NO20141158L - Ny fremgangsmåte for forebygging eller behandling av M tuberkuloseinfeksjon - Google Patents

Ny fremgangsmåte for forebygging eller behandling av M tuberkuloseinfeksjon

Info

Publication number
NO20141158L
NO20141158L NO20141158A NO20141158A NO20141158L NO 20141158 L NO20141158 L NO 20141158L NO 20141158 A NO20141158 A NO 20141158A NO 20141158 A NO20141158 A NO 20141158A NO 20141158 L NO20141158 L NO 20141158L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
tuberculosis
mtb72f
polypeptide
seq
sequence
Prior art date
Application number
NO20141158A
Other languages
English (en)
Other versions
NO345071B1 (no
Inventor
Rhea Coler
Steven Reed
Yves Lobet
Original Assignee
Glaxosmithkline Biolog Sa
Infectious Disease Res Inst Idri
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Publication of NO20141158L publication Critical patent/NO20141158L/no
Application filed by Glaxosmithkline Biolog Sa, Infectious Disease Res Inst Idri filed Critical Glaxosmithkline Biolog Sa
Publication of NO345071B1 publication Critical patent/NO345071B1/no

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4409—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof only substituted in position 4, e.g. isoniazid, iproniazid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response

Abstract

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot fremgangsmåter for forhindring av reaktivering av aktive og latente M. tuberculosis-infeksjoner ved administrering av et farmasøytisk preparat omfattende en nukleinsyre som koder for et Mtb72ffusjonsprotein, eller et Mtb72f-fusjonsprotein eller et immunogent fragment derav, for eksempel sammen med en adjuvans. Mtb72f-nukleinsyren eller -fusjonsproteinet kan administreres med ett eller flere kjemoterapeutiske midler som er effektive overfor en M. tuberculosis-infeksjon. Fremgangsmåtene tilveiebringer også forkortning av tidsforløpet for et kjemoterapeutisk regime overfor en M. tuberculosis-infeksjon.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåter for forhindring eller behandling av reaktivering av en M. tuberculosis-infeksjon hos et pattedyr, samt fremgangsmåter for forkorting av tidsforløpet for kjemoterapi mot en M. tuberculosis-infeksjon.
Tuberkulose er en kronisk infeksiøs sykdom som forårsakes av infeksjon med M. tuberculosis og andre Mycobacterium-arter. Det er en betydelig sykdom i utviklingsland, samt et økende problem i utviklede områder av verden, med ca. 8 millioner nye tilfeller og 3 millioner dødsfall hvert år. Skjønt infeksjonen kan være asymptomatisk i et lengre tidsrom, viser sykdommen seg som oftest som en akutt inflammasjon i lungene, som resulterer i feber og en uproduktiv hoste. Hvis den ikke behandles, er resultatet typisk alvorlige komplikasjoner og død.
Skjønt tuberkulose vanligvis kan bekjempes ved anvendelse av utstrakt antibiotikabehandling, er slik behandling ikke tilstrekkelig til å forhindre utbredelse av sykdommen. Infiserte individer kan være asymptomatiske, men overføre smitte, i en viss tid. Skjønt dessuten forenlighet med behandlingsregimet er avgjørende, er pasientens oppførsel vanskelig å overvåke. Noen pasienter fullfører ikke behandlingen, noe som kan føre til ineffektiv behandling og utvikling av medikamentresistens. Selv om en fullstendig behandlingssekvens fullføres, blir ikke infeksjon med M. tuberculosis utryddet fra det infiserte individ, men forblir som en latent infeksjon som kan reaktiveres.
For bekjempelse av spredning av tuberkulose er effektiv vaksinering og nøyaktig tidlig diagnostisering av sykdommen av største betydning. Fortiden er vaksinasjon med levende bakterier den mest effektive metode for induksjon av beskyttende immunitet. Den mest vanlige mycobakterie som anvendes for dette formål, er Bacullus Calmette Guerin (BCG), en avirulent stamme av M. bovis. Imidlertid er sikkerheten og effektiviteten av BCG en kilde til strid, og noen land, så som USA, vaksinerer ikke allmennheten med dette middel.
Diagnostisering av tuberkulose oppnås vanligvis ved anvendelse av en hudtest, som innbefatter intradermal eksponering for tuberkulin-PPD (protein-renset derivat). Antigenspesifikke T-celle-responser resulterer i målbar herdning på injeksjonsstedet i løpet av 48-72 timer etter injeksjon, som tyder på eksponering for mycobakterieantigener. Sensitivitet og spesifisitet har imidlertid vært et problem med denne test, og individer som er vaksinert med BCG, kan ikke skjelnes fra infiserte individer.
Skjønt makrofager er blitt vist å virke som hovedeffektorene for Mycobacterium-immunitet, er T-celler de viktigste induktorer for en slik immunitet. T-cellers essensielle rolle ved beskyttelse mot Mycobacterium-infeksjon er illustrert ved den hyppige forekomst av Mycobacterium-infeksjon hos AIDS-pasienter, på grunn av uttømming av CD4<+->T-celler knyttet til infeksjon med humant immundefektvirus (HIV). Mycobacterium-reaktive CD4<+->T-celler er blitt vist å være potente produsenter av y-interferon (IFN-y), som i sin tur er vist å trigge de anti-mycobakterielle virkninger av makrofager hos mus. Skjønt IFN^'s rolle hos mennesker er mindre klar, har studier vist at 1,25-dihydroksy-vitamin D3, enten alene eller i kombinasjon med IFN-y eller tumornekrosefaktor-alfa, aktiverer humane makrofager til å hemme M. tuberculosis-infeksjon. Det er videre kjent at IFN-y stimulerer humane makrofager til å danne 1,25-dihydroksy-vitamin D3. Likeledes er interleukin-12 (IL-12) vist å spille en rolle ved stimulering av resistens overfor M. tuberculosis-infeksjon. For en oversikt over immunologien ved M. tuberculosis-infeksjon, se Chan & Kaufmann, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control (Bloom red., 1994), Tuberculosis (2. utg. Rom og Garay, red., 2003), og Harrison' s Principles of Internal Medicine, kapittel 150, s. 953-966 (16. utg., Braunwald et al., red., 2005).
Det er et behov for effektive behandlingsstrategier for forhindring av reaktivering av Mycobacterium tuberculosis-infeksjoner, både for aktive og latente infeksjoner. Denne oppfinnelse oppfyller dette og andre behov.
Beskrivelse av de oppførte sekvenser:
SEKV ID Nr: 1: Mtb72f med N-terminal 6 His-merkesubstans (DNA)
SEKV ID Nr: 2: Mtb72f med N-terminal 6 His-merksubstans (protein)
SEKV ID Nr: 3: M72 (variant av Mtb72f) med N-terminalt 2 His-innskudd (DNA) SEKV ID Nr: 4: M72 (variant av Mtb72f) med N-terminalt 2 His-innskudd (protein) SEKV ID Nr: 5: Mtb72f uten N-terminalt 6 His-innskudd (DNA)
SEKV ID Nr: 6: Mtb72f uten N-terminalt 6 His-innskudd (protein)
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer farmasøytiske preparater omfattende et Mtb72f-fusjonsprotein eller et immunogent fragment derav fra en Mycobacterium-art i tuberkulosekomplekset, for eksempel sammen med én eller flere adjuvanser, innbefattende AS01B og AS02A.
Foreliggende oppfinnelse er delvis basert på oppfinnernes oppdagelse av at administrering av et Mtb72f-fusjonsprotein eller immunogent fragment derav, f.eks. sammen med én eller flere adjuvanser eller en nukleinsyre som koder for et Mtb72f-fusjonsprotein eller immunogent fragment derav, kan forhindre eller behandle reaktivering av en aktiv eller inaktiv M. tuberculosis-infeksjon. Ved en foretrukket utførelsesform administreres et Mtb72f-fusjonsprotein eller nukleinsyre med ett eller flere kjemoterapeutiske midler som er effektive overfor en M. tuberculosis-infeksjon.
Ved ett aspekt anvendes preparatene ved fremgangsmåter for forhindring eller behandling av tuberkulose-reaktivering hos et individ, hvilke fremgangsmåter omfatter det trinn at det til et pattedyr som allerede er infisert med Mycobacterium tuberculosis, administreres en immunologisk effektiv mengde av et farmasøytisk preparat omfattende et Mtb72f-fusjonsprotein eller et immunogent fragment derav fra en Mycobacterium-art i tuberkulosekomplekset, og en adjuvans, hvor Mtb72f-fusjonsproteinet induserer en immunrespons overfor M. tuberculosis, hvorved tuberkulose-reaktivering forhindres eller behandles.
Ved et annet aspekt anvendes preparatene ved fremgangsmåter for forhindring av tuberkulose-reaktivering hos et individ, hvilken fremgangsmåte omfatter det trinn at det til et pattedyr som allerede er infisert med Mycobacterium tuberculosis, administreres en immunologisk effektiv mengde av et farmasøytisk preparat omfattende en nukleinsyre som koder for et Mtb72f-fusjonsprotein eller et immunogent fragment derav fra en Mycobacterium-art i tuberkulosekomplekset, hvor det uttrykte Mtb72f-fusjonsprotein induserer en immunrespons overfor M. tuberculosis, hvorved tuberkulose-reaktivering forhindres eller behandles.
Ved et annet aspekt anvendes preparatene ved fremgangsmåter for redusering av tidsforløpet for kjemoterapi overforen M. tuberculosis-infeksjon, hvilken fremgangsmåte omfatter at det til et pattedyr som allerede er infisert med Mycobacterium tuberculosis, administreres ett eller flere kjemoterapeutiske midler som er effektive overfor en M. tuberculosis-infeksjon, samt en immunologisk effektiv mengde av et farmasøytisk preparat omfattende et Mtb72f-fusjonsprotein eller et immunogent fragment derav fra en Mycobacterium-art i tuberkulose-komplekset, og en adjuvans, hvor Mtb72f-fusjonsproteinet eller det immunogene fragment derav induserer en immunrespons mot M. tuberculosis, hvorved det muliggjøres reduksjon av tiden for kjemoterapi mot en M. tuberculosis-infeksjon. Ved at tidsforløpet for kjemoterapi mot en M. tuberculosis-infeksjon forkortes, er de foreliggende fremgangsmåter også effektive til forbedring av forenligheten hos et individ som behandles med henblikk på en M. tuberculosis-infeksjon, ved fullføring av en fullstendig behandling.
Det vises nå til tegningene.
Fig. 1 viser en grafisk representasjon av M. tuberculosis-reaktiverings-modellen i Swiss Webster-mus (SWR/J). Figuren viser tidspunkter for infeksjon, kjemoterapibehandling (50 mg rifampin/85 mg isoniazid pr. liter drikkevann), immuniseringer og nummerering av bakteriemengde/kolonidannende enheter
(CFU).
Fig. 2 viser lgG1- og lgG2-antistoff-mmunresponser hos M. tuberculosis-infiserte SWR/J-mus behandlet med kjemoterapi og deretter immunisert med Mtb72f. Musene var ubehandlede, behandlet med kjemoterapi (50 mg rifampin/85 mg isoniazid pr. liter drikkevann) eller behandlet med kjemoterapi og immunisert tre ganger intramuskulært med 8ug pr. dose av Mtb72f formulert uten adjuvans. Ti dager etter den siste immunisering ble blod tappet fra musene og seraene testet med henblikk på anti-Mtb72f-antistoffrespons både med henblikk på lgG1- (røde) og lgG2a- (svarte) isotoper ved hjelp av ELISA. Fig. 3 viser lgG1- og lgG2a-antistoffresponser immunresponser hos M. tuberculosis-infiserte SWR/J-mus behandlet med kjemoterapi og deretter immunisert med Mtb72f. Musene var ubehandlede, behandlet med kjemoterapi (50 mg rifampin/85 mg isoniazid pr. liter drikkevann) eller behandlet med kjemoterapi og immunisert tre ganger intramuskulært med 8 u.g pr. dose av Mtb72f formulert med adjuvansen AS01B. Ti dager etter den siste immunisering ble blod tappet fra musene og seraene testet med henblikk på anti-Mtb72f-antistoffrespons både med henblikk på lgG1- (røde) og lgG2a- (svarte) isotoper ved hjelp av
ELISA.
Fig. 4 viser interferon-gamma-(IFN-y)-responser hos M. tuberculosis-infiserte SWR/J-mus behandlet med kjemoterapi og deretter immunisert med
Mtb72f. Miltceller ble tatt fra musene på varierende tidspunkter og stimulert in vitro i tre dager med 10 u.g/ml av enten rMtb72f eller komponentene (Mtb32cog Mtb39) som angitt. Som kontroller ble splenocyttkulturer også stimulert med enten PPD (3 ug/ml), BCG-lysat (10 ug/ml), conA (3 ug/ml) eller medium alene. IFN-y-produksjon ble deretter målt ved hjelp av ELISA. Fig. 5 viser IFN^y-responser hos M. tuberculosis-infiserte SWR/J-mus behandlet med kjemoterapi og deretter immunisert med Mtb72f. Miltceller ble tatt fra musene på forskjellige tidspunkter og stimulert in vitro i tre dager med 10ug/ml av enten rMtb72f eller komponentene (Mtb32cog Mtb39) som angitt. Som kontroller ble splenocyttkulturer også stimulert med enten PPD (3ug/ml), BCG-lysat (10 ug/ml), conA (3 ug/ml) eller medium alene. IFN^y-produksjon ble deretter målt ved hjelp av ELISA. Fig. 6 viser CD4<+->T-celle- og IFN^y-cytokin-responser hos M. tuberculosis-infiserte SWR/J-mus behandlet med kjemoterapi og deretter immunisert med Mtb72f. Miltceller ble tatt fra mus på forskjellige tidspunkter og stimulert in vitro natten over med 10ug/ml av rMtb72f. Cellene ble deretter merket med hensyn til CD4og IFN^y. Som kontroll ble splenocyttkulturer også stimulert med medium alene. CD4<+->T-celle-spesifikk IFN^-produksjon ble deretter målt ved intracellulær cytokinmerking (ICS). Fig. 7 viser en tabellarisk oppsummering av verdiene for CD4<+->og CD8<+->T-celle-spesifikk IFN^+-produksjon på dag 120 etter Mtb-infisering. Miltceller ble tatt fra grupper av mus som var ubehandlet, behandlet med 30, 60 eller 90 dagers kombinasjons-kjemoterapi eller behandlet med kombinasjons-kjemoterapi som hjelpestoff for Mtb72f-vaksinen. Splenocytter ble stimulert in vitro natten over med 10ug/ml rMtb72f. Cellene ble deretter merket med henblikk på CD4, CD8 eller IFN^y. Som kontroll ble splenocyttkulturer også stimulert med medium alene. CD4<+->og CD8<+->T-cellespesifikk IFNy"-Produksj°n D|e deretter målt ved hjelp av intracellulær cytokinmerking. Fig. 8 viser overlevelse av M. tuberculosis-infiserte SWR/J-mus behandlet med kjemoterapi og deretter immunisert med Mtb72f. Musene ble infisert via aerosol med 50-100 CFU av MtbH37Rv, og kjemoterapi (50 mg rifampin/85 mg
isoniazid pr. liter drikkevann) ble startet hos et subsett av mus tretti dager senere. Kjemoterapi ble fortsatt i 60 dager. Halvdelen av musene som fikk kjemoterapi, ble immunisert tre ganger intramuskulært med 8ug pr. dose av Mtb72f formulert med adjuvansen AS01B.
Fig. 9 viser overlevelse av M. tuberculosis-infiserte SWR/J-mus behandlet med kjemoterapi og deretter immunisert med Mtb72f. Musene ble infisert via aerosol med 50-100 CFU av MtbH37Rv, og kjemoterapi (50 mg rifampin/85 mg isoniazid pr. liter drikkevann) ble startet hos et subsett av mus tretti dager senere. Kjemoterapi ble fortsatt i 30, 60 eller 90 dager i separate subsett av mus. Halvdelen av musene som fikk kjemoterapi, ble immunisert tre ganger intramuskulært med 8 ug pr. dose av Mtb72f formulert med adjuvansen AS01B.
Foreliggende oppfinnelse angår preparater omfattende Mtb72f-nukleinsyrer eller -fusjonsproteiner og en adjuvans egnet for behandling, forhindring eller forsinking av reaktivering av en aktiv eller inaktiv (dvs. latent) Mycobacterium-infeksjon, samt fremgangsmåter for anvendelse av dem. Mer spesifikt omfatter preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse Mtb72f-fusjonspolypeptider eller immunogene fragmenter derav eller nukleinsyrer som koder for Mtb72f-fusjonspolypeptider eller immunogene fragmenter derav som har komponenter fra en Mycobacterium-art i tuberkulosekomplekset, f.eks. en art så som M. tuberculosis, M. bovis eller M. africanum, eller en Mycobacterium-art som er miljøbestemt eller opportunistisk og som forårsaker opportunistiske infeksjoner så som lungeinfeksjoner hos immunkompromitterte verter (f.eks. pasienter med AIDS), f.eks. BCG, M. avium, M. intracellulare, M. celatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M. simiae, M. vaccae, M. fortuitum og M. scrofulaceum (se f.eks. Harrison' s Principles oflnternal Medicine, kapittel 150, s. 953-966 (16. utg., Braunwald et al., red, 2005). Oppfinnerne av foreliggende patentsøknad oppdaget overraskende nok at preparater omfattende Mtb72f-fusjonspolypeptider eller nukleinsyrer som koder for Mtb72f-fusjonspolypeptider, eller immunogene fragmenter derav, er anvendelige ved behandling, forhindring eller forsinkelse av reaktivering av en M. tuberculosis-infeksjon. Ved en foretrukket utførelsesform administreres et Mtb72f-fusjonspolypeptid eller -nukleinsyre med ett eller flere kjemoterapeutiske midler. Disse preparater, polypeptider og nukleinsyrene som koder for dem, er derfor anvendelige for fremkalling av en immunrespons hos pattedyr som er beskyttende overfor reaktivering av sykdomssymptomer.
Mtb72f-nukleinsyrene og -fusjonspolypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan videre omfatte andre komponenter som er utformet for å forøke deres antigenisitet eller for å forbedre disse antigener i andre henseender. For eksempel kan forbedret isolasjon av fusjonspolypeptid-antigenene gjøres lettere ved tilsetting av et stykke histidinrester mot én ende av antigenet. Preparatene, polypeptidene og nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen kan omfatte ytterligere kopier av antigener, eller ytterligere heterologe polypeptider fra Mycobacterium sp., så som MTB8.4-antigen, MTB9.8-antigen, MTB9.9-antigen, MTB40-antigen, MTB41-antigen, ESAT-6-antigen, MTB85-kompleks-antigen, a-krystallinsk antigen eller NS1-antigen.
Alternativt eller i tillegg kan preparatene, polypeptidene og nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen omfatte ytterligere kopier av andre antigener fra Mycobacterium sp., så som AG85B eller MTCC#2. Preparatene, polypeptidene og nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen kan også omfatte ytterligere polypeptider fra andre kilder. For eksempel kan preparatene og fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen innbefatte polypeptider eller nukleinsyrer som koder for polypeptider, hvor polypeptidet forsterker ekspresjonen av antigenet, f.eks. NS1, et influensavirusprotein (se f.eks. WO99/40188 og WO93/04175). Nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen kan konstrueres basert på kodonpreferanse i en ønsket art, f.eks. mennesker.
Mtb72f-fusjonsproteinpreparatene omfatter vanligvis én eller flere adjuvanser, f.eks. AS01B (monofosforyl-lipid A (MPL) og QS21 i en liposomformulering; se US-patentpublikasjon nr. 2003/0143240); AS02A (3D-MPL og QS21 og en olje-i-vann-emulsjon; se Bojang et al., Lancet (2001) 358:1927); ENHANZYN (Detox); 3D-MPL; saponiner innbefattende Quil A og dens komponenter, f.eks. QS21 og saponinmimetika; CWS; TDM; AGP; immunstimulatoriske oligonukleotider, f.eks. CPG; Leif; og derivater derav. Ved en foretrukket utførelsesform administreres et Mtb72f-fusjonspolypeptid med én eller flere adjuvanser valgt fra gruppen bestående av 3D-MPL og QS21 i en liposomformulering, f.eks. AS01B og MPL og QS21 og en olje-i-vann-emulsjon (f.eks. AS02A). Adjuvansene AS01B og AS02A er ytterligere beskrevet i Pichyangkul et al., Vaccine (2004) 22:3831-40.
Ved avgivelse av Mtb72f-antigenet som nukleinsyre kan det for eksempel avgis i en virusvektor (dvs. en adnovirusvektor) eller i en mutant bakterieverstcelle (dvs. en mutant, avirulent Mycobacterium-, Lactobacillus- eller Bacullis-vertscelle innbefattende Bacillus Calmette-Guerin (BCG) og Lactococcus lactis).
Ved ett aspekt anvendes preparatene ved fremgangsmåter for forhindring eller behandling av tuberkulose-reaktivering i et individ, hvilken fremgangsmåte omfatter det trinn at det til et pattedyr som allerede er infisert med Mycobacterium tuberculosis, administreres en immunologisk effektiv mengde av et farmasøytisk preparat omfattende et Mtb72f-fusjonsprotein eller et immunogent fragment derav fra en Mycobacterium-art i tuberculosis-komplekset, og en adjuvans, hvor Mtb72f-fusjonsproteinet induserer en immunrespons overfor M. tuberculosis, hvorved tuberkulose-reaktivering forhindres. Ved utøvelse av fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse kan reaktivering av en M. tuberculosis-infeksjon forsinkes (for eksempel med et tidsrom på måneder, år eller uendelig).
Ved ett aspekt anvendes preparatene ved fremgangsmåter for forhindring eller behandling av tuberkulose-reaktivering hos et individ, hvilken fremgangsmåte omfatter det trinn at det til et pattedyr som allerede er infisert med Mycobacterium tuberculosis, administreres en immunologisk effektiv mengde av et farmasøytisk preparat omfattende en nukleinsyre som koder for et Mtb72f-fusjonsprotein eller et immunogent fragment derav fra en Mycobacterium-art i tuberkulosekomplekset, hvor det uttrykte Mtb72f-fusjonsprotein induserer en immunrespons overfor M. tuberculosis, hvorved tuberkulose-reaktivering forhindres.
Ved én utførelsesform administreres Mtb72f-nukleinsyren eller -fusjonsproteinet til et individ med en aktiv M. tuberculosis-infeksjon. Ved én utførelsesform administreres Mtb72f-nukleinsyren eller -fusjonsproteinet til et individ med en inaktiv eller latent M. tuberculosis-infeksjon. Ved én utførelsesform administreres Mtb72f-nukleinsyren eller -fusjonsproteinet til et individ som er infisert med en multimedikament-resistent stamme av M. tuberculosis. Ved én utførelsesform administreres Mtb72f-nukleinsyren eller -fusjonsproteinet til et individ som på forhånd er blitt immunisert med Bacillus Calmette-Guerin (BCG). Ved noen utførelsesformer administreres Mtb72f-nukleinsyren eller -fusjonsproteinet med ett eller flere kjemoterapeutiske midler som er effektive overfor en M. tuberculosis-infeksjon. Eksempler på slike kjemoterapeutiske midler innbefatter, men er ikke begrenset til, amikacin, aminosalisylsyre, capreomycin, cykloserin, etambutol, etionamid, isoniazid, kanamycin, pyrazinamid, rifamyciner (dvs. rifampin, rifapentin og rifabutin), streptomycin, ofloxacin, ciprofloxacin, claritromycin, azitromycin og fluorkinoloner. Slik kjemoterapi bestemmes ved bedømmelsen hos den behandlende lege under anvendelse av foretrukne medikamentkombinasjoner. Kjemoterapeutiske "førstelinje"-midler som anvendes til behandling av en M. tuberculosis-infeksjon som ikke er medikamentresistent, innbefatter isoniazid, rifampin, etambutol, streptomycin og pyrazinamid. Kjemoterapeutiske "andrelinje"-midler som anvendes til behandling av M. tuberculosis-infeksjon som har vist medikament-resistens overfor ett eller flere "førstelinje"-medikamenter, innbefatter ofloxacin, ciprofloxacin, etionamid, aminosalisylsyre, cykloserin, amikacin, kanamycin og capreomycin.
Mtb72f-nukleinsyren eller -fusjonsproteinet kan administreres før, samtidig med eller etter administrering av det ene eller flere kjemoterapeutiske midler som er effektive mot en M. tuberculosis-infeksjon. Ved én utførelsesform administreres Mtb72f-nukleinsyren eller -fusjonsproteinet ca. 2 uker etter starting av administrering av ett eller flere kjemoterapeutiske midler. Det ene eller flere kjemoterapeutiske midler administreres vanligvis i løpet av et tidsrom, for eksempel i ca. 1, 2, 3 eller 4 uker, 2, 3, 4, 5, 6 eller 8 måneder, 1 år eller lengre.
Ved noen utførelsesformer forsterkes virkningen av en Mtb72f-nukleinsyre eller -fusjonsprotein ved administrering med Bacillus Calmette-Guerin (BCG).
Ved en del utførelsesformer blir en priming eller en første administrering av en Mtb72f-nukleinsyre eller -fusjonspolypeptid fulgt av én eller flere "forsterknings-" eller påfølgende administreringer av en Mtb72f-nukleinsyre eller -fusjonspolypeptid ("primings- og forsterknings"- metode). For eksempel blir en første administrering med en Mtb72f-nukleinsyre eller -fusjonspolypeptid fulgt av én eller flere påfølgende administreringer av en Mtb72f-nukleinsyre eller -fusjonsprotein. Ved én utførelsesform blir en første administrering med en Mtb72f-nukleinsyre eller fusjonspolypeptid fulgt av én eller flere påfølgende administreringer av et Mtb72f-fusjonspolypeptid. Ved én utførelsesform blir en første administrering med en Mtb72f-nukleinsyre eller -fusjonspolypeptid fulgt av én eller flere påfølgende administreringer av en Mtb72f-nukleinsyre. Vanligvis blir den første eller "primings-" administrering og den andre eller "forsterkende" administrering gitt med ca. 2-12 ukers mellomrom, eller opp til 4-6 måneders mellomrom. Deretter gis "forsterknings"-administreringer med ca. 6 måneders mellomrom, eller med så mye som 1, 2, 3, 4 eller 5 års mellomrom. Konvensjonell forsterkningsbehandling (f.eks. en proteinprimings-administrering fulgt av en proteinforsterkningsadministrering) er også anvendelig ved forhindring eller behandling av M. tuberculosis-reaktivering.
Ved et annet aspekt anvendes preparatene ved metoder for redusering eller forkortning av tidsforløpet for kjemoterapi mot en M. tuberculosis-infeksjon, hvilken metode omfatter at det til et pattedyr som allerede er infisiert med Mycobacterium tuberculosis, administreres ett eller flere kjemoterapeutiske midler som er effektive mot en M. tuberculosis-infeksjon, og en immunologisk effektiv mengde av et farmasøytisk preparat omfattende et Mtb72f-fusjonspolypeptid eller et immunogent fragment derav fra en Mycobacterium-art i tuberkulose-komplekset og en adjuvans, hvor Mtb72f-fusjonspolypeptidet induserer en immunrespons mot M. tuberculosis, hvorved det muliggjøres reduksjon eller forkortning av tidsforløpet for kjemoterapi overfor en M. tuberculosis-infeksjon. Vanligvis vil administrering av en Mtb72f-nukleinsyre eller -fusjonspolypeptid muliggjøre effektiv kjemoterapeutisk behandling overforen M. tuberculosis-infeksjon innenfor6 måneder, 5 måneder, 4 måneder, 3 måneder eller mindre.
Mtb72f-preparatene administreres vanligvis til mennesker, men er effektive for andre pattedyr innbefattende husdyr (dvs. hunder, katter, kaniner, rotter, mus, marsvin, hamstere, chinchillaer) og gårdsdyr (dvs. kuer, griser, sauer, geiter, hester).
I sin mest generelle henseende er et Mtb72f-fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen et protein omfattende minst et immunogent fragment av hvert av de 3 antigener Ra12-TbH9-Ra35.
Ved nomenklaturen for søknaden angir Ra35 den N-terminale ende av Mtb32A (Ra35FL), omfattende minst omtrent de første 205 aminosyrer av Mtb32A fra M. tuberculosis, hvis nukleotid- og aminosyresekvens er beskrevet på fig. 4 i US-patentsøknad nr. 09/597 796 eller den tilsvarende region fra en annen Mycobacterium-art. Mest typisk angir Ra35 delen av SEKV ID Nr: 2 beskrevet i foreliggende patentsøknad svarende til restene 535-729. Alternativt angir den en variant av Ra35 hvor aminosyren Ser svarende til 710 i SEKV ID Nr: 2 er erstattet med Ala.
Ra12 angir den C-terminale ende av Mtb32A (Ra35FL), omfattende minst ca. de siste 132 aminosyrer fra Mtb32A fra M. tuberculosis, hvis sekvens er beskrevet som SEKV ID Nr: 4 (DNA) og SEKV ID Nr: 66 (forutsett aminosyresekvens) i US-patentsøknad nr. 09/072 967 eller den tilsvarende region fra en annen Mycobacterium-art. Mest typisk angir Ra12 delen av SEKV ID Nr: 2 beskrevet i foreliggende patentsøknad svarende til restene 8-139.
Mtb39 (TbH9) angir en sekvens som hovedsakelig er den som er beskrevet som SEKV ID Nr: 106 (cDNA i hel lengde) og SEKV ID Nr: 107 (protein i hel lengde) i US-patentsøknader nr. 08/658 800, nr. 08/659 683, nr. 08/818 112 og nr. 08/818 111 og i patentsøknadene WO97/09428 pg WP97/09429. Sekvensen er også beskrevet som SEKV ID Nr: 33 (DNA) og SEKV ID Nr: 91 (aminosyre) i US-patentsøknad nr. 09/056 559. Mest typisk angir TbH9 delen av SEKV ID Nr: 2 beskrevet i foreliggende patentsøknad svarende til restene 143-532.
Det følgende viser sekvenser for en del individuelle antigener anvendt i preparatene og fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen: Mtb32A (TbRa35FL eller Ra35FL), hvis sekvens er beskrevet som SEKV ID Nr: 17 (cDNA) og SEKV ID Nr:79 (protein) i US-patentsøknadene nr. 08/523 436, 08/523 435, nr. 08/658 800, nr. 08/659 683, nr. 08/818 112, nr. 09/056 556 og nr. 08/818 111, og i patentsøknadene W097/09428 og W097/09429; se også Skeiky et al., Infection and Immunity 67:3998-4007 (1999).
Det følgende viser sekvenser for en del fusjonsproteiner ifølge oppfinnelsen: TbH9-Ra35 (Mtb59F), hvis sekvens er beskrevet som SEKV ID Nr: 23 (cDNA) og SEKV ID Nr: 24 (protein) i US-patentsøknad nr. 09/287 849 og i PCT/US99/07717-patentsøknaden;
Ra12-TbH9-Ra35 (Mtb72f), hvis sekvens er beskrevet som SEKV ID Nr: 1 eller SEKV ID Nr: 5 (DNA) og SEKV ID Nr: 2 eller SEKV ID Nr: 6 (protein) i foreliggende oppfinnelse, samt i US-patentsøknad nr. 09/223 040, og i PCT/US99/07717. Sekvensene ifølge SEKV ID Nr: 1 og SEKV ID Nr: 2 innbefatter en His-merkesubstans med 6 His-rester.
M72, som er en mutant av Mtb72f hvor serinresten ved aminosyre svarende til stilling 710 i SEKV ID Nr: 2 er forandret til Ala (samt 4 His-rester er fjernet fra His-merkesubstansen i den N-terminale ende), hvis sekvens er beskrevet som SEKV ID Nr: 3 (DNA) og SEKV ID Nr: 4 (protein) i foreliggende patentsøknad. En variant av disse sekvenser hvor proteinet har en His-merkesubstans med 6 His-rester, er beskrevet i US-patentsøknad nr. 09/597 796 og i PCT/US01/19959. På bakgrunn av erstatningen av Ser710 med Ala, antas M72 å være mer bestandig overfor autolyse enn Mtb72f.
Det følgende tilveiebringer sekvenser av en del ytterligere antigener som anvendes i preparatene og fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen: Mtb8.4 (DPV), hvis sekvens er beskrevet som SEKV ID Nr: 101 (cDNA) og SEKV ID Nr: 102 (protein) i US-patentsøknadene nr. 08/658 800, nr. 08/659 683, nr. 08/818 112 og nr. 08/818 111, og i patentsøknadene W097/09428 og W097/09429;
Mtb9.8 (MSL), hvis sekvens er beskrevet som SEKV ID Nr: 12 (DNA), SEKV ID Nr: 109 (forutsett aminosyresekvens) og SEKV ID Nr: 110 til 124 (peptider) i US-patentsøknadene nr. 08/859 381, nr. 08/858 998, nr. 09/073 009 og nr. 09/073 010, og i patentsøknadene PCT/US98/10407 og PCT/US98/10514;
Mtb9.9A (MTI, også kjent som MTI-A), hvis sekvens er beskrevet som SEKV ID Nr: 3 og SEKV ID Nr: 4 (DNA) og SEKV ID Nr: 29 og SEKV ID Nr: 51 til 66 (ORF-peptid for MTI) i US-patentsøknadene nr. 08/859 381, nr. 08/858 998, nr. 09/073 009 og nr. 09/073 010, og i patentsøknadene PCT/US98/10407 og PCT/US98/10514. Det finnes også to andre MTI-varianter kalt MTI-B og MTI-C;
Mtb40 (HTCC#1), hvis sekvens er beskrevet som SEKV ID Nr: 137 (cDNA) og 138 (antatt aminosyresekvens) i US-patentsøknadene nr. 09/073 009 og nr. 09/073 010 og i patentsøknadene PCT/US98/10407 og PCT/US98/10514;
Mtb41 (MTCC#2), hvis sekvens er beskrevet som SEKV ID Nr: 140 (cDNA) og SEKV ID Nr:142 (antatt aminosyresekvens) i US-patentsøknadene nr.
09/073 009 og nr. 09/073 010 og i patentsøknadene PCT/US98/10407 og PCT/US98/10514;
ESAT-6, hvis sekvens er beskrevet som SEKV ID Nr: 103 (DNA) og SEKV ID Nr: 104 (antatt aminosyresekvens) i US-patentsøknad nr. 09/072 967. Sekvensen for ESAT-6 er også beskrevet i US-patent nr. 5 955 077;
a-krystallinsk antigen, hvis sekvens er beskrevet i Verbon et al., J. Bact. 174:1352-1359 (1992);
85-kompleksantigen, hvis sekvens er beskrevet i Content et al., Infect. & Immunol. 59:3205-3212 (1991).
Hver av de ovennevnte sekvenser er også beskrevet i Cole et al. Nature 393:537 (1998) og kan finnes på f.eks. http://www.sanger.ac.uk og http7www.pasteur.fr/mycdb/.
Ovennevnte sekvenser er beskrevet i US-patentsøknader nr. 08/523 435, 08/523 436, 08/658 800, 08/659 683, 08/818 111, 08/818 112, 08/942 341, 08/942 578, 08/858 998, 08/859 381, 09/056 556, 09/072 596, 09/072 967, 09/073 009, 09/073 010, 09/223 040 og 09/287 849, og i PCT-patentsøknader PCT/US98/10407, PCT/US98/10514, PCT/US99/03265, PCT/US99/03268, PCT/US99/07717, W097/09428 og W097/09429, W098/16645, W098/16646, som alle er medtatt her i dokumentet som referanse.
Antigenene beskrevet her i dokumentet innbefatter polymorfe varianter og konservativt modifiserte variasjoner, samt inter-stamme- og interarts-Mycobacterium-homologer. I tillegg innbefatter antigenene beskrevet her i dokumentet subsekvenser eller avkortede sekvenser. Fusjonsproteinene kan også inneholde ytterligere polypeptider, eventuelt heterologe peptider fra Mycobacterium eller andre kilder. Disse antigener kan modifiseres for eksempel ved tilføyning av linker-peptidsekvenser som beskrevet nedenfor. Disse linkerpeptider kan innsettes mellom én eller flere komponenter som utgjør hvert av fusjonsproteinene.
Betegnelsen "tuberkulose-reaktivering" angir det senere utslag av sykdomssymptomer hos et individ som tester positivt i en tuberkulintest, men som ikke har tydelige sykdomssymptomer. Individet infiseres med M. tuberculosis og kan ha, eller har ikke, tidligere utslag av aktive sykdomssymptomer som er blitt behandlet tilstrekkelig til å bringe tuberkulosen inn i en inaktiv eller latent tilstand. Metoder for forebygging eller behandling av tuberkulose-reaktivering kan imidlertid innledes hos et individ som viser aktive symptomer på sykdom.
"Primær tuberkulose" angir klinisk sykdom (utslag av sykdomssymptomer) direkte etter infeksjon med M. tuberculosis. Se Harrison' s Principles oflnternal Medicine, kapittel 150, s. 953-966 (16. utg., Braunwald et al., red., 2005).
"Sekundær tuberkulose" eller "postprimær tuberkulose" angir reaktivering av en slumrende, inaktiv eller latent M. tuberculosis-infeksjon. Se Harrison' s Principles oflnternal Medicine, som ovenfor.
En "aktiv infeksjon av M. tuberculosis" angir en M. tuberculosis-infeksjon med utslag av syksomssymptomer.
En "inaktiv, slumrende eller latent infeksjon av M. tuberculosis" angir en M. tuberculosis-infeksjon uten utslag av sykdomssymptomer.
En "medikamentresistent" M. tuberculosis-infeksjon angir en M. tuberculosis-infeksjon hvor den infiserernde stamme ikke holdes statisk eller drepes av (er resistent overfor) ett eller flere såkalte kjemoterapeutiske "frontlinje"-midler som er effektive til behandling av M. tuberculosis-infeksjon (f.eks. isoniazid, rifampin, etambutol, streptomycin og pyrazinamid).
En "multimedikamentresistent" M. tuberculosis-infeksjon angir en M. tuberculosis-infeksjon hvor den infiserende stamme er resistent overfor to eller flere kjemoterapeutiske "frontlinje"-midler som er effektive til behandling av en M. tuberculosis-infeksjon.
Et "kjemoterapeutisk middel effektivt til behandling av en M. tuberculosis-infeksjon" angir farmakologiske midler kjent og anvendt på området for behandling av M. tuberculosis-infeksjoner. Eksemplifiserte farmakologiske midler som anvendes til behandling av M. tuberculosis-infeksjoner, innbefatter, men er ikke begrenset til, amikacin, aminosalisylsyre, capreomycin, cykloserin, etambutol, etionamid, isoniazid, kanamycin, pyrazinamid, rifamyciner (dvs. rifampin, rifapentin og rifabutin), streptomycin, ofloxacin, ciprofloxacin, claritromycin, azitromycin og fluorkinoloner. Kjemoterapeutiske "førstelinje"-midler som anvendes til behandling av en M. tuberculosis-infeksjon som ikke er medikament-resistent, innbefatter isoniazid, rifampin, etambutol, streptomycin og pyrazinamid. Kjemoterapeutiske "andrelinje"-midler som anvendes til behandling av en M. tuberculosis-infeksjon som har vist medikamentresistens overfor ett eller flere "førstelinje"-medikamenter, innbefatter ofloxacin, ciprofloxacin, etionamid, aminosalisylsyre, cykloserin, amikacin, kanamycin og capreomycin. Slike farmakologiske midler er gjennomgått i kapittel 48 i Goodman and Gilman' s The Pharmacological Basis ofTherapeutics, Hardman og Limbird red., 2001.
"FL" angir hel lengde, dvs. et polypeptid som har samme lengde som villtype-polypeptidet.
"His-merkesubstans" angir en streng av His-rester, typisk 6 rester som innføres i den N-terminale ende, vanligvis umiddelbart etter begynnelses-Met-resten eller ellers i den C-terminale ende. De er vanligvis heterologe i forhold til den native sekvens, men innlemmes siden de letter isoleringen ved forbedring av proteinbindingen til immobiliserte metall-affinitetskromatografiharpikser (IMAC). Generelt angitt er tilstedeværelsen eller fraværet av en His-merkesubstans ikke av betydning ut fra det synspunkt å forårsake en egnet immunrespons som skal fremkalles overfor det antigene protein. I det tilfelle hvor det fremkalles en uheldig immunrespons overfor selve His-merkesubstansen, anses det best å minimalisere lengden av His-merkesubstansen f.eks. til 4 eller færre rester, spesielt to rester.
Betegnelsen "immunogent fragment derav" angir et polypeptid omfattende en epitop som gjenkjennes av cytotoksiske T-lymfocytter, hjelper-T-lymfocytter eller B-celler. Typisk vil et immunogent fragment av Mtb72f være et polypeptid inneholdende 500 eller flere aminosyrer, f.eks. 600 eller flere aminosyrer, f.eks. 700 eller flere aminosyrer. Oppfinnelsen omfatter også et stort antall fragmenter, f.eks. overlappende fragmenter, som sammen dekker hele eller hovedsakelig hele (f.eks. 500 eller flere aminosyrer, f.eks. 600 eller flere aminosyrer, f.eks. 700 eller flere aminosyrer) sekvensen av et Mtb72f-fusjonsprotein.
Betegnelsen "Mycobacterium-art i tuberkulose-komplekset" innbefatter de arter som tradisjonelt anses som å forårsake sykdommen tuberkulose, samt miljøbestemte og opportunistiske arter av Mycobacterium som forårsaker tuberkulose og lungesykdom hos immunkompromitterte pasienter, så som pasienter med AIDS, f.eks. M. tuberculosis, M. bovis eller M. africanum, BCG, M. avium, M. intracellulare, M. celatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M. simiae, M. vaccae, M. fortuitum og M. scrofulaceum (se f.eks. Harrison' s Principles of Internal Medicine, kapittel 150, s. 953-966 (16. utg., Braunwald et al., red., 2005).
En adjuvans angir komponentene i en vaksine eller det terapeutiske preparat som øker den spesifikke immunrespons overfor antigenet (se f.eks. Edelman, AIDS Res. Hum Retroviruses 8:1409-1411 (1992)). Adjuvanser induserer immunresponser av Th1- og Th2-responstype. Th1-cytokintyper (f.eks. IFN^y, IL-2 og IL-12) har tendens til å begunstige induksjon av cellemediert immunrespons overfor et administrert antigen, mens Th2-cytokintyper (f.eks. IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 og TNF-p) har tendens til å begunstige induksjon av humorale immunresponser. Adjuvanser som er i stand til preferensiell stimulering av en Th1-celle-mediert immunrespons, er beskrevet i WO 94/00153 og WO 95/17209.
"Nukleinsyre" angir deoksyribonukleotider eller ribonukleotider og polymerer derav i enten enkelt- eller dobbeltstrenget form. Betegnelsen omfatter nukleinsyrer inneholdende kjente nukleotidanaloger eller modifiserte skjelettrester eller bindinger, som er syntetiske, naturlig forekommende og ikke naturlig forekommende, som har liknende bindingsegenskaper som referanse-nukleinsyren, og som metaboliseres på en måte i likhet med referanse-nukleotidene. Eksempler på slike analoger innbefatter, uten begrensning, fosfortioater, fosforamidater, metylfosfonater, kiral-metyl-fosfonater, 2-O-metyl-ribonukleotider, peptide-nukleinsyrer (PNA).
Dersom ikke annet er angitt, omfatter en spesiell nukleinsyresekvens også underforstått konservativt modifiserte varianter derav (f.eks. degenerert kodon-substitusjoner) og komplementære sekvenser, samt sekvensen som er uttrykkelig angitt. Spesifikt kan degenererte kodon-substitusjoner oppnås ved frembringelse av sekvenser hvor den tredje stilling i én eller flere utvalgte (eller alle) kodoner er substituert med blandet-base- og/eller deoksyinosinrester (Batzer et al., Nucleic Acid Res 19:5081 (1991), Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). Betegnelsen nukleinsyre anvendes om hverandre med gen, cDNA, mRNA, oligonukleotid og polynukleotid.
Betegnelsene "polypeptid", "peptid" og "protein" anvendes om hverandre her i dokumentet for angivelse av en polymer av aminosyrerester. Betegnelsene angir aminosyrepolymerer hvor én eller flere aminosyrerester er et kunstig kjemisk mimetikum til en tilsvarende naturlig forekommende aminosyre, samt naturlig forekommende aminosyrepolymerer og ikke naturlig forekommende aminosyrepolymer.
Betegnelsen "aminosyre" angir naturlig forekommende og syntetiske aminosyrer, samt aminosyreanaloger og aminosyre-mimetika som funksjonerer på en måte i likhet med de naturlig forekommende aminosyrer. Naturlig forekommende aminosyrer er slike som kodes for ved den genetiske kode, samt aminosyrer som senere er modifisert, f.eks. hydroksyprolin, y-karboksyglutamat og O-fosfoserin. Aminosyreanaloger angir forbindelser som har den samme kjemiske grunnstruktur som en naturlig forekommende aminosyre, dvs. et a-karbon som er bundet til et hydrogen, en karboksylgruppe, en aminogruppe og en R-gruppe, f.eks. homoserin, norleucin, metioninsulfoksid, metioninmetylsulfonium. Slike analoger har modifiserte R-grupper (f.eks. norleucin) eller modifiserte peptidskjeletter, men bibeholder den samme kjemiske grunnstruktur som en naturlig forekommende aminosyre. Aminosyremimetika refererer til kjemiske forbindelser som har en struktur som er forskjellig fra den generelle kjemiske struktur av en aminosyre, men som funksjonerer på en måte i likhet med en naturlig forekommende aminosyre.
Aminosyrer kan angis her i dokumentet enten ved sine vanlig kjente trebokstavsymboler eller ved énbokstavsymbolene som anbefales av IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nukleotider kan likeledes angis ved sine vanlig aksepterte enkeltbokstavkoder.
"Konservativt modifiserte varianter" gjelder både aminosyre- og nukleinsyresekvenser. Når det gjelder spesielle nukleinsyresekvenser, angir konservativt modifiserte varianter nukleinsyrer som koder for identiske eller hovedsakelig identiske aminosyresekvenser, eller hvor nukleinsyren ikke koder for en aminosyresekvens, i det vesentlige identiske sekvenser. På grunn av degenerering av den genetiske kode koder et stort antall av funksjonelt identiske nukleinsyrer for et hvert gitt protein. For eksempel koder kodonene GCA, GCC, GCG og GCU alle for aminosyren alanin. I hver stilling hvor et alanin er spesifisert av et kodon, kan således kodonet forandres til hvilken som helst av de tilsvarende beskrevne kodoner uten at det kodede polypeptid forandres. Slike nukleinsyrevariasjoner er "stumme variasjoner", som er én type konservativt modifiserte variasjoner. Hver nukleinsyresekvens her som koder for et polypeptid, beskriver også hver mulig stum variasjon av nukleinsyren. En fagperson vil være klar over at hvert kodon i en nukleinsyre (bortsett fra AUG, som vanligvis er det eneste kodon for metionin, og TGG, som vanligvis er det eneste kodon for tryptofan) kan modifiseres til å gi et funksjonelt identisk molekyl. Følgelig er hver stum variasjon av en nukleinsyre som koder for et polypeptid, innbefattet i hver beskrevet sekvens.
Når det gjelder aminosyresekvenser, vil en fagperson være klar over at individuelle substitusjoner, delesjoner eller addisjoner til en nukleinsyre-, peptid-, polypeptid- eller proteinsekvens som forandrer, tilføyer eller utelukker en enkelt aminosyre eller en liten prosentandel av aminosyrer i den kodede sekvens, er en "konservativt modifisert variant" hvor forandringen resulterer i substitusjon av en aminosyre med en kjemisk liknende aminosyre. Konservative substitusjonstabeller som viser funksjonelt liknende aminosyrer, er velkjente på området. Slike konservativt modifiserte varianter er i tillegg til, og utelukker ikke, polymorfe varianter, interart-homologer og alleler ifølge oppfinnelsen.
Hver av følgende åtte grupper inneholder aminosyrer som er konservative substitusjoner for hverandre: 1) Alanin (A), Glycin (G); 2) Asparaginsyre (D), Glutaminsyre (E); 3) Asparagin (N), Glutamin (Q); 4) Arginin (R), Lysin (K); 5) Isoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V); 6) Fenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptofan (W);
7) Serin (S), Treonin (T); og
8) Cystein (C), Metionin (M)
(se f.eks. Creighton, Proteins (1984)).
Betegnelsen "heterolog" anvendt med henvisning til deler av en nukleinsyre angir at nukleinsyren omfatter to eller flere subsekvenser som ikke finnes i det samme forhold til hverandre i naturen. For eksempel blir nukleinsyren typisk rekombinant fremstilt, idet den har to eller flere sekvenser fra ubeslektede gener anordnet under dannelse av en ny funksjonell nukleinsyre, f.eks. en promoter fra én kilde og en kodende region fra en annen kilde. Likeledes angir et heterologt protein at proteinet omfatter to eller flere subsekvenser som ikke finnes i det samme forhold til hverandre i naturen (f.eks. et fusjonsprotein).
"Fusjonspolypeptid" eller "fusjonsprotein" angir et protein med minst to heterologe Mycobacterium sp.-polypeptider kovalent sammenbundet, enten direkte eller via en aminosyrelinker. Polypeptidene som utgjør fusjonsproteinet, er typisk sammenbundet C-terminalt til N-terminalt, skjønt de også kan være sammenbundet C-terminalt til C-terminalt, N-terminalt til N-terminalt eller N-terminalt til C-terminalt. Polypeptidene i fusjonsproteinet kan være i hvilken som helst rekkefølge. Denne betegnelse angir også konservativt modifiserte varianter, polymorfe varianter, alleler, mutanter, subsekvenser og interart-homologer til antigenene som utgjør fusjonsproteinet. Mycobacterium tuberculosis-antigener er beskrevet i Cole et al., Nature 393:537 (1998), som beskriver hele Mycobacterium tuberculosis-genomet. Den fullstendige sekvens for Mycobacterium tuberculosis kan også finnes på http://www.sanger.ac.uk og på http://www.pasteur.fr/mycdb/
(MycDB). Antigener fra andre Mycobacterium-arter som svarer til M. tuberculosis-antigener, kan identifiseres, f.eks. ved anvendelse av sekvenssammenlikningsalgoritmer, som beskrevet her i dokumentet, eller andre metoder kjent for fagfolk på området, f.eks. hybridiseringsanalyser og antistoffbindingsanalyser.
Eksempler på Mtb72f-fusjonsproteiner for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse innbefatter: Proteiner omfattende restene 8-729 av sekvensen ifølge SEKV ID Nr: 2;
Proteiner omfattende eller bestående av sekvensen ifølge SEKV ID Nr: 2 (=Mtb72f) eventuelt uten His-merkesubstansen som utgjør restene 2-7 i denne sekvens, eller med en His-merkesubstans med annen lengde;
Fusjonsproteiner omfattende sekvensen ifølge SEKV ID Nr: 2, eventuelt uten His-merkesubstansen som utgjør restene 2-7 i denne sekvens, eller med en His-merkesubstans med annen lengde (f.eks. et protein omfattene restene 8-729 av sekvensen ifølge SEKV ID Nr: 2) sammen med ett eller flere M. tuberculosis-antigener, for eksempel ett eller flere av proteinene oppregnet i avsnittene [0045] til [0052] ovenfor, eller et immunogent fragment av hvilket som helst av dem;
Proteiner omfattende restene 4-725 av sekvensen ifølge SEKV ID Nr: 4 (=M72);
Proteiner omfattende eller bestående av sekvensen ifølge SEKV ID Nr: 4 (=M72) eventuelt uten His-merkesubstansen som utgjør restene 2-3 av sekvensen, eller med en His-merkesubstans med en annen lengde;
og
Fusjonsproteiner omfattende sekvensen ifølge SEKV ID Nr: 4, eventuelt uten His-merkesubstansen som utgjør restene 2-3 av denne sekvens, eller med en His-merkesubstans med en annen lengde (f.eks. et protein omfattende restene 4-725 av sekvensen ifølge SEKV ID Nr: 4) sammen med ett eller flere M. tuberculosis-antigener, for eksempel ett eller flere av proteinene oppregnet i avsnittene [0045] til [0052] ovenfor, eller et immunogent fragment av hvilket som helst av dem.
Eksempler på immunogene fragmenter av et Mtb72f-fusjonsprotein for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse innbefatter: Proteiner omfattende eller bestående av sekvensen i TbH9-Ra35 (Mtb59F); eller TbH9; eller Ra35; eller Ra12; og
Fusjonsproteiner omfattende nevnte sekvenser sammen med ett eller flere M. tuberculosis-antigener, for eksempel ett eller flere av proteinene oppregnet i avsnittene [0045] til [0052] ovenfor, eller et immunogent fragment av hvilket som helst av dem.
Ytterligere eksempler på immunogene fragmenter av et Mtb72f-fusjonsprotein for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse innbefatter: Proteiner omfattende eller bestående av sekvensen ifølge TbH9-Ra35 (Mtb59F) eller Ra35 hvor stillingen svarende til Ser710 i SEKV ID Nr: 2 er forandret til Ala; og
Fusjonsproteiner omfattende disse sekvenser sammen med ett eller flere M. tuberculosis-antigener, for eksempel ett eller flere av proteinene oppført i avsnittene [0045] til [0052] ovenfor, etter et immunogent fragment av hvilket som helst av dem.
Mer spesifikt er Mtb72f:
et polypeptid omfattende restene 8-729 i SEKV ID Nr: 2; eller
et polypeptid bestående av restene 1 og 8-729 i SEKV ID Nr: 2 eventuelt med en His-merkesubstans innsatt etter den innledende Met-rest; eller
et polypeptid ifølge SEKV ID Nr: 2; eller
et polypeptid omfattende restene 4-725 i SEKV ID Nr: 4; eller
et polypeptid bestående av restene 1 og 4-725 i SEKV ID Nr: 4 eventuelt med en His-merkesubstans innsatt etter den innledende Met-rest; eller
et polypeptid ifølge SEKV ID Nr: 4; eller
et polypeptid ifølge SEKV ID Nr: 6.
Ytterligere eksempler på Mtb72f-fusjonsproteiner og immunogene fragmenter derav innbefatter proteinene nevnt ovenfor hvor den N- og/eller C-terminale ende er forkortet med f.eks. 5 eller 4 eller 3 eller 2 eller 1 aminosyrerester.
Ytterligere eksempler på Mtb72f-fusjonsproteiner og immunogene fragmenter derav innbefatter proteinene nevnt ovenfor hvor opp til 10% av aminosyrene, f.eks. opp til 5% av aminosyrene (f.eks. opp til 10, f.eks. opp til 5 aminosyrer) er erstattet med konservative substitusjoner som definert her i dokumentet.
Eksempler på Mtb72f-nukleinsyrer for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse innbefatter nukleinsyrer (f.eks. DNA-molekyler) som koder for de forannevnte eksempler på Mtb72f-fusjonsproteiner og immunogene fragmenter derav. Ett sett av spesifikke DNA-molekyler som kan nevnes, omfatter nukleotidene 63-2228 av SEKV ID Nr: 1. Et annet sett av spesifikke DNA-molekyler som kan nevnes, omfatter nukleotidene 10-2175 av SEKV ID Nr: 3. Spesifikke DNA-molekyler som kan nevnes, omfatter eller består av SEKV ID Nr: 1 eller SEKV ID Nr: 3 eller SEKV ID Nr: 5.
Betegnelsen "sammensmeltet" angir den kovalente binding mellom to polypeptider i et fusjonsprotein. Polypeptidene er typisk sammenbundet via en peptidbinding, enten direkte til hverandre eller via en aminosyrelinker. Eventuelt kan peptidene sammenbindes via kovalente ikke-peptid-bindinger kjent for fagfolk på området.
Uttrykket "selektivt (eller spesifikt) hybridiserer til" angir binding, dupleksdannelse eller hybridisering av et molekyl bare til en spesiell nukleotidsekvens under stringente hybridiseringsbetingelser når denne sekvens er til stede i en kompleks blanding (f.eks. total cellulær eller bibliotek-DNA eller -
RNA).
Uttrykket "stringente hybridiseringsbetingelser" angir betingelser under hvilke en probe vil hybridisere til sin mål-subsekvens, typisk i en kompleks blanding av nukleinsyrer, men ikke til andre sekvenser. Stringente betingelser er sekvensavhengige og vil være forskjellige under forskjellige forhold. Lengre sekvenser hybridiserer spesifikt ved høyere temperaturer. En omfattende rettledning for hybridisering av nukleinsyrer finnes i Tijssen, Techniques in Biochemostry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"
(1993). Generelt velges stringente betingelser til ca. 5-10°C lavere enn det termiske smeltepunktet (Tm) for den spesifikke sekvens ved en definert ionestyrke og pH. Tm er temperaturen (under definert ionestyrke, pH og nukleinsyre-konsentrasjon) ved hvilken 50% av probene som er komplementære til målsubstansen, hybridiserer til målsekvensen ved likevekt (siden målsekvensene er til stede i overskudd, ved Tm, er 50% av probene opptatt ved likevekt). Stringente betingelser vil være slike hvor saltkonsentrasjonen er lavere enn ca. 1,0 M natrium-ion, typisk ca. 0,01-1,0 M natriumionekonsentrasjon (eller andre salter) ved pH 7,0 til 8,3, og temperaturen er minst ca. 30°C for korte prober (f.eks. 10-50 nukleotider) og minst 60°C for lange prober (f.eks. større enn 50 nukleotider). Stringente betingelser kan også oppnås ved tilsetting av destabiliseringsmidler så som formamid.
For selektiv eller spesifikk hybridisering er et positivt signal minst to ganger bakgrunn, eventuelt 10 ganger bakgrunnshybridisering. Eksempler på stringente hybridiseringsbetingelser kan være som følger: 50% formamid, 5 x SSC og 1% SDS, inkubering ved 42°C, eller 5 x SSC, 1% SDS, inkubering ved 65°C, med vasking i 0,2 x SSC, og 0,1% SDS ved 65°C.
Nukleinsyrer som ikke hybridiserer til hverandre under stringente betingelser, er likevel hovedsakelig identiske hvis polypeptidene de koder for, er hovedsakelig identiske. Dette skjer for eksempel når en kopi av en nukleinsyre frembringes under anvendelse av den maksimale kodon-degenerering som tillates ved den genetiske kode. I slike tilfeller hybridiserer nukleinsyrene typisk under moderat stringente hybridiseringsbetingelser. Eksempler på "moderat stringente hybridiserings-betingelser" innbefatter en hybridisering i en buffer av 40% formamid, 1 M NaCI, 1% SDA ved 37°C og en vasking i 1X SSC ved 45°C. En positiv hybridisering er minst to ganger bakgrunnen. Vanlige fagpersoner vil lett forstå at alternative hybridiserings- og vaskebetingelser kan anvendes for tilveiebringelse av betingelser med liknende stringens. "Antistoff<1>angir et polypeptid omfattende en rammeverkregion fra et immunglobulin-gen eller fragmenter derav som spesifikt binder og gjenkjenner et antigen. De gjenkjente immunglobulin-gener innbefatter kappa-, lambda-, alfa-, gamma-, delta-, epsilon- og mu-konstant region-genene, samt de mangfoldige immunglobulin-variabel region-gener. Lette kjeder er klassifisert som enten kappa eller lambda. Tunge kjeder er klassifisert som gamma, mu, alfa, delta eller epsilon, som i sin tur definerer immunglobulinklassene, henholdsvis IgG, IgM, IgA, IgD og igE.
Et eksempel på en immunglobulin-(antistoff)-strukturenhet omfatter en tetramer. Hver tetramer består av to identiske par polypeptidkjeder, hvor hvert par har én "lett" (ca. 25 kDa) og en "tung" kjede (ca. 50-70 kDa). Den N-terminale ende av hver kjede definerer en variabel region på ca. 100-110 eller flere aminosyrer som primært er ansvarlige for antigengjenkjennelse. Betegnelsene variabel lett kjede (Vl) og variabel tung kjede (Vh) angir henholdsvis disse lette og tunge kjeder.
Antistoffer finnes f.eks. som intakte immunglobuliner eller som en rekke grundig karakteriserte fragmenter frembrakt ved digerering med forskjellige peptidaser. Således digererer for eksempel pepsin et antistoff under disulfidbindingene i hengselregionen under frembringelse av F(ab)'2, en dimerav Fab som i seg selv er en lett kjede bundet til Vh-Ch1 med en disulfidbinding. F(ab)'2kan reduseres under milde betingelser under brytning av disulfidbindingen i hengselregionen, hvorved F(ab)'2-dimeren omdannes til en Fab'-monomer. Fab'-monomeren er hovedsakelig Fab med en del av hengselregionen (se Fundamental Immunology (Paul red., 3. utg. 1993). Skjønt forskjellige antistoff-fragmenter er definert uttrykt ved digerering av et intakt antistoff, vil en fagperson forstå at slike fragmenter kan syntetiseres fra grunnen, enten kjemisk eller ved anvendelse av rekombinant DNA-metodikk. Således innbefatter betegnelsen antistoff, slik den er anvendt her i dokumentet, også antistoff-fragmenter enten dannet ved modifikasjon av hele antistoffer, eller slike som er syntetisert fra grunnen under anvendelse av rekombinante DNA-metodikker (f.eks. enkeltkjede-Fv) eller slike som identifiseres ved anvendelse av fagdisplay-biblioteker (se f.eks. McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)).
For frembringelse av monoklonale eller polyklonale antistoffer kan hvilken som helst teknikk kjent på området anvendes (se f.eks. Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozboretal., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., s. 77-96 i Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). Teknikker for frembringelse av enkeltkjedeantistoffer (US-patent 4 946 778) kan tilpasses til å frembringe antistoffer mot polypeptider ifølge denne oppfinnelse. Dessuten kan det anvendes transgene mus, eller andre organismer så som andre pattedyr, til ekspresjon av humaniserte antistoffer. Alternativt kan det anvendes fagdisplay-teknologi for identifisering av antistoffer og heteromere Fab-fragmenter som spesifikt bindes til utvalgte antigener (se f.eks. McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)).
Uttrykket "spesifikt (eller selektivt) bindes" til et antistoff, eller "spesifikt (eller selektivt) immunreaktivt med" ved henvisning til et protein eller peptid, angir en bindingsreaksjon som er bestemmende for tilstedeværelse av proteinet i en heterogen populasjon av proteiner og andre biologiske materialer. Således bindes de spesifiserte antistoffer under utvalgte immunanalysebetingelser til et spesielt protein minst to ganger bakgrunnen, og bindes hovedsakelig ikke i noen vesentlig grad til andre proteiner som finnes i prøven. Spesifikk binding til et antistoff under slike betingelser kan kreve et antistoff som utvelges på grunn av sin spesifisitet for et bestemt protein. Foreksempel kan polyklonale antistoffer fremkalt mot fusjonsproteiner utvelges for oppnåelse av bare de polyklonale antistoffer som er spesifikt immunreaktive med fusjonsprotein og ikke med individuelle komponenter i fusjonsproteinene. Denne seleksjon kan oppnås ved uttrekking av antistoffer som kryssreagerer med de individuelle antigener. En mangfoldighet av immunanalyseformater kan anvendes til utvelging av antistoffer som er spesifikt immunreaktive med et spesielt protein. For eksempel anvendes fastfase-ELISA-immunanalyser rutinemessig til utvelging av antistoffer som er spesifikt immunreaktive med et protein (se f.eks. Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) og Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998), for en beskrivelse av immunanalyseformater og -betingelser som kan anvendes til bestemmelse av spesifikk immunreaktivitet). En spesifikk eller selektiv reaksjon vil typisk være minst to ganger bakgrunnssignal eller -støy, og mer typisk mer enn 10-100 ganger bakgrunnen.
Polynukleotider kan omfatte en nativ sekvens (dvs. en endogen sekvens som koder for et individuelt antigen eller en del derav) eller en variant av en slik sekvens. Polynukleotidvarianter kan inneholde én eller flere substitusjoner, addisjoner, delesjoner og/eller innskudd slik at den biologiske aktivitet av det kodede fusjonspolypeptid ikke reduseres i forhold til et fusjonspolypeptid omfattende native antigener. Varianter oppviser fortrinnsvis minst ca. 70% identitet, mer foretrukket minst ca. 80% identitet, og mest foretrukket minst ca. 90% identitet, med en polynukleotidsekvens som koder for et nativt polypeptid eller en del derav.
Betegnelsene "identisk" eller prosent "identitet" angir, i forbindelse med to eller flere nukleinsyrer eller polypeptidsekvenser, to eller flere sekvenser eller subsekvenser som er de samme eller har en spesifisert prosentandel av aminosyrerester eller nukleotider som er de samme (dvs. 70% identitet, eventuelt 75%, 80%, 85%, 90% eller 95% identitet, over en spesifisert region), ved sammenlikning og innretting for maksimal overensstemmelse over et sammenlikningsvindu eller en utpekt region målt ved anvendelse av én av følgende sekvenssammenlikningsalgoritmer, eller ved manuell innretting og visuell inspeksjon. Slike sekvenser sies så å være "hovedsakelig identiske". Denne definisjon gjelder også komplementet til en testsekvens. Eventuelt finnes identiteten over en region som har en lengde på minst ca. 25 til ca. 50 aminosyrer eller nukleotider, eller eventuelt over en region med en lengde på 75-100 aminosyrer eller nukleotider.
For sekvenssammenlikning funksjonerer typisk én sekvens som en referansesekvens med hvilken testsekvenser sammenliknes. Ved anvendelse av en sekvenssammenlikningsalgoritme innsettes test- og referansesekvenser i en datamaskin, subsekvenskoordinater utpekes, hvis nødvendig, og sekvens-algoritme-programparametere utpekes. Default-programparametere kan anvendes, eller alternative parametere kan utpekes. Sekvenssammenliknings- algoritmen beregner så prosent sekvensidentiteter for testsekvensene i forhold til referansesekvensen, basert på programparameterne.
Et "sammenlikningsvindu" innbefatter, slik det er anvendt her i dokumentet, et segment av hvilket som helst av antallet av på hverandre følgende stillinger valgt fra gruppen bestående av fra 25 til 500, vanligvis fra ca. 50 til ca. 200, mer vanlig fra ca. 100 til ca. 150, hvor en sekvens kan sammenliknes med en referansesekvens med det samme antall av på hverandre følgende stillinger etter at det to sekvenser er optimalt innrettet. Metoder for innretting av sekvenser for sammenlikning er velkjente på området. Optimal innretting av sekvenser for sammenlikning kan utføres f.eks. ved den lokale homologialgoritme ifølge Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), ved homologi-innrettingsalgoritmen ifølge Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), ved søking etter liknende metode ifølge Pearson & Lipman, Proe. Nat' 1. Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), ved datastyrte implementeringer av disse algoritmer (GAP, BESTFIT, FASTA og TFASTA i Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), eller ved manuell innretting og visuell inspeksjon (se f.eks. Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., red. 1995 supplement)).
Ett eksempel på en anvendelig algoritme er PILEUP. PILEUP frembringer en multippel sekven si nn retting fra en gruppe av beslektede sekvenser under anvendelse av progressive, parvise innrettinger for å vise slektskap og prosent sekvensidentitet. Den tegner også inn et tre eller dendogram som viser klynge-slektskapene anvendt til frembringelse av innrettingen. PILEUP anvender en forenkling av den progressive innrettingsmetode ifølge Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987). Den anvendte metode likner metoden beskrevet av Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). Programmet kan innrette opp til 300 sekvenser, hver med en meksimumslengde på 5 000 nukleotider eller aminosyrer. Den multiple innrettingsprosedyre begynner med parvis innretting av de to mest like sekvenser, under frembringelse av en klynge av to innrettede sekvenser. Denne klynge blir så innrettet med den nest mest beslektede sekvens eller klynge av innrettede sekvenser. To klynger av sekvenser innrettes ved en enkelt ekstensjon av den parvise innretting av to individuelle sekvenser. Den endelige innretting oppnås ved en serie av progressive, parvise innrettinger. Programmet kjøres ved utpeking av spesifikke sekvenser og deres aminosyre- eller nukleotid- koordinater for regioner av sekvenssammenlikning og ved utpeking av programparameterne. Ved anvendelse av PILEUP blir en referansesekvens sammenliknet med andre testsekvenser for bestemmelse av prosent sekvensidentitetsslektskap under anvendelse av følgende parametere: "default gap weight" (3,00), "default gap length weight" (0,10) og "weighted end gaps". PILEUP kan fås ut fra GCG-sekvens-analyse-programvarepakken, f.eks. versjon 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984).
Et annet eksempel på algoritme som er egnet for bestemmelse av prosent sekvensidentitet og sekvenslikhet, er BLAST- og BLAST 2.0-algoritmene, som er beskrevet i henholdsvis Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) og Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Programvare for utførelse av BLAST-analyser er offentlig tilgjengelig via National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Denne algoritme innbefatter først identifisering av høytskårende sekvenspar (HSP) ved identifisering av korte ord med lengde W i spørresekvensen, som enten passer til eller oppfyller et terskel-poengtall T med positiv verdi ved innretting med et ord med samme lengde i en databasesekvens. T omtales som nabo-ordpoengterskelen (Altschul et al., som ovenfor). Disse innledende nabo-ordtreff funksjonerer som såkorn for innleding av forsøk for å finne lengre HSP inneholdende dem. Ordtreffene utvides i begge retninger langs hver sekvens så lenge de kumulative innrettingspoeng kan økes. Kumulative poeng beregnes ved anvendelse, for nukleotidsekvenser, av parameterne M (belønningspoeng for et par matchende rester; alltid > 0) og N (straffepoeng for ikke-matchende rester; alltid < 0). Når det gjelder aminosyresekvenser, anvendes en poengberegningsmatriks for beregning av de kumulative poeng. Forlengelse av ordtreffene i hver retning stoppes når: de kumulative innrettingspoeng avtar ved mengden X fra dets maksimalt oppnådde verdi; de kumulative poeng går til null eller under, på grunn av opphopning av én eller flere negativt scorende rest-innrettinger; eller enden av én av sekvensene er nådd. BLAST-algoritmeparameterne W, T og X bestemmer sensitiviteten og hastigheten av innrettingen. BLASTN-programmet (for nukleotidsekvenser) anvender som default en ordlengde (W) på 11, en forventning (E) på 10, M=5, N=-4 og en sammenlikning av begge strenger. Når det gjelder aminosyresekvenser, anvender BLASTP-programmet som default en ordlengde på 3, og forventning (E) på 10, og BLOSUM62-poengberegningsmatriks- (se Henikoff & Henikoff, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:10915 (1989)) innrettingene (B) på 50, forventning (E) på 10, M=5, N=-4 og en sammenlikning av begge strenger.
BLAST-algoritmen utfører også en statistisk analyse av likheten mellom to sekvenser (se f.eks. Karlin & Altschul, Proe. Nat' l. Acad. Sei USA 90:5873-5787
(1993)). Ett mål for likhet tilveiebrakt ved BLAST-algoritmen er minstesum-sannsynligheten (P(N)), som gir en indikasjon på sannsynligheten ved hvilken en match mellom to nukleotid- eller aminosyresekvenser tilfeldig vil finnes. For eksempel anses en nukleinsyre å være lik en referansesekvens hvis minstesum-sannsynligheten i en sammenlikning av test-nukleinsyren med referanse-nukleinsyren er mindre enn ca. 0,2, mer foretrukket mindre enn ca. 0,01 og mest foretrukket mindre enn ca. 0,001.
POLYNUKLEOTIDPREPARATER
Anvendt her i dokumentet angir betegnelsene "DNA-segment" og "polynukleotid" et DNA-molekyl som er isolert fritt for totalt genom-DNA fra en bestemt art. Derfor angir et DNA-segment som koder for et polypeptid, et DNA-segment som inneholder én eller flere kodingssekvenser, og som likevel er hovedsakelig isolert fra, eller renset fri for, totalt genom-DNA fra arten fra hvilken DNA-segmentet er tatt. Innbefattet i betegnelsene "DNA-segment" og "polynukleotid" er DNA-segmenter og mindre fragmenter av slike segmenter, og dessuten rekombinante vektorer, innbefattende for eksempel plasmider, kosmider, fagemider, fag, virus og liknende.
Som fagfolk på området vil være klar over, kan DNA-segmentene ifølge denne oppfinnelse innbefatte genomsekvenser, ekstragenom- og plasmid-kodede sekvenser og mindre konstruerte gensegmenter som uttrykker, eller kan tilpasses til å uttrykke, proteiner, polypeptider, peptider og liknende. Slike segmenter kan være naturlig isolert, eller modifisert syntetisk av mennesker.
"Isolert" angir, slik det er anvendt her i dokumentet, at et polynukleotid er i en vesentlig avstand fra andre kodingssekvenser, og at DNA-segmentet ikke inneholder store deler av ubeslektet kodende DNA, så som store kromosomfragmenter eller andre funksjonelle gener eller polypeptidkodende regioner. Dette henviser selvfølgelig til DNA-segmentet slik det opprinnelig er isolert, og utelukker ikke gener eller kodende regioner som senere er tilføyd til segmentet av mennesker.
Som en fagperson på området vil være klar over, kan polynukleotider være enkeltstrengede (kodende eller antisense) eller dobbeltstrengede, og kan være DNA- (genomiske, cDNA- eller syntetiske) eller RNA-molekyler. RNA-molekyler innbefatter HnRNA-molekyler, som inneholder introner og svarer til et DNA-molekyl på en én-til-én-måte, og mRNA-molekyler, som ikke inneholder introner. Ytterligere kodende eller ikke-kodende sekvenser kan, men behøver ikke, være til stede i et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse, og et polynukleotid kan, men behøver ikke, være knyttet til andre molekyler og/eller understøttende materialer.
Polynukleotider kan omfatte en nativ sekvens (dvs. en endogen sekvens som koder for et Mycobacterium-antigen eller en del derav) eller en variant, eller en biologisk eller antigent funksjonell ekvivalent til en slik sekvens. Polynukleotidvarianter kan inneholde én eller flere substitusjoner, addisjoner, delesjoner og/eller innskudd, som ytterligere beskrevet nedenfor, fortrinnsvis slik at immunogeniteten hos det kodede polypeptid ikke reduseres, i forhold til et nativt tumorprotein. Virkningen på immunogeniteten av det kodede polypeptid kan generelt fastsettes som beskrevet her i dokumentet. Betegnelsen "varianter" omfatter også homologe gener av xenogen opprinnelse.
Ved ytterligere utførelsesformer tilveiebringer foreliggende oppfinnelse isolerte polynukleotider og polypeptider omfattende forskjellige lengder av på hverandre følgende stykker av sekvens identisk med eller komplementær til én eller flere av sekvensene beskrevet her i dokumentet. For eksempel er det tilveiebrakt polynukleotider ved denne oppfinnelse som omfatter minst ca. 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 eller 1000 eller flere på hverandre følgende nukleotider av én eller flere av sekvensene beskrevet her i dokumentet, samt alle mellomliggende lengder mellom disse. Det vil lett forstås at "mellomliggende lengder" i denne forbindelse angir hvilken som helst lengde mellom de angitte verdier, så som 16, 17, 18, 19 osv.; 21, 22, 23 osv.; 30, 31, 32 osv.; 50, 51, 52, 53 osv; 100, 101, 102, 103 osv.; 150, 151, 152, 153 osv.; innbefattende alle hele tall fra og med 200 til og med 500; 500-1 000, og liknende.
Polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse, eller fragmenter derav, kan, uansett lengde av selve kodingssekvensen, kombineres med andre DNA-sekvenser, så som promotere, polyadenyleringssignaler, ytterligere restriksjonsenzymseter, multiple kloningsseter, andre kodingssegmenter og liknende, slik at deres totale lengde kan variere betraktelig. Det er derfor påtenkt at et nukleinsyrefragment med nesten hvilken som helst lengde kan anvendes, idet den totale lengde fortrinnsvis er begrenset av hvor lettvint tilberedningen og anvendelsen i den påtenkte rekombinante DNA-protokoll er. For eksempel er illustrerende DNA-segmenter med totale lengder på ca. 10 000, ca. 5 000, ca. 3 000, ca. 2 000, ca. 1 000, ca. 500. ca. 200. ca. 100. ca. 50 basepar, og liknende (innbefattende alle mellomliggende lengder) påtenkt å være anvendelige ved mange implementeringer av denne oppfinnelse.
Vanlige fagfolk på området vil videre være klar over at det, som resultat av degenerering av den genetiske kode, er mange nukleotidsekvenser som koder for et polypeptid som beskrevet her i dokumentet. Noen av disse polynukleotider bærer minimal homologi til nukleotidsekvensen i hvilket som helst nativt gen. Ikke desto mindre er polynukleotider som varierer på grunn av forskjeller i kodonanvendelse, spesifikt påtenkt ved foreliggende oppfinnelse, for eksempel polynukleotider som er optimalisert for human og/eller primat-kodonseleksjon. Videre er alleler av genene omfattende polynukleotidsekvensene tilveiebrakt her i dokumentet innenfor foreliggende oppfinnelses ramme. Alleler er endogene gener som er forandret som resultat av én eller flere mutasjoner, så som delesjoner, addisjoner og/eller substitusjoner av nukleotider. Det resulterende mRNA og protein kan, men behøver ikke, ha en forandret struktur eller funksjon. Alleler kan identifiseres ved anvendelse av standardteknikker (så som hybridisering, amplifisering og/eller databasesekvenssammenlikning).
POLYNUKLEOTID-IDENTIFIKASJON OG -KARAKTERISERING
Polynukleotider kan identifiseres, prepareres og/eller manipuleres ved anvendelse av hvilken som helst av mange forskjellige veletablerte teknikker. For eksempel kan et polynukleotid identifiseres, som beskrevet mer detaljert nedenfor, ved screening av en mikrorekke av cDNA for tumorassosiert ekspresjon (dvs. ekspresjon som er minst to ganger større i en tumor enn i normalt vev, ifølge bestemmelse ved anvendelse av en representativ analyse tilveiebrakt i det foreliggende). Slike screeninger kan for eksempel utføres ved anvendelse av en Synteni-mikrorekke (Palo Alto, CA) i henhold til fabrikantens instruksjoner (og hovedsakelig som beskrevet av Schena et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93:10614-10619 (1996) og Heller et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94:2150-2155
(1997)). Alternativt kan polynukleotider amplifiseres fra cDNA tilberedt fra celler som uttrykker proteinene beskrevet her i dokumentet, så som M. tuberculosis-celler. Slike polynukleotider kan amplifiseres via polymerasekjedereaksjon (PCR). For denne fremgangsmåte kan sekvens-spesifikke primere utformes basert på sekvensene tilveiebrakt her i dokumentet, og kan kjøpes eller syntetiseres.
En amplifisert del av et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes til isolering av et gen i hel lengde fra et egnet bibliotek (f.eks. et M. tuberculosis-cDNA-bibliotek) ved anvendelse av velkjente teknikker. Innenfor slike teknikker blir et bibliotek screenet (cDNA eller genomisk) ved anvendelse av én eller flere polynukleotidprober eller primere egnet for amplifikasjon. Fortrinnsvis blir et bibliotek størrelsesselektert til å innbefatte større molekyler. Tilfeldige primede biblioteker kan også foretrekkes for identifisering av 5'- og oppstrømsregioner av gener. Genomiske biblioteker er foretrukket for oppnåelse av introner og forlengelse av 5'-sekvenser.
Når det gjelder hybridiseringsteknikker, kan en spesiell sekvens merkes (f.eks. ved "nick"-translasjon eller endemerking med<32>P) ved anvendelse av velkjente teknikker. Et bakterie- eller bakteriofagbibliotek blir så generelt screenet ved hjelp av hybridiseringsfiltere inneholdende denaturerte bakterie-kolonier (eller flekker inneholdende fagplakk) med den merkede probe (se Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2000)). Hybridiseringskolonier eller plakk selekteres og ekspanderes, og DNA isoleres for ytterligere analyse. cDNA-kloner kan analyseres for bestemmelse av mengden av tilleggssekvens for eksempel ved PCR under anvendelse av en primer fra den partielle sekvens og en primer fra vektoren. Restriksjonskart og partialsekvenser kan frembringes for identifisering av én eller flere overlappende kloner. Den fullstendige sekvens kan så bestemmes ved anvendelse av standardteknikker, som kan involvere frembringelse av en serie av delesjonskloner. De resulterende overlappende sekvenser kan så settes sammen til en enkelt sammenhengende sekvens. Et DNA-molekyl i hel lengde kan frembringes ved ligering av egnede fragmenter, under anvendelse av velkjente teknikker.
Alternativt er det tallrike amplifikasjonsteknikker for oppnåelse av en
kodingssekvens i hel lengde fra en partiell cDNA-sekvens. Innenfor slike teknikker utføres amplifikasjon vanligvis via PCR. Hvilket som helst av en rekke kommersielt tilgjengelige utstyrssett kan anvendes til utførelse av amplifikasjonstrinnet. Primere
kan utformes for eksempel under anvendelse av programvare som er velkjent på området. Primere har fortrinnsvis en lengde på 22-30 nukleotider og et GC-innhold på minst ca. 50%, og koples til målsekvensen ved temperaturer på ca. 68-72°C. Den amplifiserte region kan sekvensbestemmes som beskrevet ovenfor, og overlappende sekvenser settes sammen til en sammenhengende sekvens.
Én slik amplifikasjonsteknikk er invers PCR (se Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186 (1988)), som anvender restriksjonsenzymer til frembringelse av et fragment i den kjente region av genet. Fragmentet blir så sirkeldannet ved intramolekylær ligering og anvendt som templat for PCR med innbyrdes forskjellige primere tatt fra den kjente region. Innenfor en alternativ fremgangsmåte kan sekvenser i nabostilling til en partialsekvens gjenvinnes ved amplifikasjon med en primer til en linkersekvens og en primer som er spesifikk for en kjent region. De amplifiserte sekvenser blir typisk underkastet en andre runde amplifikasjon med den samme linkerprimer og en andre primer som er spesifikk for den kjente region. En variasjon av denne prosedyre, som anvender to primere som setter i gang utvidelse i motsatte retninger fra den kjente sekvens, er beskrevet i WO 96/38591. En annen slik teknikk er kjent som "hurtig amplifikasjon av cDNA-ender" eller RACE. Denne teknikk involverer anvendelse av en indre primer og en ytre primer, som hybridiserer til en polyA-region- eller vektorsekvens, under identifisering av sekvenser som er 5' og 3' i forhold til en kjent sekvens. Ytterligere teknikker innbefatter oppfangings-PCR (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19 (1991)) og vandrende PCR (Parker et al., Nucl. Acids Res. 19:3055-60 (1991)). Andre metoder som anvender amplifikasjon, kan også anvendes for oppnåelse av en cDNA-sekvens i hel lengde.
I visse tilfeller er det mulig å oppnå en cDNA-sekvens i hel lengde ved analysering av sekvenser tilveiebrakt i en uttrykt sekvensmerke-(EST)-database, så som den som kan fås fra GenBank. Undersøkelser med henblikk på overlappende EST kan generelt utføres under anvendelse av velkjente programmer (f.eks. NCBI BLAST-søkinger), og slike EST kan anvendes til frembringelse av en sammenhengende sekvens i hel lengde. DNA-sekvenser i hel lengde kan også fås ved analyse av genomf rag menter.
POLYNUKLEOTID-EKSPRESJON I VERTSCELLER
Ved andre utførelsesformer av oppfinnelsen kan det anvendes polynukleotidsekvenser eller fragmenter derav som koder for polypeptider ifølge oppfinnelsen, eller fusjonsproteiner eller funksjonelle ekvivalenter derav, i rekombinante DNA-molekyler for å styre ekspresjonen av et polypeptid i passende vertsceller. På grunn av den iboende degenerering av den genetiske kode kan andre DNA-sekvenser som koder for hovedsakelig den samme eller en funksjonelt ekvivalent aminosyresekvens, frembringes, og disse sekvenser kan anvendes til kloning og ekspresjon av et gitt polypeptid.
Som fagfolk på området vil være klar over, kan det i noen tilfeller være fordelaktig å frembringe polypeptidkodende nukleotidsekvenser som har ikke naturlig forekommende kodoner. For eksempel kan kodoner som foretrekkes av en bestemt prokaryot eller eukaryot vert, utvelges for økning av hastigheten av proteinekspresjon eller for frembringelse av en rekombinant RNA-transkript med ønskede egenskaper, så som en halveringstid som er lengre enn halveringstiden for et transkript frembrakt ut fra den naturlig forekommende sekvens.
Videre kan polynukleotidsekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse konstrueres under anvendelse av metoder som er generelt kjent på området, for forandring av polypeptidkodende sekvenser av en rekke grunner, innbefattende, men ikke begrenset til, forandringer som modifiserer kloningen, prosesseringen og/eller ekspresjonen av genproduktet. For eksempel kan DNA-stokking ved tilfeldig fragmentering og ny PCR-sammensetting av genfragmenter og syntetiske oligonukleotider anvendes til konstruering av nukleotidsekvensene. Dessuten kan seterettet mutagenese anvendes til innsetting av nye restriksjonsseter, forandring av glykosyleringsmønstre, forandring av kodonpreferanse, frembringelse av spleisevarianter eller innføring av mutasjoner, og så videre.
Ved en annen utførelsesform av oppfinnelsen kan naturlige, modifiserte eller rekombinante nukleinsyresekvenser ligeres til en heterolog sekvens for koding av et fusjonsprotein. For screening av peptidbiblioteker med henblikk på inhibitorer av polypeptidaktivitet kan det for eksempel være anvendelig å kode for et kimærisk protein som kan gjenkjennes av et kommersielt tilgjengelig antistoff. Et fusjonsprotein kan også konstrueres til å inneholde et spaltningssete anbrakt mellom den polypeptidkodende sekvens og den heterologe proteinsekvens, slik at polypeptidet kan spaltes og renses fra den heterologe del.
Sekvenser som koder for et ønsket polypeptid, kan syntetiseres, helt eller delvis, ved anvendelse av kjemiske metoder som er velkjente på området (se Caruthers, M.H. et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. s. 215-223 (1980), Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. s. 225-232 (1980)).
Alternativt kan selve proteinet fremstilles ved anvendelse av kjemiske metoder for syntetisering av aminosyresekvensen av et polypeptid, eller en del derav. For eksempel kan peptidsyntetisering utføres under anvendelse av forskjellige fastfasteknikker (Roberge et al., Science 269:202-204 (1995)) og automatisk syntese kan oppnås for eksempel under anvendelse av ABI 431A-peptidsyntetiseringsapparatet (Perkin Eimer, Palo Alto, CA).
Et nylig syntetisert peptid kan i det vesentlige renses ved preparativ høyytelses-væskekromatografi (f.eks. Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles (1983)) eller andre sammenliknbare teknikker som er tilgjengelige på området. Sammensetningen av de syntetiske peptider kan bekreftes ved aminosyreanalyse eller -sekvensering (f.eks. Edman-degraderings-metoden). I tillegg kan aminosyresekvensen for et polypeptid, eller en del derav, forandres under direkte syntese og/eller kombineres under anvendelse av kjemiske metoder med sekvenser fra andre proteiner, eller en del derav, under frembringelse av et variant-polypeptid.
For ekspresjon av et ønsket polypeptid kan nukleotidsekvensen som koder for polypeptidet, eller funksjonelle ekvivalenter, innsettes i en passende ekspresjonsvektor, dvs. en vektor som inneholder de nødvendige elementer for transkripsjon og translasjon av den innsatte kodingssekvens. Metoder som er velkjente for fagfolk på området, kan anvendes til konstruering av ekspresjonsvektorer inneholdende sekvenser som koder for et aktuelt polypeptid, og passende transkripsjons- og translasjons-kontrollelementer. Disse metoder innbefatter in vitro-rekombinante DNA-teknikker, synteseteknikker og genetisk in vivo-rekombinasjon. Slike teknikker er beskrevet i Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2000) og Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (oppdatert årlig).
Mange forskjellige ekspresjonsvektor/vert-systemer kan anvendes til å inneholde og uttrykke polynukleotidsekvenser. Disse innbefatter, men er ikke begrenset til, mikroorganismer så som bakterier transformert med rekombinante bakteriofag-, plasmid- eller kosmid-DNA-ekspresjonsvektorer; gjærsopp transformert med gjærsoppekspresjonsvektorer; insektcellesystemer infisert med virusekspresjonsvektorer (f.eks. baculovirus); plantecellesystemer transformert med virusekspresjonsvektorer (f.eks. blomkål-mosaikkvirus, CaMV; tobakkmosaikkvirus, TMV) eller med bakterielle ekspresjonsvektorer (f.eks. Ti-eller pBR322-plasmider); eller dyrecellesystemer.
"Kontrollelementene" eller "regulatorsekvensene" som finnes i en ekspresjonsvektor, er de ikke-translaterte regioner av vektoren - forsterkere, promotere, ikke-translaterte 5'- og 3'-regioner - som interagerer med vertscelle-proteiner under utførelse av transkripsjon og translasjon. Slike elementer kan variere med hensyn til styrke og spesifisitet. Avhengig av vektorsystemet og verten som anvendes, kan hvilket som helst antall egnede transkripsjons- og translasjonselementer, innbefattende konstitutive og induserbare promotere, anvendes. Ved for eksempel klooning i bakteriesystemer kan induserbare promotere så som hybrid-lacZ-promoteren for PBLUESCRIPT-fagemidet (Stratagene, La Jolla, Calif.) eller PSPORT1-plasmidet (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) og liknende anvendes. I pattedyrcellesystemer er promotere fra pattedyrgener eller fra pattedyrvirus generelt foretrukket. Hvis det er nødvendig å frembringe en cellelinje som inneholder multiple kopier av sekvensen som koder for et polypeptid, kan vektorer basert på SV40 eller EBV med fordel anvendes med en passende selekterbar markør.
I bakteriesystemer kan en rekke ekspresjonsvektorer utvelges avhengig av anvendelsen som er påtenkt for det uttrykte polypeptid. Når det for eksempel trenges store mengder, for eksempel for induksjon av antistoffer, kan det anvendes vektorer som styrer høynivåekspresjon av fusjonsproteiner som lett kan renses. Slike vektorer innbefatter, men er ikke begrenset til, de flerfunksjonene E. co//'-klonings- og ekspresjonsvektorer så som BLUESCRIPT (Stratagene), hvor sekvensen som koder for det aktuelle polypeptid, kan ligeres i vektoren i ramme med sekvenser for det aminoterminale Met og de påfølgende 7 rester av p-galaktosidase slik at det dannes et hybridprotein; pIN-vektorer (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509 (1989)); og liknende. pGEX-vektorer (Promega, Madison, Wis.) kan også anvendes til ekspresjon av fremmede polypeptider som fusjonsproteiner med glutation S-transferase (GST). Slike fusjonsproteiner er generelt løselige og kan lett renses fra lyserte celler ved adsorpsjon til glutation-agarose-kuler, fulgt av eluering i nærvær av fritt glutation. Proteiner laget i slike systemer kan utformes til å innbefatte heparin, trombin eller faktor XA-proteasespaltningsseter slik at det klonede aktuelle polypeptid kan frigjøres fra GST-delen etter ønske.
I gjærsoppen Saccharomyces cerevisiae kan det anvendes en rekke vektorer inneholdende konstitutive eller induserbare promotere så som alfafaktor, alkoholoksidase og PGH. For en oversikt, se Ausubel et al. (som ovenfor) og Grant et al., Methods Enzymol. 153:516-544 (1987).
I tilfeller hvor planteekspresjonsvektorer anvendes kan ekspresjon av sekvenser som koder for polypeptider, styres av hvilken som helst av en rekke promotere. For eksempel kan viruspromotere så som 35S- og 19S-promoterne for CaMV anvendes alene eller i kombinasjon med omega-ledersekvensen fra TMV (Takamatsu, EMBO J., 6:307-311 (1987)). Alternativt kan plantepromotere så som den lille subenheten av RUBISCO eller varmesjokkpromotere anvendes (Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie et al., Science 224:838-843 (1984); og Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)). Disse konstruksjoner kan innføres i planteceller ved direkte DNA-transformasjon eller patogenmediert transfeksjon. Slike teknikker er beskrevet i en rekke generelt tilgjengelige redegjørelser (se f.eks. Hobbs i McGrawHill Yearbook of Science and Technology s. 191-196 (1992)).
Et insektsystem kan også anvendes til å uttrykke et aktuelt polypeptid. I ett slikt system anvendes for eksempel nukleær polyhedrosevirus Autographa californica (AcNPV) som vektor for å uttrykke fremmede gener i Spodoptera frugiperda-celler eller i Trichoplusia-larver. Sekvensene som koder for polypeptidet, kan klones inn i en ikke-essensiell region av viruset, så som polyhedringenet, og anbringes under kontroll av polyhedrin-promoteren. Vellykket innsetting av den polypeptidkodende sekvens vil gjøre polyhedringenet inaktivt og danne rekombinant virus som mangler kappeprotein. De rekombinante virus kan så anvendes til for eksempel å infisere S. frugiperda-celler eller Trichoplusia-larver i hvilke det aktuelle polypeptid kan uttrykkes (Engelhard et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 91:3224-3227 (1994)).
I pattedyr-vertsceller er det vanligvis tilgjengelig en rekke virusbaserte ekspresjonssystemer. I tilfeller hvor for eksempel adenoviruset anvendes som ekspresjonsvektor, kan sekvenser som koder for et aktuelt polypeptid, ligeres i et adenovirus-transkripsjons/translasjons-kompleks bestående av senpromoteren og den tredelte ledersekvens. Innsetting i en ikke-essensiell E1- eller E3-region av virusgenomet kan anvendes til oppnåelse av et levedyktig virus som er i stand til å uttrykke polypeptidet i infiserte vertsceller (Logan & Shenk, Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 81:3655-3659 (1984)). Dessuten kan transkripsjonsforsterkere, så som Rous-sarkom-virus-(RSV)-forsterkeren, anvendes til å øke ekspresjonen i pattedyr-vertsceller. Metoder og protokoller for å arbeide med adenovirusvektorer er beskrevet i Wold, Adenovirus Methods and Protocols, 1998. Ytterligere referanser angående anvendelse av adenovirusvektorer kan finnes i Adenovirus: A Medical Dictionary, Bibliography, and Annotated Research Guide to Internet References, 2004.
Spesifikke initieringssignaler kan også anvendes til oppnåelse av mer effektiv translasjon av sekvenser som koder for et aktuelt polypeptid. Slike signaler innbefatter ATG-initieringskodonet og nabosekvenser. I tilfeller hvor sekvenser som koder for polypeptidet, dets initieringskodon og oppstrøms-sekvenser innsettes i den passende ekspresjonsvektor, vil det ikke trenges noen ytterligere transkripsjons- eller translasjonskontrollsignaler. I tilfeller hvor imidlertid bare kodingssekvens eller en del derav innsettes, bør det tilveiebringes eksogene translasjonskontrollsignaler innbefattende ATG-initieringskodonet. Videre bør initieringskodonet være i den riktige leseramme for å sikre translasjon av hele innskuddet. Eksogene translasjonselementer og initieringskodoner kan ha forskjellige opprinnelser, både naturlige og syntetiske. Effektiviteten av ekspresjonen kan forbedres ved innlemming av forsterkere som er passende for det spesielle cellesystem som anvendes, så som dem som er beskrevet i litteraturen (Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)).
I tillegg kan en vertscellestamme anvendes på grunn av sin evne til å modulere ekspresjonen av de innsatte sekvenser eller til å bearbeide det uttrykte protein på ønsket måte. Slike modifikasjoner av polypeptidet innbefatter, men er ikke begrenset til, acetylering, karboksylering, glykosylering, fosforylering, lipidering og acylering. Post-translasjonell prosessering som spalter en "prepro"-form av proteinet, kan også anvendes for å lette riktig innsetting, folding og/eller funksjon. Forskjellige vertsceller så som CHO, HeLa, MDCK, HEK293 og W138, som har spesifikt cellemaskineri og karakteristiske mekanismer for slike post-translasjonelle aktiviteter, kan velges for å sikre riktig modifikasjon og prosessering av det fremmede protein.
For langsiktig fremstilling av rekombinante proteiner i høyt utbytte er stabil ekspresjon generelt foretrukket. For eksempel kan cellelinjer som stabilt uttrykker et aktuelt polynukleotid, transformeres under anvendelse av ekspresjonsvektorer som kan inneholde virus-replikasjonsorigoer og/eller endogene ekspresjons-elementer og et selekterbart markørgen på den samme eller på en separat vektor. Etter innføring av vektoren kan cellene få vokse i 1-2 dager i et anriket medium før de skiftes til selektivt medium. Formålet med den selekterbare markør er å gi bestandighet overfor seleksjon, og tilstedeværelse av den muliggjør vekst og gjenvinning av celler som på en vellykket måte uttrykker de innførte sekvenser. Resistente kloner av stabilt transformerte celler kan prolifereres under anvendelse av vevsdyrkningsteknikker som er passende for celletypen.
Hvilket som helst antall seleksjonssystemer kan anvendes for gjenvinning av transformerte cellelinjer. Disse innbefatter, men er ikke begrenset til, herpes simplex-virus-thymidinkinase- (Wigler et al., Cell 11:223-32 (1997)) og adeninfosforibosyltransferase- (Lowy et al., Cell 22:817-23 (1990)) genene som kan anvendes i henholdsvis tk.sup.- eller aprt.sup.-celler. Det kan dessuten anvendes antimetabolitt-, antibiotika- eller herbicidresistens som basis for seleksjon; for eksempel dhfr som gir resistens overfor metotreksat (Wigler et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 77:3567-70 (1980)); npt, som gir resistens overfor aminoglykosidene, neomycin og G-418 (Colberg-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)); og als eller pat, som gir resistens overfor henholdsvis klorsulfuron og fosfinotricinacetyltransferase (Murry, som ovenfor). Ytterligere selekterbare gener er beskrevet, for eksempel trpB, som muliggjør at celler kan utnytte indol i stedet for tryptofan, eller hisD, som muliggjør at celler kan utnytte histinol i stedet for histidin (Hartman & Mulligan, Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 85:8047-51 (1988)). Anvendelse av synlige markører er i det siste blitt populært med slike markører som anthocyaniner, p-glukuronidase og dens substrat GUS, og luciferase og dens substrat luciferin, som er alminnelig anvendt ikke bare til å identifisere transformanter, men også til å kvantifisere mengden av forbigående eller stabil proteinekspresjon som skyldes et spesifikt vektorsystem (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995)).
Skjønt tilstedeværelse/fravær av markørgen-ekspresjon tyder på at det aktuelle genet også er til stede, vil det være nødvendig å bekrefte tilstedeværelsen og ekspresjonen av det. Hvis for eksempel sekvensen som koder for et polypeptid, innsettes i en markørgensekvens, kan rekombinante celler inneholdende sekvenser identifiseres ved fravær av markørgenfunksjon. Alternativt kan et markørgen anbringes i tandem med en polypeptidkodende sekvens under kontroll av en enkelt promoter. Ekspresjon av markørgenet som svar på induksjon eller seleksjon tyder også vanligvis på ekspresjon av tandemgenet.
Alternativt kan vertsceller som inneholder og uttrykker en ønsket polynukleotidsekvens, identifiseres ved en rekke metoder kjent for fagfolk på området. Disse metoder innbefatter, men er ikke begrenset til, DNA-DNA- eller DNA-RNA-hybridiseringer og protein-bioanalyse- eller -immunanalyseteknikker som innbefatter membran-, løsnings- eller brikkebaserte teknologier for deteksjon og/eller kvantifikasjon av nukleinsyre eller protein.
En mangfoldighet av protokoller for deteksjon og måling av ekspresjon av polynukleotid-kodede produkter ved anvendelse av enten polyklonale eller monoklonale antistoffer som er spesifikke for produktene, er kjent på området. Eksempler innbefatter enzymbundet immunsorpsjons-analyse (ELISA), radioimmunanalyse (RIA) og fluorescensaktivert cellesortering (FACS). En monoklonal-basert tosete-immunanalyse som benytter monoklonale antistoffer som er reaktive overfor to ikke-interfererende epitoper på et gitt polypeptid, kan foretrekkes for noen anvendelser, men en kompetitiv bindingsanalyse kan også anvendes. Disse og andre analyser er, blant andre steder, beskrevet i Hampton et al., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) og Maddox et al., J. Exp. Med. 158:1211-1216(1983).
Mange forskjellige merkesubstanser og konjugeringsteknikker er kjent av fagfolk på området, og kan anvendes i forskjellige nukleinsyre- og aminosyre-analyser. Midler for frembringelse av merket hybridisering eller PCR-proberfor detektering av sekvenser i forbindelse med polynukleotider innbefatter oligomerking, "nick-"-translasjon, endemerking eller PCR-amplifikasjon ved anvendelse av et merket nukleotid. Alternativt kan sekvensene eller deler derav klones i en vektor for frembringelse av en mRNA-probe. Slike vektorer er kjent på området, er kommersielt tilgjengelige og kan anvendes til syntetisering av RNA-prober in vitro ved tilsetning av en passende RNA-polymerase så som T7, T3 eller SP6 og merkede nukleotider. Disse metoder kan utføres under anvendelse av en rekke kommersielt tilgjengelige utstyrssett. Egnede reportermolekyler eller merkesubstanser som kan anvendes, innbefatter radionuklider, enzymer, fluorescerende, kjemiluminescerende eller kromogene midler samt substrater, kofaktorer, inhibitorer, magnetiske partikler og liknende.
Vertsceller transformert med en aktuell polynukleotidsekvens kan dyrkes under betingelser egnet for ekspresjon og gjenvinning av proteinet fra cellekultur. Proteinet som dannes av en rekombinant celle, kan utskilles eller finnes intracellulært avhengig av sekvensen og/eller vektoren som anvendes. Som fagfolk på området vil være klar over, kan ekspresjonsvektorer inneholdende polynukleotider ifølge oppfinnelsen utformes til å inneholde signalsekvenser som styrer sekresjonen av det kodede polypeptid gjennom en prokaryot eller eukaryot cellemembran. Andre rekombinante konstruksjoner kan anvendes til å knytte sekvenser som koder for et aktuelt polypeptid, til en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid-doméne som vil lette rensing av løselige proteiner. Slike rensningslettende doméner innbefatter, men er ikke begrenset til, metall-chelaterende peptider så som histidin-tryptofan-moduler som muliggjør rensning på immobiliserte metaller, protein A-doméner som muliggjør rensning på immobilisert immunglobulin, og doménet som benyttes i FLAGS-ekstensjons/- affinitetsrensningssystemet (Immunex Corp. Seattle, Wash.). Innlemming av spaltbare linkersekvenser så som dem som er spesifikke for faktor XA eller enterokinase (Invitrogen, San Diego, Calif.) mellom rensningsdoménet og det kodede polypeptid, kan anvendes til å lette rensningen. Én slik ekspresjonsvektor tilveiebringer ekspresjon av et fusjonsprotein inneholdende et aktuelt polypeptid, og en nukleinsyre som koder for 6 histidinrester som går forut for et tioredoksin eller et enterokinase-spaltningssete. Histidinrestene gjør rensing på IMIAC lettere (immobilisert metallion-affinitetskromatografi) som beskrevet i Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3:263-281 (1992), mens enterokinase-spaltningssetet tilveiebringer et middel for rensing av det ønskede polypeptid fra fusjonsproteinet. En omtale av vektorer som inneholder fusjonsproteiner, er tilveiebrakt i Kroll et al., DNA Cell Biol. 12:441-453(1993)).
I tillegg til rekombinante produksjonsmetoder, kan polypeptider ifølge oppfinnelsen, og fragmenter derav, fremstilles ved direkte peptidsyntese under anvendelse av fastfaseteknikker (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154
(1963)). Proteinsyntese kan utføres ved anvendelse av manuelle teknikker eller ved automatisering. Automatisert syntese kan oppnås for eksempel under anvendelse av Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Eimer). Alternativt kan forskjellige fragmenter syntetiseres kjemisk separat og kombineres under anvendelse av kjemiske metoder for dannelse av molekylet i hel lengde.
IN VIVO-POLYNUKLEOTIDAVGIVELSESTEKNIKKER
Ved ytterligere utførelsesformer innføres genetiske konstruksjoner omfattende ett eller flere av polynukleotidene ifølge oppfinnelsen i celler in vivo. Dette kan oppnås ved anvendelse av hvilken som helst av mange forskjellige velkjente fremgangsmåter, hvorav flere er skissert nedenfor for illustrasjonsformål.
1. ADENOVIRUS
Én av de foretrukne metoder for in vivo-avgivelse av én eller flere nukleinsyresekvenser innbefatter anvendelse av adenovirus-ekspresjonsvektor. "Adenovirus-ekspresjonsvektor" er ment å innbefatte konstruksjoner inneholdende adenovirussekvenser tilstrekkelig til (a) å understøtte innpakning av konstruksjonen, og (b) å uttrykke et polynukleotid som er klonet i den i sense- eller antisenseorientering. I forbindelse med en antisensekonstruksjon fordrer ekspresjon selvfølgelig ikke at genproduktet syntetiseres.
Ekspresjonsvektoren omfatter en genteknologisk konstruert form av et adenovirus. Kunnskap om genetisk organisasjon av adenovirus, et 35 kb, lineært, dobbeltstrenget DNA-virus, muliggjør substitusjon av store stykker adenovirus-DNA med fremmede sekvenser opp til 7 kb (Grunhaus & Horwitz, 1992). I motsetning til retrovirus, resulterer ikke adenovirusinfeksjonen av vertsceller i kromosomintegrasjon på grunn av at adenovirus-DNA kan replikere på episomal måte uten potensiell gentoksisitet. Dessuten er adenovirus strukturelt stabile, og ingen genom-rearrangering er påvist etter omfattende amplifikasjon. Adenovirus kan infisere praktisk talt alle epitelceller uansett deres cellesyklusstadium. Så langt ser det ut til at adenovirusinfeksjon bare er knyttet til mild sykdom så som akutt respiratorisk sykdom hos mennesker.
Adenovirus er spesielt egnet for anvendelse som genoverføringsvektor på grunn av sitt midtstørrelses-genom, sin lettvinte manipulering, høye titer, vide målcelleområde og høye smittsomhet. Begge ender av virusgenomet inneholder 100-200 basepar-inverterte repeteringer (ITR), som er cis-elementer som er nødvendige for virus-DNA-replikasjon og -innpakking. Tidlig- (E) og sen- (L) regionene av genomet inneholder forskjellige transkripsjonsenheter som deles ved igangsetting avvirus-DNA-replikasjon. E1-regionen (E1A og E1B) koder for proteiner som er ansvarlige for regulering av transkripsjon av virusgenomet og noen få cellegener. Ekspresjon av E2-regionen (E2A og E2B) resulterer i syntese av proteinene for virus-DNA-replikasjon. Disse proteiner er involvert i DNA-replikasjon, sen genekspresjon og vertscelle-avstengning (Renan, 1990). Produktene fra sen-genene, innbefattende hovedandelen av viruskapsid-proteinene, uttrykkes først etter signifikant prosessering av et enkelt primært transkript som stammer fra hoved-senpromoteren (MLP). MLP (som befinner seg ved 16,8 m.u..) er spesielt effektiv under den sene fasen av infeksjon, og alle mRNA som stammer fra denne promoter, har en 5'-tredelt leder- (TPL) sekvens som gjør dem til foretrukne mRNA for translasjon.
I et någjeldende system frembringes rekombinante adenovirus ut fra homolog rekombinasjon mellom skyttelvektor og provirusvektor. På grunn av mulig rekombinasjon mellom to provirusvektorer kan villtype-adenovirus frembringes ut fra denne prosess. Det er derfor avgjørende å isolere en enkelt klon av virus fra en individuell plakk og undersøke dens genomstruktur.
Frembringelse og formering av de foreliggende adenovirusvektorer, som er replikasjonsdefekte, avhenger av en unik hjelpercellelinje, betegnet 293, som ble transformert fra humane embryo-nyreceller ved Ad5-DNA-fragmenter og konstitutivt uttrykker E1-proteiner (Graham et al., 1977). Siden E3-regionen kan befris fra adenovirusgenomet (Jones & Schenk, 1978), bærer foreliggende adenovirusvektorer, med hjelp av 293-celler, fremmed DNA i enten E1-, D3- eller begge regioner (Graham & Prevec, 1991). I naturen kan adenovirus pakke inn ca. 105% av villtypegenomet (Ghosh-Choudhury et al., 1987), under tilveiebringelse av kapasitet for ca. 2 ekstra kB DNA. Kombinert med de omtrent 5,5 kB av DNA som kan erstattes i E1- og E3-regionene, er den maksimale kapasitet av den foreliggende adenovirusvektor under 7,5 kB, eller ca. 15% av den totale lengde av vektoren. Mer enn 80% av adenovirus-virusgenomet blir tilbake i vektorskjelettet og er kilden til vektorbåren cytotoksisitet. Dessuten er replikasjonsmangelen av E1-deletert virus ufullstendig. For eksempel er det observert lekkasje av virus-genekspresjon med de for tiden tilgjengelige vektorer ved stor infeksjons-mangeartethet (MOI) (Mulligan, 1993).
Hjelpercellelinjer kan fås fra humane celler så som humane embryo-nyreceller, muskelceller, hematopoietiske celler eller andre humane embryo- mesenkym- eller epitelceller. Alternativt kan hjelpercellene fås fra cellene fra andre pattedyrarter som er tillatt for humant adenovirus. Slike celler innbefatter f.eks. Vero-celler eller andre embryoniske apemesenkym- eller -epitelceller. Som angitt ovenfor, er den for tiden foretrukne hjelpercellelinje 293.
Racher et al (1995) har nylig beskrevet forbedrede metoder for dyrkning av 293-celler og formering av adenovirus. I ett format dyrkes naturlige celleaggregater ved inokulering av individuelle celler i 1 liter silikonbelagte spinnerkolber (Techne, Cambridge, UK) inneholdende 100-200 ml medium. Etter omrøring ved 40 omdr. pr. min., vurderes cellenes levedyktighet med trypanblått. I et annet format anvendes Fibra-Cel-mikrobærere (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 g/l) som følger. Et celleinokulum, gjenoppslemmet i 5 ml medium, tilsettes til bæreren (50 ml) i en 250 ml Erlenmeyerkolbe og blir holdt stasjonært, med leilighetsvis agitasjon, i 1-4 timer. Mediet blir så erstattet med 50 ml friskt medium og risting igangsatt. For virusproduksjon får cellene vokse til ca. 80% konfluens, etter hvilken tid mediet erstattes (til 25% av sluttvolumet), og adenovirus tilsettes ved en MOI på 0,05. Kulturene får være stasjonære natten over, og etter dette økes volumet til 100% og risting fortsettes i ytterligere 72 timer.
Bortsett fra kravet om at adenovirusvektoren skal være replikasjonsdefekt, eller i det minste defekt med visse forbehold, antas det ikke at beskaffenheten av adenovirusvektoren er avgjørende for vellykket utøvelse av oppfinnelsen. Adenoviruset kan ha hvilken som helst av de 42 forskjellige kjente serotyper eller subgrupper A-F. Adenovirus type 5 av subgruppe C er det foretrukne utgangsmateriale for oppnåelse av en, på visse betingelser, replikasjonsdefekt adenovirusvektor for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse, siden adenovirus type 5 er et humant adenovirus om hvilket en stor del biokjemisk og genetisk informasjon er kjent, og det er historisk blitt anvendt for de fleste konstruksjoner som anvender adenovirus som vektor.
Som angitt ovenfor, er den typiske vektor ifølge foreliggende oppfinnelse replikasjonsdefekt og vil ikke ha noen adenovirus-E1-region. Det vil således være mest passende å innføre polynukleotidet som koder for det aktuelle gen, i stillingen fra hvilken de E1-kodende sekvenser er fjernet. Imidlertid er stillingen for innsetting av konstruksjonen i adenovirussekvensene ikke avgjørende for oppfinnelsen. Polynukleotidet som koder for det aktuelle gen, kan også innsettes i stedet for den deleterte E3-region i E3-erstatningsvektorer som beskrevet av Karlsson et al. (1986) eller i E4-regionen hvor en hjelpercellelinje eller hjelpervirus utfyller E4-defekten.
Adenovirus er lette å dyrke og manipulere og viser vid vertsrekkevidde in vitro og in vivo. Denne gruppe virus kan fås i høye titer, f.eks. 10<9->10<11>plakk-dannende enheter pr. ml, og de her meget smittsomme. Adenovirusenes livssyklus fordrer ikke integrering i vertscellegenomet. De fremmede gener som avgis av adenovirusvektorer, er episomale og har derfor lav gentoksisitet overfor vertsceller. Ingen bivirkninger er rapportert i studier i forbindelse med vaksinasjon med villtype-adenovirus (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), noe som viser deres sikkerhet og terapeutiske potensial som in vivo-genoverføringsvektorer.
Adenovirusvektorer er blitt anvendt ved eukaryot genekspresjon (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) og vaksineutvikling (Grunhaus & Horwitz, 1992; Graham & Prevec, 1992). Dyrestudier har nylig tydet på at rekombinante adenovirus kan anvendes for genterapi (Stratford-Perricaudet & Perricaudet, 1991; Startford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Studier angående administrering av rekombinant adenovirus til forskjellige vev innbefatter trachea-instillasjon (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), muskelinjeksjon (Ragot et al., 1993), perifere intravenøse injeksjoner (Herz & Gerard, 1993) og stereotaktisk inokulering i hjernen (Le Gal La Salle et al., 1993).
Adenovirusvektorer kan stamme fra humant adenovirus. Alternativt kan de stamme fra adenovirus av andre arter, f.eks. sjimpanser, noe som kan ha den fordel at virusvektorene ikke nøytraliseres av antistoffer mot adenovirus som sirkulerer hos mange mennesker (se f.eks. Tatsis N et al. (2005), Gene Ther. 1. des.; [Epub før trykking]).
2. RETROVIRUS
Retrovirusene er en gruppe enkeltstrengede RNA-virus kjennetegnet ved evne til å omdanne sitt RNA til dobbeltstrenget DNA i infiserte celler ved en reverstranskripsjonsprosess (Coffin, 1990). Den resulterende DNA blir så stabilt integrert i cellekromosomer som et provirus, og styrer syntesen av virusproteiner. Integreringen resulterer i retensjon av virusgensekvensene i mottakercellen og dens etterkommere. Retrovirusgenomet inneholder tre gener, gag, pol og env, som koder for henholdsvis kapsidproteiner, polymerase-enzym og kappe-komponenter. En sekvens som finnes oppstrøms for gag-genet, inneholder et signal for innpakking av genomet i virioner. To lange terminale gjentatte (LTR) sekvenser er til stede i 5'- og 3'-enden av virusgenomet. Disse inneholder sterke promoter- og forsterkersekvenser og er også nødvendige for integrering i vertscellegenomet (Coffin, 1990).
For konstruering av en retrovirusvektor innsettes en nukleinsyre som koder for én eller flere oligonukleotid- eller polynukleotidsekvenser, i virusgenomet i stedet for visse virussekvenser under frembringelse av et virus som er replikasjonsdefekt. For frembringelse av virioner konstrueres en innpaknings-cellelinje inneholdende gag-, pol- og env-genene, men uten LTR- og innpakningskomponentene (Mann et al., 1983). Når et rekombinant plasmid inneholdende en cDNA, sammen med retrovirus-LTR- og innpakningssekvensene, innføres i denne cellelinje (for eksempel ved kalsiumfosfatutfelling), muliggjør innpakningssekvensen at RNA-transkriptet i det rekombinante plasmid kan innpakkes i viruspartikler, som deretter utskilles i dyrkningsmediet (Nicolas & Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Mediet inneholdende de rekombinante retrovirus blir deretter oppsamlet, eventuelt konsentrert, og anvendt for genoverføring. Retrovirusvektorer er i stand til å infisere mange forskjellige celletyper. Imidlertid fordrer integrasjon og stabil ekspresjon deling av vertsceller (Paskind et al., 1975).
En ny fremgangsmåte utformet til å muliggjøre spesifikk målsøking av retrovirusvektorer er nylig blitt utviklet basert på den kjemiske modifikasjon av et retrovirus ved kjemisk addisjon av laktoserester til viruskappen. Denne modifikasjon kan muliggjøre spesifikk infisering av hepatocytter via sialoglykoproteinreseptorer.
En annen fremgangsmåte for målsøking av rekombinante retrovirus ble utformet, hvor biotinylerte antistoffer mot et retrovirus-kappeprotein og mot en spesifikk cellereseptor ble anvendt. Antistoffene ble koplet via biotinkomponentene ved anvendelse av streptavidin (Roux et al., 1989). Ved anvendelse av antistoffer mot vevstypekompleks ("major histocompatibility complex") klasse I- og klasse II-antigener viste de infisering av forskjellige humane celler som bar disse overflateantigener med et ekotropisk virus in vitro (Roux et al., 1989).
3. ADENO-ASSOSIERTE VIRUS
AAV (Ridgeway, 1988; Hermonat & Muzycska, 1985) er et parovirus, oppdaget som en forurensning av adenovirusbestander. Det er et alle steds nærværende virus (antistoffer finnes i 85% av USA's befolkning) som ikke er blitt knyttet til noen sykdom. Det er også klassifisert som et dependovirus, på grunn av at replikasjonene av det er avhengig av tilstedeværelse av et hjelpervirus, så som adenovirus. Fem serotyper er isolert, hvorav AAV-2 er den best karakteriserte. AAV har et enkeltstrenget lineært DNA som er innelukket i kapsidproteinene VP1, VP2 og VP3 under dannelse av et tjueflatet virion med diameter 20-24 nm (Muzyczka & McLaughlin, 1988).
AAV-DNA haren lengde på omtrent 4,7 kilobaser. Det inneholder to åpne leserammer og er flankert av to ITR. Det er to hovedgener i AAV-genomet: rep og cap. Rep-genet koder for proteiner som er ansvarlige for virusreplikasjoner, mens cap koder for kapsidprotein VP1-3. Hver ITR danner en T-formet hårnålstruktur. Disse terminale gjentatte enheter er de eneste essensielle cis-komponenter i AAV for kromosomal integrasjon. AAV kan derfor anvendes som en vektor med alle viruskodende sekvenser fjernet og erstattet av kassetten av gener for avgivelse. Tre viruspromotere er identifisert og kalt p5, p19 og p40, i henhold til deres kartposisjon. Transkripsjon fra p5 og p19 resulterer i dannelse av rep-proteiner, og transkripsjon fra p40 danner kapsidproteinene (Hermonat & Muzyczka, 1984).
Det er flere faktorer som påvirket forskere til å studere muligheten for å bruke rAAV som ekspresjonsvektor. Én er at betingelsene for avgivelse av et gen for integrering i vertskromosomet, er overraskende få. Det er nødvendig å ha de 145 bp ITR, som bare er 6% av AAV-genomet. Dette gir rom i vektoren for sammensetting av et DNA-innskudd på 4,5 kb. Skjønt denne bærekapasitet kan forhindre AAV i å avgi store gener, er det meget godt egnet for avgivelse av antisensekonstruksjonene ifølge foreliggende oppfinnelse.
AAV er også et godt valg for avgivelse av bærermaterialer, på grunn av sin sikkerhet. Det er en relativt komplisert redningsmekanisme: ikke bare villtype-adenovirus, men også AAV-gener, kreves for mobilisering av rAAV. Likeledes er AAV ikke patogent og ikke forbundet med noen sykdom. Fjerning av viruskodende sekvenser minimaliserer immunreaksjoner overfor virus-genekspresjon, og derfor fremkaller ikke rAAV en inflammatorisk respons.
4. ANDRE VIRUSVEKTORER SOM EKSPRESJONSKONSTRUKSJONER
Andre virusvektorer kan anvendes som ekspresjonskonstruksjoner ved foreliggende oppfinnelse for avgivelse av oligonukleotid- eller polynukleotidsekvenser til en vertscelle. Vektorer som stammer fra virus så som vacciniavirus (Ridgeway, 1988; Couparetal., 1988), lentivirus, poliovirus og herpesvirus, kan anvendes. De gir flere attraktive momenter for forskjellige pattedyrceller (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Couparetal., 1988; Horwich et al., 1990).
Med den nylige oppdagelse av defekte hepatitt B-virus ble det oppnådd ny innsikt i struktur-funksjon-forholdet for forskjellige virussekvenser. In vitro-studier har vist at viruset kunne bibeholde evnen for hjelperavhengig innpakking og revers transkripsjon til tross for delesjonen av opp til 80% av dets genom (Horwich et al., 1990). Dette tydet på at store andeler av genomet kunne erstattes med fremmed genmateriale. Hepatotropismen og vedvarenheten (integrasjonen) var spesielt attraktive egenskaper for leverstyrt genoverføring. Chang et al. (1991) innførte kloramfenikolacetyltransferase-(CAT)-genet i hepatitt B-virus-genom hos and i stedet for de polymerase-, overflate- og pre-overflate-kodende sekvenser. Det ble ko-transfektert med villtypevirus i en fuglehepatom-cellelinje. Dyrkningsmedier inneholdende høye titer av det rekombinante virus ble anvendt til infisering av primære andunge-hepatocytter. Stabil CAT-genekspresjon ble påvist i minst 24 dager etter transfeksjon (Chang et al., 1991).
5. IKKE-VIRUS-VEKTORER
For bevirkning av ekspresjon av oligonukleotid- eller polynukleotidsekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse må ekspresjonskonstruksjonen avgis i en celle. Denne avgivelse kan utføres in vitro, som ved laboratorieprosedyrer for transformering av cellelinjer, eller in vivo eller ex vivo, som ved behandling av visse sykdomstilstander. Som beskrevet ovenfor, er én foretrukket mekanisme for avgivelse via virusinfeksjon hvor ekspresjonskonstruksjonen er innkapslet i en infeksiøs viruspartikkel.
Straks ekspresjonskonstruksjonen er avgitt i cellen, kan nukleinsyren som koder for de ønskede oligonukleotid- eller polynukleotidsekvenser, anbringes og uttrykkes på forskjellige steder. Ved noen utførelsesformer kan nukleinsyren som koder for konstruksjonen, stabilt integreres i cellens genom. Denne integrering kan være på det spesifikke sted og i den spesifikke orientering via homolog rekombinasjon (generstatning), eller den kan integreres i en tilfeldig, ikke-spesifikk lokasjon (genøkning). Ved enda ytterligere utførelsesformer kan nukleinsyren stabilt opprettholdes i cellen som et separat, episomalt segment av DNA. Slike nukleinsyre-segmenter eller "episomer" koder for sekvenser som er tilstrekkelige til å muliggjøre opprettholdelse og replikasjon uavhengig av, eller i synkronisering med, vertscellesyklusen. Hvordan ekspresjonskonstruksjonen avgis til en celle, og hvor i cellen nukleinsyren blir værende, er avhengig av typen ekspresjons-konstruksjon som anvendes.
Ved noen utførelsesformer av oppfinnelsen kan ekspresjonskonstruksjonen omfattende én eller flere oligonukleotid- eller polynukleotidsekvenser ganske enkelt bestå av ren rekombinant DNA eller plasmider. Overføring av konstruksjonen kan utføres ved hjelp av hvilken som helst av metodene nevnt ovenfor som fysisk eller kjemisk trenger gjennom cellemembranen. Dette er spesielt anvendbart for overføring in vitro, men det kan også gjelde in vivo-anvendelse. Dubensky et al. (1984) injiserte med hell polyomvirus-DNA i form av kalsiumfosfatutfelninger i lever og milt hos voksne og nyfødte mus, noe som viste aktiv virusreplikasjon og akutt infeksjon. Benvenisty & Reshef (1986) viste også at direkte intraperitoneal injeksjon av kalsiumfosfat-utfelte plasmider resulterer i ekspresjon av de transfekterte gener. Man forestiller seg at DNA som koder for et aktuelt gen, også kan overføres på liknende måte in vivo og uttrykke genproduktet.
En annen utførelsesform av oppfinnelsen for overføring av en ren DNA-ekspresjonskonstruksjon i celler kan innbefatte partikkelbombardement. Denne metoden er basert på evnen til å akselerere DNA-belagte mikroprosjektiler til en høy hastighet, hvorved de får trenge gjennom cellemembraner og komme inn i celler uten å drepe dem (Klein et al., 1987). Flere innretninger for akselerering av små partikler er utviklet. Én slik innretning er basert på høy spenningsutladning under frembringelse av en elektrisk strøm, som i sin tur tilveiebringer den drivende kraft (Yang et al., 1990). Mikroprosjektilene som anvendes, har bestått av biologisk inerte substanser så som wolfram- eller gullkorn.
Utvalgte organer innbefattende lever, hud og muskelvev hos rotter og mus er blitt bombardert in vivo (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Dette kan fordre kirurgisk eksponering av vevet eller cellene, for eliminering av eventuelt intervenerende vev mellom innskytingen og målorganet, dvs. ex vivo-behandling. Igjen kan en DNA som koder for et spesielt gen, avgis via denne metode og fremdeles være innbefattet i foreliggende oppfinnelse.
POLYPEPTIDPREPARATER
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer ved andre aspekter polypeptidpreparater. Generelt vil et polypeptid ifølge oppfinnelsen være et isolert polypeptid (eller en epitop, variant eller aktivt fragment derav) som stammer fra en pattedyrart. Polypeptidet kodes fortrinnsvis av en polynukleotidsekvens beskrevet her i dokumentet, eller en sekvens som hybridiserer under moderat stringente betingelser til en polynukleotidsekvens beskrevet her i dokumentet. Alternativt kan polypeptidet defineres som et polypeptid som omfatter en sammenhengende aminosyresekvens fra en aminosyresekvens beskrevet her i dokumentet, eller hvilket polypeptid omfatter en hel aminosyresekvens beskrevet her i dokumentet.
Immunogene deler kan generelt identifiseres ved anvendelse av velkjente teknikker, så som dem som er oppsummert i Paul, Fundamental Immunology, 3.
utg., 243-247 (1993) og referanser angitt der. Slike teknikker innbefatter screening av polypeptider med henblikk på evnen til å reagere med antispesifikke antistoffer, antisera og/eller T-cellelinjer eller -kloner. Slik det er anvendt her i dokumentet, er antisera og antistoffer "antigenspesifikke" hvis de spesifikt bindes til et antigen
(dvs. at de reagerer med proteinet i en ELISA eller annen immunanalyse, og ikke reagerer påvisbart med ikke-beslektede proteiner). Slike antisera og antistoffer kan frembringes som beskrevet her i dokumentet, og under anvendelse av velkjente teknikker. En immunogen del av et Mycobacterium sp.-protein er en del som reagerer med slike antisera og/eller T-celler i et nivå som ikke er noe vesentlig lavere enn reaktiviteten av polypeptidet i hel lengde (f.eks. i en ELISA-og/eller T-celle-reaktivitetsanalyse). Slike immunogene deler kan reagere i slike analyser i et nivå som er likt eller større enn reaktiviteten av polypeptidet i hel lengde. Slike screeninger kan generelt utføres under anvendelse av metoder som er velkjente for vanlige fagfolk på området, så som dem beskrevet i Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988) og Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998). For eksempel kan et polypeptid immobiliseres på en fast bærer og bringes i kontakt med pasientsera under muliggjøring av binding av antistoffer i seraene til det immobiliserte polypeptid. Ubundne sera kan deretter fjernes og
bundne antistoffer påvises under anvendelse av for eksempel 125l-merket protein
A.
Polypeptider kan frembringes under anvendelse av hvilken som helst av forskjellige velkjente teknikker. Rekombinante polypeptider som kodes for av DNA-sekvenser som beskrevet ovenfor, kan lett frembringes ut fra DNA-sekvensene under anvendelse av hvilken som helst av forskjellige ekspresjonsvektorer kjent for vanlige fagfolk på området. Ekspresjon kan oppnås i hvilken som helst hensiktsmessig vertscelle som er transformert eller transfektert med en ekspresjonsvektor inneholdende et DNA-molekyl som koder for et rekombinant polypeptid. Egnede vertsceller innbefatter prokaryote celler, gjærceller og høyere eukaryote celler, så som pattedyrceller og planteceller. De anvendte vertsceller er fortrinnsvis E. coli, gjærsopp eller en pattedyr-cellelinje så som COS eller CHO. Supernatanter fra egnede vert/vektor-systemer som utskiller rekombinant protein eller polypeptid til dyrkningsmedier, kan først konsentreres under anvendelse av et kommersielt tilgjengelige filter. Etter konsentrering kan konsentratet påsettes på en egnet rensematriks så som en affinitetsmatriks eller en ionebytterharpiks. Endelig kan det anvendes ett eller flere reversfase-HPCL-trinn for ytterligere rensning av et rekombinant polypeptid.
Polypeptider ifølge oppfinnelsen, immunogene fragmenter derav og andre varianter med mindre enn ca. 100 aminosyrer, og generelt mindre enn ca. 50 aminosyrer, kan også frembringes syntetisk under anvendelse av teknikker som er velkjente for vanlige fagfolk på området. Slike polypeptider kan for eksempel syntetiseres under anvendelse av hvilken som helst av de kommersielt tilgjengelige fastfaseteknikker, så som Merrifield fastfasesyntesemetoden, hvor aminosyrer sekvensielt tilføyes til en voksende aminosyrekjede. Se Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146 (1963). Utstyr for automatisert syntese av polypeptider er kommersielt tilgjengelig fra leverandører så som Perkin Eimer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA) og kan opereres i henhold til fabrikantens instruksjoner.
Innenfor visse spesifikke utførelsesformer kan et polypeptid være et fusjonsprotein som omfatter multiple polypeptider som beskrevet her i dokumentet, eller som omfatter minst ett polypeptid som beskrevet her, og en ikke-beslektet sekvens, så som et kjent tumorprotein. En fusjonspartner kan for eksempel understøtte tilveiebringelse av T-hjelper-epitoper (en immunologisk fusjons partner), fortrinnsvis T-hjelper-epitoper som gjenkjennes av mennesker, eller den kan understøtte ekspresjon av proteinet (en ekspresjonsforsterker) i høyere utbytter enn det native rekombinante protein. Visse foretrukne fusjonspartnere er både immunologiske og ekspresjonsforsterkende fusjonspartnere. Andre fusjonspartnere kan velges for økning av proteinets solubilitet eller for å sette proteinet i stand til å kunne målrettes mot ønskede intracellulære kamre. Enda ytterligere fusonspartnere innbefatter affinitetsmerkesubstanser, som gjør rensning av proteinet lettere.
Fusjonsproteiner kan vanligvis frembringes ved anvendelse av standardteknikker, innbefattende kjemisk konjugering. Et fusjonsprotein uttrykkes fortrinnsvis som et rekombinant protein, noe som muliggjør frembringelse av økte nivåer, i forhold til et ikke-sammensmeltet protein, i et ekspresjonssystem. Kort angitt kan DNA-sekvenser som koder for polypeptidkomponentene, settes sammen separat og ligeres i en passende ekspresjonsvektor. 3'-Enden av DNA-sekvensen som koder for én polypeptidkomponent, ligeres, med eller uten en peptidlinker, til 5'-enden av en DNA-sekvens som koder for den andre polypeptidkomponent slik at leserammene for sekvensene er i fase. Dette muliggjør translasjon til et enkelt fusjonsprotein som bibeholder den biologiske aktivitet av begge komponent-polypeptider.
En peptidlinkersekvens kan anvendes til separering av den første og andre polypeptidkomponent til en avstand tilstrekkelig til å sikre at hvert polypeptid foldes til sin sekundære og tertiære struktur. En slik peptidlinkersekvens innlemmes i fusjonsproteinet under anvendelse av standardteknikker som er velkjente på området. Egnede peptidlinkersekvenser kan velges basert på følgende faktorer: (1) sin evne til innta en fleksibel utvidet konformasjon; (2) sin manglende evne til å innta en sekundærstruktur som kan interagere med funksjonelle epitoper på det første og andre polypeptid; og (3) mangel på hydrofobe eller ladede rester som kan reagere med de polypeptid-funksjonelle epitoper. Foretrukne peptidlinkersekvenser inneholder Gly-, Asn- og Ser-rester. Andre nær nøytrale aminosyrer, så som Thr og Ala, kan også anvendes i linkersekvensen. Aminosyresekvenser som er nyttige som linkere, innbefatter dem som er beskrevet i Maratea et al., Gene 40:39-46 (1985); Murphy et al. Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 83:8258-8262 (1986); US-patent nr. 4 935 233 og US-patent nr. 4 751 180. Linkersekvensen kan generelt ha en lengde på fra 1 til ca. 50 aminosyrer. Linkersekvenser trenges ikke når det første og andre polypeptid har ikke-essensielle N-terminale aminosyreregioner som kan anvendes til å separere de funksjonelle doméner og forhindre sterisk interferens.
De ligerte DNA-sekvenser er operabelt bundet til egnede transkripsjonene eller translasjonene regulatorelementer. Regulatorelementene som er ansvarlige for ekspresjon av DNA, befinner seg bare 5' i forhold til DNA-sekvensen som koder for de første polypeptider. Likeledes er stoppkodoner som trenges for å avslutte translasjons- og transkripsjonstermineringssignaler, bare til stede 3' i forhold til DNA-sekvensen som koder for det annet polypeptid.
Fusjonsproteiner er også tilveiebrakt. Slike proteiner omfatter et polypeptid som beskrevet her i dokumentet, sammen med et ikke-beslektet immunogent protein. Det immunogene protein er fortrinnsvis i stand til å fremkalle en erindringsrespons. Eksempler på slike proteiner innbefatter tetanus-, tuberkulose-og hepatittproteiner (se f.eks. Stoute et al, New Engl. J. Med. 336:86-91 (1997)).
Innenfor foretrukne utførelsesformer stammer en immunologisk fusjonspartner fra protein D, et overflateprotein av den gramnegative bakterie Haemophilus influenza B (WO 91/18926). Et protein D-derivat omfatter fortrinnsvis omtrent den første tredjedel av proteinet (f.eks. de første N-terminale 100-110 aminosyrer), og et protein D-derivat kan lipideres. Innenfor visse foretrukne utførelsesformer inngår de første 109 rester i en lipoprotein D-fusjonspartner på den N-terminale ende under tilveiebringelse av polypeptidet med ytterligere eksogene T-celle-epitoper og økning av ekspresjonsnivået i E. coli (hvorved det funksjonerer som en ekspresjonsforsterker). Lipidhalen sikrer optimal presentasjon av antigenet for antigenpresenterende celler. Andre fusjonspartnere innbefatter det ikke-strukturelle protein fra influensavirus, NS1 (hemagglutinin). Typisk anvendes de N-terminale 81 aminosyrer, skjønt forskjellige fragmenter som innbefatter T-hjelper-epitoper kan anvendes.
Ved en annen utførelsesform er den immunologiske fusjonspartner proteinet kjent som LYTA, eller en del derav (fortrinnsvis en C-terminal del). LYTA stammer fra Streptococcus pneumoniae, som syntetiserer en N-acetyl-L-alanin-amidase kjent som amidase LYTA (som kodes for av LytA-genet; Gene 43:265-292 (1986)). LYTA er et autolysin som spesifikt bryter ned visse bindinger i peptidoglykanskjelettet. Det C-terminale doméne av LYTA-proteinet er ansvarlig for affiniteten til cholinet eller til noen cholinanaloger så som DEAE. Denne egenskap er blitt utforsket med henblikk på utvikling av E. coli C-LYTA-ekspresjonsplasmider som er anvendelige for ekspresjon av fusjonsproteiner. Rensning av hybridproteiner inneholdende C-LYTA-fragmentet i den aminoterminale ende er beskrevet (se Biotechnology 10:795-798 (1992)). Innenfor en foretrukket utførelsesform kan en gjentatt del av LYTA innlemmes i et fusjonsprotein. En gjentatt del finnes i den C-terminale region som starter ved rest 178. En spesielt foretrukket gjentatt del innlemmer restene 188-305.
Vanligvis blir polypeptider (innbefattende fusjonsproteiner) og polynukleotider som beskrevet her i dokumentet, isolert. Et "isolert" polypeptid eller polynukleotid er ett som er fjernet fra sitt opprinnelige miljø. For eksempel er et naturlig forekommende protein isolert hvis det er skilt fra en del av eller alle de sam-eksisterende materialer i det naturlige system. Slike polypeptider er fortrinnsvis minst ca. 90% rene, mer foretrukket minst ca. 95% rene og mest foretrukket minst ca. 99% rene. Et polynukleotid anses for å være isolert hvis det for eksempel er klonet i en vektor som ikke er en del av det naturlige miljø.
T-CELLER
Immunterapeutiske preparater kan også, eller alternativt, omfatter T-celler som er spesifikke for et Mycobacterium-antigen. Slike celler kan generelt frembringes in vitro eller ex vivo, under anvendelse av standardprosedyrer. For eksempel kan T-celler isoleres fra benmarg, perifert blod eller en fraksjon av benmarg eller perifert blod fra en pasient, under anvendelse av et kommersielt tilgjengelig celleseparasjonssystem, så som lsolex™-systemet, som leveres av Nexell Therapeutics, Inc. (Irvine, CA; se også US-patent nr. 5 240 856; US-patent nr. 5 215 926; WO 89/06280; WO 91/16116 og WO 92/07243). Alternativt kan T-celler stamme fra beslektede eller ikke-beslektede mennesker, ikke-humane pattedyr, cellelinjer eller kulturer.
T-celler kan stimuleres med et polypeptid ifølge oppfinnelsen, polynukleotid som koder for et slikt polypeptid, og/eller en antigenpresenterende celle (APC) som uttrykker et slikt polypeptid. Slik stimulering utføres under betingelser og i et tidsrom tilstrekkelig til å muliggjøre frembringelse av T-celler som er spesifikke for polypeptidet. Polypeptidet eller polynukleotidet er fortrinnsvis til stede i en avgivelsesbærer, så som en mikrokule, for å gjøre dannelsen av spesifikke T-celler lettere.
T-celler anses for å være spesifikke for et polypeptid ifølge oppfinnelsen hvis T-cellene spesifikt prolifererer, utskiller cytokiner eller dreper målceller som er belagt med polypeptidet, eller som uttrykker et gen som koder for polypeptidet. T-celle-spesifisitet kan evalueres under anvendelse av hvilken som helst av mange forskjellige standardteknikker. Ved en kromfrigjøringsanalyse eller proliferasjons-analyse indikerer for eksempel en stimuleringsindeks på mer enn to gangers økning i lyse og/eller proliferasjon, sammenliknet med negative kontroller, T-celle-spesifisitet. Slike analyser kan for eksempel utføres som beskrevet i Chen et al. Cancer Res. 54:1065-1070 (1994)). Alternativt kan deteksjon av proliferasjon av T-celler utføres ved mange forskjellige kjente teknikker. For eksempel kan T-celle-proliferasjon detekteres ved måling av en øket hastighet av DNA-syntese (f.eks. ved pulsmerking av kulturer av T-celler med tritiert thymidin og måling av mengden av tritiert thymidin som er inkorporert i DNA). Kontakt med et polypeptid ifølge oppfinnelsen (100 ng/ml -100ug/ml, fortrinnsvis 200 ng/ml - 25 ug/ml) i 3-7 dager bør resultere i minst en to gangers økning i proliferasjon av T-cellene. Kontakt som beskrevet ovenfor i 2-3 timer bør resultere i aktivering av T-cellene, målt ved anvendelse av standard-cytokinanalyser hvor en to gangers økning i nivået av cytokinfrigjøring (f.eks. TNF eller IFN-y) er et tegn på T-celle-aktivering (se Coligan et al, Current Protocols in Immunology, vol. 1 (1998)). T-celler som er aktivert som svar på et polypeptid, polynukleotid eller polypeptid-uttrykkende APC, kan være CD4<+>og/eller CD8<+>. Proteinspesifikke T-celler kan ekspanderes under anvendelse av standardteknikker. Innenfor foretrukne utførelsesformer fås T-cellene fra en pasient, en beslektet donor eller en ikke-beslektet donor, og administreres til pasienten etter stimulering og ekspansjon.
For terapeutiske formål kan CD4<+->eller CD8<+->T-celler som prolifererer som respons overfor et polypeptid, polynukleotid eller APC, ekspanderes i antall enten in vitro eller in vivo. Proliferasjon av slike T-celler in vitro kan utføres på mange forskjellige måter. For eksempel kan T-cellene eksponeres på nytt for et polypeptid, eller et kort peptid svarende til en immunogen del av et slikt polypeptid, med eller uten tilsetning av T-celle-vekstfaktorer, så som interleukin-2, og/eller stimulatorceller som syntetiserer et polypeptid. Alternativt kan én eller flere T-celler som prolifererer i nærvær av et protein, ekspanderes i antall ved kloning. Metoder for kloning av celler er velkjente på området og innbefatter
begrensningsfortynning.
FARMASØYTISKE PREPARATER
Ved ytterligere utførelsesformer angår foreliggende oppfinnelse formulering av ett eller flere av polynukleotidet, polypeptidet, T-cellen, antistoffet og de kjemoterapeutiske preparater beskrevet her i dokumentet i farmasøytisk akseptable løsninger for administrering til en celle eller et dyr, enten alene eller i kombinasjon med én eller flere andre behandlingsmodaliteter.
Det vil også være underforstått at, hvis ønskelig, kan nukleinsyre-segmentet (f.eks. RNA eller DNA) som uttrykker et polypeptid som beskrevet her i dokumentet, også administreres i kombinasjon med andre midler, så som f.eks. andre proteiner eller polypeptider eller forskjellige farmasøytisk aktive midler, innbefattende kjemoterapeutiske midler som er effektive overfor en M. tuberculosis-infeksjon. Faktisk er det praktisk talt ingen grense for andre komponenter som også kan innlemmes, under forutsetning av at de ytterligere midler ikke forårsaker noen betydelig uheldig virkning ved kontakt med målcellene eller vertsvevene. Preparatene kan således avgis sammen med forskjellige andre midler etter behov i det spesielle tilfelle. Slike preparater kan renses fra vertsceller eller andre biologiske kilder, eller de kan alternativt syntetiseres kjemisk som beskrevet her i dokumentet. Likeledes kan slike preparater videre omfatte substituerte eller derivatiserte RNA- eller DNA-preparater.
Formulering av farmasøytisk akseptable tilsetningsmidler og bærerløsninger er velkjent for fagfolk på området, og likeledes utvikling av egnede doserings- og behandlingsregimer for anvendelse av de spesielle preparatene beskrevet her i dokumentet i mange forskjellige behandlingsregimer, innbefattende f.eks. oral, parenteral, intravenøs, intranasal og intramuskulær administrering og formulering. Formuleringer omfattende en terapeutisk effektiv mengde avgir typisk fra ca. 2ug til ca. 50ug Mtb72f-polypeptid pr. administrering, mer typisk fra ca. 5 u.g til ca. 40 ug Mtb72f-polypeptid pr. administrering.
1. ORAL AVGIVELSE
Ved visse anvendelser kan de farmasøytiske preparatene beskrevet her i dokumentet avgis ved oral administrering til et dyr. Som sådanne kan disse preparater utformes med et inert fortynningsmiddel eller med en assimilerbar spiselig bærer, eller de kan innelukkes i gelatinkapsler med hardt eller mykt skall, eller de kan komprimeres til tabletter, eller de kan innlemmes direkte i maten i dietten.
De aktive forbindelser kan til og med innlemmes med tilsetningsmidler og anvendes i form av inntakbare tabletter, bukkaltabletter, pastiller, kapsler, eliksirer, suspensjoner, sirup, kjeks og liknende (Mathiowitz et al, 1997; Hwang et al, 1998; US-patent nr. 5 641 515; US-patent nr. 5 580 579 og US-patent nr. 5 792 451, hver i sin helhet spesifikt medtatt her i dokumentet som referanse). Tablettene, pastillene, pillene, kapslene og liknende kan også inneholde følgende: et bindemiddel, så som tragantgummi, akasie, maisstivelse eller gelatin; tilsetningsmidler, så som dikalsiumfosfat; et desintegreringsmiddel, så som maisstivelse, potetstivelse, alginsyre og liknende; et glattemiddel, så som magnesiumstearat; og et søtningsmiddel, så som sakkarose, laktose eller sakkarin, kan tilsettes, eller et smaksmiddel, så som peppermynte, vintergrønt-olje eller kirsebær-smaksmiddel. Når en doseringsenhetsform er en kapsel, kan den, i tillegg til materialer av ovennevnte type, inneholde en flytende bærer. Forskjellige andre materialer kan være til stede som belegg eller for på annen måte å modifisere doseringsenhetens fysiske form. For eksempel kan tabletter, piller eller kapsler belegges med skjellakk, sukker eller begge. En sirup eller eliksir kan inneholde den aktive forbindelse sakkarose som søtningsmiddel, metyl- og propylparabener som konserveringsmidler, et fargestoff og smaksmiddel, så som kirsebær- eller appelsinsmaksmiddel. Selvfølgelig bør et hvert materiale som anvendes ved tilberedning av en doseringsenhetsform, være farmasøytisk rent og hovedsakelig ikke-toksisk i de anvendte mengder. I tillegg kan de aktive forbindelser innlemmes i preparater og formuleringer med langvarig frigjøring.
Disse formuleringer inneholder vanligvis typisk mellom 2 ug og 50 ug Mtb72f-polypeptid. Selvfølgelig kan mengden av aktiv(e) forbindelse(r) i hvert terapeutisk anvendelig preparat tilberedes på en slik måte at en egnet dose vil oppnås i en hver gitt enhetsdose av forbindelsen. Faktorer så som løselighet, biotilgjengelighet, biologisk halveringstid, administreringsvei, produktholdbarhet samt andre farmakologiske hensyn vil bli overveid av fagfolk på området som omfatter tilberedning av slike farmasøytiske formuleringer, og som sådanne kan mange forskjellige doseringer og behandlingsregimener være ønskelige.
For oral administrering kan preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse alternativt innnlemmes med ett eller flere tilsetningsmidler i form av en munnskyllevæske, tannkrem, bukkaltablett, oralspray eller sublingval oralt administrert formulering. En munnskyllevæske kan foreksempel tilberedes under innlemming av den aktive bestanddel i den fordrede mengde i et passende løsningsmiddel, så som natriumboratløsning (Dobells løsning). Alternativt kan den aktive bestanddel innlemmes i en oralløsning så som én som inneholder natriumborat, glycerol og kaliumbikarbonat, eller dispergeres i en tannkrem, eller tilsettes i en terapeutisk effektiv mengde til et preparat som kan innbefatte vann, bindemidler, slipemidler, smaksmidler, skummingsmidler og fuktemidler. Alternativt kan preparatene utformes til en tablett- eller løsningsform som kan anbringes under tungen eller på annen måte oppløses i munnen.
2. INJISERBAR AVGIVELSE
Under visse forhold vil det være ønskelig å avgi de farmasøytiske preparater beskrevet her i dokumentet parenterealt, intravenøst, intramuskulært eller til og med intraperitonealt som beskrevet i US-patent nr. 5 543 158; US-patent nr. 5 641 515 og US-patent nr. 5 399 363 (hvert i sin helhet spesifikt medtatt her i dokumentet som referanse). Løsninger av de aktive forbindelser som fri base eller farmakologisk akseptable salter kan tilberedes i vann passende blandet med et overflateaktivt middel, så som hydroksypropylcellulose. Dispersjoner kan også tilberedes i glycerol, flytende polyetylenglykoler og blandinger derav og i oljer. Under vanlige betingelser for lagring og anvendelse inneholder disse preparater et konserveringsmiddel for forhindring av vekst av mikroorganismer.
De farmasøytiske former egnet for injiserbar anvendelse innbefatter sterile vandige løsninger eller dispersjoner og sterile pulver for improvisert tilberedning av sterile injiserbare løsninger eller dispersjoner (US-patent nr. 5 466 468, i sin helhet spesifikt medtatt her i dokumentet som referanse). I alle tilfeller må formen være steril, og den må være fluid i et slikt omfang at den lett kan sprøytes. Den må være stabil under betingelsene for fremstilling og lagring, og må være konservert mot den forurensende virkning av mikroorganismer, så som bakterier og sopp. Bæreren kan være et løsningsmiddel eller dispergeringsmedium inneholdende for eksempel vann, eteanol, polyol (f.eks. glycerol, propylenglykol og flytende polyetylenglykol, og liknende), egnede blandinger av disse, og/eller vegetabilske oljer. Riktig fluiditet kan for eksempel opprettholdes ved anvendelse av et belegg, så som lecitin, ved opprettholdelse av den fordrede partikkelstørrelse når det gjelder dispersjon, og ved anvendelse av overflateaktive midler. Forhindring av virkningen av mikro-organismer kan gjøres lettere ved forskjellige antibakterielle midler og antisoppmidler, for eksempel parabener, klorbutanol, fenol, sorbinsyre, timerosal og liknende. I mange tilfeller vil det være foretrukket å innlemme isotoniske midler, for eksempel sukkerarter eller natriumklorid. Langvarig absorpsjon av det injiserbare preparater kan tilveiebringes ved anvendelse i preparatene av midler som forsinker absorpsjonen, for eksempel aluminium-monostearat og gelatin.
For parenteral administrering i for eksempel en vandig løsning bør løsningen være passende bufret, hvis nødvendig, og det flytende fortynningsmiddel først gjort isotonisk med tilstrekkelig saltløsning eller glukose. Disse spesielle vandige løsninger er spesielt egnet for intravenøs, intramuskulær, subkutan og intraperitoneal administrering. I denne forbindelse vil et sterilt vandig medium som kan anvendes, være kjent for fagfolk på området i lys av foreliggende beskrivelse. Én dose kan for eksempel oppløses i 1 ml isoton NaCI-løsning og enten tilsettes til 1000 ml hypodermoclysis-fluid eller injiseres på det foreslåtte infusjonssted (se f.eks. Remington' s Pharmaceutical Sciences, 15. utgave, s. 1035-1038 og 1570-1580). En viss variasjon i dosering vil nødvendigvis forekomme avhengig av tilstanden for individet som behandles. Personen som er ansvarlig for administrering, vil under alle omstendigheter bestemme den passende dose for det individuelle individ. For administrering til mennesker bør preparatene videre oppfylle sterilitets-, pyrogenitets- og generelle sikkerhets- og renhetsstandarder ifølge krav i henhold til FDA Office of Biologics-standarder.
Sterile injiserbare løsninger tilberedes ved innlemming av de aktive forbindelser i den fordrede mengde i et passende løsningsmiddel med forskjellige av de andre bestanddeler oppregnet ovenfor, etter behov, fulgt av sterilfiltrering. Vanligvis tilberedes dispersjoner ved innlemming av de forskjellige steriliserte aktive bestanddeler i et sterilt bærermateriale som inneholder basis-dispersjonsmediet og de fordrede andre bestanddeler blant dem som er oppregnet ovenfor. Når det gjelder sterile pulver for tilberedning av sterile injiserbare løsninger, er de foretrukne tilberedningsmetoder vakuumtørkings- og frysetørkingsteknikker som gir et pulver av den aktive bestanddel pluss en eventuell ytterligere ønsket bestanddel fra en på forhånd sterilfiltrert løsning av disse.
Preparatene beskrevet her i dokumentet kan formuleres i nøytral form eller saltform. Farmasøytisk akseptable salter innbefatter syreaddisjonssaltene (dannet med de frie aminogrupper på proteinet), og som er dannet med uorganiske syrer så som for eksempel saltsyre eller fosforsyre, eller slike organiske syrer som eddiksyre, oksalsyre, vinsyre, mandelsyre og liknende. Salter dannet med de frie karboksylgrupper kan også fås fra uorganiske baser så som for eksempel natrium-, kalium-, ammonium-, kalsium- eller ferrihydroksider, og organiske baser så som isopropylamin, trimetylamin, histidin, prokain og liknende. Ved formulering vil løsninger bli administrert på en måte som er kompatibel med dose-formuleringen og i en mengde som er terapeutisk effektiv. Formuleringene administreres lett i mange forskjellige doseringsformer så som injiserbare løsninger, medikament-frigjørende kapsler og liknende.
Anvendt her i dokumentet innbefatter "bærer" hvilke som helst og alle løsningsmidler, dispergeringsmedier, bærermaterialer, belegg, fortynningsmidler, antibakterielle og antisoppmidler, isotoniske og absorpsjonsforsinkende midler, buffere, bærerløsninger, suspensjoner, kolloider og liknende. Anvendelse av slike medier og midler for farmasøytisk aktive substanser er velkjent på området. Bortsett fra for så vidt som et eventuelt konvensjonelt medium eller middel er inkompatibelt med den aktive bestanddel, er dets anvendelse i de terapeutiske preparater påtenkt. Supplerende aktive bestanddeler kan også innlemmes i preparatene.
Uttrykket "farmasøytisk akseptabel" angir molekylære enheter og preparater som ikke frembringer en allergisk eller liknende uheldig reaksjon ved
administrering til et menneske. Tilberedning av et vandig preparat som inneholder et protein som aktiv bestanddel, er velkjent på området. Slike preparater tilberedes typisk som injiserbare preparater, enten som flytende løsninger eller suspensjoner; faste former egnet for løsing i, eller suspendering i, væske før injeksjon kan også tilberedes. Preparatet kan også emulgeres.
3. NESE- OG KINNAVGIVELSE
Ved noen utførelsesformer kan de farmasøytiske preparater avgis ved intranasale sprayer, bukkalsprayer, inhalasjon og/eller andre aerosolavgivelses- bærermaterialer. Metoder for avgivelse av gener, nukleinsyrer og peptidpreparater direkte til lungene f.eks. via nasale og bukkale aerosolsprayer er beskrevet f.eks. i US-patent nr. 5 756 353 og US-patent nr. 5 804 212 (hvert i sin helhet spesifikt medtatt her i dokumentet som referanse). Likeledes er avgivelse av medikamenter ved anvendelse av intranasale mikropartikkelharpikser (Takenga et al, 1998) og lysofosfatidyl-glycerol-forbindelser (US-patent nr. 5 725 871, spesifikt medtatt i sin helhet her i dokumentet som referanse) også velkjent på de farmasøytiske områder. Likeledes er transmukosal medikamentavgivelse i form av en polytetrafluoretylen-bærermatriks beskrevet i US-patent nr. 5 780 045 (i sin helhet spesifikt medtatt her i dokumentet som referanse).
4. LIPOSOM-, NANOKAPSEL- OG MIKROPARTIKKEL-MEDIERT
AVGIVELSE
Ved noen utførelsesformer påtenker oppfinnerne anvendelse av liposomer, nanokapsler, mikropartikler, mikrokuler, lipidpartikler, vesikler og liknende for innføring av preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse i egnede vertsceller. Preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan spesielt formuleres for avgivelse enten innkapslet i en lipidpartikkel, et liposom, en vesikkel, en nanokule eller en nanopartikkel eller liknende.
Slike formuleringer kan være foretrukket for innføring av farmasøytisk akseptable formuleringer av nukleinsyrene eller konstruksjonene beskrevet her i dokumentet. Dannelse og anvendelse av liposomer er generelt kjent for fagfolk på området (se for eksempel Couvreur et al, 1977; Couvreur, 1988; Lasic, 1998; som beskriver anvendelse av liposomer og nanokapsler i målsøkings-antibiotika-behandlingen av intracellulære bakterielle infeksjoner og sykdommer). Det er nylig utviklet liposomer med forbedret serumstabilitet og sirkulasjons-halveringstider (Gabizon & Papahadjopoulos, 1988; Allen og Choun, 1987; US-patent nr. 5 741 516, spesifikt medtatt i sin helhet her i dokumentet som referanse). Forskjellige metoder for liposom- og liposomliknende tilberedninger som potensielle medikamentbærere er videre omtalt (Takakura, 1998; Chandran et al, 1997; Margalit, 1995; US-patent nr. 5 567 434; US-patent nr. 5 552 157; US-patent nr. 5 565 213; US-patent nr. 5 738 868 og US-patent nr. 5 795 587, hvert spesifikt medtatt i sin helhet her i dokumentet som referanse).
Liposomer er anvendt med hell med en rekke celletyper som normalt er resistente overfor transfeksjon ved andre prosedyrer innbefattende T-celle-suspensjoner, primære hepatocyttkulturer og PC12-celler (Renneisen et al, 1990; Muller et al, 1990). Dessuten er liposomer fri for DNA-lengdetvingningene som er typiske for virusbaserte avgivelsessystemer. Liposomer er blitt anvendt effektivt for innføring av gener, medikamenter (Heath & Martin, 1986; Heath et al, 1986; Balazsovits et al, 1989; Fresta & Puglisi, 1996), radioterapeutiske midler (Pikul et al, 1987), enzymer (Imaizumi et al, 1990a; (Imaizumi et al, 1990b), virus (Faller & Baltimore, 1984), transkripsjonsfaktorer og allosteriske effektorer (Nicolau & Gersonde, 1979) i mange forskjellige dyrkede cellelinjer og dyr. Dessuten er det påtenkt flere vellykkede kliniske forsøk med undersøkelse av effektiviteten av liposom-mediert medikamentavgivelse (Lopez-Berestein et al, 1985a; 1985b; Coune, 1988; Sculier et al, 1988): Videre tyder flere studier på at anvendelse av liposomer ikke er forbundet med autoimmune responser, toksisitet eller gonadal lokalisasjon etter systemisk avgivelse (Mori & Fukatsu, 1992).
Liposomer dannes ut fra fosfolipider som er dispergert i et vandig medium og spontant danner multilamellære konsentriske tolagsvesikler (også betegnet multilamellære vesikler (MLV). MLV har vanligvis diametere på fra 25 nm til 4 nm. Sonikering av MLV resulterer i dannelse av små unilamellære vesikler (SUV) med diameter i området fra 200 til 500 Å, inneholdende en vandig løsning i kjernen.
Liposomer har likhet med cellulære membraner og er påtenkt for anvendelse i forbindelse med foreliggende oppfinnelse som bærere for peptidpreparatene. De er meget godt egnet siden både vann- og lipidløselige substanser kan innfanges, dvs. henholdsvis i de vandige rom i selve bilaget. Det er mulig at de medikament-bærende liposomer til og med kan anvendes for setespesifikk avgivelse av aktive midler ved selektiv modifisering av liposomformuleringen.
I tillegg til læren ifølge Couvreur et al. (1977; 1988), kan følgende informasjon anvendes ved frembringelse av liposomformuleringer. Fosfolipider kan danne mange forskjellige andre strukturer enn liposomer ved dispergering i vann, avhengig av det molare forhold mellom lipid og vann. Ved lave forhold er liposomet den foretrukne struktur. De fysiske karakteregenskaper hos liposomer avhenger av pH, ionestyrke og tilstedeværelse av divalente kationer. Liposomer kan vise lav permeabilitet for ioniske og polare substanser, men ved forhøyede temperaturer gjennomgår de en faseomvandling som markert forandrer deres permeabilitet. Faseomvandlingen innbefatter en forandring fra en tettpakket, ordnet struktur, kjent som geltilstanden, til en løstpakket, mindre ordnet struktur, kjent som fluidtilstanden. Dette skjer ved en karakteristisk faseomvandlings-temperatur og resulterer i en økning i permeabilitet overfor ioner, sukkerarter og medikamenter.
I tillegg til temperatur, kan eksponering for proteiner forandre liposomers permeabilitet. Noen løselige proteiner, så som cytokrom c, binder, deformerer og trenger gjennom bilaget, hvorved det forårsakes forandringer i permeabiliteten. Kolesterol hemmer denne gjennomtrengning av proteiner, tilsynelatende ved tettere pakking av fosfolipidene. Det er påtenkt at de mest anvendelige liposom-utformningene for antibiotika- og inhibitoravgivelse vil inneholde kolesterol.
Evnen til innfangning av oppløste materialer varierer mellom forskjellige typer liposomer. For eksempel er MLV moderat effektive for innfangning av oppløste materialer, men SUV er meget ineffektive. SUV har imidlertid den fordel at størrelsesfordelingen er homogen og reproduserbar, og store unilamellære vesikler (LUV) frembyr et kompromiss mellom størrelse og innfangingseffektivitet. Disse frembringes ved eterfordampning og er tre til fire ganger mer effektive når det gjelder innfangning av oppløste materialer enn MLV.
I tillegg til liposomkarakteristikk er en viktig determinant i innfangende forbindelser de fysisk-kjemiske egenskaper hos selve forbindelsen. Polare forbindelser innfanges i de vandige rom, og ikke-polare forbindelser bindes til lipid-bilaget i vesikkelen. Polare forbindelser frigjøres via gjennomtrengning eller når bilaget brytes, men ikke-polare forbindelser forblir tilknyttet til bilaget dersom det forstyrres av temperatur eller eksponering for lipoproteiner. Begge typer viser maksimale utstrømningshastigheter ved faseomvandlingstemperaturen.
Liposomer interagerer med celler via fire forskjellige mekanismer: endocytose ved fagocyttiske celler i det retikuloendoteliale system så som makrofager og nøytrofile celler; adsorpsjon til celleoverflaten, enten ved ikke-spesifikke svake hydrofobe eller elektrostatiske krefter, eller ved spesifikke interaksjoner med celleoverflatekomponenter; sammensmelting med plasmacellemembranen ved innføring av lipid-bilaget hos liposomet i plasmamembranen, med samtidig frigjøring av liposominnhold i cytoplasmaet; og ved overføring av liposomale lipider til cellulære eller subcellulære membraner, eller omvendt, uten noen tilknytning til liposominnholdet. Det er ofte vanskelig å bestemme hvilken mekanisme som er operativ, og mer enn én kan operere på samme tid.
Skjebnen til, og fjerningen av, intravenøst injiserte liposomer avhenger av deres fysiske egenskaper, så som størrelse, fluiditet og overflateladning. De kan bestå i vev i timer eller dager, avhengig av sammensetningen av dem, og halveringstider i blodet er i området fra minutter til flere timer. Større liposomer, så som MLV og LUV, tas opp hurtig av fagocyttiske celler i det retikuloendoteliale system, men fysiologien i sirkulasjonssystemet innskrenker uttredelsen av slike store forbindelser på de fleste steder. De kan bare gå ut på steder hvor det er store åpninger eller porer i kapillærendotelet, så som sinusoidene i leveren eller milten. Således er disse organer det fremherskende opptakssted. På den andre side viser SUV en videre vevsfordeling, men blir likevel sekvestrert sterkt i leveren og milten. Vanligvis begrenser denne in vivo-oppførsel den potensielle målretting av liposomer til bare de organer og vev som er tilgjengelige for deres store størrelse. Disse innbefatter blodet, leveren, milten, benmargen og de lymfoide organer.
Målretting er vanligvis ikke en begrensning når det gjelder foreliggende oppfinnelse. Skulle imidlertid spesifikk målretting være ønskelig, er det tilgjengelig metoder for at dette kan utføres. Antistoffer kan anvendes til å binde til liposomoverflaten og å styre antistoffet og dets medikamentinnhold til spesifikke antigene reseptorer som befinner seg på en spesiell celletype-overflate. Karbohydrat-determinanter (glykoprotein eller glykolipid-celleoverflatekomponenter som spilleren rolle ved celle-celle-gjenkjenning, -interaksjon og -adhesjon) kan også anvendes som gjenkjennelsesseter siden de har potensial til å syre liposomer til spesielle celletyper. Som oftest er det påtenkt at intravenøs injeksjon av liposomalpreparater vil bli anvendt, men andre administreringsveier er også tenkelige.
Alternativt tilveiebringer oppfinnelsen farmasøytisk akseptable nanokapsel-formuleringer av preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse. Nanokapsler kan vanligvis innfange forbindelser på en stabil og reproduserbar måte (Henry-Michelland et al, 1987; Quintanar-Guerrero et al, 1998; Douglas et al, 1987). For å unngå bivirkninger på grunn av intracellulær polymer overbelastning, bør slike ultrafine partikler (med størrelse rundt 0,1 u.m) utformes under anvendelse av polymerer som er i stand til å kunne nedbrytes in vivo. Bionedbrytbare polyalkyl- cyanoakrylat-nanopartikler som oppfyller disse krav, er påtenkt for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse. Slike partikler kan lett lages, som beskrevet (Couvreur et al, 1980; 1988; zur Muhlen et al, 1998; Zambauxetal, 1998; Pinto-Alphandry et al, 1995 og US-patent nr. 5 145 684, i sin helhet spesifikt medtatt her i dokumentet som referanse).
VAKSINER
Ved noen foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt vaksiner. Vaksinene vil vanligvis omfatte ett eller flere farmasøytiske preparater, så som dem omtalt ovenfor, i kombinasjon med et immunstimulerende middel. Et immunstimulerende middel kan være hvilken som helst substans som forsterker eller potensierer en immunrespons (antistoff- og/eller cellemediert) overfor et eksogent antigen. Eksempler på immunstimulerende midler innbefatter adjuvanser, bionedbrytbare mikrokuler (f.eks. polymelkesyregalaktid) og lipsomer (i hvilke forbindelsen er innlemmet; se f.eks. US-patent nr. 4 235 877). Vaksine-fremstilling er generelt beskrevet for eksempel i Powell & Newman, red. Vaccine Design (subenhet- og adjuvans-fremgangsmåten) (1995). Farmasøytiske preparater og vaksiner innenfor foreliggende oppfinnelses ramme kan også inneholde andre forbindelser, som kan være biologisk aktive eller inaktive. For eksempel kan det være til stede én eller flere immunogene deler av andre tumorantigener, enten innnlemmet i et fusjonspolypeptid eller som en separat forbindelse, i preparatet eller vaksinen.
Illustrerende vaksiner kan inneholde DNA som koder for ett eller flere av polypeptidene som beskrevet ovenfor, slik at polypeptidet frembringes in situ. Som angitt ovenfor, kan DNA være til stede i hvilket som helst av avgivelsessystemene kjent for vanlige fagfolk på området, innbefattende nukleinsyre-ekspresjonssystemer, bakterier og virusekspresjonssystemer. Tallrike genavgivelsesteknikker er velkjente på området, så som dem som er beskrevet av Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198 (1998) og referanser angitt i denne. Passende nukleinsyre-ekspresjonssystemer inneholder de nødvendige DNA-sekvenser for ekspresjon i pasienten (så som en egnet promoter og terminerings-signal). Bakterieavgivelsessystemer innbefatter administrering av en bakterie-vertscelle (for eksempel en Mycobacterium-, Bacillus- eller Lactobacillus-stamme, innbefattende Bacillus-Calmette-Guerin eller Lactococcus lactis) som uttrykker en immunogen del av polypeptidet på sin celleoverflate eller utskiller en slik epitop (se for eksempel Ferreira et al, An Acad Bras Cienc (2005) 77:113-124; og Raha et al, Appl Microbiol Biotechnol (2005) PubMedID 15635459). Ved en foretrukket utførelsesform kan DNA innføres ved anvendelse av et virusekspresjonssystem (f.eks. vaccinia eller annet poxvirus, retrovirus eller adenovirus), som kan innbefatte anvendelse av et ikke-patogent (defekt), replikasjonskompetent virus. Egnede systemer er for eksempel beskrevet i Fisher-Hoch et al. Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 86:317-321 (1989); Flexneretal, Ann. NY Acad. Sei. 569:86-103
(1989); Flexneretal, Vaccine 8:17-21 (1990); US-patenter nr. 4 603 112, 4 769 330 og 5 017 487; WO 89/01973; US-patent nr. 4 777 127; GB 2 200 651; EP 0 345 242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627 (1988); Rosenfeld et al. Science 252:431-434 (1991); Kolls et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91:215-219 (1994); Kass-Eisler et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:11498-11502 (1993); Guzman et al, Circulation 88:2838-2848 (1993); og Guzman et al, Cir. Res. 73:1202-1207 (1993). Teknikker for inkorporering av DNA i slike ekspresjonssystemer er velkjente for vanlige fagfolk på området. DNA kan også være "nakent", som beskrevet for eksempel i Ulmer et al. Science 259:1745-1749
(1993) og anmeldt av Cohen, Science 259:1691-1692 (1993). Opptaket av rent DNA kan økes ved belegging av DNA på bionedbrytbare perler, som effektivt transportes inn i cellene. Det vil være åpenbart at en vaksine kan omfatte både en polynukleotid- og en polypeptidkomponent. Slike vaksiner vil tilveiebringe en forsterket immunrespons. Det vil være klart at en vaksine kan inneholde farmasøytisk akseptable salter av polynukleotidene og polypeptidene tilveiebrakt her. Slike salter kan fremstilles ut fra farmasøytisk akseptable ikke-toksiske baser, innbefattende organiske baser (f.eks. salter av primære, sekundære og tertiære aminer og basiske aminosyrer) og uorganiske baser (f.eks. natrium-, kalium-, litium-, ammonium-, kalsium- og magnesiumsalter). Skjønt hvilken som helst egnet bærer kjent for vanlige fagfolk på området kan anvendes i vaksinepreparatene ifølge denne oppfinnelse, vil typen bærer variere avhengig av administreringsmåten. Preparater ifølge foreliggende oppfinnelse kan formuleres for hvilken som helst passende administreringsmåte, innbefattende for eksempel topisk, oral, nasal, intravenøs, intrakranial, intraperitoneal, subkutan eller intramuskulær administrering. For parenteral administrering, så som subkutan injeksjon, omfatter bæreren fortrinnsvis vann, saltoppløsning, alkohol, en fettart, en vokstype eller en buffer. For oral administrering kan det anvendes hvilken som helst av de ovennevnte bærere eller en fast bærer, så som mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, talkum, cellulose, glukose, sakkarose og magnesiumkarbonat. Bionedbrytbare mikrokuler (f.eks. polylaktat-polyglykolat) kan også anvendes som bærere for de farmasøytiske preparater ifølge denne oppfinnelse. Egnede bionedbrytbare mikrokuler er for eksempel beskrevet i US-patenter nr. 4 897 268; 5 075 109; 5 928 647; 5 811 128; 5 820 883; 5 853 763; 5 814 344 og 5 942 252. Man kan også anvende en bærer omfattende partikkel-protein-kompleksene beskrevet i US-patent nr. 5 928 647, som er i stand til å indusere en klasse I-begrenset cytotoksisk T-lymfocytt-respons i en vert. Slike preparater kan også omfatte buffere (f.eks. nøytralt bufret saltoppløsning eller fosfatbufret saltoppløsning), karbohydrater (f.eks. glukose, mannose, sakkarose eller dekstraner), mannitol, proteiner, polypeptider eller aminosyrer så som glycin, antioksidanter, bakteriostater, chelateringsmidler så som EDTA eller glutation, adjuvanser (f.eks. aluminiumhydroksid), oppløste materialer som gjør formuleringen isotonisk, hypotonisk eller svakt hypertonisk med blodet fra en mottaker, oppslemmingsmidler, fortykningsmidler og/eller konserveringsmidler. Alternativt kan preparater ifølge foreliggende oppfinnelse formuleres som et lyofilisat. Forbindelser kan også innkapsles i liposomer under anvendelse av velkjent teknologi. Hvilket som helst av mange forskjellige immunstimulerende midler kan anvendes i vaksinene ifølge denne oppfinnelse. Det kan for eksempel innlemmes en adjuvans. De fleste adjuvanser inneholder en substans utformet til å beskytte antigenet mot hurtig katabolisme, så som aluminiumhydroksid eller mineralolje, og en stimulator for immunresponser, så som lipid A, Bordetella pertussis eller Mycobacterium-arter eller Mycobacterium-avledede proteiner. Det kan for eksempel anvendes delipidert, deglykolipidert M. vaccae ("pVac"). Egnede adjuvanser er kommersielt tilgjengelige, så som for eksempel Freunds ikke-komplette adjuvans og komplette adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, Ml); Merck Adjuvans 65 (Merck and Company, Inc, Rahway, NJ); AS01B, AS02A, AS15, AS-2 og derivater derav (GlaxoSmithKline, Philadelphia, PA); CWS, TDM, Leif, aluminiumsalter så som aluminiumhydroksid-gel (alun) eller aluminiumfosfat; salter av kalsium, jern eller sink; en uløselig suspensjon av acylert tyrosin; acylerte sukkerarter; kationisk eller anionisk derivatiserte polysakkarider; polyfosfazener; bionedbrytbare mikrokuler; monofosforyl-lipid A og quil A. Cytokiner, så som GM-CSF eller interleukin-2, -7 eller -12, kan også anvendes som adjuvanser. I vaksinene tilveiebrakt her er adjuvansmaterialet fortrinnsvis utformet til å indusere en immunrespons hovedsakelig av Th1-typen. Høye nivåer av Th1-cytokintypen (f.eks. IFN-y, TNFa, IL-2 og IL-12) har tendens til å begunstige induksjon av cellemedierte immunresponser overfor et administrert antigen. I motsetning til dette har høye nivåer av Th2-cytokintyper (f.eks. IL-4, IL-5, IL-6 og IL-10) tendens til å begunstige induksjon av humorale immunresponser. Etter tilføring av en vaksine som tilveiebrakt her, vil en pasient understøtte en immunrespons som innbefatter Th1- og Th2-responstyper. Ved en foretrukket utførelsesform hvor en respons hovedsakelig er av Th1-typen, vil nivået av Th1-cytokintyper øke i større omfang enn nivået av Th2-cytokintyper. Nivåene av disse cytokiner kan lett fastsettes ved anvendelse av standardanalyser. For en oversikt over cytokinfamiliene, se Janeway et al, Immunobiology, 5. utgave, 2001. Foretrukne adjuvanser for anvendelse til fremkalling av en hovedsakelig Th1-responstype innbefatter for eksempel en kombinasjon av monofosforyl-lipid A, fortrinnsvis 3-O-deacylert monofosforyl-lipid A (3D-MPL), eventuelt med et aluminiumsalt (se for eksempel Ribi et al, 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp. NY, s. 407-419; GB 2122204B; GB 2220211; og US 4 912 094). En foretrukket form av3D-MPL er i form av en emulsjon med en liten partikkelstørrelse på under 0,2 mm i diameter, og metoden for fremstilling av den er beskrevet i WO 94/21292. Vandige formuleringer omfattende monofosforyl-lipid A og et overflateaktivt middel er beskrevet i WO 98/43670. Eksemplifiserte foretrukne adjuvanser innbefatter AS01B (MPL og QS21 i en liposomformulering), 3D-MPL og QS21 i en liposomformulering, AS02A (MPL og QS21 i en olje-i-vann-emulsjon), 3D-MPL og QS21 i en olje-i-vann-emulsjon, og AS15, tilgjengelig fra GlaxoSmithKline. MPL-adjuvanser er tilgjengelige fra GlaxoSmithKline, Seattle, WA (se US-patenter nr. 4 436 727; 4 877 611; 4 866 034 og 4 912 094). CpG-holdige oligonukleotider (hvor CpG-dinukleotidet er umetylert) induserer også en hovedsakelig Th1-respons. CpG er en forkortning for cytosin-guanosin-dinukleotidmønstre som finnes i DNA. Slike oligonukleotider er velkjente og er beskrevet for eksempel i WO 96/02555, WO 99/33488 og US-patenter nr. 6 008 200 og 5 856 462. Immunstimulerende DNA-sekvenser er også beskrevet for eksempel av Sato et al. Science 273:352 (1996). CpG blir, når det er formulert i vaksiner, vanligvis administrert i fri løsning sammen med fritt antigen (WO 96/02555; McClusckie og Davis, som ovenfor) eller kovalent konjugert til et antigen (WO 98/16247), eller formulert med en bærer så som aluminiumhydroksid ((Hepatitt-overflateantigen) Davis et al. som ovenfor; Brazolot-Millan et al. Proe. Nati. Acad. Sei. I/.S.A1998, 95(26), 15553-8). CpG er kjent på området som å være en adjuvans som kan administreres både systemisk og mukosalt (WO 96/02555, EP 468520, Davis et al, J. Immunol., 1998, 160(2):870-876; McCluskie og Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6). En annen foretrukket adjuvans er et saponin eller saponinmimetika eller -derivater, fortrinnsvis QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc, Framingham, MA), som kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre adjuvanser. Et forsterket system innbefatter for eksempel kombinasjonen av et monofosforyl-lipid A og et saponinderivat, så som kombinasjonen av QS21 og 3D-MPL som beskrevet i WO 94/00153, eller et mindre reaktogent preparat hvor QS21 er nøytralisert med kolesterol, som beskrevet i WO 96/33739. Andre foretrukne formuleringer omfatter en olje-i-vann-emulsjon og tokoferol. En spesielt potent adjuvansformulering som innbefatter QS21, 3D-MPL og tokoferol i en olje-i-vann-emulsjon, er beskrevet i WO 95/17210. Ytterligere saponinadjuvanser for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse innbefatter QS7 (beskrevet i WO 96/33739 og WO 96/11711) og QS17 (beskrevet i US-patent nr. 5 057 540 og EP 0 362 279 B1).
Andre foretrukne adjuvanser innbefatter Montanide ISA 720 (Seppic, Frankrike), SAF (Chiron, California, U.S.A.), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), SBAS-adjuvans-serien (f.eks. SBAS-2, AS2', AS2", SBAS-4 eller SBAS6, tilgjengelige fra GlaxoSmithKline, Rixensart, Belgia), Detox (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) og andre aminoalkyl-glukosaminid 4-fosfater (AGP), så som dem som er beskrevet i samtidig verserende US-patentsøknader nr. 08/853 826 og 09/074 720, hvis beskrivelser i sin helhet er medtatt her i dokumentet som referanse.
Ytterligere eksempler på adjuvanser innbefatter syntetisk MPL og adjuvanser basert på Shiga-toksin B-subenhet (se WO2005/112991).
En hver vaksine tilveiebrakt her kan fremstilles under anvendelse av velkjente metoder som resulterer i en kombinasjon av antigen, immunrespons-forsterker og en egnet bærer eller tilsetningsmiddel. Preparatene beskrevet her i dokumentet kan administreres som en del av en langvarig frigjørings-formulering (dvs. en formulering så som en kapsel, svamp eller gel (bestående av polysakkarider, for eksempel) som bevirker langsom frigjøring av forbindelse etter administrering). Slike formuleringer kan vanligvis fremstilles under anvendelse av velkjent teknologi (se f.eks. Coombes et al, Vaccine 14:1429-1438 (1996)) og administreres for eksempel ved oral, rektal eller subkutan implantasjon, eller ved implantasjon på det ønskede målsted. Formuleringer med langvarig frigjøring kan inneholde et polypeptid, polynukleotid eller antistoff dispergert i en bærermatriks, og/eller finnes i et reservoar omgitt av en hastighetsregulerende membran.
Bærere for anvendelse i slike formuleringer er biokompatible, og kan også være bionedbrytbare; formuleringen tilveiebringer fortrinnsvis et relativt konstant nivå av frigjøring av aktiv forbindelse. Slike bærere innbefatter mikropartikler av poly(laktid-ko-glykolid), polyakrylat, lateks, stivelse, cellulose, dekstran og liknende. Andre bærere med forsinket frigjøring innbefatter supramolekylære biovektorer, som omfatter en ikke-flytende hydrofil kjerne (f.eks. et kryssbundet polysakkarid eller oligosakkarid) og eventuelt et ytre lag omfatttende en amfifil forbindelse, så som etfosfolipid (se f.eks. US-patent nr. 5 151 254 og PCT-patentsøknader WO 94/20078, WO 94/23701 og WO 96/06638). Mengden av aktiv forbindelse som finnes i en slik langvarig frigjørings-formulering, avhenger av implantasjonsstedet, hastigheten og den ventede varighet av frigjøring og beskaffenheten av tilstanden som skal behandles eller forebygges.
Hvilket som helst av mange forskjellige avgivelses-bærermaterialer kan anvendes i farmasøytiske preparater og vaksiner for å lette fremkallelsen av en antigenspesifikk immunrespons som er rettet mot tumorceller. Avgivelses-bærermaterialer innbefatter antigenpresenterende celler (APC), så som dendrittceller, makrofager, B-celler, monocytter og andre celler som kan konstrueres til å være effektive APC. Slike celler kan, men behøver ikke, være genetisk modifiserte for å øke kapasiteten for presentering av antigenet, for forbedring av aktivering og/eller opprettholdelse av T-celle-responsen, for å ha anti-tumor-virkninger per se og/eller for å være immunologisk kompatible med mottakeren (dvs. tilsvarende ("matched") HLA-haplotype). APC kan generelt isoleres fra hvilket som helst av mange forskjellige biologiske fluider og organer, innbefattende tumor- og peritumorvev, og kan være analoge, allogene, syngene eller xenogene celler.
Visse foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse anvender dendrittceller eller forløpere for disse som antigenpresenterende celler. Dendrittceller er meget potente APC (Banchereau & Steinman, Nature 394:245-251 (1998)) og er vist å være effektive som fysiologisk adjuvans for frembringelse av profylaktisk eller terapeutisk antitumor-immunitet (se Timmerman & Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529 (1999)). Dendrittceller kan vanligvis identifiseres basert på sin typiske form (stjerneformet in situ, med markerte cytoplasma-fremspring
(dendritter) synlige in vitro), sin evne til å ta opp, prosessere og presentere antigener med høy effektivitet, og sin evne til å aktivere naturlige T-celle-responser. Dendrittceller kan selvfølgelig konstrueres til å uttrykke spesifikke celleoverflatereseptorer eller ligander som ikke vanligvis finnes på dendrittceller in vivo eller ex vivo, og slike modifiserte dendrittceller er påtenkt ved foreliggende oppfinnelse. Som et alternativ til dendrittceller kan det anvendes utskilte vesikler fra antigen-lastede dendrittceller (kalt eksosomer) i en vaksine (se Zitvogel et al. Nature Med. 4:594-600 (1998)).
Dendrittceller og forløpere kan fås fra perifert blod, benmarg, tumor-infiltrerende celler, peritumorale vevsinfiltrerende celler, lymfeknuter, milt, hud, navlestrengblod eller hvilket som helst annet egnet vev eller fluid. Dendrittceller kan for eksempel differensieres ex vivo ved tilsetning av en kombinasjon av cytokiner så som GM-CSF, IL-4, IL-13 og/eller TN Fa til kulturer av monocytter høstet fra perifert blod. Alternativt kan CD34-positive celler høstet fra perifert blod, navlestrengblod eller benmarg differensieres til dendtittceller ved at det til dyrkningsmediet tilsettes kombinasjoner av GM-CSF, IL-3, TNFa, CD40-ligand, LPS, flt3-ligand og/eller annen forbindelse (andre forbindelser) som induserer differensiering, modning og proliferasjon av dendrittceller.
Dendrittceller blir hensiktsmessig klassifisert som "umodne" og "modne" celler, som muliggjør en enkel måte til å skjelne mellom to grundig karakteriserte fenotyper. Imidlertid må ikke denne nomenklatur forstås som å utelukke alle mulige mellomliggende stadier av differensiering. Umodne dendrittceller erkarakterisertsom APC med høy kapasitet for antigenopptak og -prosessering, som samsvarer med den høye ekspresjon av Fcy-reseptor og mannosereseptor. Den modne fenotype er typisk kjennetegnet ved en lavere ekspresjon av disse markører, men en høy ekspresjon av celleoverflatemolekyler som er ansvarlige for T-celle-aktivering så som klasse I- og klasse ll-MHC, adhesjonsmolekyler (f.eks. CD54 og CD11) og kostimulerende molekyler (f.eks. CD40, CD80, CD86 og 4-1BB).
APC kan vanligvis transfekteres med et polynukleotid som koder for et protein (eller en del eller annen variant derav) slik at polypeptidet, eller en immunogen del derav, uttrykkes på celleoverflaten. Slik transfeksjon kan finne sted ex vivo, og et preparat eller en vaksine omfattende slike transfekterte celler kan så anvendes for terapeutiske formål, som beskrevet her i dokumentet. Alternativt kan et genavgivelses-bærermateriale som er rettet mot en dendtittcelle eller annen antigenpresenterende celle, administreres til en pasient, noe som resulterer i transfeksjon som finner sted in vivo. In vivo- og ex vivo-transfeksjon av for eksempel dendrittceller kan vanligvis utføres ved anvendelse av hvilken som helst metode kjent på området, så som dem beskrevet i WO 97/24447, eller genpistolmetoden beskrevet av Mahvi et al, Immunology and Cell Biology 75:456-460 (1997). Antigenbelastning av dendrittceller kan oppnås ved inkubering av dendrittceller eller forløperceller med polypeptidet, DNA (nakent eller i en plasmidvektor) eller RNA; eller med antigenuttrykkende rekombinante bakterier eller virus (f.eks. vacciniavirus-, fjærfekoppevirus-, adenovirus- eller lentivirusvektorer). Før tilføring kan polypeptidet konjugeres kovalenttil en immunologisk partner som gir T-celle-hjelp (f.eks. et bærermolekyl). Alternativt kan en dendrittcelle pulseres med en ikke-konjugert immunologisk partner, separat eller i nærvær av polypeptidet.
Vaksiner og farmasøytiske preparater kan presenteres i enhetsdose- eller flerdosebeholdere, så som forseglede ampuller eller medisinglass. Slike beholdere blir fortrinnsvis hermetisk forseglet for bevaring av steriliteten av formuleringen inntil bruk. Vanligvis kan formuleringer lagres som suspensjoner, løsninger eller emulsjoner i olje- eller vann-bærermaterialer. Alternativt kan en vaksine eller et farmasøytisk preparat lagres i frysetørket tilstand som bare fordrer tilsetning av en steril flytende bærer umiddelbart før bruk.
Alle publikasjoner og patentsøknader angitt i denne beskrivelse er medtatt her i dokumentet som referanse som om hver individuell publikasjon eller patentsøknad var spesifikt og individuelt angitt å være medtatt som referanse.
Skjønt foranstående oppfinnelse er beskrevet noe detaljert ved illustrasjon og eksempel for å gjøre forståelsen lettere, vil det være klart for en vanlig fagperson på området i lys av læren ifølge denne oppfinnelse at visse forandringer og modifikasjoner kan utføres uten at man avviker fra prinsippet eller rammen for de tilknyttede krav.
EKSEMPLER
Følgende eksempler er tilveiebrakt kun som en illustrasjon, og ikke som en begrensning. Fagfolk på området vil lett bli klar over mange forskjellige ikke-avgjørende parametere som kan forandres eller modifiseres med oppnåelse av hovedsakelig like resultater.
Eksempel 1: Frembringelse av Mtb72f ( ingen His- merkesubstans) ( SEKV ID Nr: 6) Konstruksjon av Mtb72f-ekspresjonsvektoren
Mtb72f er et fusjonsprotein dannet av 2 Mycobacterium tuberculosis-proteiner MTB32 og Mtb39. Mtb72f konstrueres ved sammensmelting av Mtb39 og de N- og C-terminale deler av Mtb32 som følger: Mtb32 C-terminal ende - Mtb39 - Mtb32 N-terminal ende. Spesifikt ble Mtb72f-protein frembrakt ved sekvensiell sammenbinding i tandem av de åpne leserammer (OFR) som koder for det -14 kDa C-terminale fragment av Mtb32 (restene 192-323; 132 aminosyrer) til hel lengde-ORF av Mtb39, fulgt, i den C-terminale ende, av den -20 kDa N-terminale del (restene 1-195) av Mtb32. Dette ble utført ved anvendelse av sekvens-spesifikke oligonukleotider inneholdende unike retriksjonsseter (EcoRI og EcoRV) og uten stoppkodonene i de C-terminale ender (når det gjelder Mtb32-C og Mtb39) for polymerasekjedereaksjon (PCR) et stykke unna genomisk DNA fra M. tuberculosis-stammen H37Rv.
Detaljene ved prosessen er som følger:
Først ble DNA som koder for den C-terminale del av Mtb32 (Mtb32C), klonet fra H37Rv ved anvendelse av PCR med følgende oligonukleotider: 5' (5 '-CAA-TTA- CAT- ATG-CAT-CAC-CAT-CAC-CAT-CAC-ACG-GCC-GCG-TCC-GAT-AAC-TTC-3') og 3' (5'-CTA-ATC- GAA- TCC-GGC-CGG-GGG-TCC-CTC-GGC-CAA-3'). 5'-oligonukleotidet inneholdt et Ndel-restriksjonssete (understreket) omfattende ATG-initieringskodonet. 3-oligonukleotidet inneholdt et EcoRI-restriksjonssete (understreket). Disse oligonukleotider ble anvendt til amplifikasjon av Mtb32C, en 396 nukleotiders del av Mtb32, og det resulterende produkt ble subklonet i Ndel- og EcoRI-setene i en ekspresjonsvektor. Digerering med EcoRI og EcoRV lineariserte deretter Mtb32C-plasmidet.
Når det gjaldt Mtb39, ble følgende oligonukleotider anvendt for PCR-amplifikasjon og kloning: 5'-(5'-CTA-ATC- GAA- TTC-ATG-GTG-GAT-TTC-GGG-GCG-TTA-3') og 3' (5'-CTA-ATC- GAT- ATC-GCC-GGC-TGC-CGG-AGA-ATG-CGG-3'). 5'-oligonukleotidet inneholdt et EcoRI-restriksjonssete (understreket), mens 3'-oligonukleotidet inneholdt et EcoRV-restriksjonssete (understreket). Hel-lengde-kodingssekvensen for Mtb39 ble amplifisert, digerert og subklonet i ramme nedstrøms for Mtb32c under anvendelse av det for-digererte plasmid fra det første trinn.
5'- og 3'-oligonukleotidene for det N-terminale fragment av Mtb32 var utformet som følger: 5'- (5'-CTA-ATC- GAT- ATC-GCC-CCG-CCG-GCC-TTG-TCG-CAG-GAC-3') og 3' (5'-CTA-ATC- GAT- ATC-Cr^-GGA-CGC-GGC-CGT-GTT-CAT-AC-3'). Begge sett av oligonukleotider inneholdt et EcoRV-restriksjonssete (understreket), mens 3'-oligonukleotidet også innbefattet et stoppkodon (kursiv). Oligonukleotidene ble utformet for amplifisering av en 585 bp del av Mtb32 som kodet for det forutsette N-terminale doméne av dette protein. Det resulterende PCR-produkt ble subklonet i Mtb32c-Mtb39-fusjonsplasmidet. Den riktige orientering av innskudd og fravær av mutasjoner ble deretter verifisert ved DNA-sekvensering. Når det gjaldt den endelige konstruksjon, anvendt for å lage Master Cell Bank og Manufacturefs Working Cell Bank, ble 6XHis-affinitetsmerkesubstansen fjernet ved hjelp av PCR, og den åpne leseramme (ORF) for Mtb72f ble subklonet i pPDM, en pET-avledet ekspresjonsvektor. ORF koder for et polyprotein på ca. 72 kDa (Mtb72f), med doméner organisert i lineær rekkefølge: Mtb32C-Mtb39-Mtb32N. Dette DNA ble deretter transformert i HMS174 pLysS-stammen av E. co//'og anvendt for testing, cellebankinnføring og fremstilling.
Frembringelse av Mtb72f-medikamentmassesubstans
Fremstillingsprosessen for frembringelse av Mtb72f er oppsummert som følger: - Fermentering, fulgt av cellehøsting ved sentrifugering, istykkerrivning av celler (mikrofluidiseringsapparat) og sentrifugering under oppnåelse av en inklusjonslegeme-pellet;
- Rensning av inklusjonslegeme-pelleten ved ekstraksjon i 8 M urea, fulgt av Q Sepharose hurtigstrømnings-(QFF)-kromatografi, keramisk hydroksyapatitt-(CHT)-kromatografi, diafiltrering og sterilfiltrering under oppnåelse av den rensede medikamentmassesubstans.
Fermentering
Fermenteringer utføres i et 10 I driftsvolum. Fermentoren inokuleres med 300 ml av en ristekolbekultur av drifts-utsåingscellene dyrket ved 37°C natten over. Både inokulumet og fermenteringen anvender et halvdefinert medium med planteavledet glycerol som hoved-karbonkilde. Sammensetningen av mediet er vist i tabellen nedenfor. Alle mediumkomponenter steriliseres ved oppvarming ved 121°C i 20 minutter eller ved sterilfiltrering. Under fermenteringen holdes fermentoren på en temperatur på 37°C. Luft blåses igjennom med en hastighet på 5 standardliter pr. minutt (SLPM). Mediets pH holdes på 7,0 ved automatisk tilsetning av syre (H2SO4) eller base (NaOH). Fermentoren programmeres for regulering av det oppløste oksygen på 30% ved automatisk justering av agitasjonen, mens det opprettholdes en minimumsagitasjon på 200 omdr. pr. min. Skumkontroll i fermentoren oppnås ved automatisk tilsetning av 1,05% SAG-471 silikon-antiskum (Witco Corp.). Når celletettheten når en optisk tetthet (600 mm) på omtrent 3,5, tilsettes isopropyl-beta-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) i fermentoren til en konsentrasjon på 1,0 mM. IPTG induserer ekspresjon av det rekombinante gen som koder for Mtb72f-proteinet. 3,0 timer etter induksjon avkjøles fermentoren, og cellene høstes ved sentrifugering i 1 I sentrifugeflasker.
Isolering av inklusjonslegemer
Cellepelletene gjenoppslemmes og blandes i 2,3 I lysebuffer (50 mM NaCI, 10 mM Tris pH 8,0), og en M1 10Y Microfluidizer® anvendes til å rive cellene i stykker. Cellene ledes gjennom mikrofluidiseringsinnretningen fem ganger ved et trykk på 75,8 MPa + 6,90 MPa. Suspensjonen sentrifugeres ved 8000 x g i 500 ml flasker. Under disse betingelser pelleteres inklusjonslegemene (IB) inneholdende Mtb72f-proteinet, mens størstedelen av cellebrokkene forblir i supernatanten. IB-pelletene gjenoppslemmes i vaskebuffer (2 M urea, 50 mM NaCI, 10 mM Tris pH 8,0), fulgt av sentrifugering ved 8 000 g. Supernatantfraksjonene kastes, og IB-pelletene oppbevares ved fra -70°C til -80°C til de trenges for videre rensning.
Rensning av polyprotein
De frosne IB-preparater tines ved 37°C i 15 minutter og blir deretter gjenoppslemmet i 8 M urea, 50 mM NaCI, 20 mM Bis-tris-propan, pH 7,0 (buffer A) under anvendelse av forsiktig mekanisk agitasjon. De gjenoppslemmede IB blir deretter omrørt ved romtemperatur med magnetisk rørestav ved 300 omdr. pr. min. i 2 timer. IB-ekstraktene blir deretter sentrifugert ved høy hastighet, og den resulterende supernatantfraksjon filtreres gjennom et 0,45 nM filter (Pall, Supor) før kromatografisk fraksjonering.
IB-ekstraktet påsettes på en kolonne inneholdende Q Sepharose Fast Flow (QFF)-anoinebytterharpiks (10 x 12,5 cm Amersham/Pharmacia BPG; 1 I pakket sjikt) på forhånd rengjort med 1 N NaOH og deretter ekvilibrert med buffer A. Kolonnen innstilles ("developed") ved en lineær strømningshastighet på 60 cm/time med buffer A, og den gjennomstrømmede blanding inneholdende hovedsakelig forurensninger med liten masse, oppsamles for referanse. Størstedelen av Mtb72f elueres i et enkelt trinn under anvendelse av 8 M urea, 90 mM NaCI, 20 mM Bis-tris-propan, pH 7,0 og oppsamles som en enkelt massetopp basert på absorbans.
QFF-harpikser er sterkt kryssbunde agaroseharpikser med en funksjonell kvaternær amingruppe som er positivt ladet ved betingelsene som anvendes under rensning. Den ladede matriks muliggjør binding av forskjellige anioner som deretter kan elueres selektivt under anvendelse av en saltgradient. Denne anionebytterkromatografi anvendes til separering av nukleinsyrer og endotoksin, som bindes fast til harpiksen, fra proteinet, som bindes svakere og elueres før disse forurensninger. Dessuten fjerner dette trinn uladede forurensninger og en stor andel av proteinforurensningene. 90 mM NaCI-eluattoppen fra QFF-kolonnen påsettes på en kolonne (2,6 x 12 cm Amersham/Pharmacia XK26/20; 63 ml pakket sjikt) inneholdende MacroPrep® keramisk hydroksyapatitt (CHT) (type I, 40 nM, BioRad) på forhånd rengjort ved anvendelse av 1 N NaOH og deretter ekvilibrert med buffer C (8 M urea, 250 mM NaCI og 20 mM Bis-tris-propan, pH 7,0). Det gjennomstrømmede materiale (FT1) inneholdende hovedandelen av Mtb72f, fritt for forurensninger, oppsamles. Kolonnen vaskes med buffer C, og eventuelt resulterende UV-absorberende materiale oppsamles. Til slutt blir kolonnen eluert i buffer D (8 M urea, 200 mM natriumfosfat, pH 7,4).
MacroPrep® CHT er en sfærisk, makroporøs form av hydroksyapatitt [Ca5(P04)30H]2. CHT-kromatografi kan være en meget selektiv metode for rensning hvis de riktige bindings- og elueringsbetingelser blir funnet. Bindings-måtene innbefatter ionebyttings-bindingstype til ladde kalsium- og fosfat-ioner samt chelatering av molekyler. DNA vil bindes til denne harpiks, og høy selektivitet for individuelle proteiner kan oppnås. Betingelsene som anvendes for rensning av Mtb72f, tjener som et poleringstrinn som muliggjør praktisk talt fullstendig fjerning av detekterbare vertscelleforurensninger.
Under kromatografiske separasjoner blir ultrafiolett (UV) absorbans, ledningsevne, trykk, pH, strømningshastighet og omgivelsestemperatur overvåket og registrert. Begynnelses-CHT-gjennomstrømningsmaterialet (FT1) anvendes for
ytterligere nedstrøms-prosessering.
Diafiltrering og sterilfiltrering
Diafiltrering utføres for CHT FT1-blandingen under fjerning av urea og erstatning av bufferen med 20 mM Tris pH 7,5. Diafiltreringen utføres ved anvendelse av et Pall Minim™-system med en tangentiell strømnings-filtreringsinnretning av typen LV-Centramate™ med en ultrafiltreringsmembran med 30 kDa molekylvekt-utelukkelse (MWCO). Mtb72f-løsningen i 20 mM Tris pH 7,5 blir sterilfiltrert under anvendelse av et 0,2 nm steriliseringsfilter (Millipak 40). Femti ml av løsningen fordeles i sterile 60 ml PETG- (polyetylentereftalat-kopolymer) mediumflasker og blir deretter frosset og oppbevart ved -70°C. Dette materiale er den rensede Mtb72f-medikamentmassesubstans.
Eksempel 2: Frembringelse av Mtb72f ( 6 His Tag) ( SEKV ID Nr: 2)
Metoden ifølge eksempel 1 kan følges, bortsett fra at trinnet for subkloning i pPDM for fjerning av His-merkesubstansen utelates.
Eksempel 3: Frembringelse av M72 ( 2 His- merkesubstans) ( SEKV ID Nr: 4) Konstruering av M72-ekspresjonsvektoren
Utgangsmateriale for konstruering av M72-antigen var det rekombinante plasmid 6His-Mtb72fmut. 6His-Mtb72fmut ble frembrakt ved seterettet mutagenese under anvendelse av det rekombinante 6his-Mtb72f-plasmid (se eksempel 1) som templat. Seterettet mutagenese innbefattet erstatning av kodonet for Ser ved stilling 710 i SEKV ID Nr: 1 med et kodon for Ala. Delesjon av fire N-terminale histidiner som fantes på 6His-Mtb72Fmut-konstruksjonen (Corixa-plasmid), ble oppnådd med "Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System"
(Invitrogen), noe som førte til den ventede 2His-Mtb72Fmut-konstruksjon. Etter sekvensverifisering ble 2His-Mtb72fmut-kodingssekvens fjernet fra plasmidet (ved enzymatisk restriksjon), gel-renset og ligert i pET29a-ekspresjonsvektor, noe som resulterte i det endelige rekombinante plasmid pET29a/2His-Mtb72fmut. Etter sekvensverifisering ble det rekombinante plasmid gitt den offisielle betegnelsen pRIT15497 og anvendt til transformering av HMS174(DE3)-vertsceller. pRIT15497 koder for et 725 aminosyrers protein kalt M72.
Produksjon av M72-protein
Den samme produksjonsprosess som beskrevet for Mtb72f (se eksempel 1) kan anvendes, bortsett fra at når det gjaldt M72-produksjon, er kloramfenikol fraværende i fermenteringsmediet.
Biologisk eksempel 1: En musemodell av en inaktiv/ latent tilstand av M.
tuberculosis- infeksjon
For oppretting av en musemodell av latent M. tuberculosis-infeksjon ble SWR-stammen anvendt. SWR-mus er ikke immunkompromitterte, men er mangelfulle med hensyn til utskillelse av komplementkomponent C5 (se Ooi og Colten, Nature (1979) 282:207-8). SWR-mus er ikke i stand til å etablere en kronisk tilstand med Mtb-infeksjon, men utvikler diffus granulomatøs pneumoni kjennetegnet ved store epiteloide og skumaktige makrofager med krystalloide inklusjoner (nøytrofil- eller eosinofil-avledede granuler som er blitt fagocyttert), multifokal nekrose, nøytrofil-opphopning og scant-lymfocytter (se Turner et al, J Submicrosc Cytol Pathol. (2001) 33(1-2):217-9; og Turner et al, Infect Immun.
(2003) 71(9):5266-72). Det følgende er protokollen for anvendelse av Swiss Webster-(SWR/J)-musestamme i en modell for latent M. tuberculosis-infeksjon for evaluering av den terapeutiske effektivitet av Mtb72f (SEKV ID Nr: 6) formulert med AS01B-adjuvans. Dobbeltstyrke-AS01B frembringes ved tilsetting av QS21 (5 ng) til små unilamellære vesikler (SUV) av dioleoylfosfatidylcholin (100 ng) inneholdende kolesterol (25ng) (WO 96/33739) og monofosforyl-lipid A (MPL) (5ng) i membranen (se US-patentpublikasjon nr. 2003/0143240). En porsjon for injeksjon (50 ni) tilberedes ved blanding av 4 ng protein i buffer (PBS pH 6,8) med 50 ni dobbeltstyrke-AS01B. Hver mus fikk to injeksjoner på 50 ni (dvs. 8 ng protein).
En representativ tidslinje for etablering av en modell av en latent M. tuberculosis-infeksjon er skjematisk angitt på fig. 1.
Dag 1: Infiser via aerosol med 50-100 kolonidannende enheter (CFU) M.
tuberculosis-organismer
Dag 30-90: Behandle et subsett av mus med 50 mg rifampin/85 mg isoniazid pr. liter drikkevann
Dag 61: Alle mus som får kandidatvaksine 5, skal immuniseres med rMtb72f+ AS01B
Dag 82: Alle mus som får kandidatvaksinen, skal immuniseres med rMtb72f + AS01B
Dag 103: Alle mus som får kandidatvaksinen, skal immuniseres med rMtb72f+ AS01B
Dag 113: Blodtapping for IgG-analyser
Forskjellige tidspunkter: Ta milter og lunger for CFU-fortegnelse og immunogenitet
Variasjon 1 Behandle med kjemoterapi i 60 dager. Start på dag 30 -» Hvil i 3, 4, 5 måneder CFU i 2 mus på hvert tidspunkt og la 4-7 mus være tilbake for overlevelsesstudier
Variasjon 2 -» Behandle med kjemoterapi i 90 dager. Start på dag 30 -» Hvil i 4, 5 måneder -» CFU i 2 mus på hvert tidspunkt og la 7 mus være tilbake for overlevelsesstudier
Variasjon 3 -» Hvil i 4, 5, 6 måneder -» CFU i 2 mus på hvert tidspunkt og la 4 mus være tilbake for overlevelsesstudier
Variasjon 4 -» Behandle med kjemoterapi i 60 dager. Start på dag 30 -» 3 immuniseringer med r72F+AS01B intramuskulært (i.m.), start på dag 60 -» Hvil i 3, 4, 5 måneder -» CFU i 2 mus på hvert tidspunkt og la 4-7 mus være tilbake for overlevelsesstudier
Variasjon 5 -» Behandle med kjemoterapi i 90 dager. Start på dag 30 -» 3 immuniseringer med r72F+AS01B i.m, start på dag 60 -» Hvil i 4, 5 måneder-> CFU i 2 mus på hvert tidspunkt og la 4-7 mus være tilbake for overlevelsesstudier
Analyse av post-infeksjons-antistoffrespons under anvendelse av rMtb72f til belegging av ELISA-platene viste at de grupper som fikk en kombinasjon av kjemoterapi og Mtb72f+AS01 B-immunisering, hadde høyere antistoffrespons (OD opp til 2,0) enn mus som var ubehandlede eller fikk kjemoterapibehandling alene (OD på under 0,5) (fig. 2). Mus immunisert med Mtb72f frembrakte en betydelig Mtb72f-spesifikk antistoffrespons (OD på mellom 1,5 og 2,5) enten de fikk 60 eller 90 dagers kjemoterapi (fig. 3).
Miltceller ble høstet fra mus med forskjellige intervaller etter at musene var infisert med M. tuberculosis. Splenocytttene ble stimulert på nytt in vitro med rekombinante antigener for måling av IFN^-sekresjon. IFN^y-nivåene frembrakt av disse celler var ensartet ubetydelige i gruppene 1 (ubehandlede) og 2 (kun kjemoterapi) på dag 60, med unntak av Mrb39. Positive kontrollstimuleringer med conA-, PPD- og BCG-lysat viste at cellene var i stand til å syntetisere og skille ut IFN^y som svar på andre stimulerende molekyler (fig. 4). IFN^y-nivåene var høye i grupper som fikk Mtb72f+AS01 B, men de var lave eller ubetydelige i grupper som ikke var blitt immunisert med Mtb72f+AS01B, enten de hadde fått kjemoterapi eller ikke (fig. 5).
I løpet av tuberkuloseinfeksjon og påfølgende behandling responderer spesifikke T-celler. Ved anvendelse av intracellulær cytokinmerking med henblikk på IFN-y ble prosentandelen av spesifikke CD4<+->celleresponser overfor Mtb72F målt (fig. 6). Det syntes ikke å være noen forandring i de Mtb72F-spesifikke CD4<+->IFNy<+->T-celle-responser i løpet av kjemoterapi alene på noe tidspunkt ifølge måling ved denne analyse (fig. 7). På dag 120 etter Mtb-infeksjon så det ut til at tendensen for CD4<+->IFNy<+->respons overfor Mtb72F i grupper som fikk Mtb72f pluss AS01B-vaksine, økte med tidslengden på kjemoterapi (fig. 7).
Resultatene av våre forsøk viser at SWR-mus er utsatt for infeksjon med M. tuberculosis. Hvis SWR-musene forblir ubehandlet, dør de innen 115 dager etter Mtb-infeksjon (fig. 8 og 9). Middel-overlevelsestid for mus som fikk 60 dagers kombinasjons-kjemoterapi, var 170 dager (fig. 8 og 9). Middel-overlevelsestid for mus som fikk 60 dagers kombinasjons-kjemoterapi og 3 immuniseringer med Mtb72f/AS01 B, var 215 dager (fig. 8 og 9). Overlevelse for gruppen av mus som fikk kjemoterapi, er betydelig forskjellig (95% konfidensintervall (p=0,0067)) fra dem som fikk kjemoterapi og Mtb72f/AS01B-vaksinen.

Claims (31)

1. Fremgangsmåte for forhindring eller behandling av tuberkulose-reaktivering hos et individ, karakterisert ved at den omfatter det trinn at det til et pattedyr som allerede er infisert med Mycobacterium tuberculosis, administreres en effektiv mengde av et farmasøytisk preparat omfattende et Mtb72f-fusjonsprotein eller et immunogent fragment derav fra en Mycobacterium-art av tuberkulosekomplekset, og en adjuvans, hvor Mtb72f-fusjonsproteinet fremkaller en immunrespons overfor M. tuberculosis, hvorved tuberkulose-reaktivering forhindres.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pattedyret har en aktiv infeksjon av M. tuberculosis.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pattedyret har en latent infeksjon av M. tuberculosis.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pattedyret er infisert med en multimedikament-resistent stamme av M. tuberculosis.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pattedyret på forhånd er immunisert med Bacillus Calmette-Guerin (BCG).
6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at Mtb72f er fra Mycobacterium tuberculosis.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at Mtb72f er et polypeptid omfattende restene 8-729 av SEKV ID Nr: 2.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at Mtb72f er et polypeptid bestående av restene 1 og 8-729 av SEKV ID Nr: 2, eventuelt med en His-merkesubstans innsatt etter begynnelses-Met-resten.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at Mtb72f er et polypeptid ifølge SEKV ID Nr: 2.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at Mtb72f er et polypeptid ifølge SEKV ID Nr: 6.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at Mtb72f er et polypeptid omfattende restene 4-725 av SEKV ID Nr: 4.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at Mtb72f er et polypeptid besetående av restene 1 og 4-725 av SEKV ID Nr: 4, eventuelt med en His-merkesubstans innsatt etter begynnelses-Met-resten.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at Mtb72f er et polypeptid ifølge SEKV ID Nr: 4.
14. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pattedyret er et menneske.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at adjuvansen er valgt fra gruppen bestående av 3D-MPL og QS21 i en liposomformulering, og 3D-MPL og QS21 i en olje-i-vann-emulsjon.
16. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den videre omfatter administrering av ett eller flere kjemoterapeutiske midler som er effektive til behandling av en M. tuberculosis-infeksjon.
17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at det ene eller flere kjemoterapeutiske midler er valgt blant isoniazid og rifampin.
18. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at pattedyret først får administrert ett eller flere kjemoterapeutiske midler over et tidsrom og deretter får administrert det farmasøytiske preparat ifølge krav 1.
19. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at pattedyret først får administrert det farmasøytiske preparat ifølge krav 1, og deretter får administrert ett eller flere kjemoterapeutiske midler i løpet av et tidsrom.
20. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at administrering av det ene eller flere kjemoterapeutiske midler og det farmasøytiske preparat ifølge krav 1 innledes på samme tid.
21. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den videre omfatter administrering av det farmasøytiske preparat ifølge krav 1 én gang eller flere på hverandre følgende ganger.
22. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den videre omfatter en fremgangsmåte for priming og forsterkning ved påfølgende administrering av en nukleinsyre som koder for et Mtb72f-fusjonsprotein eller et immunogent fragment derav fra en Mycobacterium-art av tuberkulosekomplekset.
23. Fremgangsmåte for forhindring eller behandling av tuberkulose-reaktivering hos et individ, karakterisert ved at den omfatter det trinn at det til et pattedyr som allerede er infisert med Mycobacterium tuberculosis, administreres en immunologisk effektiv mengde av et farmasøytisk preparat omfattende en nukleinsyre som koder for et Mtb72f-fusjonsprotein eller et immunogent fragment derav fra en Mycobacterium-art av tuberkulosekomplekset, hvor det uttrykte Mtb72f-fusjonsproteinet fremkaller en immunrespons overfor M. tuberculosis, hvorved tuberkulose-reaktivering forhindres.
24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at nukleinsyren er SEKV ID Nr: 1.
25. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at nukleinsyren omfatter nukleotidene 63-2222 av SEKV ID Nr: 1.
26. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at nukleinsyren er SEKV ID Nr: 3.
27. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at nukleinsyren omfatter nukleotidene 10-2175 av SEKV ID Nr: 3.
28. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at nukleinsyren avgis i en adenovirusvektor.
29. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at nukleinsyren avgis i en mutant Mycobacterium- eller Bacillus-vertscellevektor.
30. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at den videre omfatter en fremgangsmåte for priming og forsterkning ved påfølgende administrering av et Mtb72f-fusjonsprotein eller et immunogent fragment derav fra en Mycobacterium-art av tuberkulosekomplekset.
31. Fremgangsmåte for redusering av tidsforløpet for kjemoterapi mot en M. tuberculosis-infeksjon, karakterisert ved at den omfatter at det til et pattedyr som allerede er infisert med Mycobacterium tuberculosis, administreres ett eller flere kjemoterapeutiske midler som er effektive overfor en M. tuberculosis-infeksjon, og en immunologisk effektiv mengde av et farmasøytisk preparat omfattende et Mtb72f-fusjonsprotein eller et immunogent fragment derav fra en Mycobacterium-art av tuberkulosekomplekset, og en adjuvans, hvor Mtb72f-fusjonsproteinet fremkaller en immunrespons overfor M. tuberculosis, hvorved det muliggjøres reduksjon av tidsforløpet for kjemoterapi overfor en M. tuberculosis-infeksjon.
NO20141158A 2005-04-29 2014-09-24 Farmasøytisk preparat og anvendelse derav NO345071B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67654905P 2005-04-29 2005-04-29
US77701706P 2006-02-27 2006-02-27
PCT/EP2006/004319 WO2006117240A2 (en) 2005-04-29 2006-04-27 Novel method for preventing or treating m tuberculosis infection

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20141158L true NO20141158L (no) 2008-01-25
NO345071B1 NO345071B1 (no) 2020-09-14

Family

ID=36972897

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20075201A NO340766B1 (no) 2005-04-29 2007-10-11 Farmasøytisk preparat
NO20120381A NO340206B1 (no) 2005-04-29 2012-03-28 Polypeptid og polynukleotid, samt farmasøytiske preparater omfattende dem.
NO20141158A NO345071B1 (no) 2005-04-29 2014-09-24 Farmasøytisk preparat og anvendelse derav

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20075201A NO340766B1 (no) 2005-04-29 2007-10-11 Farmasøytisk preparat
NO20120381A NO340206B1 (no) 2005-04-29 2012-03-28 Polypeptid og polynukleotid, samt farmasøytiske preparater omfattende dem.

Country Status (24)

Country Link
US (6) US8470338B2 (no)
EP (3) EP2457926B1 (no)
JP (4) JP5164830B2 (no)
KR (4) KR20130110233A (no)
CN (3) CN106390108B (no)
AT (1) ATE543832T1 (no)
AU (1) AU2006243357B2 (no)
BR (1) BRPI0611347A2 (no)
CA (2) CA2607715C (no)
CY (1) CY1112851T1 (no)
DK (3) DK2457926T3 (no)
EA (1) EA012576B1 (no)
ES (3) ES2381492T3 (no)
HR (3) HRP20120331T1 (no)
IL (2) IL186654A (no)
MA (1) MA29678B1 (no)
NO (3) NO340766B1 (no)
NZ (1) NZ562729A (no)
PH (1) PH12013502449A1 (no)
PL (3) PL2457926T3 (no)
PT (3) PT2457926E (no)
SI (3) SI2457926T1 (no)
WO (1) WO2006117240A2 (no)
ZA (1) ZA200709209B (no)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5164830B2 (ja) * 2005-04-29 2013-03-21 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 結核菌感染の予防または治療のための新規方法
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
EP2441469A1 (en) * 2006-03-14 2012-04-18 Oregon Health and Science University Methods for producing an immune response to tuberculosis
US9717788B2 (en) 2007-03-02 2017-08-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Method of inducing an immune response against HIV employing HIV immunogens, adenoviral vectors encoding said immunogens, and adjuvant
MX362698B (es) * 2007-03-02 2019-02-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Metodo novedoso y composiciones.
WO2009025820A2 (en) * 2007-08-21 2009-02-26 Stc. Unm Rationally improved isoniazid and ethionamide derivatives and activity through selective isotopic substitution
WO2009158284A2 (en) * 2008-06-26 2009-12-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for producing immune responses against polypeptides involved in antibiotic resistance
MX2011000982A (es) * 2008-07-25 2011-03-02 Glaxosmithkline Biolog Sa La proteina de tuberculosis rv2386c, composiciones y usos de la misma.
PL2315597T3 (pl) 2008-07-25 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nowe kompozycje i sposoby
LT2315773T (lt) 2008-07-25 2016-11-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Polipeptidai, polinukleotidai ir kompozicijos, skirti naudoti latentinės tuberkuliozės gydymui
GB0815872D0 (en) 2008-09-01 2008-10-08 Pasteur Institut Novel method and compositions
DK2421557T3 (en) 2009-04-24 2019-03-25 Statens Seruminstitut TB TUBERCULOSE VACCINE FOR PREVENTION PREVENTION
HUE031184T2 (en) 2010-01-27 2017-06-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified tuberculosis antigens
MY161412A (en) * 2010-12-14 2017-04-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mycobacterium antigenic composition
GB201022007D0 (en) 2010-12-24 2011-02-02 Imp Innovations Ltd DNA-sensor
HUE032409T2 (en) 2011-01-04 2017-09-28 Archivel Farma Sl Liposome preparation for treating or preventing tuberculosis
GB201116248D0 (en) 2011-09-20 2011-11-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Liposome production using isopropanol
WO2013090897A1 (en) * 2011-12-15 2013-06-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Using adaptive immunity to detect drug resistance
PT2802345T (pt) 2012-01-12 2018-04-24 Archivel Farma Sl Vacina mtb-c contra a asma
JP2015525784A (ja) * 2012-08-03 2015-09-07 インフェクティアス ディジーズ リサーチ インスティチュート 活動性結核菌感染を治療するための組成物及び方法
WO2014047848A1 (en) * 2012-09-27 2014-04-03 Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd. Modified bcg strains with reduced or eliminated activity of lsr2 and pharmaceutical composition comprising same
CN102994595B (zh) * 2012-11-30 2018-10-26 广州白云山拜迪生物医药有限公司 一种融合蛋白包涵体的制备方法
CN102993266B (zh) * 2012-11-30 2019-08-23 广州白云山拜迪生物医药有限公司 一种融合蛋白的纯化和复性方法
GB201405921D0 (en) * 2014-04-02 2014-05-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel methods for inducing an immune response
US10588980B2 (en) * 2014-06-23 2020-03-17 Novartis Ag Fatty acids and their use in conjugation to biomolecules
US10335374B2 (en) 2014-12-04 2019-07-02 University System of Georgia, Valdosta State University Tablet composition for anti-tuberculosis antibiotics
JP2018516358A (ja) * 2015-04-02 2018-06-21 バイオデシー， インコーポレイテッド 表面選択的非線形光学技法を使用してタンパク質構造を決定するための方法
WO2016179231A1 (en) * 2015-05-04 2016-11-10 Board Of Trustees Of Michigan State University Compositions and methods for inhibiting bacterial growth
GB201513176D0 (en) * 2015-07-27 2015-09-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel methods for inducing an immune response
JP7136777B2 (ja) 2016-12-07 2022-09-13 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 新規プロセス
US11717519B2 (en) 2017-04-21 2023-08-08 Washington University In St. Louis Use of fatty acid oxidation inhibitors as antimicrobials
WO2019178472A1 (en) * 2018-03-16 2019-09-19 Washington University In St. Louis Use of fatty acid oxidation inhibitors as antimicrobials
GB201707700D0 (en) 2017-05-12 2017-06-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Dried composition
TW202237116A (zh) * 2020-12-02 2022-10-01 日商塩野義製藥股份有限公司 以組合細胞色素bc1抑制劑與克拉黴素或阿奇黴素為特徵之用於治療分枝桿菌感染之藥物
TW202328167A (zh) 2021-08-31 2023-07-16 美商維爾生物科技股份有限公司 結核病疫苗
KR102534846B1 (ko) 2021-12-14 2023-05-19 재단법인 환동해산업연구원 결핵균에 항균 활성을 가지는 해조류 추출물
CN116162141B (zh) * 2022-11-30 2024-04-12 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种结核分枝杆菌抗原epcra013及其应用

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
US4777127A (en) 1985-09-30 1988-10-11 Labsystems Oy Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5811128A (en) 1986-10-24 1998-09-22 Southern Research Institute Method for oral or rectal delivery of microencapsulated vaccines and compositions therefor
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
GB8702816D0 (en) 1987-02-07 1987-03-11 Al Sumidaie A M K Obtaining retrovirus-containing fraction
CA1340522C (en) 1987-03-10 1999-05-04 Heinz Dobeli Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
CA1331443C (en) 1987-05-29 1994-08-16 Charlotte A. Kensil Saponin adjuvant
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
WO1989001973A2 (en) 1987-09-02 1989-03-09 Applied Biotechnology, Inc. Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
AU2613988A (en) 1988-01-04 1989-08-01 E.I. Du Pont De Nemours And Company Multiple stage affinity process for isolation of specific cells from a cell mixture
US5215926A (en) 1988-06-03 1993-06-01 Cellpro, Inc. Procedure for designing efficient affinity cell separation processes
AP129A (en) 1988-06-03 1991-04-17 Smithkline Biologicals S A Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5549910A (en) 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
EP1001032A3 (en) 1989-08-18 2005-02-23 Chiron Corporation Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
US5725871A (en) 1989-08-18 1998-03-10 Danbiosyst Uk Limited Drug delivery compositions comprising lysophosphoglycerolipid
KR920007887B1 (ko) 1989-08-29 1992-09-18 스즈키 지도오샤 고오교오 가부시키가이샤 내연기관의 배기가스 정화장치
US5707644A (en) 1989-11-04 1998-01-13 Danbiosyst Uk Limited Small particle compositions for intranasal drug delivery
US5466468A (en) 1990-04-03 1995-11-14 Ciba-Geigy Corporation Parenterally administrable liposome formulation comprising synthetic lipids
WO1991016116A1 (en) 1990-04-23 1991-10-31 Cellpro Incorporated Immunoselection device and method
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
JP3218637B2 (ja) 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
JP2958076B2 (ja) 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
WO1992007243A1 (en) 1990-10-18 1992-04-30 Cellpro, Incorporated An apparatus and method for separating particles using a pliable vessel
US5145684A (en) 1991-01-25 1992-09-08 Sterling Drug Inc. Surface modified drug nanoparticles
US5399363A (en) 1991-01-25 1995-03-21 Eastman Kodak Company Surface modified anticancer nanoparticles
CA2115554A1 (en) 1991-08-15 1993-03-04 Yves Lobet Osp a proteins of borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines
US5240856A (en) 1991-10-23 1993-08-31 Cellpro Incorporated Apparatus for cell separation
US5756353A (en) 1991-12-17 1998-05-26 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol-and liposome-based delivery
DK0641192T3 (da) 1992-05-18 1998-03-02 Minnesota Mining & Mfg Anordning til transmucosal lægemiddelafgivelse
US5792451A (en) 1994-03-02 1998-08-11 Emisphere Technologies, Inc. Oral drug delivery compositions and methods
HU219808B (hu) 1992-06-25 2001-08-28 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Adjuvánst tartalmazó vakcinakompozíció és eljárás annak előállítására
JPH08505625A (ja) 1993-01-11 1996-06-18 ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート 細胞毒性ｔリンパ球応答の誘導
FR2702160B1 (fr) 1993-03-02 1995-06-02 Biovecteurs As Vecteurs particulaires synthétiques et procédé de préparation.
DE69405551T3 (de) 1993-03-23 2005-10-20 Smithkline Beecham Biologicals S.A. 3-0-deazylierte monophosphoryl lipid a enthaltende impfstoff-zusammensetzungen
FR2704145B1 (fr) 1993-04-21 1995-07-21 Pasteur Institut Vecteur particulaire et composition pharmaceutique le contenant.
US5955077A (en) 1993-07-02 1999-09-21 Statens Seruminstitut Tuberculosis vaccine
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5741516A (en) 1994-06-20 1998-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5551622A (en) 1994-07-13 1996-09-03 Yoon; Inbae Surgical stapler
CA2194761C (en) 1994-07-15 2006-12-19 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
FR2723849B1 (fr) 1994-08-31 1997-04-11 Biovector Therapeutics Sa Procede pour augmenter l'immunogenicite, produit obtenu et composition pharmaceutique
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5580579A (en) 1995-02-15 1996-12-03 Nano Systems L.L.C. Site-specific adhesion within the GI tract using nanoparticles stabilized by high molecular weight, linear poly (ethylene oxide) polymers
IE80468B1 (en) 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
CA2220530A1 (en) 1995-06-02 1996-12-05 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Improved method for obtaining full-length cdna sequences
US5738868A (en) 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
US6290969B1 (en) 1995-09-01 2001-09-18 Corixa Corporation Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis
ATE324445T1 (de) 1995-09-01 2006-05-15 Corixa Corp Verbindungen und verfahren zur diagnose von tuberkulose
IL123506A (en) 1995-09-01 2004-12-15 Corixa Corp Polypeptide compounds and preparations for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis
EP0871747A1 (en) 1996-01-02 1998-10-21 Chiron Viagene, Inc. Immunostimulation mediated by gene-modified dendritic cells
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
CZ126699A3 (cs) 1996-10-11 1999-09-15 Corixa Corporation Polypeptid obsahující antigenní část rozpustného antigenu M. tuberculosis nebo variantu uvedeného antigenu, molekula DNA kódující tento polypeptid, expresivní vektor, hostitelská buňka, způsoby diagnostiky infekce M. tuberculosis a diagnostické kity
ATE292980T1 (de) 1996-10-11 2005-04-15 Univ California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
US5655998A (en) 1996-12-03 1997-08-12 Yu; Chih-An Space walking exerciser
KR100603884B1 (ko) 1997-04-01 2006-07-24 코리사 코퍼레이션 모노포스포릴 지질 ａ의 수성 면역적 아쥬반트 조성물
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
JP4768121B2 (ja) 1998-02-05 2011-09-07 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Ｍａｇｅファミリーからの腫瘍関連抗原及びそれらをコードする核酸配列、融合タンパク質の及びワクチン接種のための組成物の調製のための使用
AU753995B2 (en) 1998-04-07 2002-10-31 Corixa Corporation Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses
WO2001024820A1 (en) 1999-10-07 2001-04-12 Corixa Corporation Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis
US7472098B2 (en) 2000-02-14 2008-12-30 Ubs Financial Services, Inc. System and method for execution of trades made pursuant to stock option and purchase plans
ATE442866T1 (de) * 2000-06-20 2009-10-15 Corixa Corp Fusionsproteine aus mycobakterium tuberculosis
US20030143240A1 (en) 2000-06-27 2003-07-31 Cabezon-Silva Teresa Elisa Virginia Prostase protein vaccine comprising derivatised thiol residues and methods for producing said antigen
AU2002303135A1 (en) * 2001-03-13 2002-09-24 Corixa Corporation Heterologous fusion protein constructs comprising a leishmania antigen
CN101570594B (zh) 2002-02-14 2012-06-20 三井化学株式会社 聚酯树脂及聚酯制备用催化剂、用此催化剂制备聚酯树脂的方法
US7026465B2 (en) * 2002-02-15 2006-04-11 Corixa Corporation Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis
GB0411411D0 (en) 2004-05-21 2004-06-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccines
KR101188690B1 (ko) 2005-01-19 2012-10-09 팬듀트 코포레이션 억제 코어를 가진 통신 채널
JP5164830B2 (ja) * 2005-04-29 2013-03-21 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 結核菌感染の予防または治療のための新規方法
JP4468858B2 (ja) 2005-06-01 2010-05-26 オリンパスイメージング株式会社 データ符号化装置、データ符号化方法、プログラム
US7296798B2 (en) 2006-01-31 2007-11-20 Matt Overfield Gameboard, games played on board and methods of play requiring strategy and luck
DK2421557T3 (en) * 2009-04-24 2019-03-25 Statens Seruminstitut TB TUBERCULOSE VACCINE FOR PREVENTION PREVENTION
WO2011011323A1 (en) 2009-07-21 2011-01-27 Cooper Technologies Company Interfacing a light emitting diode (led) module to a heat sink assembly, a light reflector and electrical circuits
MY161412A (en) 2010-12-14 2017-04-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mycobacterium antigenic composition
US9119754B2 (en) 2011-10-08 2015-09-01 Michael Dennis Mattress overlay system with positionally adjustable, lateral ramp-wedge bolster structure
US9051890B2 (en) 2013-10-28 2015-06-09 Ford Global Technologies, Llc Method for estimating charge air cooler condensation storage with an intake oxygen sensor
US9903268B2 (en) 2015-04-02 2018-02-27 Ford Global Technologies, Llc Internal combustion engine with two-stage supercharging capability and with exhaust-gas aftertreatment arrangement, and method for operating an internal combustion engine
US9810514B2 (en) 2015-09-08 2017-11-07 Deufol Sunman Inc. Ammunition carrier consumer package

Also Published As

Publication number Publication date
NO20120381L (no) 2008-01-25
MA29678B1 (fr) 2008-08-01
IL186654A (en) 2013-04-30
US20150231224A1 (en) 2015-08-20
NZ562729A (en) 2009-10-30
AU2006243357A1 (en) 2006-11-09
CY1112851T1 (el) 2016-02-10
US9056913B2 (en) 2015-06-16
JP2013040190A (ja) 2013-02-28
PL1877426T3 (pl) 2012-10-31
DK1877426T3 (da) 2012-05-14
CN106390108A (zh) 2017-02-15
US20190307872A1 (en) 2019-10-10
PL2457926T3 (pl) 2015-03-31
PT2426141E (pt) 2014-11-25
US10105430B2 (en) 2018-10-23
KR20150036658A (ko) 2015-04-07
CN101273055A (zh) 2008-09-24
ES2524572T3 (es) 2014-12-10
NO345071B1 (no) 2020-09-14
HRP20120331T1 (hr) 2012-05-31
US10639361B2 (en) 2020-05-05
NO340206B1 (no) 2017-03-20
IL186654A0 (en) 2008-01-20
NO20075201L (no) 2008-01-25
KR20080021624A (ko) 2008-03-07
JP2015057403A (ja) 2015-03-26
US20190030154A1 (en) 2019-01-31
DK2457926T3 (da) 2015-01-05
EA012576B1 (ru) 2009-10-30
IL215112A (en) 2013-07-31
JP2012065650A (ja) 2012-04-05
SI2457926T1 (sl) 2015-01-30
ES2381492T3 (es) 2012-05-28
EP2426141A2 (en) 2012-03-07
US20170196961A1 (en) 2017-07-13
SI1877426T1 (sl) 2012-06-29
CN102617739A (zh) 2012-08-01
US10350283B2 (en) 2019-07-16
CA2821389C (en) 2015-11-17
EP1877426A2 (en) 2008-01-16
CN106390108B (zh) 2020-09-08
AU2006243357B2 (en) 2012-03-15
JP5659207B2 (ja) 2015-01-28
ZA200709209B (en) 2009-12-30
US20090123491A1 (en) 2009-05-14
KR20120089475A (ko) 2012-08-10
WO2006117240A3 (en) 2007-01-18
JP5164830B2 (ja) 2013-03-21
US9655958B2 (en) 2017-05-23
CN101273055B (zh) 2016-03-16
PT1877426E (pt) 2012-05-02
PH12013502449A1 (en) 2015-12-14
KR101352806B1 (ko) 2014-02-17
NO340766B1 (no) 2017-06-19
ATE543832T1 (de) 2012-02-15
EP2426141A3 (en) 2012-08-15
SI2426141T1 (sl) 2015-01-30
CA2607715C (en) 2015-11-24
DK2426141T3 (da) 2014-11-10
EA200702081A1 (ru) 2008-04-28
JP2008539187A (ja) 2008-11-13
US8470338B2 (en) 2013-06-25
PL2426141T3 (pl) 2015-02-27
ES2524570T3 (es) 2014-12-10
BRPI0611347A2 (pt) 2010-08-31
PT2457926E (pt) 2014-11-25
IL215112A0 (en) 2011-10-31
US20170065696A9 (en) 2017-03-09
HRP20141184T1 (en) 2015-03-13
EP1877426B1 (en) 2012-02-01
HRP20141125T1 (hr) 2015-01-02
CA2607715A1 (en) 2006-11-09
EP2426141B1 (en) 2014-10-01
CA2821389A1 (en) 2006-11-09
EP2457926B1 (en) 2014-09-24
WO2006117240A2 (en) 2006-11-09
KR20130110233A (ko) 2013-10-08
US20140050776A1 (en) 2014-02-20
EP2457926A1 (en) 2012-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10639361B2 (en) Method for preventing or treating M tuberculosis infection
EP1542732B1 (en) Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis
AU2011224145B2 (en) Novel method for preventing or treating M tuberculosis infection
MX2007013240A (en) Novel method for preventing or treating m tuberculosis infection

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees