NO300911B1

NO300911B1 - Fremgangsmåte for inaktivering av virus i blod og blodprodukter

Info

Publication number: NO300911B1
Application number: NO920834A
Authority: NO
Inventors: Harald Mohr; Bernd Lambrecht
Original assignee: Blutspendedienst Dt Rote Kreuz
Priority date: 1989-09-13
Filing date: 1992-03-03
Publication date: 1997-08-18
Also published as: ATE161681T1; EP0593098A3; HUT60142A; AU635068B2; DE122008000026I1; EP0593098A2; CA2065842C; EP0491757A1; FI99192C; FI920981A0; ES2113347T3; DE122008000026I2; JPH05500366A; DK0491757T4; HU9200627D0; DK0491757T3; CA2065842A1; HU215131B; EP0491757B2; RU2036235C1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for inaktivering av virus i blod og blodprodukter idet oppløs-ningene, hhv. suspensjonene som skal bli behandlet, utsettes for fenotiazinfarvestoffer og blir tilslutt bestrålt med synlig lys i det maksimale området for absorpsjon til farvestoffene og deretter blir blodet, hhv. blodproduktene, ledet gjennom adsorpsjonsmiddel for fjerning av farvestoffene.

Det er kjent at fotodynamiske forbindelser i forbindelse med synlig lys eller UV-lys kan virke inaktiverende på virus. Årsaken til dette er affiniteten som disse stoffene har for ytre virusstrukturer eller virale nukleinsyrer. Begge gjelder for fenotiazinfarvestoffer. De reagerer med membranstruktur-omhyllet vira og skader disse irreversibelt under innvirkning av lys, slik at viruset mister sin inf eksiøsitet (jfr. Snipes, W. et al., 1979, Photochem. and Photobiol. 29, 785-790). Videre reagerer de med viralt RNA eller DNA, spesielt med guaninrestene. Fotodynamiske forbindelser reagerer også med viral RNA eller DNA, spesielt med guaninrestene til disse nukleinsyrene. Etter dannelse av et farvestoff-nukleinsyre-kompleks blir disse påvirket av lysenergi, slik at nukleinsyrene blir denaturert og til slutt blir trådene brutt opp. Videre bevirker fenotiazinfarvestoffene til omdanning av molekylært oksygen i oksygenradikaler som er høyreaktive, og som på forskjellige måter kan være virulente (jfr. Hiatt, C.W., 1972, i: Concepts in Radiation Cell Biology, s. 57-89, Academic Press, New York; 0H Uigin et al., 1987, Nucl. Acid. Res. 15, 7411-7427).

I forhold til andre fotodynamiske farvestoffer for virusinaktivering, er fenotiazinfarvestoffer som metylenblå, nøytralrød og toluidinblå derfor av betydning, på grunn av at de allerede i forbindelse med synlig lys kan inaktivere en rekke vira, derunder også, under bestemte betingelser, slike som ikke inneholder lipidbelegg, som f.eks. Adenovirus.

Her kan det nevnes at f.eks. metylenblå (MB) og toluidinblå

(TB) selv har terapeutisk anvendelse, bl.a. som antidot ved karbonmonoksidforgiftninger og ved langtidsterapi-psykotiske sykdommer. Her anvendes ubetydelige ved siden av virkende mengder av MB hhv. TB for anvendelse (1-2 mg/kg kroppsvekt), som er mye høyere enn de som er nødvendig for virusinaktivering. De lave toksisitetene til MB og TB blir også vist ved data fra dyreeksperimenter.

Siden året 1955 har det vært antatt at farvestoffkonsentrasjoner, spesielt for toluidinblå, under 2,5 jiM bare virker utilstrekkelig virusinaktiverende (jfr. F. Heinmets et al., 1955, Joint Report with the Naval Medical Research Institute, Walter Reed Army Institute of Research, USA).

I de fra før beskrevne undersøkelser for virusinaktivering med fenotiazinfarvestoffer ligger farvestoffkonsentrasjonene mellom 10 uM og 100 uM. (Chang and Weinstein, 1975, Photody-namic Inactivation of Herpes-virus Hominis by Methylene Blue

(38524), Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 148:291-293; Yen and Simon, 1978, Photosensiti-zation of Herpes Simplex Virus Type 1 with Neutral Red, J. gen. Virol., 41:273-281). Ved disse konsentrasjonene gjelder den ulempen at det ikke bare foregår virusinaktivering, men også inaktivering av plasmaproteiner som f.eks. koagulasjonsfaktorer. Dette er en av grunnen til at fenotiazinfarvestoffer lenge ikke har oppnådd en rolle ved virusinaktivering i blod og blodprodukter.

Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for virusinaktivering, hvor virus og forskjellige typer ved tilsetning av fenotiazin-farvestoffer uten funksjonell innvirkning av plasmaproteinene blir drept. Gjenstand for oppfinnelsen er videre å gjøre fremgangsmåten så enkel at blod, hhv. blodprodukter, umiddelbart blir behandlet i kjøpte blodposer og slik at de tilsatte farvestoffene kan bli fjernet igjen etter behandlingen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for inaktivering av vira i blod og blodprodukter der oppløsningen, hhv. suspensjonen som skal inaktiveres, blir tilsatt fenotiazinfarvestoffer og bestrålt med synlig lys i området ved absorpsjonsmaksimumet til farvestoffene, og deretter blir blodet hhv. blodproduktene eventuelt ledet over et adsorpsjonsmiddel for fjerning av farvestoffene, kjennetegnet ved at fenotiazinfarvestoffene tilsettes i en konsentrasjon på 0,1 til 2 jjM, og at bestrålingen foretas umiddelbart i gjennomsiktige beholdere som blodposer, som anvendes for bloduttagning og oppbevaring.

Bestrålingen foregår med dagslys med tilstrekkelig styrke eller med monokromatisk lys, fortrinnsvis en kaldlyskilde, som har en bølgelengde i området av absorpsjonsmaksimum til det gjeldende farvestoffet. Videre bør følgende betingelser ved virusinaktivering i blodplasma, hhv. i plasmaprotein-oppløsninger, anvendes. Arbeidstemperaturen bør ligge i området 0 til 37°C, fortrinnsvis i området 4 til 20°C. Inaktiveringsvarigheten utgjør spesielt 5 minutter til 5 timer, fortrinnsvis 10 minutter til 3 timer, og pH-verdien skal ligge mellom pH 5 og pH 9, fortrinnsvis mellom pH 6 og pH 8.

Den vesentlige fordelen ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ligger i at den er enkel. F. Heinmets et al. (som angitt ovenfor) beskriver en innviklet apparatur, hvor-igjennom f.eks. blodplasma må bli ledet. Her inntreffer problemer ved oppmerksomhet og også apasitetsproblemer. Det ble nå overraskende fastslått at man kan anvende vesentlig mindre mengder farvestoffer, og det er ikke nødvendig med arbeidskrevende teknisk innretning for fotoinaktivering.

Det var også uventet at et ikke-omhyllet virus som adeno, som ikke lar seg inaktivere under fysiologiske omstendigheter i plasma, lar seg gjennom et fryse/tine-trinn bli fotosensiti-vert og dermed inaktivert. Dermed kunne inaktiveringen, uavhengig av rekkefølgen av arbeidstrinnene fryse/tine og tilsetning av farvestoff, bli fastslått. Under frysing forståes en dypfrysingsbehandling med flytendegjort gass som kjølemiddel ved temperaturer på omtrent -20°C til omtrent 80 K. Som regel blir den dypfryst under -30°C.

Man kan gjennomføre virusinaktiveringen umiddelbart i blod-hhv. plasmaposer, til tross for at disse bare er begrenset lysgjennomtrengende. Farvestoffet må bli tilført. Deretter blir posen med innhold belyst, og deretter kan produktet bli videre bearbeidet.

Fremgangsmåten kan dermed bli gjennomført uten større tekniske problemer, og er integrerbar i blodbanker ved arbeidet med bearbeiding av enkelte blod-donorer. Den lille mengden tilsatt farvestoff kan forbli i den behandlede væsken eller blir fjernet med adsorpsjonsmiddel.

Som blod, hhv. blodprodukter, gjelder blant andre følgende:

- fullblod

erytrozyttkonsentrat

trombozyttkonsentrat

plasma

serum

kryopresipitat

konsentrat av koagulasjonsfaktorer

inhibitorer

fibronektin

albumin.

For anvendelse i foreliggende fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, er fenotiaziner med følgende strukturformel egnet.

Eksempel 1

Med metylenblå (MB) blir nedenfor avhengigheten ved fotoin-ativering av vesikulær Stomatitis-Virus (VVS) vist i humanplasma.

Ca. 5 x IO<7> plaque-dannende enheter (PFU) pr. ml VSV ble suspendert i humanplasma og reagert med forskjellige konsentrasjoner MB. Kontrollprøven ble ikke tilsatt farvestoff. Prøvevolumet utgjorde 0,5 ml. En kontrollprøve og en del av de MB-inneholdende prøven ble bestrålt i 4 timer ved romtemperatur med synlig lys; og de andre ble lagret like lenge i mørke. Som lyskilde tjener en diaprojektor som var erstattet med en 150 W halogenpære (Osram Xenophot). Avstanden mellom objektivet til diaprojektoren, altså lysutløpsåpningen og prøven, utgjorde ved dette og alle ytterligere forsøk 30 cm. (Med unntak av virusinaktivering i blodposer).

Etter endt bestråling ble virustitre bestemt i alle prøver ved hjelp av en plaque-analyse. Som indikatorceller ble BHK-celler anvendt. Forsøksresultatene er oppført i tabell 1. Tab. 1: Inaktivering av VSV i humanplasma med og uten bestråling.

Bestrålingsvarighet: 4 timer.

Resultatene fra tab. 1 viser at fra en konsentrasjon av MB på 0,5 uM, ble det infeksiøse titeret til VSV redusert med mer enn 6 titerpotenser. Tydelig høyere konsentrasjoner av farvestoffet, fra omtrent 50 uM, fører uten bestråling til en signifikant reduksjon av VSV-titere.

Eksempel 2

Ved hjelp av følgende forsøk ble virusinaktiveringen ved lave farvestoffkonsentrasjoner bestemt.

VSV ble i nærvær av plasma og forskjellige mengder metylenblå, i aliquoter på 500 ul volum overnatt i kjølerom, bestrålt fra en avstand på 30 cm med diaprojektoren. Prøven A

- F ble bestrålt, prøve G ble ikke bestrålt.

Resultatene fra disse forsøkene er oppført i tab. 2. De viser at under ovennevnte betingelser ble tilsatt VSV inaktivert med mer enn 4 tierpotenser. Her var 0,5 jjM metylenblå nødvendig.

Sannsynligvis er titere til VSV blitt redusert bare ved inkubasjon overnatt ved 4°C med 1-2 tierpotenser, og dette forklarer det relativt lave utgangstiteret. Dette ble derimot ikke tatt med i forsøket.

Sammenligning av A (bestrålt) og G (mørk) viser at lys alene åpenbart ikke utøver en stor innflytelse på infeksiøsiteten til viruset.

Eksempel 3

Fotoinaktiveringen av virus i nærvær av fenotiazinfarvestoffer er avhengig av varigheten av bestrålingen. For å undersøke hvilke bestrålingstider som er tilstrekkelige for fotoinaktivering av VSV, ble 10^ plaque-dannende enheter (PFU) pr. ml suspendert i plasma, og bestrålt som beskrevet i forskjellige tider ved 22°C. Tabell 3 viser de oppnådde resultatene. Det fremgår at under de angitte forsøksbe-tingelsene er en times bestråling tilstrekkelig for å redusere det infeksiøse VSV-titeret med mer enn 6 tierpotenser .

Eksempel 4

Et lignende forsøk ble gjennomført i steden for med MB i nærvær av 1 uM av et annet f enotiazinf arvestof f, TB. De i tabell 4 oppførte resultater viser at også ved hjelp av TB kan VSV bli virkningsfullt inaktivert.

Den inaktiverende virkningen av fenotiazinfarvestoffet ble vist også i Herpex-Simplex-virus (HSV) samt human immun-sviktvirus type 1 (HIV-1).

Eksempel 5

I nærvær av metylenblå (1 uM) blir HSV også inaktivert. Tab.

5 viser kinetikken til MB-forbmidlet fotoinaktivering av HSV.

Eksempel 6

Et lignende forsøk ble gjennomført med AIDS-frembringer HIV-1. Virustitere utgjorde 6 x IO<2> PFXJ/ml. Som indikatorceller anvendes MT4-celler. Tabell 6 viser at HIV-1 er spesielt ømfintlig overfor fotoinaktivering; allerede i løpet av 10 min. ble virustitere redusert med mer enn 600 ganger.

Eksempel 7

I forsøket på å inaktivere ikke-omhyllede vira under vanlige fysiologiske betingelser i nærvær av 80% plasma, kunne det ikke oppnås noe resultat. Adenovirus ble, som modell for et ikke-omhyllet virus, forinkubert i lengre tid (4°C, mørk) i nærvær av farvestoffet metylenblå (MB), 1 uM. Deretter fulgte en 30 minutters bestråling med halogenstråle (150 000 Lux). Infektiøsiteten til adenovirus var her uforandret.

Titere ble bestemt som TCID50 (beregningsmetode "Tissue Culture Infectious Dosis" ifølge Spearman og Kaeber). Viruset ble titrert på FL-celler (definert cellelinje for virusti-trering).

Ved anvendelse av toluidinblå under samme eksperimentelle betingelser kunne det likeledes ikke fastslås noen reduksjon i virustitere.

For å oppnå en inaktivering av adenovirus ble det innført et fryse/tørke-trinn (F/T) under dypfrysning ved -30°C i forsøksforløpet. Dermed spiller rekkefølgen av F/T og tilsetning av farvestoffet (1 uM MB) bare en underordnet rolle. Bestråling av prøvene foregår ved hjelp av halogen-stråler. Det ble målt 120 000 Lux.

Tab. 8: Fotosensibilisering av adenovirus på grunnlag av et innført F/T-trinn.

Gjennomføring av virustitreringen foregikk som beskrevet i tab. 7.

Eksempel 8

Det spesielle problemet ved anvendelse av høyere farvestoffkonsentrasjoner ligger i den umiddelbare virkningen av disse stoffene på plasmaproteinene. I et ytterligere forsøk ble deretter undersøkt forskjellige farvestoffkonsentrasjoner med henblikk på deres virkning overfor aktiviteten til koagula-sj onsfaktorene.

Humant plasma (2 ml aliquoter) ble omsatt med forskjellige mengder MB. Like deretter ble aktiviteten til koagulasjonsfaktorene V, VIII og IX målt. Som det fremgår fra tabell 7, ble de i alle tre tilfellene inhibert doseavhengig, de til faktorene VIII og V fra omtrnet 10 pM og til faktorene IX allerede fra 2,5 uM. Deretter virker ved høyere konsentrasjoner MB direkte på proteinene uten at lys må virke inn.

Eksempel 9

Det er ikke bare den tilsatte farvestoffkonsentrasjonen som har en innvirkning på aktiviteten til koagulasjonsfaktoren, men også bestrålingstiden. Denne tidsavhengigheten ble bestemt ved forskjellige metylenblå-konsentrasjoner.

Humant plasma (2 ml aliquoter) ble omsatt med forskjellige mengder MB og bestrålt i 1 til 4 timer (som beskrevet i eksempel 1). Kontrollprøvene ble ikke fotobehandlet. Som det fremgår av tabell 8, ble aktiviteten til de tre koagulasjonsfaktorene V, VIII og IX inhibert tids- og doseavhengig. Spesielt ved faktorene VIII og IX viser det seg at høyere MB-konsentrasjoner og lyseksponeringstiden fra 2 t bevirker en forhøyning av trombolytiske aktiviteter.

Tab. 10: Innvirkning av lys og MB på aktiviteten til koagulasjonsfaktorer: Tids- og doseavhengighet.

Eksempel 10

Ifølge en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse kan fotoinaktiveringen av vira forekomme umiddelbart i plasmaposer. Blod eller blodproduktene blir tilført farvestoff i nødvendige mengder, og posen kan deretter bli bestrålt med lys. På denne enkle måten er det mulig å behandle blodproduktene fra enkelte donorer.

I et forsøk ble tre prøver av et humant friskplasma tint opp og omsatt i plasmaposer med hver 1,5 x 106 PFU VSV. Til to prøver ble MB i konsentrasjoner på 1 hhv. 10 uM tilført. Fra det MB-frie plasmaet ble det tatt ut en prøve og oppbevart som positiv kontroll i mørket ved 4°C. Deretter ble de tre posene festet mellom to fleksiglassplater for å muliggjøre en så godt som mulig lik sjikt-tykkelse på ca. 2,5 cm. De ble deretter bestrålt fra en avstand på ca. 90 cm ved hjelp av en diaprojektor. Etter 4 timer ble det for bestemmelse av virustitere tatt ut prøver, og disse ble målt ved hjelp av plaque-analyse på FL-celler. Resultatene i tab. 9 viser at

1 >jm MB er tilstrekkelig for i plasmaposer gjennom fire timers bestråling, å redusere det infeksiøse titeret til VSV med mer enn tre tierpotenser. Også ved fravær av f arvestof-fet, førte bestrålingen til en reduksjon av virustitere, men bare med omtrent 50$.

De til virusaktivering tilsatte fenotiazinfarvestoffene kan forbli i de her anvendte konsentrasjonene på opptil 1 uM i blod eller blodproduktene uten at det skjer bireaksjoner. De lar seg også etterpå fjernes over dialyse, gelfiltrering eller adsorpsjon.

Av de nevnte metodene er spesielt det adsorberende av interesse, på grunn av at de er minst arbeidskrevende med hensyn på tid og teknikk, og de angjeldende plasmaprotein-oppløsningene blir ikke fortynnet.

Enkelte adsorberingsmidler er derimot åpenbart uegnede, som f.eks. de til Hiatt (Consepts in Radiation Cell Biology, s. 57-89, Academic Press, New York, 1972) nevnte ionebyttere, på grunn av at de ved siden av farvestoffet også binder plasmaproteinene meget sterkt, bl.a. koagulasjonsfaktorene.

Det kunne nå overraskende bli fastslått at MB og andre fenotiazinfarvestoffer blir bundet meget sterkt på forskjellige, kommersielt oppnåelige separasjonsgeler, derunder også slike som har enten ingen eller bare svak protein-binding. Slike absorberingsmidler er også egnede for den senere fjerningen av foto-oksideringsbilder. Av de utprøvde adsorpsjonsmidlene gjelder slike for adskillelse av MB og andre fenotiazinfarvestoffer.

I de fleste tilfellene var det ved en tilsetningskonsentra-sjon på 10 pM MB nødvendig med 2 g av gjeldende adsorpsjonsmiddel for å ekstrahere farvestoffet fullstendig, i hatch, fra en plasmaproteinoppløsning.

Som adsorpsjonstype har det vist seg å være spesielt egnet: 1. Silkageler, hhv. kieselgeler med porevidder, som er så små

(40 til ca. 100 A diameter), at plasmaproteiner ikke kan trenge inn i gelmatrisen, men derimot bare lavmolekylære farvestoffmolekyler som dermed, på grunn av ioniske, elek-trostatiske og hydrofobe vekselvirkninger, blir bundet.

Eksempler på kommersielt oppnåelige adsorbsjonsmidler av denne typen er Matrex silikagel (Amicon, Witten), Daltosil (Serva, Haidelbeg) og Kiesel-Gel (Merck,. Darmstadt). 2. Geler på grunnlag av polystyrol-divinylbenzen hhv. akrylester-polymerisat. De blir likeledes fremstilt med egnede porestørrelser.

Eksempler på kommersielt oppnåelige geler av denne typen, er Amberlite (bl.a. Rohm og Haas, Frankfurt) og Bio Beads (Bio Rad, Munchen). De tjener hovedsakelig til å fjerne fra vandige oppløsninger ikke-polare forbindelser, hhv. over-flateaktive stoffer, f.eks. detergenter. Enten er de ikke polare, eller de er svakt polare.

Eksempel 11

Friskt plasma ble omsatt med metylenblå (10 uM). 5 ml aliquoter ble omsatt med forskjellige mengder Saltosil (porevidde 75 A) hhv. Bio Beads SM 16 (porevidde 144 A) og blandet i 30 minutter. Deretter lar man gelen sedimentere. I plasma ble faktor VIII- hhv. faktor V-innholdet, ekstinksjo-nen ved 660 nm samt for enkelt prøver målt proteininnholdet. Det fremgår fra ekstinksjonsverdiene at det, bortsett fra farvestoffet, blir ekstrahert ytterligere forbindelser fra plasmaet. Det dreier seg ikke her om plasmaproteiner. Ekstinksjonsverdiene til plasmaet som ble behandlet med 100 til 250 mg adsorberingsmidler pr. 5 ml, dvs. med 2-5 vekt-#

{% v/v), skiller seg nesten ikke fra de som ble ekstrahert med 10% v/v adsorberingsmidler. Det fremgår derfor at det ved en MB-konsentrasjon på 10 jjM i begge tilfellene er tilstrekkelig med 2-556 v/v adsorberingsmiddel, for ved batch-vis behandling å fjerne farvestoffet fra plasmaet. Tilsvarende mindre absorberingsmidler er nødvendig når tilsetnings-konsentrasjonen av farvestoffet er lavere.

Eksempel 12

I et ytterligere forsøk ble det i steden for blodplasma tilsatt en 5 % human serumalbuminoppløsning ( 5% HSA). MB-konsentrasjonen var videre 10 uM. 5 ml aliquoter ble i batch ekstrahert, hver med 100 mg, dvs. 2% v/v av følgende adsorberingsmidler i forskjellige tidspunkter: Daltosil

(porevidde 75 A, Kieselgel (poregvidde 40 A) samt Bio Beads SM16 (porevidde 144 A).

Som Abb. 1 viser, går i alle tre tilfeller distinksjonen ved 660 nm tilbake i løpet av 20-30 minutter til en konstant verdi, dvs. denne tiden er tilstrekkelig for å fjerne foto-oksideringsmidler batch-vis opparbeiding fra plasmapro-teinoppløsningen. Som Abb. 1 også viser, er Bio Beads SM16 og kieselgel 40 i angitte tilfelle åpenbart et bedre adsorpsjonsmiddel enn Daltosil med 75 A porevidde.

Eksempel 13

Søylekromatografisk fjerning av MB fra plasmaprotein-oppløsninger.

Fra dette forsøket må det bestemmes om den adsorberende fjerningen av foto-oksideringsmidler også kan foregå kromatografisk. Bakgrunnen for dette er idéen om at virusinaktiveringen gjennomføres ved hjelp av farvestoff i kombinasjon med lys i en beholder, eksempelvis i en blodpose, og deretter overfører plasmaproteinoppløsningen over en liten derimellom anpasset separasjonskolonne som inneholder adsorpsjonsmidlet i en andre "beholder, f. eks. en annen blodpose. Dersom enheten førstepose -adsorpsjonskolonne -andrepose var prefabrikert, råder man altså over et lukket system, og man kunne på enkel måte under liten kontamina-sjonsrisiko fremstille virus-inaktiverte plasmaproteinpreparater, også slike som stammer fra enkelte donorer.

Her ble 250 ml 5% albuminoppløsning med forskjellig hurtighet ført gjennom en separasjonskolonne som inneholdt 5 ml kieselgel (porevidde 40 A). 10 ml-fraksjoner ble fanget opp, og ekstinksjonsverdiene målt ved 660 nm.

Som det fremgår fra tabell 10, er det mulig å lede totalvolu-mer av albuminoppløsningen med gjennomstrømningshastigheter på 5 hhv. 7,5 ml/min. gjennom kolonnen, uten at det var mulig å påvise gjenværende MB i gjennomløpsfraksjonene. Tiden det tar for å fjerne farvestoffet fra 250 ml oppløsning, ligger på høyst 30 til 35 minutter.

Resultatet av forsøket viser at den kromatografiske se-pareringen av foto-oksideringsmidlet ikke utgjør et problem, og for det andre blir det bevist at ovenfor beskrevne frem-stilling av virus-inaktiverte plasmaproteinpreparater fra enkeltdonorer er mulig.

Claims

1. Fremgangsmåte for inaktivering av vira i blod og blodprodukter der oppløsningen, hhv. suspensjonen som skal inaktiveres, blir tilsatt fenotiazinfarvestoffer og bestrålt med synlig lys i området ved absorpsjonsmaksimumet til farve-stof f ene, og deretter blir blodet hhv. blodproduktene eventuelt ledet over et adsorpsjonsmiddel for fjerning av farvestoffene, karakterisert ved at fenotiazinfarvestoffene tilsettes i en konsentrasjon på 0,1 til 2 uM, og at bestrålingen foretas umiddelbart i gjennomsiktige beholdere som blodposer, som anvendes for bloduttagning og oppbevaring.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fenotiazinfarvestoffene toluidinblå eller metylenblå anvendes.

3. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at oppløsningen hhv. suspensjonen som skal inaktiveres først blir dypfryst, og deretter videre opptint før bestrålingen.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at farvestoffet tilsettes før fryseforløpet.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at farvestoffet tilsettes etter opptiningen og før bestrålingen.

6. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 5, karakterisert ved at denne gjennomføres over to egnede beholdere for bloduttak som blodpose med en derimellom koblet separasjonskolonne, som inneholder adsorpsjonsmidlet for fenotiazinfarvestoffet.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det som adsorpsjonsmiddel tilsettes kieselgel eller slike som er basert på polystyrol-divinylbenzen- eller akrylester-polymerisater.