NO20023752L - 2-karboksamid-benzimidazoler som er nyttige ved behandling og forebygging av iskemisk reperfusjonsskade - Google Patents

Description

Kryssreferanse til beslektet søknad

Foreliggende oppfinnelse krever prioritet fra US Provisional Application Serial No. 60/181,234, 7945P, innlevert 9. februar 2000.

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører 2-karboksamid-benzimidazoler som er nyttige ved behandling eller forebygging av iskemisk reperfusjonsskade av myokardiale eller andre vev eller andre kardiovaskulære og inflammatoriske sykdommer og forstyrrelser.

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse inkluderer forbindelser med den generelle struktur:

hvori:

(a) RI er valgt fra gruppen bestående av alkyl, aryl,

alkoksy og aryloksy, hvor alkyl og aryl i den foretrukne RI inneholder 1-14 karbonatomer,

(b) R3 og R4 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, alkyl, alkoksy, alkyl-aryloksy, alkyltio, amino og mono- eller dialkylamino, alkyldelene av de foretrukne R3 og R4

har 1-8 karbonatomer, bortsett fra når R3 og R4 begge er hydrogen,

(c) hver R5 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, cyano, alkyl, hydroksy, alkoksy, tio, alkyltio, amino og mono- eller dialkylamino, alkyldelene av foretrukne R5 har 1-8 karbonatomer, og

en optisk isomer, diastereomer eller enantiomer eller blanding derav, et farmasøytisk akseptabelt salt, hydrat eller biohydrolyserbar ester, amid eller imid derav.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også farmasøytiske blandinger som inneholder slike forbindelser, samt fremgangsmåter for anvendelse av slike forbindelser for å behandle eller forhindre reperfusjonsskader av vev.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Det er ca. 1,1 million myokardiale infarkter i USA hvert år og 350.000 mennesker dør. Myokardial infarkt (MI) eller hjerteattakk forekommer når blodkar som tilfører blod til hjertet blir fullstendig eller delvis okkludert. Behandling med trombolytiske midler for å gjenopprette blodstrømmen (reperfusjon) er den første behandling i mange tilfeller. Fordelen ved reperfusjon er imidlertid ledsaget av den akutte inflammatoriske responsen assosiert med den, hvilket fører til et syndrom kalt reperfusjonsskade.

Inflammasjonen tjener generelt som en beskyttende rolle. For eksempel vil posisjoner for bakteriell infeksjon, bakterielle endotoksiner indusere produksjon av inflammatoriske cytokiner som tiltrekker sirkulerende leukocytter, inkludert nøytrofiler og monocytter for å ødelegge bakteriene. Straks infeksjonen er stoppet vil inflammasjonen avta. Det finnes imidlertid betingelser hvor det inflammatoriske signal opprettholdes (reumatoid artritt) eller det er unødvendig alvorlig (iskemi-reperfusjonsskade).

Et vesentlig trekk ved inflammasjon er migrering av nevrofiler (PMNer) fra blod inn i vev. Denne migrering er forutgående for en kaskade av hendelser forårsaket av adhesjonsmolekyler. Vedhefting av PMNer til vaskulære endotelia celler krever samvirkning av adhesjonsmolekylene og overflaten av begge celletyper. Disse molekyler tilhører tre distinkte familier: seleksjons-, integins- og immunoglobulinsuperfamilien. Nevrofiler vil først "rulle" langs endoteliacellene, en prosess forårsaket av selektiner. Ved inflammasjonsstedene vil kraftig vedhefting forårsakes av samvirkning av 02 integriner på PMNer og ICAM-1 (intercellulært adhesjonsmolekyl-1) uttrykt på endoteliacellene. Endelig vil transendotelialmigrering av PMNer inn i vevene føre til vevødeleggelse. Forbindelser som er i stand til å blokkere vedhefting av nøytrofile til endotelium vil være nyttige ved behandling av et antall tilstander som inkluderer iskemi-reperfusjonsskade inkludert, men nødvendigvis ikke begrenset til myokardinfarkt, kransarterie bypass poding, angioplastikk, angina, slag, perifer vaskulær sykdom, inflammatorisk buksykdom, ulcerøs kolitt, forbrenninger, frostskader, pustestressyndrom hos voksne, astma, vev og organtransplantasjoner, generell kirurgi, replantasjon, akutt renalfeil, revmatoid artritt, psoriasis, hepatitt, pankreatitt, solforbrenning, stråling, svulst og sjokk.

(For nye oversikter se: C.Cornejo, J. Harlan, R. Winn, in Adhesion Molecules in Health&Disease, L. Paul and T. Issekutz, Eds., Marcel Dekker, 1997, kapittel 18; J. Prince, C. Ballantyne, Emerging Therapeutic Targets, 1999, 263-277.)

Ordliste over betegnelser

Hvis ikke annet er angitt, har de etterfølgende betegnelser den indikerte betydning anvendt i foreliggende beskrivelse. Betegnelsen "alkyl" betyr en hydrokarbonkjede som er lineær, forgrenet eller syklisk, mettet eller umettet (en ikke aromatisk), substituert eller usubstituert. Betegnelsen kan anvendes alene eller som en del av et annet ord hvor den kan være forkortet til "alk" (for eksempel alkoksy, alkylamino). Foretrukket lineær alkyl har 1-20 karbonatomer, mer foretrukket 1-8 karbonatomer og mest foretrukket 1-4 karbonatomer og aller mest foretrukket er metyl eller etyl. Foretrukket syklisk og forgrenet alkyl har 3-20 karbonatomer, mer foretrukket 3-10 karbonatomer og mest foretrukket 3-6 karbonatomer. Foretrukket syklisk alkyl har en hydrokarbonring, men kan ha to, tre eller flere sammensmeltede eller spirosykliske hydrokarbonringer. Alkyl kan være umettet kun med en eller flere dobbeltbindinger ("alkenyl")(ingen trippelbindinger), fortrinnsvis med en, to eller tre dobbeltbindinger, mer foretrukket med en dobbeltbinding. Alkyl kan være umettet med en eller flere trippelbindinger ("alkynyl"), fortrinnsvis med en trippelbinding. Mer foretrukket er mettet ("alkanyl"). Betegnelsen "alkylen" betyr en alkyl som er knyttet til 2 eller flere grupper. Fortrukne substituenter på alkyl inkluderer alkyl, aryl, halo, hydroksy, alkoksy, aryloksy, amino, alkylamino, arylamino, tio, alkyltio, aryltio, acyl, alkylacyl, arylacyl, karboksy, alkylester, arylester, amino, alkylamino, arylamino, sulfonyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, nitro, cyano, heterocykel. Foretrukket alkyl er usubstituert.

Betegnelsen "aryl" betyr en aromatisk hydrokarbonring som er substituert eller usubstituert. Betegnelsen kan anvendes alene eller som en del av et annet ord (aryloksy, arylamino). Foretrukket aryl har 6-14 karbonatomer i den aromatiske ring eller ringer, og totalt 6-20, fortrinnsvis ca. 12 karbonatomer. Foretrukket aryl er fenyl eller naftyl, mest foretrukket er fenyl. Betegnelsen "arylen" betyr aryl som er knyttet til to eller flere grupper. Foretrukne substituenter på aryl inkluderer alkyl, aryl, halo, hydroksy, alkoksy, aryloksy, amino, alkylamino, arylamino, tio, alkyltio, aryltio, acyl, alkylacyl, arylacyl, karboksy, alkylester, arylester, amino, alkylamino, arylamino, sulfonyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, nitro, cyano, heterocykel.

Betegnelsen "heteroatom" betyr et nitrogen, oksygen eller svovelatom.

Betegnelsen "heterocykel" eller "heterocyklyl" betyr en cyklisk alkyl eller aryl hvor en eller flere karbonatomer er erstattet med heteroatomer i ringen eller ringene, fortrinnsvis en, to eller tre heteroatomer i ringen eller ringene. Foretrukne heterocykliske substituenter er de samme som for alkyl. Betegnelsen "heteroaryl" henviser til en undergruppe av heterocykliske forbindelser som omfatter en aromatisk ring. Foretrukket heteroaryl har 5-14, mer foretrukket 10 og mest foretrukket 5 eller 6 karbon pluss heteroatomer i ringen (e) og totalt 5-20, mer foretrukket ca. 12 karbon pluss heteroatomer.

Betegnelsen "sikker og effektiv mengde" betyr en mengde av en farmakologisk aktiv forbindelse tilstrekkelig til i det vesentlige å indusere en positiv modifikasjon av tilstanden som skal behandles, men tilstrekkelig lav til å unngå alvorlige bivirkninger (et rimelig fordel-/risikoforhold) innen omfanget av sunn medisinsk vurdering. En sikker og effektiv mengde av en forbindelse vil variere med den spesielle tilstand som behandles, størrelse og alder og fysisk tilstand for pasienten, tilstandens alvorlighet, behandlingens varighet, type av samtidig terapi, den anvendte spesielle farmasøytisk akseptable bærer, samt lignende faktorer bestemt av den behandlende lege ut fra dennes kunnskap og ekspertise.

Betegnelsen "farmasøytisk akseptabel bærer" eller "farmasøytisk akseptable eksipienter" betyr en eller flere forenlige faststoffer eller væskeeksipienter som er egnet for administrasjon til mennesker og lavere dyr. Betegnelsen "forenlig" betyr at eksipientene er i stand til å blandes med den farmakoligsk aktive forbindelse eller forbindelser og med hverandre, på en måte slik at det ikke er noen samvirkning som i det vesentlige nedsetter den farmasøytiske effekt av blandingen under vanlige anvendelsessituasjoner. Eksipientene har i seg selv ingen vesentlig farmakologisk aktivitet, men kan for eksempel fungere som fortynningsmidler, smøremidler, disintegreringsforsterkere, oppløsningsforsterkere, inkapsuleringsmaterialer, preserveringsmidler, fargestoffer, smaksstoffer og lignende. Farmasøytisk akseptable eksipienter må være av tilstrekkelig høy renhet og tilstrekkelig lav toksisitet for å gjøre dem egnet for administrasjon til mennesker og lavere dyr som behandles.

Betegnelsen "enhetsdoseform" betyr at blandingen omfatter en mengde av en farmakologisk aktiv forbindelse som er egnet for administrasjon til et menneske eller et lavere dyr i en enkel doseform, i henhold til god medisinsk praksis.

En "biohydrolyserbar ester" er en ester av en

karboksylsyreinnholdende 2-karboksyamid benzimidazol ifølge foreliggende oppfinnelse som ikke innvirker på aktiviteten av 2-karboksyamid benzimidazolene eller som lett omdannes i et dyr for å gi en aktiv 2-karboksyamid benzimidazol ifølge oppfinnelsen. Slike estere inkluderer lavere alkylestere, lavere cykloalkylestere (slik som acetoksymetyl-, acetoksyetyl-, aminokarbonyloksymetyl-, pivaloyloksymetyl-og pivaloyloksyetylestere), laktonylestere (slik som ftalidyl- og tioftalidylestere).

Forbindelsene

Foreliggende oppfinnelse inkluderer 2-karboksamid benzimidazolforbindelser med strukturen:

I formel (I) er RI valgt fra alkyl, aryl, alkoksy og aryloksy. Alkyl- og aryldelene i foretrukne Rl-grupper inneholder 1-14 karbonatomer.

Mer foretrukket er RI valgt fra usubstituerte eller substituert alkyl med 1-12 karbonatomer og usubstituert eller substituert fenyl eller naftyl. Mer foretrukket alkyl RI inkluderer usubstituert eller substituert lineær alkyl med 2-8 karbonatomer, mer foretrukket 3-6 karbonatomer og ytterligere med foretrukket er n-propyl eller n-butyl eller n-pentyl. Mer foretrukket RI inkluderer forgrenet alkyl med 3-8 karbonatomer, mer foretrukket 3-6 karbonatomer og ytterligere mer foretrukket er isometyl eller isopentyl. Mer foretrukket RI inkluderer cyklisk alkyl med 3-8 karbonatomer, mer foretrukket 3-6 karbonatomer. Foretrukne substituenter for slik lineær, forgrenet eller cyklisk alkyl inkluderer halo, hydroksy, alkoksy, amino, mono- og dialkylamino, tio, alkyltio, aryl (spesielt fenyl) og heterocykel; mer foretrukket er slik alkyl usubstituert. Foretrukket RI som er lineær, forgrenet eller cyklisk alkyl, er mettet eller umettet med en eller flere dobbeltbindinger, mer foretrukket er mettet.

Mer foretrukket aryl RI inkluderer substituert eller usubstituert fenyl. Foretrukne substituenter for slik fenyl inkluderer halo, hydroksy, alkoksy, amino, mono- og dialkyamino, også foretrukket for slik fenyl er at den er usubstituert.

Mer foretrukket aralkyl RI inkluderer substituert eller usubstituert fenyl. Foretrukne substituenter for slik benzyl inkluderer halo, hydroksy, alkoksy, amino, mono- og dialkylamino, også foretrukket for slik benzyl er at den er umettet.

I formelen (I) er R3 og R4 uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halo, alkyl, alkoksy, alkyl-aryloksy, alkyltio, amino og mono- eller dialkylamino, bortsett fra at R3 og R4 ikke begge er hydrogen. Alkyldelene av foretrukket R3 og R4 grupper kan ha 1-8 karbonatomer. Fortrinnsvis er R3 og R4 uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, haloalkylalkoksy, alkyltio og mono- eller dialkylamino, bortsett fra at R3 og R4 ikke begge er hydrogen.

Foretrukket R3 og R4 inkluderer hydrogen, alkoksy med 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer, alkyltio med 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer, monoalkylamino eller dialkylamino hvor hver alkyl har 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer og alkyl med 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer. Foretrukne substituenter på alkyl av slike grupper inkluderer halo, hydroksy, alkoksy, amino, mono- eller dialkylamino, tio, alkyltio, mer foretrukket er det for slik R3 og R4 grupper at de er usubstituerte. Ytterlige mer foretrukket er minst en av R3 og R4 etoksy og spesielt metoksy. Fortrinnsvis er en av R3 og R4 hydrogen, mer foretrukket er R3 hydrogen.

I formel (I) angir R5-grupper i posisjonene 4 og 7 av benzimidazolringene. Hver R5 er uavhengig valgt fra hydrogen, halo, cyano, alkyl, hydroksy, alkoksy, tio, alkyltio, amino og mono- eller dialkylamino. Alkyldelene i foretrukne R5-grupper inneholder 1-8 karbonatomer.

Foretrukket R5 inkluderer hydrogen, halo, alkyl med 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer, alkoksy med 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer, monoalkyl- eller dialkylamino hvor hver alkyl inneholder 1-6, fortrinnsvis opp til omkring 3 karbonatomer og alkyltio med 1-6, fortrinnsvis opp til 3 karbonatomer. Foretrukne substituenter for alkyl i slike R5 grupper inkluderer alkoksy, amino og alkyl, mer foretrukket er det at alkyl i slike grupper er ikke-substituerte.

Mer foretrukket er det at hver R5 er uavhengig valgt fra hydrogen, halo og usubstituert alkyl med 1-3 karbonatomer. Mer foretrukket er det at ikke flere enn en R5 er hydrogen. Mest foretrukket er begge R5 hydrogen.

Foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen inkluderer følgende eksempler med strukturen (I) og med de indikerte substituenter:

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen inkluderer alle aktive optiske isomerer, diastereomerer og enantiomerer og blandinger derav av de ovennevnte forbindelser. Forbindelsen ifølge oppfinnelsen inkluderer også farmasøytisk akseptable salter, hydrater og biohydrolyserbare estere, amider og imider av slike forbindelser.

Fremstilling av forbindelsene

I det følgende gis generelle skjemaer for fremstilling av foreliggende forbindelser og-spesielle fremgangsmåter for fremstilling av foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen. Hvis ikke noe annet er angitt er alle kommersielt tilgjenglige reaktanter anvendt uten ytterligere rensing. Reaksjonene blir generelt utført under en inert atmosfære (argon eller nitrogen). Saltlake henviser til mettet vandig natriumklorid. Restoppløsningsmiddel fjernes under vakuum (ca. 0,03 mm hg) ved romtemperatur (rt).

Strukturene for forbindelsene fremstilt er underbygget under anvendelse av de følgende analytiske redskaper. Proton NMR spektra ble tatt med et "GE QE-300" (300 MHz) spektrometer, et "Bruker AC-300" (300 MHz) kvad-kjernesondesystem eller mer en "Varian Unityplus" (300 MHz). Alle kjemiske skift er rapportert i liten 8-skala som ppm, nedfelt fra (CH3)4Si. Spektra opptatt med CDC13er betegnet enten som (CH3)4Si eller som rest-CHCl3(7,24 ppm). Spektra opptatt i D20 er referert som HOD (4,80 ppm), de som er opptatt i (CH3)2CO er betegnet som rest (CH3)2CO (2,04 ppm), de i CD30D er referert som rest CH3OH (3,30 ppm) og de i (CD3)2SO er referert til rest (CH3)2SO (2,49 ppm). Karbon-13 spektra blir tatt opp med "GE QE-300" (75 MHz) spektrometer eller "Bruker AC-300" (75 MHz) kvad-kjernesondesystem. Spektra tatt i CDD13er referert til oppløsningsmiddel (78 ppm), de i CD3OD er referert til oppløsningsmiddel (49 ppm), de i (CD3)2SO er referert til oppløsningsmiddel (39,7 ppm) og de i (CD3)2CO er referert til oppløsningsmiddel (206,5, 29,8 ppm). Massespektra blir bestemt på "Fision's Trio 2000" forsynt med en robotsonde eller en "Fison's Platform II Mass Spectrometer". Kjemiske ioniseringsspektra ble erholdt under anvendelse av metan og/eller ammoniakk som reaktantgass. ESI forbindelsesinnføring skjedde via "Hewlett Packard 1050 HPLC" autoprøvetaker under anvendelse av metanol, 0,2% maursyre og 0,2 mM ammoniumacetat som elueringsoppløsningsmiddel. Tynnsjiktskromatografi blir utført på silikagel 60-F254 forbelagte plater. Flash kromatografi blir utført -under anvendelse av silikagel 60 (Merck, 230-400 mesh). Smeltepunktet ble erholdt med en "Electrothermal 1A9200" eller en "MelTemp II" kapilærsmeltepunktsapparat og er ukorrigerte.

Skjema I er et generelt skjema nyttig for fremstilling av mange forbindelser ifølge oppfinnelsen:

5-Metoksy-2-nitrofenol (B fra skjema I med R4 = metoksy og R3 og begge R5 = H): Til en 2 1 rundbunnet flaske, forsynt med mekanisk rører og fylletrakt ble propionsyre (300 ml) og 3-metoksyfenol (37,2 g, 0,3 mol) tilsatt. Den resulterende blanding ble avkjølt til 0°C og en oppløsning av natriumnitritt (21 g, 0,304 mol) i vann (50 ml) ble langsomt tilsatt. Etter omrøring i 1 time ved 0°C ble rykende salpetersyre (40 ml) langsomt tilsatt. Den resulterende oppslemming ble omrørt ved 0°C i en time og deretter oppvarmet til romtemperatur i løpet av 2 timer. Vann (250 ml) ble tilsatt dråpevis ved romtemperatur og det resulterende faststoff ble filtrert og vasket med 300 ml 50% vandig propionsyre for å gi, etter tørking, 5-metoksy-2-nitrofenol som et faststoff.

N-Alkyl-5-metoksy-2-nitroanilin (C fra skjema I med RI = alkyl, R4 = metoksy og R3 og begge R5 = H). Til en 1 1 rundbunnet flaske ble toluen (300 ml), 5-metoksy-2-nitrofenol (5,0 g, 0,03 mol) og trietylamin (6,68 g, 0,066 mol) tilsatt. Den resulterende oppløsning ble avkjølt til 0°C og trifluormetansulfonsyre anhydrid (Tf20) ble langsomt tilsatt via en pipette (9,3 g, 0,033 mol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0°C i 5 min., aminet (R1-NH2) (0,12 mol) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til refluks i 5,5 timer. Etter avkjøling til romtemperatur ble reaksjonsinnholdet filtrert gjennom en plugg silikagel (eluert med 90:10 heksan:etylacetat) og konsentrert via en roterende inndamper for å gi rå N-alkyl-5-metoksy-2-nitroa-nilin. Materialet ble anvendt i det neste syntesetrinn.

Nl-Alkyl-6-metoksybenzimidazol (D fra skjema I med RI = alkyl, R4 = metoksy og R3 og begge R5 = H): Til en 250 ml rundbunnet flaske ble det tilsatt 88% maursyre (50 ml) og N-alkyl-5-metoksy-2-nitroanilin (0,02 mol). Til denne homogene blanding ble det tilsatt en etylacetatoppslemming av 10% Pd-C (600 mg). Den resulterende heterogene reaksjonsblanding ble oppvarmet til 100°C i 1 time, avkjølt til romtemperatur og filtrert gjennom "Celite" (eluert med vann). Filtratet ble gjort basisk ved tilsetting av 28% NH4OH oppløsning og deretter vasket med etylacetat (3 x 100 ml). De kombinerte organiske faser ble tørket (MgS04) , filtrert og konsentrert via en roterende inndamper til å gi en rest. Resten ble kromatografert (Si02, 50:50 heksan:etylacetat) til å gi Nl-alkyl-6-metoksybenzimidazol.

Etyl l-alkyl-6-metoksy-lH-benzimidazol-2-karboksylat (E fra skjema I med RI = alkyl, R4 = metoksy og R3 og begge R5 = H): til en 250 ml rundbunnet flaske under argon, ble det tilsatt Nl-alkyl-6-metoksybenzimidazol (2,9 g, 0,014 mol) og THF (100 ml). Dette ble kjølt til -78°C og n-butyl litium (12,3 ml, 0,019 mol, i heksaner) ble tilsatt dråpevis, resulterende i en gul blanding. Omrøring fortsatte ved -78°C i 30 min, deretter ble etylklorformat (ECF) tilsatt rent (2,13 g, 0,019 mol). Reaksjonsblandingen ble varmet til romtemperatur og omrørt i 30 min. Vann (100 ml) ble tilsatt, og den resulterende blanding ble ekstrahert med etylacetat (3 x 100 ml). De kombinerte organiske faser ble tørket (MgSCM, filtrert og konsentrert for å gi en gul rest. Denne resten ble deretter kromatografert (flash, 70:30 heksan:etylacetat) for å gi etyl l-alkyl-6-metoksy-lH-benzimidazol-2-karboksylat.

Nl-Alkyl-6-metoksybenzimidazol-2-karboksamid (F fra skjema I med RI = alkyl, RA - metoksy og R3 og begge R5 = H): Til en ACE GLASS trykktube med omrører ble det tilsatt etyl 1-alkyl-6-metoksy-lH-benzimidazol-2-karboksylat (1,8 mmol), metanolammoniakk (10 ml, 2,0 M) og natrium eller kalsiumcyanid (8,8 mg, 0,18 mmol). Reaksjonsbeholderen ble deretter forseglet, oppvarmet til 80°C i 3 timer og deretter kjølt til romtemperatur. Den resulterende reaksjonsblandingen ble konsentrert med rotasjonsfordamping og residuet ble kromatografert (flash, 60:40 heksan:etylacetat) for å gi Nl-alkyl-6-metoksybenzimidazol-2-karboksamid.

Skjema II er et annet generelt skjema nyttig fremstilling av mange forbindelser ifølge oppfinnelsen. N-(Cyanometyl)-4-metoksy-2-nitroanilin (H fra skjema II med R4 = metoksy og R3 og begge R5 = H): til en 3-halset 1 1 rundbunnet flaske tilpasset med en mekanisk omrører, reflukskondenser og en fylletrakt ble det tilsatt 4-metoksy-2-nitroanilin (8,4 g, 0,05 mol), paraformaldehyd (4,5 g, 0,15 mol) kaliumcyanid (9,75 g, 0,15 mol) og sinkklorid (25 g, 0,18 mol). Til denne kraftig omrørte blandingen ble det langsomt tilsatt en blanding av H2S04(4 dråper) og iskald eddiksyre (250 ml). Den resulterende reaksjonsblandingen ble varmet til 50°C i 8 timer og deretter avkjølt til romtemperatur. Reaksjonsinnholdene ble helt over is/vann og det dannede faststoff ble oppsamlet via sugefiltrering, vasket med vann, tørket og rekrystallisert (abs. EtOH) for å gi N-(cyanometyl)-4-metoksy-2-nitroanilin som nåler.

2-Cyano-6-metoksybenzimidazol-Nl-oksid (J fra skjema II med R4 = metoksy og R3 og begge R5 = H): Til en 500 ml rundbunnet flaske ble det tilsatt N-(cyanometyl)-4-metoksy-2-nitroanilin (2,5 g, 0,012 mol) og 95% etanol (130 ml). Reaksjonsblandingen ble varmet til 60°C, fast kaliumkarbonat (1,77 g, 0,013 mol) ble tilsatt og den resulterende blanding ble deretter varmet til refluks i 4,5 timer, kjølt til romtemperatur og konsentrert i vakuum. Residuet ble oppløst i vann og deretter surgjort (kons. HC1) for å danne et hvitt faststoff som ble samlet sammen via filtrering, tørket og rekrystallisert (DMF) for å gi 2-cyano-6-metoksybenzimidazol-N-oksid som et faststoff.

2-cyano-l-isopropoksy-6-metoksybenzimidazol (K fra skjema II med RI = isopropyl, R4 = metoksy og R3 og begge R5 = H): Til en 100 ml rundbunnet flaske ble det tilsatt 2-cyano-6-metoksybenzimidazol-N-oksid (457 mg, 2,41 mmol), tetrahydrofuran (THF) (50 ml), isopropylalkohol (145 mg, 2,41 mmol), trifenylfosfin (Ph3P)(632 mg, 2,41 mmol) og endelig dietylazodikarboksylat (DEAD)(444 mg, 2,55 mmol). Den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer, deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble kromatografert (80:20 heksan:etylacetat) for å gi 2-cyano-l-isopropoksy-6-metoksybenzimidazol som et faststoff. l-Isopropoksy-6-metoksybenzimidazol-2-karboksamid (L fra skjema II med RI = isopropyl, R4 = metoksy og R3 og begge R5=H): Til en 25 ml rundbunnet flaske ble det tilsatt 2-cyano-l-isopropoksy-6-metoksybenzimidazol (100 mg, 0,43 mmol), t-butylalkohol (5 ml) og kaliumhydroksid (200 mg, 3,57 mmol). Denne blandingen ble refluksert i 1 timer, kjølt til romtemperatur, helt i saltsyre (50 ml) og ekstrahert med etylacetat (3 x 50 ml). De kombinerte organiske fraksjoner ble tørket (MgS04) , filtrert og konsenstrert i vakuum for å gi en gul olje. Denne oljen ble kromatografert (70:30 heksan:etylaceat) for å gi 1-isopropoksy-6-metoksybenzimidazol-2-karboksamid som et faststoff).

Skjema III er enda et generelt skjema nyttig fremstilling av mange forbindelser ifølge oppfinnelsen:

3-fluor-4-nitroanilin (N fra skjema III med R4 = amino og R3 og begge R5 = H): 3-Fluoranilin (5g; 1 ekvivalent) ble kombinert med benzaldehyd (5g; 1,05 ekvivalent). Blandingen ble omrørt ved 25°C i ^ time for å oppnå en mild refluks.

Blandingen ble oppløst i konsentrert svovelsyre (20 ml) og kjølt til <5°C med et isbad. En blanding av konsentrert salpetersyre (3 ml) og konsentrert svovelsyre (10 ml) ble langsomt tilsatt og blandingen ble omrørt ved 25°C i 1^time. Reaksjonen ble bråkjølt ved å helle over vann (200 ml); den ble deretter vasket med etylacetat. De kombinerte etylacetatlagene ble tørket over magnesiumsulfat og fordampet til tørrhet. Produktet ble kromatografert på en silikagelkolonne ved å anvende 20% etylacetat-heksan som eluent for å gi tittelforbindelsen og en blanding av andre regioisomerer.

(3-Fluor-4-nitro-fenyl)-karbamidsyre tert-butylester (P fra skjema III med R4 = Boc-NH og R3 og begge R5 = H): Ditertbutyldikarbonat (1,4 g; 1 evkivalent) ble kombinert med 3-fluor-4-nitroanilin (1 g; 1 ekvivalent) i diklormetan (30 ml). Blandingen ble omrørt ved 25°C i 10 min. og dimetylaminopyrridin (0,08 g; 0,1 ekvivalent) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved 25°C i 24 timer. Blandingen ble fortynnet i etylacetat og vasket med 1 molar vandig sitronsyre; blandingen ble deretter vasket to ganger med vann. Etylacetatlaget ble tørket over magnesiumsulfat og fordampet til tørrhet. Produktet ble kromatografert på en silikagelkolonne ved å anvende 30% etylacetat-heksan som eluent for å gi en blanding av tittelforbindelsen (og den bis Boc-beskyttede forbindelsen).

(3-Isobutylamino-4-nitro-fenyl)-karbamidsyre tert-butylester (Q fra skjema III med Ri = isobutyl, R4 = Boc-NH og R3 og begge R5 = H): Isobutylamin (0,29 g; 2 ekvivalenter) ble tilsatt langsomt til en løsning av (3-fluor-4-nitrofenyl)-karbamidsyre tert-butylester (0,5 g; 1 ekvivalent) i acetonitril (20 ml). Blandingen ble omrørt ved 25°C i 24 timer. Blandingen ble deretter fortynnet i diklormetan og vasket to ganger med vann. Diklormetanlaget ble tørket over natriumsulfat og fordampet til tørrhet for å gi tittelforbindelsen.

(4-Amino-3-isobutylamino-fenyl)-karbamidsyre tert-butylester (R fra skjema III med RI = isobutyl, R4 = Boc-NH og R3 og begge R5 = H): En løsning av (3-Isobutylamino-4-nitro-fenyl)-karbamidsyre tert-butylester (0,51 g; 1 ekvivalent) i etanol (15 ml) ble kombinert med en suspensjon av palladium på karbon (10 vekt%) (0,1 g; 2 ekvivalenter) i etanol (15 ml) mens den ble omrørt under en nitrogenatmosfære. Nitrogen ble deretter erstattet med et positivt trykk av hydrogen, og blandingen ble omrørt i 16 timer ved 25°C under hydrogenatmosfære. Blandingen ble deretter filtrert gjennom kiselgur, og presipitatet ble vasket med diklormetan. Filtratet ble fordampet til tørrhet for å gi tittelforbindelsen.

6-tert-Butoksykarbonylamino-1-isobutyl-lH-benzimidazol-2-karboksylsyreetylester (S fra skjema III med RI = isobutyl, R4 = Boc-NH og R3 og begge R5 = H): En 50% løsning etylglyoksylatpolymer i toluen (0,5 g; 1,5 ekvivalenter) ble kombinert med en løsning (4-amino-3-isobutylamino-fenyl)-karbamidsyre tert-butylester (0,46 g; 1 ekvivalent, forutsetter 100% utbytte fra tidligere trinn) i etanol (3 ml). Blandingen ble omrørt utildekket i H time. En løsning jodin (0,21 g; 0,5 ekvivalenter) i etanol (1,5 ml) ble tilsatt og blandingen ble deretter omrørt utildekket ved 25°C i 8 timer. Natriumtiosulfat (0,41 g; 1 ekvivalent) i vann (2 ml) ble tilsatt og blandingen ble omrørt i ^ time ved 25°C. Blandingen ble fortynnet i etylacetat og vasket med vann og saltlake. Etylacetatlaget ble tørket over magnesiumsulfat og fordampet til tørrhet. Produktet ble kromatografert på en silikagelkolonne ved å anvende 50% etylacetat-heksan som ekstraksjonsmiddel for å gi tittelforbindelsen.

6-Amino-l-isobutyl-lH-benzimidazol-2-karboksylsyreetylester (T fra skjema III med RI = isobutyl, R4 = Boc-NH og R3 og begge R5 = H): Trifluoreddiksyre (0,5 ml) ble tilsatt langsomt til en løsning av 6-tert-butoksykarbonylamino-l-isobutyl-lH-benzoimidazol-2-karboksylsyreetylester (0,12 g)

i diklormetan (4,5 ml). Blandingen ble omrørt ved 25°C i 3 timer. Blandingen ble deretter fordampet til tørrhet og residuet ble oppløst i metanol. Løsningen i metanol ble fordampet til tørrhet; dette ble deretter oppløst i diklormetan og vasket med 2 M vandig kaliumkarbonat. Diklormetanlaget ble tørket over natriumsulfat og fordampet til tørrhet for å gi tittelforbindelsen.

6-Amino-1-isobutyl-lH-benzimidazol-2-karboksylsyreamid (U fra skjema III med RI = isobutyl, R4 = Boc-NH og R3 og begge R5 = H): En 25% vandig løsning av ammoniakk (5 ml) ble tilsatt til en løsning av 6-amino-l-isobutyl-lH-benzoimidazol-2-karboksylsyre etylester (0,02g) i tetrahydrofuran (0,5 ml) under omrøring. Blandingen ble omrørt ved 25°C i 72 timer. Blandingen ble deretter fortynnet i etylacetat og vasket med vann. Etylacetatfraksjonen ble tørket over magnseiumsulfat og fordampet til tørrhet for å gi tittelforbindelsen.

Skjema IV er enda et generelt skjema nyttig fremstilling av mange forbindelser ifølge oppfinnelsen:

N-(4-metoksy-2-nitrofenyl)-isobutyramid (W fra skjema IV med R3 = metoksy, R4 og begge R5 = H og R6 = iPr): 4-metoksy-2-nitroanilin (1,0 g; 1 ekvivalent) og isobutyrylklorid (0,634 g; 1 ekvivalent) ble kombinert i pyridin (60 ml) og omrørt i 4 timer. Blandingen ble konsentrert i vakuum til et residu og oppløst i diklormetan (DCM) (70 ml), vasket to ganger med IN HC1 (vandig), mettet Na2C03(vandig) vann og saltlake og tørket over MgS04. Oppløsningsmiddelet ble fjernet i vakuum for å gi 1,35 g av tittelforbindelsen.

Isobutyl-(4-metoksy-2-nitrofenyl)-amin (X fra skjema IV med R3 = metoksy, R4 og begge R5 = H og R6 = iPr) : Isobutyl-(4-metoksy-2-nitrofenyl)-amin (0,1 g; 1 ekvivalent) ble oppløst i THF (2 ml) og kombinert med en 1 M borantetrahydrofuran kompleksløsning i THF (1,25 ml; 3 ekvivalenter) og omrørt i 18 timer. Metanol (1 ml) ble langsomt tilsatt og oppløsningen ble varmet til 50°C i 2 timer. Oppløsningsmiddelet ble fjernet i vakuum og residuet ble kromatografert (silikagel, 0 til 30% EtOAc/heksaner) for å gi tittelforbindelsen.

l^-isobutyl-4-metoksy-benzen-l, 2-diamin (Y fra skjema IV med R3 = metoksy, R4 og begge R5 = H og R6 = iPr) : N<1->isobutyl-4-metoksy-benzen-l,2-diamin (0,054 g; 1 ekvivalent) ble oppløst i etanol (2 ml) og vann (0,1 ml), 10% palladium på karbon (50% våt) (0,011 g) ble tilsatt. Suspensjonen ble omrørt under en atmosfære av hydrogengass i 2 timer og deretter ble flasken renset med nitrogen. Suspensjonen ble filtrert gjennom en kiselgurpute, vasket grundig med DCM og de kombinerte organiske faser ble tørket in vacuo for å gi tittelforbindelsen.

l-Isobutyl-5-metoksy-lH-benzoimidazol-2-karboksylsyre etylester { Z fra skjema IV med R3 = metoksy, R4 og begge R5=H og R6 = iPr): l-isobutyl-5-metoksy-lH-benzimidazol-2-karboksylsyre etylester (0,034 g; 1 ekvivalent i etanol (0,5 ml)) og en 50% løsning av etylglyoksalatpolymer i toluen (0,051 ml; 1,5 ekvivalent) ble kombinert og omrørt i H time. En løsning av jodin (0,022 g; 0,5 ekvivalent) i etanol (0,5 ml) ble tilsatt og reaksjonen ble videre omrørt i 20 timer. En løsning av natirumtiosulfat (0,044 g) i vann (0,5 ml) ble tilsatt og blandingen ble omrørt i 1 time, deretter fortynnet med EtOAc (20 ml). Blandingen ble vasket med vann (x 3) og saltlake, tørket med MgS04og oppløsningsmidlene ble fjernet i vakuum. Residuet ble renset ved kromatografi (silikagel, 5% metanol i DMC) for å gi tittelforbindelsen. l-Isobutyl-5-metoksy-lH-benzoimidazol-2-karboksylsyreamid ( AA fra skjema IV med R3 = metoksy og R4 og begge R5 = H og R6 = iPr): En 25 % vandig løsning av ammoniakk (1 ml) ble tilsatt under omrøring til en løsning av l-isobutyl-5-metoksy-lH-benzoimidazol-2-karboksylsyreetylester (0,0036 g) i THF (1 ml). Den organiske fase ble tørket med MgS04og fordampet in vakuum for å gi tittelforbindelsen.

Skjema V og VI er to generelle skjemaer nyttige ved fremstilling av mange forbindelser ifølge oppfinnelsen: 6-[[(4-Metoksy-fenyl)-metyl]amino]-1-isobutyl-l-H-benzimidazol-2-karboksylsyreamid (AB fra skjema RI = isobutyl, R3 og begge R5 = H og R7 = metoksy): Til en 200 ml rundbunnet flaske 6-amino-l-isobutyl-lH-benzimidazol-karboksylsyreamid (U; 0,1 g) ble oppløst i vannfri MeOH (10 ml). Reagenseddiksyre (0,1 ml) og 4-metoksybenzaldehyd (0,15 g) ble tilsatt og reaksjonen ble refluksert til fullstendig konvertering av utgangsmaterialet. På dette punkt ble reaksjonsblandingen kjølt til romtemperatur og natriumcyanoborhydrat (0,1 g) ble tilsatt porsjonsvis. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 4 timer. Blandingen ble deretter fordampet til tørrhet og residuet ble oppløst i etylacetat og vasket med 5% vandig natrium bikarbonat, vann og saltlake. Det organiske lag ble tørket over natriumsulfat og fordampet til tørrhet. Residuet ble kromatografert på en silikagelkolonne ved å anvende 25% etylacetat-heksan som ekstraksjonsmiddel for å gi tittelforbindelsen.

6-{[(2S)-2-(ft-Benzyloksykarbonyl)amino-l-okso-3-fenylpropyl]amino}-l-isobutyl-lH-benzimidazol-2-karboksamid ( AC fra skjema VI med RI - isobutyl, R3 og begge R5 = H og R9 = Z) : W-Benzyloksykarbonyl-L-fenylalanin (64,4 mg) ble oppløst i tørr diklormetan (1,5 ml) og N, N-diiosoporpyletylamin (41,2 jai). 1- (3-dimetylaminopropyl) -3-etylkarbodiimid (45,4 mg) og 4-dimetylaminopyridin (kat.) ble tisatt og blandingen ble omrørt i 10 minutter ved romtemperatur. 1-Hydroksybenzotriazol (32,0 mg) ble deretter tilsatt og omrøringen fortsatte i 5 minutter. Endelig ble 6-amino-l-isobutyl-l#-benzimidazol-2-karboksamid tilsatt og den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 5 dager. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med diklormetan og vasket med mettet natriumbikarbonatløsning (lx), vann (lx) og saltlake (lx). Det organiske lag ble tørket og konsentrert til et faststoff. Finmaling med metanol gav tittelforbindelsen som et faststoff.

6-{[(2S)-2-amino-l-okso-3-fenylpropyl]amino}-l-isobutyl-lff-benzimidazol-2-karboksamidhydroklorid (AD fra skjema med RI = isobutyl, R3, begge R5 og R9 - H). 6-{[(2S)-2-( N-Benzyloksykarbonyl)amino-1-okso-3-fenylpropyl]amino}-1-isobutyl-lH-benzimidazol-2-karboksamid (84,7 mg) og 10% Pd/C (17,0 mg) ble plassert i en flaske. I tørr etanol (3,5 ml) ble argontilførselen erstattet med en luftballong. Etter omrøring ved romtemperatur over natten ble hydrogen skylt fra systemet med argon og reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom en Celite®-propp med 1:1 etanol/vann (100 ml). Filtratet ble konsentrert gjennom en faststoffresidu. Det resulterende faststoff ble oppløst i et minimum av metanol og dryppet i overskytende eter for å gi en slurry. Filtrering ga tittelforbindelsen som et faststoff.

Komposisj oner

Foreliggende oppfinnelse inkluderer farmasøytiske sammensetninger som omfatter en sikker og effektiv mengde av en 2-karboksamidbenzimidazolforbindelse beskrevet over og farmasøytiske akseptable eksipienter. Sammensetningene kan også eventuelt inkludere andre farmakologisk aktive forbindelser, spesielt de med aktivitet som trombolytiker (for eksempel reteplase, streptokinase eller vevsplasminogenaktivatorer), antikoagulenter (for eksempel heparin), beta-blokkere (for eksempel karvedilol, propanalol), kalsiumkanalblokkere (for eksempel verapamil, nifedipin) og anti-blodplate forbindelser (for eksempel aspirin, abciximab).

Noen eksempler av farmasøytisk akseptable bærere eller komponenter derav er sukker, slik som laktose, glukose og sukrose; stivelser, slik som maisstivelse og potetstivelse; cellulose og dens derivater, slik som natriumkarboksymetylcellulose, etylcellulose, celluloseacetat; finmalt tragant; malt, gelatin, talkum, faste smøremidler, slik som stearinsyre, magnesiumstearat eller kalsiumsulfat; vegetabilske oljer, slik som peanøttolje, bomullsfrøolje, sesamolje, olivenolje, maisolje og olje fra teobrom; polyoler slik som propylenglykol, glyserin, sorbitol, mannitol og polyetylenglykol; alginsyre; emulgeringsmidler, slik som Tweens®; vætende midler slik som natriumlaurylsulfat; fargemidler; smakstilsetningsmidler; eksipineter; tabletthjelpemider; stabilisatorer; antioksidanter; konserveringsmidler; pyrogenfritt vann; isotonisk salt og fosfatbufferløsninger.

Valget av en farmasøytisk akseptabel bærer for anvendelse sammen med en forbindelser blir egentlig bestemt ved måten forbindelsen skal administreres på. Forbindelsene og sammensetningene av foreliggende oppfinnelse kan administreres systematisk. Administrasjonsruter inkluderer topisk eller transdermal (plaster, salve, krem, pulver, etc), oral, parenteral, inkludert subkutant, intramuskulært eller intravenøs injeksjon, topisk, rektal, kolonisk, intraperitoneal, intraokkulær, sublingval, bukal, inhalasjon og/eller intranasal. Den foretrukne administrasjonsrute er parenteral, spesielt intravenøs injeksjon på en daglig eller nødvendig basis.

Den passende mengde av forbindelsen som skal anvendes kan bestemmes ved rutineeksperimentering med dyremodeller. Slike modeller inkluderer, men er ikke begrenset til frett, kanin og ikke-humane primatmodeller. Generelt blir en mengde mellom 0,01 (jg/kg til 100 mg/kg kroppsvekt per dag administrert avhengig av forbindelsen eller sammensetningene som er anvendt sitt potensial.

Foretrukket enhetsdoseform for injeksjon inkluderer sterile vannløsninger, fysiologisk salt eller blandinger derav. Parenterale enhetsdoseformsammesetninger kan være i form av løsninger klare for injisering eller tørre (for eksempel lyofiliserte) sammensetninger som er rekondisjonert med vann eller saltløsning før injeksjon. Løsningenes pH bør justeres til omkring 7,4. Passende bærere for injeksjon eller kirurgiske implantater inkluderer hydrogeler, kontrollerte eller uavbrutte løseanordninger, polyeddiksyre og kollagenmatriser. Andre passende bærere for injeksjon inkluderer dekstrose, mannitol, laktose, lecitin, albumin, natriumglutamat og lignende.

Sammensetninger av foreliggende oppfinnelse er foretrukket tilveiebrakt i enhetsdoseformer. En

enhetsdoseformsammensetning inneholder foretrukket fra omkring 50 mg, mer foretrukket fra omkring 200 mg, også foretrukket fra omkring 500 mg, foretrukket til omkring 2000 mg, mer foretrukket til omkring 1000 mg, også foretrukket til omkring 500 mg av en 2-karboksamidbenzimidazolforbindelse beskrevet over.

Foreliggende sammensetninger kan være i et mangfold av passende former (for eksempel) for peroral, topisk eller parenteral administrasjon. Avhengig av den spesielt ønskede administrasjonsrute kan et mangfold av farmasøytisk akseptable bærere som er velkjente i teknikken anvendes. Disse inkluderer faste eller flytende fyllstoffer, fortynningsmidler, hydrotoper, overflateaktive midler og innkapslingssubstanser. Mengden av bærerkomponenter som er anvendt sammen med den aktive forbindelse er tilstrekkelig til å tilveiebringe en praktisk mengde av materialet for administrasjon per enhetsdose av den aktive forbindelse. Teknikker og sammensetninger for fremstilling av enhetsdoseformer i henhold til oppfinnelsen er beskrevet i følgende referanser: Modern Pharmaceutics, volum 7, kap. 9 og 10, Banker and Rhodes, editors, 1979; Lieberman et al., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, 1981 og Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 2. utgave, 1976.

En foretrukket doseringsform av foreliggende oppfinnelse er tiltenkt parenteral administrasjon. Foretrukket farmasøytisk akseptable bærere for slike sammensetninger inkluderer steril, pyrogenfritt vann og fysiologisk saltløsninger. Parenterale enhetsdoseformsammensetninger kan være i form av løsninger klare for injisering eller tørre (for eksempel lyofiliserte) sammensetninger som er rekondisjonert med vann eller saltløsning før injeksjon.

Foretrukne sammensetninger av foreliggende oppfinnelse inkluderer de som er tiltenkt peroral administrasjon, slik som tabletter, kapsler, pulvere og væsker. Passende farmasøytiske akseptable eksipienter og anti-platelet forbindelser (for eksempel aspirin, abciximab)nts for slike sammensetninger inkluderer sukker, stivelser, cellulose og dets derivater, malt, gelatin, talkum, kalsiumsulfat, vegetabilske oljer, syntetiske oljer, polyoler, algesyre, fosfatbuffere, emulgatorer, alkoholer og vann.

Metode for anvendelse av forbindelsene

2-karboksamid-benzimidazolforbindelsene av foreliggende oppfinnelse kan anvendes ved behandling av iskemi-reperfusjonsskade. Selv om de ikke begrenset til noen spesifikk mekanisme, tror man at forbindelsene virker via modulasjon av adhesjonsmolekylmetabolisme. Forbindelsene er derfor muligens anvendbare for behandling av iskemi-reperfusjonsskade som inkluderer: kardiovaskulær lidelse (myokardial iskemi, angina, hjertearytmi, hjertefeil, hypertensjon); for behandling for å redusere nevrotisk skade assosiert med anoksia eller iskemi som typisk kommer etter slag, hjertestans eller perinatal kvelning, for behandling for å redusere reperfusjonsskade etter organtransplantasjon, for behandling av forfrysning, inflammatorisk hjerteklaffsykdom, psoriasis, astma, pustevanskesyndrom hos voksne, for behandling av kronisk inflammatorisk lungesykdom inkludert emfysem, bronkitt og for behandling av fibrose, urtikaria, angioedema, vaskulitis, migarin, revmatoid artritt, gikt og allergi.

Det er kjent at et mangfold av prosesser er involvert i reperfusjonsskade, inflammasjon og relaterte prosesser. Ved å ikke være bundet ved teori er den følgende mekanisme interessant for foreliggende oppfinnelse. En viktig hendelse i reperfusjonskadeprosessen er oppregulering, uttrykk, aktivering av intracellulær adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) på endotelceller. ICAM-1 kan deretter samhandle med nøytrofile som resulterer ved transmigrasjon av nøytrofile inn i vevet med påfølgende frigjøring av skadelige enzymer og destruktive reaktive oksygenmolekyler. Derved har sannsynligvis forbindelser som kan forstyrre-oppregulering, uttrykk, aktivering av ICAM-1 fordelaktig effekt på iskemisk reperfusjonshendelser. Disse forbindelsene kan administreres oralt, intra-vaskulært, subkutant, intra-muskulært, intra-nasalt, intra-rektalt, intra-okkulært, sublingvalt/bukalt, ved inhalering og topisk (plaster, salve, pulver eller krem), så lenge en effektiv dose blir levert til ICAM-l-kilden.

2-karboksamid-benzimidazoler i henhold til oppfinnelsen reduserer ICAM-1 oppregulering, uttrykk eller aktivering signifikant. I andre prøver viser forbindelsene aktivitet som samsvarer med beskyttelse av hjertet. Heretter følger testmetoder anvendbare for å bestemme slike forbindelsers aktiviteter.

Test for hemming av ICAM-1-uttrykk

Vev: Uttrykket av molekyladhesjon (spesielt ICAM-1) ble utført på humane navlestreng endoteliaceller (HUVEC) erholdt fra Clonetics Corp. (Ca# CC2519), San Diego, CA.

Endepunkt: Konsentrasjon av materiale som hemmer 50% av ICAM-l-uttrykket på overflaten av HUVECs oppregulert med 300 U/ml TNF-alfa (IC50) .

Metode: Smelt 1 ampulle frossen HUVEC (raskt ved 37°C i~2 min (5 x 10<5->1 x 10<6>) celler i 1 ml medium), overfør deretter celler til 45 ml forvarmet vekstmedium (EGM for HUVEC) i en 225 cm<2>flaske (sådd ved 2500-5000 celler/cm<2>) og plasser dette i en fuktet 37°C inkubater med 5% C02. Skift medium etter 24-30 timer (for å fjerne døde celler og cytopreservativer) og skift deretter hver 2-3 dager - celler bør flyte sammen etter 5-7 dagers vekst. Trypsiner celler for å fjerne dem fra flasken - spinn (200 g, 5 min) til pelletceller - resuspender celler i 50 ml medium (behov~l-2 x IO<5>celler/ml) og plate 100 ml cellesuspensjon i 96-kum, kollagenbelagte plater (anvend~l-2 x. IO<4>celler/kum) - la vokse sammen (1-2 dager). Fjern gammelt næringsmedium (avfall) og tilsett 90 ml friskt medium som inneholder TNF-alfa (eller annen ICAM-1 stimulator i ønsket konsentrasjon) eller 90 ml medium alene (for ustimulerte kontrollkummer). Tilsett 10 ml medium (eller PBS eller PBS, 1% DMSO) som inneholder forbindelse som skal testes (ved 10 x ønsket konsentrasjon) eller i tillegg 10 ml medium alene (eller PBS eller PBS, 1% DMSO) for kontrollkummer - (endelig forbindelseskonsentrasjon = 1 x; endelig DMSO-konsentrasjon = 0,1%, dersom anvendt) - inkuber 4 timer ved 37°C. Fjern medium (avfall) og fest celler i 200 ml 80% aceton: 20% H2i 20 min ved (-20°C) . Fjern aceton: H20 (avfall) og tillat plater å tørke - og lagre ved (-20°C) over natten i eksikator. Vask plater med PBS (5 x 250 ml), tilsett deretter 200 ml BLOTTO-løsning for å hemme ikke-spesifikk binding - dyrk 1 time ved romtemperatur og fjern ICAM-1 antiserum (avfall) og vask plater med PBS (5 x 250 ml), tilsett deretter 100 ml geit anti-mus-HRP antiserumkonjugat (in BLOTTO) - dyrk 1 ved romtemperatur. Fjern antiserum-HRP-konjugat (avfall) og vask plater med PBS (5 x 250 ml), vask deretter med citratbuffer (1 x 300 (il; avfall) . Tilsett 100 ml HRP-substrat og la vokse i 5-20 min ved romtemperatur (tiden kan variere, se fargeutvikling), tilsett 50 ml IN H2S04til kummer for å stoppe reaksjonen. Avles plater ved 490 nm på plateleser.

Løsninger for ICAM-1 ELISA:

(1) 80% aceton: 20% H20 (vekt:vekt) - lagre ved (-20°C). (2) (lx) Dulbeccos fosfatbufferløsning (DPBS), vekt/o Ca<++>eller Mg<++>, pH 7,5 - (Sigma D-5652, lx pulver eller Sigma D-1408, 10 x væske, fortynne 1:10 før anvendelse). (3) BLOTTO - 5% (vekt:volum) skummet tørrmelk (Carnation eller annen) i DPBS. (4) Mus anti-humant ICAM-1 monoklonalt antise-rum (Research Diagnostics; katalog #RDI-CBL450-lx, anti CD54-klon 15,2) - lagerløsning (1 mg/ml) - fortynne 1:1000 i BLOTTO rett før anvendelse (1 mg/ml endelig antiserumkonsentrasjon). (5) Geit anti-mus IgG-pepperrot peroksidasekonjugat (IgG-HRP, DAKO Corp, katalog # P0447)-lagerløsning (1 mg/ml) - fortynne 1:1000 i BLOTTO rett før anvendelse (1 mg/ml endelig konsentrasjon). (6) Citratbuffer, pH 5,0 - 65,3 mM natriumfosfat (dibasisk, 12-hydrat, MW = 358,4, 23,4 g/l) og 34,7 mM sitronsyre (vannfri, syrefri, MW = 192,1, 6,67 g/l) - sjekk pH (5,0), lagre ved 4°C. (7) HRP-substrat - o-fenylendiamindihydroklorid (OPD, Sigma, P6912, 5 mg OPD/tablett) - tilsett 1

tablett/10 ml citratbuffer (ved romtemperatur), tilsett deretter 4 ml 30% H202(Sigma, H1009)/10 ml substratløsning rett før anvendelse - endelig konsentrasjon = 0,5 mg OPD/ml og 0,012% H202.

(8) Human tumornekrosefaktoralfa (TNF-alfa, Boehringer-Manheim, katalog # 1371843) - 10 mg/ampulle (i 1 ml) - 10<8>U aktivitet/mg = IO<6>U/10 mg - fortynnet til 20 ml endoteliaceller basalmedium (EBM) (50000 U/ml, 500 ng/ml) - alikvot 150 ml (7500 U, 75 ng) i eppendorftuber (x 133) - lagre ved 20°C - for hvert eksperiment, tilsett en alikvot til 25 ml EBM - endelig konsentrasjon = 300 U/ml eller 3 ng/ml TNF-alfa.

Test for hemming av human navlestreng (vein) endoteliacelle (HUVEC)/nøytrofil adhesjon

Vev: Adhesjon blir utført på human navlestreng endoteliaceller (HUVEC) oppnådd fra Clonetics (Ca# CC2519).

Endepunkt: Konsentrasjon av materiale som hemmer 20% av PMN-adhesjon til HUVECer oppregulert med 300 U/ml av TNFalfa (IC20)

Metode:

I. Celler:

A. Endoteliaceller

Human navlestreng endoteliaceller (HUVEC) blir kjøpt som frosne celler i 1 ml alikvoter (Clonetic Corporation, San Diego, CA). Endotelia vekstmedia navlestreng (EGM-UV), "bullet kit" additiver, trypsiniseringsreagenser (trypsin nøytraliseringsløsning og HEPES buffer) blir også kjøpt fra Clonetics. Flasken blir plassert ved 37°C i en 5% C02+ 95% luft, 100% fuktighet inkubator.

En ampulle med væske N2frossen celle blir tint i det 37°C vannbadet, hele ampullen blir plassert i en T-275 flaske med 50 ml friskt media og plassert i C02-inkubatoren. Mediene blir byttet ut 24-48 timer senere. Sammenløp bør finne sted innen 4-5 dager. Mediene blir byttet minst en gang i løpet av denne perioden. Monolaget i flasken blir fraskilt ved anvendelse av trypsinløsningen etter at monolaget er vasket med Hanks balanserte saltløsning (HBSS). De tysiniserte cellene blir sentrifugert ved 200 x Gs i 5 min og resuspendert i omkring 150 ml media. 100 ul alikvoter blir plassert i hvert kar av 96-kum plate som på forhånd ble belagt med kollagen. Monolaget i platen bør flyte sammen innen 48 timer.

B. Nøytrofil isolering

Perifere blodpolymorfonukleære nøytrofiler (PMNer) blir isolert ved etablert metodologi (1). Humant blod oppnås fra kubital vene ved venepunktur utført av kvalifisert flebotomist. Blodet blir samlet opp i heparinisert "vacutainer" (Vacutainer #6489, grønt deksel, 15 ml strekk, VWR). Tretti ml blod blir anvendt ved hver test. Det hepariniserte blodet blir fortynnet med okring ^ volum fosfatbufret salt inneholdende 0,2% glukose (PBS-G). En avbrutt gradient Histopaque (3 ml Histopaque-1119 i bunnen og 3 ml Histopaque-1077 på toppen)(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) blir fremstilt i 6, 15 ml koniske sentrifugerør. Det fortynnede blodet blir forsiktig lagt på toppen av Histopaque-1077. Rørene blir sentrifugert ved 800 x G i 30 min ved romtemperatur. Etter sentrifugering blir PMNene fjernet ved aspirasjon fra området mellom Histopaque-1077/Histopaque-1119 mellomsjiktet og toppen av de pelleterte røde blodcellene. PMNene blir samlet fra alle rørene, deretter fortynnet til et totalt volum på 30 ml og sentrifugert ved 600 x G i 15 min. Supernatanten blir forkastet og pelleten (som inneholder PMNer og noen røde blodceller) blir behandlet med 6 ml kaldt vann i 30 sekunder til lyse forurensende RBC. Normal osmolaritet blir gjenopprettet ved å tilsette 3 ml 2,7% saltløsning. PMNene blir vasket enda to ganger med PBS-G. Levdyktighet og nummer på PMNene blir bestemt ved å anvende trypanblå eksklusjonstest i et emocytometer tellingsrom. Nå og da blir en liten alikvot av PMNenes suspensjon anvendt for en Cytofuge fremstilling. Cytofuge slide blir flekket med Wrights blodflekker (Sigma Chemical Co.) og en differensiell "court" blir utført for å evaluere prosenten PMNer i fremstillingen.

II. Oppregulering av endoteliaceller:

Monolagene av endoteliaceller i 96—kum platene blir oppregulert med 300 U/ml tumornekrosefaktor (TNF, Boehinger-Manheim katalog # 1371-843). TNF og forbindelsen blir tilsatt til hvert kar 4 timer før tilsettingen av PMNerPMNer.

III. Fluorescerende merking av nøytrofiler:

Etter den siste vaskingen blir den nøytrofile pellet resuspendert i 5 ml PBS-G (omtrent 1-3 x lOVml) . 5 (og 6) karboksyfluoriserende diacetat suksinimidylester (CFSE, Molecular Probes, Eugene, OR). Et 20 mM lager av CFSE blir fremstilt ved å oppløse 25 mg i 2,24 ml (MW557, 5) DMSO. 5 (il av lageret tilsettes til 5 ml suspensjon av PMNer for en endelig konsentrasjon av 2 uM. Blandingen blir innkubert i kjøleskapet i 20 minutter. På slutten av denne perioden ble PMNene vasket fire ganger med PBS-G. Etter den siste vasken ble PMNene resuspendert i komplett EGM-UV media til den ønskede konsentrasjon (vanligvis får hvert kar av en 96-kum plate 0,6-1,2 x IO<5>PMNer).

IV. Tilsetning av testforbindelser

Et hundre (.ti media som inneholder TNF-forbindelsene anvendes for å erstatte mediene i kummene som inneholder monolagene med endoteliaceller 4 timer før tilsetting av PMNer.

V. Adhesjonstest:

A. Innsamling av data:

CFSE-merkede nøytrofiler (0,7 til 1,5 x IO<5>) i 10 (il volumer (se III) tilsettes til HUVEC monolagene. Platene inkuberes ved 37°C in en 5% C02+ 95% luft, 100% fuktighet inkubator i 30 min. Ikke-klebende celler fjernes ved sentrifugering i henhold til følgende protokoll: (1) En avlesing blir gjort i Cytofluor 2400 etter inkubering ved 37°C. Denne avlesingen blir vurdert som 100% av cellene som er tilsatt. (2) Kummene blir fylt med varmet (inkubator) media på toppen av kummen med en lett konveks menisk (vanligvis 260 ul (tillegg til de 100 ul eller så som allerede er i kummene)). (3) Kummene blir forseglet ved anvendelse av adhesiv forseglingsfilm for mikroplater (Rainin katalog # 96-SP-100). (4) Lokket erstattes på platen, og størrelsen og plasseringen av enhver boble blir registrert på lokkene med en markør. (5) Lokkene fjernes og foldes (4 bretter) og kuttede biter av papirhåndkle plasseres på toppen av den forseglede film. Platelokket blir deretter erstattet på toppen av papirhåndkleet og platen snues. (6) Platene plasseres på sentrifugens plateholdere (Sorvall Modell ROMTEMPERATUR 6000D) og sentrifugeres ved å skru faren ned til omkring 500 RPMer, deretter blir sentrifugen skrudd på med tidsknappen. Fartskontrollen justeres til takometeret avleser 1100 rpm (dette er ekvivalenten til 200 Gs). Når en fart på 1100 rpm er oppnådd blir en separat timer startet. Etter nøyaktig 2 minutter bringes sentrifugens timer til null for å stoppe motoren. Platene får komme til ro uten bremsing. (7) Platene fjernes og-enhver tom kum registreres. Lokket og det brettede papirhåndkleet fjernes (platene beholdes opp-ned). Den forseglende film fjernes deretter fra avfallsbeholderen for biologisk materiale og mediene ristes ut. Platen blottes deretter på papirhåndkleet og ethvert overskytende fluid suges av. (8) Platen vendes til stående stilling og studeres under mikroskop. (9) En andre avlesing utføres på Cytofluor. Denne andre avlesingen anvendes for å bestemme andelen PMNer som forble fastklebet til monolaget. (10) Informasjonen fra CSV-filene av Cytofluor nedlastes og dataene prosesseres i et EXCEL regneark der bakgrunn (PMNer klebet til ikke-oppregulert endotelium) subtraheres og andelen klebehemming bestemmes som følger:

(11) EXCEL regnearket kalkulerer a) prosenten PMNer som kleber til monolaget, b) prosenten PMNer som kleber til monolaget minus bakgrunn (PMNer som kleber til ustimulerte endoteliaceller) og

c) prosenten klebehemming for kummene som mottar TFN alene til 0% hemming (negativt

antall indikerer økning i klebing).

B. Statistikk, databehandling og lagring: Statistikk utføres ved å anvende den tosidige t-test med lik varians- i EXCEL, og resultatene registrert som P-verdien.

IV. Tilleggsinformasjon:

A. For å kle kummer med kollagen:

Løs opp 25 mg syreløselig rottehalekollagen 446 ml vann surgjort med få dråper HC1. Steriliser ved filtrering. Tilsett 50 ul til hver kum i 96-kum plate (,28 cm<2>) for 10 ug/kum. La dette inkubere over natten i 37°C inkubatoren. Blås bort væsken og lagre i kjøleskap til anvendelse.

B. For å fremstille PBS+0,2% glukose (dekstrose): Fremstill 2 liter PBS (Sigma) og tilsett 2 g glukose. Steriliser filter og lagre.

Rottehjerteinfarkt/ reperfusjonsskademodell

Hann Sprague-Dawley rotter bedøves med uretan, 1,25 g/kg ip. En halsarterie og halsblodåre eksternaliseres og det innføres en kanyle med PE-50 tubing for å registrere blodtykket og for å lette intravenøs administrasjon av fargestoff eller medikament. En trakeotomi blir utført. Dyrene blir knyttet til en Harvard Roden Ventilator (Modell 683, Harvard Apparatus, South Natick, MA) og ventilert ved 1,5 ml/100 g kroppsvekt ved 50 slag/minutt. Nålelektroder plasseres for et lede II elektrokardiogram. Dyrene beholdes ved 37°C ved hjelp av elektriske varmeputer justert til den ønskede temperatur og kontrollert via rektal termistor probe og kontroller. Hjertet blir forsiktig isolert ved en venstre torakotomi og ved femte interkostale rom, og den venstre ytre synkende koronærarterie (LAD) lokaliseres. En ligatur av 6-0 silke plasseres rundt LAD med endende trædde gjennom en liten lengde PE-320 rør for å lette rask okklusjon og reperfusjon av arterien. LAD okkluderes ved fastklemming av suturen og klemt tett rundt hjerteoverflaten ved å anvende 25 mm Schwarz aneurismeklemme. Okklusjon varer i 90 min og etterfølges av reperfusjon i 3,0-4,5 timer. Dyr doseres med medikament eller midler 10 min før reperfusjon av det angrepne området av hjertet ved intravenøs levering via halsblodåren. Simulert-opererte rotter underkastes ikke iskemi eller reperfusjon. Ved slutten av eksperimentet blir LAD permanent re-okkludert og en 10 mg/ml løsning Evans Blue Stain administreres via halsblodårekanylen for å identifisere området som er angrepet av iskemi, dvs. riskområdet (AAR). Det skadede hjertet blir raskt fjernet og plassert i 0,9% saltlake ved 4°C før

kreatinfosfokinaseaktiviteten (CPK) avsluttes.

Bestemmelse av kreatinfosfokinaseaktivitet:

Den venstre ventrikulærfrie veggen (LVFW) dissekeres fri fra hjertet og veies. AAR, som definert ved fravær av feil, dissekeres fra LVFW og veies også. AAR homogeniseres i 5 sekunder i 4 ml 0,25 M sukrose som inneholder 1 g i 30 min ved 4°C. Supernatanten dekanteres for å bestemme CPK-aktivitet og pelleten lagres frossen for isolering og test av myeloperoksidaseaktivitet. CPK-aktivitet testes spektrofotometrisk med et kommersielt levert substrat, CPK Assay Vial® (Sigma Diagnostics) ved en bølgelengde på 340 nm ved 24-26°C.

Bestemmelse av myeloperoksidaseaktivitet:

Myeloperoskidase (MPO) isoleres fra den frosne pelleten etter fremstilling av CPK. Pelleten suspenderes i 50 mM fosfatbuffer, pH6, som inneholder 0,5% heksadcyltrimetylammoniumbromid (HTAB) til en konsentrasjon på omkring 10% sonikert i 10 sekunder og frossen på tørr is. Tre fryse-tine sykluser gjøres med 10 sekunder sonikering mellom syklene. Prøvene kjøles på is i 30 min. etterfulgt av sentrifugering ved 12.500 x g i 15 min ved 4°C. En alikvot av supernatanten testes spektrometrisk for MPO-aktivitet i 50 mM natriumfosfatbuffer, pH6, som inneholder 0,167 mg/ml o-dianisidindihydroklorid og 0,113 ml hydrogenperoksid per 100 ml buffer ved en bølgelengde på 460 nm ved 24-26°C.

Beregning og statistisk analyse:

Resultatene rapporteres som den midlere ± SEM. CPK- og MPO-aktivitet uttrykkes som enheter/g vev, hvor 1 enhet CPK-aktivitet er definert som mengden CPK anvendende 1 ujnol fosfokreatin per minutt. AAR kvantifiseres som vekt% av LVFW. Midlere arterieblodtrykk (MABP) beregnes som en tredjedel av forskjellen mellom systolisk og diastolisk blodtrykk tilsatt til diastolisk blodtrykk. Data analyseres for statistisk signifikans av behanlingsvirkningene ved 95% sikkerhetsnivået ved en koordinert t-test eller ved enveis analyse av varians.

Oppfinnelsen vedrører metoder for behandling eller forebygging av enhver lidelse eller forstyrrelse som vist over, spesielt reperfusjonsskade, ved å administrere en sikker og effektiv mengde av en 2-karboksamid benzimidazolforbindelse som beskrevet over. Slike behandlingsmetoder kan involvere å administrere en enhetsdoseringsform av slike forbindelser parenteralt, peroralt eller topisk. Parenteral administrasjon inkluderer intravenøs, intramuskulær, sukutan, intraperitoneal eller annen injeksjon av doseringsformen. Peroral administrasjon involverer svelging av doseringsformen og absorpsjon av det aktive fra den gastrointestinale trakt. Topisk administrasjon involverer å kontakte doseringsformen med overflaten av hud eller mukosalt vev, inkludert, men ikke begrenset til de av den fordøyelseskanalen og respirasjonssystemet.

For parenteral administrasjon er mengden 2-karboksamid benzimidazolforbindelse typisk administrert foretrukket fra omkring 2 mg/kg, mer foretrukket fra omkring 5 mg/kg, foretrukket til 2 mg/kg, mer foretrukket til omkring 10 mg/kg. Frekvensen av slik administrasjon er typisk en eller to ganger daglig. En behandlingskur er typisk en enkel dose eller varer fra omkring 1 dag, foretrukket fra omkring 5 dager, til omkring 30 dager, foretrukket til omkring 15 dager.

For peroral administrasjon er mengden 2-karboksamid benzimidazolforbindelse typisk administrert foretrukket fra omkring 5 mg/kg, mer foretrukket fra omkring 10 mg/kg, foretrukket til 25 mg/kg, mer foretrukket til omkring 15 mg/kg. Frekvensen av slik administrasjon er typisk fra en til fire ganger daglig. En behandlingskur er typisk en enkel dose eller varer fra omkring 1 dag, foretrukket fra omkring 5 dager, til omkring 30 dager, foretrukket til omkring 15 dager.

Sammensetning og metodeeksempler

Følgende ikke-begrensende eksempler illustrerer oppfinnelsen. Følgende sammensetning og metodeeksempler begrenser ikke oppfinnelsen, men er retningslinjer for fagmannen for fremstilling og anvendelse av forbindelsene, sammensetningene og metodene i henhold til oppfinnelsen. I hvert tilfelle kan andre forbindelser innen oppfinnelsen værer erstatning for esksempelforbindelsen vist under med samme resultater.

Eksempel A

Farmasøytiske sammensetninger i form av en intravenøs løsning fremstilles ved konvensjonelle metoder, slik som ved å blande følgende:

Når 1 ml av sammensetningen over administreres intravenøst, enten rett før eller rett etter en vevsskade (aneurismereparasjon, koronær bypass, transplantasjon, blødning, organiskemi grunnet hypoperfusjon, sepsis, etc), unngås eller reduseres vevsskade.

Eksempel B

Parmasøytiske sammensetninger i væskeform fremstilles ved konvensjonelle metoder, formulert som følger:

Når 1,0 ml av sammensetningen over administreres intravenøst, enten rett før eller rett etter en vevsskade (aneurismereparasjon, koronær bypass, transplantasjon,<1>Forbindelse i henhold til eksempel 1 kan erstattes med et hvilket som helst av eksemplene 2-14.<2>Forbindelse i henhold til eksempel 1 kan erstattes med et hvilket som helst av eksemplene 2-14.

blødning, organiskemi grunnet hypoperfusjon, sepsis, etc), unngås eller reduseres vevsskade.

Mens enkelte utførelser av oppfinnelsen er beskrevet, er det klart for fagmannen at en rekke endringer og modifiseringer av sammensetningene inkludert heri kan gjøres uten å fravike fra oppfinnelsens ånd og virkeområde.

Claims (10)

1. Forbindelse med strukturen:

hvori: (a) RI er valgt fra gruppen bestående av alkyl, aryl, alkoksy og aryloksy, hvor alkyl og aryl i den foretrukne RI inneholder 1-14 karbonatomer, (b) R3 og R4 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, alkyl, alkoksy, alkyl-aryloksy, alkyltio, amino og mono- eller dialkylamino, alkyldelene av de foretrukne R3 og R4 har 1-8 karbonatomer, bortsett fra når R3 og R4 begge er hydrogen, (c) hver R5 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halogen, cyano, alkyl, hydroksy, alkoksy, tio, alkyltio, amino og mono- eller dialkylamino, alkyldelene av foretrukne R5 har 1-8 karbonatomer, og en optisk isomer, diastereomer eller enantiomer eller blanding derav, et farmasøytisk akseptabelt salt, hydrat eller biohydrolyserbar ester, amid eller imid derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1, hvori RI er alkyl eller aryl med fra 2 til 8 karbonatomer, foretrukket er RI alkyl med fra 3 til 8 karbonatomer, alkylet er usubstituert eller substituert med substituenter valgt fra gruppen bestående av halo, hydroksy, C1 -C3 alkoksy, tio, C1 -C3 alkyltio, amino, C1 -C3 mono- eller dialkylamino, fenyl og heterocykel med 5 eller 6 ringatomer, mer foretrukket er RI mettet eller umettet med en dobbelbinding, lineær eller forgrenet eller cyklisk alkyl med fra 3 til 6 karbonatomer.

3. Forbindelse ifølge krav 2, hvori R3 og R4 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogenalkyl, alkoksy, alkyltio, amino og mono- eller dialkyamino, alkyldelene av slik R4 har fra 1 til 6 karbonatomer.

4. Forbindelse ifølge krav 3, hvori hver R5 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av hydrogen, halo, alkyl, alkoksy, alkyltio og mono- eller dialkylamino, alkyldelene av slik R5 har fra 1 til 6 karbonatomer.

5. Forbindelse ifølge krav 4, hvori alkyldelene av R3, R4 og R5 delene uavhengig har fra 1 til 3 karbonatomer, usubstituert eller substituert med halo, hydroksy, C1 -C3 alkoksy, tio, C1 -C3 alkyltio, amino og C1 -C3 mono- eller dialkylamino, foretrukket er alkyldelene av R3/ R4 , R5 usubstituert.

6. Forbindelse ifølge krav 5, hvori RI er fenyl eller benzyl, usubstituert eller substituert med substituenter valgt fra gruppen bestående av halo, C1 -C3 alkyl, hydroksy, C1 -C3 alkoksy, amino og C1 -C3 mono- eller dialkylamino, foretrukket er Ri mettet eller umettet og foretrukket er R3 metoksy eller etoksy.

7. Forbindelse ifølge krav 6, hvori R4 er alkoksy, foretrukket metoksy eller etoksy, mer foretrukket metoksy og R3 og begge R5 er hydrogen.

8. Forbindelse ifølge krav 7, hvori R3 er alkoksy og R4 og begge R5 er hydrogen.

9. Farmasøytisk sammensetning som omfatter: (a) en sikker og effektiv mengde av en forbindelse av et hvilket som helst av kravene 1 eller 6; og (b) farmasøytisk akseptable eksipienter.

10. Fremgangsmåte av å forebygge eller behandle en iskemi-reperfusjonsskade som omfatter å administrere en sikker og effektiv mengde av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 6 til et menneske eller et lavere dyr med behov derav.