PT1877426E

PT1877426E - Método para prevenção ou tratamento de uma infecção por m. tuberculosis

Info

Publication number: PT1877426E
Application number: PT06753523T
Authority: PT
Inventors: Rhea Coler; Yves Lobet; Steven Reed
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa; Infectious Disease Res Inst Idri
Priority date: 2005-04-29
Filing date: 2006-04-27
Publication date: 2012-05-02
Also published as: DK2426141T3; US9056913B2; HRP20141125T1; PL1877426T3; US20150231224A1; KR20130110233A; US10350283B2; EP1877426B1; EP2426141B1; PL2426141T3; KR20120089475A; EP2457926B1; CY1112851T1; HRP20141184T1; NO20120381L; JP5659207B2; ZA200709209B; NO345071B1; US20170196961A1; DK1877426T3

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODO PARA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE UMA INFECÇÃO POR M. TUBERCULOSIS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos de prevenção ou tratamento da reactivação de uma infecção por M. tuberculosis num mamífero e a métodos de encurtamento do período de tempo de quimioterapia contra uma infecção por M. tuberculosis.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A tuberculose é uma doença infecciosa crónica, causada por infecção com M. tuberculosis e outras espécies de Mycobacterium. É uma das principais doenças nos países em desenvolvimento, assim como um problema crescente em áreas desenvolvidas do mundo, com cerca de 8 milhões de novos casos e 3 milhões de mortes todos os anos. Embora a infecção possa ser assintomática durante um período de tempo considerável, a doença manifesta-se mais geralmente como uma inflamação aguda dos pulmões, resultando em febre e uma tosse improdutiva. Se não for tratada, tipicamente resultam sérias complicações e morte.

Embora a tuberculose possa, em geral, ser controlada utilizando terapia antibiótica prolongada, esse tratamento não é suficiente para prevenir a propagação da doença. Durante algum tempo, os indivíduos infectados podem ser assintomáticos, mas 1 contagiosos. Além disso, embora o cumprimento do regime de tratamento seja crítico, o comportamento do doente é difícil de monitorizar. Alguns doentes não completam o processo de tratamento, o que pode conduzir a um tratamento ineficaz e ao desenvolvimento de resistência a fármacos. Mesmo se a totalidade de um processo de tratamento for completada, a infecção com M. tuberculosis não é erradicada do indivíduo infectado, mas permanece como uma infecção latente que pode ser reactivada.

De modo a controlar a propagação da tuberculose, a vacinação eficaz e o correcto diagnóstico precoce da doença, são de importância extrema. Actualmente, a vacinação com bactérias vivas é o método mais eficaz para a indução de imunidade protectora. 0 Mycobacterium mais comum empregue para o efeito é o Bacillus de Calmette-Guerin (BCG), uma estirpe avirulenta do M. bovis. Contudo, a segurança e eficácia de BCG são uma fonte de controvérsia e, alguns países, tal como os Estados Unidos, não vacinam a população em geral com este agente. 0 diagnóstico da tuberculose é geralmente conseguido utilizando um teste cutâneo que envolve a exposição intradérmica à tuberculina PPD (derivado purificado de proteína) . As respostas de células T específicas de antigénio resultam em induração mensurável no local de injecção até 48-72 horas após a injecção, o que indica exposição a antigénios micobacterianos. Contudo, a sensibilidade e especificidade têm sido um problema deste teste e os indivíduos vacinados com BCG não podem ser distinguidos de indivíduos infectados.

Embora se tenha mostrado que os macrófagos actuam como os efectores principais da imunidade de Mycobacterium, as células T são os indutores predominantes dessa imunidade. 0 papel 2 essencial das células T na protecção contra a infecção por Mycobacterium é ilustrado pela frequente ocorrência de infecção por Mycobacterium em doentes com SIDA, devido à depleção de células T CD4+ associadas à infecção pelo virus da imunodeficiência humana (VIH). Mostrou-se que as células T CD4+ reactivas ao Mycobacterium são potentes produtores de interferão-γ (IFN-γ) que, por sua vez, se demonstrou que desencadeia os efeitos antimicobacterianos de macrófagos em murganhos. Embora o papel do IFN-γ em humanos seja menos claro, estudos mostraram que a 1,25-di-hidroxi-vitamina D3, isoladamente ou em combinação com IFN-γ ou factor alfa de necrose tumoral, activa os macrófagos humanos a inibirem a infecção por M. tuberculosis. Além disso, sabe-se que o IFN-γ estimula os macrófagos humanos a produzirem a 1,25-di-hidroxi-vitamina D3. De modo semelhante, mostrou-se que a interleucina 12 (IL-12) desempenha um papel na estimulação da resistência à infecção por M. tuberculosis. Para uma revisão da imunologia da infecção por M. tuberculosis, ver Chan & Kaufmann, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control (Bloom ed., 1994), Tuberculosis (2a ed., Rom e Garay, eds., 2003) e Harrison's Principies of Internai Medicine, Capítulo 150, p. 953-966 (16a ed., Braunwald, et al., eds., 2005). MOREIRA ANDRE L ET AL: "Os antigénios micobacterianos exacerbam as manifestações de doença em murganhos infectados com Mycobacterium tuberculosis" INFECTION AND IMMUNITY, vol. 70, n° 4, Abril de 2002 (2002-04), páginas 2100-2107, ISSN: 0019-9567 e TURNER JOANNE ET AL: "As vacinas de tuberculose de pré-exposição eficazes não protegem quando são administradas num modo imunoterapêutico" INFECTION AND IMMUNITY, vol. 68, n° 3, Março de 2000 (2000-03), páginas 1706-1709, ISSN: 0019-9567 envolvem o tratamento de infecção latente por M. tuberculosis 3 utilizando a administraçao de vacinações BCG numa tentativa para prevenir a reactivação.

Permanece uma necessidade de estratégias de tratamento eficazes para prevenir a reactivação de infecções por Mycobacterium tuberculosis de infecções activas e latentes. Esta invenção preenche esta e outras necessidades.

DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS LISTADAS SEQ ID N° 1: Mtb72f com cauda N-terminal de 6 His (ADN) SEQ ID N° 2: Mtb72f com cauda N-terminal de 6 His (proteina) SEQ ID N° 3: M72 (variante de Mtb72f) com inserção N-terminal de 2 His (ADN) SEQ ID N° 4: M72 (variante de Mtb72f) com inserção N-terminal de 2 His (proteina) SEQ ID N° 5: Mtb72f sem inserção N-terminal de His (ADN) SEQ ID N° 6: Mtb72f sem inserção N-terminal de His (proteina)

BREVE SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo uma proteina de fusão Mtb72f, ou um seu fragmento 4 imunogénico, de uma espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose, por exemplo, juntamente com um ou mais adjuvantes, incluindo AS01B e AS02A. A presente invenção é baseada, em parte, na verificação da requerente de que a administração de uma proteína de fusão Mtb72f ou o seu fragmento imunogénico, e. g., juntamente com um ou mais adjuvantes ou um ácido nucleico codificando uma proteína de fusão Mtb72f, ou o seu fragmento imunogénico, pode prevenir ou tratar a reactivação de uma infecção, activa ou inactiva, por M. tuberculosis. Numa forma de realização preferida, uma proteína de fusão ou ácido nucleico Mtb72f é administrada com um ou mais agentes quimioterapêuticos eficazes contra uma infecção por M. tuberculosis.

Num aspecto, as composições são empregues em métodos para a prevenção ou tratamento da reactivação de tuberculose num indivíduo, o método compreendendo a etapa de administrar, a um mamífero já infectado com Mycobacterium tuberculosis, uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de fusão Mtb72f, ou um seu fragmento imunogénico, de uma espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose e um adjuvante, em que a proteína de fusão Mtb72f induz uma resposta imunitária contra M. tuberculosis prevenindo ou tratando, desse modo, a reactivação de tuberculose.

Noutro aspecto, as composições são empregues em métodos para a prevenção da reactivação de tuberculose num indivíduo, o método compreendendo a etapa de administrar, a um mamífero já infectado com Mycobacterium tuberculosis, uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição farmacêutica 5 compreendendo um ácido nucleico codificando uma proteína de fusão Mtb72f, ou um seu fragmento imunogénico, de uma espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose, em que a proteína de fusão Mtb72f expressa, induz uma resposta imunitária contra M. tuberculosis prevenindo ou tratando, desse modo, a reactivação de tuberculose.

Noutro aspecto, as composições são empregues em métodos para a redução do período de tempo da quimioterapia contra uma infecção por M. tuberculosis, o método compreendendo administrar, a um mamífero já infectado com Mycobacterium tuberculosis, um ou mais agentes quimioterapêuticos eficazes contra uma infecção por M. tuberculosis e uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de fusão Mtb72f ou um seu fragmento imunogénico, de uma espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose e um adjuvante, em que a referida proteína de fusão Mtb72f, ou o seu fragmento imunogénico, induz uma resposta imunitária contra M. tuberculosis permitindo, desse modo, a redução do período de tempo da quimioterapia contra uma infecção por M. tuberculosis. Através do encurtamento do período de tempo da quimioterapia contra uma infecção por M. tuberculosis, os presentes métodos também são eficazes na estimulação da adesão de um indivíduo, que está a ser tratado contra uma infecção por M. tuberculosis, a completar um processo de tratamento integral.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra uma representação gráfica do modelo de reactivação de M. tuberculosis em murganhos Swiss Webster (SWR/J). A figura mostra os intervalos de tempo para infecção, 6 tratamento de quimioterapia (50 mg de rifampina/80 mg de isoniazida, por Litro de água potável), imunizações e enumeração de carga bacteriana/unidades de formação de colónias (CFU). A Figura 2 mostra respostas imunitárias de respostas de anticorpos IgGl e IgG2a em murganhos SWR/J infectados por M. tuberculosis tratados com quimioterapia e, depois, imunizados com Mtb72f. Os murganhos foram deixados não tratados, tratados com quimioterapia (50 mg de rifampina/85 mg de isoniazida, por Litro de água potável) ou tratados com quimioterapia e imunizados três vezes, intramuscularmente, com 8 pg por dose de

Mtb72f formulado sem adjuvante. Dez dias após a última imunização, os murganhos foram sangrados e os soros testados para resposta de anticorpo anti-Mtb72f para isótopos de IgGl (vermelho) e IgG2a (preto) por ELISA. A Figura 3 mostra respostas imunitárias de respostas de anticorpos IgGl e IgG2a em murganhos SWR/J infectados por M. tuberculosis tratados com quimioterapia e, depois, imunizados com Mtb72f. Os murganhos foram deixados não tratados, tratados com quimioterapia (50 mg de rifampina/85 mg de isoniazida, por Litro de água potável) ou tratados com quimioterapia e imunizados três vezes, intramuscularmente, com 8 pg por dose de Mtb72f formulado com o adjuvante AS01B. Dez dias após a última imunização, os murganhos foram sangrados e os soros testados para resposta de anticorpo anti-Mtb72f para isótopos de IgGl (vermelho) e IgG2a (preto) por ELISA. A Figura 4 mostra respostas de interferão gama (IFN-γ) em murganhos SWR/J infectados por M. tuberculosis tratados com quimioterapia e, depois, imunizados com Mtb72f. As células do baço foram obtidas de murganhos em intervalos de tempo variáveis 7 e estimuladas, in vitro, durante três dias, com 10 pg/mL de rMtb72f ou os componentes (Mtb32c e Mtb39), como indicado. Como controlos, as culturas de esplenócitos também foram estimuladas com PPD (3 pg/mL), Lisado de BCG (10 pg/mL), conA (3 pg/mL) ou apenas meio. A produção de IFN-γ foi subsequentemente medida por ELISA. A Figura 5 mostra respostas de IFN-γ em murganhos SWR/J infectados por M. tuberculosis tratados com quimioterapia e, depois, imunizados com Mtb72f. As células do baço foram obtidas de murganhos em intervalos de tempo variáveis e estimuladas, in vitro, durante três dias, com 10 pg/mL de rMtb72f ou os componentes (Mtb32c e Mtb39), como indicado. Como controlos, as culturas de esplenócitos também foram estimuladas com PPD (3 pg/mL), Lisado de BCG (110 pg/mL), conA (3 pg/mL) ou apenas meio. A produção de IFN-γ foi subsequentemente medida por ELISA. A Figura 6 mostra respostas de citocina de células T CD4+ e IFN-γ em murganhos SWR/J infectados por M. tuberculosis tratados com quimioterapia e, depois, imunizados com Mtb72f. As células do baço foram obtidas de murganhos em intervalos de tempo variáveis e estimuladas, in vitro, de um dia para o outro, com 10 pg/mL de rMtb72f. As células foram, depois, coradas para CD4 e IFN-γ. Como um controlo, as culturas de esplenócitos também foram estimuladas apenas com meio. A produção de IFN-Y+ específico de células T CD4+ foi subsequentemente medida por coloração de citocina intracelular (ICS). A Figura 7 mostra um sumário em tabela dos valores da produção de IFN-Y+ especifico de células T CD4+ e CD8+ no Dia 120 após infecção por Mtb. As células do baço foram obtidas de grupos de murganhos deixados não tratados, tratados com 30, 60 8 ou 90 dias de quimioterapia de combinação ou tratados com quimioterapia de combinação como um adjunto à vacina Mtb72f. Os esplenócitos foram estimulados in vitro, de um dia para o outro, com 10 pg/mL de rMtb72f. As células foram, depois, coradas para CD4, CD8 ou IFN-γ. Como um controlo, as culturas de esplenócitos também foram estimuladas apenas com meio. A produção de IFN-Y+ especifico de células T CD4+ e CD8+ foi subsequentemente medida por coloração de citocina intracelular. A Figura 8 mostra a sobrevivência de murganhos SWR/J infectados por M. tuberculosis tratados com quimioterapia e, depois, imunizados com Mtb72f. Os murganhos foram infectados por meio de aerossol com 50-100 CFU de MtbH37Rv e a quimioterapia (50 mg de rifampina/85 mg isoniazida, por Litro de água potável) foi iniciada num subconjunto de murganhos trinta dias mais tarde. A quimioterapia continuou durante 60 dias. Metade dos murganhos recebendo quimioterapia foi imunizada três vezes, intramuscularmente, com 8 pg por dose de Mtb72f formulado com o adjuvante AS01B. A Figura 9 mostra a sobrevivência de murganhos SWR/J infectados por M. tuberculosis tratados com quimioterapia e, depois, imunizados com Mtb72f. Os murganhos foram infectados por meio de aerossol com 50-100 CFU de MtbH37Rv e a quimioterapia (50 mg de rifampina/85 mg isoniazida, por Litro de água potável) foi iniciada num subconjunto de murganhos trinta dias mais tarde. A quimioterapia continuou durante 30, 60 ou 90 dias em subconjuntos separados de murganhos. Metade dos murganhos recebendo quimioterapia foi imunizada três vezes, intramuscularmente, com 8 pg por dose de Mtb72f formulado com o adjuvante AS01B. 9

DESCRIÇÃO DETALHADA DE FORMAS DE REALIZAÇÃO ESPECÍFICAS A presente invenção refere-se a composições compreendendo ácidos nucleicos ou proteinas de fusão Mtb72f e um adjuvante, úteis para tratamento, prevenção ou retardamento da reactivação de uma infecção, activa ou inactiva (i. e., latente), por Mycobacterium e métodos para a sua utilização. Mais especificamente, as composições da presente invenção compreendem polipéptidos de fusão Mtb72f, ou os seus fragmentos imunogénicos, ou ácidos nucleicos codificando polipéptidos de fusão Mtb72f, ou os seus fragmentos imunogénicos, tendo componentes de uma espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose, e. g., uma espécie, tais como M. tuberculosis, M. bovis ou M. africanum ou uma espécie de Mycobacterium que seja ambiental ou oportunista e que cause infecções oportunistas, tal como infecções pulmonares, em hospedeiros imunocomprometidos (e. g., doentes com SIDA), e. g., BCG, M. avium, M. intracellulare, M. celatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M. simiae, M. vaccae, M. fortuitum e M. scrofulaceum (ver, e. g., Harrison's Principies of Internai Medicine, Capitulo 150, p. 953-966 (16a ed., Braunwald, et al., eds., 2005). A requerente do presente pedido verificou, surpreendentemente, que as composições compreendendo polipéptidos de fusão Mtb72f ou ácidos nucleicos codificando polipéptidos de fusão Mtb72f, ou os seus fragmentos imunogénicos, são úteis no tratamento, prevenção ou retardamento da reactivação de uma infecção por M. tuberculosis. Numa forma de realização preferida, um polipéptido de fusão ou ácido nucleico Mtb72f é administrado com um ou mais agentes quimioterapêuticos. Estas composições, polipéptidos e os ácidos nucleicos que os codificam são, por conseguinte, úteis para a 10 obtenção de uma resposta imunitária em mamíferos que é protectora contra a reactivação dos sintomas de doença.

Os ácidos nucleicos e polipéptidos de fusão Mtb72f da presente invenção podem compreender, adicionalmente, outros componentes concebidos para melhorarem a sua antigenicidade ou para melhorarem estes antigénios noutros aspectos. Por exemplo, o isolamento melhorado dos antigénios dos polipéptidos de fusão pode ser facilitado por meio da adição de um segmento de resíduos de histidina a uma extremidade do antigénio. As composições, polipéptidos e ácidos nucleicos da invenção podem compreender cópias adicionais de antigénios ou polipéptidos heterólogos adicionais de Mycobacterium sp. , tais como antigénio MTB8.4; antigénio MTB9.8, antigénio MTB9.9, antigénio MTB40, antigénio MTB41, antigénio ESAT-6, antigénio complexo MTB85, antigénio α-cristalino ou antigénio NS1.

Alternativamente ou adicionalmente, as composições, polipéptidos e ácidos nucleicos da invenção podem compreender cópias adicionais de outros antigénios de Mycobacterium sp., tais como Ag85B ou MTCC#2. As composições, polipéptidos e ácidos nucleicos da invenção também podem compreender polipéptidos adicionais de outras fontes. Por exemplo, as composições e proteínas de fusão da invenção podem incluir polipéptidos ou ácidos nucleicos codificando polipéptidos, em que o polipéptido melhora a expressão do antigénio, e. g., NS1, uma proteína do vírus influenza (ver, e. g., os documentos WO99/40188 e WO93/04175). Os ácidos nucleicos da invenção podem ser manipulados com base na preferência de codão e numa espécie de escolha, e. g., humanos. 11

As composições da proteína de fusão Mtb72f compreendem, habitualmente, um ou mais adjuvantes, e. g., AS01B (monofosforil-lípido A (MPL) e QS21 numa formulação lipossomal; ver a Publicação de Patente U.S. N° 2003/0143240); AS02A (3D-MPL e QS21 e uma emulsão de óleo em água; ver Bojang et ai., Lancet (2001) 358:1927); ENHANZYN (Detox); 3D-MPL; saponinas, incluindo Quil A e os seus componentes, e. g., QS21 e miméticos de saponina; CWS; TDM; AGP; oligonucleótidos imunoestimulatórios, e. g., CPG; Leif e os seus derivados. Numa forma de realização preferida, um polipéptido de fusão Mtb72f é administrado com um ou mais adjuvantes seleccionados do grupo consistindo em 3D-MPL e QS21 numa formulação lipossomal, e. g., AS01B e MPL e QS21 e uma emulsão de óleo em água (e. g., AS02A) . Os adjuvantes AS01B e AS02A são adicionalmente descritos em Pichyangkul, et al., Vaccine (2004) 22:3831-40.

Quando se distribui o antigénio Mtb72f como um ácido nucleico, este pode ser distribuído, por exemplo, num vector virai (i. e.r um vector de adenovírus) ou numa célula hospedeira mutante de bactéria (i. e., uma célula hospedeira mutante, avirulenta de Mycobacterium, Lactobacillus ou Bacillus, incluindo Bacillus de Calmette-Guerin (BCG) e Lactococcus lactis) .

Num aspecto, as composições são empregues em métodos para a prevenção ou tratamento da reactivação de tuberculose num indivíduo, o método compreendendo a etapa de administrar, a um mamífero já infectado com Mycobacterium tuberculosis, uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de fusão Mtb72f, ou um seu fragmento imunogénico, de uma espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose e um adjuvante, em que a proteína de 12 fusão Mtb72f induz uma resposta imunitária contra M. tuberculosis prevenindo, desse modo, a reactivação de tuberculose. Através da prática dos métodos da presente invenção, a reactivação de uma infecção por M. tuberculosis pode ser retardada (por exemplo, por um período de meses, anos ou indefinidamente).

Num aspecto, as composições são empregues em métodos para a prevenção ou tratamento da reactivação de tuberculose num indivíduo, o método compreendendo a etapa de administrar, a um mamífero já infectado com Mycobacterium tuberculosis, uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um ácido nucleico codificando uma proteína de fusão Mtb72f, ou um seu fragmento imunogénico, de uma espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose, em que a proteína de fusão Mtb72f expressa induz uma resposta imunitária contra M. tuberculosis prevenindo, desse modo, a reactivação de tuberculose.

Numa forma de realização, o ácido nucleico ou proteína de fusão Mtb72f é administrado a um indivíduo com uma infecção por M. tuberculosis activa. Numa forma de realização, o ácido nucleico ou proteína de fusão Mtb72f é administrado a um indivíduo com uma infecção por M. tuberculosis inactiva ou latente. Numa forma de realização, o ácido nucleico ou proteína de fusão Mtb72f é administrado a um indivíduo infectado com uma estirpe de M. tuberculosis multirresistente a fármacos. Numa forma de realização, o ácido nucleico ou proteína de fusão Mtb72f é administrado a um indivíduo que estava anteriormente imunizado com o Bacillus de Calmette-Guerin (BCG). 13

Em algumas formas de realização, o ácido nucleico ou proteína de fusão Mtb72f é administrado com um ou mais agentes quimioterapêuticos eficazes contra uma infecção por M. tuberculosis. Os exemplos desses agentes quimioterapêuticos incluem mas não estão limitados a amicacina, ácido aminossalicílico, capreomicina, ciclosserina, etambutol, etionamida, isoniazida, canamicina, pirazinamida, rifamicinas (i. e., rifampina, rifapentina e rifabutina), estreptomicina, ofloxacina, ciprofloxacina, claritromicina, azitromicina e fluoroquinolonas. Essa quimioterapia é determinada pela avaliação do médico assistente utilizando combinações de fármacos preferidas. Os agentes quimioterapêuticos de "primeira linha" utilizados para tratar uma infecção por M. tuberculosis que não é resistente a fármacos incluem isoniazida, rifampina, etambutol, estreptomicina e pirazinamida. Os agentes quimioterapêuticos de "segunda linha" utilizados para tratar uma infecção por M. tuberculosis que demonstrou resistência a fármacos a um ou mais fármacos de "primeira linha" incluem ofloxacina, ciprofloxacina, etionamida, ácido aminossalicílico, ciclosserina, amicacina, canamicina e capreomicina. 0 ácido nucleico ou proteína de fusão Mtb72f pode ser administrado antes, concorrentemente com ou após administração dos um ou mais agentes quimioterapêuticos eficazes contra uma infecção por M. tuberculosis. Numa forma de realização, o ácido nucleico ou proteína de fusão Mtb72f é administrado cerca de 2 semanas após o começo da administração de um ou mais agentes quimioterapêuticos. Os um ou mais agentes quimioterapêuticos são, em geral, administrados ao longo de um período de tempo, por exemplo, durante cerca de 1, 2, 3 ou 4 semanas, 2, 3, 4, 5, 6 ou 8 meses, 1 ano ou superior. 14

Em determinadas formas de realização, o efeito de um ácido nucleico ou proteína de fusão Mtb72f é melhorado através da administração com o Bacillus de Calmette-Guerin (BCG).

Em algumas formas de realização, uma imunização primária ou primeira administração de um ácido nucleico ou polipéptido de fusão Mtb72f é seguida por uma ou mais administrações de "reforço" ou subsequentes de um ácido nucleico ou polipéptido de fusão Mtb72f (método de "imunização primária e reforço"). Por exemplo, uma primeira administração com um ácido nucleico ou polipéptido de fusão Mtb72f é seguida por uma ou mais administrações subsequentes de um ácido nucleico ou polipéptido de fusão Mtb72f. Numa forma de realização, uma primeira administração com um ácido nucleico ou polipéptido de fusão Mtb72f é seguida por uma ou mais administrações subsequentes de um polipéptido de fusão Mtb72f. Numa forma de realização, uma primeira administração com um ácido nucleico ou polipéptido de fusão Mtb72f é seguida por uma ou mais administrações subsequentes de um ácido nucleico Mtb72f. Habitualmente a primeira administração ou "imunização primária" e a segunda administração ou "reforço" são dadas com cerca de 2-12 semanas de intervalo ou até 4-6 meses de intervalo. As administrações de "reforço" subsequentes são dadas com cerca de 6 meses de intervalo ou com 1, 2, 3, 4 ou 5 anos de intervalo. 0 tratamento de reforço convencional (e. g., uma administração de imunização primária de proteína seguida por uma administração de reforço de proteína) também é útil na prevenção ou tratamento contra a reactivação de M. tuberculosis.

Noutro aspecto, as composições são empregues em métodos para a redução ou encurtamento do período de tempo da quimioterapia contra uma infecção por M. tuberculosis, o 15 método compreendendo administrar a um mamífero já infectado com Mycobacterium tuberculosis, um ou mais agentes quimioterapêuticos eficazes contra uma infecção por M. tuberculosis e uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um polipéptido de fusão Mtb72f ou um seu fragmento imunogénico, de uma espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose e um adjuvante, em que o referido polipéptido de fusão Mtb72f induz uma resposta imunitária contra M. tuberculosis permitindo, desse modo, a redução ou encurtamento do período de tempo da quimioterapia contra uma infecção por M. tuberculosis. Habitualmente, a administração de um ácido nucleico ou polipéptido de fusão Mtb72f irá permitir o tratamento quimioterapêutico eficaz contra uma infecção por M. tuberculosis no espaço de 6 meses, 5 meses, 4 meses, 3 meses ou inferior.

As composições Mtb72f são, habitualmente, administradas a humanos, mas são eficazes noutros mamíferos incluindo mamíferos domésticos (i. e., cães, gatos, coelhos, ratos, murganhos, porquinhos-da-índia, hámsteres, chinchilas) e mamíferos agrícolas (i. e., vacas, porcos, ovelhas, cabras, cavalos).

No seu aspecto mais geral, uma proteína de fusão Mtb72f de acordo com a invenção é uma proteína compreendendo, pelo menos, um fragmento imunogénico de cada dos 3 antigénios Ral2-TbH9-Ra35.

Na nomenclatura do pedido, Ra35 refere-se ao terminal N de Mtb32A (Ra35FL), compreendendo, pelo menos, cerca dos primeiros 205 aminoácidos de Mtb32A de M. tuberculosis, cuja sequência nucleotídica e de aminoácidos é divulgada na Figura 4 do Pedido de Patente U.S. N° 09/597796 ou a correspondente região de outra 16 espécie de Mycobacterium. De um modo muito típico, Ra35 refere-se à porção da SEQ ID N° 2 divulgada no presente pedido, correspondendo aos resíduos 535-729. Alternativamente, refere-se a um variante de Ra35 no qual o aminoácido Ser, correspondendo a 710 na SEQ ID N° 2 é substituído com Ala.

Ral2 refere-se à terminação C de Mtb32A (Ra35FL), compreendendo, pelo menos, cerca dos últimos 132 aminoácidos de MTB32A de M. tuberculosis, cuja sequência é divulgada como SEQ ID N° 4 (ADN) e SEQ ID N° 66 (sequência de aminoácidos prevista) no pedido de patente U.S. N° 09/072967, ou a correspondente região de outra espécie de Mycobacterium. De um modo muito típico, Ral2 refere-se à porção da SEQ ID N° 2 divulgada no presente pedido, correspondendo aos resíduos 8-139.

Mtb39 (TbH9) refere-se a uma sequência, essencialmente a que é divulgada como SEQ ID N° 106 (ADNc de comprimento completo) e SEQ ID N° 107 (proteína de comprimento completo) nos pedidos de patente U.S. N° 08/658800, N° 08/659683, N° 08/818112 e N° 08/818111 e nos documentos WO97/09428 e WO97/09429. A sequência também é divulgada como SEQ ID N° 33 (ADN) e SEQ ID N° 91 (aminoácido) no pedido de patente U.S. N° 09/056559. De um modo muito típico, TbH9 refere-se à porção da SEQ ID N° 2 divulgada no presente pedido, correspondendo aos resíduos 143-532. O seguinte proporciona sequências de alguns antigénios individuais utilizados nas composições e proteínas de fusão da invenção:

Mtb32A (TbRa35FL ou Ra35FL), cuja sequência é divulgada como SEQ ID N° 17 (ADNc) e SEQ ID N° 79 (proteína) nos pedidos de patente 17 U.S. N° 08/523436, 08/523435, N° 08/658800, N° 08/659683, N° 08/818112, N° 09/056556 e N° 08/818111 e nos pedidos WO97/09428 e WO97/09429, ver também Skeiky et al., Infection and Immunity 67:3998-4007 (1999); O seguinte proporciona sequências de algumas proteínas de fusão da invenção:

TbH9-Ra35 (Mtb59F), cuja sequência é divulgada como SEQ ID N° 23 (ADNc) e SEQ ID N° 24 (proteína) no pedido de patente U.S. N° 09/287849 e no pedido PCT/US99/07717;

Ral2-TbH9-Ra35 (Mtb72f), cuja sequência é divulgada como SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 5 (ADN) e SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 6 (proteína) no presente pedido, assim como no pedido de patente US N° 09/223040 e no documento PCT/US99/07717. As sequências de SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 2 incluem uma cauda His de 6 resíduos His. Ο M72 que é um mutante de Mtb72f, no qual o resíduo de serina no aminoácido correspondendo à posição 710 em SEQ ID N° 2 foi alterado para Ala, (assim como 4 resíduos His tendo sido removidos da cauda His no terminal N), cuja sequência é divulgada como SEQ ID N° 3 (ADN) e SEQ ID N° 4 (proteína) no presente pedido. Um variante nestas sequências, nas quais a proteína tem uma cauda His de 6 resíduos His, é divulgado no pedido de patente US N° 09/597796 e no documento PCT/US01/19959. Em virtude da substituição de Ser710 com Ala, pensa-se que ο M72 é mais resistente à autólise do que o Mtb72f. 18 0 seguinte proporciona sequências de alguns antigénios adicionais utilizados nas composições e proteínas de fusão da invenção:

Mtb8.4 (DPV) , cuja sequência é divulgada como SEQ ID N° 101 (ADNc) e SEQ ID N° 102 (proteína) nos pedidos de patente U.S. N° 08/658800, N° 08/659683, N° 08/818112 e N° 08/818111 e nos pedidos WO97/09428 e WO97/09429;

Mtb9.8 (MSL) , cuja sequência é divulgada como SEQ ID N° 12 (ADN), SEQ ID N° 109 (sequência de aminoácidos prevista) e SEQ ID N° 110 a 124 (péptidos) nos pedidos de patente U.S. N° 08/859381, N° 08/858998, N° 09/073009 e N° 09/073010 e nos documentos PCT/US98/10407 e PCT/US98/10514;

Mtb9.9A (MTI, também conhecido por MTI-A), cuja sequência é divulgada como SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4 (ADN) e SEQ ID N° 29 e SEQ ID N° 51 a 66 (péptido ORF para MTI) nos pedidos de patente U.S. N° 08/859381, N° 08/858998, N° 09/073009 e v09/073010 e nos pedidos PCT/US98/10407 e PCT/US98/10514. Também existem dois outros variantes de MTI, denominados MTI-B e MTI-C;

Mtb40 (HTCC#1), cuja sequência é divulgada como SEQ ID N° 137 (ADNc) e 138 (sequência de aminoácidos prevista) nos pedidos de patente U.S. N° 09/073009 e N° 09/073010 e nos pedidos PCT/US98/10407 e PCT/US98/10514;

Mtb41 (MTCC#2), cuja sequência é divulgada como SEQ ID N° 140 (ADNc) e SEQ ID N° 142 (sequência de aminoácidos prevista) nos pedidos de patente U.S. N° 09/073009 e N° 09/073010 e nos pedidos PCT/US98/10407 e PCT/US98/10514; 19 ESAT-6, cuja sequência é divulgada como SEQ ID N° 103 (ADN) e SEQ ID N° 104 (sequência de aminoácidos prevista) no pedido de patente U.S. N° 09/072967. A sequência de ESAT -6 também é divulgada na Patente U.S. N° 5955077;

Antigénio cristalino a, cuja sequência é divulgada em Verbon et al., J. Bact. 174:1352-1359 (1992);

Antigénio complexo 85, cuja sequência é divulgada em Content et al., Infect. & Immunol. 59:3205-3212 (1991).

Cada das sequências acima também é divulgada em Cole et al. Nature 393:537 (1998) e podem ser consultadas em, e. g., http://www.sanger.ac.uk e http:/www.pasteur.fr/mycdb/.

As sequências acima são divulgadas nos pedidos de patente U.S. N° 08/523435, 08/523436, 08/658800, 08/659683, 08/818111, 08/818112, 08/942341, 08/942578, 08/858998, 08/859381, 09/056556, 09/072596, 09/072967, 09/073009, 09/073010, 09/223040, 09/287849 e nos pedidos de patente internacionais PCT/US 9 8/10407, PCT/US98/10514, PCT/US99/03265, PCT/US99/03268, PCT/US99/07717, WO97/09428 e WO97/09429, W098/16645, W098/16646, cada qual é incorporado por referência.

Os antigénios aqui descritos incluem variantes polimórficas e variações conservativamente modificadas, assim como homólogos interestirpe e interespécie de Mycobacterium. Além disso, os antigénios aqui descritos incluem subsequências ou sequências truncadas. As proteínas de fusão também podem conter polipéptidos adicionais, opcionalmente péptidos heterólogos de Mycobacterium ou outras fontes. Estes antigénios podem ser modificados, por exemplo, através da adição de sequências 20 peptídicas adaptadoras, como descrito abaixo. Estes péptidos adaptadores podem ser inseridos entre um ou mais componentes que compõem cada das proteínas de fusão.

DEFINIÇÕES 0 termo "reactivação de tuberculose" refere-se à manifestação tardia de sintomas de doença num indivíduo que dá positivo num teste de , mas não tem sintomas de doença evidentes. 0 indivíduo está infectado com M. tuberculosis e pode ou não ter anteriormente manifestado sintomas de doença activa que tivessem sido tratados suficientemente para colocar a tuberculose num estado inactivo ou latente. Os métodos para a prevenção ou tratamento da reactivação de tuberculosis podem, contudo, ser iniciados num indivíduo manifestando sintomas activos de doença. A "tuberculose primária" refere-se à enfermidade clínica (manifestação de sintomas de doença) directamente após infecção com M. tuberculosis. Ver Harrison's Principies of Internai Medicine, Capítulo 150, p. 953-966 (16a ed., Braunwald, et al., eds., 2005) . A "tuberculose secundária" ou "tuberculose pós-primária" refere-se à reactivação de uma infecção dormente, inactiva ou latente por M. tuberculosis. Ver Harrison's Principies of Internai Medicine, supra.

Uma "infecção activa de M. tuberculosis" refere-se a uma infecção por M. tuberculosis com sintomas de doença manifestados. 21

Uma "infecção inactiva, dormente ou latente de M. tuberculosis" refere-se a uma infecção por M. tuberculosis sem sintomas de doença manifestados.

Uma infecção por M. tuberculosis "resistente a fármacos" refere-se a uma infecção por M. tuberculosis em que a estirpe infectante não é mantida estática ou morta (é resistente a) um ou mais dos denominados agentes quimioterapêuticos de "linha da frente", eficazes no tratamento de uma infecção por M. tuberculosis (e. g. , isoniazida, rifampina, etambutol, estreptomicina e pirazinamida).

Uma infecção por M. tuberculosis "multirresistente a fármacos" refere-se a uma infecção por M. tuberculosis em que a estirpe infectante é resistente a dois ou mais dos agentes quimioterapêuticos de "linha da frente", eficazes no tratamento de uma infecção por M. tuberculosis. 0 "agente quimioterapêutico eficaz no tratamento de uma infecção por M. tuberculosis" refere-se a agentes farmacológicos conhecidos e utilizados na técnica para tratar infecções por M. tuberculosis. Os agentes farmacológicos exemplificados utilizados para tratar infecções por M. tuberculosis incluem mas não estão limitados a amicacina, ácido aminossalicilico, capreomicina, ciclosserina, etambutol, etionamida, isoniazida, canamicina, pirazinamida, rifamicinas (i. e., rifampina, rifapentina e rifabutina), estreptomicina, ofloxacina, ciprofloxacina, claritromicina, azitromicina e fluoroquinolonas. Os agentes quimioterapêuticos de "primeira linha" utilizados para tratar uma infecção por M. tuberculosis que não é resistente a fármacos incluem isoniazida, rifampina, etambutol, estreptomicina e pirazinamida. Os agentes quimioterapêuticos de 22 "segunda linha" utilizados para tratar uma infecção por M. tuberculosis que demonstrou resistência a fármacos a um ou mais fármacos de "primeira linha" incluem ofloxacina, ciprofloxacina, etionamida, ácido aminossalicilico, ciclosserina, amicacina, canamicina e capreomicina. Esses agentes farmacológicos são revistos no Capitulo 48 de The Pharmacological Basis of Therapeutics de Goodman e Gilman, Hardman e Limbird eds., 2001. "FL" refere-se a comprimento completo, i. e., um polipéptido que tem o mesmo comprimento que o polipéptido de tipo selvagem. "Cauda His" refere-se a um segmento de resíduos His, tipicamente 6 resíduos, que são inseridos no terminal N, habitualmente imediatamente após o resíduo de iniciação Met ou, então, no terminal C. São, habitualmente, heterólogos à sequência nativa mas são incorporados, visto que facilitam o isolamento através do melhoramento da ligação da proteína a resinas de cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC) . De um modo geral, a presença ou ausência de uma cauda His, não é relevante do ponto de vista de causar a dedução de uma resposta imunitária útil contra a proteína antigénica. No caso de ser deduzida uma reacção imunitária adversa contra a própria cauda His, considera-se que é melhor minimizar o comprimento da cauda His, e. g., para 4 resíduos ou menos, em particular dois resíduos. O termo "seu fragmento imunogénico" refere-se a um polipéptido compreendendo um epitopo que é reconhecido por linfócitos T citotóxicos, linfócitos T auxiliares ou células B. Tipicamente, um fragmento imunogénico de Mtb72f será um 23 polipéptido contendo 500 ou mais aminoácidos, e. g., 600 ou mais aminoácidos, e. g. , 700 ou mais aminoácidos. A invenção também abrange uma pluralidade de fragmentos, e. g. , fragmentos de sobreposição que, em conjunto, abrangem toda ou substancialmente toda (e. g., 500 ou mais aminoácidos, e. g., 600 ou mais aminoácidos, e. g., 700 ou mais aminoácidos) a sequência de uma proteína de fusão Mtb72F. O termo "espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose" inclui as espécies tradicionalmente consideradas como causando a doença de tuberculose, assim como espécies de Mycobacterium ambientais e oportunistas que causam tuberculose e doença pulmonar em doentes imunocomprometidos, tal como doentes com SIDA, e. g., M. tuberculosis, M. bovis ou M. africanum, BCG, M. avium, M. intracellulare, M. celatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M. simiae, M. vaccae, M. fortuitum e M. scrofulaceum (ver, e. g., Harrison's Principies of Internai Medicine, Capítulo 150, p. 953-966 (16a ed., Braunwald, et al., eds., 2005).

Um adjuvante refere-se aos componentes numa vacina ou composição terapêutica que aumentam a resposta imunitária específica ao antigénio (ver, e. g. , Edelman, AIDS Res. Hum Retroviruses 8:1409-1411 (1992)). Os adjuvantes induzem respostas imunitárias do tipo Th-1 e resposta do tipo Th-2. As citocinas do tipo Thl (e. g., IFN-γ, IL-2 e IL-12) tendem a favorecer a indução de resposta imunitária de mediação celular a um antigénio administrado, enquanto as citocinas do tipo Th-2 (e. g., IL-4, IL-5, 11-6, IL-10 e TNF-β) tendem a favorecer a indução de respostas imunitárias humorais. Os adjuvantes capazes de estimulação preferencial de uma resposta imunitária de mediaçao celular Th-1 são descritos nos documentos WO 94/00153 e WO 95/17209. "Acido nucleico" refere-se a desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos e os seus polímeros na forma de cadeia simples ou dupla. O termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos nucleotídicos conhecidos ou resíduos ou ligações de estrutura modificados que sao sintéticos, de ocorrência natural e de ocorrência não natural, que têm propriedades de ligaçao semelhantes às do ácido nucleico de referência e que são metabolizados num modo semelhante aos nucleótidos de referência. Os exemplos desses análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirais, 2-O-metilrribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos (PNA).

Salvo indicação em contrário, uma particular sequência de ácidos nucleicos também abrange implicitamente os seus variantes conservativamente modificados (e. g., substituições de codões degenerados) e sequências complementares, assim como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições de codões degenerados pode ser conseguida através da produção de sequências, nas quais a terceira posição de um ou mais codões seleccionados (ou todos) é substituída com resíduos de base mista e/ou desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (19 8 5); Rossolini et al., Mol. Ce 11. Probes 8:91-98 (1994)). O termo ácido nucleico é utilizado indistintamente com gene, ADNc, ARNm, oligonucleótido e polinucleótido.

Os termos "polipéptido" "péptido" e "proteína" são aqui utilizados indistintamente para referir um polímero de resíduos 25 de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos, nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um mimético químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, assim como a polímeros de aminoácidos de ocorrência natural e polímero de aminoácido de ocorrência não natural. 0 termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, assim como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam num modo semelhante ao dos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são os codificados pelo código genético, assim como os aminoácidos que são posteriormente modificados, e. g. , hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato e 0-fosfosserina. Análogos de aminoácidos, refere-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural, i. e., um carbono α que está ligado a um hidrogénio, um grupo carboxilo, um grupo amino e um grupo R, e. g., homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metilsulfónio de metionina. Esses análogos têm grupos R modificados (e. g., norleucina) ou estruturas peptídicas modificadas, mas retêm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural. Miméticos de aminoácidos, refere-se a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam num modo semelhante ao de um aminoácido de ocorrência natural.

Os aminoácidos podem ser aqui referidos pelos seus símbolos de três letras geralmente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica da IUPAC-IUB. Do mesmo modo, os nucleótidos podem ser referidos pelos seus códigos de letra única geralmente aceites. 26 "Variantes conservativamente modificadas" aplica-se a sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos. Em relação a particulares sequências de ácidos nucleicos, variantes conservativamente modificados refere-se aos ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, a sequências essencialmente idênticas. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer proteína dada. Por exemplo, os codões GCA, GCC, GCG e GCU codificam, todos, o aminoácido alanina. Deste modo, em cada posição onde uma alanina é especificada por um codão, o codão pode ser alterado para qualquer dos codões correspondentes descritos, sem alterar o polipéptido codificado. Essas variações de ácidos nucleicos são "variações silenciosas" que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Cada sequência de ácidos nucleicos aqui presente que codifica um polipéptido também descreve cada possível variação silenciosa do ácido nucleico. Um especialista reconhecerá que cada codão num ácido nucleico (excepto AUG, que é habitualmente o único codão para metionina, e TGG, que é habitualmente o único codão para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipéptido está implícita em cada sequência descrita.

Quanto a sequências de aminoácidos, um especialista reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais a um ácido nucleico, péptido, polipéptido ou sequência de proteína que alteram, adicionam ou eliminam um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada é um "variante conservativamente modificada", onde a alteração 27 resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente semelhante. As tabelas de substituições conservativas proporcionando aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas na técnica. Essas variantes conservativamente modificadas são adicionais a, e não excluem, variantes polimórficos, homólogos interespécies e alelos da invenção.

Os seguintes oito grupos contêm, cada, aminoácidos que são substituições conservativas mútuas: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T) e 8) Cisteina (C), Metionina (M) (ver, e. g., Creighton, Proteins (1984)). 0 termo "heterólogo", quando utilizado com referência a porções de um ácido nucleico, indica que o ácido nucleico compreende duas ou mais subsequências que não se encontram na mesma relação entre si na natureza. Por exemplo, o ácido 28 nucleico é, tipicamente, recombinantemente produzido, tendo duas ou mais sequências de genes não relacionadas, dispostas para produzir um novo ácido nucleico funcional, e. g., um promotor de uma fonte e uma região codificante de outra fonte. De modo semelhante, uma proteína heteróloga indica que a proteína compreende duas ou mais subsequências que não se encontram na mesma relação entre si na natureza (e. g., uma proteína de fusão) . "Polipéptido de fusão" ou "proteína de fusão" refere-se a uma proteína tendo, pelo menos, dois polipéptidos heterólogos de Mycobacterium sp. covalentemente ligados, directamente ou por meio de um aminoácido adaptador. Os polipéptidos formando a proteína de fusão estão, tipicamente, ligados do terminal C para o terminal N, embora também possam estar ligados do terminal C para o terminal C, terminal N para o terminal N ou terminal N para o terminal C. Os polipéptidos da proteína de fusão podem estar em qualquer ordem. Este termo também se refere a variantes conservativamente modificadas, variantes polimórficos, alelos, mutantes, subsequências e homólogos interespécies dos antigénios que compõem a proteína de fusão. Os antigénios de Mycobacterium tuberculosis são descritos em Cole et al., Nature 393:537 (1998), os quais divulgam o genoma integral de Mycobacterium tuberculosis. A sequência completa de Mycobacterium tuberculosis também pode ser encontrada em http://www.sanger.ac.uk e em http://www.pasteur.fr/mycdb/ (MycDB). Os antigénios de outras espécies de Mycobacterium que correspondem a antigénios de M. tuberculosis podem ser identificados, e. g., utilizando algoritmos de comparação de sequências, como aqui descritos, ou outros métodos conhecidos dos especialistas na técnica, e. g., ensaios de hibridação e ensaios de ligação de anticorpos. 29

As proteínas de fusão Mtb72f exemplificativas de utilização na presente invenção incluem:

Proteínas compreendendo os resíduos 8-729 da sequência da SEQ ID N° 2;

Proteínas compreendendo ou consistindo na sequência de SEQ ID N° 2 (=Mtb72f), opcionalmente sem a cauda His formando os resíduos 2-7 da referida sequência ou com uma cauda His de comprimento diferente;

Proteínas de fusão compreendendo a sequência de SEQ ID N° 2, opcionalmente sem a cauda His formando os resíduos 2-7 da referida sequência ou com uma cauda His de comprimento diferente (e. g., uma proteína compreendendo os resíduos 8-729 da sequência de SEQ ID N° 2), juntamente com um ou mais antigénios de M. tuberculosis, por exemplo, uma ou mais das proteínas listadas nos parágrafos [0045] a [0052] acima, ou um fragmento imunogénico de qualquer delas;

Proteínas compreendendo os resíduos 4-725 da sequência de SEQ ID N° 4 (=M72);

Proteínas compreendendo ou consistindo na sequência de SEQ ID N° 4 (=M72), opcionalmente sem a cauda His formando os resíduos 2-3 da referida sequência ou com uma cauda His de comprimento diferente; e

Proteínas de fusão compreendendo a sequência de SEQ ID N° 4, opcionalmente sem a cauda His formando os resíduos 2-3 da 30 referida sequência ou com uma cauda His de comprimento diferente (e. g., uma proteína compreendendo os resíduos 4-725 da sequência de SEQ ID N° 4), juntamente com um ou mais antigénios de M. tuberculosis, por exemplo uma ou mais das proteínas listadas nos parágrafos [0045] a [0052] acima, ou um fragmento imunogénico de qualquer delas;

Os fragmentos imunogénicos exemplificativos de uma proteína de fusão Mtb72f de utilização na presente invenção incluem:

Proteínas compreendendo ou consistindo na sequência de TbH9-Ra35 (Mtb59F); ou TbH9; ou Ra35; ou Ral2 e

Proteínas de fusão compreendendo as referidas sequências, juntamente com um ou mais antigénios de M. tuberculosis, por exemplo uma ou mais das proteínas listadas nos parágrafos [0045] a [0052] acima, ou um fragmento imunogénico de qualquer delas.

Os fragmentos imunogénicos exemplificativos adicionais de uma proteína de fusão Mtb72f de utilização na presente invenção incluem:

Proteínas compreendendo ou consistindo na sequência de TbH9-Ra35 (Mtb59F) ou Ra35, na qual a posição correspondendo a Ser710 na SEQ ID N° 2 foi alterada para Ala e

Proteínas de fusão compreendendo as referidas sequências, juntamente com um ou mais antigénios de M. tuberculosis, por exemplo uma ou mais das proteínas listadas nos parágrafos [0045] a [0052] acima ou um fragmento imunogénico de qualquer delas.

Mais especificamente, o Mtb72f é: 31 um polipéptido compreendendo os resíduos 8-729 da SEQ ID N° 2; ou um polipéptido consistindo nos resíduos 1 e 8-729 da SEQ ID N° 2, opcionalmente com uma cauda His inserida a seguir ao resíduo Met inicial; ou um polipéptido da SEQ ID N° 2; ou um polipéptido compreendendo os resíduos 4-725 da SEQ ID N° 4; ou um polipéptido consistindo nos resíduos 1 e 4-725 da SEQ ID N° 4, opcionalmente com uma cauda His inserida a seguir ao resíduo Met inicial; ou um polipéptido da SEQ ID N° 4; ou um polipéptido da SEQ ID N° 6.

As proteínas de fusão Mtb72f exemplificativas adicionais e os seus fragmentos imunogénicos incluem as proteínas mencionadas acima, nas quais os terminais N e/ou C foram encurtados em, e. g., 5 ou 4 ou 3 ou 2 ou 1 resíduos de aminoácidos.

As proteínas de fusão Mtb72f exemplificativas adicionais e os seus fragmentos imunogénicos incluem as proteínas mencionadas acima, nas quais até 10% dos aminoácidos, e. g., até 5% dos aminoácidos (e. g., até 10, e. g., até 5) aminoácidos foram substituídos com substituições conservativas, como aqui definido.

Os ácidos nucleicos Mtb72f exemplificativos de utilização na presente invenção incluem ácidos nucleicos (e. g., moléculas de ADN) codificando as supramencionadas proteínas de fusão Mtb72f exemplificativas e os seus fragmentos imunogénicos. Um conjunto de moléculas de ADN específicas que pode ser mencionado compreende os nucleótidos 63-2228 da SEQ ID N° 1. Outro conjunto 32 de moléculas de ADN específicas que pode ser mencionado compreende os nucleótidos 10-2175 da SEQ ID N° 3. As moléculas de ADN específicas que podem ser mencionadas compreendem ou consistem na SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 5. O termo "fundido" refere-se à ligação covalente entre dois polipéptidos numa proteína de fusão. Os polipéptidos são, tipicamente, ligados por meio de uma ligação peptídica, directamente entre si ou por meio de um aminoácido adaptador. Opcionalmente, os péptidos podem ser ligados por meio de ligações covalentes não peptídicas, conhecidas dos especialistas na técnica. A expressão "hibrida-se selectivamente (ou especificamente) a" refere-se à ligação, duplexação ou hibridação de uma molécula apenas a uma particular sequência nucleotídica, sob condições de hibridação restringentes, quando essa sequência está presente numa mistura complexa (e. g., ADN ou ARN total celular ou de biblioteca). A expressão "condições de hibridação restringentes" refere-se a condições sob as quais uma sonda se irá hibridar à sua subsequência alvo, tipicamente numa mistura complexa de ácido nucleico, mas não a outras sequências. As condições restringentes são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. As sequências mais compridas hibridam-se especificamente a temperaturas mais elevadas. Um guia extenso para a hibridação de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Em geral, as condições restringentes são seleccionadas para serem cerca de 5-10 °C mais baixas do que o 33 ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência especifica, a um pH de força iónica definida. A Tm é a temperatura (sob força iónica, pH e concentração nucleica definidos) a que 50% das sondas complementares ao alvo se hibridam à sequência alvo em equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, à Tm, 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio). As condições restringentes serão aquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,0 M de ião de sódio, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de ião de sódio (ou outros sais), a pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é, pelo menos, cerca de 30 °C para sondas curtas (e. g., 10 a 50 nucleótidos) e, pelo menos, cerca de 60 °C para sondas compridas (e. g., superiores a 50 nucleótidos). As condições restringentes também podem ser conseguidas com a adição de agentes de desestabilização, tal como formamida.

Para hibridação selectiva ou específica, um sinal positivo é, pelo menos, duas vezes o fundo, opcionalmente 10 vezes a hibridação de fundo. As condições de hibridação restringentes exemplificativas podem ser como se seguem: formamida a 50%, 5x SSC e SDS a 1%, incubação a 42 °C, ou, 5x SSC, SDS a 1%, incubação a 65 °C, com lavagem em 0,2x SSC e SDS a 0,1% a 65 °C.

Os ácidos nucleicos que não se hibridam entre si sob condições restringentes são, ainda, substancialmente idênticos se os polipéptidos que codificam forem substancialmente idênticos. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criada utilizando a máxima degenerescência de codão permitida pelo código genético. Nesses casos, o ácido nucleico hibrida-se tipicamente sob condições de hibridação moderadamente restringentes. As "condições de hibridação moderadamente restringentes" exemplificativas incluem uma 34 hibridação num tampão de formamida a 40%, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37 °C e uma lavagem em IX SSC a 45 °C. Uma hibridação positiva é, pelo menos, duas vezes o fundo. Alguém com conhecimentos gerais na técnica facilmente reconhecerá que podem ser utilizadas condições alternativas de hibridação e lavagem para proporcionar condições de restringência semelhante. "Anticorpo" refere-se a um polipéptido compreendendo uma região de estrutura de um gene de imunoglobulina ou os seus fragmentos, que se liga e reconhece especificamente um antigénio. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes da região constante capa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, assim como a miríade de genes de região variável de imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas como capa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon que, por sua vez, definem as classes de imunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

Uma unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) exemplificativa compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, tendo cada par uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 50-70 kDa). 0 terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos responsável, principalmente, pelo reconhecimento de antigénio. Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) referem-se a estas cadeias leves e pesadas, respectivamente.

Os anticorpos existem, e. g., como imunoglobulinas intactas ou como um número de fragmentos bem caracterizados, produzidos por digestão com diversas peptidases. Deste modo, por exemplo, a 35 pepsina digere um anticorpo abaixo das ligações dissulfureto na região de charneira para produzir F(ab) '2, um dimero de Fab que é, ele próprio, uma cadeia leve ligada a VH-CH1 por uma ligação dissulfureto. 0 F(ab)'2 pode ser reduzido, sob condições moderadas, para quebrar a ligação dissulfureto na região de charneira convertendo, desse modo, o dimero F(ab)'2 num monómero Fab'. 0 monómero Fab' é, essencialmente, Fab com parte da região de charneira (ver Fundamental Immunology (Paul ed., 3a ed., 1993). Embora diversos fragmentos de anticorpo sejam definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, um especialista entenderá que esses fragmentos podem ser sintetizados de novo quimicamente ou através da utilização de metodologia de ADN recombinante. Deste modo, o termo anticorpo, como aqui utilizado, também inclui fragmentos de anticorpo produzidos pela modificação de anticorpos intactos ou os sintetizados de novo utilizando metodologias de ADN recombinante (e. g., Fv de cadeia única) ou os identificados utilizando bibliotecas de apresentação fágica (ver, e. g., McCafferty et al., Nature 348 : 552-554 (1990) ) .

Para a preparação de anticorpos monoclonais ou policlonais, pode ser utilizada qualquer técnica conhecida na técnica (ver, e. g. , Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al. , Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al. , p. 77-96 em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy (1985)). As técnicas para a produção de anticorpos de cadeia simples (Patente U.S. N° 4946778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos para polipéptidos desta invenção. Do mesmo modo, os murganhos transgénicos, ou outros organismos, tal como outros mamíferos, podem ser utilizados para expressar anticorpos humanizados. Alternativamente, a tecnologia de apresentação fágica pode ser utilizada para identificar anticorpos e 36 fragmentos Fab heteroméricos que se ligam especificamente a antigénios seleccionados {ver, e. g., McCafferty et al. , Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)). A expressão "liga-se especificamente (ou selectivamente)" a um anticorpo ou "especificamente (ou selectivamente) imunorreactivo com", quando se faz referência a uma proteína ou péptido, refere-se a uma reacção de ligação que é determinativa da presença da proteína numa população heterogénea de proteínas e outros biológicos. Deste modo, sob condições designadas de imunoensaio, os anticorpos especificados ligam-se a uma proteína particular, pelo menos, duas vezes o fundo e não se ligam substancialmente, numa quantidade significativa, a outras proteínas presentes na amostra. A ligação específica a um anticorpo, sob essas condições, pode requerer um anticorpo que é seleccionado pela sua especificidade para uma proteína particular. Por exemplo, os anticorpos policlonais deduzidos para proteínas de fusão podem ser seleccionados para se obter apenas os anticorpos policlonais que são especificamente imunorreactivos com proteína de fusão e não com componentes individuais da proteína de fusão. Esta selecção pode ser conseguida através da subtracção de anticorpos que reagem de modo cruzado com os antigénios individuais. Pode ser utilizada uma variedade de formatos de imunoensaio para seleccionar anticorpos especificamente imunorreactivos com uma proteína particular. Por exemplo, os imunoensaios de ELISA de fase sólida são rotineiramente utilizados para seleccionar anticorpos especificamente imunorreactivos com uma proteína (ver, e. g., Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) e Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998), para uma descrição de formatos de imunoensaios e condições que podem ser utilizadas 37 para determinar imunorreactividade específica). Tipicamente, uma reacção específica ou selectiva será, pelo menos, duas vezes o sinal ou ruído de fundo e, de um modo mais típico, mais de 10 a 100 vezes o fundo.

Os polinucleótidos podem compreender uma sequência nativa (i. e., uma sequência endógena que codifica um antigénio individual, ou uma sua porção) ou podem compreender um variante de uma dessas sequências. Os variantes polinucleotídicos podem conter uma ou mais substituições, adições, deleções e/ou inserções, de modo que a actividade biológica do polipéptido de fusão codificado não seja diminuída, em relação a um polipéptido de fusão compreendendo antigénios nativos. Os variantes exibem, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 70% de identidade, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 80% de identidade e, de um modo muito preferido, pelo menos, cerca de 90% de identidade com uma sequência polinucleotídica que codifica um polipéptido nativo ou uma sua porção.

Os termos "idêntico" ou percentagem de "identidade", no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipéptidos, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleótidos que são iguais (i. e., 70% de identidade, opcionalmente 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade ao longo de uma região especificada), quando se compara e alinha para máxima correspondência ao longo de uma janela de comparação, ou região designada, como medida utilizando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências ou por alinhamento manual e inspecção visual. Essas sequências são, depois, referidas como sendo "substancialmente idênticas". Esta definição também se refere ao comprimento de 38 uma sequência de teste. Opcionalmente, a identidade existe ao longo de uma região que tem, pelo menos, cerca de 25 a cerca de 50 aminoácidos ou nucleótidos em comprimento ou, opcionalmente, ao longo de uma região que tem 75-100 aminoácidos ou nucleótidos em comprimento.

Para a comparação de sequências, tipicamente, uma sequência actua como uma sequência de referência, com a qual as sequências de teste são comparadas. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e referência são introduzidas num computador, se necessário são designadas coordenadas de subsequência e são designados parâmetros de programa de algoritmo de sequência. Podem ser utilizados os parâmetros predefinidos do programa ou podem ser designados parâmetros alternativos. O algoritmo de comparação de sequência, depois, calcula a percentagem de identidade de sequência para as sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.

Uma "janela de comparação", como aqui utilizada, inclui referência a um segmento de qualquer um do número de posições contíguas seleccionadas do grupo consistindo em desde 25 a 500, habitualmente 50 a cerca de 200, de um modo mais habitual, cerca de 100 a cerca de 150, nas quais uma sequência pode ser comparada com uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas, depois das duas sequências estarem alinhadas de modo óptimo. Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser conduzido, e. g., pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método 39 de pesquisa para semelhança de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), por implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software da Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) ou por alinhamento manual e verificação visual (ver, e. g. , Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et ai., eds., suplemento de 1995)).

Um exemplo de um algoritmo útil é o PILEUP. 0 PILEUP cria um alinhamento de múltiplas sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas, utilizando alinhamentos progressivos, aos pares, para mostrar a relação e percentagem de identidade de sequência. Também representar graficamente uma árvore ou dendrograma mostrando relações de agrupamento utilizadas para criar o alinhamento. 0 PILEUP utiliza uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987). O método utilizado é semelhante ao método descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). O programa pode alinhar até 300 sequências, cada de um comprimento máximo de 5000 nucleótidos ou aminoácidos. O processo de múltiplo alinhamento começa com o alinhamento aos pares das duas sequências mais semelhantes, produzindo um agrupamento de duas sequências alinhadas. Este agrupamento é, depois, alinhado com a próxima sequência mais relacionada ou agrupamento de sequências alinhadas. Os dois agrupamentos de sequências são alinhados por uma extensão simples do alinhamento aos pares de duas sequências individuais. O alinhamento final é conseguido por uma série de alinhamentos progressivos, aos pares. O programa é corrido através da designação de sequências especificas e suas coordenadas de aminoácido ou nucleótido para regiões de comparação de sequência e através da designação dos parâmetros do programa. Utilizando o PILEUP, uma sequência de referência é 40 comparada com outras sequências de teste para determinar a relação de percentagem de identidade de sequência utilizando os seguintes parâmetros: ponderação de lacuna predefinida (3,00), ponderação de comprimento de lacuna predefinida (0,10) e lacunas de extremidade ponderadas. O PILEUP pode ser obtido do pacote de software de análise de sequências GCG, e. g., versão 7.0 (Devereaux et ai., Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984).

Outro exemplo de algoritmo que é adequado para determinar a percentagem de identidade de sequência e semelhança de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0 que são descritos em Altschul et al. , Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. O software para a realização de análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve, em primeiro lugar, a identificação de pares de sequências de pontuação elevada (HSP), através da identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de pesquisa, que correspondem ou satisfazem alguma pontuação T limiar de valor positivo, quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento numa sequência da base de dados. T é referido como o limiar de pontuação de palavra de vizinhança (Altschul et al., supra). Estes acertos de palavras de vizinhança iniciais actuam como sementes para a iniciação de pesquisas para encontrar HSP mais compridas que as contêm. Os acertos de palavras são estendidos em ambas as direcções ao longo de cada sequência tanto quanto a pontuação de alinhamento cumulativo possa ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas utilizando, para sequências nucleotidicas, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos não correspondentes; 41 sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, é utilizada uma matriz de pontuação para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acertos de palavras em cada direcção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa diminui pela quantidade X do seu valor máximo conseguido; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou o final de uma das sequências é conseguido. Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências nucleotídicas) utiliza como predefinições um tamanho de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) ou 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cadeias. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTN utiliza, como predefinições, um tamanho de palavra de 3 e expectativa (E) de 10 e os alinhamentos (B) da matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915 (1989)) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cadeias. O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da semelhança entre duas sequências (ver, e. g., Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 90:5873-5787 (1993)). Uma medida de semelhança proporcionada pelo algoritmo BLAST é a probabilidade da soma menor (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleótidos ou aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado semelhante a uma sequência de referência se a probabilidade da soma menor, numa comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nucleico de referência, for inferior a cerca de 0,2, de um modo mais preferido inferior a cerca de 0,01 e, de um modo muito preferido, inferior a cerca de 0,001. 42

COMPOSIÇÕES POLINUCLEOTÍDICAS

Como aqui utilizados, os termos "segmento de ADN" e "polinucleótido" referem-se a uma molécula de ADN que foi isolada, isenta de ADN genómico total de uma particular espécie. Por conseguinte, um segmento de ADN codificando um polipéptido, refere-se a um segmento de ADN que contém uma ou mais sequências codificantes sendo, porém, substancialmente isolado ou purificado de ADN genómico total da espécie a partir da qual o segmento de ADN é obtido. Estão incluídos nos termos "segmento de ADN" e "polinucleót ido" segmentos de ADN e fragmentos mais pequenos desses segmentos e também vectores recombinantes incluindo, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, fagemídeos, fago, vírus e semelhantes.

Como será compreendido pelos especialistas na técnica, os segmentos de ADN desta invenção podem incluir sequências genómicas, sequências extra-genómicas e codificadas por plasmídeos e segmentos génicos mais pequenos manipulados que expressam, ou podem ser adaptados para expressar, proteínas, polipéptidos, péptidos e semelhantes. Esses segmentos podem ser naturalmente isolados ou modificados sinteticamente pela mão do homem. "Isolado", como aqui utilizado, significa que um polinucleótido está substancialmente afastado de outras sequências codificantes e que o segmento de ADN não contém grandes porções de ADN codificante não relacionado, tais como grandes fragmentos cromossómicos ou outros genes funcionais ou regiões codificando polipéptidos. Certamente, isto refere-se ao segmento de ADN como originalmente isolado e não exclui genes ou 43 regiões codificantes adicionadas posteriormente ao segmento pela mão do homem.

Como será reconhecido pelo especialista, os polinucleótidos podem ser de cadeia simples (codificantes ou anti-sentido) ou de cadeia dupla e podem ser moléculas de ADN (genómico, ADNc ou sintético) ou ARN. As moléculas de ARN incluem moléculas de ARNHn, que contêm intrões e correspondem a uma molécula de ADN, num modo um-para-um, e moléculas de ARNm que não contêm intrões. As sequências codificantes ou não codificantes adicionais podem, mas não necessitam, de estar presentes num polinucleótido da presente invenção e um polinucleótido pode, mas não necessita, estar ligado a outras moléculas e/ou materiais de suporte.

Os polinucleótidos podem compreender uma sequência nativa (i. e., uma sequência endógena que codifica um antigénio de Mycobacterium ou uma sua porção) ou podem compreender um variante, ou um equivalente biológico ou antigénico funcional, de uma dessas sequências. Os variantes polinucleotidicos podem conter uma ou mais substituições, adições, deleções e/ou inserções, como adicionalmente descrito abaixo, de um modo preferido para que a imunogenicidade do polipéptido codificado não seja diminuída em relação a uma proteína tumoral nativa. 0 efeito na imunogenicidade do polipéptido codificado pode, em geral, ser avaliado como aqui descrito. 0 termo "variantes" também abrange genes homólogos de origem xenogénica.

Em formas de realização adicionais, a presente invenção proporciona polinucleótidos e polipéptidos isolados, compreendendo diversos comprimentos de segmentos contíguos de sequências, idênticos ou complementares a uma ou mais das sequências aqui divulgadas. Por exemplo, são proporcionados por 44 esta invenção polinucleótidos que compreendem, pelo menos, cerca de 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 ou 1000, ou mais, nucleótidos contíguos de uma ou mais das sequências aqui divulgadas, assim como todos os comprimentos intermédios entre aqueles. Será facilmente compreendido que "comprimentos intermédios", neste contexto, significa qualquer comprimento entre os valores citados, tais como 16, 17, 18, 19, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, , 31, 32, etc. ; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153 , etc.; incluindo todos os números inteiros de 200 -500 ; 500- -1000 e semelhantes.

Os polinucleótidos da presente invenção ou os seus fragmentos, independentemente do comprimento da própria sequência codificante, podem ser combinados com outras sequências de ADN, tais como promotores, sinais de poliadenilação, sítios de restrição enzimática adicionais, sítios de múltipla clonagem, outros segmentos codificantes e semelhantes, de modo que o seu comprimento total possa variar consideravelmente. Está, por conseguinte, contemplado que pode ser empregue um fragmento de ácido nucleico de praticamente qualquer comprimento, com o comprimento total sendo, de um modo preferido, limitado pela facilidade de preparação e utilização no protocolo de ADN recombinante pretendido. Por exemplo, segmentos de ADN ilustrativos, com comprimentos totais de cerca de 10000, cerca de 5000, cerca de 3000, cerca de 2000, cerca de 1000, cerca de 500, cerca de 200, cerca de 100, cerca de 50 pares de bases em comprimento e semelhantes, (incluindo todos os comprimentos intermédios), estão contemplados como sendo úteis em muitas implementações desta invenção.

Além disso, será entendido por alguém com conhecimentos gerais na técnica que, como resultado da degenerescência do 45 código genético, há muitas sequências nucleotídicas que codificam um polipéptido como aqui descrito. Alguns destes polinucleótidos têm homologia mínima com a sequência nucleotídica de qualquer gene nativo. Não obstante, os polinucleótidos que variam devido a diferenças na utilização de codão, estão especificamente contemplados pela presente invenção, por exemplo, polinucleótidos que estão optimizados para selecção de codão humano e/ou primata. Adicionalmente, os alelos dos genes compreendendo as sequências polinucleotídicas aqui proporcionadas estão dentro do âmbito da presente invenção. Os alelos são genes endógenos que estão alterados como resultado de uma ou mais mutações, tais como deleções, adições e/ou substituições de nucleótidos. 0 ARNm e proteína resultante podem, mas não necessitam, de ter uma estrutura ou função alterada. Os alelos podem ser identificados utilizando técnicas habituais (tais como hibridação, amplificação e/ou comparação de sequências de base de dados).

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO POLINUCLEOTÍDICA

Os polinucleótidos podem ser identificados, preparados e/ou manipulados utilizando qualquer de uma variedade de técnicas bem estabelecidas. Por exemplo, um polinucleótido pode ser identificado, como descrito em mais detalhe abaixo, através do rastreio de uma micromatriz de ADNc para expressão associada a tumor (i. e., expressão que é, pelo menos, duas vezes maior num tumor do que em tecido normal, como determinado utilizando um ensaio representativo aqui proporcionado). Esses rastreios podem ser realizados, por exemplo, utilizando uma micromatriz Synteni (Paio Alto, CA) , de acordo com as instruções do fabricante (e, essencialmente, como descrito por Schena et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 93:10614-10619 (1996) e Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:2150-2155 (1997)). Alternativamente, os polinucleótidos podem ser amplificados a partir de ADNc preparado de células expressando as proteínas aqui descritas, tal como células de M. tuberculosis. Esses polinucleótidos podem ser amplificados por reacção de polimerização em cadeia (PCR). Para esta abordagem, os iniciadores específicos de sequência podem ser concebidos com base nas sequências aqui proporcionadas e podem ser adquiridos ou sintetizados.

Uma porção amplificada de um polinucleótido da presente invenção pode ser utilizada para isolar um gene de comprimento completo a partir de uma biblioteca adequada (e. g., uma biblioteca de ADNc de M. tuberculosis) , utilizando técnicas bem conhecidas. Dentro dessas técnicas, uma biblioteca (ADNc ou genómico) é rastreada utilizando uma ou mais sondas ou iniciadores polinucleotídicos, adequados para amplificação. De um modo preferido, uma biblioteca é seleccionada por tamanho para incluir moléculas maiores. As bibliotecas de iniciadores aleatórios também podem ser preferidas para identificação de regiões 5' e a montante dos genes. As bibliotecas genómicas são preferidas para a obtenção de intrões e sequências prolongando-se em 5'.

Para técnicas de hibridação, uma sequência parcial pode ser marcada (e. g., por tradução nick ou marcação de extremidade com 32P) , utilizando técnicas bem conhecidas. Uma biblioteca bacteriana ou de bacteriófago é, depois, em geral, rastreada através da hibridação de filtros contendo colónias bacterianas desnaturadas (ou áreas contendo placas de fago) com a sonda marcada (ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2000)) . As colónias ou placas que se hibridam são 47 seleccionadas e expandidas e o ADN é isolado para análise adicional. Os clones de ADNc podem ser analisados para determinar a quantidade de sequência adicional, por exemplo, por PCR, utilizando um iniciador da sequência parcial e um iniciador do vector. Os mapas de restrição e sequências parciais podem ser gerados para identificar um ou mais clones de sobreposição. A sequência completa pode ser, depois, determinada utilizando técnicas habituais que podem envolver a geração de uma série de clones de deleção. As sequências de sobreposição resultantes podem ser, depois, agrupadas numa única sequência contígua. Uma molécula de ADNc de comprimento completo pode ser gerada através da ligação de fragmentos adequados, utilizando técnicas bem conhecidas.

Alternativamente, existem numerosas técnicas de amplificação para a obtenção de uma sequência codificante de comprimento completo a partir de uma sequência de ADNc parcial. Dentro dessas técnicas, a amplificação é, em geral, realizada por PCR. Para realizar a etapa de amplificação, pode ser utilizado qualquer de uma variedade de kits comercialmente disponíveis. Os iniciadores podem ser concebidos utilizando, por exemplo, software bem conhecido na técnica. Os iniciadores têm, de um modo preferido, 22-30 nucleótidos em comprimento, têm um teor de GC, pelo menos, de 50% e emparelham-se à sequência alvo a temperaturas de cerca de 68 °C a 72 °C. A região amplificada pode ser sequenciada como descrito acima e as sequências de sobreposição agrupadas numa sequência contígua.

Uma dessas técnicas de amplificação é o PCR inverso (ver Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186 (1988)), que utiliza enzimas de restrição para produzir um fragmento na região conhecida do gene. O fragmento é, depois, circularizado por 48 ligação intramolecular e utilizado como um molde para PCR, com iniciadores divergentes derivados da região conhecida. Numa abordagem alternativa, as sequências adjacentes a uma sequência parcial podem ser recuperadas por amplificação com um iniciador para uma sequência adaptadora e um iniciador específico para uma região conhecida. As sequências amplificadas são, tipicamente, submetidas a um segundo ciclo de amplificação com o mesmo iniciador adaptador e um segundo iniciador específico para a região conhecida. Uma variação deste processo, que emprega dois iniciadores que iniciam a extensão da sequência conhecida em direcções opostas, é descrita no documento WO 96/38591. Outra dessas técnicas é conhecida como "amplificação rápida de extremidades de ADNc" ou RACE. Esta técnica envolve a utilização de um iniciador interno e um iniciador externo, que se hibridam a uma região de poliA ou sequência de vector, para identificar sequências que estão em 5' e 3' de uma sequência conhecida. As técnicas adicionais incluem PCR de captura (Lagerstrom et ai., PCR Methods Applic. 1:111-19 (1991)) e PCR móvel (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60 (1991)). Para se obter uma sequência de ADNc de comprimento completo, também podem ser empregues outros métodos empregando a amplificação.

Em determinados casos, é possível obter-se uma sequência de ADNc de comprimento completo por análise de sequências proporcionadas numa base de dados de caudas de sequências expressas (EST) , tal como a disponível a partir do GenBank. As pesquisas para EST de sobreposição podem ser, em geral, realizadas utilizando programas bem conhecidos (e. g., pesquisas BLAST no NCBI) e essas EST podem ser utilizadas para produzir uma sequência contígua de comprimento completo. As sequências de ADN de comprimento completo também podem ser obtidas por análise de fragmentos genómicos. 49

EXPRESSÃO POLINUCLEOTÍDICA EM CÉLULAS HOSPEDEIRAS

Noutras formas de realização da invenção, as sequências polinucleotídicas ou os seus fragmentos que codificam polipéptidos da invenção, ou proteínas de fusão ou suas equivalentes funcionais, podem ser utilizadas em moléculas de ADN recombinante para dirigir a expressão de um polipéptido em células hospedeiras apropriadas. Devido à inerente degenerescência do código genético, podem ser produzidas outras sequências de ADN que codificam substancialmente a mesma ou uma sequência de aminoácidos funcionalmente equivalente e estas sequências podem ser utilizadas para clonar e expressar um determinado polipéptido.

Como será compreendido pelos especialistas na técnica, pode ser vantajoso, em alguns casos, produzir sequências nucleotídicas codificando polipéptidos possuindo codões de ocorrência não natural. Por exemplo, podem ser seleccionados os codões preferidos por um particular hospedeiro procariótico ou eucariótico para aumentar a taxa de expressão de proteína ou para produzir um transcrito de ARN recombinante, tendo propriedades desejáveis, tal como uma meia-vida que seja mais longa do que a de um transcrito produzido a partir da sequência de ocorrência natural.

Além disso, as sequências polinucleotídicas da presente invenção podem ser manipuladas utilizando métodos conhecidos, em geral, na técnica, de modo a alterar as sequências codificando polipéptidos por uma variedade de razões, incluindo mas não limitadas a alterações que modificam a clonagem, processamento e/ou expressão do produto génico. Por exemplo, um rearranjo de ADN, por fragmentação aleatória e reagrupamento de PCR de 50 fragmentos génicos e oligonucleótidos sintéticos, pode ser utilizado para manipular sequências nucleotidicas. Além disso, a mutagénese dirigida pontual pode ser utilizada para inserir novos sitios de restrição, alterar padrões de glicosilação, alterar a preferência de codão, produzir variantes de excisão ou introduzir mutações e assim por diante.

Noutra forma de realização da invenção, as sequências de aminoácidos naturais, modificadas ou recombinantes podem ser ligadas a uma sequência heteróloga para codificar uma proteína de fusão. Por exemplo, para rastrear bibliotecas peptídicas para inibidores de actividade polipeptídica, pode ser útil codificar uma proteína quimérica que pode ser reconhecida por um anticorpo comercialmente disponível. Uma proteína de fusão também pode ser manipulada para conter um sítio de clivagem, localizado entre a sequência codificando polipéptido e a sequência de proteína heteróloga, de modo que o polipéptido possa ser removido por clivagem e purificado da fracção heteróloga.

As sequências codificando um polipéptido desejado podem ser sintetizadas, na totalidade ou em parte, utilizando métodos químicos bem conhecido na técnica (ver Caruthers, Μ. H. et ai., Nucl. Acids Res. Symp. Ser., p. 215-223 (1980), Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser., p. 225-232 (1980)).

Alternativamente, a própria proteína pode ser produzida utilizando métodos químicos para sintetizar a sequência de aminoácidos de um polipéptido ou uma sua porção. Por exemplo, a síntese peptídica pode ser realizada utilizando diversas técnicas de fase sólida (Roberge et al. , Science 269:202-204 (1995)) e a síntese automatizada pode ser conseguida, por 51 exemplo, utilizando o Sintetizador Peptidico ABI 431A (Perkin Elmer, Paio Alto, CA).

Um péptido sintetizado de novo pode ser substancialmente purificado por cromatografia liquida de alta resolução preparativa (e. g., Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principies (1983)) ou outras técnicas comparáveis disponíveis na técnica. A composição dos péptidos sintéticos pode ser confirmada por análise ou sequenciação de aminoácidos (e. g., o processo de degradação de Edman) . Adicionalmente, a sequência de aminoácidos de um polipéptido, ou sua qualquer parte, pode ser alterada durante a síntese directa e/ou combinada utilizando métodos químicos com sequências de outras proteínas, ou sua qualquer parte, para produzir um variante polipeptídico.

De modo a expressar um polipéptido desejado, as sequências nucleotídicas codificando o polipéptido, ou equivalentes funcionais, podem ser inseridas num vector de expressão apropriado, i. e., um vector que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência codificante inserida. Os métodos que são bem conhecidos dos especialistas na técnica podem ser utilizados para construir vectores de expressão, contendo sequências codificando um polipéptido de interesse e elementos de controlo de transcrição e de tradução apropriados. Estes métodos incluem técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. Essas técnicas são descritas em Sambrook et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2000) e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (actualizado anualmente). 52

Uma variedade de sistemas de vector/hospedeiro de expressão pode ser utilizada para conter e expressar sequências polinucleotidicas. Estes incluem mas não estão limitados a microrganismos, tais como bactérias transformadas com vectores de expressão de ADN recombinantes de bacteriófago, plasmídeo ou cosmideo; levedura transformada com vectores de expressão de levedura; sistemas de células de insectos infectadas com vectores de expressão de vírus (e. g., baculovírus); sistemas de células de plantas transformadas com vectores de expressão de vírus (e. g. , vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou com vectores de expressão bacterianos (e. g., plasmídeos Ti ou pBR322; ou sistemas de células animais.

Os "elementos de controlo" ou "sequências regulatórias" presentes num vector de expressão são as regiões não traduzidas dos estimuladores de vectores, promotores, regiões 5' e 3' não traduzidas que interagem com proteínas de célula hospedeira para efectuar a transcrição e tradução. Esses elementos podem variar na sua resistência e especificidade. Dependendo do sistema de vector e hospedeiro utilizado, pode ser utilizado qualquer número de elementos de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e indutível. Por exemplo, quando se clona em sistemas bacterianos, podem ser utilizados promotores indutíveis, tais como o promotor lacZ híbrido do fagemídeo PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) ou plasmídeo PSP0RT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) e semelhantes. Em sistemas celulares mamíferos, são, em geral, preferidos os promotores de genes de mamíferos ou de vírus de mamíferos. Se for necessário produzir uma linha celular que contenha múltiplas cópias da sequência codificando um polipéptido, os vectores baseados em SV40 ou EBV podem ser, de um modo vantajoso, utilizados com um marcador seleccionável apropriado. 53 bacterianos, sistemas

Em sistemas bacterianos, dependendo da utilização pretendida para o polipéptido expresso, pode ser seleccionado um número de vectores de expressão. Por exemplo, quando são necessárias grandes quantidades, por exemplo para a indução de anticorpos, podem ser utilizados vectores que dirigem expressão de elevado nivel de proteínas de fusão que são facilmente purificadas. Esses vectores incluem mas não estão limitados aos vectores de clonagem e expressão de E. coli multifuncionais, tal como BLUESCRIPT (Stratagene), no qual a sequência codificando o polipéptido de interesse pode ser ligada ao vector, em fase, com sequências para a Met amino-terminal e os 7 resíduos subsequentes de β-galactosidase, de modo que seja produzida uma proteína híbrida; vectores pIN (Van Heeke &Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509 (1989)) e semelhantes. Os vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) também podem ser utilizados para expressar polipéptidos estranhos como proteínas de fusão com glutationo S-transferase (GST). Em geral, essas proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas de células lisadas, por adsorção em esférulas de glutationo-agarose, seguida de eluição na presença de glutationo livre. As proteínas preparadas nesses sistemas podem ser concebidas para incluir sítios de clivagem de heparina, trombina ou protease de factor XA, de modo que o polipéptido clonado de interesse possa ser libertado da fracção de GST, conforme desejado.

Na levedura Saccharomyces cerevisiae, pode ser utilizado um número de vectores contendo promotores constitutivos ou indutíveis, tais como factor alfa, álcool oxidase e PGH. Para revisões, ver Ausubel et al. (supra) e Grant et al., Methods Enzymol. 153:516-544 (1987). 54

Nos casos onde sejam utilizados vectores de expressão de plantas, a expressão de sequências codificando polipéptidos pode ser dirigida por qualquer de um número de promotores. Por exemplo, os promotores virais, tais como os promotores 35S e 19S de CaMV, podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com a sequência condutora ómega de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)). Alternativamente, podem ser utilizados promotores de plantas, tais como os promotores da pequena subunidade de RUBISCO ou choque térmico (Coruzzi et al. , EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie et al., Science 224:838-843 (1984) e Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)). Estas construções podem ser introduzidas em células de plantas por transformação de ADN directa ou transfecção mediada por patógeno. Essas técnicas são descritas num número de revisões geralmente disponíveis (ver, e. g., Hobbs em McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, p. 191-196 (1992)).

Para expressar um polipéptido de interesse, também pode ser utilizado um sistema de insecto. Por exemplo, num desses sistemas, o vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) é utilizado como um vector para expressar genes estranhos em células de Spodoptera frugiperda ou em Trichoplusia larvae. As sequências codificando o polipéptido podem ser clonadas dentro numa região não essencial do vírus, tal como o gene da poliedrina e colocadas sob o controlo do promotor da poliedrina. A inserção bem-sucedida da sequência codificando o polipéptido irá tornar o gene da poliedrina inactivo e produzir vírus recombinante desprovido de proteína de revestimento. Os vírus recombinantes podem ser, depois, utilizados para infectar, por exemplo, células de S. frugiperda ou Trichoplusia larvae, nas quais o polipéptido de interesse 55 pode ser expresso (Engelhard et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91:3224-3227 (1994)).

Em células hospedeiras de mamífero, está, em geral, disponível um número de sistemas de expressão de base virai. Por exemplo, nos casos onde um adenovírus é utilizado como um vector de expressão, as sequências codificando um polipéptido de interesse podem ser ligadas a um complexo de transcrição/tradução de adenovírus, consistindo no promotor tardio e sequência condutora tripartida. A inserção numa região de EI ou E3 não essencial do genoma virai pode ser utilizada para obter um vírus viável que é capaz de expressar o polipéptido em células hospedeiras infectadas (Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:3655-3659 (1984)). Além disso, os estimuladores de transcrição, tal como o estimulador do vírus do sarcoma de Rous (RSV), podem ser utilizados para aumentar a expressão em células hospedeiras mamíferas. Os métodos e protocolos para trabalhar com vectores de adenovírus são revistos em Adenovírus Methods and Protocols, 1998. As referências adicionais em relação à utilização de vectores de adenovírus podem ser encontradas em Adenovírus: A Medicai Dictionary, Bibliography, and Annotated Research Guide to Internet References, 2004.

Os sinais de iniciação específicos também podem ser utilizados para se conseguir uma tradução mais eficiente de sequências codificando um polipéptido de interesse. Esses sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Nos casos onde as sequências codificando o polipéptido, seu codão de iniciação e sequências a montante estejam inseridas no vector de expressão apropriado, podem não ser necessários sinais de controlo de transcrição ou tradução adicionais. Contudo, nos 56 casos onde é inserida apenas a sequência codificante ou uma sua porção, devem ser proporcionados sinais de controlo de tradução exógenos, incluindo o codão de iniciação ATG. Além disso, o codão de iniciação deve estar na fase de leitura correcta para garantir a tradução do inserto integral. Os elementos de tradução exógenos e codões de iniciação podem ser de diversas origens, naturais e sintéticas. A eficiência de expressão pode ser melhorada pela inclusão de estimuladores que sejam apropriados para o particular sistema celular que é utilizado, tal como os descritos na literatura (Scharf. et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)).

Além disso, uma estirpe de célula hospedeira pode ser escolhida pela sua capacidade para modular a expressão das sequências inseridas ou para processar a proteína expressa no modo desejado. Essas modificações do polipéptido incluem mas não estão limitadas a acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. O processamento pós-tradução que cliva uma forma "prepro" da proteína também pode ser utilizado para facilitar a correcta inserção, enrolamento e/ou função. Podem ser escolhidas diferentes células hospedeiras, tais como CHO, HeLa, MDCK, HEK293 e WI38, que têm maquinaria celular especifica e mecanismos característicos para essas actividades pós-tradução, para garantir a correcta modificação e processamento da proteína estranha.

Para a produção de longo prazo, de alto rendimento, de proteínas recombinantes é, em geral, preferida a expressão estável. Por exemplo, as linhas celulares que expressam, de um modo estável, um polinucleótido de interesse, podem ser transformadas utilizando vectores de expressão que podem conter origens de replicação virais e/ou elementos de expressão 57 endógenos e um gene marcador seleccionável no mesmo ou num vector separado. A seguir à introdução do vector, as células podem ser deixadas crescer, durante 1-2 dias, em meios enriguecidos, antes de serem mudadas para meios selectivos. 0 objectivo do marcador seleccionável é o de conferir resistência para selecção e a sua presença permite o crescimento e recuperação de células gue expressam com sucesso as sequências introduzidas. Os clones resistentes de células transformadas de um modo estável podem ser proliferados, utilizando técnicas de cultura de tecidos apropriadas ao tipo de célula.

Para recuperar linhas celulares transformadas pode ser utilizado qualquer número de sistemas de selecção. Estes incluem mas não estão limitados aos genes da timidina cinase do virus herpes simplex (Wigler et al., Cell 11:223-32 (1977)) e adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., Cell 22:817-23 (1990)) que podem ser empregues em células tk.sup.- ou aprt.sup.-, respectivamente. Do mesmo modo, a resistência a antimetabolito, antibiótico ou herbicida pode ser utilizada como a base para selecção; por exemplo, dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77:3567-70 (1980)); npt, que confere resistência aos aminoglicósidos, neomicina e G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)); e ais ou pat, que conferem resistência ao clorossulfurão e fosfinotricina acetiltransferase, respectivamente (Murry, supra). Foram descritos genes seleccionáveis adicionais, por exemplo, trpB, que permite às células utilizarem indole em vez de triptofano, ou hisD, que permite às células utilizarem histinol em vez de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:8047-51 (1988)). Recentemente, a utilização de marcadores visíveis tem ganho popularidade com marcadores, tais como 58 antocianinas, β-glucuronidase e o seu substrato GUS e luciferase e o seu substrato luciferina, sendo largamente utilizados, não apenas para identificar transformantes, mas também para quantificar a quantidade de expressão transiente ou estável de proteína, atribuível a um sistema de vector específico (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995)).

Embora a presença/ausência de expressão de gene marcador sugira que o gene de interesse também esteja presente, a sua presença e expressão podem necessitar de ser confirmadas. Por exemplo, se a sequência codificando um polipéptido for inserida numa sequência de gene marcador, as células recombinantes contendo sequências podem ser identificadas pela ausência de função de gene marcador. Alternativamente, um gene marcador pode ser colocado em posição tandem com uma sequência codificando polipéptidos, sob o controlo de um único promotor. A expressão do gene marcador, em resposta à indução ou selecção, também indica, habitualmente, expressão do gene em posição tandem.

Alternativamente, as células hospedeiras que contêm e expressam uma sequência polinucleotídica desejada podem ser identificadas por uma variedade de processos conhecidos dos especialistas na técnica. Estes processos incluem mas não estão limitados a hibridações de ADN-ADN ou ADN-ARN e técnicas de bioensaio ou imunoensaio de proteína que incluem tecnologias baseadas em membrana, solução ou chip, para a detecção e/ou quantificação de ácido nucleico ou proteína. É conhecida na técnica uma variedade de protocolos para detecção e medição da expressão de produtos codificados por polinucleotidos, utilizando anticorpos policlonais ou monoclonais específicos para o produto. Os exemplos incluem o 59 ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e separação de células activadas por fluorescência (FACS). Um imunoensaio de dois sítios, de base monoclonal, utilizando anticorpos monoclonais reactivos para dois epitopos não interferentes num determinado polipéptido, pode ser preferido para algumas aplicações mas, um ensaio de ligação competitiva, também pode ser empregue. Este e outros ensaios são descritos, entre outros lugares, em Hampton et ai., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) e Maddox et al., J. Exp. Med. 158:1211-1216 (1983).

Uma ampla variedade de marcadores e técnicas de conjugação é conhecida dos especialistas na técnica e pode ser utilizada em diversos ensaios de ácidos nucleicos e aminoácidos. Os meios para a produção de sondas de hibridação ou PCR marcadas, para a detecção de sequências relacionadas com polinucleótidos, incluem oligomarcação, tradução nick, marcação de extremidade ou amplificação por PCR, utilizando um nucleótido marcado. Alternativamente, as sequências ou quaisquer suas porções, podem ser clonadas num vector para a produção de uma sonda de ARNm. Esses vectores são conhecidos na técnica, estão comercialmente disponíveis e podem ser utilizados para sintetizar sondas de ARN in vitro por adição de uma ARN polimerase apropriada, tais como T7, T3 ou SP6 e nucleótidos marcados. Estes processos podem ser conduzidos utilizando uma variedade de kits comercialmente disponíveis. As moléculas ou marcadores repórter adequados que podem ser utilizados incluem radionuclídeos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminescentes ou cromogénicos, assim como substratos, cofactores, inibidores, partículas magnéticas e semelhantes. 60

As células hospedeiras transformadas com uma sequência polinucleotídica de interesse podem ser cultivadas sob condições adequadas para a expressão e recuperação da proteína da cultura celular. A proteína produzida por uma célula recombinante pode ser segregada ou estar contida intracelularmente, dependendo da sequência e/ou do vector utilizado. Como será compreendido pelos especialistas na técnica, os vectores de expressão contendo polinucleótidos da invenção, podem ser concebidos para conter sequências sinal que dirigem a secreção do polipéptido codificado através de uma membrana celular procariótica ou eucariótica. Outras construções recombinantes podem ser utilizadas para ligar sequências codificando um polipéptido de interesse a sequências nucleotídicas codificando um domínio polipeptídico que irá facilitar a purificação de proteínas solúveis. Esses domínios facilitando a purificação incluem mas não estão limitados a péptidos quelantes de metal, tal como módulos de histidina-triptofano que permitem a purificação em metais imobilizados, domínios de proteína A que permitem a purificação em imunoglobulina imobilizada e o domínio utilizado no sistema de purificação de extensão/afinidade FLAGS (Immunex Corp, Seattle Wash.). A inclusão de sequências adaptadoras cliváveis, tais como as específicas para o Factor XA ou enterocinase (Invitrogen. San Diego, Calif.), entre o domínio de purificação e o polipéptido codificado, pode ser utilizada para facilitar a purificação. Um desses vectores de expressão proporciona a expressão de uma proteína de fusão, contendo um polipéptido de interesse e um ácido nucleico codificando 6 resíduos de histidina precedendo um sítio de clivagem de tioredoxina ou enterocinase. Os resíduos de histidina facilitam a purificação em IMIAC (cromatografia de afinidade de ião metálico imobilizado), como descrito em Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3:263-281 (1992), enquanto o sítio de clivagem de 61 enterocinase proporciona um meio para purificação do polipéptido desejado a partir da proteína de fusão. Uma discussão de vectores que contêm proteínas de fusão é proporcionada em Kroll et al.r DNA Cell Biol. 12:441-453 (1993)).

Adicionalmente aos métodos de produção recombinantes, os polipéptidos da invenção e os seus fragmentos, podem ser produzidos por síntese peptídica directa, utilizando técnicas de fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)). A síntese de proteína pode ser realizada utilizando técnicas manuais ou por automatização. A síntese automatizada pode ser conseguida, por exemplo, utilizando o Sintetizador Peptídico 43 IA da Applied Biosystems (Perkin Elmer) . Alternativamente, diversos fragmentos podem ser quimicamente sintetizados separadamente e combinados utilizando métodos químicos para produzir a molécula de comprimento completo.

TÉCNICAS DE DISTRIBUIÇÃO POLINUCLEOTIDICA IN VIVO

Em formas de realização adicionais, as construções genéticas compreendendo um ou mais dos polinucleótidos da invenção são introduzidas dentro de células in vivo. Isto pode ser conseguido utilizando qualquer de uma variedade de abordagens bem conhecidas, várias das quais são esboçadas abaixo para efeitos de ilustração.

1. ADENOVIRUS

Um dos métodos preferidos para distribuição in vivo de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos envolve a utilização de 62 um vector de expressão de adenovírus. "Vector de expressão de adenovírus" tenciona incluir as construções contendo sequências de adenovírus suficientes para (a) suportar o empacotamento da construção e (b) expressar um polinucleótido que foi clonado nesta, numa orientação sentido ou anti-sentido. Certamente, no contexto de uma construção anti-sentido, a expressão não requer que o produto génico seja sintetizado. 0 vector de expressão compreende uma forma geneticamente manipulada de um adenovírus. 0 conhecimento da organização genética do adenovírus, um vírus de ADN de cadeia dupla de 36 kb, linear, permite a substituição de grandes fragmentos de ADN adenoviral com sequências estranhas até 7 kb (Grunhaus & Horwitz, 1992). Em contraste com o retrovírus, a infecção adenoviral de células hospedeiras não resulta em integração cromossómica, porque o ADN adenoviral pode replicar-se num modo epissomal, sem potencial genotoxicidade. Do mesmo modo, os adenovírus são estruturalmente estáveis e não foi detectado rearranjo genómico após extensa amplificação. 0 adenovírus pode infectar virtualmente todas as células epiteliais, independentemente do estádio do seu ciclo celular. Até agora, a infecção adenoviral parece estar ligada apenas a doença moderada, tal como a doença respiratória aguda em humanos. 0 adenovírus é particularmente adequado para utilização como um vector de transferência génica, devido ao seu genoma de tamanho médio, facilidade de manipulação, elevado título, ampla gama de célula alvo e elevada infecciosidade. Ambas as extremidades do genoma virai contêm repetições invertidas (ITR) de 100-200 pares de bases que são elementos cis necessários para a replicação e empacotamento de ADN virai. As regiões precoce (E) e tardia (L) do genoma contêm diferentes unidades de 63 transcrição que estão divididas pelo começo da replicação de ADN virai. A região EI (EIA e E1B) codifica proteínas responsáveis pela regulação da transcrição do genoma virai e alguns genes celulares. A expressão da região E2 (E2A e E2B) resulta na síntese das proteínas para replicação de ADN virai. Estas proteínas estão envolvidas na replicação de ADN, expressão génica tardia e desactivação de célula hospedeira (Renan, 1990). Os produtos dos genes tardios, incluindo a maioria das proteínas da cápside virai, são expressos apenas após processamento significativo de um único transcrito primário, emitido pelo promotor tardio principal (MLP). O MLP (localizado em 16,8 m.u.) é particularmente eficiente durante a fase tardia de infecção e todos os ARNm emitidos deste promotor possuem uma sequência condutora 5' tripartida (TPL) que os torna ARNm preferidos para tradução.

Num sistema actual, o adenovírus recombinante é gerado a partir da recombinação homóloga entre vector vaivém e vector de provírus. Devido à possível recombinação entre dois vectores provirais, o adenovírus de tipo selvagem pode ser gerado a partir deste processo. Por conseguinte, é crítico isolar um único clone de vírus de uma placa individual e examinar a sua estrutura genómica. A produção e propagação dos actuais vectores de adenovírus, que são de replicação deficiente, dependem de uma única linha celular auxiliadora, designada 293, que foi transformada a partir de células de rim embrionário humano por fragmentos de ADN Ad5 e expressam, de um modo constitutivo, proteínas EI (Graham et al., 1977). Visto que a região E3 é dispensável do genoma do adenovírus (Jones & Shenk, 1978), os actuais vectores de adenovírus, com o auxílio de células 293, 64 transportam ADN estranho na região El, na D3 ou em ambas (Graham & Prevec, 1991) . Na natureza, o adenovírus pode empacotar, aproximadamente, 105% do genoma de tipo selvagem (Ghosh-Choudhury et al., 1987), proporcionando capacidade para cerca de 2 kB extra de ADN. Combinada com os, aproximadamente, 5.5 kB de ADN que são substituíveis nas regiões El e E3, a capacidade máxima do actual vector de adenovírus está abaixo de 7.5 kB, ou cerca de 15% do comprimento total do vector. Mais de 80% do genoma virai do adenovírus permanece na estrutura do vector e é a fonte da citotoxicidade produzida pelo vector. Do mesmo modo, a deficiência de replicação do vírus, com a El eliminada, é incompleta. Por exemplo, a perda da expressão génica virai foi observada com os vectores actualmente disponíveis a elevadas multiplicidades de infecção (MOI) (Mulligan, 993).

As linhas celulares auxiliares podem ser derivadas de células humanas, tais como células embrionárias de rim humano, células musculares, células hematopoiéticas ou outras células embrionárias humanas mesenquimatosas ou epiteliais. Alternativamente, as células auxiliares podem ser derivadas das células de outras espécies mamíferas que sejam permissivas ao adenovírus humano. Essas células incluem, e. g., células Vero ou outras células embrionárias de macaco mesenquimatosas ou epiteliais. Como referido acima, a linha celular auxiliar actualmente preferida é a 293.

Recentemente, Racher et al. (1995) divulgaram métodos melhorados para cultivar células 293 e propagar em adenovírus. Num formato, os agregados de células naturais são cultivados através da inoculação de células individuais em frascos spinner siliconizados de 1 Litro (Techne, Cambridge, UK), contendo 100- 65 200 mL de meio. Após agitação, a 40 rpm, a viabilidade celular é estimada com azul de tripano. Noutro formato, microtransportadores Fibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 g/L) são empregues como se segue. Um inoculo celular, ressuspenso em 5 mL de meio, é adicionado ao transportador (50 mL) num frasco Erlenmeyer de 250 mL e mantido estacionário, com agitação ocasional, durante 1 a 4 h. O meio é, depois, substituído com 50 mL de meio fresco e a agitação iniciada. Para a produção de vírus, as células são deixadas crescer, a cerca de 80% de confluência, tempo após o qual o meio é substituído (para 25% do volume final) e o adenovírus adicionado, a uma MOI de 0,05. As culturas são mantidas estacionárias, de um dia para o outro, após o que o volume é aumentado para 100% e a agitação começada, durante mais 72 h.

Com excepção do requisito de que o vector de adenovírus seja de replicação defeituosa ou, pelo menos, condicionalmente defeituosa, não se pensa que a natureza o sucesso práctico do vector de adenovírus seja crucial para a prática bem-sucedida da invenção. O adenovírus pode ser de qualquer dos 42 diferentes serotipos ou subgrupos A-F conhecidos. O Adenovírus de tipo 5 do subgrupo C é o material de partida preferido, de modo a obter-se um vector de adenovírus de replicação defeituosa condicional, para utilização na presente invenção, visto que o Adenovírus de tipo 5 é um adenovírus humano sobre o qual se conhece uma grande quantidade de informação bioquímica e genética e tem sido historicamente utilizado para a maioria das construções empregando adenovírus como vector.

Como referido acima, o vector típico de acordo com a presente invenção é de replicação defeituosa e não terá uma região EI de adenovírus. Deste modo, será muito conveniente 66 introduzir o polinucleótido codificando o gene de interesse na posição a partir da qual foram removidas as sequências codificando El. Contudo, a posição de inserção da construção dentro das sequências de adenovirus não é crítica para a invenção. 0 polinucleótido codificando o gene de interesse também pode ser inserido no lugar da região E3 eliminada, em vectores de substituição de E3, como descrito por Karlsson et al. (1986), ou na região E4 onde uma linha celular auxiliar ou vírus auxiliar complementa o defeito de E4. 0 adenovirus é fácil de cultivar e manipular e exibe ampla gama de hospedeiro in vitro e in vivo. Este grupo de vírus pode ser obtido em elevados títulos, e. g. , 109-10n unidades de formação de placas por mL e é altamente infeccioso. 0 ciclo de vida do adenovirus não requer integração no genoma da célula hospedeira. Os genes estranhos, distribuídos por vectores de adenovirus, são epissomais e, por conseguinte, têm baixa genotoxicidade para as células hospedeiras. Não foram referidos efeitos secundários em estudos de vacinação com adenovirus de tipo selvagem (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), demonstrando a sua segurança e potencial terapêutico como vectores de transferência génica in vivo.

Os vectores de adenovirus têm sido utilizados na expressão génica eucariótica (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) e desenvolvimento de vacinas (Grunhaus & Horwitz, 1992; Graham & Prevec, 1992). Recentemente, estudos animais sugeriram que o adenovirus recombinante poderia ser utilizado para terapia génica (Stratford-Perricaudet & Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Estudos sobre a administração de adenovirus recombinante a diferentes tecidos incluem instilação em traqueia (Rosenfeld et al., 1991; 67

Rosenfeld et al., 1992), injecção muscular (Ragot et al., 1993), injecções intravenosas periféricas (Herz & Gerard, 1993) e inoculação estereostática dentro do cérebro (Le Gal La Salle et al., 1993).

Os vectores de adenovirus podem ser originários de adenovirus humanos. Alternativamente, podem ser originários de adenovirus de outra espécie, e. g., chimpanzé que pode ter a vantagem de que os vectores virais não são neutralizados por anticorpos contra adenovirus humano em circulação em muitos indivíduos humanos (ver, e. g. , Tatsis N et ai., (2005) Gene Ther., 1 de Dez.; [Publicado electronicamente enquanto ainda no prelo]).

2. RETROVÍRUS

Os retrovírus são um grupo de vírus de ARN de cadeia simples, caracterizados por uma capacidade para converter o seu ARN em ADN de cadeia dupla em células infectadas por um processo de transcrição reversa (Coffin, 1990). O ADN resultante integra-se, depois, de um modo estável, nos cromossomas celulares como um provírus e dirige a síntese de proteínas virais. A integração resulta na retenção das sequências génicas virais na célula receptora e os seus descendentes. O genoma retroviral contém três genes, gag, pol e env que codificam para proteínas da cápside, enzima polimerase e componentes de envelope, respectivamente. Uma sequência verificada a montante do gene gag contém um sinal para empacotamento do genoma em viriões. Estão presentes duas sequências de repetição terminal longa (LTR) nas extremidades 5' e 3' do genoma virai. Estas contêm sequências promotoras e estimuladoras fortes e também são 68 requeridas para integração no genoma de célula hospedeira (Coffin, 1990) .

De modo a construir um vector retroviral, um ácido nucleico codificando uma ou mais sequências oligonucleotidicas ou polinucleotidicas de interesse, é inserido no genoma virai no lugar de determinadas sequências virais, para produzir um virus que é de replicação defeituosa. De modo a produzir viriões, é construída uma linha celular de empacotamento contendo os genes gag, pol e env, mas sem a LTR e componentes de empacotamento (Mann et al. , 1983). Quando um plasmídeo recombinante contendo um ADNc, juntamente com a LTR retroviral e sequências de empacotamento, é introduzido dentro desta linha celular (por precipitação com fosfato de cálcio, por exemplo), a sequência de empacotamento permite que o transcrito de ARN do plasmídeo recombinante seja empacotado em partículas virais que são, depois, segregadas para os meios de cultura (Nicolas &

Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983) . Os meios contendo os retrovírus recombinantes são, depois, recolhidos, opcionalmente concentrados e utilizados para a transferência génica. Os vectores retrovirais são capazes de infectar uma ampla variedade de tipos de células. Contudo, a integração e expressão estável requer a divisão das células hospedeiras (Paskind et al., 1975).

Foi recentemente desenvolvida uma nova abordagem, concebida para permitir o direccionamento específico de vectores de retrovírus, com base na modificação química de um retrovírus pela adição química de resíduos de lactose ao envelope virai. Esta modificação poderia permitir a infecção específica de hepatócitos por meio de receptores de sialoglicoproteína. 69

Foi concebida uma abordagem diferente para o direccionamento de retrovírus recombinantes, na qual foram utilizados anticorpos biotinilados contra uma proteína de envelope retroviral e contra um receptor celular específico. Os anticorpos foram ligados por meio dos componentes de biotina através da utilização de estreptavidina (Roux et al., 1989). Utilizando anticorpos contra os antigénios do complexo de histocompatibilidade principal de classe I e classe II, estes demonstraram a infecção de uma variedade de células humanas que continham os antigénios de superfície com um vírus ecotrópico in vitro (Roux et al., 1989).

3. VÍRUS ADENO-ASSOCIADOS 0 AAV (Ridgeway, 1988; Hermonat & Muzycska, 1984) é um parovírus, identificado como uma contaminação de stocks adenovirais. É um vírus ubíquo (os anticorpos estão presentes em 85% da população humana do EUA) que não foi ligado a qualquer doença. Também é classificado como um dependovírus, porque a sua replicação está dependente da presença de um vírus auxiliar, tal como adenovírus. Foram isolados cinco serotipos, dos quais o AAV-2 é o mais bem caracterizado. 0 AAV tem um ADN linear de cadeia simples que está encapsidado nas proteínas de cápside VP1, VP2 e VP3, para formar um virião icosaédrico, de 20 a 24 nm em diâmetro (Muzyczka & McLaughlin, 1988). O ADN de AAV tem, aproximadamente, 4,7 quilobases de comprimento. Contém duas fases de leitura aberta e está flanqueado por duas ITR. Há dois genes principais no genoma de AAV: rep e cap. O gene rep codifica para proteínas responsáveis por replicações virais, ao passo que o cap codifica para a 70 proteína da cápside VP1-3. Cada ITR forma uma estrutura em gancho em forma de T. Estas repetições terminais são os únicos componentes cis essenciais do AAV para a integração cromossómica. Por conseguinte, o AAV pode ser utilizado como um vector, com todas as sequências codificantes virais removidas e substituídas pela cassete de genes para distribuição. Três promotores virais foram identificados e denominados p5, pl9 e p40, de acordo com a sua posição mapeada. A transcrição a partir de p5 e pl9 resulta na produção de proteínas rep e a transcrição a partir de p40 produz as proteínas da cápside (Hermonat & Muzyczka, 19 8 4) . Há vários factores que instaram os investigadores a estudar a possibilidade de utilização de rAAV como um vector de expressão. Um é que os requisitos para a distribuição de um gene para se integrar no cromossoma hospedeiro são surpreendentemente poucos. É necessário ter as ITR de 145 pb, que são apenas 6% do genoma de AAV. Isto deixa espaço no vector para montar uma inserção de ADN de 4,5 kb. Embora esta capacidade de transporte possa impedir o AAV de distribuir genes grandes, está amplamente adaptado para a distribuição das construções anti-sentido da presente invenção. 0 AAV também é uma boa escolha de veículos de distribuição, devido à sua segurança. Há um mecanismo de resgate relativamente complicado: para mobilizar o rAAV são requeridos, não apenas adenovírus de tipo selvagem, mas também genes de AAV. Do mesmo modo, o AAV não é patogénico e não está associado a qualquer doença. A remoção de sequências codificantes virais minimiza reacções imunitárias à expressão génica virai e, por conseguinte, o rAAV não evoca uma resposta inflamatória. 71

4. OUTROS VECTORES VIRAIS COMO CONSTRUÇÕES DE EXPRESSÃO

Na presente invenção, outros vectores virais podem ser empregues como construções de expressão para a distribuição de sequências oligonucleotidicas ou polinucleotídicas a uma célula hospedeira. Podem ser empregues vectores derivados de vírus, tais como vírus da vacínia (Ridgeway, 1988; Coupar et ai., 1988), lentivírus, vírus da poliomielite e herpesvírus. Oferecem várias características atractivas para diversas células mamíferas (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).

Com o recente reconhecimento de vírus da hepatite B defeituosos, foi possível ter uma nova perspectiva da relação estrutura-função de diferentes sequências virais. Estudos in vitro mostraram que o vírus poderia reter a capacidade para o empacotamento dependente de auxiliar e transcrição reversa, não obstante a deleção de até 80% do seu genoma (Horwich et al., 1990) . Isto sugeriu que grandes porções do genoma poderiam ser substituídas com material genético estranho. O hepatotropismo e persistência (integração) eram propriedades particularmente atractivas para a transferência génica dirigida para o fígado. Chang et al. (1991), introduziram o gene da cloranfenicol acetiltransferase (CAT) no genoma do vírus da hepatite B de pato no local das sequências codificantes de polimerase, superfície e pré-superfície. Foi co-transfectado com vírus de tipo selvagem numa linha celular de hepatoma aviária. Meios de cultura contendo elevados títulos do vírus recombinante foram utilizados para infectar hepatócitos primários de patinho. A expressão génica estável de CAT foi detectada durante, pelo menos, 24 dias após a transfecção (Chang et al., 1991). 72

5. VECTORES ΝΑΟ VIRAIS

De modo a efectuar a expressão das sequências oligonucleotídicas ou polinucleotídicas da presente invenção, a construção de expressão deve ser distribuída para uma célula. Esta distribuição pode ser conseguida in vitro, como em processos laboratoriais para a transformação de linhas celulares, ou in vivo ou ex vivo, como no tratamento de determinados estados de doença. Como descrito acima, um mecanismo preferido para distribuição é por meio de infecção virai, onde a construção de expressão está encapsulada numa partícula virai infecciosa.

Depois da construção de expressão ter sido distribuída para dentro da célula, o ácido nucleico codificando as sequências oligonucleotídicas ou polinucleotídicas desejadas pode ser posicionado e expresso em diferentes sítios. Em determinadas formas de realização, o ácido nucleico codificando a construção pode ser integrado, de um modo estável, no genoma da célula. Esta integração pode ser na localização e orientação específicas por meio de recombinação homóloga (substituição génica) ou pode ser integrada numa localização aleatória, não específica (aumento génico). Em formas de realização adicionais, o ácido nucleico pode ser mantido, de um modo estável, na célula como um segmento separado, epissomal, de ADN. Esses segmentos de ácidos nucleicos ou "epissomas" codificam sequências suficientes para permitir a manutenção e replicação independente ou em sincronização com o ciclo de célula hospedeira. De que modo a construção de expressão é distribuída para uma célula, e onde, na célula, permanece o ácido nucleico, está dependente do tipo de construção de expressão empregue. 73

Em determinadas formas de realização da invenção, a construção de expressão, compreendendo uma ou mais sequências oligonucleotídicas ou polinucleotídicas, pode simplesmente consistir em ADN recombinante livre ou plasmídeos. A transferência da construção pode ser realizada por qualquer dos métodos mencionados acima que, fisicamente ou quimicamente, permeabilizam a membrana celular. Isto é particularmente aplicável para a transferência in vitro mas pode ser aplicado, igualmente, na utilização in vivo. Dubensky et al. (1984) injectaram, com sucesso, ADN de poliomavírus na forma de precipitados de fosfato de cálcio dentro de fígado e baço de murganhos adultos e recém-nascidos, demonstrando replicação virai activa e infecção aguda. Benvenisty & Reshef (1986) também demonstraram que a injecção intraperitoneal directa de plasmideos precipitados por fosfato de cálcio resulta na expressão dos genes transfectados. Está previsto que ADN codificando um gene de interesse também pode ser transferido, num modo semelhante, in vivo e expressar o produto génico.

Outra forma de realização da invenção para a transferência de uma construção de expressão de ADN livre para células pode envolver o bombardeamento de partículas. Este método depende da capacidade de acelerar microprojécteis revestidos com ADN a uma velocidade elevada, permitindo-lhes perfurar as membranas celulares e entrar nas células, sem as matar (Klein et al., 1987) . Foram desenvolvidos vários dispositivos para acelerar partículas pequenas. Um desses dispositivos baseia-se numa descarga de alta voltagem para produzir uma corrente eléctrica que, por sua vez, proporciona a força motriz (Yang et al., 1990). Os microprojécteis utilizados têm consistido em substâncias biologicamente inertes, tais como esférulas de tungsténio ou ouro. 74

Os órgãos seleccionados, incluindo o fígado, pele e tecido muscular de ratos e murganhos, foram bombardeados in vivo (Yang et al.f 1990; Zelenin et ai., 1991). Isto pode requerer exposição cirúrgica do tecido ou células, para eliminar qualquer tecido intermédio entre o canhão e o órgão alvo, i. e., tratamento ex vivo. De novo, ADN codificando um gene particular pode ser distribuído por meio deste método e ser ainda incorporado pela presente invenção.

COMPOSIÇÕES POLIPEPTÍDICAS A presente invenção, em outros aspectos, proporciona composições polipeptídicas. Em geral, um polipéptido da invenção será um polipéptido isolado (ou um seu epitopo, variante ou fragmento activo), derivado de uma espécie mamífera. De um modo preferido, o polipéptido é codificado por uma sequência polinucleotídica aqui divulgada ou uma sequência que se hibrida, sob condições moderadamente restringentes, a um sequência polinucleotídica aqui divulgada. Alternativamente, o polipéptido pode ser definido como um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos contígua, de uma sequência de aminoácidos aqui divulgada, ou cujo polipéptido compreende uma sequência de aminoácidos integral aqui divulgada.

As porções imunogénicas podem ser, em geral, identificadas utilizando técnicas bem conhecidas, tais como as resumidas em Fundamental Immunology, 3a ed., 243-247 (1993) e referências aí citadas. Essas técnicas incluem o rastreio de polipéptidos quanto à capacidade de reagirem com anticorpos específicos de antigénio, anti-soros e/ou linhas de células T ou clones. Como aqui utilizado, anti-soros e anticorpos são "específicos de 75 antigénio" se se ligarem especificamente a um antigénio (i. e., reagem com a proteína num imunoensaio de ELISA ou outro e não reagem, de um modo detectável, com proteínas não relacionadas). Esses anti-soros e anticorpos podem ser preparados como agui descrito e utilizando técnicas bem conhecidas. Uma porção imunogénica de uma proteína de Mycobacterium sp. é uma porção gue reage com esses anti-soros e/ou células T, a um nível que não é substancialmente inferior à reactividade do polipéptido de comprimento completo (e. g., num ensaio de reactividade de ELISA e/ou célula T) . Essas porções imunogénicas podem reagir nesses ensaios, a um nível que é semelhante ou superior à reactividade do polipéptido de comprimento completo. Esses rastreios podem ser, em geral, realizados utilizando métodos bem conhecidos de alguém com conhecimentos gerais na técnica, tais como os descritos em Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988) e Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998). Por exemplo, um polipéptido pode ser imobilizado num suporte sólido e colocado em contacto com soros de doentes, para permitir a ligação de anticorpos dentro dos soros ao polipéptido imobilizado. Os soros não ligados podem ser, depois, removidos e os anticorpos ligados, detectados utilizando, por exemplo, Proteína A marcada com 125I.

Os polipéptidos podem ser preparados utilizando qualquer de uma variedade de técnicas bem conhecidas. Os polipéptidos recombinantes codificados por sequências de ADN, como descritas acima, podem ser facilmente preparados a partir das sequências de ADN, utilizando qualquer de uma variedade de vectores de expressão conhecidos de alguém com conhecimentos gerais na técnica. A expressão pode ser conseguida em qualquer célula hospedeira apropriada que tenha sido transformada ou transfectada com um vector de expressão contendo uma molécula de 76 ADN que codifica um polipéptido recombinante. As células hospedeiras adequadas incluem células de procariotas, levedura e eucarióticas superiores, tais como células mamíferas e células de plantas. De um modo preferido, as células hospedeiras empregues são E. coli, levedura ou uma linha celular de mamífero, tais como COS ou CHO. Os sobrenadantes de sistemas hospedeiros/vector adequados que segregam proteína ou polipéptido recombinante nos meios de cultura podem ser, em primeiro lugar, concentrados utilizando um filtro comercialmente disponível. A seguir à concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz de purificação adequada, tal como uma matriz de afinidade, ou uma resina de permuta iónica. Finalmente, uma ou mais etapas de HPLC de fase reversa podem ser empregues para purificar, adicionalmente, um polipéptido recombinante.

Os polipéptidos da invenção, seus fragmentos imunogénicos e outros variantes tendo menos de cerca de 100 aminoácidos e, em geral, menos de cerca de 50 aminoácidos, também podem ser produzidos por meio sintético, utilizando técnicas bem conhecidas de alguém com conhecimentos gerais na técnica. Por exemplo, esses polipéptidos podem ser sintetizados utilizando qualquer das técnicas de fase sólida comercialmente disponíveis, tal como o método de síntese de fase sólida de Merrifield, onde os aminoácidos são sequencialmente adicionados a uma cadeia de aminoácidos em crescimento. Ver Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. O equipamento para a síntese automatizada de polipéptidos está comercialmente disponível a partir de fornecedores, tal como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA) e pode ser operado de acordo com as instruções do fabricante. 77

Em determinadas formas de realização especificas, um polipéptido pode ser uma proteina de fusão que compreende múltiplos polipéptidos, como aqui descritos, ou que compreende, pelo menos, um polipéptido como aqui descrito e uma sequência não relacionada, tal como uma proteina tumoral conhecida. Um parceiro de fusão pode, por exemplo, ajudar a proporcionar epitopos auxiliares T (um parceiro de fusão imunolóqico), de um modo preferido epitopos auxiliares T reconhecidos por humanos, ou pode ajudar a expressar a proteina (um estimulador de expressão) com rendimentos mais elevados do que a proteina recombinante nativa. Determinados parceiros de fusão preferidos são parceiros de fusão imunolóqicos e estimuladores de expressão. Podem ser seleccionados outros parceiros de fusão, de modo a aumentar a solubilidade da proteina ou a permitir que a proteina seja direccionada para compartimentos intracelulares desejados. Os parceiros de fusão adicionais incluem caudas de afinidade que facilitam a purificação da proteina.

As proteínas de fusão podem ser, em geral, preparadas utilizando técnicas habituais, incluindo a conjugação química. De um modo preferido, uma proteína de fusão é expressa como uma proteína recombinante, permitindo a produção de níveis aumentados, em relação a uma proteína não fundida, num sistema de expressão. Resumidamente, as sequências de ADN codificando os componentes polipeptídicos podem ser agrupadas separadamente e ligadas dentro de um vector de expressão apropriado. A extremidade 3' da sequência de ADN codificando um componente polipeptídico é ligada, com ou sem um adaptador peptídico, à extremidade 5' de uma sequência de ADN codificando o segundo componente polipeptídico, de modo que as fases de leitura das sequências fiquem em fase. Isto permite a tradução numa única 78 proteína de fusão que retém a actividade biológica de ambos os componentes polipeptídicos.

Uma sequência adaptadora peptídica pode ser empregue para separar o primeiro e segundo componentes polipeptídicos por uma distância suficiente para garantir que cada polipéptido se enrole nas suas estruturas secundária e terciária. Essa sequência adaptadora peptídica é incorporada na proteína de fusão, utilizando técnicas habituais bem conhecidas na técnica. As sequências adaptadoras peptídicas adequadas podem ser escolhidas com base nos seguintes factores: (1) sua capacidade para adoptar uma conformação flexível alargada; (2) sua incapacidade para adoptar uma estrutura secundária que poderia interagir com epitopos funcionais no primeiro e segundo polipéptidos; e (3) a ausência de resíduos hidrófobos ou carregados que pudessem reagir com os epitopos funcionais polipeptídicos. As sequências adaptadoras peptídicas preferidas contêm os resíduos Gly, Asn e Ser. Outros aminoácidos quase neutros, tais como Thr e Ala, também podem ser utilizados na sequência adaptadora. As sequências de aminoácidos que podem ser empregues de um modo útil como adaptadores, incluem as divulgadas em Maratea et ai., Gene 40:39-46 (1985); Murphy et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 : 8258-8262 (1986); Patente U.S. N° 4935233 e Patente U.S. N° 4751180. A sequência adaptadora pode, em geral, ter de 1 a cerca de 50 aminoácidos de comprimento. As sequências adaptadoras não são requeridas quando o primeiro e segundo polipéptidos têm regiões de aminoácidos N-terminais não essenciais, que podem ser utilizadas para separar os domínios funcionais e impedir a interferência estereoquímica. 79

As sequências de ADN ligadas são ligadas de um modo operativo a elementos reguladores de transcrição ou tradução adequados. Os elementos reguladores responsáveis pela expressão de ADN estão localizados apenas em 5' relativamente à sequência de ADN codificando os primeiros polipéptidos. De modo semelhante, os codões de terminação requeridos para terminar a tradução e os sinais de terminação de transcrição estão apenas presentes em 3', relativamente à sequência de ADN codificando o segundo polipéptido.

Também são proporcionadas proteínas de fusão. Essas proteínas compreendem um polipéptido, como aqui descrito, juntamente com uma proteína imunogénica não relacionada. De um modo preferido, a proteína imunogénica é capaz de deduzir uma resposta de memória. Os exemplos dessas proteínas incluem proteínas do tétano, tuberculose e hepatite (ver, e. g., Stoute et al. , New Engl. J. Med. 336:86-91 (1997)).

Dentro de formas de realização preferidas, um parceiro de fusão imunológico é derivado de proteína D, uma proteína de superfície da bactéria gram-negativa Haemophilus influenza B (documento WO 91/18926). De um modo preferido, um derivado de proteína D compreende, aproximadamente, o primeiro terço da proteína (e. g., os primeiros 100-110 aminoácidos N-terminais) e um derivado de proteína D pode estar lipidado. Em determinadas formas de realização preferidas, os primeiros 109 resíduos de um parceiro de fusão de lipoproteína D estão incluídos no terminal N, para proporcionar o polipéptido com epitopos de célula T exógenos adicionais e para aumentar o nível de expressão em E. coli (funcionando, deste modo, como um estimulador de expressão) . A cauda lipídica garante apresentação óptima do antigénio às células de apresentação de antigénios. Outros 80 parceiros de fusão incluem a proteína não estrutural do vírus da influenza, NS1 (hemaglutinina) . Tipicamente, são utilizados os 81 aminoácidos N-terminais, embora possam ser utilizados fragmentos diferentes que incluem epitopos auxiliares T.

Noutra forma de realização, o parceiro de fusão imunológico é a proteína conhecida como LYTA ou uma sua porção (de um modo preferido, uma porção C-terminal) . A LYTA é derivada de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza uma N-acetil-L-alanina amidase, conhecida como LYTA amidase (codificada pelo gene LytA; Gene 43:265-292 (1986)). A LYTA é uma autolisina que degrada especificamente determinadas ligações na estrutura do peptidoglicano. 0 domínio C-terminal da proteína LYTA é responsável pela afinidade para a colina ou para alguns análogos de colina, tal como DEAE. Esta propriedade foi explorada para o desenvolvimento de plasmídeos expressando C-LYTA de E. coli, úteis para expressão de proteínas de fusão. Foi descrita a purificação de proteínas híbridas contendo o fragmento de C-LYTA na extremidade amino (ver Biotechnology 10: 795-798 (1992)). Numa forma de realização preferida, uma porção de repetição de LYTA pode ser incorporada numa proteína de fusão. Uma porção de repetição é encontrada na região C-terminal, começando no resíduo 178. Uma porção de repetição particularmente preferida incorpora os resíduos 188-305.

Em geral, são isolados polipéptidos (incluindo proteínas de fusão) e polinucleótidos como aqui descritos. Um polipéptido ou polinucleótido "isolado" é aquele que é removido do seu ambiente original. Por exemplo, uma proteína de ocorrência natural é isolada se for separada de alguns ou da totalidade dos materiais coexistindo no sistema natural. De um modo preferido, esses polipeptídeos são, pelo menos, cerca de 90% puros, de um modo 81 mais preferido, pelo menos, cerca de 95% puros e, de um modo muito preferido, pelo menos, cerca de 99% puros. Um polinucleótido é considerado como estando isolado se, por exemplo, for clonado num vector que não seja uma parte do ambiente natural.

CÉLULAS T

As composições imunoterapêuticas também podem ou, alternativamente, compreendem células T específicas para um antigénio de Mycobacterium. Essas células podem, em geral, ser preparadas in vitro ou ex vivo, utilizando processos habituais. Por exemplo, as células T podem ser isoladas de medula óssea, sangue periférico ou uma fracção de medula óssea ou sangue periférico de um doente, utilizando um sistema de separação celular comercialmente disponível, tal como o Sistema Isolex™, disponível a partir de Nexell Therapeutics, Inc. (Irvine, CA; ver também a Patente U.S. N° 5240856; Patente U.S. N° 5215926; documentos WO 89/06280, WO 91/16116 e WO 92/07243). Alternativamente, as células T podem ser derivadas de humanos, relacionados ou não relacionados, mamíferos não humanos, linhas celulares ou culturas.

As células T pode ser estimuladas com um polipéptido da invenção, polinucleótido codificando esse polipéptido e/ou uma célula de apresentação de antigénios (APC) que expressa esse polipéptido. Essa estimulação é realizada sob condições e durante um tempo suficiente para permitir a produção de células T que são específicas para o polipéptido. De um modo preferido, o polipéptido ou polinucleótido está presente num veículo de 82 distribuição, tal como uma microsfera, para facilitar a produção de células T especificas.

As células T são consideradas como sendo especificas para um polipéptido da invenção se as células T proliferarem especificamente, segregarem citocinas ou provocarem a morte a células alvo revestidas com o polipéptido ou expressando um gene codificando o polipéptido. A especificidade de célula T pode ser avaliada utilizando qualquer de uma variedade de técnicas habituais. Por exemplo, dentro de um ensaio de libertação de crómio ou ensaio de proliferação, um aumento de mais de duas vezes do índice de estimulação na lise e/ou proliferação, em comparação com controlos negativos, indica especificidade de célula T. Esses ensaios podem ser realizados, por exemplo, como descrito em Chen et al., Câncer Res. 54:1065-1070 (1994)).

Alternativamente, a detecção da proliferação de células T pode ser conseguida por uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, a proliferação de células T pode ser detectada através da medição de um aumento da taxa de síntese de ADN (e. g., por culturas de marcação com pulsos de células T com timidina tritiada e medição da quantidade de timidina tritiada incorporada dentro do ADN) . O contacto com um polipéptido da invenção (100 ng/mL - 100 pg/mL, de um modo preferido 200 ng/mL - 25 pg/mL), durante 3-7 dias, deve resultar num aumento de, pelo menos, duas vezes na proliferação das células T. 0 contacto, como descrito acima, durante 2-3 horas, deve resultar na activação das células T, como medida utilizando ensaios de citocina padrão, nos quais um aumento de duas vezes no nível de libertação de citocina (e. g., TNF ou IFN-γ) é indicativo de activação de célula T (ver Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1 (1998)). As células T que foram activadas em resposta a um polipéptido, polinucleótido ou 83 polipéptido APC expressando polipéptido podem ser CD4+ e/ou CD8+. As células T específicas de proteína podem ser expandidas utilizando técnicas habituais. Em formas de realização preferidas, as células T são derivadas de um doente, um dador relacionado ou um dador não relacionado, e são administradas ao doente após estimulação e expansão.

Para efeitos terapêuticos, as células T CD4+ ou CD8+ que proliferam em resposta a um polipéptido, polinucleótido ou APC podem ser expandidas em número, in vitro ou in vivo. A proliferação dessas células T in vitro pode ser conseguida numa variedade de modos. Por exemplo, as células T podem ser expostas novamente a um polipéptido, ou um péptido curto correspondendo a uma porção imunogénica desse polipéptido, com ou sem a adição de factores de crescimento de células T, tal como interleucina 2, e/ou células estimuladoras que sintetizam um polipéptido. Alternativamente, uma ou mais células T que proliferem na presença de uma proteína ser expandidas em número através de clonagem. Os métodos para clonagem de células são bem conhecidos na técnica e incluem a diluição limitante.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

Em formas de realização adicionais, a presente invenção relaciona-se com a formulação de um ou mais dos polinucleótidos, polipéptidos, células T, anticorpos e composições quimioterapêuticas aqui divulgados, em soluções farmaceuticamente aceitáveis, para administração a uma célula ou um animal, isoladamente ou em combinação com uma ou várias outras modalidades de terapia. 84

Também será compreendido que, se desejado, o segmento de ácido nucleico (e. g. , ARN ou ADN) que expressa um polipéptido, como aqui divulgado, pode também ser administrado em combinação com outros agentes, tais como, e. g., outras proteínas ou polipéptidos ou diversos agentes farmaceuticamente activos, incluindo agentes quimioterapêuticos eficazes contra um infecção por M. tuberculosis. De facto, não existe virtualmente limite para outros componentes que também podem estar incluídos, dado que os agentes adicionais não causam um efeito adverso significativo após contacto com as células alvo ou tecidos hospedeiros. As composições podem, deste modo, ser distribuídas juntamente com diversos outros agentes, como requerido no caso particular. Essas composições podem ser purificadas de células hospedeiras ou outras fontes biológicas ou, alternativamente, podem ser quimicamente sintetizadas, como aqui descrito. Do mesmo modo, essas composições podem compreender, adicionalmente, composições de ARN ou ADN substituídas ou derivatizadas. A formulação de excipientes e soluções transportadoras farmaceuticamente aceitáveis é bem conhecida dos especialistas na técnica, como é o desenvolvimento de regimes de dosagem e tratamento adequados, para utilização das composições particulares aqui descritas, numa variedade de regimes de tratamento, incluindo, e. g., administração e formulação oral, parentérica, intravenosa, intranasal e intramuscular. Tipicamente, as formulações compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz distribuem cerca de 2 pg a cerca de 50 pg de polipéptido Mtb72f, por administração, de um modo mais típico cerca de 5 pg a cerca de 40 pg de polipéptido Mtb72f, por administração. 85

1. DISTRIBUIÇÃO ORAL

Em determinadas aplicações, as composições farmacêuticas aqui divulgadas podem ser distribuídas a um animal por meio de administração oral. Como tal, estas composições podem ser formuladas com um diluente inerte ou com um veículo comestível assimilável, ou podem estar encerradas em cápsula de gelatina de capa dura ou mole, ou podem ser prensadas em comprimidos ou podem ser incorporadas directamente com o alimento da dieta.

Os compostos activos podem ser ainda incorporados com excipientes e utilizados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, pastilhas e semelhantes (Mathiowitz et al., 1997; Hwang et al., 1998; Patente U.S. 5641515; Patente U.S. 5580579 e Patente U.S. 5792451, cada, aqui especificamente incorporada por referência na sua totalidade). Os comprimidos, trociscos, pílulas, cápsulas e semelhantes também podem conter o seguinte: um aglutinante, como goma de tragacanto, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes, tais como fosfato dicálcio; um agente desagregante, tais como amido de milho, amido de batata, ácido algínico e semelhantes; um lubrificante, tal como estearato de magnésio e um agente adoçante, tais como sacarose, lactose ou sacarina pode ser adicionado ou um agente aromatizante, tais como hortelã-pimenta, óleo de gaultéria ou aromatizante de cereja. Quando a forma unitária de dosagem é uma cápsula, pode conter, adicionalmente aos materiais do tipo acima, um veículo líquido. Diversos outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para, de outro modo, modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com goma-laca, açúcar ou ambos. Um xarope ou elixir pode conter o composto activo sacarose como um 86 agente adoçante, metil e propilparabenos como conservantes, um corante e aromatizante, tais como aroma de cereja ou laranja. Certamente, qualquer material utilizado na preparação de qualquer forma unitária de dosagem deve ser farmaceuticamente puro e substancialmente não tóxico nas quantidades empregues. Além disso, os compostos activos podem ser incorporados dentro de preparações e formulações de libertação prolongada.

Tipicamente, estas formulações, habitualmente, contêm entre 2 pg a 50 pg de polipéptido Mtb72f. Naturalmente, a quantidade de composto(s) activo(s) em cada composição terapeuticamente útil, pode ser preparada de modo a que uma dosagem adequada seja obtida em qualquer dose unitária proporcionada do composto. Factores, tais como solubilidade, biodisponibilidade, meia-vida biológica, via de administração, estabilidade em armazenamento do produto, assim como outras considerações farmacológicas, serão contemplados por um especialista na técnica de preparação dessas formulações farmacêuticas e, como tal, pode ser desejável uma variedade de dosagens e regimes de tratamento.

Para administração oral, as composições da presente divulgação podem, alternativamente, ser incorporadas com um ou mais excipientes, na forma de uma formulação oralmente administrada de colutório, dentifrica, comprimido bucal, sprays oral ou sublingual. Por exemplo, um colutório pode ser preparado incorporando o ingrediente activo na quantidade requerida num solvente apropriado, tal como uma solução de borato de sódio (solução de Dobell). Alternativamente, o ingrediente activo pode ser incorporado dentro de uma solução oral, tal como uma solução contendo borato de sódio, glicerina e bicarbonato de potássio ou disperso num dentifrico ou adicionado numa quantidade terapeuticamente eficaz a uma composição que pode incluir água, 87 aglutinantes, abrasivos, agentes aromatizantes, agentes espumantes e humectantes. Alternativamente, as composições podem ser moldadas numa forma de comprimido ou solução gue pode ser colocada sob a língua ou, de outro modo, dissolvida na boca.

2. DISTRIBUIÇÃO INJECTÁVEL

Em determinadas circunstâncias, será desejável distribuir as composições farmacêuticas aqui divulgadas parentericamente, intravenosamente, intramuscularmente ou mesmo intraperitonealmente, como descrito na Patente U.S. 5543158; Patente U.S. 5641515 e Patente U.S. 5399363 (cada, aqui especificamente incorporada por referência na sua totalidade). As soluções dos compostos activos, como base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis, podem ser preparadas em água, adequadamente misturadas com um tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulose. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e as suas misturas e em óleos. Em condições normais de armazenamento e utilização, estas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de microrganismos.

As formas farmacêuticas adequadas para utilização injectável incluem soluções aquosas ou dispersões estéreis e pós estéreis, para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis (Patente U.S. 5466468, especificamente aqui incorporada por referência na sua totalidade) . Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida, na medida em que exista fácil seringabilidade. Deve ser estável sob as condições de preparação e armazenamento e deve ser preservada contra a acção contaminante de microrganismos, tais como bactérias e fungos. 0 veiculo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (e. g., glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes) , as suas misturas adequadas e/ou óleos vegetais. A correcta fluidez pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido, no caso de dispersão, e pela utilização de tensioactivos. A prevenção da acção de microrganismos pode ser facilitada por diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferido incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser conduzida pela utilização nas composições de agentes de retardamento a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

Para administração parentérica numa solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada, se necessário, e o diluente líquido tornado, em primeiro lugar, isotónico com solução salina ou glucose suficiente. Estas particulares soluções aquosas são especialmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. A este respeito, um meio aquoso estéril que possa ser empregue será conhecido dos especialistas na técnica, à luz da presente divulgação. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 mL de solução de NaCl isotónica e adicionada a 1000 mL de fluido de hipodermóclise ou injectada no local de infusão proposto, (ver, e. g., Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a Edição, p. 1035-1038 e 1570-1580). Dependendo do estado do indivíduo a ser tratado irá, necessariamente, ocorrer 89 alguma variação na dosagem. A pessoa responsável pela administração irá, em todo o caso, determinar a dose apropriada para o próprio indivíduo. Além disso, para administração humana, as preparações deverão cumprir padrões gerais de esterilidade, pirogenicidade e de segurança e pureza, como requerido pelos padrões do Departamento de Produtos Biológicos da FDA.

As soluções injectáveis estéreis são preparadas através da incorporação dos compostos activos, na quantidade requerida no solvente apropriado, com diversos dos outros ingredientes acima enumerados, como requerido, seguido de esterilização por filtração. Em geral, as dispersões são preparadas através da incorporação dos diversos ingredientes activos esterilizados num veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos a partir dos enumerados acima. No caso de pós estéreis, para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são as técnicas de secagem a vácuo e liof ilização, que produzem um pó do ingrediente activo, bem como qualquer ingrediente adicional desejado, a partir de uma sua solução anteriormente esterilizada por filtração.

As composições aqui divulgadas podem ser formuladas numa forma neutra ou salina. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres da proteína) e que são formados com sais inorgânicos, tais como, por exemplo, os ácidos clorídrico ou fosfórico ou ácidos orgânicos, tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais formados com os grupos carboxilo livres também podem ser derivados de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, sódio, potássio, amónio, cálcio ou hidróxidos férricos e bases orgânicas, tais como 90 isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e semelhantes. Após formulação, as soluções serão administradas num modo compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade tal que seja terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas numa variedade de formas de dosagem, tais como soluções injectáveis, cápsulas de libertação de fármaco e semelhantes.

Como aqui utilizado, "veículo", inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, transportadores, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardantes de absorção, tampões, soluções veículo, suspensões, colóides e semelhantes. A utilização desses meios e agentes para substâncias activas farmacêuticas é bem conhecida na técnica. Excepto na medida em que quaisquer meios ou agentes convencionais sejam incompatíveis com o ingrediente activo, a sua utilização nas composições terapêuticas está contemplada. Os ingredientes activos suplementares também podem ser incorporados nas composições. A expressão "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reacção imprópria, alérgica ou semelhante, quando administradas a um humano. A preparação de uma composição aquosa que contém uma proteína como um ingrediente activo é bem compreendida na técnica. Tipicamente, essas composições são preparadas como injectáveis, como soluções ou suspensões líquidas; também podem se preparadas formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injecção. A preparação pode também ser emulsionada. 91

3. DISTRIBUIÇÃO NASAL E BUCAL

Em determinadas formas de realização, as composições farmacêuticas podem ser distribuídas por sprays intranasais, sprays bucais, inalação e/ou outros veículos de distribuição por aerossol. Os métodos para distribuição de genes, ácidos nucleicos e composições peptídicas directamente nos pulmões, e. g., por meio de sprays de aerossol nasais e bucais foram descritos, e. g., na Patente U.S. 5756353 e Patente U.S. 5804212 (cada, aqui especificamente incorporada por referência na sua totalidade). Do mesmo modo, a distribuição de fármacos utilizando resinas de micropartícuias intranasais (Takenaga et al.r 1998) e compostos de lisofosfatidilglicerol (Patente U.S. 5725871, aqui especificamente incorporada por referência na sua totalidade) também é bem conhecida nas técnicas farmacêuticas. Do mesmo modo, a distribuição de fármaco transmucosal na forma de uma matriz de suporte de politetrafluoroetileno é descrita na Patente U.S. 5780045 (aqui especificamente incorporada por referência na sua totalidade).

4. DISTRIBUIÇÃO MEDIADA POR LIPOSSOMA, NANOCÁPSULA E MICROPARTÍCULA

Em determinadas formas de realização, a requerente contempla a utilização de lipossomas, nanocápsulas, micropartículas, microsferas, partículas lipídicas, vesículas e semelhantes, para a introdução das composições da presente invenção em células hospedeiras adequadas. Em particular, as composiçoes da presente invenção distribuição, encapsuladas numa podem ser partícula formuladas para lipídica, num 92 lipossoma, numa vesícula, numa nanosfera ou numa nanopartícula ou semelhantes.

Essas formulações podem ser preferidas para a introdução de formulações farmaceuticamente aceitáveis dos ácidos nucleicos ou construções aqui divulgadas. A formação e utilização de lipossomas são, em geral, conhecidas dos especialistas na técnica (ver, por exemplo, Couvreur et al., 1977; Couvreur, 1988; Lasic, 1998; que descrevem a utilização de lipossomas e nanocápsulas na terapia antibiótica dirigida para infecções e doenças bacterianas intracelulares). Recentemente, foram desenvolvidos lipossomas com estabilidade sérica e meias-vidas de circulação melhoradas (Gabizon & Papahadjopoulos, 1988; Allen e Choun, 1987; Patente U.S. 5741516, aqui especificamente incorporada por referência na sua totalidade). Adicionalmente, foram revistos diversos métodos de preparações de lipossomas e semelhantes a lipossomas como potenciais transportadores de fármacos (Takakura, 1998; Chandran et al., 1997; Margalit, 1995; Patente U.S. 5567434; Patente U.S. 5552157; Patente U.S. 5565213; Patente U.S. 5738868 e Patente U.S. 5795587, cada, aqui especificamente incorporada por referência na sua totalidade).

Os lipossomas têm sido utilizados com sucesso com um número de tipos de células que são normalmente resistentes à transfecção por outros processos, incluindo suspensões de células T, culturas primárias de hepatócitos e células PC12 (Renneisen et al., 1990; Muller et al., 1990). Além disso, os lipossomas estão isentos dos constrangimentos do comprimento de ADN que são típicos dos sistemas de distribuição de base virai. Os lipossomas têm sido utilizados eficazmente para introduzir genes, fármacos (Heath & Martin, 1986; Heath et al., 1986; Balazsovits et al., 1989; Fresta & Puglisi, 1996), agentes 93 radioterapêuticos (Pikul et al., 1987), enzimas (Imaizumi et al. , 1990a; Imaizumi et al., 1990b), vírus (Faller & Baltimore, 1984 ), factores de transcrição e efectores alostéricos (Nicolau & Gersonde, 1979), numa variedade de linhas celulares cultivadas e animais. Além disso, foram completados vários ensaios clinicos com sucesso, examinando a eficácia da distribuição de fármaco mediada por lipossoma (Lopez-Berestein et ai., 1985a; 1985b; Coune, 1988; Sculier et al., 1988). Além disso, vários estudos sugerem que a utilização de lipossomas não está associada a respostas auto-imunes, toxicidade ou localização gonádica, após distribuição sistémica (Mori & Fukatsu, 1992).

Os lipossomas são formados a partir de fosfolipidos que são dispersos num meio aquoso e formam espontaneamente vesículas de bicamadas concêntricas multilamelares (também designadas vesículas multilamelares (MLV)). As MLV têm, em geral, diâmetros desde 25 nm a 4 pm. A sonicação de MLV resulta na formação de pequenas vesículas unilamelares (SUV), com diâmetros na gama de 200 a 500 Ã, contendo uma solução aquosa no núcleo.

Os lipossomas assemelham-se a membranas celulares e estão contemplados para utilização, com respeito à presente invenção, como veículos para as composições peptídicas. São largamente adequados, visto que substâncias solúveis em água e lípido podem ser aprisionadas, i. e., nos espaços aquosos e dentro da própria bicamada, respectivamente. É possível que os lipossomas contendo fármacos possam mesmo ser empregues para distribuição específica de sítio de agentes activos, através da modificação selectiva da formulação lipossomal. 94

Adicionalmente aos ensinamentos de Couvreur et al. (1977; 1988), a seguinte informação pode ser utilizada na produção de formulações lipossomais. Os fosfolípidos podem formar uma variedade de estruturas que não lipossomas, quando dispersos em água, dependendo da razão molar de lípido para água. A baixas razões, o lipossoma é a estrutura preferida. As caracteristicas físicas dos lipossomas dependem do pH, força iónica e da presença de catiões divalentes. Os lipossomas podem mostrar baixa permeabilidade a substâncias iónicas e polares mas, a temperaturas elevadas, sofrem uma transição de fase que altera vincadamente a sua permeabilidade. A transição de fase envolve uma alteração de uma estrutura ordenada, intimamente compactada, conhecida como o estado de gel, para uma estrutura menos ordenada, folgadamente compactada, conhecida como o estado fluido. Isto ocorre a uma temperatura de transição de fase caracteristica e resulta num aumento na permeabilidade a iões, açúcares e fármacos.

Adicionalmente à temperatura, a exposição a proteínas pode alterar a permeabilidade dos lipossomas. Determinadas proteínas solúveis, tal como citocromo c, ligam-se, deformam e penetram na bicamada causando, desse modo, alterações na permeabilidade. 0 colesterol inibe esta penetração de proteínas, aparentemente através da compactação mais firme dos fosfolípidos. Está contemplado que as formações lipossomais mais úteis para a distribuição de antibiótico e inibidor conterão colesterol. A capacidade de aprisionar solutos varia entre diferentes tipos de lipossomas. Por exemplo, as MLV são moderadamente eficientes no aprisionamento de solutos, as SUV são extremamente ineficientes. Contudo, as SUV oferecem a vantagem de homogeneidade e reprodutibilidade na distribuição de tamanho e 95 um compromisso entre tamanho e eficiência de aprisionamento é oferecido pelas vesículas unilamelares grandes (LUV). Estas são preparadas por evaporação com éter e são três a quatro vezes mais eficientes no aprisionamento de soluto que as MLV.

Adicionalmente às características dos lipossomas, um determinante importante no aprisionamento de compostos são as propriedades físico-químicas do próprio composto. Os compostos polares são aprisionados nos espaços aquosos e os compostos não polares ligam-se à bicamada lipídica da vesícula. Os compostos polares são libertados através de permeação ou quando a bicamada é fracturada, mas os compostos não polares permanecem afiliados com a bicamada, salvo se for dissociada pela temperatura ou exposição a lipoproteínas. Ambos os tipos mostram taxas de efluxo máximas na temperatura de transição de fase.

Os lipossomas interagem com células por meio de quatro mecanismos diferentes: endocitose, por células fagocíticas do sistema reticuloendotelial, tais como macrófagos e neutrófilos; adsorção à superfície celular, por forças hidrófobas fracas não específicas ou electrostáticas, ou por interacções específicas com componentes de superfície celular; fusão com a membrana celular plasmática, por inserção da bicamada lipídica do lipossoma na membrana plasmática, com libertação simultânea de conteúdo lipossomal no citoplasma e por transferência de lípidos lipossomais para membranas celulares ou subcelulares, ou vice-versa, sem qualquer associação do conteúdo dos lipossomas. É, frequentemente, difícil determinar que mecanismo está operativo e pode operar mais do que um ao mesmo tempo. 0 destino e disposição de lipossomas intravenosamente injectados dependem das suas propriedades físicas, tais como 96 tamanho, fluidez e carga de superfície. Podem persistir nos tecidos durante horas ou dias, dependendo da sua composição e as meias-vidas no sangue variam desde minutos a várias horas. Os lipossomas maiores, tais como MLV e LUV, são absorvidos rapidamente por células fagocíticas do sistema reticuloendotelial, mas a fisiologia do sistema circulatório impede a saída dessas espécies grandes na maioria dos locais. Podem apenas sair em locais onde existam grandes aberturas ou poros no endotélio capilar, tais como as sinusoides do fígado ou baço. Deste modo, estes órgãos são o local de absorção predominante. Por outro lado, as SUV mostram uma distribuição tecidular mais ampla mas ainda são altamente sequestradas no fígado e baço. Em geral, este comportamento in vivo limita o potencial direccionamento dos lipossomas apenas para os órgãos e tecidos acessíveis ao seu grande tamanho. Estes incluem o sangue, fígado, baço, medula óssea e órgãos linfóides.

Nos termos da presente invenção, o direccionamento não é, em geral, uma limitação. Contudo, caso se deseje o direccionamento específico, estão disponíveis métodos para que este seja conseguido. Os anticorpos podem ser utilizados para se ligarem à superfície do lipossoma e para dirigir o anticorpo e seu conteúdo de fármaco para receptores antigénicos específicos, localizados na superfície de um particular tipo de célula. Também podem ser utilizados determinantes de hidratos de carbono (componentes de superfície celular de glicoproteína ou glicolípido que desempenham um papel no reconhecimento, interacção e adesão celular) como sítios de reconhecimento, visto que têm potencial no direccionamento de lipossomas para tipos de células particulares. Em grande parte, está contemplado que poderia ser utilizada injecção intravenosa de preparações 97 lipossomais, mas também são concebíveis outras vias de administração.

Alternativamente, a invenção proporciona formulações de nanocápsulas farmaceuticamente aceitáveis das composições da presente invenção. As nanocápsulas podem, em geral, aprisionar compostos num modo estável e reproduzível (Henry-Michelland et al., 1987; Quintanar-Guerrero et al., 1998; Douglas et al., 1987). Para evitar efeitos secundários, devido a sobrecarga polimérica intracelular, essas partículas ultrafinas (com tamanhos de cerca de 0,1 pm) devem ser concebidas utilizando polímeros capazes de serem degradados in vivo. Estão contempladas para utilização na presente invenção as nanopartículas de polialquil-cianoacrilato biodegradáveis que cumprem estes requisitos. Essas partículas podem ser facilmente preparadas, como descrito (Couvreur et al. , 1980; 1988; zur Muhlen et al., 1998; Zambaux et al. 1998; Pinto-Alphandry et al., 1995 e Patente U.S. 5145684, aqui especificamente incorporada por referência na sua totalidade).

VACINAS

Em determinadas formas de realização preferidas da presente invenção, são proporcionadas vacinas. As vacinas compreenderão, em geral, uma ou mais composições farmacêuticas, tal como as discutidas acima, em combinação com um imunoestimulante. Um imunoestimulante pode ser qualquer substância que melhora ou potência uma resposta imunitária (mediada por anticorpo e/ou célula) a um antigénio exógeno. Os exemplos de imunoestimulantes incluem adjuvantes, microsferas biodegradáveis (e. g., galáctido poliláctico) e lipossomas (nos quais o composto é incorporado; 98 ver, e. g., Fullerton, Patente U.S. N° 4235877). A preparação de vacina é, em geral, descrita, por exemplo, em Powell & Newman, eds., Vaccine Design (a abordagem de subunidade e adjuvante) (1995). As composições farmacêuticas e vacinas, no âmbito da presente invenção, também podem conter outros compostos que podem ser biologicamente activos ou inactivos. Por exemplo, na composição ou vacina podem estar presentes uma ou mais porções imunogénicas de outros antigénios tumorais, incorporadas num polipéptido de fusão ou como composto separado.

As vacinas ilustrativas podem conter ADN codificando um ou mais dos polipéptidos como descritos acima, de modo a que o polipéptido seja produzido in situ. Como notado acima, o ADN pode estar presente em qualquer um de uma variedade de sistemas de distribuição conhecidos de alguém com conhecimentos gerais na técnica, incluindo sistemas de expressão de ácidos nucleicos, sistemas de expressão bacterianos e virais. São bem conhecidas na técnica numerosas técnicas de transferência de genes, tal como as descritas por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198 (1998) e referências ai citadas. Os sistemas apropriados de expressão de ácidos nucleicos contêm as sequências de ADN necessárias para a expressão no doente (tais como um promotor e sinal de terminação adequados). Os sistemas de distribuição bacterianos envolvem a administração de uma célula hospedeira bacteriana (por exemplo, uma estirpe de

Mycobacterium, Bacillus ou Lactobacillus, incluindo Bacillus-Calmette-Guerrin ou Lactococcus lactis) que expressa uma porção imunogénica do polipéptido na sua superfície celular ou segrega esse epitopo (ver, por exemplo, Ferreira, et al., An Acad Bras Cienc (2005) 77:113-124 e Raha, et al. , Appl Microbiol

Biotechnol (2005) PubMedID 15635459). Numa forma de realização preferida, o ADN pode ser introduzido utilizando um sistema de 99 expressão virai (e. g., vírus da vacínia ou outro poxvírus, retrovírus ou adenovírus) , que pode envolver a utilização de um vírus não patogénico (defeituoso) competente para replicação. Os sistemas adequados são divulgados, por exemplo, em Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 86:317-321 (1989); Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sei. 569:86-103 (1989); Flexner et al., Vaccine 8:17-21 (1990); Patentes U.S. N° 4603112, 4769330 e 5017487; documento WO 89/01973; Patente U.S. N° 4777127; documentos GB 2200651; EP 0345242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627 (1988); Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Kolls et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 91:215-219 (1994); Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:11498-11502 (1993); Guzman et al., Circulation 88:2838-2848 (1993) e Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207 (1993). As técnicas para a incorporação de ADN dentro desses sistemas de expressão são bem conhecidas de alguém com conhecimentos gerais na técnica. O ADN também pode estar "livre", como descrito, por exemplo, em Ulmer et al., Science 259:1745-1749 (1993) e revisto por Cohen, Science 259:1691-1692 (1993). A absorção de ADN livre pode ser aumentada através do revestimento do ADN sobre esférulas biodegradáveis, as quais são eficientemente transportadas para nas células. Será evidente que uma vacina pode compreender um componente polinucleotídico e um polipeptídico. Essas vacinas podem proporcionar uma resposta imunitária melhorada.

Será evidente que uma vacina pode conter sais farmaceuticamente aceitáveis dos polinucleótidos e polipéptidos aqui proporcionados. Esses sais podem ser preparados a partir de bases não tóxicas farmaceuticamente aceitáveis, incluindo bases orgânicas (e. g., sais de aminas primárias, secundárias e 100 terciárias e aminoácidos básicos) e bases inorgânicas (e. g., sais de sódio, potássio, litio, amónio, cálcio e magnésio).

Embora qualquer veiculo adequado, conhecido de alguém com conhecimentos gerais na técnica, possa ser empregue nas composições vacinais desta invenção, o tipo de veiculo irá variar, dependendo do modo de administração. As composições da presente divulgação podem ser formuladas para qualquer modo de administração apropriado incluindo, por exemplo, administração tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraniana, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular. Para administração parentérica, tal como injecção subcutânea, o veiculo compreende, de um modo preferido, água, solução salina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para administração oral, pode ser empregue qualquer dos veículos acima ou um veículo sólido, tais como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarinato de sódio, talco, celulose, glucose, sacarose e carbonato de magnésio. As microsferas biodegradáveis (e. g., poliglicolato de polilactato) também podem ser empregues como veículos para as composições farmacêuticas desta invenção. As microsferas biodegradáveis adequadas são divulgadas, por exemplo, nas Patentes U.S. N° 4897268; 5075109; 5928647; 5811128; 5820883; 5853763; 5814344 e 5942252. Também pode empregar-se um veículo compreendendo os complexos de particulado-proteína, descritos na Patente U.S. N° 5928647 que são capazes da indução de respostas de linfócitos T citotóxicos restringidos à classe I num hospedeiro.

Essas composições também podem compreender tampões (e. g., solução salina tamponada neutra ou solução salina tamponada com fosfatos) , hidratos de carbono (e. g., glucose, manose, sacarose ou dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos ou aminoácidos, 101 antioxidantes tais como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes guelantes, tais como EDTA ou glutationo, adjuvantes (e. g., hidróxido de alumínio), solutos gue tornam a formulação isotónica, hipotónica ou fracamente hipertónica com o sangue de um receptor, agentes de suspensão, agentes de espessamento e/ou conservantes. Alternativamente, as composições da presente invenção podem ser formuladas como um liofilizado. Os compostos também podem ser encapsulados dentro em lipossomas, utilizando tecnologia bem conhecida.

Qualguer de uma variedade de imunoestimulantes pode ser empregue nas vacinas desta invenção. Por exemplo, pode ser incluído um adjuvante. A maioria dos adjuvantes contém uma substância concebida para proteger o antigénio do rápido catabolismo, tais como hidróxido de alumínio ou óleo mineral, e um estimulador de respostas imunitárias, tais como lípido A, espécies Bortadella pertussis ou Mycobacterium ou proteínas derivadas de Mycobacterium. Por exemplo, pode ser utilizado M. vaccae deslipidado, desglicolipidado ("pVac"). Os adjuvantes adequados estão comercialmente disponíveis como, por exemplo, Adjuvante Incompleto e Adjuvante Completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI); Adjuvante 65 Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ) ; AS01B, AS02A, AS 15, AS-2 e os seus derivados (GlaxoSmithKline, Philadelphia, PA) ; CWS, TDM, Leif, sais de alumínio, tais como gel de hidróxido de alumínio (alúmen) ou fosfato de alumínio; sais de cálcio, ferro ou zinco; uma suspensão insolúvel de tirosina acilada; açúcares acilados; polissacáridos cationicamente ou anionicamente derivatizados; polifosfazenos; microsferas biodegradáveis; monofosforil-lípido A e quil A. Citocinas, tais como GM-CSF ou interleucina 2, 7 ou 12, também podem ser utilizadas como adjuvantes. 102

Nas vacinas aqui proporcionadas, a composição de adjuvante é, de um modo preferido, concebida para induzir uma resposta imunitária, predominantemente do tipo Thl. Níveis elevados de citocinas de tipo Thl (e. g., IFN-γ, TNFa, IL-2 e IL-12) tendem a favorecer a indução de respostas imunitárias de mediação celular a um antigénio administrado. Em contraste, níveis elevados de citocinas de tipo Th2 (e. g., IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tendem a favorecer a indução de respostas imunitárias humorais. Após aplicação de uma vacina, como aqui proporcionada, um doente suportará uma resposta imunitária que inclui respostas de tipo Thl e Th2. Numa forma de realização preferida, na qual uma resposta é predominantemente de tipo Thl, o nível de citocinas de tipo Thl aumentará em maior grau do que o nível de citocinas de tipo Th2. Os níveis destas citocinas podem ser facilmente avaliados utilizando ensaios padrão. Para uma revisão das famílias de citocinas, ver Janeway, et al., Immunobiology, 5a Edição, 2001.

Os adjuvantes preferidos para utilização na dedução de uma resposta predominantemente de tipo Thl incluem, por exemplo, uma combinação de monofosforil-lípido A, de um modo preferido monofosforil-lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL), opcionalmente com um sal de alumínio (ver, por exemplo, Ribi, et ai., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p. 407-419; documentos GB 2122204B; GB 2220211 e US 4912094) . Uma forma preferida de 3D-MPL é na forma de uma emulsão tendo um tamanho de partícula pequeno, inferior a 0,2 mm em diâmetro e o seu método de preparação é divulgado no documento WO 94/21292. As formulações aquosas compreendendo monofosforil-lípido A e um tensioactivo foram descritas no documento WO 98/43670. Os adjuvantes exemplificados preferidos incluem AS01B (MPL e QS21, numa formulação 103 lipossomal), 3D-MPL e QS21, numa formulação lipossomal, AS02A (MPL e QS21 e uma emulsão de óleo em água) , 3D-MPL e QS21 e uma emulsão de óleo em água e AS15, disponíveis a partir da GlaxoSmithKline. Os adjuvantes MPL estão disponíveis a partir da GlaxoSmithKline, Seattle, WA (ver as Patentes US N° 4436727; 4877611; 4866034 e 4912094).

Os oligonucleótidos contendo CpG (nos quais o dinucleótido CpG não está metilado) também induzem uma resposta predominantemente Thl. CpG é uma abreviatura para os motivos dinucleotídicos de citosina-guanosina presentes em ADN. Esses oligonucleótidos são bem conhecidos e são descritos, por exemplo, nos documentos WO 96/02555, WO 99/33488 e Patentes U.S. N° 6008200 e 5856462. As sequências de ADN imunoestimulatórias também são descritas, por exemplo, por Sato et al., Science 273:352 (1996). O CpG, quando formulado em vacinas é, em geral, administrado em solução livre, juntamente com antigénio livre (documento WO 96/02555; McCluskie e Davis, supra) ou covalentemente conjugado a um antigénio (documento WO 98/16247) ou formulado com um veículo, tal como hidróxido de alumínio (Antigénio de superfície de hepatite) Davis et al. supra; Brazolot-Millan et al., Proc.Natl.Acad.Sei., EUA, 1998, 95 (26), 15553-8) . O CpG é conhecido na técnica como sendo um adjuvante que pode ser administrado pelas vias sistémica e de mucosa (documentos WO 96/02555, EP 468520, Davis et al., J.Immunol, 1998, 160 (2) : 870-876; McCluskie e Davis, J.Immunol., 1998, 161 (9) :4463-6) .

Outro adjuvante preferido é uma saponina, ou miméticos ou derivados de saponina, de um modo preferido QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA) que pode ser utilizado isoladamente ou em combinação com outros adjuvantes. Por 104 exemplo, um sistema melhorado envolve a combinação de um monofosforil-lípido A e derivado de saponina, tais como a combinação de QS21 e 3D-MPL, como descrita no documento WO 94/00153, ou uma composição menos reactogénica onde o QS21 é neutralizado com colesterol, como descrito no documento WO 96/33739. Outras formulações preferidas compreendem uma emulsão de óleo-em-água e tocoferol. Uma formulação de adjuvante particularmente potente envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol, numa emulsão de óleo-em-água, é descrita no documento WO 95/17210. Os adjuvantes de saponina adicionais de utilização na presente invenção incluem QS7 (descrito no documento WO 96/33739 e WO 96/11711) e QS17 (descrito na Patente U.S. N° 5057540 e documento EP 0362279 Bl).

Outros adjuvantes preferidos incluem Montanide ISA 720 (Seppic, França), SAF (Chiron, Califórnia, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), a série SBAS de adjuvantes (e. g., SBAS-2, AS2', AS2", SBAS-4 ou SBAS6, disponíveis a partir da GlaxoSmithKline, Rixensart, Bélgica), Detox (Corixa, Hamilton, MT) , RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) e outros aminoalquilglucosaminida 4-fosfatos (AGP), tais como os descritos nos Pedidos de Patente U.S. pendentes com os Números de Série 08/853826 e 09/074720, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência nas suas totalidades.

Exemplos adicionais de adjuvantes incluem MPL sintético e adjuvantes baseados na subunidade B da toxina Shiga (ver o documento W02005/112991).

Qualquer vacina aqui proporcionada pode ser preparada utilizando métodos bem conhecidos que resultam numa combinação de antigénio, estimulador de resposta imunitária e um veículo ou 105 excipiente adequado. As composições aqui descritas podem ser administradas como parte de uma formulação de libertação prolongada (i. e., uma formulação, tais como uma cápsula, esponja ou gel (composta por polissacáridos, por exemplo) que efectua uma libertação lenta de composto após administração). Essas formulações podem, em geral, ser preparadas utilizando tecnologia bem conhecida {ver, e. g., Coombes et al., Vaccine 14:1429-1438 (1996)) e administradas, por exemplo, por implantação oral, rectal ou subcutânea ou por implantação no sitio alvo desejado. As formulações de libertação prolongada podem conter um polipéptido, polinucleótido ou anticorpo disperso numa matriz transportadora e/ou contido dentro de um reservatório rodeado por uma membrana de controlo de velocidade.

Os veículos para utilização nessas formulações são biocompativeis e também podem ser biodegradáveis; de um modo preferido, a formulação proporciona um nível relativamente constante de libertação de componente activo. Esses veículos incluem micropartículas de poli(lactida-co-glicolida) , poliacrilato, látex, amido, celulose, dextrano e semelhantes. Outros veículos de libertação retardada incluem biovectores supramoleculares, que compreendem um núcleo hidrófilo não líquido (e. g., um polissacárido ou oligossacárido reticulado) e, opcionalmente, uma camada externa compreendendo um composto anfifílico, tal como um fosfolípido (ver, e. g., Patente U.S. N° 5151254 e pedidos PCT WO 94/20078, WO/94/23701 e WO 96/06638). A quantidade de composto activo contida numa formulação de libertação prolongada depende do sítio de implantação, da taxa e duração prevista da libertação e da natureza do estado a ser tratado ou prevenido. 106

Qualquer de uma variedade de transportadores de distribuição pode ser empregue em composições farmacêuticas e vacinas, para facilitar a produção de uma resposta imunitária específica de antigénio que visa células tumorais. Os transportadores de distribuição incluem células de apresentação de antigénios (APC), tais como células dendríticas, macrófagos, células B, monócitos e outras células que podem ser manipuladas para serem APC eficientes. Essas células podem, mas não necessitam, ser geneticamente modificadas para aumentarem a capacidade para apresentarem o antigénio, para melhorarem a activação e/ou manutenção da resposta de célula T, para terem efeitos antitumorais per se e/ou para serem imunologicamente compatíveis com o receptor (i. e., correspondência de haplótipo de HLA). As APC podem, em geral, ser isoladas de qualquer de uma variedade de fluidos biológicos e órgãos, incluindo tecidos tumorais e peritumorais e podem ser células autólogas, alógenas, singénicas ou xenógenas.

Determinadas formas de realização preferidas da presente invenção utilizam células dendríticas ou os seus progenitores, como células de apresentação de antigénios. As células dendríticas são APC altamente potentes (Banchereau& Steinman, Nature 392:245-251 (1998)) e mostrou-se que são eficazes como adjuvante fisiológico para a dedução de imunidade antitumoral profiláctica ou terapêutica (ver Timmerman & Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529 (1999)). Em geral, as células dendríticas podem ser identificadas com base na sua forma típica (estrelada in situ, com marcados processos citoplasmáticos (dendrites) visíveis in vitro), a sua capacidade para absorverem, processarem e apresentarem antigénios com elevada eficiência e a sua capacidade para activarem respostas de célula T inactivas. As células dendríticas podem, certamente, ser manipuladas para 107 expressarem receptores ou ligandos de superfície celular específicos que, geralmente, não se encontram em células dendríticas in vivo ou ex vivo e essas células dendríticas modificadas estão contempladas pela presente divulgação. Como uma alternativa às células dendríticas, células dendríticas carregadas com antigénio de vesículas segregadas (denominadas exossomas) podem ser utilizadas dentro de uma vacina (ver Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600 (1998)).

As células dendríticas e progenitoras podem ser obtidas de sangue periférico, medula óssea, células de infiltração tumoral, células de infiltração de tecidos peritumorais, nodos linfáticos, baço, pele, sangue de cordão umbilical ou qualquer outro tecido ou fluido adequado. Por exemplo, as células dendríticas podem ser diferenciadas ex vivo, através da adição de uma combinação de citocinas, tais como GM-CSF, IL-4, IL-13 e/ou TNFa, a culturas de monócitos recolhidos de sangue periférico. Alternativamente, células positivas para CD34 recolhidas de sangue periférico, sangue do cordão umbilical ou medula óssea podem ser diferenciadas em células dendríticas, através da adição ao meio de cultura de combinações de GM-CSF, IL-3, TNFa, ligando CD40, LPS, ligando flt3 e/ou outro(s) composto (s) que induz(em) diferenciação, maturação e proliferação de células dendríticas.

As células dendríticas são convenientemente classificadas como células "imaturas" e "maduras", o que permite discriminar entre dois fenótipos bem caracterizados num modo simples. Contudo, esta nomenclatura não deve ser interpretada como excluindo todos os possíveis estádios de diferenciação intermédios. As células dendríticas imaturas são caracterizadas como APC, com uma elevada capacidade para absorção e 108 processamento de antigénio, o que se correlaciona com a elevada expressão de receptor de Fcy e receptor de manose. 0 fenótipo maduro é, tipicamente, caracterizado por uma expressão mais baixa destes marcadores, mas uma expressão elevada de moléculas de superfície celular responsáveis por activação de células T, tais como moléculas de adesão de MHC de classe I e classe II (e. g., CD54 e CD11) e moléculas co-estimulatórias (e. g., CD40, CD80, CD86 e 4-1BB).

As APC podem, em geral, ser transf ectadas com um polinucleótido codificando uma proteína (ou sua porção ou outro variante) , de modo a que o polipéptido, ou uma sua porção imunogénica, seja expresso na superfície celular. Essa transfecção pode realizar-se ex vivo e uma composição ou vacina compreendendo essas células transfectadas pode ser, depois, utilizada para efeitos terapêuticos, como aqui descritos. Alternativamente, um veículo de transferência génica que vise uma célula dendrítica, ou outra célula de apresentação de antigénios, pode ser administrado a um doente, resultando em transfecção que ocorre in vivo. A transfecção in vivo e ex vivo de células dendríticas, por exemplo, pode ser, em geral, realizada utilizando quaisquer métodos conhecidos na técnica, tais como os descritos no documento WO 97/24447, ou a abordagem da pistola de genes descrita por Mahvi et al., Immunology and Cell Biology 75:456-460 (1997). A carga de antigénio de células dendríticas pode ser conseguida através da incubação de células dendríticas ou células progenitoras com o polipéptido, ADN (livre ou dentro de um vector plasmídico) ou ARN; ou com bactéria ou vírus recombinantes expressando antigénios (e. g., vectores de vacínia, varíola das aves de capoeira, adenovírus ou lentivírus). Antes do carregamento, o polipéptido pode ser covalentemente conjugado a um parceiro imunológico que 109 proporcione auxílio de células T (e. g., uma molécula transportadora). Alternativamente, uma célula dendrítica pode ser pulsada com um parceiro imunológico não conjugado, separadamente ou na presença do polipéptido.

As vacinas e composições farmacêuticas podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou multidose, tais como ampolas ou frasquinhos selados. Esses recipientes são, de um modo preferido, hermeticamente selados para preservar a esterilidade da formulação até à sua utilização. Em geral, as formulações podem ser armazenadas como suspensões, soluções ou emulsões em transportadores oleosos ou aquosos. Alternativamente, uma vacina ou composição farmacêutica pode ser armazenada num estado liofilizado, requerendo apenas a adição de um transportador líquido estéril, imediatamente antes da utilização.

Todas as publicações e pedidos de patentes citados nesta descrição são aqui incorporados por referência como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse, especificamente e individualmente, indicado como estando incorporado por referência.

Embora, para efeitos de clareza de compreensão, a título de ilustração e exemplo, a invenção anterior tenha sido descrita com algum detalhe, será facilmente perceptível a alguém com conhecimentos gerais na técnica, à luz dos ensinamentos desta invenção, que podem ser feitas determinadas alterações e modificações na mesma, sem sair do espírito ou âmbito das reivindicações anexas. 110

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes são proporcionados apenas a título de ilustração e não a título de limitação. Os especialistas na técnica facilmente reconhecerão uma variedade de parâmetros não críticos que poderiam ser alterados ou modificados para produzir resultados essencialmente semelhantes.

Exemplo 1: Preparaçao de Mtb72f (sem Cauda His) (SEQ ID N° 6)

Construção do Vector de Expressão de Mtb72f A Mtb72f é uma proteína de fusão formada a partir de 2 proteínas de Mycobacterium tuberculosis Mtb32 e Mtb39. A Mtb72f é construída através da fusão de Mtb39 e das porções N e C terminais de Mtb32, como se segue: extremidade C-terminal de Mtb32 - Mtb39 - extremidade N-terminal de Mtb32. Especificamente, a proteína Mtb72f foi gerada pela ligação sequencial em posição tandem das fases de leitura aberta (ORF) codificando o fragmento C-terminal de ~14-kDa de Mtb32 (resíduos 192-323; 132 aminoácidos) à ORF de comprimento completo de Mtb39, seguida do terminal C com a porção N-terminal de ~20-kDa (resíduos 1-195) de Mtb32. Isto foi conseguido através da utilização de oligonucleótidos específicos de sequência, contendo sítios de restrição únicos (EcoRI e EcoRV) e desprovidos de codões de terminação nas extremidades C-terminais (no caso de Mtb32-C e Mtb39) para a reacção de polimerização em cadeia (PCR) de ADN genómico da estirpe H37Rv de M. tuberculosis. 111

Os detalhes do processo sao como se segue:

Em primeiro lugar, o ADN codificando a porção C-terminal de

Mtb32 (Mtb32c) foi clonado a partir de H37Rv, utilizando PCR, com os seguintes oligonucleótidos: 5' (5 ‘-CAA-TTA-CAT-ATG-CAT-CAC-CAT-CAC-CAT-CAC-ACG-GCC-GCG-TCC-GAT-AAC-TTC-3') e 3' (5'-CTA-ATC-GAA-TCC-GGC-CGG-GGG-TCC-CTC-GGC-CAA-3'). 0 oligonucleótido 5' continha um sitio de restrição Ndel (sublinhado) abrangendo o codão de iniciação ATG. 0 oligonucleótido 3' continha um sitio de restrição EcoRI (sublinhado). Estes oligonucleótidos foram utilizados para amplificar Mtb32c, uma porção de 396 nucleótidos de Mtb32, e o produto resultante foi subclonado nos sitios Ndel e EcoRI de um vector de expressão. A digestão com EcoRI e EcoRV linearizou, subsequentemente, o plasmideo Mtb32c.

Para Mtb39, os seguintes oligonucleótidos foram utilizados para amplificação por PCR e clonagem: 5'-(5'-CTA-ATC-GAA-TTC-ATG-GTG-GAT-TTC-GGG-GCG-TTA-3') e 3' (5'-CTA-ATC-GAT-ATC-GCC-GGC-TGC-CGG-AGA-ATG-CGG-3'). 0 oligonucleótido 5' continha um sítio de restrição EcoRI (sublinhado), enquanto o oligonucleótido 3' continha um sítio de restrição EcoRV (sublinhado). A sequência codificante de comprimento completo de Mtb39 foi amplificada, digerida e subclonada, em fase, a jusante de Mtb32c, utilizando o plasmideo pré-digerido da primeira etapa.

Os oligonucleótidos 5' e 3' do fragmento N-terminal de Mtb32 foram concebidos como se segue: 5' (5'-CTA-ATC-GAT-ATC-GCC-CCG-CCG-GCC-TTG-TCG-CAG-GAC-3') e 3' (5'-CTA-ATC-GAT-ATC-CrA-GGA-CGC-GGC-CGT-GTT-CAT-AC-3'). Ambos os conjuntos de oligonucleótidos continham um sítio de restrição EcoRV 112 (sublinhado), enquanto o oligonucleótido 3' também incluiu um codão de terminação (itálico). Os oligonucleótidos foram concebidos para amplificar uma porção de 585 pb de Mtb32 codificando o domínio N-terminal previsto desta proteína. 0 produto de PCR resultante foi subclonado no plasmídeo de fusão Mtb32c-Mtb39. A orientação apropriada dos insertos e a ausência de mutações foi, depois, verificada por sequenciação de ADN.

Para a construção final, utilizada para preparar o Banco de Células Principal e o Banco de Células de Trabalho do fabricante, a cauda de afinidade 6xHis foi removida por PCR e a fase de leitura aberta (ORF) para Mtb72f foi subclonada em pPDM, um vector de expressão derivado de pET. A ORF codifica para uma poliproteína de cerca de 72 kDa (Mtb72f), com domínios organizados na ordem linear: Mtb32c-Mtb39-Mtb32N. Este ADN foi, depois, transformado na estirpe HMS 174 pLysS de E. coli e utilizado para testagem, criação de banco de células e preparação.

Produção de Agregado de Substância de Fármaco de Mtb72f 0 processo de preparação para a produção de Mtb72f é resumido como se segue: - Fermentação, seguida de recolha de células por centrifugação, dissociação de células (microfluidificador) e centrifugação, para produzir um sedimento de corpos de inclusão; - Purificação do sedimento de corpos de inclusão por

extracção em ureia a 8 M, seguido de cromatografia de Q 113 sepharose Fast Flow (QFF), cromatografia de Hidroxiapatite Cerâmica (CHT), diafiltração e esterilização por filtração, para produzir o agregado de substância de fármaco purificado.

Fermentação

As fermentações são realizadas a um volume de trabalho de 10 L. O fermentador é inoculado com 300 mL de uma cultura de balão de agitação das células de sementeira de trabalho, cultivadas a 37 °C, de um dia para o outro. O inoculo e a fermentação utilizam um meio semidefinido, com glicerol derivado de plantas, como a fonte de carbono primária. A composição do meio é mostrada na tabela abaixo. Todos os componentes do meio são esterilizados através do aquecimento a 121 °C, durante 20 minutos ou por esterilização por filtração. Durante a fermentação, o fermentador é mantido a uma temperatura de 37 °C. O ar é aspergido a uma taxa de 5 litros padrão por minuto (SLPM) . O pH do meio é mantido a 7,0 por adição automática de ácido (H2S04) ou base (NaOH) . O fermentador é programado para controlar o oxigénio dissolvido a 30%, através do ajuste automático da agitação mantendo, simultaneamente, uma agitação minima de 200 rpm. O controlo da espuma no fermentador é conseguido pela adição automática de antiespumante de silicone SAG-471 (Witco Corp.) a 1,05%. Quando a densidade celular atinge uma densidade óptica (600 nm) de, aproximadamente, 3,5, é adicionado isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) ao fermentador, a uma concentração de 1,0 mM. O IPTG induz a expressão do gene recombinante codificando a proteina Mtb72f. Às 3, 0 horas após a indução, o fermentador é arrefecido e as 114 células são recolhidas por centrifugação em frascos de centrífuga de 1 L.

Composição do Meio de Fermentação

Material Concentração Extracto de Levedura 15 g/L Glicerol 30 g/L Sulfato de magnésio, hepta-hidratado 0,5 g/L (MgS04“) Fosfato de potássio, monobásico 2,4 g/L (KH2P04) Fosfato de sódio, dibásico (Na2HPC>4) 3,2 g/L Cloreto de amónio (NH4CI) 1,0 g/L Cloreto de sódio (NaCl) 0,5 g/L Sulfato de canamicina 30 mg/L Cloranfenicol 34 mg/L Antiespumante de silicone SAG-471 0,0005% (v/v) (não (Witco Corp.) incluído)

Isolamento de Corpos de Inclusão

Os sedimentos celulares são ressuspensos e agregados em 2,3 L de Tampão de lise (NaCl a 50 mM, Tris a 10 mM, pH 8,0) e um Microfluidizer® M-l 10Y é utilizado para dissociar as células. As células são passadas através do Microfluidificador cinco vezes, a uma pressão de 11000 ± 1000 psi. A suspensão é centrifugada a 8000 x g em frascos de 500 mL. Nestas condições, os corpos de inclusão (IB) contendo a proteína Mtb72f são sedimentados, enquanto a maioria dos detritos celulares 115 permanece no sobrenadante. Os sedimentos de IB são ressuspensos em Tampão de Lavagem (ureia a 2 M, NaCl a 50 mM, Tris a 10 mM, pH 8,0), seguido de centrifugação a 8000 g. As fracções de sobrenadante são descartadas e os sedimentos de IB são armazenados a -70 °C até -80 °C, até serem necessários para purificação adicional.

Purificação de poliproteina

As preparações de IB congeladas são descongeladas, a 37 °C, durante 15 minutos e, depois, ressuspensas em ureia a 8 M, NaCl a 50 mM, Bis-tris propano a 20 mM, pH 7, 0 (Tampão A) utilizando agitação mecânica suave. Os IB ressuspensos são, depois, agitados à temperatura ambiente com uma barra de agitação magnética, a 300 rpm, durante 2 h. 0 extracto de IB é, depois, centrifugado, a velocidade elevada e a fracção de sobrenadante resultante é filtrada através de um filtro de 0,45 μΜ (Pall, Supor), antes do fraccionamento cromatográfico. O extracto de IB é aplicado a uma coluna contendo resina de permuta aniónica Q sepharose Fast Flow (QFF) (10 x 12,5 cm Amersham/Pharmacia BPG; 1 L de leito empacotado) , anteriormente desinfectada com NaOH a 1 N e, depois, equilibrada com Tampão A. A coluna é desenvolvida a um caudal linear de 60 cm/h com Tampão A e o escoamento, contendo, predominantemente, contaminantes de massa inferior, é recolhido para referência. O agregado de Mtb72f é eluído, numa única etapa, utilizando ureia a 8 M, NaCl a 90 mM, Bis-tris propano a 20 mM, pH 7,0 e é recolhido como um único pico de agregado, com base na absorvência. 116

As resinas QFF são resinas de agarose altamente reticulada, com um grupo funcional de amina quaternária que está carregado positivamente nas condições utilizadas durante a purificação. A matriz carregada permite a ligação de diversos aniões que podem ser, depois, selectivamente eluidos utilizando um gradiente de sal. Esta cromatografia de permuta aniónica é utilizado para separar ácidos nucleicos e endotoxina que se ligam firmemente à resina, da proteína, que está ligada mais fracamente e elui antes destes contaminantes. Adicionalmente, esta etapa remove contaminantes não carregados e uma grande parte das impurezas de proteína. 0 pico de eluato de NaCl a 90 mM é da coluna QFF, é aplicado a uma coluna (2,6 x 12 cm Amersham/Pharmacia XK26/20; 63 mL de leito empacotado) contendo hidroxiapatite cerâmica MacroPrep® (CHT) (tipo I, 40 μΜ, BioRad), anteriormente desinfectada utilizando NaOH a 1 N e, depois, equilibrada com Tampão C (ureia a 8 M, NaCl a 250 mM e Bis-tris propano a 20 mM, pH 7,0). O material de escoamento (FT1) contendo a maioria do Mtb72f, isento de contaminantes, é recolhido. A coluna é lavada com Tampão C e qualquer material absorvendo UV resultante é recolhido. Finalmente, a coluna é eluida em Tampão D (ureia a 8 M, fosfato de sódio a 200 mM, pH 7,4). O MacroPrep® CHT é uma forma esférica, macroporosa, de hidroxiapatite [Cas (PO4) 3OH] 2. A cromatograf ia de CHT pode ser um método de purificação altamente selectivo se forem verificadas as condições de ligação e eluição apropriadas. Os modos de ligação incluem ligação de tipo permuta iónica a iões de cálcio e fosfato carregados, assim como quelação de moléculas. O ADN irá ligar-se a esta resina e pode conseguir-se elevada selectividade para proteínas individuais. As condições 117 utilizadas para a purificação de Mtb72f servem como uma etapa de polimento, permitindo a remoção virtualmente completa de contaminantes de célula hospedeira detectáveis.

Durante as separações cromatográficas, a absorvência ultravioleta (UV), condutividade, pressão, pH, caudal e temperatura ambiente são monitorizados e registados. 0 material de escoamento de CHT inicial (FT1) é utilizado para processamento a adicional jusante.

Diafiltração e Esterilização por Filtração A diafiltração é realizada no agregado de CHT FT1 para remover a ureia e substituir o tampão com Tris a 20 mM, pH 7,5. A diafiltração é realizada utilizando um sistema Pall Minim™, com um dispositivo de filtração de fluxo tangencial LV-Centramate™ com uma membrana de ultrafiltração de exclusão de peso molecular de 30 kDa (MWCO) . A solução de Mtb72f em Tris a 20 mM, pH 7,5 é esterilizada por filtração utilizando um filtro de esterilização de 0,2 pm (Millipak 40). Cinquenta mL da solução são distribuídos para frascos de meios estéreis de 60 mL PETG (copolímero de tereftalato de polietileno), depois, congelados e armazenados a -70 °C. Este material é o agregado de substância de fármaco purificado Mtb72f. 118

Exemplo 2: Preparaçao de Mtb72f (Cauda de 6 His) (SEQ ID N° 2) O método do Exemplo 1 pode ser seguido, com a excepção de que a etapa de subclonagem em pPDM de modo a remover a Cauda His é omitida.

Exemplo 3: Preparação de M72 (Cauda de 2 His) (SEQ ID N° 4)

Construção do vector de expressão de M72 0 material de partida para a construção do antigénio M72 foi o plasmideo recombinante 6His-Mtb72fmut. 0 6His-Mtb72fmut foi preparado por mutagénese dirigida pontual, utilizando o plasmideo recombinante 6his-Mtb72f (ver o Exemplo 1) como molde. A mutagénese dirigida pontual envolveu a substituição do codão para Ser, na posição 710 em SEQ ID N° 1, com um codão para Ala. A deleção de quatro histidinas N-terminais presentes na construção 6His-Mtb72fmut (plasmideo Corixa) foi conseguida com o "Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System" (Invitrogen), conduzindo à construção 2His-Mtb72Fmut esperada. Após verificação de sequência, a sequência codificando 2His-Mtb72finut foi excisada do plasmideo (por restrição enzimática), purificada em gel e ligada ao vector de expressão pET29a resultando no plasmideo recombinante final pET29a/2His-Mtb72fmut. Após verificação de sequência, ao plasmideo recombinante foi dada a designação oficial pRIT15497 e utilizado para transformar células hospedeiras HMS174(DE3). 0 pRIT15497 codifica para uma proteína de 725 aminoácidos, denominada M72. 119

Produção da proteína M72

Pode ser empregue o mesmo processo de produção que o descrito para Mtb72f (ver o Exemplo 1), excepto que para a produção de M72, o cloranfenicol está ausente no meio de fermentação.

Exemplo Biológico 1: Um modelo de murganho de um estado inactivo/latente de infecção por M. tuberculosis

Para estabelecer um modelo de murganho de infecção latente por M. tuberculosis, foi utilizada a estirpe SWR. Os murganhos SWR não estão imunocomprometidos, mas são deficientes para secreção de componente C5 do complemento (ver Ooi e Colten, Nature (1979) 282:207-8). Os murganhos SWR são incapazes de estabelecerem um estado crónico de infecção por Mtb, mas desenvolvem pneumonia granulomatosa difusa, caracterizada por macrófagos grandes epitelióides e espumosos, com inclusões cristaloides (grânulos derivados de neutrófilos ou eosinófilos que foram fagocitados), necrose multifocal, acumulação de neutrófilos e linfócitos raros (ver Turner et al., J Submicrosc Cytol Pathol. (2001) 33 (1-2):217-9 e Turner, et al., Infect

Inrnun. (2003) 71 (9) :5266-72) . O seguinte é o protocolo para utilização da estirpe de murganho Swiss Webster (SWR/J), num modelo de infecção latente por M. tuberculosis, para avaliar a eficácia terapêutica de Mtb72f (SEQ ID N° 6) formulado com adjuvante AS01B. O AS01B de dupla resistência é preparado através da adição de QS21 (5 yg) a vesículas unilamelares pequenas (SUV) de dioleoilfosfatidilcolina (100 yg) , contendo colesterol (25 yg) (documento WO 96/33739) e monofosforil-lípido A (MPL) (5 yg) na membrana (ver a Publicação de Patente U.S. 120 Ν° 2003/0143240). Uma alíquota para injecção (50 pL) é preparada através da mistura de 4 pg de proteína em tampão (PBS pH, 6,8) com 50 pL de AS01B de dupla resistência. Cada murganho recebeu duas injecções de 50 pL (i. e., 8 pg de proteína).

Um friso cronológico representativo para o estabelecimento de um modelo de uma infecção latente por M. tuberculosis é esquematicamente representado na Figura 1.

Dia 1: Infectar por meio de aerossol, com 50-100 unidades de formação de colónias (CFU) de organismos de M. tuberculosis

Dia 30-90: Tratar um subconjunto de murganhos com 50 mg de rifampina/85 mg de isoniazida, por Litro de água potável

Dia 61: Todos os murganhos recebendo a vacina 5 candidata devem ser imunizados com rMtb72f + AS01B

Dia 82: Todos os murganhos recebendo a vacina candidata devem ser imunizados com rMtb72f + AS01B

Dia 103: Todos os murganhos recebendo a vacina candidata devem ser imunizados com rMtb72f + AS01B

Dia 113: Sangrar para ensaios de IgG

Diversos Intervalos de Tempo: Retirar baços e pulmões para enumeração de CFU & imunogenicidade 121

Variação 1 -> Tratar com quimioterapia, durante 6 0 dias.

Começando no dia 3 0 -► Repousar durante 3, 4, 5 meses -► CFU em 2 murganhos em cada intervalo de tempo e deixar 4-7 murganhos para estudos de sobrevivência

Variação 2 -» Tratar com quimioterapia, durante 90 dias.

Começando no dia 30 -► Repousar durante 4, 5 meses -> CFU em 2 murganhos em cada intervalo de tempo e deixar 7 murganhos para estudos de sobrevivência

Variação 3 -* Repousar durante 4, 5, 6 meses -*· CFU em 2 murganhos em cada intervalo de tempo e deixar 4 murganhos para estudos de sobrevivência

Variação 4 -► Tratar com Quimioterapia, durante 60 dias.

Começando no dia 30 -► 3 imunizações com r72F+AS01B intramuscularmente (i.m.) começando no Dia 60 -► Repousar durante 3, 4, 5 meses -► CFU em 2 murganhos em cada intervalo de tempo e deixar 4-7 murganhos para estudos de sobrevivência

Variação 5 -► Tratar com quimioterapia, durante 90 dias.

Começando no dia 30 -► 3 imunizações com r72F+AS01B, i.m., começando no Dia 6 0 -► Repousar durante 4, 5 meses -► CFU em 2 murganhos em cada intervalo de tempo e deixar 4-7 murganhos para estudos de sobrevivência. 122 A análise das respostas de anticorpos pós-infecção, utilizando rMtb72f para revestir as placas de ELISA, revelou que os grupos que receberam uma combinação de quimioterapia e imunização de Mtb72f+AS01B tinham uma resposta de anticorpo mais elevada (OD até 2,0) do que murganhos que não foram tratados ou apenas receberam tratamento de quimioterapia (OD inferior a 0,5) (Figura 2). Os murganhos imunizados com Mtb72f montaram uma resposta de anticorpo específica de Mtb72f mensurável (OD compreendida entre 1,5 e 2,5), quer tenham recebido 60 ou 90 dias de quimioterapia (Figura 3).

As células do baço foram recolhidas de murganhos em diversos intervalos, depois dos murganhos terem sido infectados com M. tuberculosis. Os esplenócitos foram reestimulados in vitro com antigénios recombinantes para medir a secreção de IFN-γ. Os niveis de IFN-γ produzidos por estas células foram uniformemente negligenciáveis nos grupos 1 (não tratado) e 2 (apenas quimioterapia) no dia 60, com a excepção de Mtb39. As estimulações de controlo positivo com lisado de conA, PPD e BCG demonstraram que as células foram capazes de sintetizar e segregar IFN-γ em resposta a outras moléculas estimulatórias (Figura 4). Os niveis de IFN-γ foram elevados nos grupos recebendo Mtb72f+AS01B, mas foram baixos ou negligenciáveis nos grupos que não tinham sido imunizados com Mtb72f+AS01B, quer tenham ou não recebido quimioterapia (Figura 5).

Durante o curso de infecção de tuberculose e tratamento subsequente, as células T especificas respondem. Utilizando coloração de citocina intracelular para IFN-γ, foi medida a percentagem de respostas de células CD4+ especificas para Mtb72F (Figura 6). Pareceu não haver alteração nas respostas de células T CD4+ IFN γ+ específicas de Mtb72F, durante o curso de apenas 123 quimioterapia, em qualquer intervalo de tempo, como medido por este ensaio (Figura 7) . No dia 120 após infecção por Mtb, a tendência de resposta de CD4+ IFNy+ a Mtb72F, nos grupos recebendo o Mtb72f mais a vacina AS01B, pareceu aumentar com a duração do tempo de quimioterapia (Figura 7).

Os resultados destas experiências demonstram que os murganhos SWR são susceptiveis a infecção com M. tuberculosis.

Se deixados nao tratados, os murganhos SWR morrem em torno dos 115 dias após infecção por Mtb (Figuras 8 e 9) . 0 tempo de sobrevivência médio para os murganhos recebendo 60 dias de quimioterapia de combinação foi 170 dias (Figuras 8 e 9) . 0 tempo de sobrevivência médio para os murganhos recebendo 60 dias de quimioterapia de combinação e 3 imunizações de Mtb72f/AS01B foi 215 dias (Figuras 8 e 9) . A sobrevivência para o grupo de murganhos recebendo quimioterapia é significativamente diferente (intervalo de confiança de 95% (p=0,0067)) dos recebendo quimioterapia e a vacina Mtb72f/AS01B.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Coler, Rhea N Reed, Steven G Lobet, Yves <120> Novo método para a prevenção ou tratamento de infecção por M. tuberculosis 124 <130> VB61507 <16 Ο > 6 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 2287 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: proteína de tri-fusão Mtb72F (Ral2-TbH9-Ra35 ou Mtb32-Mtb39) <220> <221> característica_misc <222> (30)..(30) <223> n é a, c, g ou t <220> <221> característica_misc <222> (33)..(33) <223> n é a, c, g ou t <220>

<221> CDS <222> (42) . . (2228) <220> <221> característica_misc <222> (2270)..(2270) <223> n é a, c, g ou t 125 <4 Ο 0> 1 tctagaaata attttgttta çtttaagáan ganatataca t atg cat cac cat cac SÊ

Met Hie His His His 1 $ cat cac acg gcc gcg tcc gat aac ttc cag ctg tcc cag ggt ggg cag 104

His His Thr Ala Ala 10 Ser . Asp Asn Phe Gin ] 15 Leu Ser < 3l n < 3ly C 5 »ly C Í0 íln gga ttc gcc 152 att ccg ate ggg cag gcg atg gcg ate gcg ggc cag ate Gly Phe Ala Ile 25 Pro Ile Gly Gin Ala 30 Met Ala Ile Ala Gly 35 Gin Ile cga tcg ggt ggg ggg tea ccc acc gtt cat ate ggg cct acc gcc ttc £llU Arg Ser Gly 40 Gly Gly Ser Pro Thr 45 Vai His Ile Gly Pro 50 Thr Ala Phe etc ggc ttg 240 ggt gtt gtc gac aac aac ggc aac ggc gea cga gtc càa Leu Gly Leu 55 Gly Vai Vai Asp 60 Asn Àsn Gly Asn Gly 65 Ala Arg Vai Gin ege gtg gtc 296 ggg age gct ccg gcg gea agt ctc ggc ate tcc acc ggc Arg Vai Vai 70 Gly Ser Ala 75 Pro Ala Ala Ser Leu 80 Gly Ile Ser Thr Gly 85 gac gtg ate 344 acc gcg gtc gac ggc gct ccg ate aac tcg gcc acc gcg Asp Vai Ile Thr Ala 90 Vai Asp Gly Ala Pro 95 Ile Asn Ser Ala Thr 100 Ala atg gcg gac ^ 05 gcg ctt aac ggg cat cat ccc ggt gac gtc ate tcg gtg V 76 Met Ala Asp Ala 105 Leu Asn Gly His His 110 Pro Gly Asp Vai Ile 115 Ser vai acc tgg caa 4 4Π aee aag tcg 99« ggc acg cgt aca ggg aac gtg aca ttg Thr Trp Gin 120 Thr Lys Ser Gly Gly 125 Thr Arg Thr Gly Asn 130 vai Thr Leu 126 gcc λ «Η gag gga ccc ccg gcc gaa ttc atg gtg gat ttc ggg gcg tta cca Ala GlU 135 Gly Pro Pro Ala Glu 140 Phe Met val Asp Phe 145 Gly Ala Léu Pro cm 9*9 ate aac tcc gcg egg atg tac gcc ggc cçg ggt tcg gcc tcg Pro ISO Glu Ile Asn Ser Ala 155 Arg Met Tyr Ala Gly Pro Gly 160 Ser Ala Ser 165 ctg gtg gcc gcg gct cag atg tgg gac age gtg gcg agt gac ctg ttc 584 Leu Vai Ala Ala Ala 170 Gin Met Trp Asp Ser 175 Val Ala Ser Asp Leu Phe 180 tcg 632 gcc gcg tcg gcg ttt cag tcg gtg gte tgg ggt ctg acg gtg ggg Ser Ala Ala Ser 185 Ala Phe Gin Ser Val 190 Val Trp Gly Leu Thr Val Gly 195 tcg tgg ata ggt tcg tcg gcg ggt ctg atg gtg gcg gcg gcc tcg ccg 680 Ser Trp Ile 200 Gly Ser Ser Ala Gly 205 Leu Met Val Ala Ala 210 Ala Ser Pro ta-t:· gtg gcg tSf9 atg age gte acc gcg 999 cag gcc gag ctg acc gcc 726 Tyr vai 215 Ala Trp Met Ser vai 220 Thr Ala Gly Gin Ala 225 Glu Leu Thr Ala gcc cag gte egg gct gct acg gcg gcc tac gag açg gcg tat ggg ctg 776 Ala 230 Gin Val Arg Val Ala 235 Ala Ala Ala Tyr Glu Thr 240 Ala Tyr Gly Leu 245 acg A 7 Λ gtg ccc ccg ccg gtg ate gcc iag aac cgt gct gaa ctg atg att Thr Vai Pro Pro Pro 250 Val Ile Ala Glu Asn 255 Arg Ala Glu Leu Met Ile 260 ctg Α'ϊ'ί ata gcg acc aac etc ttg ggg caa aac acc ccg gcg ate gcg gte y. «£* Leu lie Ala Thr 265 Asn Leu Leu Gly Gin 270 Asn Thr Pro Ala Ile Ala Val 275 aac 920 gag gcc gaa tac ggc gag atg tgg gcc caa gac gcc gcc gcg atg Asn GlU Ala 280 Glu Tyr Gly Glu Met 285 Trp Ala Gin Asp Ala 290 Ala Ala Met 127 ttt ggc 968 tac gcc gcg gcg acg gcg acg gcg acg gcg acg ttg ctg ccg Phe Gly 295 Tyr Ala Ala Thr 300 Ala Thr Ala Thr Ala 305 Thr Leu Leu Pro tte gag 1016 gag gcg ccg 900 atg acc age gcg ggt ggg etc ctc gag cag Phe Glu 310 Glu Ala Pro Glu 315 Met Thr Ser Ala Gly 320 Gly Leu Leu Glu Gin 325 gcc gcc 1064 gcg gcc gag gag gcc tcc gac acc gcc gcg gcg aac cag ttg Ala Ala Ala Vai Glu 330 Glu Ala Ser Asp Thr 335 Ala Ala Ala Asn Gin Leu 340 atg aac 1112 aat gtg eec cag gcg ctg caa cag ctg gcc cag ;CCC acg cag Met Asn Asn Vai 345 Pro Gin Ala Leu Gin 350 Gin Leu Âlâ Glu Pro 355 Thr Gin ggc acc 1160 acg cct tct tcc aag ctg ggt ggc ctg tgg aag acg gtc tcg Gly Thr Thr 360 Pro Ser Ser Lys Leu 365 Gly Gly Leu Trp Lys 370 Thr Val Sèr ccg eat 1208 cgg tcg ccg ate age aac atg gtg tcg atg gcc aac aac cac Pro Hlâ 375 Arg Ser Pro Ile Ser 380 Asn Met Val Ser Met 385 Ala Asn Asn His atg tcg 10« atg acc aac tcg ggt gtg tcg atg acc aac acc ttg age tcg Met Ser 390 Met Thr Asn Ser 395 Gly Val Ser Met Thr 400 Asn Thr Leu Ser Ser 405 atg ttg Ti Λ 4 aag ggc ttt gct ccg gcg gcg gcc gcc cag gcc gtg caa acc Met Leu Lys Gly Phe 410 Ala Pro Ala Ala Ala 415 Ala Gin Ala Val Gin 420 Thr gcg gcg 1352 caa aac ggg gtc cgg gcg atg age tcg ctg ggc age tcg ctg Ala Ala Gin Asn 425 Gly Val Arg Ala Met 430 Ser Ser Leu Gly Ser 435 Ser Leu ggt tct 1400 tcg ggt ctg ggc ggt ggg gtg gcc gcc aac ttg ggt cgg gcg Gly Ser Ser' 440 Gly Leu Gly Gly Gly 445 Val Ala Ala Asn Leu 450 Gly Arg Ala 128 gcé teg 1448 gtc ggt teg ttg teg gtg ecg cag gee tgg gee gcg gcç aac Ala Ser 455 Val Gly Ser Leu Ger 460 Val Pro Gin Ala Trp 465 Ala Ala Ala Asn cag gca 1496 :gtc aee ceg gcg gcg cgg gcg ctg ccg ctg acc age. ctg acc Gin Ala 470 Val Thr pro Ala 475 Ala Arg Ala Leu Pro 480 Leu Thr Ser Leu Thr 485 age gee 1544 gcg gaa aga 999 ccc ggg cag atg ctg ggc ggg ctg ccg gtg Ser Ala Ala Glu Arg 490 Gly Pro Gly Gin Met 495 Leu Gly Gly Leu Pro 500 Val 999 cag 1592 atg 99C gee agg gee ggt ggt 999 etc agt ggt gtg ctg cgt Gly Gin Met Gly 505 Ala Arg Ala Gly Gly 510 Gly Leu Ser Gly Val 515 Leu Arg gtt ccg 184o ccg cga çce tat gtg atg ceg cat. tet ccg gca gee ggc gat Vai Pro Pró: 520 Arg Pro Tyr Val Met 525 Pro His Ser Pro Ala 530 Ala Gly Asp ate gee 1688 ceg ceg gee ttg teg cag gac cgg tte gee gac ttc ccc gcg Ile Ala 535 Pro pro Ala Leu Ser 540 Gin Asp Arg Phe Ala 545 Asp Phe Pro Ala ctg: ccc 1736 etc gac eeg tcc gcg atg gtc gee caa gtg ggg cca cag gtg Leu Pro 550 Leu Asp Pro Ser Ala 555 Met Val Ala Gin 560 Val Gly Pro Gin Val 565 gtc aac τ no a ate aac aee aaa Ctg ggc tse aac aac gee gtg ggc gee ggg X /0^4 Val Aan Ile Asn Thr S 70 Lys Leu Gly Tyr Asn 515 Asn Ala Val Gly Ala 580 Gly aee ggc 1832 ate gtC: ate gat ccc aac ggc gtc gtg ctg acc aac aac cae Thr Gly ile Val 585 Ile. Asp Pro Asn Gly 590 Val val Leu Thr Asn 595 Asn His gtg ate gcg 990 gee acc gac ate aat gcg ttc age gtc 93C tcc ggc ISO O Val ile Ala Gly Ala Thr Asp Ile Asn Ala Phe Ser val Gly Ser Gly caa acc tac ggc gtc gat gtg gtc 999 tat gac cgc acc cag gat gtc 1928 Gin Thr Tyr Gly Vai Asp Val Val Gly Tyr Asp Arg Thr Gin Asp Val 615 620 625 gcg gtg ctg cag ctg cgc ggt gcc ggt ggc ctg ccg tcg gcg gcg ate 1976 Ala Vai Leu Gin Leu Arg Gly Ala Gly Gly Leu Pro Ser Ala Ala Ile 630 635 640 645 ggt ggc 2024 ggc gtc gcg gtt ggt gag ccc gtc gtc gcg atg ggc aac age Gly Gly Gly Vai Ala Val Gly Glu Pro Val Val Ala Met Gly Asn Ser 650 655 660 99t ggg 2072 cag ggc gga acg ccc cgt gcg gtg cct ggc agg gtg gtc gcg Gly Gly Gin Gly Gly Thr Pro Arg Ala Val Pro Gly Arg Val Val Ala 665 670 675 ctc ggc 2120 caa acc gtg cag gcg tcg gat tcg ctg acc ggt gcc gaa gag Leu Gly Gin Thr Val Gin Ala Ser Asp Ser Leu Thr Gly Ala Glu Glu 680 685 690 aca ttg aac 999 ttg ate cag ttc gat gcc gcg ate cag ccc ggt gat 2168 Thr Leu Asn Gly Leu lie Gin Phe Asp Ala Ala Ile Gin Pro Gly Asp 695 700 705 tcg ggc 2216 999 ccc gtc gtc aac ggc cta gga cag gtg gtc ggt atg aac Ser Gly Gly Pro val Val Asn Gly Leu Gly Gin Val Val Gly Met Asn 710 715 720 725 acg gcc gcg tcc taggatatcc atcacactgg cggccgctcg agcagatccg 2268

Thr Ala Ala Ser gntgtaacaa agcccgaaa 2287 <210> 2 <211> 729 <212> PRT <213> Artificial 130 <220> <223> Descrição de Sequência tri-fusão Mtb72F (Ral2-TbH9-Ra35

Artificial: proteína ou Mtb32-Mtb39) de <400> 2

Met His Hia His His His Hia Thr 1 5

Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gin Leu 10 15

Ser Gin Gly Gly Gin Gly Phe Ala 20

Ile Pro Ile Gly Gin Ala Met Ala 25 30

Zle Ala Gly Gin Ile Arg Ser Gly 35 40

Gly Gly Ser Pro Thr Vai His Ile 45

Gly Pro Thr Ala Phe Leu Gly Leu 50 55

Gly Vai Vai Asp Asn Asn Gly Asn €0

Gly Ala Arg Vai Gin Arg Vai Vai S5 70

Gly Ser Ala Pro Ala Ala Ser Leu 75 80

Gly He Ser Thr Gly Asp Vai Ile 85

Thr Ala Vai Asp Gly Ala Pro Ile »0 95

Asn Ser Ala Thr Ala Met Ala Asp Ala Leu Asn Gly His His Pro Gly 100 105 110

Asp Vai Ile Ser Vai Thr Trp Gin Thr Lys Ser Gly Gly Thr Arg Thr 115 120 125

Gly Asn val Thr Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala Glu Phe Met Vai Asp 130 135 140

Phe Gly Ala Leu Pro Pro Glu Ile Asn Ser Ala Arg Met Tyr Ala Gly 145 150 155 160

Pro Gly Ser Ala Ser Leu Val Ala Ala Ala Gin Met Trp Asp Ser Val 165 170 175 131

Ala Ser Asp Leu Phe Ser Ala Ala Ser Ála Phe Gin Ser Vai Vai Trp 180 1::85 190

Gly Léu Thr Vai Gly Ser Trp Ile Gly Ser Se** Ala Gly Leu Met Vai 195 200 205

Ala Ala Ala Ser Pro Tyr Vai Ala Trp Met Ser Vai Thr Ala Gly Gin 210 215 220

Ala Glu Leu Thr Ala Ala Gin Vai Arg Vai Ala Ala Ala Ala Tyr Glu 225 230 235 240

Thr Ala Tyr Gly Leu Thr Vai Pro Pro Pro Vai Ile Ala Glu Asn Arg 245 250 255

Ala Glu Leu Met Ile Leu ile Ala Thr Asn Leu Leu Gly Gin Asn Thr 260 265 270

Pro Ala Ile Ala Vai Asn Glu Ala Glu Tyr Gly Glu Met Trp Ala Gin 275 280 285

Asp Ala Ala Ala Met Phe Gly Tyr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr 290 295 300

Ala Thr Leu Leu Pro Phe Glu Glu Ala Pro Glu Met Thr Ser Ala Gly 305 310 315 320

Gly Leu Leu Glu Gin Ala Ala Ala Vai Glu Glu Ala Ser Asp Thr Ala 325 330 335

Ala Ala Asn Gin Leu Met Asn Asn Vai Pro Gin Ala Leu Gin Gin Leu 340 345 350

Ala Gin Pro Thr Gin Gly Thr Thr Pro Ser Ser Lys Leu Gly Gly Leu 355 360 365 132

Trp Lys Thr Vai Ser Pro His Arg Ser Pro Ile Ser Âsn Met Vai Ser 370 375 380

Met Ala Asn Asn His Met Ser Met Thr Asn Ser Gly vai Ser Met Thr 385 390 395 400

Asn Thr Leu Ser Ser Met Leu Lys Gly Phe Ala Pro Ala Ala Ala Ala 405 410 415

Gin Ala vai Gin Thr Ala Ala Gin Asn Gly Vai Arg Ala Met Sér Ser 420 425 430

Leu Gly Ser Ser Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly Vai Ala Ala 435 440 445

Asn Leu Gly Arg Ala Ala Ser Vai Gly Ser Leu Ser Vai Pro Gin Ala 450 455 460

Trp Ala Ala Ala Asn Gin Ala Vai Thr Pro Ala Ala Arg Ala Leu Pro 465 470 475 480

Leu Thr Ser Leu Thr Ser Ala Ala Glu Arg Gly Pro Gly Gin Met Leu 485 490 495

Gly Gly Leu Pro Vai Gly Gin Met Gly Ala Arg Ala Gly Gly Gly Leu 500 505 510

Ser Gly Vai Leu Arg Vai Pro Pro Arg Pro Tyr Vai Met Pro His Ser 515 520 525

Pro Ala Ala Gly Asp Ile Ala Pro Pro Ala Leu Ser Gin Asp Arg Phe 530 535 540

Ala Asp Phe Pro Ala Leu Pro Leu Asp Pro Ser Ala Met Vai Ala Gin 545 550 555 560

Vai Gly Pro Gin Vai Vai Asn Ile Asn Thr Lys Leu Gly Tyr Asn Asn 565 570 575 133

Ala Vai Gly Ala Gly Thr Gly Ile Vai Ile Asp Pro Asn Gly Vai Vai 580 585 590

Leu Thr Asn Asn His Vai Ile Ala Gly Ala Thr Asp Ile Asn Ala Phe 595 600 605

Ser Vai Gly Ser Gly Gin Thr Tyr Gly Vai Asp Vai Vai Gly Tyr Asp 610 615 620

Arg Thr Gin Asp Vai Ala Vai Leu Gin Leu Arg Gly Ala Gly Gly Leu 625 630 635 640

Pro Ser Ala Ala Ile Gly Gly Gly Vai Ala Vai Gly Glu Pro Vai Vai 645 650 655

Ala Met Gly Asn Ser Gly Gly Gin Gly Gly Thr Pro Arg Ala Vai Pro 660 665 670

Gly Arg Vai Vai Ala Leu Gly Gin Thr Vai Gin Ala Ser Asp Ser Leu 675 680 685

Thr Gly Ala Glu Glu Thr Leu Asn Gly Leu Ile Gin Phe Asp Ala Ala 690 695 700

Ile Gin Pro Gly Asp Ser Gly Gly Pro Vai Vai Asn Gly Leu Gly Gin 705 710 715 720

Vai Vai Gly Met Asn Thr Ala Ala Ser 725 <210> 3 <211> 2178 <212> ADN <213> Artificial 134 <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: variante de proteína de tri-fusão Mtb72F (Ral2-TbH9-Ra35 ou Mtb32-Mtb39) <220> <221> característica_misc <222> (4)..(9) <223> 'cat cac' em vez de 'cat cac cat cac cat cac' <220> <221> característica_misc <222> (2116) .. (2118) <223> 'gcg' em vez de 'tcg' <400> 3 atgcatcaca cggccgcgtc cgataacttc cagctgtccc agggtgggca gggattcgcc 60 attccgatcg ggcaggcgat ggcgatcgcg ggccagatcc gatcgggtgg ggggtcaccc 120 accgttcata tcgggcctac cgccttcctc ggcttgggtg ttgtcgacaa caacggcaac 1Θ0 ggcgcacgag tccaacgcgt ggtcgggagc gctccggcgg caagtctcgg catctccacc 240 ggcgacgtga tcaccgcggt cgacggcgct ccgatcaact cggccaccgc gatggcggac 300 gcgcttaacg ggcatcatcc cggtgacgtc atctcggtga cctggcaaac caagtcgggc 360 ggcacgcgta cagggaacgt gacattggcc gagggacccc cggccgaatt catggtggat 420 ttcggggcgt taccaccgga gatcaactcc gcgaggatgt acgccggccc gggttcggcc 480 135 tcgctggtgg ccgcggctca gatgtgggac 540 tcggcgtttc agtcggtggt cfcggggtcfcg 600 ggt-Gtgatgg cggcggcggc etcgccgtat 660 gccgagctga ccgccgccca ggtccgggtt 720 ctgaçggtgc cccçgccggt gatcgccgag 780 accaacctct tggggcaaaa caecccggcg 840 atgtgggccc aagaçgçcgc cgcgatgttt 900 gcgacgttgc tgeegttcgá ggaggcgccg 960

Caggccgccg eggtcgagga ggcctccgac 1020 gcgccccagg cgctgcaaca gctggcccag 1080 ctgggtggcc tgtggaagac ggtctcgccg 1140 atggccaaca accacatgtc gatgaccaac 1200 tcgatgttga agggctttgc tccggcggcg 1260 aacggggtCG gggcgatgag ctcgctgggc 1320 ggggtggcçg ccaaettggg tcgggcggcc 1380 tgggccgegg ccaaccaggc agtcaccccg 1440 accagcgccg cggaaagagg gcccgggcag agcgtggcga gtgacctgtt ttcggcegcg acggtggggt cgtggatagg ttcgtcggcg gtggcgtgga tgagcgtcac cgcggggcag gctgcggçgg ccfcacgagac ggcgtatggg aaccgtgctg aactgatgat tctgatagcg atcgcggtca acgaggccga atacggcgag ggctacgccg cggcgacggc gacggcgacg gagatgacca gcgGgggtgg gctcetcgag accgccgcgg cgaaccagtt gatgaacaat cccacgcagg gcaccacgcc ttcttccaag catcggtegc cgatcagcaa catggtgtcg tcgggtgtgt egatgaccaa caccttgagc gccgcccagg ccgtgcaaac cgcggcgcaa agctcgctgg gttcttcggg tctgggcggt tçggtçggtt cgttgtcggt gccgçaggcc gcggcgcggg cgctgccget gaccagcctg atgctgggcg ggctgceggt ggggcagatg ggcgccaggg ccggtggtgg gctcagtggt gtgctgcgtg ttccgccgcg accctatgtg 1560 atgccgcatt ctccggcagc cggcgatatc gccccgccgg ccttgtcgca ggaccggttc 1620 gccgacttcc ccgcgctgcc cctcgacccg tccgcgatgg tcgcccaagt ggggccacag 1680 gtggtcaaca tcaacaccaa actgggctac aacaacgccg tgggcgccgg gaccggcatc 1740 gtcatcgatc ccaacggtgt cgtgctgacc aacaaccacg tgatcgcggg cgccaccgac 1800 atcaatgcgt tcagcgtcgg ctccggccaa acctacggcg tcgatgtggt cgggtatgac 1860 cgcacccagg atgtcgcggt gctgcagctg cgcggtgccg gtggcctgcc gtcggcggcg 1920 atcggtggcg gcgtcgcggt tggtgagccc gtcgtcgcga tgggcaacag cggtgggcag 1980 ggcggaacgc cccgtgcggt gcctggcagg gtggtcgcgc tcggccaaac cgtgcaggcg 2040 tcggattcgc tgaccggtgc cgaagagaca ttgaacgggt tgatccagtt cgatgccgcg 2100 atccagcccg gtgatgcggg cgggcccgtc gtcaacggcc taggacaggt ggtcggtatg 2160 aacacggccg cgtcctag 2178 <210> 4 <211> 725 <212> PRT <213> Artificial 137 <220> <220> de ou <223> Descrição de Sequência Artificial: variante proteina de tri-fusão Mtb72F (Ral2-TbH9-Ra35 Mtb32-Mtb39) <220> <221> CARACTERÍ ST ICA__MI SC <222> (2)..(3) <223> "His His" em vez de "His His His His His His" <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (706)..(706) <223> "Ala" em vez de "Ser" <400> 4

Met His His Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gin Leu Ser Gin Gly Gly 15 10 15

Gin Gly Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gin Ala Met Ala Ile Ala Gly Gin 20 25 30

Ile Arg Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Vai His Ile Gly Pro Thr Ala 35 40 45

Phe Leu Gly Leu Gly Vai Vai Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Vai 50 55 60

Gin Arg Vai Vai Gly Ser Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr 65 70 75 80

Gly Asp Vai Ile Thr Ala Vai Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr 85 90 95 138

Ala Met Ala Asp Ala Leu Asn Gly His His Pro Gly Asp Vai Ile Ser 100 105 110

Vai Thr Trp Gin Thr Lys Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Vai Thr 115 120 125

Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala Glu 130 135

Phe Met Vai Asp Phe Gly Ala Leu 140

Pro Pro Glu Ile Asn Ser Ala Arg 145 150

Met Tyr Ala Gly Pro Gly Ser Ala 155 160

Ser Leu Vai Ala Ala Ala Gin Met 165

Trp Asp Ser Vai Ala Ser Asp Leu 170 175

Phe Ser Ala Ala Ser Ala Phe Gin 180

Ser Vai Vai Trp Gly Leu Thr Vai 185 190

Gly Ser Trp Ile Gly Ser Ser Ala Gly Leu Met Vai Ala Ala Ala Ser 195 200 205

Pro Tyr Vai Ala Trp Met Ser Vai Thr Ala Gly Gin Ala Glu Leu Thr 210 215 220

Ala Ala Gin Vai Arg Vai Ala Ala Ala Ala Tyr Glu Thr Ala Tyr Gly 225 230 235 240

Leu Thr Vai Pro Pro Pro Vai Ile Ala Glu Asn Arg Ala Glu Leu Met 245 250 255

Ile Leu Ile Ala Thr Asn Leu Leu Gly Gin Asn Thr Pro Ala Ile Ala 260 265 270

Vai Asn Glu Ala Glu Tyr Gly Glu Met Trp Ala Gin Asp Ala Ala Ala 275 280 285

Met Phe Gly Tyr Ala Ala Ala Thr Alã Thr Ala Thr Ala Thr Leu Leu 290 295 300 139

Pro Phe Glu Glu Ala Pro Glu Met Thr Ser Ala Gly Gly Leu Leu Glu 305 310 315 320

Gin. Ala Ala Ala Vai Glu Glu Ala Ser Asp Thr Ala Ala Ala Aen Gin 325 330 335

Leu Met Asn Asn Vai Pro Gin Ala Leu Gin Gin Leu Ala Gin Pro Thr 340 345 350

Gin Gly Thr 'Thr· Pro Ser Ser Lye Leu Gly Gly Leu Trp Lys Thr Vai 355 360 365

Ser Pro Bis Arg Ser Pro lie Ser Asn Met Vai Ser Met Ala Asn Asn 370 375 380

His Met Ser Met Thr Asn Ser Gly Vai Ser Met Thr Asn Thr Leu Ser 385 390 395 400 ser Met Leu Lys: Gly Phe' Ala Pro Ala Ala Ala Ala Gin: Ala Vai Gin 405 ........ 410 ............. 415

Thr Ala Ala Gin. Asn Gly Vai Arcf Ala Met. Ser Ser Leu Gly Ser Ser 420 " :42:5 4.3:0

Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly Vai Ala Ala Asn Leu Gly Arg 435 440 445

Ala Ala Ser Vai Gly Ser Leu Ser Vai Pro Gin Ala Trp Ala Ala Ala 450 455 460

Asn Gin Ala Vai Thr Pro Ala Ala Arg Ala Leu Pro Leu Thr Ser Leu 465 470 475 480

Thr Ser Ala Ala Glu Arg Gly Pro Gly Gin Met Leu Gly Gly Leu Pro 485 490 495

Vai Gly Gin Met Gly Ala Arg Ala Gly Gly Gly Leu Ser Gly Vai Leu 500 505 510

Arg Vai Pro Pro Arg Pro Tyr Vai Met Pro His Ser Pro Ala Ala Gly 51S 520 525 140

Asp lie Ala Pro Piro Ala Lau Ser Gin Asp Arg Phe Ala Asp Phe Pro 53:0 S3S 540

Ala Léu Pro Leu Asp Pro ser ftlà Met vai Ala Gin vai Gly Pro Gin 545 550 555 560

Vai Vai Ásn lie Asn Thr Lys Leu Gly Tyr Asn Asn Ala vai Gly Ala 56S 570 575

Gly Thr Gly lie Vai Ile Aap Pro Asn Gly Vai vai Leu Thr Asn Asn 580 585 590

His Vai Ile Ala Gly Ala Thr Asp He Asn Ala Phe Ser Vai Gly Ser 595 600 605

Gly Gin Thr Tyr Gly Vai Asp Vai Vai Gly Tyr Asp Arg Thr Gin Asp 610 615 620

Vai Ala Vai Leu Gin Leu Arg Gly Ala Gly Gly Leu Pro Ser Ala Ala 625 630 635 640

Ile Gly Gly Gly Vai Ala Vai Gly Glu Pro Vai Vai Ala Met Gly Asn 645 650 655

Ser Gly Gly Gin Gly Gly Thr Pro Arg Ala Vai Pro Gly Arg Vai Vai MÓ 665 670

Ala Leu Gly Gin Thr Vai Gin Alâ Ser Asp Ser Leu Thr Gly Ala Glu 675 680 685

Glu 7hr Leu Asn Gly Leu llé Gin Phe: ASp Ala Ala Ile Glfi Pro Gly 6:90 698 700

Asp Ala Gly Gly Pro vai vai Asn Gly Lèu Gly Gin Vai Vai Gly Met 70:5 710" 715 720:

Asn Thr Ala Ala Ser

72S 141 <210> 5 <211> 2172 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Mtb72F-IND <220> <221> característica_misc <222> (4)..(4) <223> deleção da cauda "cat cac cat cac cat cac" <400> 5 atgacggccg cgtccgataa cttccagctg tcccagggtg ggcagggatt cgccattccg 60 atcgggcagg cgatggcgat cgcgggccag atccgatcgg gtggggggtc acccaccgtt 120 catatcgggc ctaccgcctt cctcggcttg ggtgttgtcg acaacaacgg caacggcgca 180 cgagtccaac gcgtggtcgg gagcgctccg gcggcaagtc tcggcatctc caccggcgac 240 gtgatcaccg cggtcgacgg cgctccgatc aactcggcca ccgcgatggc ggacgcgctt 300 aacgggcatc atcccggtga cgtcatctcg gtgacctggc aaaccaagtc gggcggcacg 360 cgtacaggga acgtgacatt ggccgaggga cccccggccg aattcatggt ggatttcggg 420 gcgttaccac cggagatcaa ctccgcgagg atgtacgccg gcccgggttc ggcctcgctg 480 gtggccgcgg ctcagatgtg ggacagcgtg gcgagtgacc tgttttcggc cgcgtcggcg 540 tttcagtcgg tggtctgggg tctgacggtg gggtcgtgga taggttcgtc ggcgggtctg 600 142 atggtggegg cggcctcgcc gtatgtggcg 660 etgaçcgccg cccaggtccg ggttgctgcg 720 gtgcccccgc cggtgatcgc cgagaaccgt 780 ctcttggggc aaaacacccc ggcgatcgcg 840 gcccâagacg ecgeegcgaE gtctggctac 900 ttgctgccgt tcgaggaggc gecggagtatg 960 gccgcggtcg aggaggcctc cgacaccgCC 1020 caggcgctgc aacagctggc ccagcccacg 1080 ggcctgtgga agacggtctc gccgcategg 1140 aacaaccaca tgtegatgac caactcgggt 1200 ttgaagggct ttgctccggc ggcggccgcc 1260 gtccgggcga tgagctcgct gggcagctcg 1320 gccgccaact tgggtcgggc ggccteggtc 1380 gcggccaacc aggcagtcac cccggcggcg 1440 gcegcggaaa gagggcccgg gcagatgctg 1500 agggccggtg gtgggctcag tggtgtgctg 1560 cattctccgg cagccggcga tatcgccccg 1620 tggatgagcg tcaccgcggg gcaggecgag gcggcçtacg agaçggcgta tgggcEgacg gctgaactga tgattctgat agcgaccaac gtçaacgagg ccgaatacgg cgagatgtgg gccgcggcga cggcgacggc gacggcgacg accagcgcgg gtgggctcct cgagcaggcc

geggcgaaGC agttgatgaa CaatgCgCGC cagggcacca cgccttcttc caagctgggt tcgeegatGa gcaacatggt gtcgatggcc gtgtcgatga ccaacacctt gagctcgatg caggccgtgc aaaccgcggc gcaaaacggg ctgggttctt cgggtctggg cggtggggtg ggttcgttgt cggtgccgca ggcctgggcc cgggcgctgç çgctgaccag GGtgaccagc ggcgggctgc cggtggggca gatgggcgcc cgtgttccgc cgcgaçccta cgtgatgccg ccggccttgt cgcaggaccg gttcgccgae 143 ttccccgcgc tgcccctcga cccgtccgcg atggtcgccc aagtggggcc acaggtggtc 1680 aacatcaaca ccaaactggg ctacaacaac gccgtgggcg ccgggaccgg catcgtcatc 1740 gatcccaacg gtgtcgtgct gaccaacaac cacgtgatcg cgggcgccac cgacatcaat 1800 gcgttcagcg tcggctccgg ccaaacctac ggcgtcgatg tggtcgggta tgaccgcacc 1860 caggatgtcg cggtgctgca gctgcgcggt gccggtggcc tgccgtcggc ggcgatcggt 1920 ggcggcgtcg cggttggtga gcccgtcgtc gcgatgggca acagcggtgg gcagggcgga 1980 acgccccgtg cggtgcctgg cagggtggtc gcgctcggcc aaaccgtgca ggcgtcggat 2040 tcgctgaccg gtgccgaaga gacattgaac gggttgatcc agttcgatgc cgcgatccag 2100 cccggtgatt cgggcgggcc cgtcgtcaac ggcctaggac aggtggtcgg tatgaacacg 2160 gccgcgtcct ga 2172 <210> 6 <211> 723 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Mtb72F-IND <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (2)..(2) <223> deleção da cauda "His His His His His His" 144 < 4 Ο Ο > 6

Met Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gin teu Ser Gin Gly Gly Gin Gly 1 5 10 15

Phe Ala He Pro Ile Gly Gin Ala Met Ala Ile Ala Gly Gin Ile Arg 20 25 30

Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Vai His Ile Gly Pro Thr Ala Phe Leu 35 40 45

Gly Leu Gly Vai Vai Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Vai Gin Arg 50 55 60

Vai Vai Gly Ser Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly lie Ser Thr Gly Asp 65 70 75 80

Vai Ile Thr Ala Vai Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr Ala Met 85 90 95

Ala Asp Ala Leu Asn Gly His His Pro Gly Asp Vai Ile Ser Vai Thr 100 105 110

Trp Gin Thr Lys Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Vai Thr Leu Ala 115 120 125

Glu Gly Pro Pro Ala Glu Phe Met Vai Asp Phe Gly Ala Leu Pro Pro 130 135 140

Glu Ile Asn Ser Ala Arg Met Tyr Ala Gly Pro Gly Ser Ala Ser Leu 145 150 155 160

Vai Ala Ala Ala Gin Met Trp Asp Ser Vai Ala Ser Asp Leu Phe Ser 165 170 175

Ala Ala Ser Ala Phe Gin Ser Vai Vai Trp Gly Leu Thr Vai Gly Ser 180 185 190

Trp ile Gly Ser Ser Ala Gly Leu Met Vai Ala Ala Ala ser Pro Tyr 195 200 205 145

Vai Ala Trp Met Ser Vai Thr Ala Gly Gin Ala Glu Leu Thr Ala Ala 210 215 220

Gin Vai Arg Vai Ala Ala Ala Ala Tyr Glu Thr Ala Tyr Gly Leu Thr 225 230 235 240

Vai Pro Pro Pro Vai lie Ala Glu Asn Arg Ala Glu Leu Met Ile Leu 245 250 255 ile Ala Thr Asn Leu Leu Gly Gin Asn Thr Pro Ala Ile Ala vâl Asn 260 265 270

Glu Ala Glu Tyr Gly Glu Met Trp Ala Gin Asp Ala Ala Ala Met Phe 275 280 285

Gly Tyr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Thr Leu Leu Pro Phe 290 295 300

Glu Glu Ala Pro Glu Mét Thr Ser Alã Gly Gly Leu Leu Glu Gin Ala 305 310 315 320

Ala Ala Vai Glu Glu Ala Ser Asp Thr Ala Ala Ala Asn Gin Leu Met 325 330 335

Asn Asn Vai Pro Gin Ala Leu Gin Gin Leu Ala Gin Pro Thr Gin Gly 340 345 350

Thr Thr Pro Ser Ser Lys Leu Gly Gly Leu Trp Lys Thr Vai Ser Pro 355 360 365

His Arg Ser Pro Ile Ser Asn Met Vai Ser Met Ala Asn Asn His Met 370 375 380

Ser Met Thr Asn Ser Gly Vai Ser Met Thr Asn Thr Leu Ser Ser Met 385 390 395 400

Leu Lys Gly Phe Ala Pro Alà Ala Ala Ala Gin Ala Vai Gin Thr Ala 405 410 415 146

Ala Gin Asn Gly Vai Arg Ala Met Ser Ser Leu Gly Ser Ser Leu Gly 420 425 430

Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly Vai Ala Ala Asn Leu Gly Arg Ala Ala 435 440 445

Ser Vai Gly Ser Leu Ser Vai Pro Gin Ala Trp Ala Ala Ala. Asn Gin 450 455 460

Ala Vai Thr Pro Ala Ala Arg Ala Leu Pro Leu Thr Ser Leu Thr Ser 465 470 475 480

Ala Ala Glu Arg Gly Pro Gly Gin Met Leu Gly Gly Leu Pro Vai Gly 485 490 495

Gin Met Gly Ala Arg Ala Gly Gly Gly Leu Ser Gly Vai Leu Arg Vai 500 505 510

Pro Pro Arg Pro Tyr Vai Met Pro His Ser Pro Ala Ala Gly Asp Ile 515 520 525

Ala Pro Pro Ala Leu Ser Gin Asp Arg Phe Ala Asp Phe Pro Ala Leu 530 535 540

Pro Leu Asp Pro Ser Ala Met Vai Ala Gin Vai Gly Pro Gin Vai Vai 545 550 555 560

Asn Ile Asn Thr Lys Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Vai Gly Ala Gly Thr 565 570 575

Gly Ile Vai Ile Asp Pro Asn Gly Vai Vai Leu Thr Asn Asn His Vai 580 585 590

Ile Ala Gly Ala Thr Asp Ile Asn Ala Phe Ser Vai Gly Ser Gly Gin 595 600 605

Thr Tyr Gly Vai Asp Vai Vai Gly Tyr Asp Arg Thr Gin Asp Vai Ala 610 615 620 147 vai Leu Gin Leu Arg Gly Ala Gly Gly Leu Pro Ser Ala Ala lie Gly 625 630 635 640

Gly Gly Vai Ala Vai Gly Glu Pro Vai Vai Ala Met Gly Asn Ser Gly 645 650 655

Gly Gin Gly Gly Thr Pro Arg Ala Vai Pro Gly Arg Vai Vai Ala Leu 660 665 670

Gly Gin Thr Vai Gin Ala Ser Aap Ser Leu Thr Gly Ala Glu Glu Thr 675 680 685

Leu Asn Gly Leu Ile Gin Phe Asp Ala Ala Ile Gin Pro Gly Asp Ser 690 695 700

Gly Gly Pro Vai Vai Asn Gly Leu Gly Gin Vai Vai Gly Met Asn Thr 705 710 715 720

Ala Ala Ser

Lisboa, 17 de Abril de 2012 148

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica compreendendo uma proteína de fusão Mtb72f ou um seu fragmento imunogénico, de uma espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose e um adjuvante, para utilização na prevenção ou retardamento da reactivação num mamífero tendo uma infecção latente por Mycobacterium tuberculosis.
2. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que o mamífero está infectado com uma estirpe de M. tuberculosis multirresistente a fármacos.
3. Composição farmacêutica da reivindicação 1 ou 2, em que o mamífero foi anteriormente imunizado com o Bacillus de Calmette-Guerin (BCG).
4. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a proteína de fusão Mtb72f é de Mycobacterium tuberculosis.
5. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a proteína de fusão Mtb72f é um polipéptido compreendendo os resíduos 8-729 da SEQ ID N° 2.
6. Composição farmacêutica da reivindicação 5, em que a proteína de fusão Mtb72f é um polipéptido consistindo nos resíduos 1 e 8-729 da SEQ ID N° 2, opcionalmente com uma cauda His inserida a seguir ao resíduo Met inicial. 1
7. Composição farmacêutica da reivindicação 5, em que a proteína de fusão Mtb72f é o polipéptido da SEQ ID N° 2.
8. Composição farmacêutica da reivindicação 5, em que a proteína de fusão Mtb72f é o polipéptido da SEQ ID N° 6.
9. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a proteína de fusão Mtb72f é um polipéptido compreendendo os resíduos 4-725 da SEQ ID N° 4.
10. Composição farmacêutica da reivindicação 9, em que a proteína de fusão Mtb72f é um polipéptido consistindo nos resíduos 1 e 4-725 da SEQ ID N° 4, opcionalmente com uma cauda His inserida a seguir ao resíduo Met inicial.
11. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o mamífero é um humano.
12. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o adjuvante é seleccionado do grupo consistindo em 3D-MPL e QS21 numa formulação lipossomal e 3D-MPL e QS21 e uma emulsão de óleo em água.
13. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, para utilização em conjunto com um ou mais agentes quimioterapêuticos eficazes no tratamento de uma infecção por M. tuberculosis.
14. Composição farmacêutica da reivindicação 13, em que os um ou mais agentes quimioterapêuticos são seleccionados de isoniazida e rifampina. 2 15. Composição farmacêutica da reivindicação 13, em que, primeiramente, são administrados ao mamífero os um ou mais agentes quimioterapêuticos ao longo de um período de tempo e, depois, é administrada a composição.
16. Composição farmacêutica da reivindicação 13, em que, primeiramente, é administrada ao mamífero a composição e, depois, são administrados os um ou mais agentes quimioterapêuticos ao longo de um período de tempo.
17. Composição farmacêutica da reivindicação 13, em que a administração dos um ou mais agentes quimioterapêuticos e da composição é iniciada ao mesmo tempo.
18. Composição farmacêutica compreendendo um ácido nucleico codificando uma proteína de fusão Mtb72f ou um seu fragmento imunogénico, de uma espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose, para utilização na prevenção ou retardamento da reactivação num mamífero tendo uma infecção latente por Mycobacterium tuberculosis. 19 . 20 . Composição farmacêutica da reivindicação 18, em que o ácido nucleico é a SEQ ID N° 1. Composição farmacêutica da reivindicação 18, em que o ácido nucleico compreende os nucleótidos 63-2222 da SEQ ID N° 1. Composição farmacêutica da reivindicação 18, em que o ácido nucleico compreende os nucleótidos 10-2175 da SEQ ID N° 3. 3 21. 22. Composição farmacêutica da reivindicação 18, em que o ácido nucleico compreende um nucleótido codificando um polipéptido compreendendo os resíduos 4-725 da SEQ ID N° 4.
23. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 18 a 22, em que o ácido nucleico é proporcionado num vector de adenovírus.
24. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 18 a 22, em que o ácido nucleico é proporcionado num vector de célula hospedeira mutante de Mycobacterium ou Bacillus. Lisboa, 17 de Abril de 2012 4