NO175529B - Fremgangsmåte for rensing av tryptofan - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for rensing av tryptofan.

Tryptofan fås vanligvis fra en fermentasjonsvæske eller et enzymreaksjonsprodukt ved kondensasjon eller ved nøy-tralisering etter avkjøling og etterfølgende separasjon av væske og fast stoff. Ved denne vanlige fremgangsmåten opptas imidlertid urenheter i fermentasjonsvæsken eller i enzym-reaks jonsproduktet i tryptofankrystallene, slik at det er umulig å oppnå tryptofan med høy renhet.

En fremgangsmåte hvor tryptofan rekrystalliseres i nærvær av en lavere alkohol eller et keton, er beskrevet i den utlagte japanske patentsøknad (Kokai) nr. 39857/84. Ved denne fremgangsmåten kan imidlertid tryptofan med tilfredsstillende høy renhet ikke oppnås.

Den utlagte japanske patentsøknad nr. 126070/86 beskriver en fremgangsmåte for rensing av tryptofan hvor det anvendes en ikke-polar, porøs harpiks. Med denne fremgangsmåten er det imidlertid påkrevd med en kostbar harpiks. Dessuten er den erholdte tryptofanoppløsning svært tynn, slik at det er påkrevd med en vesentlig energimengde for kondensasjonen. Denne fremgangsmåten er således ikke økonomisk.

For å oppnå tryptofan med høy renhet, er det generelt påkrevd med kondensasjon, rekrystallisering og separasjon av fast stoff og væske etter at tryptofanet er oppløst for å fjerne uoppløselige urenheter. Ettersom oppløseligheten av tryptofan i vann eller alkohol er liten, er det imidlertid påkrevd med en stor mengde oppløsningsmiddel for å oppløse tryptofan, slik at en stor mengde energi er påkrevd for kondensasjon. Under kondensasjonen dekomponeres dessuten tryptofan, slik at renheten og utbyttet av tryptofan redu-seres .

Et formål ved foreliggende oppfinnelse er følgelig å tilveiebringe en fremgangsmåte for rensing av tryptofan hvorved de ovenfor nevnte problemer løses, og hvorved tryptofan kan bli høyrenset på en økonomisk og enkel måte i industriell målestokk.

Oppfinnerne gjorde grundige undersøkelser hvorved de overraskende fant at selv om tryptofan dekomponeres ved oppvarming i eddiksyre, fremmes stabiliteten av tryptofan mye dersom eddiksyren inneholder vann.

Det vil si at foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for rensing av tryptofan som er kjennetegnet ved at tryptofan oppvarmes til en temperatur på 40-115 °C i vannholdig eddiksyre med et vanninnhold på 10-80 vekt%, idet den vannholdige eddiksyre anvendes i en mengde på 3-200 ganger antallet mol tryptofan uttrykt i antallet mol av eddiksyren, og at tryptofanoppløsningen deretter avkjøles til 40-0 °C.

Ved hjelp av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan rensing av tryptofan utføres ved en høy konsentrasjon, slik at kondensasjonen og nøytraliseringen ikke er påkrevd. Ved foreliggende oppfinnelse kan det således enkelt og økonomisk fås tryptofan med høy renhet og i høye utbytter.

Figur 1 viser stabiliteten av tryptofan i eddiksyre som inneholder forskjellige mengder vann, og

figur 2 viser oppløselighet av tryptofan ved forskjellige temperaturer i eddiksyre som inneholder forskjellige mengder vann, eller i vann.

Tryptofanet som underkastes fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, kan være urent tryptofan som er fremstilt ved fermentering, enzymomsetning eller ved kjemisk syntese. Tryptofanet kan ha enten L- eller D-konfigurasjon, eller kan være racemisk. Det bør legges merke til at når bare enten L- eller D-tryptofan underkastes fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, oppstår ikke racemerisering av tryptofanet.

Ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse rekrystalliseres således det urene tryptofan ved først å varmes opp i vannholdig eddiksyre med et vanninnhold på

10-80 vekt%, for deretter å avkjøles.

Det bør legges merke til at dersom mengden av den vannholdige eddiksyre er for stor, kan utbyttet bli redusert. Mengden av den vannholdige eddiksyre er som nevnt 3-200 ganger antallet mol tryptofan uttrykt i antallet mol eddiksyre.

Temperaturen som anvendes i oppvarmingstrinnet kan være hvilken som helst temperatur bare tryptofanet kan opp-løses fullstendig i den vannholdige eddiksyre. Temperaturen er således 40-115 °C.

Til den oppvarmede oppløsning hvor tryptofan er opp-løst, kan om nødvendig aktivt kull eller en filterhjelp til-settes for å adsorbere urenheter, eller for å hjelpe på fra-filtreringen av de uoppløselige materialer. Det aktive kull kan være et som vanligvis anvendes for rensingen ved rekrystallisering. Foretrukne eksempler på filterhjelpen kan omfatte aktivt kull, diatoméjord, bentonitt, sur terra alba og talkum.

Rekrystalliseringen kan per se utføres på en lignende måte som vanlige metoder ved avkjøling av en oppløsning av

tryptofan i vannholdig eddiksyre. For effektivt å oppnå tryp-tof ankrystaller, avkjøles tryptofanoppløsningen som nevnt til 40-0 °C, fortrinnsvis 20-5 °C.

De erholdte krystaller av tryptofan kan utvinnes ved filtrering, vaskes med vandig eddiksyreoppløsning eller kaldt vann og tørkes på en vanlig måte under atmosfære- eller redusert trykk, hvorved man får høyrenset tryptofan. Det bør legges merke til at ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er det ikke påkrevd med nøytralisering med et alkali, og eddiksyren kan utvinnes fra filtratet ved destilla-sjon e.l.

Figur 1 viser stabiliteten av tryptofan i eddiksyre som inneholder forskjellige mengder vann. I figur 1 angir abscissen tidsrommet med oppvarming, og ordinaten angir den forholdsmessige andel av det gjenværende tryptofan. Videre betyr tallene ledsaget av "%" vanninnholdet i eddiksyren. Varmebehandlingen ble utført ved 90 °C. Som det kan ses av figur 1, bedrer tilsetning av vann til eddiksyren stabiliteten av tryptofan mye. På grunn av den gode stabilitet av tryptofan i den vannholdige eddiksyre dekomponeres tryptofan ikke vesentlig termisk under rekrystalliseringstrinnet.

Tryptofan har videre høy oppløselighet i den vannholdige eddiksyre. Figur 2 viser oppløseligheten av tryptofan ved forskjellige temperaturer i vann eller i eddiksyre som inneholder forskjellige mengder vann. I figur 2 angir abscissen temperaturen, og ordinaten oppgir oppløseligheten av tryptofan. Tallene som ledsages av "%" betyr vanninnholdet i eddiksyren. Som det kan ses av figur 2, har tryptofan høy opp-løselighet i eddiksyren over et bredt område av vanninnhold. Dette understøtter klart den konklusjon at vannholdig eddiksyre er et utmerket oppløsningsmiddel for rensing av tryptofan. Det vil si at ettersom tryptofan har høy oppløselighet i den vannholdige eddiksyre, kan rekrystalliseringstrinnet utføres ved en høy konsentrasjon av tryptofan slik at konden-sasjonstrinnet som var uunngåelig i den konvensjonelle fremgangsmåte, ikke er nødvendig.

Foreliggende oppfinnelse vil nå bli beskrevet nærmere ved hjelp av eksempler.

Eksempel 1

Indol og serin ble kondensert i en vandig oppløsning i nærvær av tryptofansyntetase, fremstilt ved å dyrke en vanlig E. coil, hvorved det fås et reaksjonsprodukt som inneholder 15 vekt% L-tryptofan. Til 200 g av det således erholdte reaksjonsprodukt ble det tilsatt 140 g eddiksyre, og bland-ingen ble varmet opp til 90 °C. Til den resulterende blanding ble 0,3 g aktivt kull tilsatt, og den resulterende blanding ble varmet opp ved denne temperaturen i ytterligere 1 time. Etter fjerning av uoppløselige materialer ved filtrering ble filtratet avkjølt til 20 °C og ble holdt ved denne temperaturen i 1 time. De frembrakte krystaller ble utvunnet ved filtrering. De utvunne krystaller ble vasket med 60 g kaldt vann og ble tørket i en tørker, hvorved man fikk 27 g L-tryp-tof an. Utbyttet fra reaksjonsproduktet var 89,0 %, og renheten til det erholdte tryptofan var 98,9 %.

Sammenligninqseksempel

200 g av reaksjonsproduktet som inneholdt 15 vekt% L-tryptofan, erholdt i eksempel 1, ble filtrert som det var og ble vasket med 60 g kaldt vann. Ved tørking av filtratet ble det erholdt 29 g L-tryptofan. Utbyttet fra reaksjonsproduktet var 90,3 %, og renheten til det erholdte tryptofan var 93,4 %.

Eksempel 2

Til et blandet oppløsningsmiddel bestående av 70 g eddiksyre og 70 g vann ble 25 g av det urene L-tryptofan erholdt i sammenligningseksemplet tilsatt og den resulterende blanding oppvarmet ved 90 °C. Til den resulterende blanding ble 0,2 g aktivt kull tilsatt, og den resulterende blanding ble varmet opp ved 90 °C i 1 time. De uoppløselige materialer ble fjernet ved filtrering og filtratet avkjølt til 20 °C. Etter å ha holdt filtratet ved denne temperaturen, ble de frembrakte krystaller utvunnet ved filtrering. De utvunne krystaller ble vasket med 50 g kaldt vann og ble tørket i en tørker, hvorved man fikk 22 g tryptofan. Utbyttet var 93,4 %, og renheten til det erholdte tryptofan var 99,1 %.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for rensing av tryptofan, karakterisert ved at tryptofan oppvarmes til en temperatur på 40-115 °C i vannholdig eddiksyre med et vanninnhold på 10-80 vekt%, idet den vannholdige eddiksyre anvendes i en mengde på 3-200 ganger antallet mol tryptofan uttrykt i antallet mol av eddiksyren, og at tryptofan-oppløsningen deretter avkjøles til 40-0 °C.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at oppvarmingen utføres i nærvær av aktivt kull eller en filterhjelp.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at filterhjelpen er aktivt kull, diatoméjord, bentonitt, sur terra alba eller talkum.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at tryptofanoppløsningen avkjøles til 20-5 °C.