NO20023753L - 2-fenylkarbamoyl-benzimidazoler - Google Patents

Description

Kryssreferanse til beslektet søknad

Foreliggende oppfinnelse krever prioritet fra US Provisional Application Serial No. 60/181,234, 7945P, inn-levert 9. februar 2000.

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører 2-fenyl-karbamoylbenz-imidazoler som er nyttige ved behandling eller forebygging av iskemisk reperfusjonsskade av myokardiale eller andre vev eller andre kardiovaskulære og inflammatoriske sykdom-mer og forstyrrelser.

Sammendra<g>av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse inkluderer forbindelser med den generelle struktur:

hvori:

(a) RI er valgt fra alkyl, aryl, alkoksy og aryloksy; (b) R3 og R4 er uavhengig valgt fra hydrogen, halo, cyano, alkyl, alkoksy, alkyltio og mono- eller dialkylamino, bortsett fra at R3 og R4 ikke begge er hydrogen (c) hver R5 er uavhengig valgt hydrogen, halo, cyano, alkyl, hydroksy, alkoksy, tio, alkyltio, amino og mono- eller dialkylamino; (d) hver R6 er uavhengig valgt fra hydrogen, halo,

nitro, cyano, alkyl, aryl, heterocyklyl, hydroksy, alkoksy, aryloksy, tio, alkyltio, aryltio, amino, alkylamino, arylamino, acyl, alkylacyl, arylacyl, amido, alkylamido, arylamido, sulfonyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, fosfonyl, alkylfosfonyl, arylfosfonyl, karboksy og dens alkyl- og arylestere;

en optisk isomer, diastereomer eller enantiomer eller blanding derav, et farmasøytisk akseptabelt salt, hydrat eller biohydrolyserbar ester, amid eller imid derav; farmasøy-tiske blandinger som inneholder slike forbindelser, samt fremgangsmåter for anvendelse av slike forbindelser for å behandle eller forhindre reperfusjonsskader av vev.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Det er ca. 1,1 million myokardiale infarkter i USA hvert år og 350.000 mennesker dør. Myokardial infarkt (MI) eller hjerteattakk forekommer når blodkar som tilfører blod til hjertet blir fullstendig eller delvis okkludert. Behandling med trombolytiske midler for å gjenopprette blodstrømmen (reperfusjon) er den første behandling i mange tilfeller. Fordelen ved reperfusjon er imidlertid ledsaget av den akutte inflammatoriske responsen assosiert med den, hvilket fører til et syndrom kalt reperfusjonsskade.

Inflammasjonen tjener generelt som en beskyttende rolle. For eksempel vil posisjoner for bakteriell infeksjon, bak-terielle endotoksiner indusere produksjon av inflammatoriske cytokiner som tiltrekker sirkulerende leukocytter, inkludert nøytrofiler og monocytter for å ødelegge bakteri-ene. Straks infeksjonen er stoppet vil inflammasjonen avta. Det finnes imidlertid betingelser hvor det inflammatoriske signal opprettholdes (reumatoid artritt) eller det er unød-vendig alvorlig (iskemi-reperfusjonsskade).

Et vesentlig trekk ved inflammasjon er migrering av nevrofiler (PMNer) fra blod inn i vev. Denne migrering er forut-gående for en kaskade av hendelser forårsaket av adhesjons-molekyler. Vedhefting av PMNer til vaskulære endotelia celler krever samvirkning av adhesjonsmolekylene og overflaten av begge celletyper. Disse molekyler tilhører tre distinkte familier: seleksjons-, integins- og immunoglobulinsuper-familien. Nevrofiler vil først "rulle" langs endoteliacellene, en prosess forårsaket av selektiner. Ved inflamma-sjonsstedene vil kraftig vedhefting forårsakes av samvirkning av 02 integriner på PMNer og ICAM-1 (intercellulært adhesjonsmolekyl-1) uttrykt på endoteliacellene. Endelig vil transendotelial migrering av PMNer inn i vevene føre til vevsødeleggelse. Forbindelser som er i stand til å blokkere vedhefting av nøytrofile til endotelium vil være nyttige ved behandling av et antall tilstander som inkluderer iskemi-reperfusjonsskade inkludert, men nødvendigvis ikke begrenset til myokardinfarkt, kransarterie bypass poding, angioplastikk, angina, slag, perifer vaskulær syk-dom, inflammatorisk buksykdom, ulcerøs kolitt, forbren-ninger, frostskader, pustestressyndrom hos voksne, astma, vev og organtransplantasjoner, generell kirurgi, replan-tasjon, akutt renalfeil, revmatoid artritt, psoriasis, hepatitt, pankreatitt, solforbrenning, stråling, svulst og sjokk. (For nye oversikter se: C.Cornejo, J. Harlan, R. Winn, in Adhesion Molecules in Health & Disease, L. Paul. and T. Issekutz, Eds., Marcel Dekker, 1997, kapittel 18; J. Prince, C. Ballantyne, Emerging Therapeutic Targets, 1999, 263-277.)

Ordliste over betegnelser

Hvis ikke annet er angitt, har de etterfølgende betegnelser den indikerte betydning anvendt i foreliggende beskrivelse. Betegnelsen "alkyl" betyr en hydrokarbonkjede som er lineær, forgrenet eller syklisk, mettet eller umettet (en ikke aromatisk), substituert eller usubstituert. Betegnelsen kan anvendes alene eller som en del av et annet ord hvor den kan være forkortet til "alk" (for eksempel alkoksy, alkylamino). Foretrukket lineær alkyl har 1-20 karbonatomer, mer foretrukket 1-8 karbonatomer og mest foretrukket 1-4 karbonatomer og aller mest foretrukket er metyl eller etyl. Foretrukket syklisk og forgrenet alkyl har 3-20 karbonatomer, mer foretrukket 3-10 karbonatomer og mest foretrukket 3-6 karbonatomer. Foretrukket syklisk alkyl har en hydrokarbonring, men kan ha to, tre eller flere sammen-smeltede eller spirosykliske hydrokarbonringer. Alkyl kan være umettet kun med en eller flere dobbeltbindinger ("al-kenyl")(ingen trippelbindinger), fortrinnsvis med en, to eller tre dobbeltbindinger, mer foretrukket med en dobbelt-binding. Alkyl kan være umettet med en eller flere trippelbindinger ("alkynyl"), fortrinnsvis med en trippelbinding. Mer foretrukket er mettet ("alkanyl"). Betegnelsen "alky-len" betyr en alkyl som er knyttet til 2 eller flere grupper. Fortrukne substituenter på alkyl inkluderer alkyl, aryl, halo, hydroksy, alkoksy, aryloksy, amino, alkylamino, arylamino, tio, alkyltio, aryltio, acyl, alkylacyl, arylacyl, karboksy, alkylester, arylester, amino, alkylamino, arylamino, sulfonyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, nitro, cyano, heterocykel. Foretrukket alkyl er usubstituert.

Betegnelsen "aryl" betyr en aromatisk hydrokarbonring som er substituert eller usubstituert. Betegnelsen kan anvendes, alene eller som en del av et annet ord (aryloksy, arylamino) . Foretrukket aryl har 6-14 karbonatomer i den aromatiske ring eller ringer, og totalt 6-20, fortrinnsvis ca. 12 karbonatomer. Foretrukket aryl er fenyl eller naftyl, mest foretrukket er fenyl. Betegnelsen "arylen" betyr aryl som er knyttet til to eller flere grupper. Foretrukne substituenter på aryl inkluderer alkyl, aryl, halo, hydroksy, alkoksy, aryloksy, amino, alkylamino, arylamino,

tio, alkyltio, aryltio, acyl, alkylacyl, arylacyl, kar-

boksy, alkylester, arylester, amino, alkylamino, arylamino, sulfonyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, nitro, cyano, heterocykel. Mer foretrukket aryl er usubstituert.

Betegnelsen "heteroatom" betyr et nitrogen, oksygen eller svovelatom.

Betegnelsen "heterocykel" eller "heterocyklyl" betyr en cyklisk alkyl eller aryl hvor en eller flere karbonatomer er erstattet med heteroatomer i ringen eller ringene, fortrinnsvis en, to eller tre heteroatomer i ringen eller ringene. Foretrukne heterocykliske substituenter er de samme som for alkyl. Betegnelsen "heteroaryl" henviser til en undergruppe av heterocykliske forbindelser som omfatter en aromatisk ring. Foretrukket heteroaryl har 5-14, mer foretrukket 10 og mest foretrukket 5 eller 6 karbon pluss heteroatomer i ringen(e) og totalt 5-20, mer foretrukket ca. 12 karbon pluss heteroatomer.

Betegnelsen "sikker og effektiv mengde" betyr en mengde av en farmakologisk aktiv forbindelse tilstrekkelig til i det vesentlige å indusere en positiv modifikasjon av tilstanden som skal behandles, men tilstrekkelig lav til å unngå al-vorlige bivirkninger (et rimelig fordel-/risikoforhold) innen omfanget av sunn medisinsk vurdering. En sikker og effektiv mengde av en forbindelse vil variere med den spesielle tilstand som behandles, størrelse og alder og fysisk tilstand for pasienten, tilstandens alvorlighet, behand-lingens varighet, type av samtidig terapi, den anvendte spesielle farmasøytisk akseptable bærer, samt lignende fak-torer bestemt av den behandlende lege ut fra dennes kunn-skap og ekspertise.

Betegnelsen "farmasøytisk akseptabel bærer" eller "farma-søytisk akseptable eksipienter" betyr en eller flere foren-lige faststoffer eller væskeeksipienter som er egnet for administrasjon til mennesker og lavere dyr. Betegnelsen "forenlig"betyr at eksipientene er i stand til å blandes med den farmakoligsk aktive forbindelse eller forbindelser og med hverandre, på en måte slik at det ikke er noen samvirkning som i det vesentlige nedsetter den farmasøytiske effekt av blandingen under vanlige anvendelsessituasjoner.Eksipientene har i seg selv ingen vesentlig farmakologisk aktivitet, men kan for eksempel fungere som fortynningsmid-ler, smøremidler, desintegreringsforsterkere, oppløsnings-forsterkere, inkapsuleringsmaterialer, preserveringsmidler, fargestoffer, smaksstoffer og lignende. Farmasøytisk akseptable eksipienter må være av tilstrekkelig høy renhet og tilstrekkelig lav toksisitet for å gjøre dem egnet for administrasjon til mennesker og lavere dyr som behandles.

Betegnelsen "enhetsdoseform" betyr at blandingen omfatter en mengde av en farmakologisk aktiv forbindelse som er egnet for administrasjon til et menneske eller et lavere dyr i en enkel doseform, i henhold til god medisinsk praksis.

En "biohydrolyserbar ester"er en ester av en karboksylsy-reinnholdende 2-karboksyamid benzimidazol ifølge foreliggende oppfinnelse som ikke innvirker på aktiviteten av 2-karboksyamid benzimidazolene eller som lett omdannes i et dyr for å gi en aktiv 2-karboksyamid benzimidazol ifølge oppfinnelsen. Slike estere inkluderer lavere alkylestere, lavere cykloalkylestere (slik som acetoksymetyl-, acetoksy-etyl-, aminokarbonyloksymetyl-, pivaloyloksymetyl- og piva-loyloksyetylestere), laktonylestere (slik som ftalidyl- og tioftalidylestere).

Forbindelsene

Foreliggende oppfinnelse inkluderer 2-fenyl-karbamoyl-benzimidazolforbindelser med strukturen:

I formel (I) er Ri valgt gruppen som består av fra alkyl, aryl, alkoksy og aryloksy. Alkyl- og aryldelene i foretrukne Rl-grupper inneholder 1-14 karbonatomer.

Mer foretrukket er RI valgt fra usubstituerte eller substituert alkyl med 1-12 karbonatomer og usubstituert eller substituert fenyl eller naftyl. Mer foretrukket alkyl RI inkluderer usubstituert eller substituert lineær alkyl med 2- 8 karbonatomer, mer foretrukket 3-6 karbonatomer og ytterligere med foretrukket er n-propyl eller n-butyl eller n-pentyl. Mer foretrukket inkluderer RI forgrenet alkyl med 3- 8 karbonatomer, mer foretrukket 3-6 karbonatomer og ytterligere mer foretrukket er isometyl eller isopentyl. Mer foretrukket RI inkluderer cyklisk alkyl med 3-8 karbonatomer, mer foretrukket 3-6 karbonatomer. Foretrukne substituenter for slik lineær, forgrenet eller cyklisk alkyl inkluderer halo, hydroksy, alkoksy, amino, mono- og dialkylamino, tio, alkyltio, aryl (spesielt fenyl) og heterocykel; mer foretrukket er slik alkyl usubstituert. Foretrukket RI som er lineær, forgrenet eller cyklisk alkyl, er mettet eller umettet med en eller flere dobbeltbindinger, mer foretrukket er mettet.

Mer foretrukket aryl RI inkluderer substituert eller usubstituert fenyl. Foretrukne substituenter for slik fenyl inkluderer halo, hydroksy, alkoksy, amino, mono- og dialkyamino, også foretrukket for slik fenyl er at den er usubstituert.

Mer foretrukket aralkyl RI inkluderer substituert eller usubstituert fenyl. Foretrukne substituenter for slik ben zyl inkluderer halo, hydroksy, alkoksy, amino, mono- og dialkylamino, også foretrukket for slik benzyl er at den er umettet.

I formelen (I) er R3 og R4 uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halo, alkyl, alkoksy, alkyltio og mono- eller dialkylamino, bortsett fra at R3 og R4 ikke begge er hydrogen. Alkyldelene av foretrukket R3 og R4 grupper kan ha 1-8 karbonatomer.

Foretrukket R3 og R4 inkluderer hydrogen, alkoksy med 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer, alkyltio med 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer, monoal-kylamino eller dialkylamino hvor hver alkyl har 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer og alkyl med 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer. Foretrukne substituenter på alkyl av slike grupper inkluderer halo, hydroksy, alkoksy, amino, mono- eller dialkylamino, tio, alkyltio, mer foretrukket er det for slik R3 og R4grupper at de er usubstituerte. Ytterlige mer foretrukket er minst en av R3 og R4 etoksy og spesielt metoksy. Fortrinnsvis er en av R3 og R4 hydrogen, mer foretrukket er R3 hydrogen.

I formelen (I) angir R5-grupper i posisjonene 4 og 7 av benzimidazolringene. Hver R5 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halo, cyano, alkyl, hydroksy, alkoksy, tio, alkyltio, amino og mono- eller dialkylamino. Alkyldelene i foretrukne R5-grupper inneholder 1-8 karbonatomer .

Foretrukket R5 inkluderer hydrogen, halo, alkyl med 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer, alkoksy med 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer, monoalkyl-eller dialkylamino hvor hver alkyl inneholder 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer og alkyltio med 1-6, fortrinnsvis opp til 3 karbonatomer. Foretrukne substituenter for alkyl i slikeR5 grupper inkluderer alkoksy, amino og alkyl, mer foretrukket er det at alkyl i slike grupper er ikke-substituerte.

Mer foretrukket er det at hver R5 er uavhengig valgt fra hydrogen, halo og usubstituert alkyl med 1-3 karbonatomer. Mer foretrukket er det at ikke flere enn en R5 er hydrogen. Mest foretrukket er begge R5 hydrogen.

I formel (I) er hver R6 uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halo, nitro, cyano, alkylaryl, heterocyklyl, hydroksy, alkoksy, aryloksy, tio, alkyltio, aryltio, amino, alkylamino, arylamino, acyl, alkylacyl, arylacyl, amido, alkylamido, arylamido, sulfonyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, fosfonyl, alkylfosfonyl, arylfosfonyl, karboksy og dens alkyl- og arylestere. Foretrukket er hver R6 valgt fra hydrogen, halo, nitro, omkring Ci-C4alkyl, fenyl, hydroksy, omkring Ci-C4alkoksy, tio, omkring C1.-C4alkyltio, amino, omkring C1-C4mono- eller dialkylamino. Mer foretrukket er hverR6 valgt fra hydrogen, fluor, klor, nitro, metyl, etyl, trifluormetyl, hydroksy, metoksy, etoksy, trifluormetoksy. Foretrukket er ikke mer enn tre, mer foretrukket ikke mer enn to, enda mer foretrukket ikke mer enn enR6 annet enn hydrogen.

Foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen inkluderer føl-gende eksempler med strukturen (I) og med de indikerte substituenter:

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen inkluderer alle aktive op-tiske isomerer, diastereomerer og enantiomerer og blandinger derav av de ovennevnte forbindelser. Forbindelsen ifølge oppfinnelsen inkluderer også farmasøytisk akseptable salter, hydrater og biohydrolyserbare estere, amider og imider av slike forbindelser.

Fremstilling av forbindelsene

I det følgende gis generelle skjemaer for fremstilling av foreliggende forbindelser og spesielle fremgangsmåter for fremstilling av foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen. Hvis ikke noe annet er angitt er alle kommersielt til-gjenglige reaktanter anvendt uten ytterligere rensing. Re-aksjonene blir generelt utført under en inert atmosfære (argon eller nitrogen). Saltlake henviser til mettet vandig natriumklorid. Restoppløsningsmiddel fjernes under vakuum (ca. 0,03 mm hg) ved romtemperatur (rt).

Strukturene for forbindelsene fremstilt er underbygget under anvendelse av de følgende analytiske redskaper. Proton NMR spektra ble tatt med et "GE QE-300" (300 MHz) spektro meter, et "Bruker AC-300" (300 MHz) kvad-kjernesondesystem eller mer en "Varian Unityplus" (3 00 MHz). Alle kjemiske skift er rapportert i liten 6-skala som ppm, nedfelt fra (CH3)4Si. Spektra opptatt med CDC13er betegnet enten som (CH3)4Si eller som rest-CHCl3(7,24 ppm). Spektra opptatt i D20 er referert som HOD (4,80 ppm), de som er opptatt i (CH3)2CO er betegnet som rest (CH3)2CO (2,04 ppm), de i CD3OD er referert som rest CH3OH (3,30 ppm) og de i (CD3)2SO er referert til rest (CH3)2SO (2,49 ppm). Karbon-13 spektra blir tatt opp med "GE QE-300" (75 MHz) spektrometer eller "Bruker AC-300" (75 MHz) kvad-kjernesondesystem. Spektra tatt i CDD13er referert til oppløsningsmiddel (78 ppm), de i CD3OD er referert til oppløsningsmiddel (49 ppm), de i (CD3)2SO er referert til oppløsningsmiddel (39,7 ppm) og de i (CD3)2CO er referert til oppløsningsmiddel (206,5, 29,8 ppm). Massespektra blir bestemt på "Fision's Trio 2000" forsynt med en robotsonde eller en "Fison's Platform II Mass Spectrometer". Kjemiske ioniseringsspektra ble erholdt under anvendelse av metan og/eller ammoniakk som reaktant-gass. ESI forbindelsesinnføring skjedde via "Hewlett Pack-ard 1050 HPLC" autoprøvetaker under anvendelse av metanol, 0,2% maursyre og 0,2 mM ammoniumacetat som elueringsoppløs-ningsmiddel. Tynnsjiktskromatografi blir utført på silikagel 60-F254 forbelagte plater. Flash kromatografi blir ut-ført under anvendelse av silikagel 60 (Merck, 230-400 mesh). Smeltepunktet ble erholdt med en "Electrothermal 1A9200" eller et "MelTemp II" kapilærsmeltepunktsapparat og er ukorrigerte.

Skjema I er et generelt skjema nyttig for fremstilling av mange forbindelser ifølge oppfinnelsen:

a: NaN02, propionsyre; b: HN03; c: Tf20/Et3N, toluen; d: Rl-NH2; e: HCOOH, 10% Pd/C; f: n-BuLi, THF, R6-PhNCO.

5-Metoksy-2-nitrofenol (B fra skjema I med R4 = metoksy og R3 og begge R5 = H): Til en 2 1 rundbunnet flaske, forsynt med mekanisk rører og fylletrakt ble propionsyre (3 00 ml) og 3-metoksyfenol (37,2 g, 0,3 mol) tilsatt. Den resulterende blanding ble avkjølt til 0°C og en oppløsning av natriumnitritt (21 g, 0,304 mol) i vann (50 ml) ble langsomt tilsatt. Etter omrøring i 1 time ved 0°C ble rykende salpetersyre (40 ml) langsomt tilsatt. Den resulterende oppslemming ble omrørt ved 0°C i en time og deretter oppvarmet til romtemperatur i løpet av 2 timer. Vann (250 ml) ble tilsatt dråpevis ved romtemperatur og det resulterende faststoff ble filtrert og vasket med 300 ml 50% vandig propionsyre for å gi, etter tørking, 5-metoksy-2-nitrofenol som et lysebrunt faststoff.

N-Alkyl-5-metoksy-2-nitroanilin (C fra skjema I med RI = alkyl, R4= metoksy og R3 og begge R5 = H). Til en 1 1 rundbunnet flaske ble toluen (300 ml), 5-metoksy-2-nitro-fenol (5,0 g, 0,03 mol) og trietylamin (6,68 g, 0,066 mol) tilsatt. Den resulterende oppløsning ble avkjølt til 0°C og trifluormetansulfonsyre anhydrid (Tf20) ble langsomt tilsatt via en pipette (9,3 g, 0,033 mol) . Reaksjonsblåndingen ble omrørt ved 0°C i 5 min., aminet (R1-NH2) (0,12 mol) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til refluks i 5,5 timer. Etter avkjøling til romtemperatur ble reaksjons-innholdet filtrert gjennom en plugg silikagel (eluert med 90:10 heksan:etylacetat) og konsentrert via en roterende inndamper for å gi rå N-alkyl-5-metoksy-2-nitroanilin. Materialet ble anvendt i det neste syntesetrinn.

Nl-Alkyl-6-metoksybenzimidazol (D fra skjema I med RI = alkyl, R4 = metoksy og R3 og begge R5 = H): Til en 250 ml rundbunnet flaske ble det tilsatt 88% maursyre (50 ml) og N-alkyl-5-metoksy-2-nitroanilin (0,02 mol). Til denne homo-gene blanding ble det tilsatt en etylacetatoppslemming av 10% Pd-C (600 mg). Den resulterende heterogene reaksjons-blanding ble oppvarmet til 100°C i 1 time, avkjølt til romtemperatur og filtrert gjennom "Celite" (eluert med vann). Filtratet ble gjort basisk ved tilsetting av 28% NH4OH opp-løsning og deretter vasket med etylacetat (3 x 100 ml). De kombinerte organiske faser ble tørket (MgS04) , filtrert og konsentrert via en roterende inndamper til å gi en rest. Resten ble kromatografert (Si02, 50:50 heksan:etylacetat) til å gi Nl-alkyl-6-metoksybenzimidazol.

Alkyl 6-metoksy-N-(R6-Ph)benzimidazol-2-karboksamider (E fra skjema I med RI = alkyl, R4= metoksy og R3 og beggeR5= H): til en 50 ml rundbunnet flaske under Ar ble det tilsatt l-alkyl-6-metoksybenzimidazol (1,0 ekvivalent, 0,98 mmol) og vandig THF (10 ml). Løsningen ble kjølt til -78°C, n-butyl litium (1,4 ekvivalent, 1,3 7 mmol) ble tilsatt dråpevis og den resulterende blanding ble omrørt ved -78°C i 10 minutter, deretter varmet til romtemperatur og omrørt i enda 15 minutter. Mettet natriumbikarbonat ble deretter tilsatt (20 ml) etterfulgt av tilsetting av vann (20 ml). Den resulterende blanding ble ekstrahert med etylacetat (3 x 50 ml). Det kombinert ble vasket med saltlake (1 x 100 ml) , tørket (MgS04) , filtrert og konsentrert for å gi rå benzamid. Residuet ble deretter kromatografert (hek-san -.etylacetat) for å gi ren N-l-alkyl-6-metoksybenzimida-zol-2-banzamid.

Skjema II er et annet generelt skjema nyttig fremstilling av mange forbindelser ifølge oppfinnelsen.

h: (CH20)n, KCN, HOAc, ZnCl2; j: EtOH, KOH; k: R2-OH, DEAD, Ph3P, THF; m: ArOH, H+; eller ArNH2H20, H2Ru(PPh3)4.

Skjema III er enda et generelt skjema nyttig fremstilling av mange forbindelser ifølge oppfinnelsen:

n: PhCHO, HN03, H2S04; p: (Boc)2CO, CH2Cl2; q: R1-NH2/CH3CN; r: 10% Pd/C, EtOH; s: (CHO-COOEt)n/toluen, I2/EtOH; t: CF3COOH, CH2C12; u: Ar-NH2.

Skjema IV er enda et generelt skjema nyttig fremstilling av mange forbindelser ifølge oppfinnelsen:

v: R6-C0C1, CH2C12; W: B2H6, THF; X: 10% Pd/C, EtOH; y:

(CHO-COOEt)n, I2/EtOH,2: NH2-Ar.

Komposisj oner

Foreliggende oppfinnelse inkluderer farmasøytiske sammensetninger som omfatter en sikker og effektiv mengde på en

2-fenyl-karbamoylbenzimidazolforbindelse beskrevet over og farmasøytiske akseptable eksipienter. Sammensetningene kan også eventuelt inkludere andre farmakologisk aktive forbindelser, spesielt de med aktivitet som trombolytiker (for eksempel abciksimab, reteplase) streptokinase eller vevsplasminogenaktivatorer (for eksempel streptokinase), antikoagulenter (for eksempel heparing, aspirin), beta-blokkere (for eksempel karvedilol, propanalol), kalsium-aknalblokkere (for eksempel verapamil, nifedipin).

Noen eksempler av farmasøytisk akseptable bærere eller kom-ponenter derav er sukker, slik som laktose, glukose og sukrose; stivelser, slik som maisstivelse og potetstivelse; cellulose og dens derivater, slik som natriumkarboksymetyl-cellulose, etylcellulose, celluloseacetat; finmalt tragant; malt, gelatin, talkum, faste smøremidler, slik som stearin-syre, magnesiumstearat eller kalsiumsulfat; vegetabilske oljer, slik som peanøttolje, bomullsfrøolje, sesamolje, olivenolje, maisolje og olje fra teobrom; polyoler slik som propylénglykol, glyserin, sorbitol, mannitol og polyetylen-glykol; alginsyre; emulgeringsmidler, slik som Tweens<®>;vætende midler slik som natriumlaurylsulfat; fargemidler; smakstilsetningsmidler; eksipineter; tabletthjelpemider; stabilisatorer; antioksidanter; konserveringsmidler; pyro-genfritt vann, isotonisk salt og fosfatbufferløsninger.

Valget av en farmasøytisk akseptabel bærer for anvendelse sammen med en forbindelser blir egentlig bestemt ved måten forbindelsen skal administreres på. Forbindelsene og sammensetningene av foreliggende oppfinnelse kan administreres systematisk. Administrasjonsruter inkluderer topisk eller transdermal (plaster, salve, krem, pulver, etc.) , oral, parenteral, inkludert subkutant, intramuskulært eller intravenøs injeksjon, topisk, rektal, kolonisk, intraperitoneal, intraokkulær, sublingval, bukal, inhalasjon og/eller intranasal. Den foretrukne ådministrasjonsrute er parenteral, spesielt intravenøs injeksjon på en daglig eller nødvendig basis.

Den passende mengde av forbindelsen som skal anvendes kan bestemmes ved rutineeksperimentering med dyremodeller. Slike modeller inkluderer, men er ikke begrenset til frett, kanin og ikke-humane primatmodeller. Generelt blir en mengde mellom 0,01 ug/kg til 100 mg/kg kroppsvekt per dag administrert avhengig av forbindelsen eller sammensetningene som er anvendt sitt potensial.

Foretrukket enhetsdoseform for injeksjon inkluderer sterile vannløsninger, fysiologisk salt eller blandinger derav. Parenterale enhetsdoseformsammesetninger kan være i form av løsninger klare for injisering eller tørre (for eksempel lyofiliserte) sammensetninger som er rekondisjonert med vann eller saltløsning før injeksjon. Løsningenes pH bør justeres til omkring 7,4. Passende bærere for injeksjon eller kirurgiske implantater inkluderer hydrogeler, kontrol-lerte eller uavbrutte løseanordninger, polyeddiksyre og kollagenmatriser. Andre passende bærere for injeksjon inkluderer dekstrose, mannitol, laktose, lecitin, albumin, natriumglutamat og lignende.

Sammensetninger av foreliggende oppfinnelse er foretrukket tilveiebrakt i enhetsdoseformer. En enhetsdoseformsammen-setning inneholder foretrukket fra omkring 50 mg, mer foretrukket fra omkring 200 mg, også foretrukket fra omkring 500 mg, foretrukket til omkring 2000 mg, mer foretrukket til omkring 1000 mg, også foretrukket til omkring 500 mg av en 2-fenylkarbamoyl benzimidazolforbindelse beskrevet over.

Foreliggende sammensetninger kan være i et mangfold av passende former (for eksempel) for peroral, topisk eller

parenteral administrasjon. Avhengig av den spesielt ønskede administrasjonsrute kan et mangfold av farmasøytisk akseptable bærere som er velkjente i teknikken anvendes. Disse inkluderer faste eller flytende fyllstoffer, fortynnings-midler, hydrotoper, overflateaktive midler og innkapslings-substanser. Mengden av bærerkomponenter som er anvendt sammen med den aktive forbindelse er tilstrekkelig til å til-veiebringe en praktisk mengde av materialet for administrasjon per enhetsdose av den aktive forbindelse. Teknikker og sammensetninger for fremstilling av enhetsdoseformer i henhold til oppfinnelsen er beskrevet i følgende referanser: Modem Pharmaceutics, volum 7, kap. 9 og 10, Banker and Rhodes, editors, 1979; Lieberman et al., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, 1981 ogAnsel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 2. utgave, 1976.

Som indikert over er foretrukket doseringsform av foreliggende oppfinnelse tiltenkt parenteral administrasjon. Foretrukket farmasøytisk akseptable bærere for slike sammenset ninger inkluderer steril, pyrogenfri vann og fysiologisk saltløsninger. Parenterale enhetsdoseformsammensetninger kan være i form av løsninger klare for injisering eller tørre (for eksempel lyofiliserte) sammensetninger som er rekondisjonert med vann eller saltløsning før injeksjon.

Foretrukne sammensetninger av foreliggende oppfinnelse inkluderer de som er tiltenkt peroral administrasjon, slik som

tabletter, kapsler, pulvere og væsker. Passende farmasøy-tiske akseptable eksipienter for slike sammensetninger inkluderer sukker, stivelser, cellulose og dets derivater, malt, gelatin, talkum, kalsiumsulfat, vegetabilske oljer, syntetiske oljer, polyoler, algesyre, fosfatbuffere, emul-gatorer, alkoholer og vann.

Metode for anvendelse av forbindelsene

2-fenyl-karbamoylbenzimidazolforbindelsene av foreliggende oppfinnelse kan anvendes ved behandling av iskemi-reperfusjonsskade. Selv om de ikke begrenset til noen spesifikk mekanisme, tror man at forbindelsene virker via modulasjon av adhesjonsmolekylmetabolisme. Forbindelsene er derfor muligens anvendbare for behandling av iskemi-reperfusjonsskade som inkluderer: kardiovaskulær lidelse (myokardial iskemi, angina, hjertearytmi, hjertefeil, hypertensjon); for behandling for å redusere nevrotisk skade assosiert med anoksia eller iskemi som typisk kommer etter slag, hjerte-stans eller perinatal kvelning, for behandling for å redusere reperfusjonsskade etter organtransplantasjon, for behandling av forfrysning, inflammatorisk hjerteklaffsykdom, psoriasis, astma, pustevanskesyndrom hos voksne, for behandling av kronisk inflammatorisk lungesykdom inkludert emfysem, bronkitt og for behandling av fibrose, urtikaria, angioedema, vaskulitis, migarin, revmatoid artritt, gikt og allergi.

Det er kjent at et mangfold av prosesser er involvert i re-perf us jonsskade, inflammasjon og relaterte prosesser. Ved å ikke være bundet ved teori er den følgende mekanisme interessant for foreliggende oppfinnelse. En viktig hen-delse i reperfusjonskadeprosessen er oppregulering, uttrykk, aktivering av intracellulær adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) på endotelceller. ICAM-1 kan deretter samhandle med nøytrofile som resulterer ved transmigrasjon av nøytro-file inn i vevet med påfølgende frigjøring av skadelige en-zymer og destruktive reaktive oksygenmolekyler. Derved har sannsynligvis forbindelser som kan forstyrre oppregulering, uttrykk, aktivering av ICAM-1 fordelaktig effekt på iskemisk reperfusjonshendelser. Disse forbindelsene kan administreres oralt, intra-vaskulært, subkutant, intra-muskulært, intra-nasalt, intra-rektalt, intra-okkulært, subling-valt/bukalt, ved inhalering og topisk (plaster, salve, pulver eller krem), så lenge en effektiv dose blir levert til ICAM-l-kilden.

Selv om det ikke er tenkt å bindes ved teori tror man at foreliggende oppfinnelses 2-fenylkarbamoyl-benzimidazoler reduserer ICAM-1 oppregulering, uttrykk eller aktivering signifikant. I andre prøver viser forbindelsene aktivitet som samsvarer med beskyttelse av hjertet. Heretter følger testmetoder anvendbare for å bestemme slike forbindelsers aktiviteter.

Test for hemning av ICAM-1-uttrykk

Vev: Uttrykket av molekyladhesjon (spesielt ICAM-1) ble ut-ført på humane navlestreng endoteliaceller (HUVEC) erholdt fra Clonetics Corp. (Ca# CC2519), San Diego, CA.

Endepunkt: Konsentrasjon av materiale som hemmer 50% av ICAM-l-uttrykket på overflaten av HUVECs oppregulert med 300 U/ml TNF-alfa (ICS0) .

Metode: Smelt 1 ampulle frossen HUVEC (raskt ved 3 7°C i~2 min (5x 10<5->1 xIO<6>) celler i 1 ml medium) , overfør deretter celler til 45 ml forvarmet vekstmedium (EGM for HUVEC)

1 en 225 cm<2>flaske (sådd ved 2500-5000 celler/cm<2>) og plasser dette i en fuktet 3 7°C inkubater med 5% C02. Skift medium etter 24-30 timer (for å fjerne døde celler og cytopreservativer) og skift deretter hver 2-3 dager - celler bør flyte sammen etter 5-7 dagers vekst. Trypsiner celler for å fjerne dem fra flasken - spinn (200 g, 5 min) til pelletceller - resuspender celler i 50 ml medium (behov~1-2xIO<5>celler/ml) og plate 100 ml cellesuspensjon i 96-kum, kollagenbelagte plater (anvend~l-2 x 10<4>celler/kum)

- la vokse sammen (1-2 dager). Fjern gammelt næringsmedium (avfall) og tilsett 90 ml friskt medium som inneholder TNF-alfa (eller annen ICAM-1 stimulator i ønsket konsentrasjon) eller 90 ml medium alene (for ustimulerte kontrollkummer). Tilsett 10 ml medium (eller PBS eller PBS, 1% DMSO) som inneholder forbindelse som skal testes (ved 10 x ønsket konsentrasjon) eller i tillegg 10 ml medium alene (eller PBS eller PBS, 1% DMSO) for kontrollkummer - (endelig forbin-delseskonsentrasjon = 1 x; endelig DMSO-konsentrasjon = 0,1%, dersom anvendt) - inkuber 4 timer ved 37°C. Fjern medium (avfall) og fest celler i 200 ml 80% aceton: 20% H2i 20 min ved (-20°C). Fjern aceton: H20 (avfall) og tillat

plater å tørke - og lagre ved (-20°C) over natten i eksika-tor. Vask plater med PBS (5 x 250 ml), tilsett deretter 200 ml BLOTTO-løsning for å hemme ikke-spesifikk binding - dyrk 1 time ved romtemperatur og fjern ICAM-1 antiserum (avfall) og vask plater med PBS (5 x 250 ml), tilsett deretter 100

ml geit anti-mus-HRP antiserumkonjugat (in BLOTTO) - dyrk 1 ved romtemperatur. Fjern antiserum-HRP-konjugat (avfall) og vask plater med PBS (5.x 250 ml), vask deretter med citratbuffer (1 x 300 ul; avfall) . Tilsett 100 ml HRP-substrat og la vokse i 5-2 0 min ved romtemperatur (tiden kan variere,

se fargeutvikling), tilsett 50 ml IN H2S04til kummer for å stoppe reaksjonen. Avles plater ved 490 nm på plateleser.

Løsninger for ICAM-1 ELISA:

(1) 80% aceton: 20% H20 (vekt:vekt) - lagre ved (-20°C) . (2) (lx) Dulbeccos fosfatbufferløsning (DPBS), vekt/o Ca<++>eller Mg<++>, pH 7,5 - (Sigma D-5652, lx pulver eller Sigma D-1408, 10 x væske, fortynne 1:10 før anvendelse). (3) BLOTTO - 5% (vekt:volum) skummet tørrmelk (Carnation eller annen) i DPBS. (4) Mus anti-humant ICAM-1 monoklonalt antiserum (Re-search Diagnostics; katalog #RDI-CBL4 50-lx, anti CD54-klon 15,2) - lagerløsning (1 mg/ml) - fortynne 1:1000 i BLOTTO rett før anvendelse (1 mg/ml endelig antiserumkonsentrasjon). (5) Geit anti-mus IgG-pepperrot peroksidasekonjugat (IgG-HRP, DAKO Corp, katalog # P044 7) lagerløsning (1 mg/ml) - fortynne 1:1000 i BLOTTO rett før anvendelse (1 mg/ml endelig konsentrasjon). (6) Citratbuffer, pH 5,0 - 65,3 mM natriumfosfat (dibasisk, 12-hydrat, MW = 358,4, 23,4 g/l) og 34,7 mM sitronsyre (vannfri, syrefri, MW = 192,1, 6,67 g/l) - sjekk pH (5,0), lagre ved 4°C. (7) HRP-substrat - o-fenylendiamindihydroklorid (OPD, Sigma, P6912, 5 mg OPD/tablett) - tilsett 1

tablett/10 ml citratbuffer (ved romtemperatur), tilsett deretter 4 ml 30% H202(Sigma, H1009)/10 ml substratløsning rett før anvendelse - endelig konsentrasjon = 0,5 mg OPD/ml og 0,012% H202.

(8) Human tumornekrosefaktoralfa (TNF-alfa, Boehringer-Manheim, katalog # 1371843) - 10 mg/ampulle (i 1 ml) -108U aktivitet/mg=IO<6>U/10 mg - fortynnet til 20 ml endoteliaceller basalmedium (EBM) (50000 U/ml, 500 ng/ml) - alikvot 150 ml (7500 U, 75 ng) i eppendorftuber (x 133) - lagre ved 20°C - for hvert eksperiment, tilsett en alikvot til 25 ml EBM - endelig konsentrasjon = 300 U/ml eller 3 ng/mlTNF-alfa.

Test for hemming av human navlestreng (vein) endoteliacelle (HUVEC)/nøytrofil adhesjon

Vev: Adhesjon blir utført på human navlestreng endoteliaceller (HUVEC) oppnådd fra Clonetics (Ca# CC2519).

Endepunkt: Konsentrasjon av materiale som hemmer 2 0% av PMN-adhesjon til HUVECer oppregulert med 300 U/ml av TNFalfa (IC20)

Metode:

I. Celler:

A. Endoteliaceller

Human navlestreng endoteliaceller (HUVEC) blir kjøpt som frosne celler i 1 ml alikvoter (Clonetic Corporation, San Diego, CA). Endotelia vekstmedia navlestreng (EGM-UV), "bullet kit" additiver, tryp-siniseringsreagenser (trypsin nøytraliseringsløs-ning og HEPES buffer) blir også kjøpt fra Clonetics. Flasken blir plassert ved 37°C i en 5% C02+ 95% luft, 100% fuktighet inkubator. En ampulle med væske N2frossen celle blir tint i det 37°C vann-badet, hele ampullen blir plassert i en T-275 flaske med 50 ml friskt media og plassert i C02-inkubatoren. Mediene blir byttet ut 24-48 timer se-nere. Sammenløp bør finne sted innen 4-5 dager. Mediene blir byttet minst en gang i løpet av denne perioden. Monolaget i flasken blir fraskilt ved anvendelse av trypsinløsningen etter at monolaget er vasket med Hanks balanserte saltløsning (HBSS). De tysiniserte cellene blir sentrifugert ved 200 x Gs i 5 min og resuspendert i omkring 150 ml media. 100 ul alikvoter blir plassert i hvert kar av 96-kum plate som på forhånd ble belagt med kollagen. Monolaget i platen bør flyte sammen innen 4 8 timer.

B. Nøytrofil isolering

Perifere blodpolymorfonukleære nøytrofiler (PMNer) blir isolert ved etablert metodologi (1). Humant blod oppnås fra cubital vene ved venepunktur utført av kvalifisert flebotomist. Blodet blir samlet opp i heparinisert "vacutainer" (Vacutainer #6489, grønt deksel, 15 ml strekk, VWR). Tretti ml blod blir anvendt ved hver test. Det hepariniserte blodet blir fortynnet med okring bi volum fosfatbuf-ret salt inneholdende 0,2% glukose (PBS-G). En av-brutt gradient Histopaque (3 ml Histopaque-1119 i bunnen og 3 ml Histopaque-1077 på toppen)(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) blir fremstilt i 6, 15 ml koniske sentrifugerør. Det fortynnede blodet blir forsiktig lagt på toppen av Histopaque-1077. Rørene blir sentrifugert ved 800 x G i 30 min ved romtemperatur. Etter sentrifugering blir PMNene fjernet ved aspirasjon fra området mellom Histopaque-1077/Histopaque-1119 mellomsjiktet og toppen av de pelleterte røde blodcellene. PMNene blir samlet fra alle rørene, deretter fortynnet til et totalt volum på 3 0 ml og sentrifugert ved 600 x G i 15 min. Supernatanten blir forkastet og pelleten (som inneholder PMNer og noen røde blodceller) blir behandlet med 6 ml kaldt vann i 30 sekunder til lyse forurensende RBC. Normal osmolaritet blir gjenopprettet ved å tilsette 3 ml 2,7% saltløsning. PMNene blir vasket enda to ganger med PBS-G. Lev-dyktighet og nummer på PMNene blir bestemt ved å anvende trypanblå eksklusjonstest i et emocytometer tellingsrom. Nå og da blir en liten alikvot av PMNenes suspensjon anvendt for en Cytofuge fremstilling. Cytofuge slide blir flekket med Wrights blodflekker (Sigma Chemical Co.) og en differen-siell "court" blir utført for å evaluere prosenten PMNer i fremstillingen.

II. Oppregulering av endoteliaceller:

Monolagene av endoteliaceller i 96-kum platene blir oppregulert med 300 U/ml tumornekrosefaktor (TNF, Boehinger-Manheim katalog # 1371-843). TNF og forbindelsen blir tilsatt til hvert kar 4 timer før tilsettingen av PMNer.

III. Fluorescerende merking av nøytrofiler:

Etter den siste vaskingen blir den nøytrofile pellet resuspendert i 5 ml PBS-G (omtrent 1-3 x 106/ml) .5(og 6) karboksyfluoriserende diacetat suksinimidylester (CFSE, Molecular Probes, Eugene, OR). Et 2 0 mM lager av CFSE blir fremstilt ved å oppløse 25 mg i 2,24 ml (MW557,5) DMSO. 5 ul av lageret tilsettes til 5 ml suspensjon av PMNer for en endelig konsentrasjon av 2 uM. Blandingen blir innkubert i kjøleskapet i 2 0 minutter. På slutten av denne perioden ble PMNene vasket fire ganger med PBS-G. Etter den siste vasken ble PMNene resuspendert i komplett EGM-UV media til den ønskede konsentrasjon (vanligvis får hvert kar av en 96-kum plate 0,6-1,2 x IO<5>PMNer).

IV. Tilsetning av testforbindelser

Et hundre ul media som inneholder TNF-forbindelsene anvendes for å erstatte mediene i kummene som inneholder monolagene med endoteliaceller 4 timer før tilsetting av PMNer.

V. Adhesjonstest:

A. Innsamling av data:

CFSE-merkede nøytrofiler (0,7 til 1,5 x IO<5>) i 10ul volumer (se III) tilsettes til HUVEC monolagene. Platene inkuberes ved 37°C in en 5% C02+ 95% luft, 100% fuktighet inkubator i 30 min. Ikke-klebende celler fjernes ved sentrifugering i henhold til følgende protokoll: (1) En avlesing blir gjort i Cytofluor 2400 etter inkubering ved 37°C. Denne avlesingen blir vurdert som 100% av cellene som er tilsatt. (2) Kummene blir fylt med varmet (inkubator) media på toppen av kummen med en lett konveks menisk (vanligvis 260 ul (tillegg til de 100 ul eller så som allerede er i kummene)). (3) Kummene blir forseglet ved anvendelse av adhe-siv forseglingsfilm for mikroplater (Rainin katalog # 96-SP-100). (4) Lokket erstattes på platen, og størrelsen og plasseringen av enhver boble blir registrert på lokkene med en markør. (5) Lokkene fjernes og foldes (4 bretter) og kut-tede biter av papirhåndkle plasseres på toppen av den forseglede film. Platelokket blir deretter erstattet på toppen av papirhåndkleet og platen snues. (6) Platene plasseres på sentrifugens plateholdere (Sorvall Modell ROMTEMPERATUR 6000D) og sent-rifugeres ved å skru faren ned til omkring 500 RPMer, deretter blir sentrifugen skrudd på med tidsknappen. Fartskontrollen justeres til takometeret avleser 1100 rpm (dette er ekviva-lenten til 200 Gs). Når en fart på 1100 rpm er oppnådd blir en separat timer startet. Etter nøyaktig 2 minutter bringes sentrifugens timer til null for å stoppe motoren. Platene får komme til ro uten bremsing. (7) Platene fjernes og enhver tom kum registreres. Lokket og det brettede papirhåndkleet fjernes (platene beholdes opp-ned). Den forseglende film fjernes deretter fra avfallsbeholderen for biologisk materiale og mediene ristes ut. Platen blottes deretter på papirhåndkleet og ethvert overskytende fluid suges av. (8) Platen vendes til stående stilling og studeres under mikroskop. (9) En andre avlesing utføres på Cytofluor. Denne andre avlesingen anvendes for å bestemme andelen PMNer som forble fastklebet til monolaget . (10) Informasjonen fra CSV-filene av Cytofluor ned-lastes og dataene prosesseres i et EXCEL reg-neark der bakgrunn (PMNer klebet til ikke-oppregulert endotelium) subtraheres og andelen klebehemming bestemmes som følger:

(11) EXCEL regnearket kalkulerer a) prosenten PMNer som kleber til monolaget, b) prosenten PMNer som kleber til monolaget minus bakgrunn (PMNer som kleber til ustimulerte endoteliaceller) og

c) prosenten klebehemming for kummene som mot-tar TFN alene til 0% hemming (negativt antall

indikerer økning i klebing).

B. Statistikk, databehandling og lagring: Statistikk utføres ved å anvende den tosidige t-test med lik varians i EXCEL, og resultatene registrert som P-verdien.

IV. Tilleggsinformasjon:

A. For å kle kummer med kollagen:

Løs opp 25 mg syreløselig rottehalekollagen 446 ml vann surgjort med få dråper HC1. Steriliser ved fil-trering. Tilsett 50 ul til hver kum i 96-kum plate (,28 cm2) for 10 ug/kum. La dette inkubere over natten i 37°C inkubatoren. Blås bort væsken og lagre i kjøle-skap til anvendelse.

B. For å fremstille PBS+0,2% glukose (dekstrose): Fremstill 2 liter PBS (Sigma) og tilsett 2 g glukose. Steriliser filter og lagre.

Rottehierteinfarkt/ reperfusionsskademodell

Hann Sprague-Dawley rotter bedøves med uretan, 1,25 g/kg ip. En halsarterie og halsblodåre eksternaliseres og det innføres en kanyle med PE-5 0 tubing for å registrere blod-tykket og for å lette intravenøs administrasjon av farge-stoff eller medikament. En trakeotomi blir utført. Dyrene blir knyttet til en Harvard Roden Ventilator (Modell 683, Harvard Apparatus, South Natick, MA) og ventilert ved 1,5 ml/100 g kroppsvekt ved 50 slag/minutt. Nålelektroder plasseres for et lede II elektrokardiogram. Dyrene beholdes ved 3 7°C ved hjelp av elektriske varmeputer justert til den ønskede temperatur og kontrollert via rektal termistor probe og kontroller. Hjertet blir forsiktig isolert ved en venstre torakotomi og ved femte interkostale rom, og den venstre ytre synkende koronærarterie (LAD) lokaliseres. En ligatur av 6-0 silke plasseres rundt LAD med endende trædde gjennom en liten lengde PE-320 rør for å lette rask okklusjon og reperfusjon av arterien. LAD okkluderes ved fast-klemming av suturen og klemt tett rundt hjerteoverflaten ved å anvende 25 mm Schwarz aneurismeklemme. Okklusjon varer i 90 min og etterfølges av reperfusjon i 3,0-4,5 timer. Dyr doseres med medikament eller midler 10 min før reperfusjon av det angrepne området av hjertet ved intrave-nøs levering via halsblodåren. Simulert-opererte rotter un-derkastes ikke iskemi eller reperfusjon. Ved slutten av eksperimentet blir LAD permanent re-okkludert og en 10 mg/ml løsning Evans Blue Stain administreres via halsblod-årekanylen for å identifisere området som er angrepet av iskemi, dvs. riskområdet (AAR). Det skadede hjertet blir raskt fjernet og plassert i 0,9% saltlake ved4°C før krea-tinfosfokinaseaktiviteten (CPK) avsluttes.

Bestemmelse av kreatinfosfokinaseaktivitet:

Den venstre ventrikulærfrie veggen (LVFW) dissekeres fri fra hjertet og veies. AAR, som definert ved fravær av feil, dissekeres fra LVFW og veies også. AAR homogeniseres i 5 sekunder i 4 ml 0,25 M sukrose som inneholder 1 g i 30 min ved 4°C. Supernatanten dekanteres for å bestemme CPK-aktivitet og pelleten lagres frossen for isolering og test av myeloperoksidaseaktivitet. CPK-aktivitet testes spektro-fotometrisk med et kommersielt levert substrat, CPK Assay Vial<®>(Sigma Diagnostics) ved en bølgelengde på 340 nm ved 24-26°C.

Bestemmelse av myeloperoksidaseaktivitet:

Myeloperoskidase (MPO) isoleres fra den frosne pelleten etter fremstilling av CPK. Pelleten suspenderes i 50 mM fos-fatbuffer, pH6, som inneholder 0,5% heksadcyltrimetylam-moniumbromid (HTAB) til en konsentrasjon på omkring 10% sonikert i 10 sekunder og frossen på tørr is. Tre fryse-tine sykluser gjøres med 10 sekunder sonikering mellom syk- lene. Prøvene kjøles på is i 30 min. etterfulgt av sentrifugering ved 12.500 x g i 15 min ved 4°C. En alikvot av supernatanten testes spektrometrisk for MPO-aktivitet i 50 mM natriumfosfatbuffer, pH6, som inneholder 0,167 mg/ml o-dianisidindihydroklorid og 0,0005% hydrogenperoksid ved en bølgelengde på 460 nm ved 24-26°C.

Beregning og statistisk analyse:

Resultatene rapporteres som den midlere ± SEM. CPK- og MPO-aktivitet uttrykkes som enheter/g vev, hvor 1 enhet CPK-aktivitet er definert som mengden CPK anvendende 1 umol fos-fokreatin per minutt. AAR kvantifiseres som vekt% av LVFW. Midlere arterieblodtrykk (MABP) beregnes som en tredjedel av forskjellen mellom systolisk og diastolisk blodtrykk tilsatt til diastolisk blodtrykk. Data analyseres for statistisk signifikans av behanlingsvirkningene ved 95% sik-kerhetsnivået ved en koordinert t-test eller ved enveis analyse av varians.

Oppfinnelsen vedrører metoder for behandling eller forebygging av enhver lidelse eller forstyrrelse som vist over, spesielt reperfusjonsskade, ved å administrere en sikker og effektiv mengde av forbindelsene som beskrevet over. Slike behandlingsmetoder kan involvere å administrere en enhets-doseringsform av slike forbindelser parenteralt, peroralt eller topisk. Parenteral administrasjon inkluderer intra-venøs, intramuskulær, sukutan, intraperitoneal eller annen injeksjon av doseringsformen. Peroral administrasjon involverer svelging av doseringsformen og absorpsjon av det aktive fra den gastrointestinale trakt. Topisk administrasjon involverer å kontakte doseringsformen med overflaten av hud eller mukosalt vev, inkludert, men ikke begrenset til de av den fordøyelseskanalen og respirasjonssystemet.

For parenteral administrasjon er mengden forbindelse typisk administrert foretrukket fra omkring 2 mg/kg, mer foretrukket fra omkring 5 mg/kg, foretrukket til 2 mg/kg, mer fore trukket til omkring 10 mg/kg. Frekvensen av slik administrasjon er typisk en eller to ganger daglig. En behandlingskur er typisk en enkel dose eller varer fra omkring 1 dag, foretrukket fra omkring 5 dager, til omkring 3 0 dager, foretrukket til omkring 15 dager.

For peroral administrasjon er mengden 2-karboksamid benzimidazolforbindelse typisk administrert foretrukket fra omkring 5 mg/kg, mer foretrukket fra omkring 10 mg/kg, foretrukket til 25 mg/kg, mer foretrukket til omkring 15 mg/kg. Frekvensen av slik administrasjon er typisk fra en til fire ganger daglig. En behandlingskur er typisk en enkel dose eller varer fra omkring 1 dag, foretrukket fra omkring 5 dager, til omkring 3 0 dager, foretrukket til omkring 15 dager.

Sammensetning og metodeeksempler

Følgende ikke-begrensende eksempler illustrerer oppfinnelsen. Følgende sammensetning og metodeeksempler begrenser ikke oppfinnelsen, men er retningslinjer for fagmannen for fremstilling og anvendelse av forbindelsene, sammensetningene og metodene i henhold til oppfinnelsen. I hvert til-felle kan andre forbindelser innen oppfinnelsen værer er-statning for eksempelforbindelsen vist under med samme resultater.

Eksempel A

Farmasøytiske sammensetninger i form av en intravenøs løs-ning fremstilles ved konvensjonelle metoder, slik som ved å blande følgende:

Når 1 ml av sammensetningen over administreres intravenøst, enten rett før eller rett etter en vevsskade (aneurisme-reparasjon, koronaer bypass, transplantasjon, blødning, organiskemi grunnet hypoperfusjon, sepsis, etc), unngås eller reduseres vevsskade.

Eksempel B

Parmasøytiske sammensetninger i væskeform fremstilles ved konvensjonelle metoder, formulert som følger:

Når 1,0 ml av sammensetningen over administreres intra-venøst, enten rett før eller rett etter en vevsskade (aneu-rismereparasjon, koronaer bypass, transplantasjon, blødning, organiskemi grunnet hypoperf us jon, sepsis, etc), unngås eller reduseres vevsskade.

Mens enkelte utførelser av oppfinnelsen er beskrevet, er det klart for fagmannen at en rekke endringer og modifi-<1>Forbindelse i henhold til eksempel 1 kan erstattes med et hvilket som helst av eksemplene 2-8. 2 Forbindelse i henhold til eksempel 1 kan erstattes med et hvilket som helst av eksemplene 2-8.

seringer av sammensetningene inkludert heri kan gjøres uten å fravike fra oppfinnelsens ånd og virkeområde.

Claims (7)

1. Forbindelse med strukturen:

hvori: (a) RI er valgt fra alkyl, aryl, alkoksy og aryloksy; (b) R3 og R4 er uavhengig valgt fra hydrogen, halo, cyano, alkyl, alkoksy, alkyltio og mono- eller dialkylamino, bortsett fra at R3 og R4 ikke begge er hydrogen (c) hverR 5 er uavhengig valgt hydrogen, halo, cyano, alkyl, hydroksy, alkoksy, tio, alkyltio, amino og mono- eller dialkylamino; (d) hver R6 er uavhengig valgt fra hydrogen, halo, nitro, cyano, alkyl, aryl, heterocyklyl, hydroksy, alkoksy, aryloksy, tio, alkyltio, aryltio, amino, alkylamino, arylamino, acyl, alkylacyl, arylacyl, amido, alkylamido, arylamido, sulfonyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, fosfonyl, alkylfosfonyl, arylfosfonyl, karboksy og dens alkyl- og arylestere; en optisk isomer, diastereomer eller enantiomer eller blanding derav, et farmasøytisk akseptabelt salt, hydrat eller biohydrolyserbar ester, amid eller imid derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1, hvori RI er alkyl eller aryl med fra 2 til 8 karbonatomer.

3. Forbindelse ifølge krav 2, hvori R3 og R4 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogenalkyl, alkoksy, alkyltio, amino og mono- eller dialkyamino, alkyldelene av slik R4 har fra 1 til 6 karbonatomer; bortsett fra atR 3 og R4 ikke begge er hydrogen.

4. Forbindelse ifølge krav 3, hvori hver R5 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halo, alkyl, alkoksy, alkyltio og mono- eller dialkylamino, alkyldelene av slik R5 har fra 1 til 6 karbonatomer; og hver R6 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halo, nitro, cyano, alkyl, fenyl, hydroksy, alkoksy, tio, alkyltio, amino, alkylamino, alkyldelene av slik R6 har fra 1 til omkring 6 karbonatomer og ikke mer enn tre R6 er andre enn hydrogen.

5. Forbindelse ifølge krav 4, hvori alkyldelene av R3, R4 og R5 delene uavhengig har fra 1 til 3 karbonatomer, usubstituert eller substituert med hydroksy, Ci -C3 alkoksy, tio, Ci -C3 alkyltio, amino og C1 -C3 mono- eller dialkyamino.

6. Forbindelse ifølge krav 5, hvori RI er alkyl med fra omkring 3 til omkring 8 karbonatomer, alkyl er usubstituert eller substituert med substituenter valgt fra gruppen bestående av halo, hydroksy, C1 -C3 alkoksy, tio, C1 -C3 alkyltio, amino, C1 .-C3 mono- eller dialkylamino, fenyl og heterocykel med 5 eller 6 ringatomer.

7. Forbindelse ifølge krav 5, hvori RI fenyl eller benzyl, usubstituert eller substituert med substituenter valgt fra gruppen bestående av halo, C1 -C3 alkyl, hydroksy, C1 -C3 alkoksy, amino og C1 -C3 mono- eller dialkylamino.