NO171971B

NO171971B - Koagulasjonsnoeytrale, hydrofile glassfibrer, fremgangsmaate for fremstilling av glassfibrene, middel for separasjon av plasma fra blod og anvendelse av glassfibrene

Info

Publication number: NO171971B
Application number: NO862626A
Authority: NO
Inventors: Hans Wielinger; Helmut Freitag
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1985-07-04
Filing date: 1986-06-30
Publication date: 1993-02-15
Also published as: NO862626L; KR870001126A; NO171971C; CA1262220A; EP0208218A2; DK167918B1; ES2000311A6; JPH0475860B2; PT82908B; ATE50760T1; EP0208218B1; DE3669308D1; AU560350B2; EP0208218A3; US4786603A; ZA864832B; DE3523969A1; DK313686D0; NO862626D0; JPS627650A

Description

I EP patentsøknad nr. 45 476 er det beskrevet middel

og fremgangsmåte for fraskillelse av plasma eller serum fra helblod som gjør det mulig å bestemme innholdstoffer i helblod på enkel måte. Ifølge denne litteraturhenvisnig lar plasmaet seg skille fra de røde blodlegemene ved at man lar helblodet renne gjennom et lag av glassfibrer med fiberdia-meter på under 2,5um som holder de røde blodlegemene tilbake. Blodet legges fortrinnsvis på en ende av en rettvinklet glassfibervatt hvorfra plasmaet transporteres kapillært til det øvrige området. Etter plasmautvinningsprosessen trykkes det mot denne vattdel som er fylt med plasma, en matriks (papir, sugedyktige filmer, etc.) som inneholder nødvendige reagenser for reaksjonen, hvor påvisningsreaksjonen for den parameter som skal påvises gjennomføres ved hjelp av remisjonsmålinger.

Dette enkle plasmautvinnings- og plasmatransportsystem kan brukes til alle klinisk kjemisk viktige parametere, bort-sett fra parametere som innenfor rammen av undersøkelsene er ment å skulle bestemme spørsmålsstillinger vedrørende hemo-stase. Det er kjent at koagulasjonsanalyser prinsipielt bør gjennomføres i kunststoffbeholdere eller glassbeholdere som er inaktivert ved hjelp av et belegg av silikonharpiks, mens u-behandlet glass virker inn på koagulasjonsevnen til blod eller plasma. Således nedsetter glass gjennom aktivering enfase-koagulasjonstiden (etter Quick) for plasma med koagulasjonsfaktorer som ligger i normalområdet.Enfase-koagulasjonstiden (etter Quick)} forlenges hos lavprosentig plasma gjennom inaktivering av koagulasjonsfaktorer. Glass inaktiverer fremfor alt faktorene V og Ila. Gjennom denne inaktivering og derved feil-aktig forlengede koagulasjonstider ødelegges den diagnostiske nytte, mens forholdet mellom de enkelte koagulasjonsfaktorer forskyves. Den i prosent angitte Quick-verdi omfatter ved siden av fibrinogenkonsentrasjonen, aktiviteten til faktorene II, V, VII og X. Et blandingsplasma fra friske givere defi-neres som 100% plasma, og ved fortynning ved fysiologisk kok-saltoppløsning fremstilles det passende lavprosentige plasmaer. Over denne fortynningsrekke fremstilles det en forholds-kurve som angir Quick-verdien for pasientplasmaer.

Men også bestemmelsen av den partielle tromboplastin-tid (PTT) påvirkes negativt gjennom inaktiveringen av faktorene XII og XI. Påvisningen av antitrombin III og heparin forstyrres betydelig gjennom en inaktivering av trombin med glass.

Formålet ved foreliggende oppfinnelse var følgelig å modifisere separasjons- og transportsystemene ifølge EP patentsøknad nr. 45 476 på en slik måte at disse ble koagula-sjonsnøytrale, uten å endre deres separasjons- og transport-egenskaper, og derigjennom bli anvendbare for hemostaseunder-søkelsene.

I første rekke bød det seg frem følgende løsningsmulig-heter: bruk av fibermaterialer av kunststoffer. Disse fiber-materialene har imidlertid ikke de ønskede egenskaper med hensyn til separasjonsforhold i forhold til de røde blodlegemer, og virker delvis betydelig inn på separasjonsevnen hos plasmaer. Videre er det kjent at man kan belegge glass på overflaten gjennom silikonisering med silikonharpiksemulsjoner, og derigjennom utelukke en påvirkning på koagulasjonsfaktorene. Denne silikonisering gjør imidlertid i det spesielle tilfelle med glassfibrer overflaten så sterkt hydrofob at ingen fukting lengre kan finne sted og slik at fibrene fullstendig mister sine fraskillelsesegenskaper med hensyn til røde blodlegemer og plasmatransportegenskaper.

Overraskende ble det funnet at man kjemisk kan modifisere glassfiberoverflater med bestemte silaner slik at de be-holder de hydrofile egenskaper som f.eks. er nødvendig for sugeevnen til glassfibervatter, men taper innvirkningen på koaguleringsfaktorene, dvs. blir koagulasjonsnøytrale.

Ved behandlingen av glassfibrer med forbindelser med den generelle formel I fås det, under mellomliggende spalting av alkoksygruppene til hydroksygruppene og etterfølgende reaksjon av disse hydroksygrupper med de reaktive steder på glassfiberoverflaten, glassfibrer som har de ovenfor beskrevne egenskaper.

hvor

R1 = en alkylengruppe med 2-6 C-atomer,

R2 = en lavere alkoksygruppe med 1-6 C-atomer og

R3 = en lavere alkyl- eller alkoksygruppe med 1-6 C-atomer.

Behandlingen av glassfibrene skjer på kjent måte, idet man tilsetter stoffer med den generelle formel I i vandige, svakt sure oppløsninger (FEBS Lett. 9_ 3, 5-6 (1978)). Ved denne prosess dannes de reaktive Si-OH-grupper som reagerer med glassoverflaten, mens også oksiranringene omsettes til dioler. Ved anvendelse av silaner med en alkoksygruppe R2 oppstår det monomolekylære lag. Ved anvendelse av silaner med 2 eller 3 alkoksygrupper oppstår det alt etter reaksjons-betingelser flerlags belegg (vanligvis 4-12 lag), ettersom silanene også reagerer med hverandre under polykondensasjon.

En fordelaktig mulighet er belegningen av glassover-flatene med stoffer med den generelle formel I i vannfrie

organiske oppløsningsmidler, fortrinnsvis under katalyse med svake baser og derpå følgende omsetning av oksiranringene til dioler under sur katalyse i vandig oppløsning (Advan. Chroma-togr., 21, 48-53 (1978)). Etter denne fremgangsmåte lar monomolekylære, eller noen silanmolekyler,tykke lag seg bygge opp.

Videre er det mulig å utnytte reaktiviteten til oksi-ran- eller diolgruppene for å binde ytterligere ligander som holder glasset koagulasjonsnøytralt, men forandrer på de hydrofile egenskaper såfremt dette synes nødvendig og rett-ferdiggjøres av den endelige anvendelse. Sterkt ioniske ligander skiller seg derved ut ettersom de virker inn på koagulasjonen, imidlertid kan en tilkobling av aminosyrer og peptider være fordelaktig. En alkoholyse av oksiranringene med en monoalkohol fører til mer hydrofobe glykolmonoetere, med polyoler til hydrofile polyolforbindelser.

Det erholdte sluttprodukt har følgende skjematisk fremstilte struktur:

hvor Rx er en alkylengruppe med 2-6 C-atomer, X er en hydroksylgruppe, en eventuelt med én eller flere hydroksylgrupper substituert alkoksygruppe med 1-6 C-atomer, en aminosyre eller peptidrest, og R'3 betyr enten en alkylgruppe med 1-6 C-atomer eller en oksygenbru til et silisiumatom i nabogruppen eller til glassoverflaten.

Glass/glassfibrer som er modifisert på denne måte, for-holder seg nøytrale under forløpet av koagulasjonen.

Som alkylengrupper R.^ kommer det på tale med rettkjedede eller forgrenede grupper med 2-6 C-atomer, men sili-siumatomet må skilles ut gjennom minst 2 C-atomer fra eter-oksygenet. Etylen og propylen er foretrukket.

Som alkyl- henholdsvis alkoksygrupper R2 og R3 kommer det på tale med rettkjedede eller forgrenede, lavere alkyl-grupper med 1-6 C-atomer, særlig metyl- og etylgrupper som fremstilles og omsettes* på en enkel måte. Når X betyr en alkoksygruppe, inneholder denne som nevnt 1-6 C-atomer. Metoksy-, etoksy-, propoksy-, 2-hydroksy-etylenoksy-, 2,4-dihydroksypropylenoksy- er foretrukkede grupper. Som aminosyre- eller peptidrester kommer det særlig på tale med de aminosyrer og peptider som naturlig er til stede i human-serum, særlig albumin, som ikke forstyrres av koagulasjonen.

Glassfibrene ifølge oppfinnelsen legges ut etter vanlige kjente fremgangsmåter til vatt som, slik det blant annet i eksemplene er beskrevet, kan settes inn i midler for bestemmelse av koagulasjonsparametere. I form av en kort søyle kan de også brukes til plasmautvinning ifølge EP-patentsøknad nr. 45 47 6, hvoretter plasmaet så på vanlig måte kan brukes i koagulasjonstester.

Ifølge oppfinnelsen er det således også tilveiebrakt en fremgangsmåte for fremstilling av de koagulasjonsnøytrale, hydrofile glassfibrer som er egnet for fremstilling av tester for hemostaseundersøkelser, hvor fremgangsmåten er kjennetegnet ved at rensede glassfibrer omsettes med et silan med formel I

hvor

R2 betyr en alkylengruppe med 2-6 C-atomer,

R2 betyr en lavere alkoksygruppe med 1-6 C-atomer og R3 betyr en lavere alkyl- eller lavere alkoksygruppe med

1-6 C-atomer,

og oksirangruppen overføres til gruppen X ved hydrolyse, alkoholyse eller omsetning med en aminosyre eller et peptid.

Videre er det ifølge oppfinnelsen tilveiebrakt et middel for separasjon av plasma fra blod for hemostasetester bestående av et lag av glassfibrer med en gjennomsnittlig diameter på 0,2-5 pm, fortrinnsvis 0,5-2,5 um, og en tetthet på 0,1-0,5 g/cm<3>, som er kjennetegnet ved at glassfibrene har et silanlag ifølge ett av kravene 1 og 2.

Endelig er det ifølge oppfinnelsen tilveiebrakt en anvendelse av glassfibrer ifølge ett av kravene 1 og 2 for fremstilling av tester for hemostaseundersøkelser.

Ytterligere ut føre Ises former av <g>lassfibrene ifølge oppfinnelsen for separasjon av plasma og for anvendelse i diagnostiske midler for bestemmelse av koagulasjonsparametere kan fremstilles analogt med de i EP-patentsøknad nr. 45 476 beskrevne midler, men med de her nevnte trekk. Det er selv-sagt at i slike midler må ikke bare glassfiberlagene ifølge oppfinnelsen bestå av koagulasjonsnøytrale materialer, men også alle øvrige deler som kommer i kontakt med plasmaet, slik at det brukes særlig foretrukne kunststoffer som er kjent av fagmannen.

Eksempel 1

Fremstilling av koagulasjonsnøytrale glassfibrer

Til en liter vann, som med en syre (f.eks. saltsyre eller eddiksyre) ble innstilt på en pH-verdi på 2,0-4,0, fortrinnsvis 3,0, ble det tilsatt 5-50 g, fortrinnsvis 20 g, •y-glysidoksypropyltrimetoksysilan. For avspalting av metanol-en og dannelse av Si-OH-gruppene ble det omrørt inntil det ikke lengre var noen uklarhet å se. Reaksjonen kan akselere-res ved forhøyelse av temperaturen. En reaksjonstid på 1 time ved 80°C har vist seg å være særlig velegnet. Til denne oppløsning ble det tilsatt 0,5-10 g glassfibrer, fortrinnsvis 2-7 g. Det ble omrørt i 1 til 4 timer, fortrinnsvis i 1 time, hvorved silanet ble bundet til glassoverflaten og oksiran-ringen ble omdannet til diolgruppe. Reaksjonen forløp hur-tigere ved høyere temperaturer. Glassfibrene ble fjernet og grundig vasket med vann. Glassfibrene ble oppslemmet i 1 liter vann som var blitt innstilt med saltsyre på en pH-verdi på 2,0-4,0, fortrinnsvis 3,0, og formet på en platedannende lamell med en flatevekt på 20-200 g/m 2. Den valgte flatevekt er avhengig av hvilken anvendelse man skal bruke den dannede pels til (se eksempel).

Eksempel 2

Prøve på koagulasjonsnøytralitet hos glassfibrene

Av de ifølge eksempel 1 fremstilte glassfibrer ble 40 mg brakt sammen med 300 yl blandingsplasma fra friske givere, henholdsvis også fra pasienter behandlet med antikoagulasjons-midler, og det ble inkubert i 1 minutt ved 37°C. Deretter ble plasmaene fraskilt ved sentrifugering, plasmaene ble undersøkt med hensyn på enfase-koagulasjonstid etter Ouick før og etter behandlingen med glass. Til dette kan levringstesten anvendes: Koagulasjonen startes med kalsiumklorid og tromboplastin, og prøven hektes fast, hvoretter tiden for dannelse av fibrin-tråder måles. Likeså kan det brukes en fotometrisk test for bestemmelse av Quick-tiden (Becher, U. et al.: Neue Aspekte in der Gerinnungsdiagnostik, F.K. Schattauer Verlag, Stutt-gart - New York (1984), side 17-30).

I mellomtiden ble innflytelsen av trombin (faktor Ila) testet på følgende måte. 300 pl av en oppløsning av trombin 1 vann med ca. 3 enheter/ml ble brakt sammen med glass på den ovenfor beskrevne måte. Ved alle forsøkene hvor glasset ble modifisert etter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, fremkom det ingen forskjeller med hensyn til koagulasjonsforhold hos plasmaet før og etter behandlingen med modifisert glass. Også trombinaktiviteten (trombin inaktiveres fullstendig av ube-handlet glass) forble uforandret.

Aktivitetsbestemmelsen av trombinet ble gjennomført med Tos-Gly-Pro-Arg-p-Nitro-anilin som substrat. Til dette ble 2 ml buffer Tris/HCl 2,00 mmol/1, pH 8,1 inkubert med 50 pl trombinoppløsning ved 25°C i 3 minutter, og deretter ble reaksjonen startet opp med 100 pl med 3,8 mmol/1 substrat i buffer og kinetikken overvåket.

Eksempel 3

Bestemmelse av enfase- koagulasjonstiden etter Quick Fremstilling av teststrimmelen

Reagensmatriks

2

Et papir med en platesugeevne på 60-70 ml/m ble impregnert med en vandig oppløsning med følgende sammensetning:

Oppløsningen ble innstilt på pH 7,3 med natronlut.

Etter trekkingen ble det av det impregnerte papir skåret ut felter med 15 mm bredde.

Oksidasjonsmatriks

Et nylonnett med trådtykkelse ca. 40 pm, maskevidde ca. 60 pm, (Type NY 20 HC Super fra firma Ziiricher Beuteltuch-fabrik, Sveits), ble impregnert med en vandig oppløsning av 50 mmol K3[Fe(CN)g]/1 og 50 mmol kalsiumklorid/1. Etter tørkingen ble det av det impregnerte nett skåret ut 15 mm brede felter.

Testkonstruksjon

På en 100 mm bred polystyrenfolie ble glassfiberpelsen ifølge oppfinnelsen med en flatevekt på 50-60 g/m 2 i en bredde på 15 mm lagt og festet med et nylonnett med en trådtykkelse på 140 pm og en maskebredde på 250 ym som ble lagt over og klebet fast i enden (se fig. 1). På glassfibervattens frie ende ble oksidasjons- og reagensmatriksen lagt over hverandre, tildekket med en 2 00 pm tykk gjennomsiktig poly-karbonatfolie ved 15 mm bredde og klebet fast (se fig. 1). Den således fremstilte lamell ble skåret opp i 6 mm brede strimler. Oppbygningen av teststrimmelen er vist i fig. 1.

I denne angis:

1. Polystyrol-bærerfolien

2. Klebemiddel

3. Nylonnett

4. Glassfibervatt ifølge oppfinnelsen

5. Oksidasjonsmatriks

6. Reagensmatriks

7. Polykarbonat-dekkfolie

Bestemmelse av enfase- koagulasjonstid etter Quick

Sammenligning mellom teststrimler som var fremstilt med glassfibre ifølge oppfinnelsen og med ikke-silaniserte glassfibrer.

På nylonnettet som glassfibervatten er festet med, ble det pipettert 35 ul av en sitratblod-fortynningsrekke (hematokrit på 40%) med 100%, 50%, 33%, 25% og 12,5% blod i fysiologisk NaCl-oppløsning. De røde blodlegeme ble holdt tilbake i den fraskilte del. Teststrimlene ble deretter temperert til 37°C og fargedannelsen som funksjon av tiden ble fulgt med et remisjonsfotometer. Her må det iakttas at det fås vesentlig sterkere signaler med glassfibrene ifølge oppfinnelsen enn med ubehandlede glassfibrer. Som Ouick-tid kan ved anvend-elsen av silaniserte glassfibrer den tid hvorunder det skjer en remisjonsreduksjon på 10%, måles. Derimot kan ved anvendelse av ubehandlede glassfibrer bare tiden hvorunder en endring på 4% remisjon finne sted, anvendes. Videre er spredningen ved tester med glassfibrene ifølge oppfinnelsen tydelig mindre ettersom det fra glassets side ikke skjer noen forstyrrende innflytelse på koagulasjonsforløpet. Forskjellen fremgår av følgende tabell.

Av tabellen sees det at, som det er kjent fra koagulasjonsanalyser med levringstester, det skjer en aktivering av plasmaer fra friske givere (100% plasma) med glass, mens lavprosentige plasmaer tydelig blir inaktivert.

Videre vil det legges merke til at den kurve som fås med en testkonstruksjon med glassfibrene ifølge oppfinnelsen, er svært godt i overensstemmelse med kurven til den foto-metriske Ouick-test (fig. 2).

Claims

1. Koagulasjonsnøytrale, hydrofile glassfibrer som er egnet for fremstilling av tester for hemostaseundersøkelser, karakterisert ved at det på overflatene er bundet silan i samsvar med følgende strukturformel hvor Rx er en alkylengruppe med 2-6 C-atomer, X er en hydroksylgruppe, en eventuelt med én eller flere hydroksylgrupper substituert alkoksygruppe med 1-6 C-atomer, en aminosyre eller peptidrest, og

R'3 er enten en alkylgruppe med 1-6 C-atomer eller en oksygenbru til et silisiumatom i en nabogruppe eller til glassoverflaten.

2. Glassfiber ifølge krav 1, karakterisert ved at silanlaget som er bundet på glassfiberens overflate, er 1 til 30, særlig 4-12, molekyllag tykt.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av glassfibrer ifølge krav 1-2, karakterisert ved at rensede glassfibrer omsettes med et silan med formel I hvor Rx betyr en alkylengruppe med 2-6 C-atomer, R2 betyr en lavere alkoksygruppe med 1-6 C-atomer og R3 betyr en lavere alkyl- eller lavere alkoksygruppe med 1-6 C-atomer, og oksirangruppen overføres til gruppen X ved hydrolyse, alkoholyse eller omsetning med en aminosyre eller et peptid.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at omsetningen i vandig opp-løsning utføres i nærvær av en syrekatalysator og at det fås en hydroksylgruppe som gruppe X.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at omsetningen utføres i et vannfritt medium.

6. Middel for separasjon av plasma fra blod for hemostasetester bestående av et lag av glassfibrer med en gjennomsnittlig diameter på 0,2-5 um, fortrinnsvis 0,5-2,5 pm, og en tetthet på 0,1-0,5 g/cm 3, karakterisert ved at glassfibrene har et silanlag ifølge ett av kravene 1 og 2.

7. Middel ifølge krav 6, karakterisert ved at fibrene er ordnet lagvis i en søyle hvor toppen er beregnet på tilførsel av blod og bunnen er beregnet på avgivelse av plasma.

8. Middel ifølge krav 6, karakterisert ved at glassfiberlaget består av et glassfiberpapir eller en glassfibervatt og er del av et diagnostisk middel for påvisning av koagulasjonsparametere.

9. Middel ifølge krav 8, karakterisert ved at glassfiberlaget er det øverste lag i et diagnostisk middel med flere lag.

10. Middel ifølge krav 8 eller 9, karakterisert ved at glassfiberlaget står i sugedyktig kontakt med et plasmatransportlag som på sin side står i sugedyktig kontakt med ett eller flere reagenslag, eller kan bringes i kontakt med disse.

11. Anvendelse av glassfibrer ifølge ett av kravene 1 og 2 for fremstilling av tester for hemostaseundersøkelser.