NO177673B

NO177673B - Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive N7-substituerte mitomycinderivater

Info

Publication number: NO177673B
Application number: NO910662A
Authority: NO
Inventors: Abdolhossen Talebian; Diana Green; Charles Hammer; Philip S Schein
Original assignee: Univ Georgetown
Priority date: 1988-08-23
Filing date: 1991-02-19
Publication date: 1995-07-24
Also published as: NO910662L; KR900701269A; IE892691L; DK29691D0; AU628846B2; CA1327037C; AU4065089A; GR1000785B; CN1040593A; PT91499B; ZA896025B; GR890100514A; PT91499A; JPH04500513A; NO910662D0; WO1990001931A1; IE63036B1; NZ230343A; NO177673C; EP0431008A4

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstillingen av terapeutisk aktive N<7->substituerte mitomycinderivater.

Mitomycinene er en familie av forbindelser som har følgende generelle formel (I):

Mitomyciner A, B og C er beslektet med hverandre som angitt i Tabell 1 nedenfor, betegnelsene X, Y og Z er de fra formel I.

Mitomyciner er avledet fra mitosanforbindelser som har følgende skjelett II:

Mitosanene dannes under dyrkingen av mikroorganismen Strepto-mvces caes<p>ltosus i et flytende næringsmedium under kunstig kontrollerte betingelser. Etter separasjon av det resulterende mycellium, kan forskjellige mitomyciner isoleres fra sistnevnte ved aktiv karbon- eller fortrinnvis ikke-ione-bytterharpiksadsorpsjon, organisk oppløsningsmiddelekstrak-sjon eller kromatografi på aluminiumoksid, som beskrevet i US-PS nr. 3.660.578 til Hata et al.

Selv om mitosanene er utmerkede antibiotika har de begrenset anvendelighet på grunn av deres toksisitet for humant blod (se US-PS nr. 3.450.705 til Matsui et al.). Den relativt høye toksinnaturen av forbindelsene har fremmet leting etter derivater av mitomycin for å øke den antibiotiske aktiviteten og nedsette toksisiteten.

For eksempel beskriver Matsui et al., US-PS nr. 3.450.705, mitomycinforbindelser substituert ved 7-stillingen med amino, laverealkylamino, fenylamino eller pyridyl, og substituert ved la-stillingen med halogenalkanoyl, halogenbenzoyl, nitrobenzoyl, alkenoyl, acetylglycyl, sorboyl eller acetyl-metionyl.

Matsui et al., US-PS nr. 3.558.651, beskriver mitosan-derivater innbefattende la-acyl-7-acyloksy-9a-metoksyforbin-delser.

Visse mitomyciner og mitomycinderivater har også antitumoraktivitet. Oboshi et al., Gann 58:315-321 (1967); Usubuchi et al., Gann 58:307-313 (1967); Matsui et al., J. Antibiotics XXI: 189-198 (1968); Japansk Patent nr. 68 06 627 til Matsui et al. (Chemical Abstracts 69:86986k (1968)); og Cheng et al., J. Med. Chem. 20:767-770 (1977).

Selv om mitomycin C er aktivt mot et relativt bredt spektrum av eksperimentelle tumorer, begrenser dets toksisitet og myelosuppresive effekter dets anvendelse i klinisk praksis (Mitomycin C: Current Status and New Developments, Carter et al., (red.), Academic Press, New York (1979)). I prekliniske og kliniske studier har mitomycin C vist aktivitet mot en rekke murine og humane neoplasmaer, men har også vist alvorlig, forsinket benmargstoksisitet. Goldin, A., et al., NCI-EORTC Symposium on Mitomycin C, Brussel, Belgia (1981).

I andre undersøkelser ble en kombinasjon av 5-fluorouracil, adriamycin og mitomycin C funnet å være effektiv for behand-lingen av pasienter med fremskreden mage- og tarmkreft. Denne fremgangsmåten innbefattet mitomycin C administrering i en enkeltdose-prosedyre hver to måneder, for å nedsette de behandlings-begrensende forsinkede myelosuppressive effektene av forbindelsen. Schein, P.S., et al., Mitomycin C: Current Status and New Developments, sidene 133-143, Carter et al.

(red.), Academic Press, New York (1979).

Tallrike syntetiske derivater av mitomycin C har vært fremstilt i håp om å oppnå forbindelser med forbedrede terapeutiske egenskaper. Disse derivatene innbefatter substitusjon på aziridinringen, karbamoyl eller acylgruppe-substitusjon på hydroksymetyl-sidekjeden, og erstatning av 7-substituenten i quinonringen med andre funksjonelle grupper, spesielt substituerte aminer. Som imidlertid beskrevet av Remers, US-PS nr. 4.268.676 har ingen av disse analogene nådd frem som et klinisk middel, med det mulige unntak av 7-hydroksyanalogen av mitomycin C, som har vært innbefattet i en senere undersøkelse i Japan. Denne analogen anses å være mindre leukopenisk enn mitomycin C, men er også mindre potent. Også beskrevet av Remers, supra, er fullstendig syntetiske mitomycinanaloger av mitosantypen (Mott et al., J. Med. Chem. 21:493 (1978)), fremstilt hovedsakelig for deres antibakterielle aktivitet.

Kinoshita, S., et al., J. Med. Chem. 14:103-112 (1971), beskriver flere derivater av mitomycin substituert i la-, 7-og 9a-stillingene. Spesielt ble forbindelser substituert ved la-stillingen med sulfonyl, orto-substituert benzoyl og acylderivater angitt.

Iyengar, B.S. , et al., J. Med. Chem. 24:975-981 (1981), beskriver en serie på 31 mitomycin C og porfiromycin-analoger med forskjellige substituenter ved 7- og la-stillingene. De mest aktive substituentene på 7-stillingen innbefatter aziridin, 2-metylaziridin, propargylamin, furfurylamin, metylglycinat og 3-aminopyridin.

Iyengar, B., et al., J. Med Chem. 26:16-20 (1983), beskriver en serie av 7-substituerte mitomycin C og porfiromycin-derivater og undersøkelsen derav i standard antitumor-systemer. Forfatterne angir at 7-stillingen kontrollerer reduksjonen av quinonringen, og foreslår derved at det ville være mulig å endre substitusjonen av 7-posisjonen for å vinne selektivitet mellom normale celler og visse kreftceller.

Iyengar, B.S., et al., J. Med. Chem. 26:1453-1457 (1983), beskriver 20 mitomycin C analoger substituert med sekundære aminer ved 7-stillingen. Elleve av disse analogene var mer aktive enn mitomycin C mot P388 murin leukemi og to av disse elleve var betydelig mindre leukopeniske. Forfatterne angir at ingen kvantitativ korrelasjon mellom antitumoraktivitet og fysiokjemiske egenskaper for analogene var åpenbar, selv om den relative lettheten for quinonreduksjon kan være forbundet med aktivitet.

Iyengar, B.S., et al., J. Med. Chem. 29:1864-1868 (1986), beskriver fremstillingen av 7-substituerte amino 1,2-aziridinomitosener. Forfatterne angir at en metylgruppe på aziridin-nitrogenet gav forøket potens. 7-aminomitosen-derivatene som var vanskelige å redusere til hydroquinoner var i det vesentlige inaktive.

Saml, S., et al., J. Med. Chem. 27:701-708 (1984), beskriver en serie på 30 N<7->fenyl-substituerte mitomycin C analoger. To av forbindelsene som har pyrazolyl- eller aminopyridyl-substituenter ved 7-stillingen ble beskrevet som klart overlegne mitomycin C når det gjelder aktivitet mot P388 murin leukemi.

Sami, T., et al., J. Med. Chem. 22:247-250 (1979), beskriver også N-(2-kloretyl )-N-nitrosokarbamoyl-derivater av glykosyl-aminer, innbefattende tre disakkaridderivater som viste sterk antitumoraktivitet mot leukemi 1210 i mus. I tillegg har glykopyranosederivater av N-nitrosoureaer immunogeniske- og marg-sparende egenskaper. Anderson et al., Cancer Research 35:761-765 (1975); Panasci et al., J. Clin. Invest. 64:1103-1111 (1979).

I US-PS nr. 4.720.543 beskrives forbindelser som har følgende generelle formel (III):

hvor

R<1> er valgt fra gruppen bestående av NEtø, C^- C^ alkoksy og en glykosylrest; og

R<2> er valgt fra hydrogen, C^- C^ alkyl og en glykosylrest, under den forutsetningen at enten R^ eller R£, men ikke begge, inneholder en glykosylgruppe.

Forbindelsene representert ved formel III har utmerket antineoplastisk aktivitet og har samtidig redusert benmargtoksisitet og lavere samlet toksisitet.

På tross av de ovenfor angitt mltomycinderivatene eksisterer det fremdeles et behov for forbedrede mitomycinderivater som har gode anti-neoplastiske egenskaper og lav benmargs- og samlet toksisitet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstillingen av terapeutisk aktivt N<7->substituert mitomycinderivat av formelen:

hvor Y er valgt fra gruppen bestående av glukopyranosyl, galaktopyranosyl, mannopyranosyl, xylopyranosyl eller de hydroksylbeskyttede peracetatderivatene derav.

Forbindelsene omtalt ovenfor fremstilles ved en fremgangsmåte som er kjennetegnet ved at den innbefatter: omsetning av mitomycin A med glukosamin, galaktosamin, mannosamin, xylosamin, under basiske betingelser i et polart, organisk oppløsningsmiddel for å gi det N<7->substituerte mitomycinet.

Den syntetiske fremstillingen av mitomycinderivatene som fremstilles ifølge oppfinnelsen har som utgangspunkt mitomycin C. Mitomycin C kan fremstilles ifølge fremgangs-måtene som generelt er beskrevet i Cheng et al., J. Med. Chem. 20:767-770 (1977). Alternativt kan mitomycin C oppnås fra mitomycin A ved behandling av mitomycin A med en metanol isk ammoniakkoppløsning som beskrevet av Matsui, M. , et al., J. Antibiotics XXI:189 (1968).

Mitomycinderivatene av den ovenfor angitte formelen kan oppnås ved fortrengning av metoksygruppen av mitomycin A (VIII) med aminogruppen av en aminoforbindelse, for eksempel glukosamin (Y-NH2; (IX)) under basiske betingelser i et polart organisk oppløsningsmiddel for å gi det ^-substituerte mitomycinderivatet (X) (se reaksjonsskjema I nedenfor).

Aminoforbindelser (Y-NHg) som kan "være substituerte ved 7-stillingen innbefatter glukosamin, galaktosamin, mannosamin og xylosamin og de hydroksyl-beskyttede peracetatderivatene derav. Fortrinnsvis er den sakkaridomfattende gruppen "Y" substituert ved 2-stillingen med aminogruppen. Polare organiske oppløsningsmidler som kan anvendes ved utførelsen av oppfinnelsen innbefatter metanol, etanol, propanol, dimetylsulfoksid og dimetylformamid. Egnede baser for å tilveiebringe de basiske betingelsene for reaksjonen innbefatter alkylaminer så som C]—C3 trialkylaminer, diisopropyletylamin, 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en (DBU) og dimetylaminopyridin (DMAP). Generelt er mitomycin A og aminoderivatet tilstede i et 1:1 molforhold, selv om overskudd aminoderivat kan være tilstede. Tilstrekkelig base er tilstede i reaksjonsblandingen for å sikre at reaksjonen forblir basisk hele tiden.

Foretrukne mitomycinderivater som har formel X innbefatter N<7->(2-deoksyglukopyranosyl)mitomycin C, N<7->(2-deoksygalakto-pyranosyl)mitomycin C, N<7->(tetraacetyl-2-deoksyglukopyranosyl)mitomycin C og N<7->(tetraacetyl-2-deoksygalakto-pyranosyl )mitomycin C. Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan være tilstede som farmasøytisk akseptable salter. Blant de foretrukne anioniske motionene er de av halogenidene (avledet fra hydrogenhalogenidsyrer), så som klorid, bromid eller fluorid. Andre anioner innbefatter sulfonat, eller p_-toluensulfonat.

Som et antibiotikum er forbindelsene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse nyttige mot alle mikroorganismer som er mottagelige for den anti-bakterielle virkningen av utgangsforbindelsene, disse mikroorganismene innbefatter, men er ikke begrenset til, Pseudomonas. Staphvlococcus. Sarcinia. Diplococcus. Streptococcus. Corynebacterium. Hemophilus. Escherlchla. Klebslella. Proteus, Salmonella. Shigella. Brucella. Mycobacterlum. Nocardia, Saccharomyces. Candida, Penicillium og Aspergillus. Spesifikke mikroorganismer som kan behandles med forbindelsene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter Pseudomonas aeruginosa. Staphvlococcus aureus. Staphvlococcus albus. Staphvlococcus citreus. Sarcina lutea. Diplococcus pneumoniae. Streptococcus hemo-lytlcus. Streptococcus lactis. Corvnebacterlum dlphtheriae. Hemophilus pertussis. Escherlchla coli. Klebslella pneu-moniae . Proteus vulgaris. Salmonella typhosa. Salmonella paratyphi. Shigella dysenterlae. Brucella abortus. Brucella megatherium. Brucella mvcoides. Brucella anthracius. Mycobacterlum ATCC 607. Mycobacterlum avium. Mycobacterlum phlei. Nocardia asteroides. Saccharomyces cervisiae. Candida albi-cans. Penicillium glacum og Aspergillus niger.

Mitomycinderivatene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige in vltro som antiseptiske midler, f.eks. for des-infeksjon. Forbindelsene er også nyttige topisk og internt som terapeutiske midler for bekjempelse av patogene bakterier, f.eks. i tilfeller av staphylodermatitis, bakteriell lungebetennelse, leptopserosis, rickettsiosis, salmonellosis og lignende.

Typisk tilføres for topisk anvendelse mitomycinene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse i preparater som har konsentrasjoner i området fra 0,01 til 1.000 jjg/ml.

5 Som antineoplastiske midler er forbindelsene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse nyttige ved behandling av en rekke krefttyper, innbefattende, men ikke begrenset til, de krefttypene som. er mottagelige for cellevekstsundertrykkelse

ved hjelp av utgangsforbindelsene. Behandling av krefttyper 10 med utgangsforbindelsene er beskrevet I følgende referanser: Driscoll, J.S. et al., Cancer Chemotherapy Rep. 4:1 (1974).

Kojima, R., et al., Cancer Chemotherapy Rep. 3:111 (1972).

15

Sugiura, K. , Cancer Res. 19:438 (1959).

Oboshi, S., et al., Gann 58:315 (1967).

zn Sugiura, K. , Cancer Chemotherapy Rep. 13:51 (1961).

Venditti, J.M., et al., Advances In Cancer Chemotherapy, s. 201-209 (1978) redaktører: H. Umezawa et al., Japan Soc.

Press, Tokyo/Univ. Park Press, Baltimore.

25

Usubuchi, I., et al., Gann 58:307 (1967).

Typiske krefttyper behandlet med mitomycinderivatene

fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er 3° ikke begrenset til, gastriske og pankreatiske neoplasmer (Schein, P.S. et al., i Mitom<y>cin C: Current Status and New Developments. s. 133-143, Carter et al. red., Academic Press, New York (1979)). Andre krefttyper som kan behandles med

forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen innbefatter 35 lunge, bryst, anal, kolorektal, hode og nakke og melanomer.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen er også aktive mot følgende tumorsysterner: Leukemia L1210, Leukemia P388, P1534 leukemi, Friend virus leukemi, Leukemia L4946, Mecca lymfosarkom, Gardner lymfosarkom, Ridgway osteogenisk sarkom, Sarkom 180 (ascites), Wagner osteogenisk sarkom, Sarkom T241, Lewis lungekarsinom, Karsinom 755, CD8F, Brystkarsinom, Colon 38, Karsinom 1025, Ehrlich-karsinom (ascites & fast), Krubs 2 karsinom (ascites), Bashford karsinom 63, Ådenokarsinom E

0771, B16 Melanom, Hardin-Passey melanom, Giloma 26, Miyona ådenokarsinom, Walker-karsinosarkom 256, Flexner-Jobling karsinom, Jensen-sarkom, Iglesias-sarkom, Iglesias-ovarie-tumor, Murphy-Sturn lymfosarkom, Yoshida-sarkom, Dunning-leukemi, Rous-kyllingsarkom og Crabb-hamstersarkom.

<;> De farmasøytiske preparatene oppnådd ved anvendelse av forbindelsene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres ved en hvilken som helst fremgangsmåte som oppfyller det påtenkte formålet. For eksempel kan administrering foregå ved parenteral-, subkutan-, intravenøs-, intramuskulær-, intraperitoneal-, transdermisk- eller bukkal fremgangsmåte. Alternativt eller samtidig kan administrering foregå ved oral fremgangsmåte. Doseringen som administreres vil avhenge av alderen, helsetilstanden og vekten for

mottageren, type av eventulet samtidig behandling, be-handlingshyppighet og naturen av den ønskede effekten.

Preparater som her omtales innbefatter alle preparater hvor mitomycinderivatet inneholdes i en effektiv mengde for å

oppnå det planlagte formålet. Selv om individuelle behov 1 varierer ligger bestemmelsen av optimale områder av effektive mengder av hver komponent innenfor fagmannens kunnskaps-område. Typiske doseringsformer inneholder 10 til 300 jjmol/kg dyr av mitomycinderivatet, eller en ekvivalent mengde av det farmasøytisk akseptable saltet derav.

I tillegg til de farmakologisk aktive forbindelsene kan de nye farmasøytiske preparatene inneholde egnede farmasøytisk akseptable bærere innbefattende eksipienser og hjelpestoffer som letter bearbeidelsen av de aktive forbindelsene til preparater som kan benyttes farmasøytisk. Fortrinnsvis

inneholder preparatene, spesielt de preparatene som kan 5 administreres oralt og som kan benyttes for den foretrukne typen administrering, så som tabletter, drasjéer og kapsler, og også preparater som kan administreres rektalt, så som suppositorier, såvel som egnede oppløsninger for administrering ved injeksjon eller oralt, fra 0,01 til 99 prosent, 10 fortrinnsvis fra 25 til 75 prosent av den eller de aktive forbindelsene, sammen med eksipiensen.

De farmasøytiske preparatene omtalt ovenfor fremstilles ved

en fremgangsmåte som i seg selv er kjent, for eksempel ved 15 hjelp av konvensjonelle blande-, granulerings-, drasjéfrem-stillings-, oppløsnings- eller lyofiliserings-prosesser. Følgelig kan farmasøytiske preparater for oral anvendelse oppnås ved å kombinere de aktive forbindelsene med faste

eksipienser, eventuelt nedmaling av den resulterende 20 blandingen og bearbeidelse av blandingen av korn, etter tilsetning av egnede hjelpestoffer, om nødvendig eller ønsket, for å oppnå tabletter eller drasjékjerner.

Egnede eksipienser er spesielt fyllstoffer, så som sakka-25 rider, for eksempel laktose eller sukrose, mannitol eller sorbitol, cellulosepreparater og/eller kalsiumfosfater, for eksempel trikalsiumfosfat eller kalsiumhydrogenfosfat, såvel som bindemidler, så som stivelsespasta, ved anvendelse av for

eksempel maisstivelse, hvetestivelse, risstivelse, potet-30 stivelse, gelatin, tragant, metylcellulose, hydroksypropyl-metylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose og/eller polyvinylpyrrolidon. Om ønsket kan sprengmidler tilsettes så som de ovenfor nevnte stivelsene og også karboksymetyl-stivelse, tverrbundet polyvinylpyrrolidon, agar eller 35 alginsyre eller et salt derav, så som natriumalginat. Hjelpestoffer er fremfor alt flytregulerende midler og smøremidler, for eksempel silisiumdioksid, talk, stearinsyre

eller salter derav, så som magneslumstearat eller kalsium-stearat og/eller polyetylenglykol. Drasjékjerner utstyres med egnede belegg som om ønsket er resistente overfor magesafter. For dette formålet kan konsentrerte sakkaridoppløsninger anvendes, som eventuelt kan inneholde gummiarabikum, talk, polyvinylpyrrolidon, polyetylenglykol og/eller titandioksid, lakkoppløsninger og egnede organiske oppløsningsmidler eller oppløsningsmiddelblandinger. For å fremstille belegg som er resistente overfor magesafter anvendes oppløsninger av egnede cellulosepreparater, så som acetylcelluloseftalat eller hydroksypropymetylcelluloseftalat. Fargestoffer eller pigmenter kan tilsettes til tablettene eller drasjébeleggene, for eksempel for identifisering eller for å karakterisere kombinasjoner av aktive forbindelsesdoser.

Andre farmasøytiske preparater som kan anvendes oralt innbefatter skyvetilpassede kapsler fremstilt av gelatin, såvel som myke, forseglede kapsler fremstilt av gelatin og en mykner, så som glycerol eller sorbitol. De skyvetilpassede kapslene kan Inneholde de aktive forbindelsene i form av korn som kan være blandet med fyllstoffer, så som laktose, bindemidler, så som stivelser, og/eller smøremidler, så som talk eller magneslumstearat og, eventuelt, stabiliseringsmidler. I myke kapsler er de aktive forbindelsene fortrinnsvis oppløst eller suspendert i egnede væsker, så som fete oljer, eller flytende parafin. I tillegg kan stabiliseringsmidler være tilsatt.

Mulige farmasøytiske preparater som kan anvendes rektalt innbefatter for eksempel suppositorier, som består av en kombinasjon av de aktive forbindelsene med en suppositorie-basis. Egnede suppositoriebasiser er for eksempel naturlige eller syntetiske triglyserider eller parafinhydrokarboner. I tillegg er det også mulig å anvende gelatinrektalkapsler som består av en kombinasjon av de aktive forbindelsene med en base. Mulige basematerialer innbefatter for eksempel flytende triglyserider, polyetylenglykoler eller parafinhydrokarboner. Egnede formuleringer for parenteral administrering innbefatter vandige oppløsninger av de aktive forbindelsene i vannoppløselig form, for eksempel vannoppløselige salter. I tillegg kan suspensjoner av de aktive forbindelsene, som hensiktsmessig oljeformig injeksjon administreres. Egnede lipofile oppløsningsmidler eller bærere innbefatter fete oljer, for eksempel sesamolje eller syntetiske fettsyre-estere, for eksempel etyloleat eller triglyserider. Vandige injeksjonssuspensjoner kan inneholde stoffer som øker viskositeten av suspensjonen, innbefattende for eksempel natriumkarboksymetylcellulose, sorbitol og/eller dekstran. Eventuelt kan suspensjonen også inneholde stabiliseringsmidler .

Eksempler

Eksempel 1: Fremstilling av mitomycin Å

Mitomycin C (50 mg, 0,15 mmol) ble oppløst i 3 ml av en oppløsning av 5056 metanol og 50% 0,1 N NaOH og omrørt ved romtemperatur i 18 timer. Etter fullførelse av reaksjonen (TLC, CHCl3:MeOH, 10:1) ble reaksjonsblandingen bråkjølt med tørris for å nøytralisere natriumhydroksid. Blandingen ble deretter frysetørket i vakuum, og mitosanforbindelsen ble fjernet med metanol. Metanoloppløsningen ble konsentrert i vakuum til tørrhet, og resten ble oppløst i en minimal mengde metanol og deretter utfelt med eter slik at man fikk 20 mg av et rødt-purpurfarget pulver. Dette ble oppløst i 15 ml etylacetat og avkjølt til 5°C, behandlet med diazometan (eterformig oppløsning av diazometan ble fremstilt ifølge fremgangsmåten til Arndt, Org. Synthesis, Collective Volume II, s. 165-167), og omrørt i 20 minutter (TLC, CHCl3:MeOE, 10:1). Etter fullførelse av reaksjonen ble oppløsnings-middelet først fjernet under trykk redusert ved hjelp av vannstråle og deretter tørket i vakuum. Resten ble re-krystallisert fra eter slik at man fikk 18 mg rødfargede nåler, smp. 159-160°C. TLC (EtOAc:aceton, 1:1) gav ett punkt Rf = 0,91 og (aceton:benzen, 4:1) ett punkt Rf = 0,48. UV

(metanol) 216 og 358 nm. NMR (aceton-d^, middeltopp av aceton ved 2,10), S, 5,94 (br, 2H); 4,76 (dd, 1H); 4,38 (t, 1H); 4,07 (s, 3E); 3,96 (d, 1E); 3,54 (dd, 1E); 3,41 (d, 1E); 3,35 (d, 1E); 3,25 (s, 3E); 2,99-2,264 (mmm); 2,87 (s); 1,640 (s, 3E).

Eksempel 2: Fremstilling av N7-( 2- deoksyglukopyranosyl) mitomycin C

Til en oppløsning av mitomycin A (10 mg, 0,028 mmol) i absolutt metanol ble det tilsatt en metanolisk oppløsning av glukosamin EC1 (70 mg, 0,325 mmol) og diisopropyletylamin (100 jjI). Denne blandingen ble omrørt under ^-atmosfære ved romtemperatur inntil reaksjonen var fullført i henhold til TLC (EtOAc: aceton, 1:1), ved hvilket tidspunkt (10 timer) oppløsningen hadde endret farge fra rødaktig til mørk purpurfarget. Oppløsningen ble konsentrert ved fordampning med en N2~strøm og kromatografert på en preparativ silisium-dioksidplate eluert med aceton-etylacetat (1:1). Det purpur-fargede båndet som forble nær opphavet ble skrapet av og eluert med metanol. Ytterligere rensing ved HPLC (C^g reversert fase, semipreparativ kolonne, metanol: 0.1N fosfatbuffer, 1:1) gav et purpurfarget pulver, NMR (D2O) å 5,32 (d, 1E, sakkarid anomerisk E); 3,85 (s, 3E, 9a-0CE3); og forsvinningen av singlet ved 4,09 (Matsui, M. , et al., J. Antibiot. 21:189 (1968); Cheng, L., og Remers, W.A., J. Med. Chem. 20:767 (1077); Vyas, D.M. , et al., J. Org. Chem. 51:4307 (1986)).

Eksempel 3: Fremstilling av N-( 2, 6- dlhydroksycykloheksyl)-glycinamid

Til en oppløsning av N-benzyloksykarbonylglycin (3 g, 14,3 mmol) i dioksan ble det tilsatt N-hydroksysuccinimid (1,65 g, 14,3 mmol) og N,N-dicykloheksylkarbodiimid (2,96 g, 14,3 mmol) under avkjøling. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0-5"C i en time og fikk stå under nedkjøling over natten. Ureautfellingen ble fjernet ved avsugningsfiltrering og filtratet ble konsentrert i vakuum til tørrhet. Den gulaktige resten ble rekrystalllsert fra etylacetat-eter og gav 8456 utbytte av den glycin-aktlverte esteren, smp. 112-114°C. NMR (CHCI3).

Den ovenfor fremstilte aktiverte esteren av glycin (25 g, 0,008 mol) ble oppløst i 15 ml tørr DMF (dimetylformamid), avkjølt til under 5°C og 2-amino-l,3-cykloheksandiol (2,18 g, 0,016 mol) i DMF ble tilsatt dråpevis under omrøring under N2 atmosfære. Etter fullførelse av reaksjonen (TLC, CHCl3:MeOH, 10:1) ble DMF fjernet under redusert trykk og den resulterende faste resten ble krystallisert fra etylacetat slik at man fikk hvite krystaller i 8456 utbytte, smp. 170-172° C. NMR (D20): S 7,45 (s, 5H, aromatisk H); 5,20 (s, 2E, benzylisk CH2); 3,95 (s, 2H, -C0-CE2-NE2); 3,6 (t, 1H, C^E av cykloheksanring); 3,45 (m, 2H, C2E og C5E av cykloheksanring); 2,0, 1,8 og 1,35 (m,m,m, 2 til 1 til 3E; C3, C4 og C5 hydrogener av cykloheksan). Produktet innbefatter det N-beskyttede benzyloksykarbonylderivatet av N-(2,6-di-hydroksycykloheksyl)glycinamid.

N-beskyttet benzyloksykarbonyl N-(2,6-dihydroksycykloheksyl)-glycinamid (3g, 0,093 mol) ble oppløst i 100 ml absolutt etanol med en molar ekvivalent av 1056 EC1. Eydrogenolyse med 556 Pd/C ved 206,85 kPa, fjernelse av katalysatoren over celitt og etterfølgende avdampning av oppløsningsmidlene i vakuum gav et blekt brunaktig faststoff som ble triturert med eter og rekrystalllsert fra etylacetat og eter, smp. 207-210°C. NMR (D20) S, 3,65 (t, 3E, CjE av cykloheksanring); 3,55 (m, 2H, C2H og C6H av cykloheksan); 3,4 (s, 2H, -CO-CH9-NE2); 2,05, 1,80 og 1,38 (m.m.m, 2 til 1 til 3E, hydrogener av C3, C4 og C5 av cykloheksan).

Eksempel 4

Dyreforsøk

Forbindelsen N<7->(2-deoksyglukopyranosyl)mitomycin C, fremstilt ifølge eksempel 2, ble vurdert med henblikk på både murin P388 leukemi antitumoraktivitet og toksisitet overfor benmarg i normale mus.

A. Bestemmelse av murin antitumoraktivitet

Det murine P388 leukemisystemet, opprettholdt intraperitonealt i DBA/2 hunnmus, ble benyttet for å vurdere antitumoraktivitet. Denne tumoren blir valgt på grunn av dens kjente sensitivitet overfor utgangsforbindelsen, mitomycin C (Driscoll et al., Cancer Chemotherapy Reports 4:1 (1974)). N<7->(2-deoksyglukopyranosyl)mitomycin C ble oppløst i sterilt vann (ved 4°C) straks før administrering. Mitomycin C ble oppløst i etanol, og den resulterende oppløsningen ble regulert til 556 etanol, 9556 sterilt vann.

Hver forbindelse ble administrert intraperitonealt til grupper av CD2F^-hannmus på dag 1 etter intraperitoneal implantering av 1 x IO<6> P388 leukemiceller. P388 antileukemi-aktiviteten av forsøksforbindelsen ble vurdert ved gjennomsnittlige overlevelsesdager og prosentvis økning av levetid (ILS - increased life span). 56 ILS ble beregnet som følger: 56ILS (T-C)/C x 100;

hvor T er gjennomsnittlige overlevelsesdager for de behand-lede 'musene og C er gjennomsnittlige overlevelsesdager for de ubehandlede musene.

P388 antitumoraktiviteten for N<7->(2-deoksyglukopyranosyl)-mitomycin C, sammenlignet med utgangs-mitimycin C, er sammenfattet i Tabell 2:

Tabell 2

Antitumoraktivitet mot P388 leukemi

Legemiddel Dose ( mg/ kg) 56ILS G ^ ennomsn.

overlevelse

( dager)

N7-(2-deoksy- 5a 4256 14,2 glukopyranosyl)

mitomycin C 13,5a 6156 16,1 Mitomycin C 4,5b 8156 18,1 Kontroll<0> 10,0

<e>L<Dq> dose

^Ca. LDiQ dose

<c>Behandlet med legemiddelbærer

B. Bestemmelse av virkningene av N7-( 2- deoksyglukopyranosyl)-mitomycin C på det hematopoietiske systemet i mus

Måling av perifer leukocytt (WBC) telling ble utført ved anvendelse av en 20 jjI prøve av retro-orbitalt sinusblod oppnådd fra normale CD2F^ hannmus på dag 3 etter i.p. administrering av 13,5 mg/kg N<7->(2-deoksyglukopyranosyl)-mitomycin C eller 4,5 mg/kg mitomycin C. Oppnådde blodprøver ble fortynnet i 9,98 ml isoton (en naturlig, isotonisk bufferoppløsning) og talt i en Coulter-teller etter lyserlng med "Zapoglobln" (en enzymoppløsning som lyserer røde blodceller, men Ikke hvite blodceller). WBC-tellinger uttrykkes som en prosentangivelse relativt til verdier for kontrollmus som bare mottar legemiddelbærer. Resultatene er sammenfattet i den følgende tabellen:

Tabell 3

In vivo murin WBC- depres. 1on

WBC telling på dag 3 Legemiddel Dose ( som prosent av kontr.) N<7->(deoksy- 13,5 mg/kg 9456

glukopyranosyl)

mitomycin C

Mitomycin C 4,5 mg/kg 56-6656

Sammenfattet demonstrerer disse in vivo-undersøkelsene at N<7->

(2-deoksyglukopyranosyl)-mitomycin C har betydelig aktivitet mot det murine P388 tumorsystemet, ved doser som ikke gir betydelig benmargtoksisitet, bestemt ved undertrykkelse av perifer leukocytt (WBC) telling.

Eksempel 5: Antibakteriell aktivitet

N<7->(2-deoksyglukopyranosyl)-mitomycin C ble vurdert for aktivitet overfor gram-negative bakterier, i en sammen-lignende undersøkelse med utgangs-mitomycin C. Minimum inhiberingskonsentrasjon (M.I.C.) mot en gram-negativ stamme av bakterier (HB101) ble estimert ved fortynningsmetoden, med graderte konsentrasjoner av legemiddel tilsatt til agar ved 37-40°C. N<7->(2-deoksyglukopyranosyl)-mitomycin C ble oppløst i 5056 sterilt vann-5056 etanol ved 4°C, og mitomycin C ble oppløst I etanol. Agaren, inneholdende legemiddel, størknet raskt ved romtemperatur og bakteriene ble øyeblikkelig belagt. Etter 24 timer ved 37°C ble agarplatene observert med henblikk på inhibering av bakterievekst. Resultatene er sammenfattet i Tabell 4.

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt N<7->substituert mitomycinderivat av formelen: hvor Y er valgt fra gruppen bestående av glukopyranosyl, galaktopyranosyl, mannopyranosyl, xylopyranosyl eller de hydroksylbeskyttede peracetatderivatene derav, karakterisert ved at den innbefatter: omsetning av mitomycin A med glukosamin, galaktosamin, mannosamin, xylosamin, under basiske betingelser i et polart, organisk oppløsningsmiddel for å gi det N<7->substituerte mitomycinet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av N<7->(2-deoksyglukopyranosyl ) mitomycin C, karakterisert ved at tilsvarende, eventuelt substituerte, utgangs-materialer anvendes.