FI94239C - Menetelmä tryptofaanin puhdistamiseksi - Google Patents

Description

94239

Menetelmä tryptofaanin puhdistamiseksi -Förfarande för rening av tryptofan 5 Keksintö koskee menetelmää tryptofaanin puhdistamiseksi.

Tryptofaania saadaan perinteisesti fermentointiliuoksesta tai entsyymireaktiotuotteena kondensoimalla tai neutraloimalla jäähdytyksen sekä nesteen ja kiintoaineen erottamisen jälkeen. Tällä tavanomaisella menetelmällä on kuiten- 10 kin mahdotonta saada tryptofaania, jolla olisi korkea puh tausaste, koska epäpuhtauksia fermentointiliuoksesta tai entsyymireaktiotuotteesta kiinnittyvät tryptofaanikitei-siin.

15 Menetelmä, jossa tryptofaania uudelleenkiteytetään alemman alkoholin tai ketonin läsnäollessa, on esitetty JP (Kokai) -hakemuksessa 39857/84. Tällä menetelmällä ei kuitenkaan saada tarpeeksi puhdasta tryptofaania.

30 JP-hakemus 126070/86 koskee tryptofaanin puhdistusmenetel mää, jossa käytetään ei-polaarista huokoista hartsia. Käytetty hartsi on kuitenkin kallis. Lisäksi saatu trypto-faaniliuos on niin laimea, että tarvitaan olennainen energiamäärä liuoksen kondensoimiseksi. Tämä menetelmä ei si- 25 ten ole taloudellinen.

Yleensä täytyy kondensoida, uudelleenkiteyttää ja erottaa kiintoaine liuoksesta sen jälkeen kun tryptofaani on liuotettu, jotta liukenemattomat epäpuhtaudet saataisiin pois.

30 Koska tryptofaani liukenee huonosti veteen tai alkoholiin, tarvitaan suuria määriä liuotinta tryptofaanin liuottami-seksi, jolloin kondensointiin tarvitaan paljon energiaa. Lisäksi tryptofaania hajoaa kondensoinnin aikana, jolloin tryptofaanin puhtaus ja saanto vähenee.

35 JP-hakemusjulkaisusta 60-4168 tunnetaan menetelmä, jossa tryptofaani saatetaan alkaliseen vesiliuokseen, joka sen 2 94239 jälkeen yhdistetään etikkahappoon tai etikkahapon vesi-liuokseen, jonka konsentraatio on ainakin 30 paino-%. Neutralointi aikaansaa tryptofäänin kiteytymisen. Trypto-faanikiteiden erotuksesta jää jäljelle suodos, joka si-5 sältää suuren määrän asetaattia, joka on muutettava happo- muotoon. Lisäksi kiteytysliuoksen värjäytyminen estää korkeampien, yli 60°C:een nousevien kiteytyslämpötilojen käytön, jotka muutoin olisivat suotavia saatavien kiteiden laadun kannalta.

10 JP-hakemusjulkaisusta 60-13758 on esitetty menetelmä tryp-tofäänin puhdistamiseksi, jossa tryptofaanikiteet pestään etikkahapolla tai etikkahapon vesiliuoksella. Menetelmällä voidaan tuskin poistaa muuta kuin kiteiden pintaan kiin-15 nittyneitä epäpuhtauksia. Tryptofäänin uudelleenkiteytystä siinä ei tapahdu.

Esillä oleva keksintö koskee tryptofäänin puhdistusmenetelmää, jossa edellä mainitut ongelmat on ratkaistu ja 30 tryptofaania voidaan puhdistaa taloudellisesti ja helpolla tavalla teollisessa mittakaavassa.

Yllättäen huomattiin, että vaikka tryptofaani hajoaa kuumentamalla etikkahapossa, sen stabiilisuus kuitenkin pa-25 ranee paljon, jos etikkahappo sisältää vettä.

Esillä olevan keksinnön muodostaa tryptofäänin puhdistus-menetelmä, jolle on tunnusomaista se, että raaka trypto-faani saatetaan vesipitoiseen etikkahappoon liuokseksi, 20 josta tryptofaani uudelleenkiteytetään.

• · ! Keksinnön mukaisessa menetelmässä tryptofaanin puhdistus voidaan suorittaa korkeassa pitoisuudessa niin, ettei kon-densointi ja neutralointi ole tarpeen. Keksinnön mukaises-35 sa menetelmässä saadaan korkealla saannolla puhdasta tryp- tofaania helposti ja taloudellisesti.

94239 3

Kuvassa 1 on esitetty tryptofaanin stabiilisuus etikkaha-possa, jonka vesipitoisuus vaihtelee.

Kuvassa 2 on esitetty tryptofaanin liukenevuus eri lämpö-5 tiloissa vedessä tai etikkahapossa, jonka vesipitoisuus vaihtelee.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetty tryptofaani voi olla raakaa tryptofaania, joka on saatu fermentoimalla, 10 entsyymireaktion tai kemiallisen synteesin avulla. Tryp tofaani voi olla joko L- tai D-konfiguraatiota tai rasee-minen. On huomattava, että käytettäessä vain toista konfi-guraatiomuotoa tryptofaanin raseminoitumista ei tapahdu.

15 Keksinnön mukaisessa menetelmässä raaka tryptofaani uudel- leenkiteytetään vesipitoisessa etikkahapossa. Etikkahapon vesipitoisuus voi olla 1-95 paino-%, edullisesti 2-90 pai-no-% ja vielä edullisemmin 10-80 paino-%.

$0 Vesipitoisen etikkahapon määrä laskettuna etikkahappona on edullisesti suurempi kuin ekvimolaarinen tryptofaaniin nähden. On huomattava, että saanto saattaa laskea, jos vesipitoista etikkahappoa on liikaa. Siten on edullista käyttää vesipitoista etikkahappoa 3-200 moolia etikkahap-25 pona laskettuna yhtä moolia tryptofaania kohti.

Käytetty lämpötila uudelleenkiteytyksen aikana voi olla mikä tahansa edellyttäen, että tryptofaani on täysin liuenneena vesipitoisessa etikkahapossa. Yleensä lämpötila on 30 edullisesti 40-115°C.

• Lämmitettyyn liuokseen, jossa tryptofaani on liuenneena, voidaan tarpeen mukaan lisätä aktiivihiiltä, joka adsorboi epäpuhtauksia, tai suodatusapuainetta, joka edistää liuke-35 nemattomien aineiden poissuodattamista. Aktiivihiili voi olla yleensä puhdistamiseen uudelleenkoteyttämällä käytettyä laatua. Edullisia esimerkkejä suodatusapuaineista ovat 4 94239 aktiivihiili, piimää, bentoniitti, hapan kaoliini ja talkki.

Uudelleenkiteytys voidaan suorittaa samalla tavalla kuin 5 tavanomaisissauudelleenkiteytysmenetelmissä jäähdyttämäl lä vesipitoinen etikkahappoliuos, jossa on tryptofaania liuenneena. Tryptofaanikiteitä saadaan tehokkaasti kun tryptofaaniliuos jäähdytetään yleensä lämpötilaan 40-0°C, edullisesti lämpötilaan 20-5°C.

10

Muodostuneet tryptofaanikiteet voidaan eristää suodattamalla, pestä vesipitoisella etikkahappoliuoksella tai vedellä ja kuivata tavanomaisella tavalla normaali- tai alennetussa ilmanpaineessa, jolloin saadaan erittäin puh-15 dasta tryptofaania. On huomattava, että keksinnön mukai sessa menetelmässä ei tarvita neutralointia emäksen avulla ja että etikkahappoa voidaan erottaa suodoksesta tislaamalla tai vastaavalla tavalla.

20 Kuvassa 1 on esitetty tryptofaanin stabiilisuus etikkaha- possa, jonka vesipitoisuus vaihtelee. Kuvassa 1 x-akseli kuvaa lämmitysaikaa ja y-akseli jäljellä olevan tryptofaanin määrää. Lisäksi prosenttilukujen yhteydessä olevat käyrät viittaavat etikkahapon vesipitoisuuteen. Lämmitys -25 käsittelyssä käytettiin 90°C. Kuten kuvasta 1 näkyy, tryp- tofaani on paljon stabiilimpi lisättäessä vettä etikkahap-poon. Vesipitoisessa etikkahapossa olevan tryptofaanin stabiilisuuden johdosta tryptofaani ei olennaisesti termisesti hajoa uudelleenkiteytyksen aikana.

30

Lisäksi tryptofaanin liukenevuus on suuri vesipitoisessa etikkahapossa. Kuvassa 2 on esitetty tryptofaanin liukenevuus eri lämpötiloissa vedessä tai etikkahapossa, jonka vesipitoisuus vaihtelee. Kuvassa 2 x-akseli kuvaa lämpö-35 tilaa ja y-akseli tryptofaanin liukoisuutta. Prosenttilu kujen yhteydessä olevat käyrät viittaavat etikkahapon vesipitoisuuteen. Kuvasta 2 voidaan nähdä, että tryptofaanin 5 94239 liukoisuus on suuri vesipitoisessa etikkahapossa hyvin laajalla vesipitoisuusalueella. Tämä tukee selvästi sitä johtopäätöstä, että vesipitoinen etikkahappo on erinomainen liuotin tryptofäänin puhdistuksessa. Koska tryptofaa-5 nin liukoisuus on niin suuri vesipitoisessa etikkahapossa voidaan uudelleenkiteytys suorittaa korkeassa trypto-faanipitoisuudessa niin, ettei tavanomaisessa menetelmässä välttämätön kondensointivaihe ole tarpeellinen.

10 Seuraavat esimerkit kuvaavat tarkemmin keksintöä kuiten kaan rajoittamatta sitä.

Esimerkki 1

Indolia ja seriiniä kondensoitiin vesiliuoksessa tavan-15 omaisen E. coli -kasvatuksen avulla tuotetun tryptofaa- nisyntaasin läsnäollessa, jolloin saatiin reaktiotuote, jossa oli 15 paino-% L-tryptofaania. 200 g:aan tätä tuotetta lisättiin 140 g etikkahappoa ja seos lämmitettiin 90°C:seen. Seokseen lisättiin 0,3 g aktiivihiiltä ja seos-•30 ta lämmitettiin samassa lämpötilassa vielä tunnin. Liu kenemattomien aineiden poissuodattamisen jälkeen suodos jäähdytettiin 20°C:ksi ja pidettiin tässä lämpötilassa tunnin. Muodostuneet kiteet erotettiin suodattamalla. Erotetut kiteet pestiin 60 g:11a kylmää vettä ja kuivattiin, 25 jolloin saatiin 27 g L-tryptofaania. Saanto reaktiotuot teesta laskettuna oli 89,0 % ja tryptofaanin puhtaus oli 98,9 %.

Vertailuesimerkki 30 200 g esimerkin 1 alussa tuotettua reaktiotuotetta, jossa oli 15 paino-% L-tryptofaania, suodatettiin suoraan liuoksesta ja pestiin 60 g:11a kylmää vettä. Kuivaamalla suo-dosta saatiin 29 g L-tryptofaania. Saanto reaktiotuotteesta laskettuna oli 90,3 % ja tryptofaanin puhtaus oli 35 93,4%.

6 94/39

Esimerkki 2

Liuotinseokseen, jossa oli 70 g etikkahappoa ja 70 g vettä, lisättiin 25 g raakaa vertailuesimerkissä muodostunutta L-tryptofaania ja seosta lämmitettiin 90°C:ksi. Seok-5 seen lisättiin 0,2 g aktiivihiiltä ja seosta lämmitettiin 90°C:ssa tunnin. Liukenemattomat aineet poistettiin suodattamalla ja suodos jäähdytettiin 20°C:ksi. Jäähdytyksen jälkeen muodostuneet kiteet erotettiin suodattamalla. Erotetut kiteet pestiin 50 g:11a kylmää vettä ja kuivattiin, 10 jolloin saatiin 22 g tryptofaania. Saanto oli 93,4 % ja tryptofäänin puhtaus oli 99,1 %.

Vaikka keksintö on kuvattu vain muutaman sovellutusmuodon avulla, on ammattimiehelle selvää, että keksintöä voidaan 15 käyttää eri tavalla. Ainoastaan patenttivaatimukset ra joittavat keksintöä.

• · I

Claims (10)

94239

1. Menetelmä tryptofäänin puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että raaka tryptofaani saatetaan vesipitoiseen etik-kahappoon liuokseksi, josta tryptofaani uudelleenkoteyte- 5 tään.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoisen etikkahapon vesipitoisuus on 1-95 paino-%. 10

3. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat av att 20 vattenhalten i den vattenhaltiga ättiksyran är 2-90 vikt- %.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoisen etikkahapon vesipitoisuus on 2-90 paino-%.

4. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat av att vattenhalten i den vattenhaltiga ättiksyran är 10-80 vikt- 25 %.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoisen etikkahapon vesipitoisuus on 10- 80 paino-%.

5. Förfarande enligt patentkrav l, kännetecknat av att äterkristalliseringen utförs i närvaro av aktivt koi eller ett filtreringshjälpmedel. 30

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu "20 siitä, että uudelleenkiteytys suoritetaan aktiivihiilen tai suodatusapuaineen läsnäollessa.

6. Förfarande enligt patentkrav 5, kännetecknat av att « filtreringshjälpmedlet är aktivt koi, kiseljord, bentonit, surt kaolin eller taik. 35 7. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att den vattenhaltiga ättiksyran används i en mängd av 3-200 mol ättiksyra räknad per en mol tryptofan. 94239

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suodatusapuaine on aktiivihiili, piimää, ben- 25 toniitti, hapan kaoliini tai talkki.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoista etikkahappoa käytetään 3-200 moolia etikkahappona laskettuna yhtä moolia tryptofaania koh- 30 ti. 1 35 Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uudelleenkiteytys suoritetaan lämpötilassa 40-115 °C. 94239

8. Förfarande enligt patentkrav 1, kannetecknat av att äterkristalliseringen utförs vid en temperatur av 40-115 °C. 5 9. Förfarande enligt patentkrav l, kännetecknat av att tryptofanlösningen avkyls tili en temperatur av 40-0°C för äterkristalliseringsperioden.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tryptofaaniliuos jäähdytetään lämpötilaan 40-0°C uudelleenkiteytyksen ajaksi.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tryptofaaniliuos jäähdytetään lämpötilaan 20-5°C uudelleenkiteytyksen ajaksi. 10 1. Förfarande för rening av tryptofan, kännetecknat av att man bringar rätt tryptofan i lösning med vattenhaltig ättiksyra och äterkristalliserar tryptofanet frän lösnin-gen. 15 2. Förfarande enligt patentkrav l, kännetecknat av att vattenhalten i den vattenhaltiga ättiksyran är 1-95 vikt- %.

10. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att 10 tryptofanlösningen avkyls tili en temperatur av 20-5°C för äterkristalliseringsperioden.