterocariota pode produzir um perithecium amadurecido. Logo, as estirpes heterocariotas podem ser detectadas em virtude de produzirem perithecium, mas a ausência de formação de peritécios não prova que a estirpe seja homocariota.

A visualização foi levada a cabo alinhando cada isolado em agar de ripas de madeira e monitorizada em termos de produção de peritécio durante um período de 2 meses. Apenas 9 das 105 C-l isoladas e visualizadas produziram peritécios e foram descarregadas. A Tabela que se segue apresenta uma quebra numérica das restantes C-l isoladas que não produziram peritécios e que se presume serem homocariotas. Os isolados foram agrupados de acordo com a cor de desenvolvimento no agar de ripas de madeira.

Quebra Numérica das C-l Isoladas

Cor do grupo

Negro

Cinzento

Clara

Número de Isolados % Total

30%

63%

7%

As 96 colónias presumidamente homocarióticas obtidas a partir de C-l, revelaram boa cobertura no agar de ripas de madeira. Todos os isolados C-l mais brilhantes (e outros) foram previamente visualizados para a taxa de crescimento em ripas de madeira não-esterilizadas e em madeira esterilizada no sentido de seleccionar o mais virulento desses isolados para estudos posteriores.

Exemplo 3

Visualização de crescimento dos candidatos do grupo mais brilhante e virulento

Cada um dos fungos candidatos mais virulentos foram cultivados num meio de levedura de malte à temperatura ambiente, a 200 rpm durante 72 horas (foram escolhidas 72 horas devido à taxa de lento crescimento de algumas estirpes). As células

foram colhidas por centrifugação e re-suspensas em água esterilizada para uma concentração CFU viável de aproximadamen te 1x10^/ml.

Amostras de 100 g de ripas de pinho amarelo setentrional esterilizadas (em autoclave) e não esterilizadas (ripas com menos do que 1 semana armazenados a 5°C antes do uso) foram inoculadas em duplicado com L ml de suspensão fúngica. As ripas inoculadas foram armazenadas â temperatura ambiente no escuro. 0 crescimento foi monitorizado ao longo do tempo durante um período de 10 dias.

Na Tabela abaixo, é apenas registada a avaliação das 5 colónias isoladas com melhor desenvolvimento no grupo de cor brilhante. As abreviaturas têm o seguinte significado:

w.	- branco
g.	= cinzento (mediano)
i.g.	= cinzento brilhante
d.g.	= cinzento escuro
b.	= negro
+ /-	= crescimento inferior a 25%
+	= crescimento de 25%
+ +	= crescimento de 50%
+ + +	- crescimento de 75%
+ + + +	= crescimento de 100%

Desenvolvimento dos Isolados Brilhantes C-l

Fungos 1 Dia 3 Dias	5 Dias	7 Dias	10 Dias
Controlo - -	+/“	+d.g.	+++d· 2.
C-l progenitor - -	+l.g.	++i.g.	+++g.
C-l óleo 6 - -	+/-	+i.g.	++/+++g·
C-1D5	+w.	++w.	+++/++++1,g.
C-1D23	+/-	++g.	++/+++2 ·
C-1D41	+/-	++l.g.	+++g.
C-1D84	+w.	+w.	+++W.
TAB28	+++d.g.	++++d.g.	++++b.
Toros de Madeira	Esterilizada
Fungos 1 Dia 3 Dias	5 Dias	7 Dias	10 Dias
Controlo -	-	-	-
C-l progenitor - +/- 1	+++l.g.	++++l.g.	++++g.
C-l óleo 6 - +/- w	+	+++i.g.	++++l.g.
C-1D5 - ++w.	+++W .	++++l.g./w	++++l.g.
C-1D23 - +/- w.	++W.	+++g.	++++l.g.
C=1D41 - +/- 1.	++l.g.	+++/++++l.g	. ++++l.g.
C-1D84 - + w	++W	+++/++++W	+++/++++W.
TAB28 - ++d.g.	++++d.g.	++++b.	++++b.
Os homocariotas acima isolados apres	entaram um	intervalo
de virulência, com pelo menos os nossos critérios.	C-1D5 e	C-1D84 a	alcançarem

- 29 Exemplo 4

Redução do teor de pez e efeitos de brilho

fungo foi cultivado num meio de levedura de malte à temperatura ambiente, a 200 rpm durante 72 horas. As células (cerca de 95% de blasto-esporos/5% de micélios) foram removidas por centrifugação e re-suspensas em água esterilizada para θ obter um CFU viável de aproximadamente 1x10 /ml. Cinco sacos de 100 g aplicados de ripas de madeira de pinho amarelo setentrional esterilizada foram inoculados com 1,0 ml de suspensão fúngica. Os sacos inoculados e controlo foram incubados à temperatura ambiente no escuro durante três semanas. Quatro reaplicações de cada conjunto dos cinco foram analizados em termos de teor de pez. 0 quinto foi medido em termos de brilho. Os resultados são apresentados na Tabela que se segue.

Amostra	Cor de crescimento da madeira	% Extractivo	Brilho
Controlo	não aplicável	1.81	49.5
C-l progenitor cinzento	0.90	38.3
C-1D69 (Grupo cinzento)cinzento	1.15	41.2
C-1D2 (Grupo	cinzento) cinzento	0.83	44.7
C-1D5	cinzento brilhante	0.88	46.8
C-1D84	branco	1.38	51.9
C-1D90 (Grupo	negro) negro	1.49	24.0

Todas as estirpes acima testadas apresentaram redução significativa de pez. 0 grau de perda de brilho depende da cor de crescimento dos fungos na madeira. As duas estirpes brilhantes ensaiadas C-1D5 e C-1D84 apresentaram consideravelmente maior brilho do que o fungo progenitor C-l. 0 C-1D84 foi desejavelmente indicado como possuindo melhor brilho do que o controlo não tratado.

Um membro dos ascósporos desvanecidos isolados foram testados em termos de crescimento sob condições de campo (ripas de madeira não esterilizada).

spray manual a partir de As ripas de madeira a estirpe area onde

Estirpes de fungos foram inoculadas com um em ripas de madeira não esterilizada obtidas toros com 2 dias para formar 10 pilhas não esterilizadas foram obtidas duma azul 0.piliferum nativa tem sido tolerada e foram seleccionadas com base no facto de estarem naturalmente infestadas por tal estirpe azul. As pilhas foram incubadas no exterior sob condições ambientais, durante duas semanas. As pilhas foram desmanteladas e registou-se a quantidade de desenvolvimento fúngico.

A tabela abaixo resume os resultados deste ensaio de campo comparativamente aos resultados obtidos com estirpes desvanecidas inoculadas com um spray manual.

Dose

Tratamento (Grupo) CFU/kg Toro

Controlo

ΓΑΒ28 (negro)	2x10
C-1D2 (cinzento)	3x10
C-1D4 (cinzento)	9x10
C-1D23 (brilhante)	2x10
C-1D23 (brilhante)	2x10
C-1D41 (brilhante)	3x10
C-1D41 (brilhante)	3x10
C-1D72 (cinzento)	4x10
3-1D84 (branco)	4x10
C-1D84 (branco)	4x10
C-1D5 (brilhante)	5x10
C-1D5 (brilhante)	5x10

Crescimento Médio

Recúo	Brilh
+ + + +
+ + + +
+ + + +	+ + / +
+ + + +	+
+ + + +	+
+++ +	+ +
++++
++++	+/+
+ + + +	+ /+
+ + + +	+ + +
++++	+ + + / +
++++	+ + +
+ + + +	+ + +

A dosagem aplicada é expressa como unidades de formação de colónias (CFU) por kg de ripas de madeira. 0 atraso de crescimento indica que existiam já fungos negros/escuros na madeira (ou no inoculo no caso da estirpe negra TAB28).

Em adição, o C-1D5 foi inoculado com um spray manuseável à mão em ripas de madeira preparadas de 3 semanas de idade e o resultado de crescimento em pilhas de 10 ton são apresentados abaixo (que também indicam uma supressão do atraso do crescimento pelos fungos).

Dose	Crescimento Médio Negro	Brilho
Tratamento	CFU/kg Toros
Controlo		+ + + / +
C-1D5	7xl0⁷	++ +	+ + +
C-1D5	4xl0⁸	+ + / +	+ + + +

Ambas as estirpes C-1D5 e C-1D84 apresentaram um muito bom crescimento em ripas de madeira não esterilizada e também uma boa relação dose/resposta.

Os resultados anteriores indicam, em adição a uma elevada redução de pez e essencialmente à ausência de influência negativa em termos de brilho, que as estirpes C-1D84 e C-1D5 isolados seleccionados crescem muito bem sob condições altamente competitivas que podem ser encontradas em pilhas de ripas de madeira ou em outras formas de polpa de celulose, e particularmente produzem o seu efeito desejado a dosagens de inoculo da mesma ordem de magnitude que a estirpe altamente eficaz TAB28. Não são apenas tais objectivos atingidos por estas duas espécies, mas os resultados indicam as vantagens adicionais e mais significativas no potencial que

estes fungos apresentam em ultrapassar parcialmente ou deslocar as influências de escurecimento que infectam naturalmente tais polpas de celulose, resultando consequentemente numa polpa de celulose que é essencialmente mais clara do que a polpa controlo ou convencionalmente manuseada, permitindo assim potencialmente uma redução nos tratamentos subsequentes usados para aumentar o brilho tal como ê particularmente aplicado, por exemplo, em ligação com polpas.

Exemplo 5

Produção de WZ19, WZ24 e WZ58

Os fungos ascósponus de crescimento branco C-ID84 e o fungo TAB51 do tipo selvagem 0.piliferum que se desenvolvem com cor negra foram cruzados por repicagem de culturas de cada uma das placas de Agar Levedura de Malte na mesma área da placa de Agar de ripas de madeira e posteriormente cultivadurante 4 semanas com parafina. Os

Três (3) dos ram-se as placas de culturas cruzadas ao ar livre após se ter selado a placa ascospórus resultantes do cruzamento foram isolados e recuperados pela técnica acima descrita (isolamento óleo/detergente) e posteriormente, aproximadamente 93 colónias isoladas desenvolveram-se e procedeu-se à avaliação preliminar em termos de cor e virulência em crescimento candidatos, aqui denominados WZ19, WZ24 e WZ58 foram seleccionados para avaliação posterior com base na sua cor branca e excelentes características de crescimento (todos os três candidatos exibiram virulência de crescimento similar ao TAB28 que por si só ê superior ao TAB51 em termos de virulência de crescimento). 0 TAB51 exibe um azul escuro ou essencial mente negro típico do fungo azul quando se desenvolve num substracto de madeira, por exemplo, pinho amarelo setentrional não esterilizado ou esterilizado.

Os três (3) candidatos desenvolveram-se então para produzir o inoculo e avaliou-se o crescimentos como acima se descreveu sob supervisão Growth Screening of More Virulent Light Group Candidates (Visualização do Crescimento dos Candidatos do Grupo Brilhante mais Virulentos), com outros para comparação, tendo sido registados abaixo os resultados das ripas de madeira não esterilizada de pinho amarelo setentrional.

Estirpe O.piliferum

Controlo

TAB28

C-1D5

C-1D84

WZ19

WZ24

WZ58

Crescimento Fúngico Inoculado dias + / + + +

+ + /+ / + + + + dias

+++/++++ +++/++++ + + + + + + + +

dias + /+ + + + + + + + + + + + + + + +

Os três candidatos foram então avaliados em termos de redução de pez e efeitos de brilho de acordo com o processo previamente descrito sob o título Redução de Pez e Efeitos de Brilho, excepto os substractos tratados que foram incubados durante apenas duas semanas. Os resultados das ripas de madeira de pinho amarelo setentrional esterilizadas abaixo.

sao registados

Estirpe	Cor de Desenvolvimento na Madeira
Controlo	Não aplicável
TAB28	Negro
C-1D5	Cinzento Brilhante
C-1D84	Branco
WZ19	Branco
WZ24	Branco
WZ58	Branco
Exemplo 6

% Extracto	Brilho
3.2	34.5
2.0	25.0
2.6	34.6
2.3	37.6
2.2	35.9
2.1	37.1
2.1	35.9

Desenvolvimento em ripas de condições de campo madeira não esterilizada sob

As estirpes fúngicas foram inoculadas com um spray manual em ripas de madeira de pinho amarelo setentrional não esteride toros 40% madeira fresca armazenadas em inoculadas a (aproximadamente pilhas de ripas de 10 ton.

.11 idade) e ripas foram

No sentido de providenciar lizadas, e preparadas a partir de um grupo sazonais (2 a 3 meses de idade) e 60% de 3 semanas de

As uma dosagem de 2x10^ CFU/ton (cerca de 9,09x10' CFU/kg) à medida que foram removidas para a extremidade frontal da palete de plataforma de aquecimento em armazenamento. As plataformas de aquecimento compreendiam paredes de dois pês de altura que suportam uma vedação construída de 2x4.

um suporte para as ripas de madeira, enrolaram-se as mesmas em redes de galinheiro. Um aquecedor de ar forçado termostaticamente controlado foi colocado sob cada uma das placas de aquecimento para manter a temperatura do ar a 24°C. As pilhas foram encubadas sob estas condições durante 10 dias, sendo posteriormente desmanteladas para avaliação. A quantidade média do crescimento fúngico ao longo da pilha foi registada. Foram removidas amostras do centro das pilhas e analisadas em termos de teor de pez e brilho. Os resultados estão registados na tabela abaixo.

Amostra	Crescimento Médio	% Extractos	Brilho
	Recúo	Brilho
Controlo	+ /-	+ /-	3.7	33.5
C-1D5	+ /-	+	2.8	34.2
WZ19	+ /-	++/+++	2.7	32.9
WZ24	+ /-	+ +	3.6	32.9
WZ58	+ /-	++++	2.3	33.5
A espécie que	exibiu a	melhor taxa	de crescimento	global,

WZ58, reduziu também o nível de pez para o válor mais baixo. 0 atraso do crescimento é indicativo dos fungos coloridos negros/escuros que se encontravam já presentes na madeira.

Exemplo 7

Fermentação e formulação

As células (Blastospóros) de WZ58 desenvolveram-se a 25 C (Vo= lume de 10 Its de meio num fermentador Chemap de 20 Its) num meio que compreendia 200 grs por de malte e 200 g por litro de extracto até se obter uma densidade celular de 3x10 células/ml. 0 meio de fermentação (cerca de 36 a 48 horas) foi arejado a dois volumes de ar por volume médio por minuto (níveis de oxigénio isto ê litro de extracto de levedura proximos da saturação, não limitado a qualquer ponto durante a fermentação).

D crescimento da biomassa no fermentador foi removido por centrifugação e as células peletizadas foram misturadas com barro a uma taxa de 1 parte de biomassa húmida (aproximadamente 20% sólido) para duas partes de caolino seco. 0 teor de humidade da mistura biomassa: barro está compreendido ao intervalo entre 25 a 30%. A mistura fluída é carregada em secadores de leito fluído Aeromatico e submetida a condições de temperatura ambiente para secagem para se obter um teor de humidade final de 5 a 10%. A temperatura de ar de saída é mantida abaixo dos 75° C. 0 tempo de secagem está compreendido entre 20 a 40 minutos. 0 material seco co leito fluído retêm a viabilidade e a capacidade de erescinento em ripas de madeira não esterilizada e reduz o teor de pez após armazenagem prolongada a -15° C.

Tempo de Armazenagem (dias) Unidade de formação colónia/g

0	2	X	10
24	2	X	IO¹⁰
67	1	X	IO¹⁰
107	6	X	io⁹
178	5	X	io⁹

Exemplo 8

Fermentação e Formulação

As células (Blastospóros) de WZ58 desenvolveram-se a 25°C (Volume de 10 1 de meio num fermentador Chemap de 20 1) num meio que compreendia 200 g por litro de extracto de malte e 20 g por litro de extracto de fermento atê se obter uma 9 densidade celular de 3x10 cêlulas/ml. 0 meio de fermentação (cerca de 36 a 48 horas) foi arejado a dois volumes de

ar por volume de meio por minuto (níveis de oxigénio próximos da saturação, isto ê, não limitado a qualquer ponto durante a fermentação).

A biomassa desenvolvida no fermentador foi removida por centrifugação sob a forma de uma pasta celular com 5% de teor em sólidos. A pasta é alimentada (aspergida) horizontalmente para dentro de um secador de leito fluidificado Aeromatic e posta em contacto com areia de caolino sob condições de temperatura ambiente para se obter um teor em humidade final compreendido entre 2 a 10%. A taxa de peso da pasta de caolino é de 1:1. A temperatura de saída de ar é de 35°C. 0 tempo de secagem ê de 20 a 40 minutos. 0 produto granulado aspergido resultante retém viabilidade e capacidade de crescimento em ripas de madeira não esterilizada e reduz os níveis de pez após armazenamento prolongado a -15°C.

Exemplo 9

Redução de pez em ripas de madeira de várias espécies de madei ras.

As ripas de madeira foram processadas de acordo com os seguintes padrões:

Ripas de madeira	TAPPI	T 257 cm 85
Calibração de Serradura	TAPPI	T 264 cm 88
Extracção de pez	TAPPI	T 204 os 78

Tabela: Redução de pez por C-1D5

Dose 5x10 FCU/g; DCM: diclorometano; E/T: etanol/tolueno % Diminuição

Espécies de madeira	4 dias	7 dias	14 dias
Abeto vermelho	DCM	26	34	47
(Picea ables)	E/T	20	33	42
Pinho	DCM	35	40	45
(Mediterranean)	E/T	27	27	50
Vidoeiro	DCM	15	27	53
(branco)	E/T	19	23	31
Eucalipto	DCM	47	51	71
(Globulus)	E/T	17	27	34

Claims

REIVINDICAÇÕES

1-. Processo para o tratamento de madeira para polpa de celulose com fungos específicos a fim de reduzir o seu teor de pez, caracterizado pelo facto de se adicionar um inoculo de, pelo menos, um fungo específico, à madeira 10 a tratar numa dosagem que não excede 10 unidades que formam colónias (CFU) por quilograma de 9 substracto, de θ , em especial, inferior a 10 preferência, menor do que 10 e CFU por quilograma de substracto e se manter o substracto inoculado a uma temperatura à qual se verifica o desenvolvimen to do fungo, geralmente compreendida entre cerca de 2 e 43°C, preferivelmente, entre cerca de 7 e 34°C, durante um intervalo de tempo suficiente para degradar o do substracto, por exemplo, 7-14 dias.
2^a. Processo de acordo com a reivindicação 1, □ elo facto de o fungo reduzir o teor de pez esterilizado em, pelo menos 25% depois de teor de pez caracterizado do substracto se desenvolver □ ão mais do que 21 dias sem diminuir o brilho do substracto em mais do que 10% em comparação com um controlo não tratado.

3^a . Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se empregar uma estirpe de fungos compreendendo jm ascósporo isolado ou uma estirpe que se pode obter a

partir dum ascósporo que ê da classe dos Ascomycotina ou dos Deuteromycotina e que se caracteriza por:

a) afectar o grau de brilho dum substracto de madeira esterilizada, depois de 21 dias de desenvolvimento, não mais do que um fungo referenciado de que provém, enquanto se

- 40 desenvolve mais virulentamente do que o referido fungo de que provêm no mesmo substracto de madeira mas não esterilizado como se verifica ao longo do intervalo de desenvolvimento de 10 dias;

b) originar um maior nível do grau de brilho num substracto de madeira esterilizada do que um fungo referenciado de que provém depois de 21 dias de desenvolvimento enquanto se desenvolve substancialmente não menos virulentamente

que 0 fungo de que provém no mesmo substracto de madeira mas não esterilizado como se determina durante um período de desenvolvimento de 10 dias.
4^. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracteriza do pelo facto de a estirpe do fungo empregada ser um fungo dos gêneros Ceratocystis , .Ceratogystiopsis,__Graphium,__Leptographium ou Ophiostoma.
5-. Processo de acordo rizado pelo facto de escolhida do grupo que com as reivindicações 3 ou 4, caractese empregar uma estirpe de fungos consiste em:

a) um ascósporo isolado duma cultura de um ou mais fungos das classes dos Ascomycotina ou dos Deuteromycotina;

b) uma cultura biologicamente pura do fungo que se pode obter a partir do referido ascósporo;

c) um inoculo que compreende esporos e/ou micélios separados duma cultura de acordo com a alínea h) acima mencionada;

d) uma cultura biologicamente pura do fungo derivado do fungo que se pode obter a partir do citado ascósporo, tendo o referido fungo derivado pelo menos a capacidade de degradação do pez, o efeito de branqueamento da madeira e a capacidade de desenvolvimento competitivo em madeira não esterilizada do fungo que se pode obter a partir do mencionado ascósporo; e

- 41 e) um inoculo que compreende esporos e/ou micêlios separados de uma cultura de acordo com d).
6^ã. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se empregar uma cultura biologicamente pura ou um inoculo dum fungo homocariótico da classe dos Ascomycotina ou Deuteromycotina que tem pelo menos a mesma virulência de crescimento do fungo com o Número de Acesso 18690 do Northern Regional Research Laboratory (Laboratório de Investigação da Região Setentrional) (NRRL) norte-americano e se desenvolver ainda essencialmente originando essencialmente originando uma cor branca quando ensaiado em pinheiro amarelo meridional.
7^â. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se empregar uma cultura biologicamente pura ou um inoculo dum fungo homocariótico da classe dos Ascomycotina ou Deuteromycotina que tem pelo menos a mesma virulência de crescimento num substracto de madeira não esterilizado e que afecta menos o brilho do mesmo substracto mas esterilizado que o fungo com o Número de Acesso 18691 do NRRL.
8ã. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se empregar uma cultura biologicamente pura ou um inoculo dum fungo homocariótico da classe dos Ascomycotina ou Deuteromycotina que tem pelo menos a mesma virulência de desenvolvimento num substracto de madeira não esterilizado e que afecta menos o brilho do mesmo que o fungo com o Número de Acesso 18677 do NRRL.
9^â. Processo de acordo com a reivindicação

1, caracterizado pelo facto de se empregar uma cultura biologicamente pura ou um inoculo dum fungo homocariótico da classe dos Ascomycotina ou Deuteromycotina que tem pelo menos a mesma virulência de desenvolvimento num substracto de madeira não esterilizado e que afecta menos o brilho do mesmo substracto mas esterilizado que o fungo com o Número de Acesso 18678 do NRRL .
10^â. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se empregar uma cultura biologicamente pura ou um inoculo dum fungo homocariótico da classe dos Ascomycotinas ou Deuteromycotina que tem pelo menos a virulência de desenvolvimento num substracto de madeira não esterilizada e afecta menos o brilho do mesmo substracto mas esterilizado que o fungo com o Número de Acesso 18755 do NRRL.

ll^ã. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto se empregar um fungo com o Número de Acesso 18755 ou um inoculo obtido a partir desse inoculo.
12^ã . Processo para obtenção duma estirpe de fungos de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo facto de compreender o isolamento de ascósporos de uma cultura de um ou mais fungos da classe dos Ascomycotina ou Deuteromycotina e a escolha de um ou mais fungos homocarióticos obtidos a partir destes ascósporos que têm uma das características mencionadas na reivindicação 3.
13^â. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de se dispersarem os ascósporos do fungo num óleo natural não tóxico consumível pelo fungo produzido pelos ascósporos e, em seguida, se tratar o óleo que contém os ascósporos com um agente dispersante do óleo não tóxico para se obterem gotículas discretas do citado óleo que contêm ascósporos.
14- . Processo de acordo com as reivindicações 12 ou 13, caracterizado pelo facto de compreender a escolha de acordo com o critério de o fungo se desenvolver num substracto de madeira esterilizada e reduzir o teor de pez do substracto em, pelo menos, 20% ao fim de não mais do que 21 dias de desenvolvimento.
15- , Processo para a preparação duma composição contendo fungos, caracterizado pelo facto de se misturar um concentrado de fermentação contendo esporos de um fungo de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 11 com um veículo sólido inerte que não afecta adversamente a estabilidade dos fungos.
16^â. Processo para a preparação de madeira para a fabricação de polpa de celulose, caracterizado pelo facto de se tratar com um fungo que penetra na madeira e degrada o pez da classe dos Ascomycotina ou Deuteromycotina de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 11.